JP2008515926A - 自己免疫障害の免疫療法 - Google Patents

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Abstract

自己免疫疾患を治療する組成物および方法が記述されている。特に、これまでに報告された手順より有意に高い薬剤負荷を有し、自己免疫疾患の治療の際に低下した凝集および低接合画分（ＬＣＦ）を有するＢ細胞除去剤および細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体の使用が記述されている。Ｂ細胞除去剤、複合体および／または抗サイトカイン剤を含む、自己免疫疾患を治療するための併用療法および組成物も記述されている。

Description

本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、免疫性血球減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血）、自己免疫性血管炎、および／または関連症状等の自己免疫疾患を治療するための化合物、化合物の複合体、組成物および併用療法に関する。特に、本発明は、細胞表面抗原決定基に対する特異性を有するＢ細胞表面抗原標的抗体等のＢ細胞除去剤、および、細胞毒性薬に複合した該当するＢ細胞除去剤の複合体に関する。例えば、本発明は、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤に関し、ここでＢ細胞除去剤はＢ細胞上の抗原決定基に対する特異性を有する抗体である。本発明は、複合体を製造する方法およびそれらの治療的使用にも関する。特に、本発明は、Ｂ細胞表面抗原標的抗体（例えば、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２０、および／または抗ＣＤ１９抗体）等のＢ細胞除去剤、または、Ｂ細胞除去剤の細胞毒性薬との複合体を患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を治療するための方法に関する。本発明は、Ｂ細胞除去剤、またはＢ細胞除去剤の細胞毒性薬との複合体を抗ＴＮＦ剤等の抗サイトカイン剤と組み合わせて使用する自己免疫疾患の治療にも関する。
自己免疫疾患は、免疫系が誤って個体自身の体の細胞、組織、および器官を標的とする、重大な慢性病の一種である。国立衛星研究所によると、自己免疫疾患の多くは確かに稀であるが、これらの疾患は米国においてのみ何百万もの人々を集団的に苦しめている。そのことが十分に理解されていないために、自己免疫疾患は男性よりも女性を頻繁に襲い、症例の約７５％は女性に発生している。特に、これらの疾患は、労働年齢であり出産適齢期の女性に対し最も頻繁に影響を及ぼす。実際、自己免疫疾患は、米国における女性の身体障害の４番目に大きな要因を占めている。自己免疫疾患による社会、経済、および健康への影響が広範囲に及ぶことは明らかである。
自己免疫疾患の発病は、主に自己抗原の認識およびサイトカイン産生の不均衡によって支配される複雑な組織障害機構網を伴う。Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．＆Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４，３９７−４４０（１９９６）。
Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｊ．＆Ｋｏｔｚｉｎ，Ｂ．Ｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ｗｈｙ ａｎｄ ｗｈｅｒｅ ｉｔ ｏｃｃｕｒｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ７，８９９−９０５（２００１）。未だ病因不明の一般的かつ消耗性の自己免疫疾患である関節リウマチ（ＲＡ）において、関節における慢性炎症、ならびに、後続の軟骨破壊および骨びらんの原因である主要な細胞型は、マクロファージ、滑膜繊維芽細胞、好中球、およびリンパ球である。
サイトカインは、自己免疫疾患にも関与している。サイトカインは、抗原によって活性化されると細胞によって放出され、細胞間伝達に携わると見られているタンパク質分子であり、白血球における特異的な細胞表面受容体との相互作用を通じて、免疫応答のための増強伝達体として作用する。インターロイキン、リンフォカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む、様々な異なる種類のサイトカインがある。
抗体ベースの治療法等、現在利用可能な自己免疫疾患の治療は、様々な自己免疫疾患を効果的に治療することができない。したがって、自己免疫疾患の治療に対する治療的アプローチを改良する重大な必要性が残る。この必要性を満たすためには、現在の抗体ベースの治療法における欠陥を克服し、様々な自己免疫疾患を治療し、処置が容易かつ効率的であり、免疫応答を誘発することなく繰り返し施すことのできる治療法を有することが有用であろう。免疫複合体の使用を抗ＴＮＦ剤等の抗サイトカイン剤と組み合わせる治療法等、自己免疫疾患の治療において高度な有効性を提供する併用療法の必要性もある。
本発明は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記被験者に治療効果のある量のＢ細胞除去剤を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の実施形態は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記被験者に、治療効果のある量の（ａ）Ｂ細胞除去剤と、（ｂ）少なくとも１つの抗サイトカイン剤とを投与するステップを含む方法を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記被験者に、式Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍを有し、
式中、
ＰｒはＢ細胞除去剤であり、
ＸはＢ細胞除去剤と反応することができる任意の反応基の生成物を含むリンカーであり、
Ｗは細胞毒性薬であり、
ｍは細胞毒性薬が複合体重量の７〜９％を構成するような精製した複合生成物の平均装填量であり、
（−Ｘ−Ｗ）ｍは細胞毒性薬派生である、
低複合画分（ＬＣＦ）を減少させた、治療効果のある量の単量体の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明のよりさらなる実施形態は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記自己免疫疾患を持つ前記被験者に、式Ｐｒ（−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ）ｍを有し、
式中、
Ｐｒは抗ＣＤ２２抗体であり、
Ｘは抗体と反応することができる反応基の生成物を含む加水分解型リンカーであり、
Ｗはカリチェアミシンラジカルであり、
ｍはカリチェアミシンが複合体重量の４〜１０％を構成するような精製した複合生成物の平均装填量であり、
（−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ）ｍはカリチェアミシン派生である、
治療効果のある量の単量体のカリチェアミシン派生／抗ＣＤ２２抗体複合体を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明のよりさらなる実施形態は、治療効果のある量の単量体の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体の安定凍結乾燥組成物を投与するステップを含む、被験者における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記複合体は、前記単量体の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体を、重量濃度１．５％〜５％の抗凍結剤と、重量濃度０．５％〜１．５％の高分子充填剤と、濃度０．０１Ｍ〜０．１Ｍの電解液と、重量濃度０．００５〜０．０５％の溶解促進剤と、前記溶体の最終ｐＨが７．８〜８．２となるような濃度５〜５０ｍＭの緩衝剤と、水とを含む溶体中に、０．５〜２ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるまで溶解するステップと、上記溶体を温度＋５℃〜＋１０℃でバイアルに分注するステップと、凍結温度−３５℃から−５０℃で前記溶体を凍結するステップと、前記凍結した溶体に、一次乾燥圧２０〜８０ミクロン、棚温度−１０℃〜−４０℃で２４〜７８時間、初回凍結乾燥ステップを受けさせるステップと、ステップ（ｄ）の前記凍結乾燥した生成物に、乾燥圧２０〜８０ミクロン、棚温度＋１０℃〜＋３５℃で１５〜３０時間、二次乾燥ステップを受けさせるステップとを含む方法によって調製される方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記被験者に治療効果のある量の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体を投与するステップを含み、前記Ｂ細胞除去剤は抗体である方法を提供する。
本発明のさらに別の実施形態は、被験者における自己免疫疾患を治療するための方法であって、前記被験者に治療効果のある量のＢ細胞除去剤を投与するステップを含み、前記Ｂ細胞除去剤はＣＤ２２、ＣＤ１９、またはＣＤ２０に対するヒト化抗体である方法を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、被験者に治療効果のある量の本明細書に説明するような複合体を投与するステップを含む、被験者における自己免疫疾病の治療のための薬物の調製において、前記複合体の使用を提供する。
本発明のよりさらなる実施形態は、（ａ）少なくとも１つのＢ細胞除去剤に複合された少なくとも１つの細胞毒性薬を含む細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体と、（ｂ）少なくとも１つの抗サイトカイン剤とを含む組成物を提供する。
（図面の簡単な記載）
図１は、マウス単クローン性抗体５／４４（配列番号：１〜６）のＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
図２は、カリチェアミシン（ＣＤ２２／ｃａｌ）と複合されたＣｙ３４．１ｍＡｂが、Ｂ細胞上で結合し、ＬＰＳ刺激を受けて増殖応答を抑制することを示す。（ａ）ＣＤ２２／ｃａｌの構造、カリチェアミシンのＣＤ２２標的免疫複合体。（ｂ）Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞を、Ｃｙ３４．１またはＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体で染色した。（ｃ）ＬＰＳで刺激し、Ｃｙ３４．１またはＣＤ２２／ｃａｌの濃度を増加させて４８時間インキュベートした初代マウスＢ細胞の増殖。（ｄ）ＬＰＳで刺激し、ＣＤ２２／ｃａｌまたは対照Ｊ１１０／ｃａｌ抗体の濃度を増加させて４８時間インキュベートした初代マウスＢ細胞の増殖。（ｅ）ＣＤ２２／ｃａｌまたは対照Ｊ１１０／ｃａｌＡｂの濃度を増加させて４８時間のインキュベート後、ＴＣＲ副刺激までの初代マウスＴ細胞の増殖。
図３は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体の生体内細胞毒性効果を図示している。（ａ）２度のＣＤ２２／ｃａｌ注射の前（事前）および１２日後（事後）の、ＰＢ、脾臓、ＢＭ、およびＬＮにおけるＣＤ２２＋Ｂ細胞のパーセンテージ。（ｂ）１２日目の検体にＣＤ１９発現のための染色も行った。（ｃ）ＣＤ２２およびＣＤ１９の発現のために、未治療のｗｔＢ６マウスの有効組織検体を二重染色した。
図４は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧｒ−１＋骨髄性細胞におけるＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体の生体内効果を図示している。２度のＣＤ２２／ｃａｌ注射の前（事前）および１２日後（事後）の、ＰＢ、脾臓、ＢＭ、およびＬＮ検体におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（ａ）およびＧｒ−１＋骨髄性細胞（ｂ）のパーセンテージ。（ｃ）０日目および５日目にＣＤ２２／ｃａｌを注射したマウスの有効組織を５０日目に採取し、ＣＤ２２発現のために染色した。
図５は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体によるＢ細胞除去が臨床関節炎の進行を抑制することを図示している。Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの群を０日目にＣＦＡ中のII型コラーゲンで免疫し、５日目および１０日目にＰＢＳ（ａ）またはＣＤ２２／ｃａｌ（ｂ）を注射した。半定量スコアリングシステムを使用して、足の臨床関節炎を評価した。実行した２つの代表的実験を示す。
図６は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体によるＢ細胞除去が関節炎の組織学的所見を抑制することを図示している。Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの群を０日目にＣＦＡ中のII型コラーゲンで免疫し、５日目および１０日目にＰＢＳ（非処理）またはＣＤ２２／ｃａｌ（Ｂ細胞除去済）を注射した。II型コラーゲンによる免疫後２５日目（ａ、ｂ）または７５日目（ｃ、ｄ）に、２つの異なる実験から組織病理学的評価用の足を採取した。
図７は、ＣＤ２２／ｃａｌの投与が、ＲＳＶのＦタンパク質で免疫されたＢ６マウスにおける抗Ｆタンパク質抗体滴定濃度を変化させないことを明示している。Ｂ６マウス（Ｆ／ＡｌＰＯ）における（ａ）血清ＩｇＭおよび（ｂ）血清ＩｇＧ滴定濃度を、０週目および２週目（黒矢印）にＦタンパク質で免疫した。対照マウス（ＰＢＳ）は免疫しなかった。４週目および４週＋５日目（白矢印）に、Ｆ／ＡｌＰＯおよびＰＢＳマウスにＣＤ２２／ｃａｌを受けさせるか、ＰＢＳのみに投与した。１２週目に、全てのマウスに感染性ＲＳＶ（★）を投与した。
図８（ａ）は、ＣＤ２２／ｃａｌまたはＧＧ５／ｃａｌを注射されたＢ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの臨床関節炎スコアを示す。
図８（ｂ）は、標準ＥＬＩＳＡにより測定されるようなII型コラーゲンに対するＣＩＡの経過中の血清ＩｇＧ２ｂ抗体価を示す。
この開示の目的のため、「病気（病）」「疾患」「内科的障害」「内科的状態」「異常状態」等の用語は同義的に使用される。
「Ｂ細胞除去剤」という用語は、本明細書において使用する場合、有機体におけるＢ細胞血中濃度を低下させる、または、有機体におけるＢ細胞の活性を低下させる、もしくはそれを妨害する、任意の媒介物（例えば、抗体、拮抗薬等）をいう。
本明細書において使用する場合、「細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体」という用語は、当業者には既知である任意の方式で任意のＢ細胞除去剤等と複合した任意の細胞毒性薬、細胞毒性薬派生等を含む、任意の構成を表す。この説明において使用する場合、「細胞毒性薬」という用語は、「細胞毒性薬派生」という用語と同義的に使用される。これは、複合体中の細胞毒性薬が、複合体を調製するために使用された細胞毒性薬の誘導体化形である場合があることを意図している。
「抗サイトカイン剤」という用語は、本明細書において使用する場合、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン、リンフォカイン、インターフェロン、および特にサイトカインに結合する媒介物等、サイトカインの活性を低下させる任意の媒介物をいう。
「単離した」または「精製した」という用語は、この明細書の文脈で、タンパク質組成物等の組成物の純度を定義するために使用する場合、その組成物は、自然または内在性由来のその他の構成要素を実質的に含んでおらず、製造過程の残留汚染物質を約１質量％未満含有することを意味する。しかしながら、該当する組成物は、安定剤、カーダー、賦形剤、または補助治療薬として追加されるその他のタンパク質を含んでよい。例えば、ＴＮＦＲは、銀染色法によってポリアクリルアミドゲル中において単一のタンパク質バンドとして検出可能である場合、単離していると見なされる。
「組み換え」は、本明細書において使用する場合、タンパク質が組み換え（例えば、微生物または哺乳類の）発現系に由来するものであることを意味する。「微生物（の）」は、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系で作られた組み換えタンパク質をいう。「組み換え微生物」は、天然内因性物質を本質的に含んでいない微生物の発現系において製造されたタンパク質を生成物として定義するものである。ほとんどの細菌培養において発現されるタンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）は、グリカンを含んでいないことになる。酵母において発現されるタンパク質は、哺乳類細胞において発現されたものと異なる糖鎖付加パターンを有する場合がある。
タンパク質受容体、例えばＴＮＦ受容体の特性として明細書を通して使用される「生物学的に活性な」は、特定の分子が、例えばハイブリッド受容体構成の構成要素として、検出可能な量の、タンパク質刺激を細胞へ伝達するタンパク質、例えばＴＮＦを結合できる、または、タンパク質に対する抗体、例えば自然の（すなわち、非組み換え型の）源からＴＮＦＲに対して作製された抗ＴＮＦＲ抗体と交差反応できるとして本明細書において開示される本発明の実施形態と、十分なアミノ酸配列類似性を共有することを意味する。好ましくは、本発明の範囲内の生物学的に活性なＴＮＦ受容体は、標準結合アッセイにおいて、ｎモルの受容体につき０．１ｎモル超のＴＮＦ、最も好ましくは、ｎモルの受容体につき０．５ｎモル超のＴＮＦを結合することができる。
本明細書において使用する場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用して、その抗原に対する特異性および親和性を抗体に与えるアミノ酸残基を含有する、抗体分子の部分をいう。抗体領域は、抗原結合残基の適切な立体構造を維持するために必要な「骨格」アミノ酸残基を含む。
本明細書において使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、一価、二価、または多価免疫グロブリンを含む。一価キメラ抗体は、ジスルフィド架橋を通じてキメラＬ鎖と結び付いたキメラＨ鎖によって形成された二量体（ＨＬ）である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を通じて結び付いた２つのＨＬ二量体によって形成された四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価キメラ抗体は、例えば、（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖、またはｍｕ鎖から）凝集するＣＨ領域を用いることによって製造することもできる。
「治療効果のある量」という語句は、本明細書において使用する場合、少なくとも、治療される個体に、治療されている状態の臨床的影響を低減する応答を生成させるために、各一回投与量において、または一連の投与量の一部として、被験者（好ましくは、ヒト）に投与される量をいう。投薬量は、個体の特異的状態によって異なる場合がある。投与する一定の量は、本明細書において提供される指導に基づいて、当業者には既知である手段により、ルーチン試験または別の手法において決定され得る。
本明細書において使用する場合、「治療効果のある量の」治療剤を「投与する」という語句は、患者が、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、基準を超える持続的改善を誘発するのに十分な量の媒介物および時間で治療されることを意味する。改善は、患者が、１週間以上に分けられる少なくとも２つの機会において改善を示す場合に「持続的」であると見なされる。改善度は兆候または症状に基づいて測定され、測定には、生活の質アンケート等、患者に施行されたアンケートを用いてもよい。
本明細書において使用する場合、「腫瘍壊死因子」または「ＴＮＦ」という用語は、ＴＮＦアルファおよび／またはＴＮＦベータをいう。
「ＴＮＦ受容体」および「ＴＮＦＲ」という用語は、タンパク質アミノ酸配列を結合する天然哺乳類のＴＮＦ受容体またはＴＮＦと実質的に同様であり、かつ、ＴＮＦ分子を結合することができ、ＴＮＦが細胞膜結合型ＴＮＦＲに結合するのを抑制することができるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
フローサイトメトリー分析によってＢ細胞除去の特性、ならびに、ナイーブマウスから採取した末梢血（ＰＢ）、脾臓、骨髄（ＢＭ）、およびリンパ節（ＬＮ）検体の回復を検査するために、新規マウスＢ細胞標的細胞毒性免疫複合体（カリチェアミシンと複合した抗ＣＤ２２ｍＡｂ抗体）を発現させた。検査は、マウスコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける臨床および組織学的関節炎の進行ならびにＲＳＶ感染症のマウスモデルにおける液性免疫応答にＢ細胞除去が及ぼす影響を示した。これらの検査結果により、免疫複合体を２度注射することによるＢ細胞の除去は、ＣＩＡモデルにおける臨床および組織学的関節炎を抑制し、一方、同じ手順は、ＲＳＶワクチン接種モデルにおいて、肺から採取した感染症ウィルスの攻撃および撤去後の記憶抗体応答に悪影響を及ぼさないことがわかる。これらの結果は、マウス自己免疫およびワクチン接種モデルにおけるＣＤ２２標的Ｂ細胞除去の役割に新規の見識を提供する。
本発明は、自己免疫疾患の治療において効果のある組成物および方法を対象としている。特に、本発明は、Ｂ細胞除去剤（例えば、ヒト化抗体）、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体、抗サイトカイン剤（例えば、抗ＴＮＦ剤）、およびそれらの組み合わせを提供する。
本発明の複合体は、抗体または好ましくはヒト化抗体等のＢ細胞除去剤を含む。本発明は、抗体と細胞毒性薬との複合体に関し、ここで抗体はＢ細胞上の抗原決定基に対する特異性を有する。本発明は、免疫複合体を製造する方法およびそれらの治療的使用にも関する。
抗サイトカイン剤は、本発明のＢ細胞除去剤および／または細胞毒性薬と組み合わせて使用してよい。本発明は、抗サイトカイン剤を本発明の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体と組み合わせて使用することを意図している。本発明は、治療効果のある量の抗サイトカイン剤を、単独で、またはＢ細胞除去剤、細胞毒性薬、もしくはその複合体と組み合わせて、好ましくは、医薬的に許容し得る希釈剤等の適合する薬物送達システムに含む組成物を提供する。本発明は、自己免疫疾患を治療するために前記組成物を使用する方法を提供する。本明細書において提供される指導に基づいて、当業者は、本発明の実装に従い、該当する化合物または組成物を容易に識別することができるであろう。
本発明の複合体は、本明細書において説明するように、単独で、または、本発明の１つ以上の化合物、もしくは抗サイトカイン剤等の他の媒介物と組み合わせて投与することができる。本明細書において説明するように、媒介物は同時もしくは実質的に異なる時間に投与される分離組成物として調合されてもよいし、または、媒介物は単一組成物中に与えられてもよい。
本発明の複合体は、好ましくは、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体を形成するためにＢ細胞除去剤と反応する任意の反応基を含むリンカーによって誘導化された細胞毒性薬を含む。具体的には、本発明の複合体は、細胞毒性薬／抗体複合体を形成するためにＢ細胞除去剤として使用される抗体と反応する反応基を含むリンカーによって誘導体化された細胞毒性薬を含む。具体的には、抗体は一定のＢ細胞に発現された細胞表面抗原に反応する。以下に説明するのは、該当する複合体を作り、生成する改良された過程である。分離過程とともに特定の共溶媒、添加剤、および特異反応条件を使用することにより、低複合画分（ＬＣＦ）を大幅に減少させた、単量体の細胞毒性薬／抗体複合体の形成が生じる。単量体型は、凝集型とは対照的に重大な治療的価値を有し、ＬＣＦを最小化し凝集を大幅に低減させて、ＬＣＦがより高い複合画分（ＨＣＦ）と競争するのを防止することによって、治療的に有意義な方式での抗体出発原料の利用をもたらす。
Ｂ細胞除去剤
本発明は、細胞表面抗原決定基に対する特異性を有するＢ細胞除去剤を提供する。Ｂ細胞除去剤は、細胞毒性薬および／または抗サイトカイン剤等の他の媒介物と組み合わせて、または単独で、組成物の一部として、ならびに任意で医薬的に許容し得る希釈剤とともに投与されることができる。Ｂ細胞除去剤は、単剤療法の一部として、または、細胞毒性薬、抗サイトカイン剤、および／もしくは他の媒介物との併用療法の一部として投与されることができる。
Ｂ細胞除去剤は、ホルモン、成長因子、抗体、抗体断片、抗体模倣体、およびそれらの遺伝子的または酵素的処理対応物を含み、以下、単数でまたは集団的に、「Ｂ細胞除去剤」と称する。好ましくは、Ｂ細胞除去剤は、一定の細胞に関連する抗原または受容体を認識してそれに結合し、続いて内在化される能力を有する。本発明において適用可能なＢ細胞除去剤の例は、米国特許第５，０５３，３９４号において開示され、当該特許はその全体が本明細書に組み込まれる。本発明で使用するための好適なＢ細胞除去剤は、抗体および抗体模倣体である。
本発明が意図する抗体は、標的細胞を破壊または妨害するために内在性受容体に結合することを必要としないエフェクター抗体、および、細胞を破壊または妨害するために内在性受容体に結合することを必要とする抗体を含む。好ましくは、内在性受容体に結合することを必要とする抗体が細胞毒性剤に複合される。
本発明は、Ｂ細胞除去剤としてのヒト化抗体と、ヒト化抗体を含む組成物とを提供する。自己免疫疾患の治療のため、治療効果のある量の、本明細書に記載されているヒト化抗体を患者に投与する方法も意図されている。
抗体の特異性を持つ抗原エピトープに結合する抗体模倣体を生成するためには、多くの非免疫グロブリンタンパク質足場が使用されてきた（ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／３４７８４号）。例えば、免疫グロブリンフォールドに関連する「ミニボディ」足場は、単クローン性抗体の重鎖可変ドメインから３つのベータストランドを削除することによって設計されてきた（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９、１９９４）。このタンパク質は６１残基を含み、２つの超可変ループを提示するために使用することができる。これらの２つのループは任意抽出されたものであり、抗原結合のために選択された生成物であるが、これまでのところこの骨格は溶解性の問題により幾分有用性が限られているようである。ループを表示するために使用される別の骨格は、テンダミスタット、つまり、哺乳類のアルファアミラーゼを特異的に抑制し、２つのジスルフィド結合によってまとめられた６ストランドベータシートサンドイッチという７４残基であるタンパク質である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０、１９９５）。この足場は３つのループを含むが、これまでのところ、これらのループのうち２つについてのみ任意抽出潜在性が検査されている。
他のタンパク質が、骨格としてテストされ、任意抽出された残基をアルファらせん表面上に（Ｎｏｒｄ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２、１９９７；Ｎｏｒｄ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１、１９９５）、アルファらせん束内のアルファらせん間にループを（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６５５２、１９９５）、および微細なプロテアーゼ阻害剤（Ｍａｒｋｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：８０４５、１９９６；Ｍａｒｋｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：８０５８、１９９６；ＲｏｔｔｇｅｎおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｇｅｎｅ １６４；２４３、１９９５；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：１２２５０、１９９５）等の、ジスルフィド架橋により拘束されたループを表示するために使用されてきた。
本発明において使用できるＢ細胞除去剤の例は、単クローン性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびそれらの生物学的に活性な断片を含む。好ましくは、該当する抗体は、標的細胞上に発現された細胞表面抗原に対するものである。標的細胞上の細胞表面抗原に対する特異的な抗体の例は、ほとんどのＢ細胞リンパ腫上に過剰発現したＣＤ２２抗原に対する抗体；Ｇ５／４４、マウス抗ＣＤ２２単クローン性抗体のヒト化型を含むがこれらに限定されない。また、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））等の市販の抗体がいくつかあり、当該抗体をＢ細胞除去剤として使用してもよい。
本発明におけるＢ細胞除去剤として使用するために本明細書において例示されるのは、細胞表面抗原ＣＤ２２に対するＣＤＲグラフトヒト化抗体分子、指定済みのＧ５／４４である。この抗体は、細胞表面抗原ＣＤ２２に対するマウス抗ＣＤ２２単クローン性抗体のヒト化型であり、当該抗体は、一定のヒトリンパ腫においてよく見られる。「ＣＤＲグラフト抗体分子」という用語は、本明細書で使用する場合、重鎖および／または軽鎖が、必要に応じて、供与体抗体（例えば、マウス単クローン性抗体）からアクセプタ抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域骨格へグラフト化された、修飾ＣＤＲ（以下、ＣＤＲ）を含む、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する抗体分子をいう。好ましくは、該当するＣＤＲグラフト抗体分子は、上記で言及した１つ以上の供与体ＣＤＲに加えて、ヒトアクセプタ骨格領域を含む可変ドメインを有する。
ＣＤＲがグラフト化される場合、任意の適切なアクセプタ可変領域骨格配列が、マウス、霊長類およびヒト骨格領域を含む、ＣＤＲが派生した供与体抗体の分類／種類を考慮して使用され得る。本発明において使用され得るヒト骨格の例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑ．ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、１：３１０−３３４（１９９４））。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは重鎖および軽鎖の双方に使用することができる。
本発明のＣＤＲグラフト抗体においては、供与体抗体の鎖と相同である鎖を有するものをアクセプタ抗体として使用することが好ましい。アクセプタ重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体から派生したものでなくてもよく、必要に応じて、異なる鎖から派生した骨格領域を有する合成鎖を含んでよい。
また、本発明のＣＤＲグラフト抗体において、骨格領域は、アクセプタ抗体と全く同じ配列を有している必要はない。例えば、異常残基は、当該アクセプタ鎖分類または種類により頻繁に発生する残基に変更される場合がある。あるいは、アクセプタ骨格領域において選択された残基は、供与体抗体の同じ位置に見られる残基、または供与体抗体の同じ位置に見られる残基との同類置換である残基に対応するように変更されてもよい。そのような変更は、供与体抗体の親和性を回復するために必要な最小限にとどめるべきである。変更が必要とされ得るアクセプタ骨格領域における残基選択の手順については、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７号において説明されており、当該公報はその全体が本明細書に組み込まれる。
供与体残基は、供与体抗体、すなわち、ＣＤＲが最初に派生した抗体からの残基である。
本発明の抗体は重鎖を含んでよく、ここで可変ドメインは（Ｋａｂａｔ等（上記）によって定義されるように）ＣＤＲ‐Ｈ２として、抗原に対する抗体の親和性を向上させるために潜在的糖鎖付加部位配列が取り除かれたＨ２’を含む。
代替として、または追加で、本発明の抗体は重鎖を含んでよく、ここで可変ドメインは（Ｋａｂａｔ等（上記）によって定義されるように）ＣＤＲ‐Ｈ２として、リジン残基が位置６０にあるＨ２’’を含む。ＣＤＲ−Ｈ２内の露出位置に位置付けられ、複合剤と反応する潜在性を有し、結果として抗原結合親和力を低下させると見なされるこのリジン残基は、代替のアミノ酸に置換される。
また、本発明の抗体は重鎖を含んでよく、ここで可変ドメインは（Ｋａｂａｔ等（上記）によって定義されるように）ＣＤＲ‐Ｈ２として、潜在的的糖鎖付加部位配列および位置６０のリジン残基がいずれも代替のアミノ酸に置換されたＨ２’’’を含む。
本発明の抗体は、完全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ断片等の生物学的に活性なその断片、軽鎖もしくは重鎖の単量体もしくは二量体、または、一本鎖抗体、例えば重鎖および軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによって繋がれた一本鎖Ｆｖを含んでよい。同様に、重鎖および軽鎖可変領域は、必要に応じて他の抗体ドメインと組み合わせてよい。
本発明の抗体は修飾されたＦａｂ断片を含んでもよく、ここで修飾は、その重鎖のＣ末端へのエフェクターまたはレポーター分子の付着を可能にする１つ以上のアミノ酸の追加である。好ましくは、追加のアミノ酸は、エフェクターまたはレポーター分子が付着できる１つまたは２つのシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ領域を形成する。
本発明の抗体の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体の提案されている機能、および特に必要かどうかわからないエフェクター機能を考慮して選択できる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体が治療的使用を意図したものであり、抗体エフェクター機能が必要とされる場合には、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのものが使用される場合がある。あるいは、抗体が治療目的を意図したものであり、抗体エフェクター機能が必要でも望ましくもない場合には、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプが使用される場合もあり、またはＩｇＧ１Ｆｃ領域がエフェクター機能を無効にするように突然変異する場合もある。
本発明の抗体は、少なくとも５×１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０−９Ｍ、より好ましくは少なくとも０．７５×１０−１０Ｍ、最も好ましくは少なくとも０．５×１０−１０Ｍの結合親和力を有する。
本発明のＢ細胞除去剤の限定的でない例は、以下を含む：ヒトＣＤ２２に対する特異性を有し、重鎖であって、可変ドメインが、図１においてＣＤＲ−Ｈ１を表すＨ１（配列番号：１）として、図１においてＣＤＲ−Ｈ２を表すＨ２（配列番号：２）もしくはＨ２’（配列番号：１３）もしくはＨ２’’（配列番号：１５）もしくはＨ２’’’（配列番号１６）として、または、図１においてＣＤＲ−Ｈ３を表すＨ３（配列番号：３）として与えられる配列のうち少なくとも１つの配列を有するＣＤＲを含む重鎖と、軽鎖であって、可変ドメインが、図１においてＣＤＲ−Ｌ１を表すＬ１（配列番号：４）として、図１においてＣＤＲ−Ｌ２を表すＬ２（配列番号：５）として、または、図１においてＣＤＲ−Ｌ３を表すＬ３（配列番号：６）として与えられる配列のうち少なくとも１つを有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、抗ＣＤ２２抗体；重鎖であって、可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１を表す配列番号：１、ＣＤＲ−Ｈ２を表す配列番号：２もしくは配列番号：１３もしくは配列番号：１５もしくは配列番号：１６、または、ＣＤＲ−Ｈ３を表す配列番号：３において与えられる配列のうち少なくとも１つを有するＣＤＲを含む重鎖と、軽鎖であって、可変領域が、ＣＤＲ−Ｌ１を表す配列番号：４、ＣＤＲ−Ｌ２を表す配列番号：５、または、ＣＤＲ−Ｌ３を表す配列番号：６において与えられる配列のうち少なくとも１つを有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、抗ＣＤ２２抗体；ＣＤＲ−Ｈ１を表す配列番号：１、ＣＤＲ−Ｈ２を表す配列番号：２もしくは配列番号：１３もしくは配列番号：１５もしくは配列番号：１６、または、ＣＤＲ−Ｈ３を表す配列番号：３、ＣＤＲ−Ｌ１を表す配列番号：４、ＣＤＲ−Ｌ２を表す配列番号：５、および、ＣＤＲ−Ｌ３を表す配列番号：６を含む抗ＣＤ２２抗体；ＣＤＲグラフト抗ＣＤ２２抗体であり、ヒトアクセプタ骨格領域および非ヒト供与体ＣＤＲを含む可変ドメインを含む、ヒト化抗ＣＤ２２抗体；ヒトアクセプタ骨格領域を有し、ここで抗体の重鎖の可変ドメインの領域は、ヒト亜群Ｉコンセンサス配列に基づき、位置１、２８、４８、７１、および９３において非ヒト供与体残基を含む、ヒト化抗ＣＤ２２抗体；位置６７および６９において非ヒト供与体残基をさらに含む、上述のヒト化抗体；ヒト亜群Ｉコンセンサス配列に基づくヒトアクセプタ骨格領域を含み、位置２、４、３７、３８、４５、および６０において非ヒト供与体残基をさらに含む軽鎖の可変ドメインを含む、ＣＤＲグラフトヒト化抗体；位置３において非ヒト供与体残基をさらに含む、前述のようなＣＤＲグラフト抗体；軽鎖可変領域５／４４−ｇＬ１（配列番号：１９）および重鎖可変領域５／４４−ｇＨ７（配列番号：２７）を含む、前述のようなＣＤＲグラフト抗体；配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖と、配列番号３０に記載の配列を有する重鎖とを含む、ＣＤＲグラフト抗体；配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖と、配列番号３０に記載の配列を有する重鎖とを含む、ＣＤＲグラフト抗体；親和性成熟手順によって得られた変異抗体であり、ヒトＣＤ２２に対する特異性を向上させた、抗ＣＤ２２ＣＤＲグラフト抗体；配列番号：７および配列番号：８にそれぞれ記載の単クローン性抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインの配列を含むキメラ抗体である、抗ＣＤ２２抗体；欠失供与体ＣＤＲ配列を持つハイブリッドＣＤＲを含み、ここで供与体ＣＤＲの紛失部分は異なる配列に置き換えられ、機能的なＣＤＲを形成する、抗ＣＤ２２抗体。
好ましくは、本発明のヒト化抗ＣＤ２２抗体は、軽鎖可変領域５／４４−ｇＬ１（配列番号：１９）と重鎖可変領域５／４４−ｇＨ７（配列番号：２７）とを含むＣＤＲグラフト抗体、配列番号：２８に記載の配列を有する軽鎖を含むＣＤＲグラフト抗体、配列番号：３０に記載の配列を有する重鎖を含むＣＤＲグラフト抗体、配列番号：２８に記載の配列を有する軽鎖と、配列番号：３０に記載の配列を有する重鎖とを含むＣＤＲグラフト抗体、または、親和性成熟手順によって得られた変異抗体であり、ヒトＣＤ２２に対する特異性を向上させた、ＣＤＲグラフト抗体である。
本発明は、Ｂ細胞除去剤として、組み換え（または組み換え技術によって調製された）タンパク質またはポリペプチドの使用を意図している。例えば、本発明の組み換えポリペプチドまたはタンパク質は、本明細書における参照配列と同一である、すなわち１００％同一の組み換えであってよく、または、同一％が１００％未満となるような、参照配列と比較して多くのアミノ酸変化を含んでよい。該当する変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、同類および非同類置換を含む置換、または挿入を含む。それらの変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで、参照アミノ酸配列内のアミノ酸に個々に散在して、または、参照アミノ酸配列内の１つ以上の隣接基において生じ得る。
このようにして、本発明は、配列表に含有されるアミノ酸配列との配列同一性を有するタンパク質も提供する。特定の配列にもよるが、配列同一性の程度は、好ましくは６０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．９％、またはそれ以上）である。これらの相同タンパク質は、突然変異体および対立遺伝子変異体を含む。ポリペプチドは、任意の断片または列挙されたポリペプチドの生物学的等価物であってよい。
この発明は、生物学的等価物である、ポリペプチドの対立遺伝子またはその他の変異体にも関する。適合する生物学的等価物は、本明細書において特定したタンパク質またはポリペプチドのうちの１つに対し、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは約８０％、さらにより好ましくは約８５％、さらにより好ましくは約９０％、さらにより好ましくは９５％、またはさらにより好ましくは９８％、またはさらにより好ましくは９９％の類似性を有する（すなわち、等価物が本発明のタンパク質のうち１つと実質的に同じ生物学的性状を引き出すことができる場合）。
生物学的等価物は、変異体およびこの発明のタンパク質への修飾を生成することによって得られる。これらの変異体およびタンパク質への修飾は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠損、または置換によってアミノ酸配列を変化させることによって得られる。アミノ酸配列は、例えば、実質的に同じまたは改良された質を有するポリペプチドを作成するために、置換によって修飾される。変化を導く好適な手段は、部位指定突然変異誘発によってポリペプチドの核酸配列の所定の突然変異体を作ることを含む。
修飾および変更は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの構造（例えば、担体、抗体、ヒト化抗体等）内において、機能的同義性（治療的利益、結合親和力等）を保持しながらなされ得る。該当する修飾および変化は、すべて本発明が意図するものである。例えば、これに限定されるものではないが、一定のアミノ酸は、機能性／有用性（例えば、治療的利益等）をそれほど損失することなく、配列内において非保存および保存置換を含む他のアミノ酸への置換を行うことができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義することは当該ポリペプチドの相互作用的な能力および性質であるため、多くのアミノ酸配列置換はポリペプチド配列（または、当然ながら、その基礎をなすＤＮＡコード配列）においてなされることができ、それにもかかららず、類似の性状を持つポリペプチドを得ることができる。本発明は、ポリペプチドをコード化する核酸配列に加えて、本明細書における前記ポリペプチドの構造への任意の変化を意図しており、当該ポリペプチドはその機能性または生物学的に等価の機能性を保持する。当業者は、本明細書において提供される指導に基づいて、本発明の発明概念および目的との整合性を保持しながら、開示したポリペプチドおよびポリヌクレオチドを定期的に適宜修飾することが容易にできるであろう。
そのような変更を行う際において、当業者に既知である任意の技術を利用してよい。例えば、これに限定することを意図しないが、アミノ酸の水治療法索引が考えられる。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を与えることにおける水治療法アミノ酸索引の重要性は、当該技術分野においては概して理解されている。Ｋｙｔｅ等、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ、１５７：１０５−１３２。
類似アミノ酸の置換は、親水性を基準に行うこともできる。参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、ポリペプチドの最も大きな局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性に支配されるため、その機能性、すなわちポリペプチドの生物学的性状と相関すると述べている。
ポリペプチドの生物学的等価物は、部位特異的な突然変異誘発を使用して調製することもできる。部位特異的な突然変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特異的な突然変異誘発によってその配列から派生した第２世代ポリペプチド、または、生物学的に機能等価であるポリペプチドもしくはペプチドの調製において有用な技術である。該当する変更は、アミノ酸置換が望ましい場合において望ましい。この技術は、例えば、１つ以上のヌクレオチド配列変更をＤＮＡへ導くことにより、前述の考慮事項のうち１つ以上を組み込む配列変異体を調製およびテストするための準備能力をさらに提供する。部位特異的な突然変異誘発は、横断されている欠損接合点の両側に安定な二本鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供するために、十分な数の隣接するヌクレオチドに加えて、望ましい突然変異体のＤＮＡ配列をコード化する特異的オリゴヌクレオチド配列の使用を通じて、突然変異体の製造を可能にする。一般に、約１７〜２５ヌクレオチド長で、変化を加えられている配列の接合点の両側において約５〜１０残基を持つプライマーが望ましい。
概して、部位特異的な突然変異誘発の技術は、当該技術分野において周知である。当然のことながら、この技術は一般に、シングルストランドおよびダブルストランド型の双方に存在し得るファージベクターを用いる。一般に、本明細書による部位指定突然変異誘発は、まず選択されたポリペプチド配列の全部または一部をコード化するＤＮＡ配列をその配列内に含むシングルストランドベクターを得ることによって実行される。突然変異した望ましい配列を持っているオリゴヌクレオチドプライマーが（例えば合成的に）調製される。突然変異を持っているストランドの標識を完了するために、このプライマーは続いて一本鎖ベクターにアニールされ、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片等の酵素の使用によって伸長される。このようにして、ヘテロ二本鎖が形成され、ここで１つのストランドが元の突然変異していない配列をコード化し、第２のストランドが望ましい突然変異を持っている。このヘテロ二本鎖ベクターは、次いで、突然変異を持っている組み換えベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）細胞および選択されたクローン等の適切な細胞を変換するために使用される。市販のキットには、オリゴヌクレオチドプライマーを除く必要な試薬がすべて付属している。
本発明のポリペプチドは、本明細書において特異的に識別された配列の１つからのアミノ酸配列を有するタンパク質との実質的な配列類似性および／または生物学的等価性を含む任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。また、本発明のポリペプチドは、特定の源に限定されない。また、ポリペプチドは、当業者に既知であるように、本明細書において提供した指導に基づき、または当該技術分野において既知であるようなその他任意の合成手法で、本明細書に記載したような本発明の目的に従って該当する技術を使用する組み換え技術によって調製されることもできる。
本発明において意図されているのは、ポリペプチドが、さらなる構造的もしくは機能的分析において、または、関連ポリペプチドおよび特異抗体等の試薬の世代において使用するための断片に有利に切断されることである。これは、精製した、または精製していないポリペプチドを、エンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（ベーリンガー、インディアナポリス、インディアナ州）等のぺプチターゼで処理することによって実現され得る。ポリペプチドからペプチド断片を製造できる別の方法は、ＣＮＢｒによる処理である。タンパク質の特異的断片を製造するために、組み換え技術を使用してもよい。
「変異体」という用語は、本明細書において使用する場合、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な性状は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が、別の参照ポリヌクレオチドと異なる。変異体のヌクレオチド配列における変更は、参照ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる場合もさせない場合もある。ヌクレオチド変更は、以下で論じるように、参照配列によってコード化されたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、追加、欠損、融合、および欠失を生じさせる。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が、別の参照ポリペプチドと異なる。概して、参照ポリペプチドの配列および変異体が極めて類似し、多くの領域で同一である（すなわち、生物学的に等価である）ように、相違点は限定される。変異体と参照ポリペプチドは、１つ以上の置換、追加、欠損の任意の組み合わせにより、アミノ酸配列が異なる場合がある。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコード化されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体等の自然発生型であってもよいし、または、自然発生しないことが知られている変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生型変異体は、突然変異誘発技術または直接標識法によって作ることができる。
同一性」は、当該技術分野において既知であるように、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の、配列を比較することによって測定されるような関係である。当該技術分野において、「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の、場合によっては該当する配列のストリング間の一致によって測定されるような配列類似度も意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓおよびＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を測定するための好適な方法は、テストされる配列間に最大一致を与えるように設計されている。同一性および類似性を測定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を測定するための好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．等、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等、１９９０）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．等、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．等、１９９０）から公的に利用可能である。同一性を測定するために、周知であるＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用してもよい。
これらに限定することを意図するものではないが、例として、本発明のアミノ酸配列は、本明細書において提供される特異的に識別された配列と同一、すなわち１００％同一であってよく、または、同一％が１００％未満となるような、参照配列と比較して多くのアミノ酸変化を含んでよい。該当する変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、同類および非同類置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され、ここで前記変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間の何処かで、参照アミノ酸配列内のアミノ酸に個々に散在して、または、参照アミノ酸配列内の１つ以上の隣接基において生じ得る。ある同一％に対するアミノ酸変化の数は、アミノ酸の総数に各同一パーセントのパーセント数値（１００で割ったもの）を乗じ、次に、前記アミノ酸の総数から当該生成物を減ずることによって測定される、つまり、
ｎａ＝ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａはアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば７０％を０．７０、８０％を０．８０、８５％を０．８５等として表したものであり、ここで、ｘａおよびｙの任意の非整数生成物は、ｘａから減ずる前に、最も近い整数になるよう端数を切り捨てられる。
一実施形態において、本発明は、抗毒素複合体、および、抗体変異体または抗体模倣体を使用してこれらの複合体を作る方法に関する。好適な実施形態において、本発明の抗体の変異体はＣＤ２２に対するものであり、ＣＤ２２に対する親和性の向上を示す。該当する変異体は、ＣＤＲを突然変異させること（Ｙａｎｇ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２−４０３、１９９５）、ｃｈａｉｎシャフリング（Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９−７８３、１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のミューテーター株の使用（Ｌｏｗ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９−３６８、１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４−７３３、１９９７）、ファージ提示法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７−８８、１９９６）およびセクシャルＰＣＲ法（Ｃｒａｍｅｒｉ等、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８−２９１、１９９８）を含む多くの親和性成熟手順によって得られる。
本発明の抗体を含むＢ細胞除去剤をコード化するＤＮＡ配列の発現のために、適合する任意の宿主細胞／ベクター系を使用してもよい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに、特にＦｖ断片および一本鎖抗体断片、例えば一本鎖Ｆｖｓ等の抗体断片の発現のために、一つには、細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）およびその他の微生物系を使用してもよい。完全抗体分子を含む、より大きな抗体を製造するために、真核性、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を使用してもよい。適合する哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、骨髄腫、酵母細胞、昆虫細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＳＯ、ＶＥＲＯまたはＰＥＲ Ｃ６細胞を含む。適合する発現系は、形質転換動物および植物も含む。
細胞毒性薬
本発明は、細胞毒性薬、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体等の細胞毒性薬を含む組成物、および、自己免疫疾患の治療のための細胞毒性薬の投与を含む治療法を提供する。
本発明における使用に適合する細胞毒性薬は、チューブリン重合を抑制または分離させる細胞毒性薬、ＤＮＡに結合およびＤＮＡを分離させるアルキル化剤、ならびに、タンパク質合成またはプロテインキナーゼ、酵素、およびサイクリン等の必須細胞タンパク質を抑制する媒介物である。該当する細胞毒性薬の例は、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン／オーリスタチン、へミアスターリン、カリチェアミシン、エスペラミシン、およびメイタンシノイドを含むがこれらに限定されない。好適な細胞毒性薬は、三硫化メチル抗腫瘍性抗生物質の例である、カリチェアミシンである。本発明における使用に適合するカリチェアミシンの例は、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号；米国特許第４，９７０，１９８号、米国特許第５，０５３，３９４号、米国特許第５，０３７，６５１号；および米国特許第５，０７９，２３３号において開示されており、それらの全体が本明細書に組み込まれる。好適なカリチェアミシンは、ガンマカリチェアミシン派生またはＮ‐アセチルガンマカリチェアミシン派生である。
細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体
本発明は、細胞毒性薬およびＢ細胞除去剤を含む、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体を提供する。本発明は、当業者には既知であるように、Ｂ細胞除去剤および細胞毒性薬の任意の適合する複合体の使用および調製を意図している。Ｂ細胞除去剤、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体、およびその調製方法の例は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号ＵＳ２００４／００８２７６４号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０９２６２３号に記載されている。
好ましくは、本発明の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤複合体は、式：
Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
を有し、
式中、
ＰｒはＢ細胞除去剤であり、
ＸはＢ細胞除去剤と反応することができる任意の反応基の生成物を含むリンカーであり、
Ｗは細胞毒性薬であり、
ｍはカリチェアミシンが複合体重量の４〜１０％を構成するような精製した複合生成物の平均装填量であり、
（−Ｘ−Ｗ）ｍは細胞毒性薬である。
好ましくは、Ｘは式
（ＣＯ−Ａｌｋ１−Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）
を有し、
式中、
ＡｌｋｌおよびＡｌｋ２は独立して結合剤または分岐もしくは非分岐（Ｃｌ−Ｃ１０）アルキレン基であり、
Ｓｐ１は結合剤−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは独立して結合剤−ＮＲ’−、−Ｓ−、または−Ｏ−、但しこのときｎ＝０であり、また、ＹおよびＺのうち少なくとも１つは結合剤でなくてはならず、Ａｒ’は任意で（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、または３基と置換された１，２−、１，３−、または１，４−フェニレン、但しこのときＡｌｋ１は結合剤、Ｓｐ１は結合剤であり、
ｎは０から５の整数であり、
Ｒ’は任意で−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ３）ジアルキルアミノ、または（Ｃ１−Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−のうち１基または２基と置換された分岐または非分岐（Ｃ１−Ｃ５）鎖であり、ここでＡ−は塩を完成する医薬的に許容し得る陰イオンであり、
Ａｒは任意で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、または３基と置換された１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであり、式中、ｎおよびＲ’は以上で定義したものであるか、または、１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、もしくは２，７−ナフチリジンである、つまり、
Figure 2008515926
 であり、任意で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、３基、または４基と置換された各ナフチリジンまたはフェノチアジンを伴い、式中ｎおよびＲ’は上記で定義されたものであり、但しこのときＡｒはフェノチアジン、Ｓｐ１は窒素のみと結び付ける結合剤であり、
Ｓｐ２は結合剤−Ｓ−、または−Ｏ−、但しこのときＡｌｋ２は結合剤、Ｓｐ２は結合剤であり、
Ｚ１は任意で（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、ＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、または３基と置換されたＨ、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、またはフェニルであり、式中ｎおよびＲ’は上記で定義されたものであり、
Ｓｐは直線または分岐鎖の二価もしくは三価（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、二価もしくは三価アリールまたはヘテロアリールラジカル、二価もしくは三価（Ｃ３−Ｃ１８）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルラジカル、二価もしくは三価アリール−またはヘテロアリール−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、二価もしくは三価シクロアルキル−またはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ１−Ｃ１８）ラジカル、または、二価もしくは三価（Ｃ２−Ｃ１８）不飽和アルキルラジカルであり、ここで、ヘテロアリールは、好ましくはフリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクマリニル、またはフェナジニルであり、Ｓｐが三価ラジカルである場合、Ｓｐを追加で低（Ｃ１−Ｃ５）ジアルキルアミノ、低（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシ、または低（Ｃ１−Ｃ５）アルキルチオ基と置換してよく、
Ｑ＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である。
好ましくは、Ａｌｋ１は分岐または非分岐（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖、Ｓｐ’は結合剤−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ’であり、式中、Ｒ’は上記で定義されたものであり、但しこのときＡｌｋ１は結合剤、Ｓｐ１は結合剤であり、
Ａｒは任意で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、または３基と置換された１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであり、式中ｎおよびＲ’は上記で定義されたものであるか、または、Ａｒはそれぞれ任意で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、３基、または４基と置換された１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリジンである。
Ｚ１は任意で（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１基、２基、または３基と置換された（Ｃ１−Ｃ５）アルキルまたはフェニルであり、Ａｌｋ２およびＳｐ２はともに結合剤であり、ＳｐおよびＱは上記で定義したばかりのものである。
その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７３，００１号は、カリチェアミシンから調製された求核誘導体、特にヒドラジドおよび関連求核試薬とともに使用できるリンカーを開示している。これらのリンカーは、薬剤とリンカーとの間に形成された結合が加水分解型である際により優れた活性が得られる場合に特に有用である。これらのリンカーは、２つの官能基を含有する。１つの基は一般に、Ｂ細胞除去剤と反応するために利用される細胞毒性薬である。酸官能基は、正しく活性化されている場合、例えば、抗体または他のＢ細胞除去剤のリジンの側鎖中のアミン等、Ｂ細胞除去剤の遊離アミン基とのアミド結合を形成することができる。もう１つの官能基は通例、適切に修飾された治療剤と反応するカルボニル基、すなわち、アルデヒドまたはケトンである。カルボニル基は、ヒドラゾン結合を形成するために、薬剤中のヒドラジド基と反応することができる。この結合は加水分解型であり、標的細胞と結合した後、複合体から治療剤を放出することが可能である。
本発明において使用するための最も好適な二官能性リンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であり、これは、複合体が、３−メルカプト−３−メチルブタノイルヒドラジドと反応させることにより官能基化されたβ−カリチェアミシン、γ−カリチェアミシンまたはＮ‐アセチルγ−カリチェアミシン、ＡｃＢｕｔリンカー、ならびに、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体標的Ｂ細胞除去剤からなる、好適な生成物を生じさせる。
単量体の複合
カリチェアミシンを含む多くの細胞毒性薬剤の自然的な疎水性により、治療的適用に必要な、良い薬負荷および適度な産出による単量体薬複合体の調合が困難となる。この問題を悪化するＢ細胞除去剤（抗体）から治療剤を分離する共有原子化価距離の増加と同様に、ＡｃＢｕｔリンカーのようなリンカーによりもたらされるリンケージの疎水性の増加は、米国特許５、７７３、００１号に開示されている。
より高い薬負荷による細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤複合体の凝縮は、薬の疎水性のために生じる。適度な量の単量体生成物を得るために、薬負荷を時に制限しなければならない。場合によっては、例えば米国特許５、８７７、２９６号の複合体によるなど、過度な凝縮のために米国特許５，０５３，３９４号に開示されている反応条件を利用して、治療的適用のための有用な負荷による有用な産出で複合体を生成するのは時に困難となる。これらの反応条件は、複合体反応物における共同溶剤としてのＤＭＦを活用する。従って、凝縮および材料固有の損失をともなわないより高い薬負荷／産出を可能にする方法は必要となる。
凝縮を縮小するための改善は、米国特許５、７１２、３７４号および５、７１４、５８６号に説明されており、これらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの特許で開示されているのは、例えばｈＰ６７．６のような細胞傷害性療法薬を標的にするために使用される、ヒトまたはヒト化抗体、およびその中で開示されている他のヒト化抗体のようなタンパク質を含むが、限定されないＢ細胞除去剤である。これらの特許では、非求核、タンパク質適合、（ｉ）共溶媒のようなプロピレングリコーゲンおよび（ｉｉ）少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸より成る添加剤を含む緩衝液を利用することにより、より高い薬負荷／産出、および優れた活性を有する凝縮の減少による単量体の細胞毒性薬剤誘導体誘導体／Ｂ細胞除去剤複合体を概して生成することが分かった。その中で説明されている好ましい酸はＣ７からＣ１２酸であり、最も好ましい酸はオクタン酸（カプリル酸などの）またはその塩であった。Ｎ結合型糖鎖合成（ＯＳｕ）エステルまたは他の比較的活性化したエステルから生成された複合体のための好ましい緩衝液は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＮ−２‐ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２‐エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝剤）であった。これらの複合体反応物に使用される緩衝液は、遊離アミンまたは求核試薬を得ることはできない。他のタイプの複合体には、許容範囲にある緩衝剤は直ちに決定できる。もう１つの方法として、非求核、タンパク質適合、付加的な添加剤を含むないｔ−ブタノールを含む緩衝液を利用することにより、より高い薬負荷／産出、および凝縮の減少による単量体のカリチュアミシン誘導体／Ｂ細胞除去剤複合体を生成することもまた分かった。
単量体の複合体を形成するために必要な共溶媒の量は、タンパク質からタンパク質により多少変化し、必要以上に実験をすることなく当業者により決定できる。単量体の複合体を効率的に形成するために必要な添加剤の量もまた抗体から抗体により変化する。この量もまた必要以上に実験をすることなく当業者により決定できる。米国特許５、７１２、３７４号および５、７１４、５８６号では、より高い薬負荷／産出、および凝縮の減少による単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤複合体を生成するために、総合溶液量の１０％から６０％、好ましくは１０％から４０％、最も好ましくは約３０％の範囲にある量のプロピレングリコールの添加、および２０ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは４０ｍＭから９０ｍＭ、最も好ましくは約６０ｍＭから９０ｍＭの範囲にある量の少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩、好ましくはカプリル酸またはその塩から成る添加剤を、複合体反応物に追加した。エチレングリコール、エタノールＤＭＦ、ＤＭＳＯなどのようなプロピレングリコール以外の他のタンパク質適合有機共溶媒もまた使用することもあり得る。薬を複合体混合物の中へ移すために、いくらかの、またはすべての有機共溶媒を使用した。
もう１つの方法では、これらの特許では、Ｃ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩の濃度は１５０〜３００ｍＭに増加され、共溶媒が１〜１０％に減少されることもあり得る。１つの実施形態では、カルボン酸はオクタン酸またはその塩であった。好ましい実施形態では、カルボン酸はデカン酸またはその塩であった。別の好ましい実施形態では、カルボン酸は、プロピレングリコールまたはエタノールをともなう２００ｍＭカプリル酸の濃度にある、５％のカプリル酸とその塩であった。
これら特許の中の、別の代替の実施形態では、より高い薬負荷／産出、および凝縮の減少による単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤複合体を生成するために、総合溶液量の１０％から２５％、好ましくは１５％の範囲にある濃度のｔ−ブタノールを複合体の反応物に付加することもあり得る。
これらの確立した複合条件は、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭとして現在市販されている、ＣＭＡ−６７６（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）の形成に適用される。急性脊髄性白血病（ＡＭＬ）のためにこの治療が紹介されてから、イオン交換クロマトグラフィーを通して、カリチェアミシンは一定の方法で抗体に分布されないことが分かった。他の半分の抗体が、少量のカリチェアミシンしか含有しない、ＬＣＦ内に存在するとはいえ、カリチェアミシンのほとんどは抗体のおおよそ半分にある。そのような事情から、カリチェアミシンのような細胞毒性薬剤を、凝縮の量を最低限にし、また複合生成物の大幅に改善された産出によるより高い均一の薬負荷を可能にする、Ｂ細胞除去剤に複合する方法を改善することには、決定的に重要な意味を持つ必要性がある。
特定例は、Ｇ５／４４−ＮＡｃガンマ・カリチェアミシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ複合の例であり、それは、図１７に一般的に示す。ＬＣＦ量を総抗体の１０％未満の状態にすることは、複合の発達のために望ましく、ＬＣＦレベル量の減少の様々なオプションを熟考した。抗原複合や細胞毒性などの他の免疫抱合体属性は、根本的な解決によって影響されてはならない。考慮されたオプションは抗体の遺伝子的、または、物理的改善、クロマト分離技法、または反応条件の改善を含んだ。
古い反応条件を用いてＮＡｃ−ガンマ・カリチェアミシン ＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕ を備えたＧ５／４４抗体の反応は、上記に示された条件を用いた場合、同様の物理学的特性（製薬負荷、ＬＣＦ、および凝集）を有する生成物となった。しかし、複合後、現在のＬＣＦの高レベル（５０〜６０％）は、望ましくないと判断された。最適の反応条件は、温度、ｐＨ、カリチェアミシン派生投入、および添加剤濃度などのキー反応変数で評価され、統計的実験計画方法論を通じて決定した。これらの実験分析は、温度およびｐＨがより小さい影響を及ぼしたが、カリチェアミシン投入および添加剤濃度は、低複合率、ＬＣＦ、および凝集体生成レベルにおいて、最も有意な効果があることを示した。さらなる実験では、タンパク質Ｂ細胞除去剤（抗体）および補助溶媒（エタノール）の濃度は、ＬＣＦおよび凝集体生成レベルを制御するのにおいて、同様にあまり重要でない（カリチェアミシン投入および添加剤濃度を比較）ことが示された。ＬＣＦを１０％未満の状態にするために、カリチェアミシン派生投入は、その反応において、抗体の量に対して、３％から８．５％（ｗ／ｗ）に増加した。添加物は、２００ｍＭの濃度でオクタン酸またはその塩から３７．５ｍＭの濃度でデカン酸またはその塩に変化した。複合反応はわずかに高い温度（３０〜３５℃）およびｐＨ（８．２〜８．７）で、より進行した。その反応は、カリケアマイシン負荷を増強している間、これらの変化を取り入れる反応条件はＬＣＦを１０％未満まで減少させ、それは、以下「新しい」処理条件と称する。新旧の処理条件で取得した結果の比較を表１に示す。
Figure 2008515926
カリチェアミシン投入の増加は、２．５〜３．０の重量パーセントから７．０〜９．０（最も通常７．５〜８．５）の重量パーセントへ薬物負荷を増加し、その反応においてタンパク質凝集の増加は見られなかった。凝集およびＬＣＦの低下のために、新しい処理条件は、より均質の生成物をもたらした。新しい処理条件は、多グラム抗体基準でこの新しい複合手順によって再生可能な方法で準備された。
以上の凝集反応で、抗体濃度は、１から１５ｍｇ／ｍｌに及び、カリチェアミシン派生の濃度は、例えば、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ ガンマ・カリチェアミシン ＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕ エステル（図１７に示される複合する際に使用）、抗体の重量により、約４．５から１１％に及ぶ。補助溶媒は、好結果が６から１１．４％（容積基準）までに変化する濃度で示されるため、無水エタノールで行われた。その反応は、８から９のｐＨ、３０℃から約３５℃に及ぶ温度、１５分から２４時間の間で、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、または他の互換性のある緩衝剤を用いて行われた。当業者は、容易に、他のタイプの複合体のために許容できるｐＨ範囲を決定可能である。様々な抗体類において、前述の添加物の併用におけるわずかな変化量の使用が、薬物負荷と単量体複合率を改善することがわかり、どんな特定タンパク質Ｂ細胞除去剤も、最適な結果を獲得するために、完全な状態または添加物の選択において、いくつかの軽微な変更を必要とすることが理解される。
複合体の精製および分離
接合に続き、単量体の複合体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、あるいはクロマト分画（ＣＦ）などの、従来の方法によって、複合していない反応物質（Ｂ細胞除去剤および細胞毒性のない薬剤／カリチェアミシンなど）および／または複合体の塊状形から分離されることがある。精製した複合体は、単量体であり、通常、細胞毒性薬剤／カリチェアミシンの重量の４〜１０％を含む。好ましい実施形態において、複合体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製される。細胞毒性薬剤／カリチェアミシン抗体複合体の産出可能規模の製造に以前使用された工程では、使用された唯一の接合後の分離方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であった。この方法は、塊状複合体の除去および製剤の緩衝液交換の両方においてかなり効果的であるが、ＬＣＦ含有量を低減させるには効果的ではない。その結果、ＳＥＣに基づく工程は、最終生成物のＬＣＦ含有量を制御するための接合反応の化学的性質を完全に頼りにする。ＳＥＣの他の不利点は、カラムに適用される接合反応混合物の量の制限である（通常、工程カラムベッド量の５％を超えない）。これは、既定の産出空間で支持されるバッチサイズ（したがって、産出力）を厳しく制限する。最終的に、ＳＥＣ精製工程は、製剤において確実に達成可能なタンパク質濃度を制限する、共役溶液の有意な希釈ももたらす。
カリチェアミシン誘導体などの細胞毒性薬剤が、高い疎水性を有し、複合体において使用される場合、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、複合しているおよび複合していない抗体を効果的に分離する、好ましい候補である。ＨＩＣは、ＳＥＣに対して次の３つの主要な利点を提示する。（１）会合体と同様に、ＬＣＦ含有量を効果的に低減させる能力を有する、（２）ＨＩＣのカラム積載量は、より高い、および（３）ＨＩＣは、生成物の過剰希釈を避ける。
Ｂｕｔｙｌ、ＰｈｅｎｙｌおよびＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス株式会社〈Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ〉、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）などの、生産規模での使用に適した大容量のＨＩＣ媒体の数は、接合工程に続いて、複合していない構成要素および複合体の会合体を単量体の複合している構成要素から効果的に分離可能である。
抗サイトカイン剤
本発明は、自己免疫疾患を治療するための抗サイトカイン剤の使用を意図する。特に、本発明は、本発明のＢ細胞除去剤あるいは本発明の複合体との併用で、抗サイトカイン剤を提供する。好ましくは、抗サイトカインは、細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体との併用で提供される。抗サイトカイン剤は、自己免疫状態の患者あるいは自己免疫状態が発症する危険性のある患者へ投与するために提供される。本発明の抗サイトカイン剤は、サイトカインなどに効果的な任意の薬剤を含む。本発明は、例えば、制限はないが、可溶性組み換えサイトカイン受容体、サイトカインに対する抗体、サイトカインの活性を作用する小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはその組み合わせなどの、当業者に周知の、任意の種類の抗サイトカイン剤の使用を意図する。
好ましくは、本発明の抗サイトカイン剤は、抗ＴＮＦ薬剤である。任意の効果的な抗ＴＮＦ薬剤は、本発明によって意図される。例えば、制限はないが、抗ＴＮＦ薬剤は、可溶性組み換え受容体、キメラタンパク質、小分子、抗ＴＮＦ抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＴＮＦ免疫受容体ペプチド、抗イディオタイプ抗体、抗ＴＮＦ抗体あるいはペプチドの構造類似体あるいは任意のその組み合わせである場合がある。
可溶性組み換え受容体およびキメラタンパク質
抗サイトカイン剤は、ＴＮＦ受容体およびＴＮＦＲ‐Ｉｇなどの、可溶性受容体を含む場合がある。Ｉ型ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲＩ）およびII型ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲII）の２つの異なる種類のＴＮＦＲの存在が周知されている。成熟した完全長ヒトＴＮＦＲIIは、約７５〜８０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する糖タンパク質である。成熟した完全長ヒトＴＮＦＲＨは、約５５〜６０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する糖タンパク質である。本発明の好ましいＴＮＦＲは、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質と同様に、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲIIの可溶形である。
可溶性抗サイトカイン分子は、例えば、少なくとも２０のアミノ酸を有する天然タンパク質の類似体あるいは亜粒子を含む。可溶性ＴＮＦＲは、例えば、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲIIあるいはＴＮＦ結合タンパク質に共通する、少なくともいくつかの生物活性を示す。可溶性ＴＮＦＲ構築物は、膜貫通領域が欠けている（および、細胞から排出される）が、ＴＮＦを結合させる能力を保持する。様々な生物学的に同等なタンパク質およびアミノ酸の類似体は、天然受容体の細胞外領域のすべてあるいは一部に対応するアミノ酸配列を有する。
同等の可溶性ＴＮＦＲは、１つ以上の置換、欠失、あるいは追加によってこれらの配列と異なる、ＴＮＦとの結合あるいは細胞表面に結合したＴＮＦ受容体タンパク質を通したＴＮＦ信号変換活性を抑制する能力を保持する、ポリペプチドを含む。類似している欠失は、ｍｕＴＮＦＲに行われる場合がある。ＴＮＦ信号変換活性の抑制は、組み換え受容体発現を得るための組み換えＴＮＦＲ ＤＮＡを有する細胞に核酸を入れることによって判定可能である。そして、細胞は、ＴＮＦと接触し、結果として生じる代謝効果が検査される。効果がリガンドの作用に起因する結果を出す場合、組み換え受容体は、信号変換活性である。ポリペプチドが信号変換活性を有するかどうかを判定するための方法の例は、Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１（１９９０）；Ｃｕｒｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８６：３０４５（１９８９）；Ｐｒｙｗｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２１７９（１９８６）およびＣｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１８４２（１９８７）で公開されている。あるいは、内因性ＴＮＦ受容体を発現し、「ＩＮＦ」に対する検知可能な生物学的反応を有する一次細胞あるいは細胞系も使用可能である。
本明細書で使用されるようなＴＮＦＲ類似体の学名は、ｈｕ（ヒト〈ｈｕｍａｎ〉）あるいはｍｕ（マウス〈ｍｕｒｉｎｅ〉）のどちらかが前に来て、Δ（欠失を指定する）およびＣ末端アミノ酸の数が後に来るタンパク質（例えば、ＴＮＦＲ）の命名法に従う。例えば、ｈｕＴＮＦＲΔ２３５は、Ｃ末端アミノ酸としてＡｓｐ２３５を有するヒトＴＮＦＲを言及する。任意のヒトあるいはマウス種の指定がなければ、ＴＮＦＲは、一般的に哺乳類のＴＮＦＲを言及する。同様に、欠失変異体に対して任意の種の指定がない場合、ＴＮＦＲという用語は、ＴＮＦＲ生物活性を有する変異種（ｒｏｕｔａｎｔ）および類似体を含むＴＮＦＲのすべての形を意味する。
好ましい実施形態において、ＴＮＦＲ‐Ｉｇは、本明細書で記載されるように、医薬的に容認可能な組成物の形で投与されることがあるＴＮＦＲ：Ｆｃである。本明細書に記載される疾患は、必要に応じて他の投与経路が使用される場合があるが、皮下注射で週に１回以上、ＴＮＦＲ：Ｆｃを投与することによって治療される場合がある。成人患者の治療に対する投薬計画の例において、２５ｍｇのＴＮＦＲ：Ｆｃが、１週以上、好ましくは４週以上に渡って、週２回あるいは週３回、皮下注射で投与される。あるいは、１回分５〜１２ｍｇ／ｍ＜ｓｕｐ＞２あるいは均一に１回分５０ｍｇが、１週以上に渡って、週１または２回、皮下に注入される。他の実施形態では、乾癬は、生体適合性ポリマーのカプセルに入ったＴＮＦＲ：Ｆｃ、生体適合性ポリマーと混合したＴＮＦＲ：Ｆｃ（局所的に適用されたヒドロゲルなど）、および半透性埋没物に入ったＴＮＦＲ：Ｆｃなどの、持続放出製剤のＴＮＦＲ：Ｆｃで治療される。
様々な他の薬物も、抗サイトカイン剤から構成される組成物と同時に投与される場合がある。前記薬物には、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、鎮痛剤、局所的ステロイド、全身性ステロイド（例えば、プレドニゾン）、サイトカイン、炎症性サイトカインの拮抗薬、Ｔ細胞表面タンパク質に対する抗体、経口レチノイド、サリチル酸、およびヒドロキシウレアがある。前記組み合わせに適した鎮痛剤には、アセトアミノフェン、コデイン、ナプシル酸プロポキシフェン、オキシコドン塩酸塩、重酒石酸ヒドロコドンおよびトラマドールがある。前記組み合わせ適したＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキサート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、経口の金、金チオリンゴ酸ナトリウムおよびアウロチオグルコースがある。さらに、抗サイトカイン剤は、抗マラリア薬あるいはコルヒチンとの併用で投与される場合がある。対象の併用療法に適したＮＳＡＩＤには、サリチル酸（アスピリン）およびサリチル酸塩誘導体、イブプロフェン、インドメタシン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ）、ケトロラク、ナブメトン、ピロキシカム、ナプロキセン、オキサプロジン、スリンダク、ケトプロフェン、ジクロフェナク、その他のＣＯＸ‐１およびＣＯＸ‐２阻害剤、および新開発の抗炎症薬を含む、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、カルボン酸誘導体、カルボン酸誘導体、酪酸誘導体、オキシカム、ピラゾールおよびピラゾロンがある。
炎症性サイトカインに対する拮抗薬がＴＮＦＲ：Ｆｃと同時に投与される場合、前記拮抗薬の適した標的は、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐６およびＩＬ‐８を含む。
さらに、抗サイトカインは、局所的ステロイド、全身性ステロイド、炎症性サイトカインの拮抗薬、Ｔ細胞表面タンパク質に対する抗体、メトトレキサート、シクロスポリン、ヒドロキシウレアおよびスルファサラジンと併用して使用される場合がある。
抗サイトカイン剤の適量は、動物の体重で決定される。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用される場合がある。あるいは、用量は、動物の表面積で決定され、模範用量は０．１〜２０ｍｇ／ｍ＜ｓｕｐ＞２、あるいはより好ましくは、５〜１２ｍｇ／ｍ＜ｓｕｐ＞２を範囲とする。犬または猫などの小動物の場合、適量は、０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい実施形態において、ＴＮＦＲ：Ｆｃ（好ましくは、患者と同じ種から派生した遺伝子から構成された）あるいは他の可溶性ＴＮＦＲの模倣体は、動物の状態が改善されるまで、あるいは永久に、注射あるいは他の適切な経路で週１回以上、投与される。
ＴＮＦ拮抗タンパク質などの、抗サイトカイン薬剤は、自己免疫疾患を治療する目的で、哺乳類、好ましくはヒトに投与される場合がある。例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２およびＩＬ‐６などのインターロイキンは、主要な役割のため、ＴＮＦを産生する役割を果たし、ＩＬ‐１Ｒおよび／またはＩＬ‐２Ｒとの併用でＴＮＦＲを使用する併用療法が意図される。ヒトの治療においては、可溶性ヒトＴＮＦＲが好ましい。Ｉ型ＩＬ‐１ＲあるいはII型ＩＬ‐１Ｒのどちらか、あるいはその組み合わせが、本発明によって使用される場合がある。その他の型のＴＮＦ結合タンパク質も同様に使用される場合がある。
対象の方法は、産出したＴＮＦの量を減少させること、あるいはＴＮＦのその細胞表面受容体への結合を阻止することなどによって、内因性生物活性ＴＮＦの効果のある量を減少させることが可能な可溶性ＴＮＦ拮抗薬を被験者に投与することを含む場合がある。この結合を抑制可能な拮抗薬は、遺伝子組み換えされた突然変異タンパク質、多様型および持続放出製剤を含む、ＴＮＦの受容体結合ペプチド断片、ＴＮＦ産生を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはリボザイム、ＴＮＦに対する抗体、およびＴＮＦの受容体あるいはその変性変異体のすべてあるいは一部から構成される組み換えタンパク質を含む。
本発明の好ましい実施形態は、可溶性ＴＮＦＲを抗サイトカイン剤として使用する。ＴＮＦＲの可溶形は、単量体、融合タンパク質（または、「キメラタンパク」と称される）、二量体、三量体あるいはそれ以上の多量体を含む。本発明の特定の実施形態では、可溶性ＴＮＦＲ誘導体は、７５ｋＤａのＴＮＦＲあるいは５５ｋＤａのＴＮＦＲを模倣し、患者の体内でＴＮＦと結合する可溶性ＴＮＦＲ誘導体である。可溶性ＴＮＦＲ模倣体は、ＴＮＦＲがｐ５５またはｐ７５、あるいはその断片から派生する場合がある。例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載にＴＮＦＲなど、ｐ５５およびｐ７５以外のＴＮＦＲも、本発明において有用である。ＴＮＦＲ模倣体を構成するために使用される可溶性ＴＮＦＲ分子は、例えば、少なくとも２０のアミノ酸を有し、天然ＴＮＦＲの膜貫通領域を欠如し、ＴＮＦを結合可能な天然ＴＮＦＲの類似体あるいは断片を含む。ＴＮＦＲから派生した拮抗薬は、細胞表面に受容体を有するＴＮＦを得るために競争するため、ＴＮＦの細胞への結合を阻止し、それによって、ＴＮＦがその生物活性を明示しないように防止する。可溶性ＴＮＦＲのＴＮＦあるいはＬＴとの結合は、ＥＬＩＳＡあるいは任意の他の簡便な試験を使用して検査可能である。
本発明の可溶性ＴＮＦＲポリペプチドあるいは断片は、キメラタンパク質を形成するための第２のポリペプチドで融合される場合がある。第２のポリペプチドは、ＴＮＦあるいはＬＴ分子を結合でき、細胞結合の受容体との結合を阻止できる二量体、三量体あるいはそれ以上の多量体のキメラタンパク質によって、自発的形成を促進する場合がある。拮抗薬として使用されるキメラタンパク質は、例えば、抗体分子の定常領域から派生した分子、およびＴＮＦＲの細胞外の部分を含む。前記分子は、本明細書において、ＴＮＦＲ‐Ｉｇ融合タンパク質と言及される。ヒトあるいはその他の哺乳類における疾患を治療するために適切な、好ましいＴＮＦＲ‐Ｉｇ融合タンパク質は、組み換えＴＮＦＲ：Ｆｃであり、ＥＮＢＲＥＬという商品名で、アムゲン社（Ａｍｇｅｎ）の子会社であるイミュネックス社（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から発売されるエタネルセプトとしても周知されている。エタネルセプトのｐ７５受容体タンパク質は、ＴＮＦ‐αだけではなく炎症性サイトカインＬＴ‐αとも結合するので、エタネルセプトは、ＴＮＦ‐αだけではなくＬＴ‐αの拮抗阻害剤としても作用可能である。これは、ＬＴ‐αを抑制することができないＴＮＦ‐αに対する抗体と対照的である。
本発明の抗サイトカインは、前記分子などを含む組成物および組み合わせのみならず、ＩｇＧのＦｃ部と融合した５５ｋＤａのＴＮＦＲの細胞外の部分からなる化合物を含む。包含物も、このＴＮＦＲから派生したＴＮＦＲ‐Ｉｇの包含物を含む、例えば、そのままの形で参照することにより組み込まれる、ＷＯ９９／０４００１に記載されるＴＮＦＲなどの、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦＲ以外のＴＮＦ‐α受容体分子の細胞外領域から派生した可溶性ＴＮＦＲである。他の適切なＴＮＦ‐α阻害剤には、ヒト化抗ＴＮＦ‐α、抗体Ｄ２Ｅ７（クノール社〈Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ〉／ＢＡＳＦ ＡＧ）がある。
抗サイトカイン剤の持続放出製剤は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの持続放出製剤を含み、本発明によって意図される。公開された方法における使用に適した持続放出製剤として、溶解速度の遅い生体適合性ポリマーのカプセルに入った薬剤（米国特許第６，０３６、９７８号に記載のアルギン酸微小粒子あるいは米国特許第６，０８３，５３４号に記載のポリエチレンビニルアセテートおよびポリ（乳‐グルコース酸）組成物など）、前記重合体と混合した薬剤（局所的に適用されたヒドロゲルなど）、および／または生体適合性半透性埋没物に入った薬剤があるが、それに限定されない。さらに、本明細書に記載される治療における使用のためのＩ型あるいはII型の可溶性ＴＮＦＲは、その血中半減期を延期するため、あるいはタンパク質の送達を強化するために、ポリエチレングリコール（ペグ化）と接合する場合がある。
小分子
本発明の他の適切な抗サイトカイン剤は、サリドマイドあるいはサリドマイド類似体、ペントキシフィリン、あるいはマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤あるいはその他の小分子などの、小分子を含む。適切なＭＭＰ阻害剤は、例えば、それぞれそのままの形で参照することにより組み込まれる、米国特許第５，８７２，１４６号に記載のメルカプトアルキルペプチジル化合物のみならず、米国特許第５，８８３，１３１号、５，８６３，９４９号および５，８６１，５１０号に記載の阻害剤を含む。ＴＮＦ産生を減少させることが可能な小分子は、例えば、米国特許第５，５０８，３００号、５，５９６，０１３号および５，５６３，１４３号に記載の分子を含み、いずれも可溶性ＴＮＦＲあるいはＴＮＦに対する抗体などの抗ＴＮＦ薬剤との併用で投与可能である。本明細書に記載されるＴＮＦ媒介疾患の治療に有用な追加小分子は、米国特許第５，８２１，２６２号に記載のヒドロキサム酸誘導体のみならず、米国特許第５，７４７，５１４号および米国特許第５，６９１，３８２号に記載のＭＭＰ阻害剤を含む。本明細書で記載される疾患も、置換オキシム誘導体（ＷＯ９６／００２１５）、キノリンスルホンアミド（米国特許第５，８３４，４８５号）、アリルフラン誘導体（ＷＯ９９／１８０９５）およびヘテロ二環式誘導体（ＷＯ９６／０１８２５；ＧＢ２ ２９１ ４２２Ａ）などの、ホスホジエステラーゼＩＶおよびＴＮＦ産生を抑制する小分子によって治療される場合がある。また、有用なものとして、ＴＮＦを抑制するキサンチン誘導体および他の炎症性サイトカイン（例えば、米国特許第５，１１８，５００号、米国特許第５，０９６，９０６号および米国特許第５，１９６，４３０号を参照）のみならず、ＴＮＦおよびＩＦＮδ（ＷＯ９９／１５５２４）を抑制するチアゾール誘導体がある。抗サイトカイン剤として適切な追加小分子は、米国特許第５，５４７，９７９に開示される小分子を含む。各前述の文献は、本明細書において、そのままの形で参照することにより組み込まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
また、抗ＴＮＦ薬剤などの、本発明の抗サイトカイン剤の中に含まれるものとして、標的ｍＲＮＡに交配し、ポリペプチド翻訳を防止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する作用をするアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独、他の抗サイトカイン剤との併用、あるいは他の薬剤との併用で、本発明に適切である。例えば、本発明のアンチセンス分子は、ＴＮＦの翻訳、ＴＮＦ受容体、あるいはＴＮＦの合成のための代謝経路において酵素を妨げる場合がある。絶対的補完は好ましいが、必須ではない。本明細書において言及されるように、核酸の部分に「相補的」な配列とは、核酸と交配が可能となるほど十分な相補性を有し、安定した二本鎖（または、必要に応じて、三本鎖）を形成する配列を意味する。交配する能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さによる。例えば、ＡＵＧ開始コドンを含む、５'非翻訳配列までの、メッセージの５'端に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を最も効果的に抑制するはずである。しかしながら、標的転写の５'あるいは３'非翻訳のいずれか、および非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは使用可能である。ｍＲＮＡの５'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの補体を含むはずである。
アンチセンス核酸は、少なくとも長さ６のヌクレオチドでなければならず、好ましくは、長さ６から約５０ヌクレオチドを範囲とするオリゴヌクレオチドである。特定の局面では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドあるいは少なくとも５０ヌクレオチドである。最も好ましくは、１８〜２１ヌクレオチドを含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの重要要素は、体内にあるオリゴヌクレオチドの半減期を延期するために化学修飾される場合がある。この目的に対する適切な修飾は、この目的に対する、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホン酸塩、様々なホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、およびホスホロジアミデートなどの使用を記述する、例えば、米国特許第１１４，５１７号に開示される修飾など、当技術分野で周知である。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡあるいはＲＮＡあるいはキメラ混合物あるいは誘導体あるいはその修正版、一本鎖あるいは二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、交配などを改善するために、基盤部分、糖成分、あるいはリン酸骨格で修飾される。オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の補足群（例えば、生体内の標的宿主細胞受容体に対する）、細胞膜を渡って運搬を促進する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８６：６５５３‐６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８‐６５２；特許公報ＷＯ８８／０９８１０号、１２月１５日出版、１９８８を参照）、あるいは交配誘発の切断剤あるいは挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、５：５３９‐５４９を参照）を含む。アンチセンス分子は、標的転写を発現する細胞へ送達されるはずである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、静脈内あるいは皮下注射を含む、非経口で投与可能であり、あるいは経口投与に適切な製剤に組み込むことが可能である。多くの方法が、アンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを送達するために開発されている。例えば、アンチセンス分子は、組織または細胞の派生部位へ直接注入可能であり、所望の細胞を標的とすることを目的とする変性アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現した受容体あるいは抗原を特異的に結合するペプチドあるいは抗体と連結したアンチセンス）は、全身に投与可能である。しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために十分なアンチセンスの細胞内濃度に到達することは困難な場合が多い。したがって、好ましい方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いｐｏｌIIIあるいはｐｏｌIIプロモーターの制御の下に置かれる、組み換えＤＮＡ構築物が使用される。患者の標的細胞に核酸を入れるための前記構築物の使用は、内因性標的遺伝子転写を有数する相補的塩基対を形成する十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写を引き起こし、それによって、標的ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を導くよう、生体内で導入可能である。前記ベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産出するために転写可能である限り、エピソーム性のままである、あるいは染色体に取り込まれる。前記ベクターは、その分野において標準的な組み換えＤＮＡの工学的方法によって構築可能である。ベクターは、哺乳類の細胞における複製および発現に使用されるプラスミド、ウイルス、あるいは当技術分野で周知の他のものであり得る。ＴＮＦの上昇を伴う疾患の治療に適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、そのままの形で参照することにより組み込まれる、米国特許第６，０８０，５８０号に記載の抗ＴＮＦオリゴヌクレオチドを含む。
ｍＲＮＡ転写を触媒的に切断することを目的としたリボザイム分子も、ＴＮＦ、ＴＮＦ受容体、あるいはＴＮＦあるいはＴＮＦＲの合成に関与する酵素をコード化するｍＲＮＡの翻訳を防止するために使用可能である（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９０／１１，３６４；米国特許第５，８２４，５１９号を参照）。この目的に対して有用なリボザイムは、テトラヒメナ好熱菌において自然発生するものなど（ＩＶＳ、あるいはL‐１９ＩＶＳ ＲＮＡとして周知）、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５‐５９１）、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）を含む（例えば、ＷＯ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ、１９８６、Ｃｅｌｌ、４７：２０７‐２１６を参照）。リボザイムは、変性オリゴヌクレオチド（例えば、改良された安定性、標的などのために）から成ることが可能で、生体内で標的ペプチドを発現する細胞へ送達されるはずである。送達の好ましい方法は、核酸を入れられた細胞が、内因性標的ｍＲＮＡを破壊するための十分な量のリボザイムを産出し、それによって翻訳を抑制するよう、強い構造性のｐｏｌIIIあるいはｐｏｌIIプロモーターの制御の下でリボザイムをコード化するＤＮＡ構築物の使用を含む。
あるいは、ＴＮＦまたはＴＮＦＲの産生に関与する遺伝子の発現は、標的遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成するための標的遺伝子（例えば、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）の調節領域に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的とすることによって低減可能である（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、６（６）、５６９‐５８４；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２、Ａｎｎ．ニューヨーク州．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０、２７‐３６；およびＭａｈｅｒ、１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４（１２）、８０７‐８１５を参照）。
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重らせん分子は、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を合成するための、当技術分野で周知の任意の方法によって調製される場合がある。オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（バイオサーチ社〈Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ〉、アプライドバイオシステムズ社〈Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ〉などから市販されている）の使用による、当技術分野で標準的な方法によって合成可能である。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって合成される場合があり、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、Ｓａｒｉｎら（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８５：７４４８‐７４５１）によって記載されるように、調製可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコード化するＤＮＡ配列の生体外および生体内の転写によって発生する場合がある。前記ＤＮＡ配列は、Ｔ７あるいはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む多種多様なベクターに取り込まれる場合がある。あるいは、使用するプロモーターによって、アンチセンスＲＮＡを構造的あるいは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、安定的に細胞系へ導入可能である。
内因性標的遺伝子発現は、標的相同的組み換えを使用して、標的遺伝子あるいはそのプロモーターを不活性化あるいは「はじき出す」ことによっても減少可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１７、２３０‐２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｅｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１、５０３‐５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５、３１３‐３２１を参照）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコーディング領域あるいは調節領域のいずれか）と相同のＤＮＡが横にある非機能的な標的遺伝子（あるいは、完全に無関係なＤＮＡ配列）である、突然変異体は、選択可能なマーカーおよび／または否定的に選択可能なマーカーの有無に関わらず、生体内で標的遺伝子を発現する細胞に核酸を入れるために使用可能である。標的相同的組み換えを通るＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活化をもたらす。前記方法は、特に、ＥＳ（胚幹）細胞への改良が、不活性の標的遺伝子で動物の子孫を産ませるために使用される圃場（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８９、ｓｕｐｒａを参照）、あるいは「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）法（Ｇｒｉｓｈｏｋ Ａ、Ｔａｂａｒａ Ｈ、およびＭｅｌｌｏ ＣＣ、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７（５４６２）：２４９４‐２４９７）、あるいは導入遺伝子の導入（Ｄｅｒｎｂｕｒｇら、２０００、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４（１３）：１５７８‐１５８３）が、特定の標的遺伝子の発現を抑制するために使用される、シノラブディスエレガンスなどの、モデル生物において適切である。この方法は、組み換えＤＮＡ構築物が、ウイルスベクターなどの、適切なベクターを使用して、生体内の所要の部位に直接投与あるいは標的となれば、ヒトにおける使用に適応可能である。
抗サイトカイン抗体
本発明に適切な抗サイトカイン剤は、これに限定されないが、本発明によって意図される酵素的切断、ペプチド合成あるいは組み換え方法などの、任意の周知の方法によって与えられる、断片、領域あるいは誘導体のみならず、可溶性あるいは付属形式でラベルを貼ることが可能な抗体に対するポリクローナル抗体、単クローン性抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含む。例えば、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦのＴＮＦ受容体との結合を抑制するＴＮＦの部分を結合することが可能な抗ＴＮＦ抗体を含む。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から派生した抗体分子の不均一集団である。単クローン性抗体は、集団が実質的に同等のエピトープ結合部位を含む、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含む。ｍＡｂは、当業者に周知の方法によって得られる場合がある。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５‐４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州、（１９８７、１９９２）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、コールドスプリングハーバー研究所〈Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〉（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州、（１９９２、１９９３）などを参照し、文献の含有量は、参照することにより本明細書にそのまま組み込まれる。前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびその任意の亜網を含む、任意の免疫グロブリンクラスの抗体である。本発明のｍＡｂを産出するハイブリドーマは、生体外、本来の位置あるいは生体内で培養される場合がある。生体内あるいは本来の位置のｍＡｂの高力価の産出は、現在、好ましい方法あるいは産生を可能にする。
キメラ抗体は、ヒト、マウスキメラのｍＡｂが使用されるよう、例えば、マウスｍＡｂがハイブリドーマからの高い産出高を有すが、ヒトにおいて高い免疫原性を有す場合など、応用において免疫原性を減少させ、産出において産出高を増加させるために主として使用される、マウスｍＡｂから派生した可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などの、異なる部分が異なる動物種から派生した分子である。キメラ抗体およびその産出法は、当技術分野で周知である（Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，米国、８１：３２７３‐３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８１：６８５１‐６８５５（１９４）、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６４３‐６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願〈Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ〉１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２６８‐２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願〈Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ〉、１７／４９６（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願〈Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ〉、１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３、（１９８６年３月１３日公開）；Ｋｕｄｏら、欧州特許出願〈Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ〉、１８４１８７（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願〈Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ〉、７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：１０６６‐１０７４（１９８６）：Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公報番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月５日公開）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８４：３４３９‐３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８４：２１４‐２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１‐１０４３（１９８８）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、コールドスプリングハーバー研究所〈Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〉（１９８８））。
ＴＮＦに対するポリクローナルマウス抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示されている（ＥＰＯ特許公報０２１２４８９、１９８７年３月４日）。
Ｒｕｂｉｎら（ＥＰＯ特許公報０２１８８６８、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するマウス単クローン性抗体、前記抗体を分泌するハイブリドーマ、前記マウス抗体の産出法、およびＴＮＦの免疫学的検定における前記マウス抗体の使用を開示する。
Ｙｏｎｅら（ＥＰＯ特許公報０２８８０８８、１９８８年１０月２６日）は、ｍＡｂを含む抗ＴＮＦマウス抗体、および病理の免疫学的検定診断における使用、特に、川崎病の病理および細菌感染を開示する。
その他の検査は、生体外での中和活性を有する組み換えヒトＴＮＦに特異的な齧歯類あるいはルーチンｍＡｂを記述した（Ｌｉａｎｇら、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７‐８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６：３０５‐３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６：３５９‐３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６：４８９‐５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７‐６２（１９８７）；およびＭｏｉｌｅｒら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２：１６２‐１６９（１９９０））。
ＴＮＦに対する中和抗血清あるいはｍＡｂは、不都合生理学的変化を取り消し、実験的内毒素血および菌における致死的攻撃後の死を防止するために、ヒト以外の哺乳類に現れる。この効果は、例えば、齧歯類の致死検査および霊長類病理モデルシステムなどにおいて証明されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１９２５‐１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８６９‐８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：６６２‐６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７：３１１‐３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６２：４２１‐４２７（１９９０）；Ｏｐａｌら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６１：１１４８‐１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ．、３０：２７９‐２９２（１９９０））。
本発明の抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦの一部を結合し、少なくとも１つのＴＮＦ生物活性を抑制および／または中和する、ポリクローナルＡｂ、モノクローナルＡｂ、その断片および／または領域が、重鎖可変領域（Ｈｖ）あるいは軽鎖可変領域（Ｌｖ）を含むことを特徴とする、少なくとも１つの重鎖定常領域（Ｈｃ）、重鎖可変領域（Ｈｖ）、軽鎖可変領域（Ｌｖ）および軽鎖定常領域（Ｌｃ）を含むことができる。
抗原は、抗原のエピトープと結合可能な抗体を産出するために動物を誘導することが可能であり、さらにその抗体による結合が可能な分子あるいは分子の一部である。抗原は、１つあるいは１つ以上のエピトープを有することができる。
上記に言及される特異反応は、抗原が、他の抗原によって惹起可能な多数の他の抗体ではなく、高度選択的な方法でその対応する抗体に反応することを示すことを意図する。好ましくは、本発明の抗ＴＮＦ抗体の抗体フラグメントおよび領域を結合する抗原は、少なくとも１つのアミノ酸残留物８７〜１０８あるいはｈＴＮＦ‐α（配列番号：５２）の残留物５９〜８０および８〜１０８の両方から構成される、少なくとも５つのアミノ酸を含む。本発明の抗ＴＮＦ抗体の抗体フラグメントおよび領域を結合する好ましい抗原は、ｈＴＮＦ‐α（配列番号：５２）のアミノ酸１１〜１３、３７〜４２、４９〜５７あるいは１５５〜１５７のアミノ酸を含まない。
エピトープは、１つ以上のＡｂの抗原結合性領域にある抗体による認識および結合可能な任意の分子の一部である。エピトープは、通常、アミノ酸あるいは糖側鎖などの、分子の化学的活性表面群から成り、特異的な電荷特性のみならず、特異的な三次元の構造特性を有する。例えば、ＴＮＦのＴＮＦ受容体との結合などを含む、「抑制および／または中和エピトープ」を意図することによって、抗体によって結合するエピトープが結合する際、生体内、生体外あるいは本来の位置で、好ましくは生体内で、エピトープを含む分子あるいは生物の生物活性の損失をもたらす。例えば、そのままの形で参照することにより組み込まれる、ＵＳ６，２７７，９６９号で開示されるエピトープである。
本発明のマウスおよびキメラ抗体フラグメントおよび領域は、個々の免疫グロブリン重（Ｈ）鎖および／または免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖を含む。キメラＨ鎖は、ＣＨ１あるいはＣＨ２などの、ヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも一部と連結される、ＴＮＦに特異的な非ヒト抗体のＨ鎖から派生した抗原結合性領域を含む。
本発明によるキメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも一部と連結したＴＮＦに特異的なラム‐ヒト抗体のＬ鎖から派生した抗原結合性領域を含む。
同等あるいは異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体フラグメントあるいは誘導体は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌの下、Ｈａｒｌｏｗの下、およびＣｏｌｌｉｇａｎの下などの、周知の方法による、個々のポリペプチドの適切な関連によっても調製可能である。
抗サイトカイン免疫受容体ペプチド
本発明の免疫受容体ペプチドは、ＴＮＦ‐αおよび／またはＴＮＦ‐βなどの、サイトカインと結合可能である。免疫受容体は、受容体の少なくとも一部と共有結合している少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖あるいは軽鎖を含む。特定の好ましい実施形態において、重鎖定常領域は、ＣＨ１の少なくとも一部を含む。具体的に、軽鎖が免疫受容体ペプチドに含まれる場合、重鎖は、軽鎖定常領域の結合に関与するＣＨ１の範囲を含まなければならない。
本発明の免疫受容体ペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン鎖と共有結合している受容体分子と有する少なくとも１つの重鎖定常領域を含み、特定の実施形態において、少なくとも１つの軽鎖定常領域を含むことができる。軽鎖あるいは重鎖可変領域は、特定の実施形態に含まれる。受容体分子は、免疫グロブリン鎖の内部に結合可能であるため、一本鎖は、可変領域および受容体分子との融合を有することができる。
免疫グロブリン分子と連結したＴＮＦ受容体の一部は、ＴＮＦ‐αおよび／またはＴＮＦ‐βを結合可能である。ＴＮＦ受容体の細胞外領域は、ＴＮＦを結合させるため、免疫受容体の免疫グロブリン分子と結合した一部は、ＴＮＦ受容体の細胞外領域の少なくとも一部から成る。
免疫グロブリン遺伝子は、マウスなどの、任意の脊椎動物が起源であり得るが、好ましくは、免疫受容体ペプチドの最終受容体と同じ起源の配列の実質的な体液を有する免疫グロブリンをコード化する。例えば、人が本発明の分子で治療さえる場合は、好ましくは、免疫グロブリンは、ヒト起源のものである。
重鎖に対して並べるＴＮＦ受容体構築物は、例えば、受容体の細胞領域に存在するＤＮＡコード化アミノ酸を使用して、合成可能である。ｈＴＮＦの推定上の受容体結合遺伝子座は、アミノ酸１１〜１３、３７〜４２、４９〜５７および１５５〜１５７から成るように、ＴＮＦ‐αの受容体結合遺伝子座を同定したＥｃｋおよびＳｐｒａｎｇｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（２９）、１７５９５‐１７６０５（１９８９）によって提示されている。ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０２０７８（優先日１９８９年８月７日）は、少なくとも１つの以下のエピトープを有する単クローン性抗体と結合可能なＴＮＦリガンドを開示する。１〜２０、５６〜７７、および１０８〜１２７；１〜２０、５６〜７７、１０８〜１２７および１３８〜１４９の少なくとも２つ；１〜１８、５８〜６５、１１５〜１２５および１３８〜１４９のすべて；１〜１８、および１０８〜１２８のすべて；５６〜７９、１１０〜１２７および１３５あるいは１３６〜１５５のすべて；１〜３０および１１７〜１２８および１４１〜１５３のすべて；１〜２６、１１７〜１２８および１４１〜１５３のすべて；２２〜４０、４９〜９６あるいは９７、１１〜１２７および１３６〜１５３のすべて；１２〜２２、３６〜４５、９６〜１０５および１３２〜１５７のすべて；１〜２０および７６〜９０の両方；２２〜４０、６９〜９７、１０５〜１２８および１３５〜１５５のすべて；２２〜３１および１４６〜１５７のすべて；２２〜４０および４９〜９８のすべて；２２〜４０、９〜９８および６９〜９７の少なくとも１つ、２２〜４０および７０〜８７の両方。したがって、当業者が一度、本開示を有した場合、ＴＮＦを結合させると知られている受容体の部分を使用して、ＴＮＦ受容体融合タンパク質を作製できる。
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質（免疫受容体ペプチド）の使用に関する利点は、（１）二量体の融合タンパク質の結果として生じる二価性のために、多価リガンドに対して起こり得る親和性の増加、（２）より長い血中半減期、（３）Ｆｃ領域を通してエフェクター細胞を活性化する能力、（４）精製の容易性（例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィーによる）（５）ＴＮＦ‐αおよびＴＮＦ‐βに対する親和性、および（６）ＴＮＦ‐αあるいはＴＮＦ‐β細胞毒性を阻止する能力、の１つ以上を含む。
これは、通常、Ｉｇ軽鎖の非存在下において融合タンパク質の分泌を可能にするが、本発明の主要な実施形態は、（１）ＴＮＦに対する親和性をより大きくする、２つの受容体分子間の距離および／または柔軟性の増加、（２）お互いが結集し、四価（ダブル融合）受容体分子を形成するために二量体になる重鎖融合タンパク質および軽鎖融合タンパク質を作製する能力、および（３）二価（シングル融合）分子と比較して、四価融合タンパク質は、ＴＮＦに対する親和性および／または中和力の増加を有することができる、などの利点を与えることができる、ＣＨｌ領域の包括を提供する。
抗イディオタイプＡＢＳ
抗ＴＮＦ抗体などの、モノクローナルあるいはキメラ抗サイトカイン抗体に加え、本発明は、例えば、抗ＴＮＦ抗体などの、本発明の抗サイトカインに特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体も意図する。抗Ｉｄ抗体は、他の抗体の抗原結合性領域と、通常、関連のある独特の決定基を認識する抗体である。例えば、ＴＮＦに特異的な抗体は、イディオタイプあるいはＩｄ抗体と称される。抗Ｉｄは、そのＩｄ抗体あるいは抗原結合性領域を有するＩｄ抗体の起源と同じ種類および遺伝子型（例えば、マウス株）の動物に免疫を与えることによって調製可能である。免疫された動物は、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識、反応し、抗Ｉｄ抗体を産出する。抗Ｉｄ抗体は、さらに他の動物において免疫応答を誘導するための「免疫原」としての使用も可能であり、いわゆる抗‐抗Ｉｄ抗体を産出する。抗‐抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した本来の抗体とエピトープ的に同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンの同定が可能になる。
その結果、本発明によるＴＮＦなどの、サイトカインに対して生成されたｍＡｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの、適切な動物において抗Ｉｄ抗体を誘導するために使用可能である。前期免疫マウスからの脾臓細胞は、抗Ｉｄ ｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産出するために使用可能である。さらに、抗Ｉｄ ｍＡｂは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの、Ｂ細胞除去剤と連結可能であり、追加ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫を与えるために使用可能である。これらのマウスからの血清は、ＴＮＦエピトープに特異的な本来のｍＡｂの結合特性を有する抗‐抗Ｉｄ抗体を含む。
その結果、任意の適切なサイトカイン中和化合物は、本発明による方法において使用可能である。例えば、ＴＮＦ中和化合物は、ＴＮＦ、ｐ５５受容体、ｐ７５受容体あるいはその複合体の中和エピトープに特異的な抗体あるいはその一部、ＴＮＦを結合させるＴＮＦ受容体の部分、ＴＮＦを結合させるペプチド、ＴＮＦを結合させるペプチド模倣薬およびＴＮＦを阻止する任意の有機模倣薬からなる群から選択可能でる。
前記ＴＮＦ中和化合物は、当業者によって、本明細書で提示される指導およびガイダンスに基づくルーチンの実験で判定可能である。
抗ＴＮＦ抗体および抗ＴＮＦペプチドの構造的類似体
本発明の抗ＴＮＦ Ａｂおよびペプチド構造的類似体は、本明細書で提示される指導およびガイダンスに基づく周知の方法によって提供される。
タンパク質の三次元構造の知識は、それらがどのように機能するかを把握することにおいて不可欠である。４００以上のタンパク質の三次元構造は、現在、タンパク質構造データベースで得られる（配列データベースにおける約１５，０００の周知のタンパク質配列と対照的）。これらの構造の分析は、モチーフの認識できるクラスに分類されることを示す。したがって、周知の構造の関連したタンパク質と相同のタンパク質に基づくタンパク質の三次元構造の模型を作ることが可能である。多くの例は、比較的低い配列相同性を有する２つのタンパク質が、非常に似た三次元構造あるいはモチーフを有することが可能であることで周知である。
近年、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって、約１５ｋＤａまでのタンパク質の三次元構造を決定することが可能となってきた。その方法には、純粋なタンパク質の濃溶液のみが必要である。結晶あるいは同型誘導体は必要ではない。多くのタンパク質の構構造は、この方法によって判定されている。ＮＭＲ構造決定の内容は、当技術分野で周知である（例えば、Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ および Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク州、１９８６；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：４５‐５０（１９８９）；Ｃｌｏｒｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：４７９‐５６４（１９８９）；Ｃｏｏｋｅら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、８：５２‐５６（１９８８）を参照）。
この方法を適用する際、様々な１Ｈ ＮＭＲ ２Ｄデータセットは、本発明の抗ＴＮＦ Ａｂおよび／または抗ＴＮＦペプチドのために収集される。これらには、
主に２種類ある。１つは、ＣＯＳＹ（相関分光分析）であり、化学結合によって連結されるプロトン共鳴を同定する。これらのスペクトルは、３つ以下の共有結合によって連結されたプロトンに関する情報を提供する。ＮＯＥＳＹ（核オーバーハウザー強化分光法）は、空間的に近い（０．５ｎｍ未満）プロトンを同定する。完全スピン系の課題に続き、二次構造は、ＮＯＥＳＹによって同定される。交差ピーク（核オーバーハウザー効果あるいはＮＯＥ）は、ペプチドの一次配列付近にある残留物の間で見られ、０．５ｎｍ未満の間隔のプロトンに対して見られる。アミドプロトン結合定数と組み合わさった順次ＮＯＥおよび、二次構造付近の、非近接アミノ酸からのＮＯＥから収集したデータは、ポリペプチドの二次構造を特徴付けるために使用される。二次構造の予測だけではなく、ＮＯＥは、プロトンが一次アミノ酸配列および二次構造の両方の空間にあるところの距離を示す。三次構造予測は、すべてのデータが考慮された後、「最適の」外挿によって決定される。
アミノ酸の種類は、まず、スルーボンド接続性を使用して同定される。第二のステップは、周知のアミノ酸配列とともに、周辺の残留物へのスルースペース接続性を使用して、特異アミノ酸を割り当てることである。そして、構造情報は集計され、ＮＯＥは、空間的に近いプロトンの対を同定し、結合定数は、２面角に関する情報を提供し、ゆっくりと交換するアミドプロトンは、水素結合の位置に関する情報を提供する、という主な３種類となる。制限は、距離幾何学法の計算法を使用して構造を計算するために使用され、続いて、制限分子動力学を使用して改良される。これらのコンピュータプログラムのアウトプットは、実験的データと適合する構造の族である（すなわち、一連の対＜０．５ｎｍの距離制限）。構造がデータによって同一されるほど、構造の族は多層となる（すなわち、より良い構造の解像度）。ＮＭＲを使用した、より明確な構造では、ほとんどの重要要素の位置（すなわち、アミド。Ｃ‐αおよびカルボニル原子）および分子の核に埋没するそれらのアミノ酸の側鎖は、結晶学によって得られる構造と同じくらい明確になり得る。しかし、表面に露出するアミノ酸残留物の側鎖は、それほど明確ではないことが多い。これは、恐らく、これらの表面残留物はより可動性であり、固定位置を有さないということを反映する（結晶構造において、これは散光電子密度として見られる場合がある）。
したがって、本発明により、ＮＭＲ分光分析データは、トポグラフィーの構造的理解に基づく、抗ＴＮＦ Ａｂおよびペプチドの少なくとも一部分の構造的類似対に達成するために、計算機モデリングと併用される。この情報を使用して、当業者は、ＴＮＦ結合親和性が、分子の予期される治療または診断に対する使用、好ましくは、ＴＮＦ結合に対するより高い特異性の到達の必要条件に従って変調される、ペプチドの産生を可能にする、合理的に基づいたアミノ酸置換などの、抗ＴＮＦ Ａｂおよび／またはペプチドの構造的類似体への到達法を周知する。
あるいは、抗ＴＮＦ治療薬および診断法として適切な構造的および化学的特徴を有する化合物は、選択的ＴＮＦ親和性を有する構造的類似体を提供する。ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬ、ＩＮＳＩＧＨＴ、およびＤＩＳＣＯＶＥＲを使用した、ＴＮＦ受容体、抗ＴＮＦ抗体、あるいは他のＴＮＦ結合分子などの、ＴＮＦ結合化合物の分子モデリング研究は、本発明による抗ＴＮＦ Ａｂおよび／またはペプチドの前記空間的必要条件および方向を提供する。従って、本発明の前記構造的類似体は、生体外、本来の位置および／または生体内で、選択的、質的および量的抗ＴＮＦ活性を提供する。
さらなる活性剤
本発明における組成物および方法は、さらに活性剤を含んでもよい。例えば、（１）細胞毒性薬、Ｂ細胞除去剤、その複合体、および／または抗サイトカイン剤の効果を強化するためのアジュバンド、（２）自己免疫状態に対して有効なさらなる活性、および／または、（３）自己免疫状態を悪化させる可能性がある状態を含む、患者が患っている他の状態に対する活性としての役割を果たすことができる。
本発明は、ＩＬ−１を調整する自然発生的なヒトタンパク質の組み換え型、ＩＬ−１の作用を阻止する単クローン性抗体、ＩＬ−１５に対して向けられたヒト単クローン性抗体、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを抑制する小分子、異常に機能するＢ細胞の生成を削減する拮抗薬、リボヌクレアーゼおよびその組み合わせなどの薬剤を検討する。例えば、米国特許第５，０７５，２２２号および６，５９９，８７３号、米国特許出願第２００２／００７７２９４号、２００２／０００９４５４号、２００３／００７２７５６号、２００３／０２３６１９３号、２００４／００４４００１号、２００４／００９７７１２号、２００３／０１３８４２１号、２００４／００３９０２９号、および２００４／００４４０４４号に記載され、および国際出願ＷＯ００／４０７１６およびＷＯ０１／０６０３９７に公開された薬などは、そっくりそのままにここに本願に引用して援用する。
また、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、抗骨粗鬆症剤、免疫原化合物、皮膚／太陽光線防護薬、自己免疫状態を悪化すると見られている状況を治療することができる任意の薬、または直接または間接的に自己免疫状態を悪化すると見られている任意の薬を結合して、本発明の結合薬および／または抗サイトカイン剤の使用を、本発明は熟考する。
抗ウイルス剤
本発明は、併用療法で、抗ウイルス剤の使用を熟考する。好ましくは、抗ウイルス化合物は、ウイルス性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害薬、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの処理を効果的にするウイルス暗号化プロテアーゼの阻害薬、血球凝集素エステラーゼの活性を効果的にする細胞である、感染細胞からコロナウイルスの発芽および発する阻害薬、特定細胞表面受容体（例、ｈＡＰＮをＨＣｏＶ−２２９Ｅに結合させる阻害薬）をウイルス結合する阻害薬、およびウイルスエントリーおよびその組み合わせに関連するウイルススパイク糖タンパク質で受容体誘発構造変化をもたらす阻害薬である。
抗ウイルス化合物は、ヌクレオシド／ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）および／またはタンパク質分解酵素阻害薬（ＰＩｓ）融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤、融合阻害剤／ケモカイン受容体拮抗薬、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ６拮抗薬を含み、ケモカイン受容体拮抗薬はまた、融合、インテグラーゼ阻害剤、ヒドロキシウレア様化合物を阻害することができる。
他の抗レトロウイルス剤は、ウイルス・インテグラーゼ阻害剤、アリーレン・ビス（メチルケトン）化合物などのウイルスゲノムの核移行抑制剤、つまり、ＨＩＶ侵入の阻害薬、ＲＡＮＴＥＳおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の可溶性免疫複合体、およびＡＭＤ−３１００の抑制剤である、ジチアン化合物などのヌクレオカプシド亜鉛フィンガー阻害剤、つまり、ＨＩＶ ＴａｔおよびＲｅｖのターゲット、中間薬理エンハンサーであるものを含む。
実施形態によると、本発明の組成物は、リンフォカインを含む他の抗レトロ化合物を構成することができる。
他の実施形態では、本発明の組成物は、追加として、抗日和見感染症薬を構成する。
抗生物質
さらに実施例では、本発明の組成物は、抗生物質製剤を構成する。投与されることができる抗生物質製剤は、アモキシシリン、βラクタマーゼ、アミノグリコシド抗生物質、ベータ・ラクタム（グリコペプチド）、βラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フロロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム・スルファメトキサゾール配合剤、およびバンコマイシンを含むがそれらに限定されない。
免疫抑制剤
本発明は、免疫抑制剤の使用を熟考する。投与されることができる免疫抑制剤は、ステロイド、サイクロスポリン、サイクロスポリンアナログ、シクロホスファミド・メチルプロパンスルホン酸、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５デオキシスパガリン、およびＴ細胞に反応する機能を鎮静することにより役目を果たす他の免疫抑制剤を含むがそれらに限定されない。本発明の治療学を備えて、投与されることができる他の免疫抑制剤は、プレドニゾロン、メトトレキサート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ブレドニン）ブレキナル、デオキシスパガリン、およびアザスピレン（ＳＫＦ １０５６８５）、オルソクローンＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）、サンディミュン、ネオーラル、ＳＡＮＧＤＹＡ（シクロスポリン）、プログラフ（ＦＫ５０６、タクロリムス）、セルセプト（活性代謝物がミコフェノール酸であるミコフェノール酸モフェチル）、イムラン（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、デルタゾン（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（プレドニゾロン）などの副腎皮質ステロイド、フォレックスおよびＭＥＸＡＴＥ（メソトレキサート）オクソラレン‐ウルトラ（メトキサレン）およびラパミューン（シロリムス）を含むがそれらに限定されない。特定の実施形態では、免疫抑制剤は、臓器または骨髄移植の拒絶を防ぐために役立てることができる。
免疫グロブリン
本発明の組成物は、静脈内免疫グロブリン製剤を構成することができる。投与されることができる静脈内免疫グロブリン製剤は、ガンマ、ＩＶＥＥＧＡＭ、サンドグロブリン、ガンマガードＳ／Ｄ、アトガム（抗胸腺細胞グロブリン）およびガミミューンを含むがそれらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の治療学は、移植治療（例、骨髄移植）において、静脈内免疫グロブリン製剤との併用で投与される。
抗炎症薬
ある実施形態では、本発明の組成物は、抗炎症薬を構成する。投与されることができる抗炎症薬は、抗ヒスタミン剤、アミノアリルカルボン酸派生、アリール酢酸派生、アリール酪酸、アリルカルボン酸、アリールプロピオン酸派生、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸派生、チアジンカルボキサミド、ｅアセトアミドカプロン酸、Ｓアデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスライド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサゾール、およびテニダップと同様に、コルチコステロイド（例、βメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド系抗炎症薬（例、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン）を含むがそれらに限定されない。
オリゴヌクレオチド
これらのアンチセンス分子は、標的ウイルス内の遺伝子配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチド構造を含む。ウイルスのＲＮＡに相補的であるホスホロチオネート オリゴヌクレオチドは、細胞培養でウイルス複製の阻害を明示する。ＩＳＩＳ ２９２２は、ＣＭＶに対して強い抗ウイルス活性を備えたホスホロチオネート・オリゴヌクレオチドであり、ＣＭＶの前初期転写ユニットのＲＮＡの領域２に相補的であり、タンパク質組み合わせを抑制する。
インターフェロン
インターフェロンは、ウイルス性または他の外来性の核酸に応えて、感染宿主細胞から放出された自然細胞生成物である。それらは、感染後、早ければ２時間で発見できる。作用の複合機構は、十分に確定されていないが、インターフェロンは、正常な宿主細胞機能を阻害することなく、ウイルス複製を停止するウイルス性ＲＮＡの変換および転写を選択的に阻止する。
免疫原
本発明は、組成物の使用および免疫原性化合物との併用での本発明の方法を熟考する。タンパク質、ポリヌクレオチド、および本発明の相当物を含む、免疫原剤または治療剤は、免疫原性組成物での単独活性免疫原として、または、治療組成物での活性として、投与されることができる、あるいは、前記組成物は、他の免疫原ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または１つ以上の他の微生物病原体（例、無制限のウイルス、プリオン、バクテリア、または真菌）または莢膜多糖類の免疫学的活性タンパク質を含む、他の免疫原および／または治療学を含む。前記組成物は、選択された表示のために要望どおり、1つ以上の好ましいタンパク質、フラグメント、または製薬化合物を構成することができる。同じ方法では、前記組成物内の１つ以上の核酸を使用する本発明の前記組成物は、また、上記で述べたように、同じ多様グループのタンパク質をコード化する核酸を含む。
本発明は、ベクター送達およびベクター発現の使用を熟考する。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現するベクターまたはプラスミド（例、Ｂ細胞除去剤、抗サイトカイン剤など）は、患者へのタンパク質またはポリペプチドを投与するために使用することができる。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、適切な方法で当業者に周知であるものとして述べることができる。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、外来性ポリペプチドとしてポリペプチドまたは免疫原部分の発現に必要な遺伝物質を含み、生ベクターを用いて、特に、組み換え生バクテリア、ウイルスまたは他の生剤を用いて送達することができる。
治療用組成物および投与
本発明は、自己免疫状態を有する患者および自己免疫状態を発展させるリスクでの患者を治療するための組成物および方法を供給する。本発明の組成物は、診断用およびアッセイ状態と同様に、被験者、好ましくはヒト被験者へ投与のための治療用組成物を含む。前記組成物は、好ましくは、本発明の結合の治療効果量を構成するはずである。本発明の使用目的のための適切な治療的に効果のある投与量は、標的疾病または状態を治療、寛解、または防ぐのに必要とされる、または発見できる治療または予防効果を示すための治療剤の量である。Ｂ細胞除去剤として、その結合、および／または抗サイトカイン剤である、治療的に効果のある投与量は、細胞培養アッセイ内または、動物モデル内で、たいてい、齧歯動物、ウサギ、犬、ブタまたは霊長類内のいずれかで、病初では見積ることができる。動物モデルは、また、適切な濃度範囲および投与の経路を決定するために使用可能である。このような情報は、ヒトへの有用量および投与の経路を決定するのに役立てることができる。
本発明の方法は、Ｂ細胞除去剤、Ｂ細胞除去剤の複合体および細胞毒性薬および／または抗サイトカイン剤など、本発明の薬剤および組成物を患者に投与することを含む。好ましくは、前記方法は、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合を患者に投与することを含む。さらに好ましくは、複合は、抗サイトカイン剤との併用で投与される。ましてさらに好ましくは、複合したＢ細胞除去剤は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体であり、複合した細胞毒性薬は、カリチェアミシンであり、抗サイトカイン剤は、エタネルセプトのような抗ＴＮＦ剤である。
個々の活性剤は、同一の組成物の一部である、分離構成または任意の組み合わせとして、投与することができる。好ましくは、Ｂ細胞除去剤またはその結合が、患者に投与される場合、抗サイトカインは、別々に投与される。抗サイトカイン剤は、Ｂ細胞除去剤または複合の同時期または異なる時期に投与することができる。活性剤は、単独で投与されるが、一般的に投与の選択経路および薬務を基本として、意訳的に許容し得る希釈剤を備えて投与される。
明確に説明すると、本発明の組成物は、被験者に直接投与することができる。治療される被験者とは、動物である可能性がある。しかし、化合物および組成物は、ヒト被験者へ投与するために適応することが好ましい。
本発明の組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮的（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９８／２０７３４を参照）皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内、および直腸経路を含むがそれらに限定されない、いくつかの経路により投与される。皮下噴射器はまた、本発明の組成物を投与するために使用できる。通常は、溶液または懸濁液のいずれかの注射液として調整されてもよい。注射を施行する前に液体溶媒内の溶液または懸濁液のための適切な固形もまた調整されてもよい。
その組成物の直接送達は、一般に注射、皮下、腹膜、点滴または筋肉注射により達成され、または組織の間質腔へ送達する。前記組成物はまた、病巣に投与することができる。投与治療は、単一投与計画または複数投与計画であってよい。
ヒト被験者への投与のための明確な効果のある量は、病態の重症度、患者の総体的な健康、年齢、体重および被験者の性別、食事、投与の時間および頻度、複合薬、反応感度、治療への耐性／応答による。この量は、定期実験により決定され、臨床医学者の判断内である。例えば、本発明における結合の効果のある投与量は、０．１ｍｇ／ｍ２から５０ｍｇ／ｍ２まで、好ましくは０．４ｍｇ／ｍ２から３０ｍｇ／ｍ２まで、さらに好ましくは、２ｍｇ／ｍ２から９ｍｇ／ｍ２まであり、その投与量は、結合のＢ細胞除去剤に基づいて、算出される。
組成物は、患者へ個々に投与され、または、他の薬剤、医薬品またはホルモンとの併用で投与される。本発明の単量体の細胞毒性薬派生／抗体結合が投与される投与量は、その結合は、予防的に使用されたか、現状を治療するために使用されたかどうかの治療される状態の質による。本発明の方法は、他の状態または疾病との併用でいくつかの自己免疫疾患を有する患者、および／または、自己免疫疾患および／または他の状態との合併症を有する患者と同様に、自己免疫疾患またはその組み合わせを有する患者を治療することを熟考する。本発明の方法は、当業者に周知であるいくつかの方法内で、患者に１つ以上の治療法を投与することを熟考する。例えば、無制限に、他の療法は、以下の任意の組み合わせで成り立つ。例えば、クローン病を有する患者の治療のためのＮａｔａｌｉｚｕｍａｂ（ＥｌａｎからＴＹＳＡＢＲＩとして入手可能）；例えば、線維筋痛症（ＦＭＳ）を有する患者のための侵害受容器をブロック；例えば、若年性関節炎（ＪＡ）の治療のための血管由来ＣＸＣＬ（ＥＬＲ＋）遺伝子の発現を減少；血管由来ＣＸＣＬ（ＥＬＲ−）遺伝子の発現を増加；例えば、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を有する狼瘡患者が流産を防ぐためのヘパリン治療；例えば、狼瘡を治療するための抗インターフェロン剤；例えば、関節リウマチを治療するための抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）剤；例えば、狼瘡を治療するための１ｑ２３および１６ｑ１２遺伝子の遺伝治療；例えば、骨関節炎（ＯＡ）を治療するための体内で成長させた移植軟骨；プレドニゾンなどの経口ステロイドを用いて治療している関節リウマチ患者において骨関節炎を治療するためのカルシウムおよびビタミンＤ栄養補助食品；例えば、関節リウマチを治療するためのII型コラーゲンのＴ細胞決定因子アナログペプチドを投与；例えば、関節リウマチ患者において骨粗鬆症を治療するためのＲＡＮＫＬサイトカインによるＲＡＮＫ受容体のブロック活性；例えば、ＲＡＮＫＬのおとり受容体としてオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）；例えば、Ｔ細胞反応を抑制するためのワクチンとしてアナログペプチドＣII（２５６−２７６、Ｎ（２６３）、Ｄ（２６６））；例えば、体内のＴ細胞に樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ（Ｍｐｈｉ）によるアナログペプチドＣIIおよびＨＣｇｐ３９提示を達成；例えば、炎症性関節炎を治療するためのアンジオポエチン１（Ａｎｇ−１）を下方制御；例えば、ＲＡからの合併症を予防するためのビタミンＢ６を投与；例えば、ＲＡを治療するための壊死因子（ＴＮＦ）またはインターロイキン１（ＩＬ−１）標的にする薬剤を投与；例えば、ＲＡを治療するための酵素酵素ＮＦ−ｋＢまたはマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）を抑制する薬剤を投与；例えば、ＲＡを治療するための抗血管形成剤（典型的には、癌治療のために使用）を投与；例えば、ＲＡを治療するためのヒドロキシクロロキン、ＮＳＡＩＤ、またはメトトレキサートを投与；患部関節にステロイド注射；生物製剤である、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、およびアナキンラのうちの１つを投与；例えば、狼瘡患者において、関節腫脹に、ＮＳＡＩＤセレコキシブまたはＮＳＡＩＤジェルジクロフェナクおよびケトプロフェン；例えば、炎症性腸疾患を治療するためのコルチコステロイドを投与；例えば、狼瘡を治療するためのブロモクリプチン、ロイプロリド、またはデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のようなホルモン介入を投与；例えば、狼瘡を治療するための治療薬メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリンＡおよびミコフェノール酸モフェチルを投与；例えば、狼瘡を治療するためのツキシマブ（抗ＣＤ２０）抗Ｃ５ａ（Ａｌｅｘｉｏｎ）ＬＪＰ３９４（Ｒｉｑｕｅｎｔ）、ＬＪＰ１０８２、ＣＴＬＡ−４１ｇ、ＥＴＩ−１０４、抗ＩＬ−１０単クローン、およびＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ Ｂなどの生物学的薬剤を投与；例えば、狼瘡関連の肺高血圧を治療するためのボセンタンまたは静脈内プロスタグランジン派生を投与；例えば、狼瘡関連の肺胞出血を治療するためのアフェレーシスを投与；例えば、血小板減少症関連の狼瘡を治療するための静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）を投与；例えば、敗血症性関節炎を治療するための抗生物質を投与；例えば、ＲＡを治療するためのエタネルセプトまたはインフリキシマブを投与；例えば、ＲＡを治療するためのアナキンラを投与；例えば、巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）を治療するための糖質コルチコイド、アセチルサリチル酸、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦを投与；糖質コルチコイド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、ミコフェノール酸モフェチル、およびシクロホスファミドを投与；例えば、骨関節炎を治療するためのグルコサミンおよびコンドロチンを投与；例えば、関節リウマチを治療するための低用量プレドニゾンを投与；例えば、ＲＡを治療するためのカルシウム、ビタミンＤ、ビスフォスフォネート、カルシトニン、エストロゲン／テストステロン、およびヒト上皮小体ホルモン（ｈＰＴＨ）および／または糖質コルチコイドを投与；ケリキシマブを投与；例えば、ＣＤ４０などの受容体を抑制する共同促進遮断薬を投与；メトトレキサート、レフルノミド、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−１を投与；ケモカイン拮抗薬を投与；例えば、ＲＡを治療するための細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）を投与；例えば、ＲＡ患者において破骨細胞形成を抑制するためのオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を投与；例えば、ＲＡにより生じた骨粗鬆症の治療に効く上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）成長ホルモン（ＧＨ）インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）１、ストロンチウム、フッ化物、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２、ＢＭＰ−７（または、骨形成１［ＯＰ−１］と称する）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の投与；および例えば、ＲＡまたは任意のその組み合わせを治療するためのヒアルロン酸（ＨＡ）の投与である。
投与量の頻度は、結合の半減期およびその効果の継続期間による。前記結合が短い半減期（例、２から１０時間）を有する場合、一日ごとに１つ以上の投与量を与える必要がある。あるいは、前記結合分子が長い半減期（例、２から１５日間）を有する場合、一日に一度、一週間に一度、または１または２ヶ月ごとに一度の投与を与えることのみひつようである可能性もある。
好ましくは、組成物は、抗体結合の投与のための意訳的に許容し得る希釈剤を含む。前記希釈剤は、組成物を個々に受取るのに有害な抗体の生成をそれ自身誘発すべきでなく、有毒であるべきではない。適切な希釈剤は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などのような大きな、ゆっくりと代謝される高分子であってよい。
医薬的に容認可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの無機酸塩、またはアセテート、プロピオン酸塩、マロネートおよび安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。
これらの組成物に医薬的に容認可能な希釈剤は、水、グリセロール、およびエタノールなどの液体をさらに含んでもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助剤またはｐＨ緩衝物質は、前記の組成物に与えても良い。前記の希釈剤は、患者への投与のために錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液体、ジェル、シロップ、懸濁液または検査液として組成物を策定することができる。
投与の好ましい形状は、例えば、注射または点滴による、例えば、大量瞬時注射または持続注入による非経口的投与に適している形状を含む。生成物が注射または点滴向けである場合、それは、油性または水性媒体で懸濁液、溶液、または乳液の形をとり、懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。
緩衝共役溶液の安定性は、短期安定には適切であるが、長期安定には不向きである。結合の安定性を強化し、保存寿命を増加させるために、抗体剤結合は、適切な無菌液と共に使用前に再構成のために乾燥型に凍結乾燥することができる。タンパク溶液の凍結乾燥と関連する問題は、文書で十分に立証されている。二次、三次、および四次構造の損害は、冷凍および乾燥処理の間に起こる可能性がある。それゆえに、抗凍結剤は、凍結乾燥処理中、結合の非晶質安定剤の機能を果たし、タンパク質構造の完全性を維持することを含まなければならない。ある実施形態では、本発明に役立つ抗凍結剤は、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ポリエチレン・グリコールおよびその組み合わせなどの糖アルコールである。他の実施形態では、抗凍結剤は、アルドン酸、ウロン酸、糖酸およびその組み合わせを含む、糖酸である。
本発明の抗凍結剤は、また、炭水化物であってもよい。相当する炭水化物は、２つ以上のヒドロキシル基を含んだアルデヒドまたはケトン化合物である。炭水化物は、例えば、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジトール、イノシトール、アルドン酸、ウロン酸、または糖酸、またはその組み合わせを環状または線上であり、含んでもよい。炭水化物はまた、例えば、二糖類か多糖類などの単一、２つ、または多くの炭水化物であってもよい。相当する炭水化物は、例えば、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシローズ、ガラクトース、ブドウ糖、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、ブドウ糖、果糖、グルコン酸、ソルビット、乳糖、マンニトール、メチルαグルコピラノシド、麦芽糖、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、蔗糖、トレハロースまたはノイラミン酸、またはその派生を含む。相当する多炭水化物は、例えば、アラビナン、フルクタン、フーカンス、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えば、イヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンゴム、またはでんぷんを含む。特に有用な炭水化物では、サッカロース、ブドウ糖、乳糖、トレハロース、およびその組み合わせである。サッカロースは、特に有用な抗凍結剤である。
望ましくは、本発明の抗凍結剤は、炭水化物または「糖」アルコールであり、それは多価アルコールであってもよい。多価化合物は、１つ以上のヒドロキシル基を含む組成物である。望ましくは、多価化合物は線上である。相当する多価化合物は、例えば、エチレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、およびポリプロピレン・グリコールなどのグリコール、またはその組み合わせを含む。
好ましい実施形態では、抗凍結剤は、サッカロース、トレハロース、マンニトール、またはソルビトールである。
発明のある実施形態で有効成分は、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合であることは、高く評価される。そのようなものとして、胃腸管での劣化を受け入れることができる。従って、組成物が胃腸管を用いる経路により投与される場合、組成物は劣化からの結合を保護するが、胃腸管から吸収されるとすぐに結合を放出する薬剤を含む必要がある。
医薬的に容認可能な基剤、希釈剤などの徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）に見ることができる。当業者に周知であるような適切な基剤、希釈剤などの使用は、本発明により考慮されている。
特に本発明は、表面でＣＤ２２抗原を発現する細胞に特徴付けられる増殖性疾患を治療で用いる単量体カリケアミシンの派生／抗ＣＤ２２ヒト化抗体（Ｇ５／４４）を供給する。
さらに本発明は、ＣＤ２２に発現する細胞に特徴付けられる増殖性疾患を治療で用いる組成物または医薬の製造で単量体カリケアミシンの派生／抗ＣＤ２２ヒト化抗体（Ｇ５／４４）の使用を供給する。
単量体カリケアミシンの派生／抗ＣＤ２２ヒト化抗体（Ｇ５／４４）はまた、ここに公開された組成物または医薬を用いて治療している被験者において示すＣＤ２２を発現する細胞を標的とすることを望む治療に使用することができる。特に、組成物または医薬は、自己免疫疾患を持つヒトまたは動物を治療するのに使用される。ＣＤ２２発現細胞は、体内の循環または体内の特定の所で局所的に好ましくない多数で示すことがある。
本発明で用いるために熟考された生物活性剤は、成長因子、サイトカイン、および細胞毒性薬を含む。単量体カリケアミシンの派生／抗ＣＤ２２ヒト化抗体（Ｇ５／４４）と共に使用できる細胞毒性薬は、最高３日まで使用可能なドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシン、およびバルルビシンなどのアントラサイクリン；およびシタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロクスウリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、グウゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフューリンなどのピリミジンまたはプリン・ヌクレオシドを含む。結合との併用で投与できる他の化学療法剤／抗腫瘍剤は、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タクソールおよびその様々なアナログ、およびマイトマイシンを含む。単量体カリケアミシンの派生／抗ＣＤ２２ヒト化抗体（Ｇ５／４４）は、１つ以上のこれらの治療剤を用いて共に投与できる。あるいは、結合は、１つ以上のこれらの治療剤を用いて連続して投与できる。
Ｂ細胞除去剤、細胞毒性薬、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合および／または抗サイトカイン剤は、成長因子、サイトカイン、ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）などの抗体、および化学療法剤などの他の生物活性剤の組み合わせを用いて、治療計画の一部として、単独で、共に、または連続して投与できる。治療計画は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシン、およびビンクリスチン）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量プレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）、ＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＡＢＶで変化する（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）およびＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）で変化するＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、およびＣｈｌＶＰＰ（クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）など、本発明により治療計画を熟考する。治療は、導入療法段階、地固め療法段階および維持療法段階を有することができる。Ｂ細胞除去剤、細胞毒性薬、細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合および／または抗サイトカイン剤はまた、導入療法段階、地固め療法段階および維持療法段階の一部として、単独で、共に、または連続して投与できる。
本発明の複合体はまた、組み合わせ処方計画の一部として、他の生物活性および化学療法薬と共に投与できる。例えば、制限なく、前記治療計画は、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル‐グリコサミノグリカン、イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン、およびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、高用量シタラビン、およびシスプラチン）、ＥＰＯＣＨ（シクロホスファミド注射および経口プレドニゾンを用いて９６時間のエトポシド、ビンクリスチン、およびドキソルビシン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ＣＡＭＰ（ロリムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニゾン）、ＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ−Ｂ．（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ＣＥＰＰ−Ｂ（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、およびブレオマイシン）、およびＰ／ＤＯＣＥ（エピルビシンまたはドキソルビシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびプレドニゾン）などのいずれかを含むことができる。さらに治療計画は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）−ＣＭＣ−５４４（ＣＭＣ−５４４は、そっくりそのままに参照より示される米国特許出願第ＵＳ２００４／０８２７６４号およびＰＣＴ公開ＷＯ０３／０９２６２３に説明がある。）を用いた段階１の第一選択治療として、ＣＨＯＰ−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）ＣＨＯＰ−ＣＭＣ−５４４またはＣＨＯＰ−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）−ＣＭＣ−５４４を用いた段階２および段階３に続いて含むことができる。あるいは、段階１は、ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）−ＣＭＣ−５４４を用いた第一選択治療と、続いてＣＯＰ−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）、ＣＯＰ−ＣＭＣ−５４４またはＣＯＰ−リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）−ＣＭＣ−５４４を用いた段階２および段階３を有する。さらなる実施形態では、治療は、段階１における、抗体剤結合ＣＭＣ−５４４を用いた第一または第二選択治療と、続いてＣＭＣ−５４４およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＭＣ−５４４およびＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）とＣＭＣ−５４４の併用またはリツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）単独を用いた段階２および３を含んでもよい。さらに他の実施形態では、抗体剤結合ＣＭＣ−５４４を用いた第一選択治療と、続いてＣＭＣ−５４４単独またはＥＳＨＯＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、高用量シタラビン、ビンクリスチンおよびシスプラチン）、ＥＰＯＣＨ（シクロホスファミド注射および経口プレドニゾンを用いて９６時間のエトポシド、ビンクリスチン、およびドキソルビシン）、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）、ＡＳＨＡＰ（アドリアマイシン、ソルメドロール、Ａｒａ−Ｃ、およびシスプラチン）、ＭＩＭＥ（メチル‐グリコサミノグリカン、イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）およびＩＣＥ（イホスファミド、シクロホスファミド、およびエトポシド）またはその任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない他の治療計画との併用で、段階２および３を含んでもよい。様々な細胞毒性薬の詳細は、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ． Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｔ． ＤｅＶｉｔａ、Ｓａｍｕｅｌｏ Ｈｅｌｌｍａｎ、Ｓｔｅｖｅｎ Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、第６版、発行者：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ（２００１）およびＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｒｕｇ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄｓ． Ｅｄｗａｒｄ Ｃｈｕ およびＶｉｎｃｅｎｔ Ｔ． ＤｅＶｉｔａ、発行者：Ｊｏｎｅｓ およびＢａｒｔｌｅｔｔ、（２００２）において探すことができる。
前記組成物の製剤は、この分野における当業者には周知のことである。本発明の組成物は、好ましくは医薬的に容認可能な希釈剤（すなわち、薬剤送達システム）を含む。相当する医薬的に容認可能な希釈剤は、任意のおよびすべての従来の溶剤、分散媒体、賦形剤、固体基材、水溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および前記同類を含む。相当する医薬的に容認可能な希釈剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよび前記同類のうち１つ以上をその組み合わせと同様に含む。医薬的に容認可能な希釈剤は、さらなる湿潤剤または乳化剤、保存または緩衝などの少量の補助剤を含み、それは、抗体の保存寿命または効果を強化できる。医薬的に容認可能な希釈剤の製剤および使用は、当業者に周知のことである。あらゆる従来媒体または薬剤が活性成分と混合できない場合を除いて、本発明の組成物でのその使用を熟考する。
前記治療組成物は、経口または鼻腔内と同様に、皮下または筋肉内のどちらかに、例えば注射により非経口で投与できる。筋肉内免疫のための方法は、ＷｏｌｆｆらおよびＳｅｄｅｇａｈらにより説明される。投与の他の形態は、例えば、制限なく、経口製剤、肺臓製剤、坐剤、および経皮投与等を用いる。経口製剤は、例えば、制限なく、マンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および前記同類などの医薬品グレードのような例えば、通常使用される賦形剤などを含む。
本発明はまた、医薬的に容認可能な賦形剤、希釈剤または基材と共に本発明の単量体の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合を混合し、治療用または診断用組成物／製剤を含む製剤の処理を供給する。
単量体の細胞毒性薬／Ｂ細胞除去剤結合は、治療用または診断用組成物／製剤に固体活性成分であり、またそれは、例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体などの抗体成分、または抗サイトカイン剤など、抗ＴＮＦ剤（例、エタネルセプト）など、成長因子、ホルモン、抗ホルモン、細胞毒性薬およびキサンチンなど抗体成分を含まないものを含む、他の活性成分を伴う。
本発明の細胞毒性薬派生／Ｂ細胞除去剤複合体と共に使用されるサイトカインおよび成長因子は、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのインターロイキンを含む。
本発明の細胞毒性薬派生／Ｂ細胞除去剤複合体と共に使用されるホルモンは、ジエチルスチルベストロールおよびエストラジオールなどのエストロゲン薬、テストステロンおよびハロテスチンなどのアンドロゲン、メゲースおよびプロベラなどのプロゲスチン、およびプレドニゾンなどの皮質ステロイド、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンを含む。
抗エストロゲン、すなわち、タモキシフェン、抗男性ホルモン物質、すなわち、フルタミドおよび抗副腎皮質剤などの抗ホルモンは、本発明の細胞毒性薬派生／Ｂ細胞除去剤結合と共に使用することができる。
本発明の複合体と同様に、投与される抗サイトカイン剤の用量は、もちろん、特定薬剤の薬力学的特性などの既知因子、およびその投与の方法および経路、受容者の年齢、健康、および体重、症状の種類および程度、併用療法の種類、治療の頻度、および望まれる効果により異なる。
例えば、抗ＴＮＦ剤エタネルセプトなどの通常の抗サイトカイン剤の１日投与量は、体重１キログラム当たり、約０．０１から１００ミリグラムである。１日に１〜６回の分割された投与量または持続している承諾書で与えられた１日あたりのキログラムあたり、通常、１．０〜５、および好ましくは、１〜１０ミリグラムは、必要な結果を得るのに有効です。
無制限の例としては、治療は、抗ＴＮＦペプチドなどの抗サイトカイン剤、本発明の単クローンキメラおよび／または日常抗体の１日投与量は、以下のように供給される。１日あたり、０．５、０．９、１．０、１．１，１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇなど、１日少なくとも１回で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、またはあるいは、１週間に少なくとも１回で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、またはその任意の組み合わせ、２４、１２、８、６、４または２時間ごとに、単一または分割用量、またはその組み合わせを用いて、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの投与が供給される。
ＴＮＦの循環濃度が、非常に低い傾向があり、非敗血症性の個人内で約１０ｐｇ／ｍｌの範囲で、敗血症性患者内で約５０ｐｇ／ｍｌに達し、敗血症候群内で１００ｐｇ／ｍｌを超え（Ｈａｍｍｅｒｌｅ、Ａ． Ｆ． ｅｔ ａｌ，、１９８９、ｉｎｆｒａ）、ＴＮＦ媒介病理学のサイトで検出可能である場合があるため、それは、高親和性および／または強力な生体内のＴＮＦ抑制および／または中和抗体、フラグメントまたはその範囲、ＴＮＦ媒介病理学のＴＮＦ免疫学的検定および治療の双方のために、使用されることが望ましい。前記抗体、フラグメントまたは範囲は、好ましくは、Ｋａとして発現されたｈＴＮＦ−αのための親和性、少なくとも１０８ Ｍ．ｓｕｐ．−１、さらに好ましくは、１０８〜１０１０ Ｍ− １、５ｘ１０８ Ｍ−１、８ｘ１０８ Ｍ−１、２ｘ１０９ Ｍ−１、４ｘ１０９ Ｍ−１、６ｘ１０９ Ｍ−１、８ｘ１０９ Ｍ−１などの、少なくともｌ０９ Ｍ−１、または任意の範囲またはその中の価値を有する。
本発明によれば、人間治療用途のために好まれているのは、ＴＮＦ誘発ＩＬ−６分泌をブロックする強力な生体内のＴＮＦ−α抑制および／または中和活性を有する、高親和性のマウスおよびキメラ抗体、およびフラグメント、範囲および派生である。また、人間治療用途のために好まれているのは、生体内で、原位置で、および生体外で、ＥＬＡＭ−ＩおよびＩＣＡＭ−Ｉなどの細胞接着分子のＴＮＦ誘発発現をブロックし、ＴＮＦマイトジェン活性をブロックするものを含む、ＴＮＦ誘発凝血促進活性をブロックする前記高親和性のマウスおよびキメラ抗体、およびフラグメント、範囲およびその派生である。
本発明の組成物は、好ましくは、医薬的に容認可能な基材を含む。相当する医薬的に容認可能な基材および／または希釈剤は、任意のおよびすべての従来の溶剤、分散媒体、賦形剤、固体基材、水溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および前記同類を含む。相当する医薬的に容認可能な希釈剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよび前記同類のうち１つ以上をその組み合わせと同様に含む。医薬的に容認可能な希釈剤は、さらなる湿潤剤または乳化剤、保存または緩衝などの少量の補助剤を含み、それは、抗体の保存寿命または効果を強化できる。医薬的に容認可能な希釈剤の製剤および使用は、当業者に周知のことである。あらゆる従来媒体または薬剤が活性成分と混合できない場合を除いて、本発明の組成物でのその使用を熟考する。
本組成物は、経口または鼻腔内と同様に、皮下または筋肉内のどちらかに、例えば注射により非経口で投与できる。筋肉内免疫のための方法は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．およびＳｅｄｅｇａｈ ｅｔ ａｌ．により説明される。投与の他の形態は、例えば、制限なく、経口製剤、肺臓製剤、坐剤、および経皮投与等を用いる。経口製剤は、例えば、制限なく、マンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および前記同類などの医薬品グレードのような例えば、通常使用される賦形剤などを含む。
体内投与に適している投薬量（組成物）は、一般的には、単位当たり約０．１ミリグラムから約５００ミリグラムの活性成分を含む。これらの製薬組成物には、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいた重さにより約０．５〜９５％の量で示される。
非経口的投与のために、抗サイトカイン剤は、例えば、抗ＴＮＦペプチドまたは抗体は、医薬的に容認可能な非経口賦形剤に関連する溶液、懸濁液、乳濁または冷凍凍結粉剤として明確に示すことができる。前記賦形剤の実施例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。また、固定油としてリポソームおよび非水性賦形剤が使用できる。賦形剤または冷凍凍結粉剤は、等調性（例、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学安定性（例、緩衝および保存料）を維持する添加剤を含む。前記製剤は、一般的に使用される方法によって殺菌される。
相当する薬剤的な基材は、この技術分野の標準参照テキストである、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌの最新版で説明される。本発明の組成物および方法は、例えば、本発明の実施に従って、支持療法などの他の治療との併用で使用できる。
本発明の実施によれば、本発明の組成物は、静脈内（ＩＶ）の体液に伴う患者に施すことができる。例えば、本組成物は、静脈内（ＩＶ）の袋内に含まれ、静脈内（ＩＶ）線のロックへと注射することができる。
他の実施では、本発明の組成物は、酸素または他のそのような治療伴う患者に施すことができる。例えば、本発明の組成物は、噴霧器を通じて投与することができる。
例えば、注射による投与に適している非経口組成物は、０．９％の塩化ナトリウム液体において、活性成分の重量の１．５％を溶かすことによって、準備されます。
どんな効果的な投与経路も、活性剤を治療的に投与することができる。注射する場合、抑制剤は、例えば、大量瞬時注射または連続点滴による、関節内、静脈内、筋肉内の、病巣内、腹腔内の、または、皮下の経路を通じて、投与できる。他の適切な投与手段は、移植、エーロゾル吸入、点眼剤、錠剤、シロップ、トローチ剤またはチューインガムを含む経口製剤、およびローション、ジェル、スプレー、軟膏剤などの局所用製剤または他の適切な方法からの持続放出を含む。あるいは、可溶性ＴＮＦＲなどのタンパク性抗サイトカイン剤は、タンパク質を発現する培養細胞を移植することにより投与できる。抑制剤が１つ以上の生物学的活性化合物との併用で投与される場合、これらは同一または異なる経路により投与でき、同時、別々にまたは連続して投与できる。
ＴＮＦＲ：Ｆｃまたは他の可溶性ＴＮＦＲなどの抗サイトカイン剤は、好ましくは、生理学的に容認可能な基材、賦形剤または希釈剤と併用して、精製した組み換え型タンパク質を有する生理学的に容認可能な組成物の形で投与される。前記基材は、使用される用量および濃度において受容者に毒性を持たない。通常、前記組成物の製剤は、緩衝を備えた抗ＴＮＦ−α剤などの抗サイトカイン剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（ｌ０より少ないアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、ブドウ糖などの炭水化物、サッカロースまたはデキストリン、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤と結合することを伴う。中性緩衝食塩水または同種血清アルブミンに混ぜられた塩水は、模範的適切な希釈剤である。また、適切な業界基準によると、ベンジルアルコールなどの保存剤を加えることができる。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、好ましくは、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例、サッカロース）を用いて凍結乾燥として明確に示す。前記成分は、使用される用量および濃度において受容者に毒性を持たない。医薬品製剤に使用できる成分のさらなる実施例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０に示される。
適切な投与量は、標準用量試験で決定され、投与の選択経路により変更することができる。投与量および頻度は、治療を受ける指示の性質および重症度、期待応答、患者の年齢および状態などの因子による。
ＴＮＦＲ：Ｆｃなどの抗サイトカイン剤を、好ましくは、１週間に１回、さらに好ましくは、１週間に少なくとも２回、およびさらにいっそう好ましくは、１週間に少なくとも３回投与する。成人患者は１８歳以上である。注射する場合、成人一人につきＴＮＦＲ：Ｆｃの効果的な量は、１〜２０ｍｇｍ．ｓｕｐ．２からの範囲で、好ましくは、約５〜１２ｍｇ／ｍ．ｓｕｐ．２を投薬する。あるいは、均一投与量は、１回分５〜１００ｍｇの範囲で変化し、投与できる。皮下注射によって投与される均一投与量のための模範的投与量域は、１回分５〜２５ｍｇ、１回分２５〜５０ｍｇおよび１回分５０〜１００ｍｇである。本発明の実施形態では、下記に説明されるさまざまな指示は、１回分２５ｍｇのＴＮＦＲ：Ｆｃに含まれる、またはあるいは、１回分５０ｍｇのＴＮＦＲ：Ｆｃに含まれる注射にふさわしい製薬を投与することにより治療される。２５ｍｇまたは５０ｍｇの投与量は、特に慢性状態のために繰り返して投与できる。注射より他の経路で使用される場合、投与量は、標準医療と一致して適切に調整される。多くの例では、少なくとも３週間以上で１週間あたり１〜３回ＴＮＦＲ：Ｆｃを１回分約２５ｍｇ、または少なくとも３週間、１週間あたり１〜３回ＴＮＦＲ：Ｆｃを１回分約５０ｍｇを注射することにより、長期間の治療が改善の望まし程度を誘発するのに必要であるが、患者の状態における改善を得ることができる。不治の慢性の状態において、患者の医師が、必要であるとそのようなものが考える場合、投与量および頻度を調整しながら、治療計画は、無期限に続けられる場合がある。
小児科の患者（年齢４〜１７歳）にとって、適切な治療計画は、０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射、ＴＮＦＲ：Ｆｃの最大投与量２５ｍｇまでの、１週間に１回以上の皮下注射による投与を伴う。
本発明は、同じ患者に投与される１つ以上の他剤と共に、各薬がその薬物に適当な治療法に従って投与されながら、さらなる抗サイトカイン剤の投与を含む。「同時投与」は、薬が次々に投与されたり、１つの成分が長期投与されたり、他が断続的に投与されたりするような治療法と同様に、組み合わせの成分と共に同時または連続した治療を含む。成分は、同じまたは異なる投与経路により、同一のまたは別々の組成物で投与してもよい。同時に投与される薬の実施例は、抗ウイルス、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、ＤＭＡＲＤ、および非ステロイド抗炎症剤を含むがそれらに限定されない。投与可能なＤＭＡＲＤは、アザチオプリン、シクロホスファミド、サイクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキサート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および経口金、金チオリンゴ酸ナトリウムやアウロチオグルコースなどの金化合物を含む。
抗サイトカイン剤は、さらに１つ以上の抗サイトカイン剤に結合することができる。例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃは、第２の抗ＴＮＦ−α剤を結合することができ、それは、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦＲに対する抗体、ＴＮＦ−α（米国特許第５，７９５，８５９号または米国特許第６，１０７，２７３号に記載されるものなど）の拮抗阻害剤として使えるＴＮＦ−α派生ペプチド、ｐ５５ ＴＮＦ−α受容体の細胞外の部分を含むものなどのエタネルセプト以外のＴＮＦＲ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＩｇＧ融合タンパク質以外の可溶性ＴＮＦＲ、またはＴＮＦ−α変換酵素（例、米国特許第５，５９４，１０６号を参照）の抑制剤などの内因性ＴＮＦ−αレベルを減少させる他の分子、または任意の小分子またはペントキシフィリンまたはサリドマイドを含む、上記に記載されたＴＮＦ−α抑制剤を含んで、結合することができる。
ＴＮＦ−αに対する抗体が抗ＴＮＦ−α剤として使用される場合、好ましい投与量域は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、およびさらに好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＴＮＦ−α抗体のためのその他の好ましい投与量は、体重のｋｇ当たり０．７５から７．５ｍｇである。ヒト化した抗体（すなわち、抗体分子の抗原結合一部だけが非人的源から派生する抗体）は、好ましい。以下記載される疾病を治療するための模範的ヒト化された抗体は、１４９，１００ダルトンの概分子量を有するキメラＩｇＧ１−κ単クローン抗体であるインフリキシマブ（レミケードとしてＣｅｎｔｏｃｏｒから販売）である。インフリキシマブは、インフリキシマブは、ヒトの定常領域、および、マウス可変領域で構成され、特にヒトＴＮＦ−ａに割り当てられる。他の適応する抗ＴＮＦ−α抗体は、ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７およびＣＤＰ５７１、およびＥＰ ０ ５１６ ７８５ Ｂ１、米国特許第５，６５６，２７２号、ＥＰ ０ ４９２ ４４８ Ａ１に記載される抗体を含む。前記抗体は、注射または静脈内に投与してもよい。
本発明のある好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ−α剤を用いて治療可能なここに開示された様々な内科的疾患は、別の抗サイトカイン剤との併用で治療される。例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃなどの可溶性ＴＮＦＲは、受容体を備えた他の炎症性サイトカインの相互作用を抑制する化合物をまた含む組成物に投与することができる。ＴＮＦＲ：Ｆｃとの併用で使用されるサイトカイン抑制剤の実施例は、例えば、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６またはＩＬ−８の拮抗薬を含む。ＴＮＦＲ：ＦｃなどのＴＮＦ−α抑制剤はまた、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２およびプロテインキナーゼＡ型１の抑制剤との併用で、抗レトロウィルス薬療法を受けているＨＩＶ感染患者でＴ細胞増殖を増進するために投与できる。さらに、ＴＮＦ−α抑制剤は、悪性リンパ腫を治療するためにＩＬ−１３の抑制剤に結合することができる。
ここに記載された疾患を治療するための他の組み合わせは、同時に抗ウイルスである化合物と共に投与されるＴＮＦＲ：Ｆｃを含む。
さらに、対象の発明は、その必要性においてヒト患者を治療するための方法である、抗ＴＮＦ剤およびＩＬ−６抑制剤の治療効果のある量を患者に投与するために伴う方法を供給する。
本発明はまた、自己免疫疾患の予防または治療療法のための薬物の製造でＴＮＦＲ：Ｆｃなどの開示された抗サイトカインの使用に関連する。
それ故に、本発明は、抗ＴＮＦ抗体（Ａｂ）を有する抗ＴＮＦ化合物および組成物および／または、生体外、原位置および／または生体内でのＴＮＦ生物活性を抑制および／または中和する抗ＴＮＦペプチド、ヒト腫よう壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）および／またはヒト腫よう壊死因子β（ｈＴＮＦ−β）の中和エピトープとの関連に対して特異なものとして、供給する。前記抗ＴＮＦ抗体またはペプチドは、自己免疫疾患を治療するために使用する実用性を有する。
本発明の抗ＴＮＦペプチドおよび／または抗体は、表面に関連するＴＮＦの有する細胞に対して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を媒介する能力によって治療効率のために適合させることができる。これらの活性において、効果細胞（ＡＤＣＣのための）または補体成分（ＣＤＣのための）の内因性源または外因性源のどちらかが使用可能である。マウスおよび派生抗体、本発明のフラグメントおよび範囲、そのフラグメント、および派生物は、免疫複合体（Ｄｉｌｌｍａｎ、Ｒ．Ｏ．、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：５９２−６０３（１９８９）概説用として参照）として、治療的に使用可能である。前記ペプチドまたは抗体は、リシンＡ、シュードモナス毒素およびジフテリア毒素を含むがそれらに限定されない、細胞傷害性タンパク質と結合することができる。抗体または他の配位子またはペプチドを複合した毒素は、当技術分野で周知のことである（例えば、Ｏｌｓｎｅｓ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １０：２９１−２９５（１９８９）を参照）。植物および細菌毒素は、通常タンパク質の合成の機構を混乱させることによって、細胞を殺す。
本発明の抗ＴＮＦペプチドおよび／または抗体などの抗サイトカインは、放射性核種、治療剤、細胞毒性剤および薬を含むがそれらに限定されない、治療部分の追加形式に複合することができる。抗体類と結合して、生体内で抗原のサイトに送達することができる放射性核種に関する実施例は、．ｓｕｐ．２１２ Ｂｉ．ｓｕｐ．１３２ Ｉ、．ｓｕｐ． １８６ Ｒｅ、および．ｓｕｐ．９０ Ｙを含み、そのリストが完全であることが意図されない。放射性核種は、放射線療法の技術分野で周知であるように、様々な細胞内の病斑に通じて、細胞を局所的に照射することにより、細胞毒性効果を出す。
抗ＴＮＦペプチドおよび／または抗体などの抗サイトカインに複合され、続いて生体内の療法に使用されることができる細胞毒性薬は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびマイトマイシンＣを含むがそれらに限定されない。細胞毒性薬はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を含む重要な細胞過程を妨げる。当技術分野で周知である薬の分野の説明、および作用機序においては、Ｇｏｏｄｍａｎら、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、第８版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９０を参照する。
本発明の抗ＴＮＦペプチドおよび／または抗体などの抗サイトカインは、他の単クローン性または通常の多くのキメラ抗体、フラグメント、および範囲との併用で、またはリンフォカインまたは造血成長因子などとの併用で、有利に使用でき、それは、抗体と相互に作用する効果細胞の数または活性を増加する働きをする。
本発明の抗ＴＮＦペプチドおよび／または抗体、フラグメント、および派生はまた、ＴＮＦ療法との併用で、ＴＮＦに望まれない副作用を妨げるのに使用可能である。例えば、癌療法への最近の手法は、癌患者へのＴＮＦの直接投与または、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を用いて癌患者への免疫療法（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１３：１４８５−１４９２（１９８５））または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（Ｋｕｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ． ３８：３６７−３８０（１９８６）；Ｋｒａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４：７６−８５（１９８７）；Ｋｒａｄｉｎｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２０：３３６−３３８（１９８８））を含む。試用は、現在、修正ＬＡＫ細胞または大量のＴＮＦを生成するためにＴＮＦの遺伝子と共に核酸を入れるＴＩＬを使用することを進行中である。前記治療方法は、ここに記載され、従来の技術に周知であるように、ＴＮＦの多面作用により多くの望まれない副作用に関連する可能性が高い。本発明によれば、これらの副作用は、被験者が本発明の抗体、フラグメントまたは派生と共に大量のＴＩＬを生成するＴＮＦまたは細胞を受ける同時治療により削減することができる。効果のある投与量は、上記に記載された通りである。ＴＮＦの主な抗腫瘍効果を妨げないで副作用を妨げるために、投与されるＴＮＦの投与量またはＴＮＦ生産細胞に従って、投与量水準は調節を必要とする。技術分野において通常の技量を有する者は、過度の実験なしで同量を測定する方法を周知である。
本発明は、任意の自己免疫疾患および前記同類、任意のその組み合わせを含む、治療を熟考する。非制限の模範的自己免疫疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、グルテン腸症・皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円盤状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギラン−バーレ、橋本甲状腺炎、突発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫性血球減少症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性内分泌不全症、リウマチ性多発性筋痛症、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性硬変、乾癬、レイノー病、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性狼蒼、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑症、およびウェジナー肉芽腫症を含む。例えば、制限なく、本発明の方法は、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性狼蒼（ＳＬＥ）；免疫性血球減少症（例、突発性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血）；自己免疫性血管炎、線維筋痛症候群（ＦＭＳ）；若年性関節炎（ＪＡ）；抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）；骨関節炎（ＯＡ）；プレドニゾンなどの経口ステロイドを用いて治療している患者における関節リウマチ；炎症性関節炎；炎症性腸疾患；狼瘡性肺高血圧症；狼瘡性肺包出血；狼瘡に関連する血小板減少症；化膿性関節炎；巨細胞性関節炎（ＧＣＡ）；またはＲＡまたはその組み合わせにより生じた骨粗しょうなど、その状態または組み合わせのうちいずれかを有する患者を治療するために熟考する。
好ましくは、本発明の方法は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性狼蒼（ＳＬＥ）、免疫性血球減少症（例、突発性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血）、および／またはヒト自己免疫性血管炎またはその組み合わせの治療に指示する。
選別法
本発明は自己免疫疾患に対して有効な薬剤、組成物、治療を特定するための選別法を検討する。ある実施態様によれば、選別法は動物モデルに候補治療を施すステップとその治療の有効性を監視するステップとを含む。好ましくは、前記動物モデルはＣＩＡマウスモデルである。他の実施態様によれば、選別法は無作為に選ばれた偽薬研究における自己免疫疾患を患う集団に対する候補治療を施すステップとその治療の有効性を監視するステップとを含む。
具体的な実施形態の説明によって、当該技術分野の範囲内の知識を適用することで、かかる具体的な実施形態を必要以上に実験することなく、本発明の概念から逸脱することなく、他者が様々な用途をたやすく修正および／または適用できる本発明の一般的な性質が完全に明らかになるであろう。従って、そのような適用および修正は、本明細書で提起される教示および指針に基づき、開示された実施形態に相当する意義および範囲内であることを意図している。本明細書の語法または用語は当業者の知識と相まって、本発明の明細書の用語または語法が、本明細書で提起される教示および指針を踏まえて当業者によって解釈されるものであるように、説明の目的のためであり、制限のためではないことが理解される。ここに示される指針に基づき、ただの決まりきった手順にすぎない実験、本明細書で説明される発明の特定の実施例に対する多くの相当物を利用して、当業者は理解することになり、または究明することができる。
以下の実施例を本発明の好ましい実施形態を実証するために含む。後に続く実施例で開示されている手法は、本発明の実践でうまく機能するように発明者によって発見された手法を表し、その結果、実践のための好ましい形態を構成するために検討できると当業者により正当に評価されるべきである。しかしながら、当業者は現在の開示を考慮して、開示されている特定の実施例で多くの変更を加えることができ、また本発明の精神と範囲を逸脱することなく同一または同様の結果をさらに得ることができることを正当に評価する。以下の実施例は説明図の手段として提示され、本発明を制限するために決して意図されることはない。
実施例１
抗−ＣＤ２２／カリチェアミシン免疫抱合体によるＢ細胞除去は
Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいてコラーゲン誘発関節炎を抑制する。
関節リウマチのマウスモデルにおいて、Ｂ細胞除去の役割を試験するための研究を実施した。本研究で使用するＢ細胞除去化合物は、カリチェアミシンに複合するマウス抗ＣＤ２２ｍＡｂ（Ｃｙ３４．１２）（複合体）、エンジイン抗腫瘍抗生物質の員である。
Ｃｙ３４．１２の反応性のために、Ｃ５７ＢＬ／６経歴のマウスを使用した。ビトロ細胞毒性実験では、複合体により雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの精製優勢Ｂ細胞を培養し、培養の開始から４８時間ＬＰＳ刺激に反応する増殖を研究した。
生体内細胞毒性研究では、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスは複合体による１６０ｐｇ／ｋｇ／注入のカリチェアミシン１回分の腹腔内投与（ｉ．ｐ．）を２回（０日と５日）受けた。フローサイトメトリーにより、骨髄（ＢＭ）、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、および末梢血（ＰＢ）連続サンプル内でＢ細胞除去を監視した。完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）内のウシ種ＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）による１回（０日）の皮内免疫により、雄のＣ５７ＢＬ／６ＩＦＮ−ｇＫＯマウス内にコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を誘発した。ＣＩＩ免疫性を与えられたマウスは、複合体により２回のｉ．ｐ．注入（５日および１０日）、１６０ｐｇ／ｋｇ／注入のカリチェアミシン投与量を受けた。半定量的な採点システム（０−４）を使用して、関節炎の臨床的徴候を調べるために足を評価した。予防接種の後の様々な時点でマウスを致死させ、組織学的分析のために足を収集した。
研究は複合体がビトロ細胞毒性の中でＣＤ２２＋Ｂ細胞の対して非常に低い濃度で（平均ＩＣ５０：０．０８ｐ、ｇ／ｍｌの複合された抗体）選択されたことを示した。１２日、２０日、および３０日に試験されたすべての組織において、複合体による実験未使用のマウスに対する２回のｉ．ｐ．注入は、ＣＤ２２＋Ｂ細胞の選択的な細胞毒性を引き起こすが、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧＲ−ｌ＋脊髄性細胞については引き起こさない。多数のＢ細胞除去のマウスにおいて、注入後約３５日で増え始め、５０日で完全なＢ細胞の回復が見られた。ＣＩＡモデルでは、ＣＩＩによる予防接種後５日および１０日で複合体によるＣ５７ＢＬ／６ＩＦＮ−７ＫＯの治療は、臨床および組織学の関節炎の発症からそれらを守る。完全なＢ細胞プールの回復後でさえ、Ｂ細胞除去のマウスは臨床の関節炎がなく残存した。
研究から、抗―ＣＤ２２／カリチェアミシンによるＣＩＩ免疫性を与えられたマウスの治療は、関節炎に関連する臨床および組織学の徴候を効率的に抑制すると結論づけることができた。予防効果はＢ細胞の生体内除去と関連があり、認証するコラーゲン誘発関節炎においてＢ細胞の病原性役割を認証する。
実施例２
ＣＤ２２−標的Ｂ細胞除去はコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて
臨床および組織学の関節炎を抑制する。
Ｂ細胞除去コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、Ｂ細胞除去の役割を試験するために研究を実施した。本研究において使用されるＢ細胞除去化合物（以下ＣＤ２２／ｃａｌと呼ぶ）は、抗マウスＣＤ２２単クローン性の抗体（ｍＡｂ）の複合およびＮ−アセチルガンマカリチェアミシンジメチル酸、エンジイン抗腫瘍抗生物質の員であった。抗マウスＣＤ２２はＣｙ３４．１ハイブリドーマ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州、ロックビル）から精製されたマウスＩｇＧ１ｍＡｂである。抗体／カリチェアミシン複合体の合成については前に説明した。Ｈａｍａｎｎ、Ｐ．Ｒ．他。急性脊髄性白血病の治療のための抗ＣＤ３３抗体−カリチェアミシン複合。リンカーの選択。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ１３、４０−６（２００２）。ＣＤ２２／ｃａｌは１７から３０μｇまでのカリチェアミシン／ｍｇ抗体タンパク質（１．２−２．６モルカリチェアミシン／モル抗体）の平均の負荷を有する。ＣＤ２２発症マウスＢ細胞に結合するとすぐに、複合体は内面化され、カリチェアミシンにより引き起こされるＤＮＡ株のために、強力な用量依存的細胞毒性を示す。Ｔｈｏｒｓｏｎ、Ｊ．Ｓ．他。性質の化学兵器庫を理解し、十分に引き出すこと。カリチェアミシンの研究の過去、現在と未来。Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ ６、１８４１−７９（２０００）。Ｄａｍｌｅ、Ｎ．Ｋ．＆Ｆｒｏｓｔ、Ｐ。カリチェアミシンの免疫複合体による抗体−標的化学療法。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ３、３８６−９０（２００３）。ビトロ中細胞毒性分析で対照として、カリチェアミシン（Ｊ１１０／ｃａｌ）に複合されるマウスＩｇＧ１ｍＡｂを使用された。マウスＣＤ２２上のＣｙ３４．１とＣＤ２２／ｃａｌの結合の状態でフローサイトメトリー研究のために、マウスＡ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を使用した。
Ｂ６経歴（Ｂ６−ＩＦＮγ−ＫＯ）で、生後６から８週間の雌および雄のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）ならびに雌のＩＦＮγ−／−をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。動物は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｃａｒｅ および Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌの指針に従い、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈの動物施設に保管された。
ビトロ中ＢおよびＴ細胞細胞毒性研究を実施した。製造者の指示に従いＣＤ１９Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州、オーバン）を使用して、優勢マウスＢ細胞を単一細胞脾細胞検査液から精製した。ビトロ中細胞毒性（ＩＣ５０）研究では、雄Ｂ６マウスからの精製された優勢Ｂ細胞（１０５細胞／ウェル）を５０μｇ／ｍｌＬＰＳ（Ｅｃｏｌｉ０２６：Ｂ６、Ｌ２７６２；ＳＩＧＭＡ、）に応えて複合体およびそれらの増殖の様々な濃度で９６−ウェルプレートの中で培養し、培養の開始４８時間後に刺激を研究した。培養の最後の６時間は、１μＣｉ／ウェル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州、ボストン）で３Ｈチミジンを付加した。ガラス繊維ろ紙マット上へ浮遊物を集めた後、液体シンチレーション計数により３Ｈ−チミジン結合を決定した。ＣＤ３Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、マウス優勢Ｔ細胞を単一細胞脾細胞検査液から精製した。精製Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）を複合体の様々な濃度で９６−ウェルプレートの中で培養し、培養の開始４８時間後に、溶解性の抗ＣＤ３ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）に加えて１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８ｍＡｂ（クローン３７．５１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の次善最適な（５００ｎｇ／ｍｌ）濃度に反応するそれらの増殖を研究した。培養の最後の６時間は、１μＣｉ／ウェルで３Ｈチミジンを付加した。
生体内Ｂ細胞細胞毒性研究を実施した。生体内プロトコルの設立とＢ細胞除去の特徴付けおよび回復のために、雄のＢ６マウスを使用した。いくつかのＣＤ２２／ｃａｌ投薬プロトコルを試験し、最も有効であったものをその後の研究のために使用した。このプロトコルに従い、雄のＢ６マウスは、複合体による１６０μｇ／ｋｇ／注入のカリチェアミシン投与量の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入を２回（０日と５日）受けた。第１回注入後１２日、２０日、３０日、３５日、および５０日に、個々のマウスに、フローサイトメトリーにより骨髄（ＢＭ）、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、および末梢血（ＰＢ）サンプルで、Ｂ細胞除去を監視した。時点ごとに３匹のマウスを研究し、個々のマウスからの代表となるフローサイトメトリーデータを示した。
細胞の分析のためにフローサイトメトリーを使用された。マウス細胞表面抗原に方向付けられる抗体に複合される、以下のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カルフォルニア州、サンノゼ）製である。：ＣＤ３ｅ（１４５− ２Ｃ１１）、ＣＤ１９（１Ｄ３）、ＣＤ２２．２（Ｃｙ３４．１）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、およびＭａｃ−３（Ｍ３／８４）。非複合体Ｃｙ３４．１またはＣｙ３４．１／カリチェアミシン（ＣＤ２２／ｃａｌ）によるＡ２０細胞の染色のために、抗マウスＩｇＧ１−ビオチンおよびストレプトアビジンＰＥポリクローナル抗体を使用した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアパッケージ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。
Ｃｙ３４．１２ｍＡｂはＬｙｂ−８．２アロ抗原を進行する株上のＣＤ２２と反応するので、ＣＩＡのＤＢＡ／１株（Ｌｙｂ−８．１）マウスモデルは我々の研究には使用できなかった。従って、Ｂ６経歴のＣＩＡモデルを使用した。Ｃｈｕ他のプロトコルに従いＣＩＡを誘発した。Ｃｈｕ、Ｃ．Ｑ．、Ｓｏｎｇ、Ｚ．、Ｍａｙｔｏｎ、Ｌ．、Ｗｕ、Ｂ．とＷｏｏｌｅｙ、Ｐ．Ｈ。ＩＦＮガンマ不完全Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスは、関節炎の関節で、Ｔ細胞受容体Ｖｂｅｔａ６およびＶｂｅｔａ８が支配的に利用されコラーゲン誘発関節炎を発症する。Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６２、 ９８３−９０ （２００３）。手短に言えば、５ｍｇ／ｍｌヒト型結核死菌（Ｈ３７Ｒａ）を含む完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ミシガン州、デトロイト）中の１００μｇのウシタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）による皮内免疫１回（０日）により、雄のＢ６ＩＦＮ−γＫＯマウスにＣＩＡを誘発した。ＣＩＩ免疫性を与えられたマウスは複合体により、１６０μｇ／ｋｇ／注入のカリチェアミシン投与量のｉ．ｐ．を注入２回（５日と１０日）受けた。説明したように、対照マウスはＣＦＡでＣＩＩにより免疫性を与えられ、５日と１０日に２００μｌのリン酸緩衛生理食塩水（ＰＢＳ）のｉ．ｐ．を注入された。半定量的な採点システム（０−４）を使用して、関節炎の臨床的徴候のため足を評価した。予防接種の後様々な時点でマウスを致死させ、組織学の分析のために足を収集した。
１０日間、１０％の中性緩衝ホルマリンの中で足を凝固し、Ｃａｌ−ＥｘＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱灰した。足は規定どおりに処理し、パラフィン角材に組み込んだ。製造者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従い、標本は６μｍで区分し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。顕微鏡的に見ると炎症性の細胞浸潤、軟骨の変性と侵食、滑膜性過形成とパンヌス形成、および骨変性とリモデリングの度合いを調べるために区分を評価した。それぞれの足にある疾患の関節炎重症度を、０から４：０＝正常範囲内；１＝軽い／軽度２＝中程度；３＝過度；４＝重度という採点システムを使用して、等級分けをした。それぞれに足に割り当てられたスコアは総体的な伸展を反映し、多くの関節についての重症度の関与をそれぞれのスライドに示している。
ＲＳＶワクチン接種モデルでのＢ細胞除去を比較のために観察した。表２に表したプロトコルにより、雌のＢ６（生後７−９週）マウスの４つの群にワクチンおよび／または複合体を投与した。０週と２週に、１群と２群のマウスにアルミニウムリン酸塩（ＡｌＰＯ）アジュバント（１００μｇ／投与量）に吸着するＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質（１μｇ／投与量）を筋肉注射で免疫性を与えた。天然Ｆタンパク質は前述のとおり精製された、Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｇ．Ｅ．他。呼吸器合胞体ウイルスの自然吸着（Ｇ）グリコーゲンタンパク質による予防接種後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける異型肺疾患の炎症性反応の生成。Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７０、７７８３−９１（１９９６）。ＲＳＶのＡ２株に感染したベロ細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ８１）から。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより予測されたように９５％よりも純粋であった。３群と４群のマウスはワクチン投与を受けていない。４週および４週と５日に、１群と３群のマウスにＣＤ２２／ｃａｌ複合体（１６０μｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注入した。対照マウスにはＰＢＳを注入した。複合体による第２治療の後、９日前と９日に収集した末梢血サンプルにフローサイトメトリー分析を実施した。１２週と４日に〜１０６ＰＦＵ ＲＳＶ（Ａ２株）によりすべてのマウスを鼻腔内で（ｉ．ｎ．）で厳密に調べた。０週、２週、４週、８週、１２週、１４週、２５週に血清を収集し、血清抗Ｆタンパク質ＩｇＧおよびＩｇＭタイターを究明するためにＥＬＩＳＡを実施した。出血の頻度を調整するために、それぞれのデータ得点が５匹のマウス／群の幾何平均タイターを表すよう、群は１０匹のマウスから構成した。
ＲＳＶ伝染力を決定した。２５週の厳密調査の後、前述のとおりプラーク測定法で、肺の中にある感染性ウイルスの検出を評価した。Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｇ．Ｅ．他。呼吸器合胞体ウイルスの自然吸着（Ｇ）グリコーゲンタンパク質による予防接種後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける異型肺疾患の炎症性反応の生成。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０、７７８３−９１（１９９６）。手短に言えば、厳密調査、均質化、浄化、急速冷凍の４日後に取り除き、Ｈｅｐ−２細胞単分子層上で分析されるまで７００Ｃで保存した。
血清抗体の決定が下された。上述のとおり、評価項目ＥＬＩＳＡにより、幾何平均血清抗Ｆタンパク質ＩｇＭおよびＩｇＧタイターを決定した。Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｇ．Ｅ．他。呼吸器合胞体ウイルスの自然吸着（Ｇ）グリコーゲンタンパク質による予防接種後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける異型肺疾患の炎症性反応の生成。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０、７７８３−９１（１９９６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（カルフォルニア州、サニーベール）のＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ プレートリーダー（４０５ｎｍ）およびＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（４パラメータ解析）を使用する。
統計分析のために以下のパラメータおよび方法を採用した。ＪＭＰ（登録商標）統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｔｅ Ｉｎｃ．、ノースキャロライナ州、キャリー）を使用してＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多重比較により、ログ変換の後、有意差（Ｐ＜ ０．０５）を決定した。データは±１ＳＤＳを示した。
結果
抗ＣＤ２２／カリチェアミシン（ＣＤ２２／ｃａｌ）はビトロＢ細胞特定抗増殖効果に見られた。ＣＤ２２に結合されたＣｙ３４．１ｍＡｂはマウス優勢Ｂ細胞およびＢ細胞株の表面上に進行した。この抗体は、結果的に細胞周期停止およびアポトーシスとなる内面化の後で、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断を誘発するＤＮＡ結合抗生物質、カリチェアミシン（図２ａ）に複合される。Ｔｈｏｒｓｏｎ、Ｊ．Ｓ．他。本質の科学兵器庫を理解することまた十分に引き出すこと。カリチェアミシン研究の過去、現在と未来。Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ ６、１８４１−７９（２０００）。カリチェアミシン（ＣＤ２２／ｃａｌ）に対する生化学の複合体はＣｙ３４．１ｍＡｂの結合性質に何か効果を有するかどうかを検査した。染色するとすぐに、Ｃｙ３４．１およびＣＤ２２／ｃａｌは両方とも、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞上のＣＤ２２と同様に結合した（図２ｂ）。ビトロ細胞毒性の試験するために、ＣＤ２２／ｃａｌの様々な濃度で雄のＢ６マウスの精製されたＢ細胞を培養し、培養の４８時間後にＬＰＳの刺激に反応する増殖を研究した。非複合化Ｃｙ３４．１に効果がない一方で、３μｇ／ｍｌＣＤ２２／ｃａｌはＢ細胞増殖を完全に抑制した（図２ｃ）。カリチェアミシン（Ｊ１１０／ｃａｌ）に複合される対照抗体とＣＤ２２／ｃａｌを比較した。対照免疫複合体Ｊ１１０／ｃａｌのＩＣ５０は３μｇ／ｍｌであった一方で、ＣＤ２２／ｃａｌのＩＣ５０は０．０３μｇ／ｍｌであった（図２ｄ）。従って、ＣＤ２２／ｃａｌは対照免疫複合体と比較して１００倍より選択的であった。化合物はビトロＴ細胞増殖分析で何も効果がなかったので、ＣＤ２２／ｃａｌの細胞毒性はＢ細胞特定であった（図２ｅ）。
上述のようにＣＤ２２／ｃａｌは生体内Ｂ細胞特定細胞毒性を示した。異種移植片モデルでの前の研究での観察に基づき、ＤｉＪｏｓｅｐｈ、Ｊ．Ｆ．他。ＣＭＣ−５４４による抗体標的化学療法、Ｂリンパ性悪性疾患の治療のためのカリチェアミシンのＣＤ２２標的免疫複合体。Ｂｌｏｏｄ１０３、１８０７−１４（２００４）、ＣＤ２２／ｃａｌの生体内細胞毒性を評価するために、いくつかの投薬スケジュールを試験した。試験されたすべての組織（スケジュールＩＩと呼ぶ）で最も効果を示したスケジュールは、５日おきにＣＤ２２／ｃａｌによる２回のｉ．ｐ．注入（１６０μｇ／ｋｇ／注入）から成っていた。０日と５日にスケジュールＩＩでＢ６マウスを処理した場合、ＣＤ２２＋Ｂ細胞は早ければ第１回ＣＤ２２／ｃａｌ注入から８日に末梢血サンプルからほとんど完全に消えていた（データを図示せず）。１２日のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ２２＋Ｂ細胞のパーセントが、ＰＢで３９％から０．５％へ、脾臓で４２％から０．７％へ、ＢＭで２５％から２％へ、ＬＮで４１％から０．７％へ減少することをさらに明らかにした（図３ａ）。Ｂ２２０（データを図示せず）または抗ＣＤ１９ｍＡｂのどちらか細胞を染色した場合、同様の結果が得られた（図３ｂ）。図示するように、実験未使用のＢ６マウス内にあるＢ細胞の同一の個体群は、ＣＤ２２とＣＤ１９の両方で進行した（図３ｃ）。興味深いことに、有効な投薬スケジュールをより少なく使用した場合、Ｂ細胞除去のレベルは骨髄および脾臓と比較して末梢血およびリンパ節において繁殖して高かった（データを図示せず）。集合的に、これらのフローサイトメトリー結果は、５日おきの１６０μｇ／ＣＤ２２／ｃａｌ／ｋｇによる２回のｉ．ｐ．注入から成るプロトコルは、Ｂ細胞生体内に対して非常に強力な細胞毒性を有していることを明示している。
ＣＤ３（Ｔ細胞）およびＧｒ−１（脊髄性）のためのｍＡｂ特定を使用して、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞および脊髄性系統の細胞に対するＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体の生体内細胞毒性もまた検査した。恐らくＣＤ２２＋Ｂ細胞の除去のせいで、１２日に、ＣＤ３＋およびＧｒ−１＋細胞のパーセントは試験されたすべての組織で増加した（図４ａ、ｂ）。２０日に同様の結果が得られた（データを図示せず）。３０日までに、ＣＤ２２＋細胞のパーセントは、骨髄および脾臓（９−１４％、±２％）で増加したが、末梢血およびリンパ節では増加しなかった（データを図示せず）。５日後、ＣＤ２２＋Ｂ細胞のパーセントは骨髄および脾臓サンプルで有意に高かった（しかし正常レベル未満）が、末梢血およびリンパ節サンプルでは＜５％未満に留まった（データを図示せず）。興味のあることは、３０日と３５日の骨髄および脾臓サンプルのＣＤ１９＋細胞のうち５−８％はＣＤ２２＋進行に対して陰性であるという観察をしたことだった（データを図示せず）。実験の５０日に試験されたすべての組織で、多数のＣＤ２２＋Ｂ細胞は正常範囲にあった（図４ｃ）。集合的に、これらの結果は、細胞毒性ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体が生体内Ｂ細胞に対して方向付けるられることを明示している。さらに、Ｂ細胞による骨髄および脾臓の再生は、第１回ＣＤ２２／ｃａｌ注入の約３０日に始まり、５０日以内で完全に再構成される。
ＣＤ２２／ｃａｌによるＢ細胞除去が観察され、臨床および組織学のコラーゲン誘発関節炎の発症を抑制した。ＣＩＡの顕著な特徴の一つは、疾病に対する感受性は、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＩＩＨ−２ｑまたはＨ−２ｒハプロタイプを有するマウス株に限定されることであり、Ｈ−２ｂを有する株は最も感染しにくい株の１つである。Ｗｏｏｌｅｙ、Ｐ．Ｈ．、Ｌｕｔｈｒａ、Ｈ．Ｓ．、Ｓｔｕａｒｔ、Ｊ．Ｍ．とＤａｖｉｄ、Ｃ．Ｓ．種ＩＩマウスのコラーゲン誘発関節炎。Ｉ。主要組織適合性複合体（Ｉ領域）リンケージおよび抗体は相互に関連がある。Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５４、６８８−７００（１９８１）。しかしながら、最近の報告は、ＩＦＮ−γ信号伝達が撤廃される場合、抵抗Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、ＣＩＡは誘発されることも有り得ることを明示している。Ｏｒｔｍａｎｎ、Ｒ．Ａ．とＳｈｅｖａｃｈ、Ｅ．Ｍ。コラーゲン誘発関節炎に対する感受性、サイトカイン−媒介調節Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ９８、１０９−１８（２００１）。Ｂ６ ＩＦＮ−γ ＫＯ ＣＩＡモデルは、Ｃｈｕ他によりさらに特性化される。Ｃｈｕ、Ｃ．Ｑ．、Ｓｏｎｇ、Ｚ．、Ｍａｙｔｏｎ、Ｌ．、Ｗｕ、Ｂ．とＷｏｏｌｅｙ、Ｐ．Ｈ．ＩＦＮガンマ不完全Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスは、関節炎の関節で、Ｔ細胞受容体Ｖｂｅｔａ６およびＶｂｅｔａ８が支配的に利用されコラーゲン誘発関節炎を発症する。６０−８０％のマウスはＤＢＡ／１マウスに観察される古典的なＣＩＡに対して臨床コースと同様の進行性の関節炎を発症したことを発見したＡｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６２、９８３−９０（２００３）。さらに、Ｂ６ ＩＦＮ−γ ＫＯマウスは、Ｂ６マウスと比較されるマウスコラーゲンＩＩに対してＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ１の自己抗体の有意により高いレベルを生成する。本研究で抗コラーゲン抗体の減少したレベルを直接確認することは安心させるものであろうが、ＣＩＡモデルでの我々の焦点は、Ｂ細胞除去のマウスにおいて臨床および組織学的スコアであったことを留意されたい。第２ＣＤ２２／ｃａｌ注入の６〜８日後に、血液サンプルをフローサイトメトリー分析することにより除去を検証した。ＣＤ２２＋およびＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセントは０．５から２％に分類された（データを図示せず）。半定量的な採点システム（０−４）を使用して、関節炎の臨床的徴候を調べるために足を評価した。免疫性を与えられた対照マウスの６０％が２９日までに関節炎を発症した一方で（図５ａ）、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体による注入は、ほとんど完全に臨床の関節炎の発症を抑制した（図５ｂ）。同様の結果が反復実験で得られた（データを図示せず）。両方の実験で、処置されたマウスは５０日を超えて臨床の関節炎の症状がないままであり、これはＢ細胞プールが末梢血サンプルで完全に回復したときであった（データを図示せず）。組織学評価のために予防接種後２５日または７５日後２つの異なる実験から足を収集した。２５日に、免疫性を与えられた対照マウスの足は、関節を包囲および浸潤し、また活動性の炎症と一致する結合組織を結合する多数の好中球およびマクロファージにより浸潤した（図６ａ）。対照的に、ＣＤ２２／ｃａｌ処置されたマウスの足は正常の関節構造を有し、以前の、または発症中の関節炎の欠如と一致する炎症性の細胞により浸潤されなかった（図６ｂ）。その後、我々は７５日に収集した足を比較した。この時点では、ＣＤ２２＋細胞のパーセントはＰＢ、ＬＮ、および脾臓サンプルで正常範囲内にあった（データを図示せず）。好中球および浮腫の欠如が活動性の炎症はすでにないと示したとしても、免疫性を与えられた対照マウスの足は、慢性関節炎と一致する関節および隣接臓器の再形成と破壊を有する（図６ｃ）。対照的に、免疫性を与えられ、またＢ細胞除去のマウスの足を顕微鏡的に見ると、これらの足に関節炎反応が決してないことに一致する正常関節を有する（図６ｄ）。集合的に、これらの結果は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体によるＢ細胞除去がＣＤ２２＋Ｂ細胞プールが回復するとすぐに、効果が持続するコラーゲン誘発関節炎の発症を抑制することを明示している。
ＣＤ２２／ｃａｌによるＢ細胞除去は、ＲＳＶのＦタンパク質に対して抗体反応に影響を与えない。
表２に表したプロトコルを使用して、マウスＲＳＶワクチン接種モデルで、血清抗Ｆタンパク質抗体タイター上のＢ細胞除去の効果について研究した。ＣＤ３＋およびＧｒ−１＋細胞が免疫になっている一方で、免疫になっているマウスで末梢血サンプルをフローサイトメトリー分析することによりＢ細胞除去を検証した（表３）（データを図示せず）。Ｂ細胞除去の前にＦ抗原のワクチン投与を受けたマウスは、Ｆタンパク質に反応するロバストＩｇＭおよびＩｇＧを有し、対照（ＰＢＳ）マウスと比較して、血清ＩｇＭ（図７ａ）およびＩｇＧ（図７ｂ）タイターに差異を示さない。さらに、１２週（Ｂ細胞除去の８週間後）にＲＳＶのＡ２株によるＢ細胞除去の実験未使用のマウスにおける感染は、対照（ＰＢＳ）実験未使用のマウスと同様に、抗Ｆタンパク質ＩｇＭ（図７ａ）およびＩｇＧ（図７ｂ）血清タイターの類似のレベルをもたらす。これは、厳密調査の時期までに再構成されたＢ細胞が、正常抗体反応をするために完全に機能し、また有能であることを示唆している。さらに、類似の抗Ｆタンパク質ＩｇＭおよびＩｇＧをもたらすＲＳＶのＡ２株によるマウスの感染は、１４週と２５週に血清上で反応し（図７ａ、ｂ）、ＣＤ２２／ｃａｌの治療によりタンパク質Ｆの記憶Ｂ細胞プールは影響を受けないことを示した。最後に、実験２５週目の厳密調査の４日後にマウスの肺に感染性ウイルスは検出されなかった（データを図示せず）。
本研究の結果は、ＲＳＶモデルの厳密調査後、同一のプロトコルがウイルスの記憶反応およびクリアランスに好ましくない結果を有していない一方で、ＣＤ２２／ｃａｌによる２回の生体内注入から成るＢ細胞除去プロトコルはＣＩＡモデルでは有効であることを明示している。本研究はまた、ＣＤ２２／ｃａｌはビトロおよび生体内細胞毒性でＢ細胞特定を有し、結果としてＣＤ２２＋を除去するが、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧｒ−１＋脊髄性細胞は除去しないことを示している。骨髄および脾臓にほとんど検出不可能なレベルのＣＤ２２＋ Ｂ細胞を持つマウスは、およそ３０〜３５日でこれらの臓器を再増殖し始め、ＣＤ２２／ｃａｌ注入後５０日にＣＤ２２＋ Ｂ細胞プールの再構成を完成する。
ＣＤ２２／ｃａｌは、リガンドを生むシアリン酸のための接着受容体として役立つＩｇスーパーファミリーの員であるＣＤ２２と結合する。Ｔｕｓｃａｎｏ、Ｊ．Ｍ．、Ｒｉｖａ、Ａ．、Ｔｏｓｃａｎｏ、Ｓ．Ｎ．、Ｔｅｄｄｅｒ、Ｔ．Ｆ．とＫｅｈｒｌ、Ｊ．Ｈ。ＣＤ２２架橋結合は、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ信号伝達カスケードを活性化するＢ細胞抗原受容体独立信号を発生させる。Ｂｌｏｏｄ９４、１３８２−９２（１９９９）。細胞質早期で、Ｂ細胞進行（遅発プロ−Ｂ細胞期）で検出されるマウスＣＤ２２（ｍＣＤ２２）は、新しく出現するＩｇＭ＋Ｂ細胞の表面に存在せず、未熟なＢ２２０ｌｏＩｇＭｈｉＢ細胞で低密度を示し、また骨髄の成熟したＢ２２０ｈｉＩｇＤ＋Ｂ細胞により完全に進行した。Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ、Ｆ．Ｗ．、Ｓｕｂｂａｒａｏ、Ｂ．、Ｍｏｓｉｅｒ、Ｄ．Ｅ．とＳｐｒｅｎｔ、Ｊ．Ｌｙｂ−８．２：Ａ新しいＢ細胞抗原は単クローン性の抗体を定義し、また特性を示す。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１６、３８１−９１（１９８２）。末梢で、ｍＣＤ２２は脾臓および腹膜Ｂ１細胞の濾胞状および辺縁域のＢ胞を含むすべてのＢ細胞サブセット上の高いレベルで示される。しかしながら、骨髄から新しく抽出される、脾臓の中にある未発達のＢ細胞のより小さなサブセットは、低い密度ＣＤ２２を示す。Ｔｅｄｄｅｒ、Ｔ．Ｆ．、Ｔｕｓｃａｎｏ、Ｊ．、Ｓａｔｏ、Ｓ．とＫｅｈｒｌ、Ｊ．Ｈ。ＣＤ２２、抗原受容体信号伝達を統制するＢリンパ球に特異的な接着分子。Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５、４８１−５０４（１９９７）。細胞表面上の比較的短い半減期で、ＣＤ２２を構造的に取り込み、分解する。Ｓｈａｎ、Ｄ．とＰｒｅｓｓ，Ｏ．Ｗ。ヒトＢ細胞によるＣＤ２２の構造性エンドサイトーシスおよび分解。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５４、４４６６−７５（１９９５）。抗ＣＤ２２ｍＡｂに結合するとすぐに、ＣＤ２２は急速に内面化される、Ｓｈａｎ、Ｄ．とＰｒｅｓｓ，Ｏ．Ｗ。ヒトＢ細胞によるＣＤ２２の構造性エンドサイトーシスおよび分解。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５４、４４６６−７５（１９９５）、またこの性質は、それをカリチェアミシン媒介Ｂ細胞細胞毒性のための適切な標的にする。実に、本研究では、ＣＤ２２／ｃａｌはビトロおよび生体内細胞毒性でＢ細胞特定を比較する。１６０μｇ／ｋｇ／注入よりも少ない投与量のスケジュールが使用される場合、Ｂ細胞上のＣＤ２２＋ 進行のパターンおよび反応速度論は、末梢血およびリンパ節と比較すると、ＣＤ２２／ｃａｌによるＢ細胞除去が、骨髄および脾臓でより少ない効果であることを示唆する。もし新しく出現するＩｇＭ＋Ｂ細胞の急速な代謝回転が骨髄および脾臓で継続的に発生するならば、これらの２つの臓器内でＢ細胞を効果的に除去できる濃度は、末梢血およびリンパ節に必要とされる濃度よりも高いと仮定することは合理的である。注目すべきことは、末梢血でのＣＤ２２＋細胞の非存在は、骨髄および脾臓での除去のレベルに酷似していないことである。この観察は重要であり、特に臨床においてＢ細胞の切除治療に関して、後者の評価は末梢血サンプルの分析に基づいているので、これらの患者における臨床の反応は、Ｂ細胞除去レベルに相関性がある場合、注意を払うべきであることを示している。
Ｂ細胞除去で治療された２２ＲＡ患者を含む臨床の研究では、末梢血Ｂリンパ球の総数は、すべての症例で検出不能なレベルまで下がり、少なくとも６ヶ月の間正常より下に留まった。Ｌｅおよびｒｏ、Ｍ．Ｊ．、Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｊ．Ｃ．とＣａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｇ．Ｂリンパ球除去で治療されたリウマチ関節炎の２２人の患者での臨床転帰。Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６１、８８３−８（２００２）。先述のマウスによる研究では約４週の間、ＣＤ２２＋ Ｂ細胞は骨髄および脾臓から激しく除去していた。Ｂ細胞の数がリンパ節および血液サンプルで低く留まる間、再生している証拠が３０日〜３５日の間で両方の組織で観察された。除去の前では、Ｂ細胞の同一の集団はＣＤ２２およびＣＤ１９と両方を進行した（図１９ｃ）。しかしながら、３０日および３５日では、より多くのＣＤ１９＋細胞がＣＤ２２＋ 細胞よりも検出された。その説明は、細胞毒性に関するＣＤ２２／ｃａｌに、または、最後の注入の後はマウスＩｇＧ抗体の予期された半減期を圧倒的に超えたので、非複合体抗ＣＤ２２抗体によるＢ細胞上のＣＤ２２エピトープのマスキング起因すると考えられることはありそうもない。
Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯＣＩＡモデルでのＣＤ２２／ｃａｌ研究は、関節炎の発症においてＢ細胞の病原性役割のための強力な証拠を提供する。これは、ＣＩＡでの疾病による結鎖Ｂ細胞機能、前の観察により支持されている。異種交配ＣＢＡ／Ｎ ｘｉｄ、Ｔｈｏｍａｓ、Ｊ．Ｄ．他。Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症およびＸ連鎖免疫不全遺伝子の共局在化。Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１、３５５−８（１９９３）、ＣＩＡ ＤＢＡ／１マウスに非常に感染しやすいマウスは、ＣＩＡの誘導に抵抗力のある株をもたらし、タイプＩＩコラーゲンの抗体反応を進行しない。Ｊａｎｓｓｏｎ、Ｌ．とＨｏｌｍｄａｈｌ、Ｒ．Ｘ染色体上の遺伝子は、マウスでコラーゲン誘発関節炎の発症に影響を与える。Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９４、４５９−６５（１９９３）。さらに、ＩｇＭ重鎖遺伝子（ｍｕＭＴ）の除去のためにＢ細胞が不足しているマウスは、ＣＩＡに抵抗力がある。Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｌ．、Ｊｉｒｈｏｌｔ、Ｊ．、Ｈｏｌｍｄａｈｌ、Ｒ．とＪａｎｓｓｏｎ、Ｌ。Ｂ細胞不完全マウスはタイプＩＩコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を発症しない。Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１１、５２１−６（１９９８）。これらのモデルでは、しかしながら、Ｂ細胞はコラーゲンの予防接種のときに還元して欠損しているか（ｘｉｄ）、または完全に非存在（ｍｕＭＴ）のどちらかであった。Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスを使用して、ＴおよびＢ細胞の反応生体内ＣＤ２２／ｃａｌプロトコルの進行は、注入されたコラーゲンＩＩに対する起爆剤およびエフェクターの間に開始されたＣＩＡ上のＢ細胞除去の役割は我々には評価できなかった。７５日までの足の組織学により明示されるように、Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスは、ＣＤ２２＋Ｂ細胞除去の間だけでなく、ＣＤ２２＋Ｂプールの完全な再構成の後でも、関節炎の臨床および組織学の徴候がないままである。これらのデータは、免疫性を与えられたマウスにおいて、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体は、自己コラーゲンに関する病原のＢ細胞クローンの生成および拡大を恒久的に抑制したことを示唆する。もう１つの方法として、しかし相互排他的ではなく、ＣＤ２２／ｃａｌは、Ｂ細胞プールの完全な再構成の後でさえ、臨床のおよび／または組織学の関節炎に至る炎症性のメカニズムの生成するのに依然として不十分なままであるレベルまで病原のＢ細胞を減少している可能性もある。この状況では、ＣＤ２２／ｃａｌは自己抗体産生機序以外の、多様性のある機能を示し、また病原の特性を見せるＢ細胞を排除している可能性もある。Ｄｕｄｄｙ、Ｍ．Ｅ．、Ａｌｔｅｒ、Ａ．とＢａｒ−Ｏｒ、Ａ。ヒトのＢ細胞エフェクターサイトカインのはっきりとした特徴：免疫調節における役割？Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２、３４２２−７（２００４）Ｐｏｒａｋｉｓｈｖｉｌｉ、Ｎ．他。自己免疫のＢ細胞機能の理解における最近の進歩。Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５４、３０−８（２００１）。これを支持して、概念は主にＳＬＥおよびＩＴＰ患者において最近の試験からのデータであり、Ｂ細胞除去に対する臨床の反応は、自己抗体タイターにおける同時変化をともなわず起きることを示している。Ｍａｒｔｉｎ、Ｆ．とＣｈａｎ、Ａ．Ｃ。ヒトの自己免疫においてＢ細胞の病原性役割；診療所からの識見。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０、５１７−２７（２００４）。従って、Ｂ細胞系統除去が自己免疫疾患を調節することにより、付加的なメカニズムがあることは有り得る。Ｍａｒｔｉｎ、Ｆ．とＣｈａｎ、Ａ．Ｃ。ヒトの自己免疫におけるＢ細胞の病原性役割診療所からの識見。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０、５１７−２７（２００４）。Ａｎｏｌｉｋ、Ｊ．、Ｓａｎｚ、Ｉ．とＬｏｏｎｅｙ、Ｒ．Ｊ。全身性エリテマトーデスにおけるＢ細胞除去の治療効果。Ｃｕｒｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｒｅｐ ５、３５０−６（２００３）。Ｌｏｏｎｅｙ、Ｒ．Ｊ．、Ａｎｏｌｉｋ、Ｊ．とＳａｎｚ、Ｉ。リウマチ性疾患のための治療標的としてのＢ細胞。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ１６、１８０−５（２００４）。滑膜の内側のリンパ集合体を有するＲＡ患者において、Ｂ細胞は細胞を表す抗原として機能し、またエフェクターＴ細胞の拡張を促進する共刺激シグナルを提供する可能性がある。滑膜の内側のＢ細胞はまた、炎症性サイトカインを分泌し、炎症の一因となる可能性がある。Ｗｅｙと、Ｃ．Ｍ．とＧｏｒｏｎｚｙ、Ｊ．Ｊ。リウマチ性滑膜炎における異所性胚中心形成。Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９８７、１４０−９（２００３）。Ｄｕｄｄｙ、Ｍ．Ｅ．、Ａｌｔｅｒ、Ａ．とＢａｒ−Ｏｒ、Ａ。ヒトのＢ細胞のエフェクターサイトカインのはっきりとした特徴：免疫調節の役割？、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７２、３４２２−７（２００４）．Ｐｉｓｔｏｉａ、Ｖ．健康および疾病においてヒトのＢ細胞によるイトカインの生成。Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８、３４３−５０（１９９７）。
ＲＳＶのＦタンパク質で免疫性を与えたＢ６マウス中のＣＤ２２／ｃａｌの効果もまた調べた。これらの研究の主要な目的は、ＣＤ２２／ｃａｌによるＢ細胞除去の前に、免疫複合体が実験未使用のおよびＦタンパク質を仕込んだマウスにおいて、抗Ｆタンパク質ＩｇＭおよびＩｇＧ反応の進行に悪影響を与えるかどうかを評価するためであった。我々の興味は、Ｂ細胞ブレーションは、Ｂ細胞プールのほとんどを、根絶しない場合は、有意に縮小する恐れがあり、前に仕込まれた“記憶”Ｂ細胞を含み、従って、低ガンマグロブリン血および液性免疫不全を引き起こすという関心により動機付けされた。本明細書での結果は、血清免疫グロブリンのレベルは、ＣＤ２２／ｃａｌプロトコルにより処置されたマウスにおいては正常範囲内に留まり、またこれらのマウスが、厳密調査の後、正常Ｉｇ反応およびウイルスのクリアランスを示すことができることを明示している。この観察は抗ＣＤ２０による臨床試験から得られるデータと一致しており、自己抗体においる大幅な低下が、破傷風トキソイドおよび肺炎球菌カプセル多糖に対する特定のＩｇＧ抗体において同時損失することなく達成できること示している。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｇ．他。以下のリウマチ関節炎のためのＢリンパ球除去治療に続く血清学の変化。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ４８、２１４６−５４（２００３）。本臨床で観察されるこの選択的な効果は、ＣＩＡおよびＲＳＶモデルでの観察を目的として推定され、ＲＳＶワクチン接種モデルにおいて好ましくない結果が除外されればＣＤ２２／ｃａｌは自己免疫のＣＩＡモデルにおいて有効であることを示している。Ｂ細胞除去しているＲＡ患者を前提として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｇ．他。以下のリウマチ関節炎のためのＢリンパ球除去治療に続く血清学の変化．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ４８、２１４６−５４（２００３）、Ｍａｎｚ、Ｒ．Ａ．とＲａｄｂｒｕｃｈ、Ａ。生涯の形質細胞？Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ３２、９２３−７（２００２）、自己抗体はＣＤ２２―陽性Ｂリンパ球からの新しい形質細胞の恒常的な生成によりさらに左右される一方で、抗ウイルス性の抗体の生成に関与するＢ細胞クローンは脾臓内に存在し、またＣＤ２２陰性形質細胞の中へゆっくりとした代謝回転を経験する。また、コラーゲンによく反応するＢ細胞クローンは場合により、恒常的な生成のためにより大きな動態にあり、正常なＢ細胞よりも大量に循環し、さらにそれらは必然的にＣＤ２２／ｃａｌにより感染しやすくなる。より重要なことには、ＲＳＶモデルにおけるＢ細胞の除去により、液性免疫の維持が記憶反応の前から存在するとができ、またＢ細胞コンパートメントが再構成されるとすぐに、新しい抗原に対する液性免疫が生成できる。
Figure 2008515926
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 ａ１０Ｃ５６Ｂｌ／６マウス群は、０週および２週にＦ／ＡｌＰＯのワクチン投与を受けた。ＣＤ２２／ｃａｌの第２回目投与の直前（前）および９日後（後）に、フローサイトメトリーにより、細胞表面マーカーＢ２２０のために、ワクチン投与を受けたマウスおよび実験未使用のマウスからの末梢血白血球を分析した。

Figure 2008515926
 群間での有意差は観察されなかった。

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 群間での有意差は観察されなかった。
実施例３
コラーゲン誘発（ＣＩＡ）モデルにおける臨床スコアおよび抗体反応でのＣＤ２２／ｃａｌによるＢ細胞除去の効果
ＣＩＡモデルでのＢ細胞除去
ＲＳＶのＦタンパク質完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、デトロイト、ＭＩ）で、５ｍｇ／ｍｌのヒト型結核死菌（Ｈ３７Ｒａ）３３を含む１００μｇウシのタイプＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、レッドモンド、ＷＡ）をともない、尾の基部に１回（０日）皮内免疫により雄のＢ６ＩＦＮ−γ ＫＯ マウスにＣＩＡを誘発した。ＣＩＩ免疫性を与えられたマウスはＣＤ２２／ｃａｌまたは対照ＧＧ５／ｃａｌ（１６０μｇ／ｋｇ／注入）による２回ｉ．ｐ．注入（５日と１０日）を受けた。臨床の関節炎を調べるために足を評価し、またそれぞれの足は個別に、４ポイント階級、０、正常足；１、最小限の膨れまたは赤み；２、前足全体にわたる赤みおよび膨れ；３、足全体の悪化にともなう赤みおよび膨れ；４、関節変形または／および強直を使用して得点を付けた。
抗タイプＩＩコラーゲン抗体ＥＬＩＳＡ
標準ＥＬＩＳＡ方法論により、ペルオキシダーゼ複合にされた２次抗ＩｇＧ２ｂ抗体および基質ＡＢＴＳを使用して、タイプＩＩコラーゲンに対するＩｇＧ２ｂ抗体レベルを測定した。仮分析の後、血清希釈物、１／１０００が選ばれた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４プレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カルフォルニア、サニーベール）を使用して、４０５ｎｍで光学密度を測定した。抗体含量（任意単位／ｍｌ）を計算して標準ＣＩＡ血清の１：２連続希釈から生成される標準曲線を参照することにより、抗タイプＩＩコラーゲン濃度を決定した。
組織学
予防接種の後２５日または７５日に組織学分析のために足を収集し、１０日間、１０％の中性緩衝ホルマリンの中で凝固し、Ｃａｌ−ＥｘＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱灰した。脱灰した足は規定どおりに処理し、その後パラフィン角材に組み込んだ。製造者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ、セントルイス、）に従い、標本は６μｍで区分し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。顕微鏡的に見ると炎症性の細胞浸潤、軟骨の変性と侵食、滑膜性過形成とパンヌス形成、および骨変性とリモデリングの度合いを調べるために区分を評価した。疾患の関節炎重症度を、０から４：０＝正常範囲内；１＝軽い／軽度２＝中程度；３＝過度；４＝重度という採点システムを使用して、等級分けをした。それぞれに足に割り当てられたスコアは総体的な伸展を反映し、多くの関節についての重症度の関与をそれぞれのスライドに示す。
血清抗体の決定
上述のとおり評価項目ＥＬＩＳＡにより、幾何平均血清抗Ｆタンパク質ＩｇＭおよびＩｇＧタイターを決定した。Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｇ．Ｅ．他。Ｓｐｅｅｌｍａｎ ＤＪ、Ｈｅｅｒｓ Ｋ、Ｂｏｒｔｅｌｌ Ｅ．、Ｓｍｉｔｈ Ｊ．、Ｃｏｓｃｏ Ｃ。呼吸器合胞体ウイルスの自然吸着（Ｇ）グリコーゲンタンパク質の予防接種後、異型の肺疾患の炎症性を生成することはＢＡＬＢ／ｃマウスに反応する。Ｊ Ｖｉｒｏｌ。１９９６；７０：７７８３−７７９１。ＪＭＰ（登録商標）統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｔｅ Ｉｎｃ．、キャリー、ＮＣ）を使用してＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ＨＳＤ多重比較により、ログ変換の後、有意差（Ｐ＜０．０５）を決定した。データは±１ＳＤＳを示した。
統計分析
Ｓｔｕｄｅｎｔの ｔ−試験を用いてタイプＩＩコラーゲン（図８Ａ、Ｂ）に対する臨床スコアおよび血清ＩｇＧ２ｂレベルを分析し、平均値±ＳＥＭとして表した。Ｐ値＜０．０５は有意であると考慮した。
Ｂ細胞除去は臨床コラーゲン誘発関節炎の発症を抑制する。
Ｃｙ３４．１抗体の反応性（Ｌｙｂ−８．２アロ抗原を有する株上のＣＤ２２、例えばＣ５７ＢＬ／６、に反応するが、ＤＢＡには反応しない、）により、感染しやすいＤＢＡ／１の利用は制限された。Ｗｏｏｌｅｙ ＰＨ、Ｌｕｔｈｒａ ＨＳ、Ｓｕｔａｒｔ ＪＭ、Ｄａｖｉｄ ＣＳ。マウスにおけるタイプＩＩコラーゲン誘発関節炎。Ｉ。主要な組織適合性複合体（Ｉ領域）リンケージおよび抗体は相互に関連する。Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９８１；１５４：６８８−７００。本研究におけるＣＩＡモデル。しかしながら、最近の報告は、ＩＦＮ−γ信号伝達が撤廃される場合、抵抗Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、ＣＩＡは誘発されることも有り得ることを明示している。Ｏｒｔｍａｎｎ ＲＡ、Ｓｈｅｖａｃｈ ＥＭ。コラーゲン誘導関節炎に対する感受性、サイトカインで媒介された調節。Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；９８：１０９−１１８。Ｂ６ ＩＦＮ−γ ＫＯ モデルのさらなる特徴付けは、６０〜８０％のマウスにおいて、感染しやすいＤＢＡ／１マウスにおいて観察される典型的なＣＩＡと同様の進行性の関節炎が発症したことを明らかにした。Ｃｈｕ ＣＱ、Ｓｏｎｇ Ｚ、Ｍａｙｔｏｎ Ｌ、ＷＵ Ｂ、Ｗｏｏｌｅｙ ＰＨ。ＩＦＮガンマ不完全Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスは、関節炎の関節で、Ｔ細胞受容体ＶｂｅｔａｏおよびＶｂｅｔａ８が支配的に利用されコラーゲン誘発関節炎を発症する。Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ。２００３；６２：９８３−９９０。さらに、Ｂ６ ＩＦＮ−γ ＫＯマウスは、Ｂ６マウスと比較されるマウスコラーゲンＩＩに対してＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ１の自己抗体の有意により高いレベルを生成する。Ｃｈｕ ＣＱ、Ｓｏｎｇ Ｚ、Ｍａｙｔｏｎ Ｌ、ＷＵ Ｂ、Ｗｏｏｌｅｙ ＰＨ。ＩＦＮガンマ不完全Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスは、関節炎の関節においてＴ細胞受容体ＶｂｅｔｏおよびＶｂｅｔａ８が支配的に利用されて、コラーゲン誘発関節炎を発症する。Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ。２００３；６２：９８３−９９０。我々のＣＩＡ研究にＢ６ ＩＦＮ−γ ＫＯ ＣＩＡモデルを使用した。第２ＣＤ２２／ｃａｌ注入の６〜８日後に血液サンプルのフローサイトメトリー分析により除去を検証した。ＣＤ２２＋およびＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセントは＜２％であった。（データを図示せず）。関節炎の臨床的徴候を調べるために足を評価した。ＧＧ５／ｃａｌ注入で免疫性を与えられたマウスの９０％が３３日までに関節炎を発症した一方で、ＣＤ２２／ｃａｌによる注入は、ほとんど完全に臨床関節炎の発症を抑制した（図８Ａ）。ＣＤ２２／ｃａｌを注入されたマウスは５０日を超えて臨床関節炎の症状がないままであり、これはＢ細胞プールが末梢血サンプルで完全に回復したときであった（データを図示せず）。
ＣＤ２２／ｃａｌで処置されたマウスにおいて、ＣＩＡの発症が抑制できるのはタイプIIコラーゲンに反応する抗体のせいであるかどうかを調査するために、ＣＩＡ実験の様々な時点で、血清中のＩｇＧ２ａの抗ＣII特定レベルを決定した。予防接種１５日後では対照マウスと比較してＢ細胞除去されたマウスにおいて、抗ＣII抗体レベルは有意により低かったが、２５日、３５日、および５５日での２つの群間においては、統計的に有意差は観察されなかった（図８Ｂ）。これらの結果は、このＣＩＡモデルにおいて臨床および組織学の関節炎が発症している間、血清抗ＣII抗体レベルが役割を有するようには見えない一方で、Ｂ細胞この疾病の病理学においては必須であることを示唆している。
図８（ａ）は、ＣＤ２２／ｃａｌまたはＧＧ５／ｃａｌを注入されたＢ６ＩＦＮ−γ ＫＯマウスの臨床関節炎スコアを示す。図８（ｂ）は、標準ＥＬＩＳＡにより測定されるタイプIIコラーゲンに対するＣＩＡの過程における血清ＩｇＧ２ｂ抗体レベルを示す。抗体含量（任意単位／ｍｌ）を計算して標準ＣＩＡ血清の１：２連続希釈から生成される標準曲線を参照することにより、抗タイプIIコラーゲン濃度を決定した。図示された値は、Ｂ細胞除去群における１０匹のマウス、および非Ｂ細胞除去群における１５匹のマウス（１０匹のマウスはＧＧ５／ｃａｌの注入を受け、５匹のマウスはどのような注入も受けなかった）に対する平均値±ＳＥＭである。アステリスクは１５日目での群の平均値間の有意差（ｐ＜０．０５）を示している。上記は、Ｂ細胞減少のみがＣＩＡモデルにおいて関節炎の予防に相互に関連があるが、タイプIIコラーゲン抗体レベルは関連がないことを初めて明示している。従って、タイプIIコラーゲン抗体レベルを除去することは、ＣＩＡの臨床および組織学的予防には必要ない。
上記に引用されたすべての参考図書および特許は、参考することにより本明細書に組み込まれる。非常多くの本発明の改良物および変形物は、上記で特定された明細書に含まれ、また当業者には明白となることが予想される。複合プロセス、そのプロセスにより生成された複合体および複合体を構成する組成物／製剤に対するそのような改良物および改変物は、本請求項の範囲内に含まれていると信じられる。
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本発明は現在では十分に説明されているので、本明細書に記載の発明の精神と範囲を逸脱することなく、多くの変更および改良が行われてもよいことが当業者には明白であろう。上記は、可能性のある多くの改変物により、本発明の好ましい実施形態を説明している。しかしながら、これらの実施形態はただ単に実施例のためにあり、本発明はこれに限定されない。
図１は、マウス単クローン性抗体５／４４（配列番号：１〜６）のＣＤＲのアミノ酸配列を示す。 図２は、カリチェアミシン（ＣＤ２２／ｃａｌ）と複合されたＣｙ３４．１ｍＡｂが、Ｂ細胞上で結合し、ＬＰＳ刺激を受けて増殖応答を抑制することを示す。（ａ）ＣＤ２２／ｃａｌの構造、カリチェアミシンのＣＤ２２標的免疫複合体。（ｂ）Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞を、Ｃｙ３４．１またはＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体で染色した。（ｃ）ＬＰＳで刺激し、Ｃｙ３４．１またはＣＤ２２／ｃａｌの濃度を増加させて４８時間インキュベートした初代マウスＢ細胞の増殖。（ｄ）ＬＰＳで刺激し、ＣＤ２２／ｃａｌまたは対照Ｊ１１０／ｃａｌ抗体の濃度を増加させて４８時間インキュベートした初代マウスＢ細胞の増殖。（ｅ）ＣＤ２２／ｃａｌまたは対照Ｊ１１０／ｃａｌＡｂの濃度を増加させて４８時間のインキュベート後、ＴＣＲ副刺激までの初代マウスＴ細胞の増殖。 図３は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体の生体内細胞毒性効果を図示している。（ａ）２度のＣＤ２２／ｃａｌ注射の前（事前）および１２日後（事後）の、ＰＢ、脾臓、ＢＭ、およびＬＮにおけるＣＤ２２＋Ｂ細胞のパーセンテージ。（ｂ）１２日目の検体にＣＤ１９発現のための染色も行った。（ｃ）ＣＤ２２およびＣＤ１９の発現のために、未治療のｗｔＢ６マウスの有効組織検体を二重染色した。 図４は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＧｒ−１＋骨髄性細胞におけるＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体の生体内効果を図示している。２度のＣＤ２２／ｃａｌ注射の前（事前）および１２日後（事後）の、ＰＢ、脾臓、ＢＭ、およびＬＮ検体におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（ａ）およびＧｒ−１＋骨髄性細胞（ｂ）のパーセンテージ。（ｃ）０日目および５日目にＣＤ２２／ｃａｌを注射したマウスの有効組織を５０日目に採取し、ＣＤ２２発現のために染色した。 図５は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体によるＢ細胞除去が臨床関節炎の進行を抑制することを図示している。Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの群を０日目にＣＦＡ中のII型コラーゲンで免疫し、５日目および１０日目にＰＢＳ（ａ）またはＣＤ２２／ｃａｌ（ｂ）を注射した。半定量スコアリングシステムを使用して、足の臨床関節炎を評価した。実行した２つの代表的実験を示す。 図６は、ＣＤ２２／ｃａｌ免疫複合体によるＢ細胞除去が関節炎の組織学的所見を抑制することを図示している。Ｂ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの群を０日目にＣＦＡ中のII型コラーゲンで免疫し、５日目および１０日目にＰＢＳ（非処理）またはＣＤ２２／ｃａｌ（Ｂ細胞除去済）を注射した。II型コラーゲンによる免疫後２５日目（ａ、ｂ）または７５日目（ｃ、ｄ）に、２つの異なる実験から組織病理学的評価用の足を採取した。 図７は、ＣＤ２２／ｃａｌの投与が、ＲＳＶのＦタンパク質で免疫されたＢ６マウスにおける抗Ｆタンパク質抗体滴定濃度を変化させないことを明示している。Ｂ６マウス（Ｆ／ＡｌＰＯ）における（ａ）血清ＩｇＭおよび（ｂ）血清ＩｇＧ滴定濃度を、０週目および２週目（黒矢印）にＦタンパク質で免疫した。対照マウス（ＰＢＳ）は免疫しなかった。４週目および４週＋５日目（白矢印）に、Ｆ／ＡｌＰＯおよびＰＢＳマウスにＣＤ２２／ｃａｌを受けさせるか、ＰＢＳのみに投与した。１２週目に、全てのマウスに感染性ＲＳＶ（★）を投与した。 図８（ａ）は、ＣＤ２２／ｃａｌまたはＧＧ５／ｃａｌを注射されたＢ６ＩＦＮ−γＫＯマウスの臨床関節炎スコアを示す。 図８（ｂ）は、標準ＥＬＩＳＡにより測定されるようなII型コラーゲンに対するＣＩＡの経過中の血清ＩｇＧ２ｂ抗体価を示す。

Claims (52)

  1. 被験者における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記被験者に治療効果のある量のＢ細胞除去剤を投与するステップを含む、方法。
  2. 前記Ｂ細胞除去剤が、ホルモン、成長因子、抗体、抗体フラグメント、抗体模倣体、およびそれらの遺伝子組み換えあるいは酵素組み換えが行われた対応物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｂ細胞除去剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記抗体が、単クローン性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、遺伝子導入動物において産出したヒト抗体、一本鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメントからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗体が、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、および抗ＣＤ２２抗体からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  6. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項３に記載の方法。
  7. 前記ヒト化抗体が、細胞表面抗原ＣＤ２２に対するＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、軽鎖可変領域５／４４‐ｇＬ１（配列番号：１９）、および重鎖可変領域５／４４‐ｇＨ７（配列番号：２７）を含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、配列番号：２８に記載の配列を有する軽鎖を含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、配列番号：３０に記載の配列を有する重鎖を含む、請求項６に記載の方法。
  11. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、配列番号：２８に記載の配列を有する軽鎖および配列番号：３０に記載の配列を有する重鎖を含む、請求項６に記載の方法。
  12. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、親和性成熟プロトコルによって得られた変異抗体であり、ヒトＣＤ２２に対する特異性が高い、請求項６に記載の方法。
  13. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、ヒト受容体フレームワーク領域および非ヒトドナーＣＤＲを備える可変領域を含む、請求項６に記載の方法。
  14. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、ヒトの亜群Ｉの共通配列に基づき、１、２８、４８、７１および９３の位置に非ヒトドナーの残留物を有する、重鎖可変領域のヒト受容体フレームワーク領域を含む、請求項６に記載の方法。
  15. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、６７および６９の位置に非ヒトドナーの残留物をさらに有する、請求項６に記載の方法。
  16. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、ヒトの亜群Ｉの共通配列に基づくヒト受容体フレームワーク領域を備え、２、４、３７、３８、４５および６０の位置にある非ヒトドナーの残留物をさらに備える、軽鎖の可変領域を含む、請求項６に記載の方法。
  17. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、３の位置に非ヒトドナーの残留物をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  18. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体は、前記可変領域がＣＤＲ‐Ｈ１に対する配列番号：１、ＣＤＲ‐Ｈ２に対する配列番号：２もしくは配列番号：１３もしくは配列番号：１５もしくは配列番号：１６、またはＣＤＲ‐Ｈ３に対する配列番号：３に記載の少なくとも１つの配列を有するＣＤＲを含む重鎖と、ＣＤＲ‐Ｌ１に対する配列番号：４、ＣＤＲ‐Ｌ２に対する配列番号：５、またはＣＤＲ‐Ｌ３に対する配列番号：６に記載の少なくとも１つの配列を有するＣＤＲを含む軽鎖とを含む、請求項６に記載の方法。
  19. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、それぞれ、配列番号：７および配列番号：８に記載の単クローン性抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を備えるキメラ抗体である、請求項６に記載の方法。
  20. 前記ＣＤＲを移植されたヒト化単クローン性抗体が、切断ドナーＣＤＲ配列であって、前記ドナーＣＤＲの欠損している部分が異なる配列によって置換され、機能的なＣＤＲを形成する切断ドナーＣＤＲ配列を備えるハイブリッドＣＤＲを含む、請求項６に記載の方法。
  21. 前記Ｂ細胞除去剤が、細胞毒性薬剤あるいは細胞毒性薬派生に接合し、細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
  22. 前記複合体が、化学式
    Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
    を有する、縮小された低接合画分（ＬＣＦ）を有する単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体であって、
    式中、Ｐｒは、Ｂ細胞除去剤であり、
    Ｘは、Ｂ細胞除去剤に反応可能な任意の反応基の生成物を含むリンカーであり、
    Ｗは、細胞毒性薬剤であり、
    ｍは、前記細胞毒性薬剤が前記複合体の重量の７〜９％を構成するよう精製した抱合生成物の平均負荷であり、
    （−Ｘ−Ｗ）ｍは、細胞毒性薬派生である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体が、
    前記細胞毒性薬派生が前記Ｂ細胞除去剤の重量の４．５〜１１％である、前記細胞毒性薬派生を前記Ｂ細胞除去剤に加えるステップと、
    単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を産出するための約７から９の範囲のｐＨを有する非求核でタンパク質適合性の緩衝液で前記細胞毒性薬派生および前記Ｂ細胞除去剤を培養するステップであって、前記緩衝液が、（ａ）有機共溶媒と、（ｂ）少なくとも１つのＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を備える添加剤とを含み、前記培養が、約１５分から２４時間を範囲とする期間に約３０℃から約３５℃を範囲とする温度で行われるステップと、
    ステップ（２）で産出された前記複合体に対し、複合していないＢ細胞除去剤、細胞毒性薬派生、および塊状の複合体から、細胞毒性薬剤の重量の４〜１０％の範囲にある負荷および１０％未満の低接合画分（ＬＣＦ）を有する単量体の細胞毒性薬派生／Ｂ細胞除去剤の複合体を分離するためのクロマトグラフ分離工程を行うステップと、
    を含む方法によって調製される、請求項２２に記載の方法。
  24. ステップ（２）（ｂ）の前記添加剤が、オクタン酸またはその塩である、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップ（２）（ｂ）の前記添加剤が、デカン酸またはその塩である、請求項２３に記載の方法。
  26. ステップ（３）の前記クロマトグラフ分離工程が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である、請求項２３に記載の方法。
  27. ステップ（３）の前記クロマトグラフ分離工程が、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣあるいはセファクリルＳ‐２００クロマトグラフィーである、請求項２３に記載の方法。
  28. ステップ（３）の前記クロマトグラフ分離工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、フェニルセファロース６ファーストフロークロマトグラフ媒体、ブチルセファロース４ファーストフロークロマトグラフ媒体、オクチルセファロース４ファーストフロークロマトグラフ媒体、トヨパールエーテル‐６５０Ｍクロマトグラフ媒体、Ｍａｃｒｏ‐ＰｒｅｐメチルＨＩＣ媒体あるいはＭａｃｒｏ‐Ｐｒｅｐ ｔブチルＨＩＣ媒体を使用して行われる、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、ブチルセファロース４ファーストフロークロマトグラフ媒体を使用して行われる、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記複合体が、化学式
    Ｐｒ（−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ）ｍ
    を含み、
    式中、Ｐｒは、抗ＣＤ２２抗体であり、
    Ｘは、抗体に反応可能な任意の反応基の生成物を含む加水分解性リンカーであり、
    Ｗは、カリチェアミシンラジカルであり、
    ｍは、カリチェアミシンが前記複合体の重量の４〜１０％を構成するよう精製した抱合生成物の平均負荷であり、
    （−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｗ）ｍは、カリチェアミシン誘導体である、請求項２１に記載の方法。
  32. 前記カリチェアミシン誘導体が、ガンマカリチェアミシンあるいはＮ‐アセチルガンマカリチェアミシン誘導体である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記カリチェアミシン誘導体が、３‐メルカプト‐３‐メチルブタノイルヒドラジドで官能基化されている、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記加水分解性リンカーが、標的細胞との結合および流入後に、前記カリチェアミシン誘導体を前記複合体から放出可能な二官能性リンカーである、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記二官能性リンカーが、４‐（４‐フェノキシアセチル）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記複合体が、ＣＭＣ‐５４４である、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記複合体は、単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体の安定した凍結乾燥組成物であり、
    単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を、終末濃度０．５から２ｍｇ／ｍＬになるように、重量の１．５％〜５％の濃度の抗凍結剤、重量の０．５〜１．５％の濃度の高分子膨張性薬剤、０．０１Ｍ〜０．１Ｍの濃度の電解質、重量の０．００５〜０．０５％の濃度の溶解性促進剤、溶液の最終ｐＨを７．８〜８．２にする５〜５０ｍＭの濃度の緩衝剤、および水を含む溶液に溶解し、前記溶液を＋５℃から＋１０℃の温度で水薬瓶に分注するステップと、
    前記溶液を、−３５℃から−５０℃の凍結温度で凍結させるステップと、
    −１０℃から−４０℃の棚温度で２４から７８時間、２０から８０ミクロンの一次乾燥圧縮で、最初の凍結乾燥ステップを前記凍結した溶液に対して行うステップと、
    ＋１０℃から＋３５℃の棚温度で１５から３０時間、２０から８０ミクロンの乾燥圧縮で、二次乾燥ステップをステップ（ｄ）の前記凍結乾燥した生成物に対して行うステップと、
    を含む方法によって、前記複合体が調製される、請求項２１に記載の方法。
  38. 前記被験者に抗サイトカイン剤を投与するステップを追加的に含む、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
  39. 前記抗サイトカイン剤が、抗ＴＮＦ薬剤である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記抗ＴＮＦ薬剤が、エタネルセプトである、請求項３９に記載の方法。
  41. 被験者における自己免疫疾患を治療する方法であって、
    前記被験者に（ａ）Ｂ細胞除去剤、および（ｂ）少なくとも１つの抗サイトカイン剤の治療効果のある量を投与するステップを含む、方法。
  42. 前記Ｂ細胞除去剤が、請求項２から２０のいずれかに記載のＢ細胞除去剤である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記Ｂ細胞除去剤が、細胞毒性薬剤あるいは細胞毒性薬派生に複合し、請求項２２から３７のいずれかに記載の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を形成する、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記抗サイトカイン剤が、請求項３９あるいは４０のいずれかに記載の抗サイトカイン剤である、請求項４１に記載の方法。
  45. 被験者における自己免疫疾患を治療する方法であって、
    化学式
    Ｐｒ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
    を備える、縮小された低接合画分（ＬＣＦ）を有する複合体の治療効果のある量を前記被験者に投与するステップを含み、
    式中、Ｐｒは、生物活性剤であり、
    Ｘは、生物活性剤に反応可能な任意の反応基の生成物を含むリンカーであり、
    Ｗは、細胞毒性薬剤であり、
    ｍは、前記細胞毒性薬剤が前記複合体の重量の７〜９％を構成するよう精製した抱合生成物の平均負荷であり、
    （−Ｘ−Ｗ）ｍは、細胞毒性薬派生である、方法。
  46. 前記細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体が、
    （１）前記細胞毒性薬派生が前記生物活性剤の重量の４．５〜１１％である、前記細胞毒性薬派生を前記生物活性剤に加えるステップと、
    （２）単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を産出するための約７から９の範囲のｐＨを有する非求核でタンパク質適合性の緩衝液で前記細胞毒性薬派生および生物活性剤を培養するステップであって、前記緩衝液が、（ａ）有機共溶媒と、（ｂ）少なくとも１つのＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を備える添加剤とをさらに含み、前記培養が、約１５分から２４時間を範囲とする期間に約３０℃から約３５℃を範囲とする温度で行われるステップと、
    （３）複合していない生物活性剤、細胞毒性薬派生、および塊状の複合体から、細胞毒性薬剤の重量の４〜１０％の範囲にある負荷および１０％以下の低接合画分（ＬＣＦ）を有する単量体の細胞毒性薬派生／生物活性剤の複合体を分離するためのクロマトグラフ分離工程を、ステップ（２）で産出された前記複合体に対して行うステップと、
    を含む方法によって、調製される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、免疫性血球減少症、免疫性血管炎あるいはその組み合わせである、請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記自己免疫疾患が、動物実験モデルにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）である、請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
  49. 被験者に複合体の治療効果のある量を投与するステップを含む、被験者における自己免疫疾患の治療に対する薬物の調製において、請求項１から４６のいずれかに記載される、Ｂ細胞除去剤あるいは前記複合体の使用法。
  50. 少なくとも１つのＢ細胞除去剤に複合する少なくとも１つの細胞毒性薬剤を備える、細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を含む、組成物。
  51. 前記少なくとも１つのＢ細胞除去剤が、請求項２から２０のいずれかに記載のＢ細胞除去剤である、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体が、
    前記細胞毒性薬派生が前記生物活性剤の重量の４．５〜１１％である、前記細胞毒性薬派生を前記生物活性剤に加えるステップと、
    単量体の細胞毒性薬剤／Ｂ細胞除去剤の複合体を産出するための約７から９の範囲のｐＨを有する非求核でタンパク質適合性の緩衝液で前記細胞毒性薬派生および生物活性剤を培養するステップであって、前記緩衝液が、（ａ）有機共溶媒と、（ｂ）少なくとも１つのＣ６〜Ｃ１８カルボン酸またはその塩を備える添加剤とをさらに含み、前記培養が、約１５分から２４時間を範囲とする期間に約３０℃から約３５℃を範囲とする温度で行われるステップと、
    複合していない生物活性剤、細胞毒性薬派生、および塊状の複合体から、細胞毒性薬剤の重量の４〜１０％の範囲にある負荷および１０％未満の低接合画分（ＬＣＦ）を有する単量体の細胞毒性薬派生／生物活性剤の複合体を分離するためのクロマトグラフ分離工程を、ステップ（２）で産出された前記複合体に対して行うステップと、
    を含む方法によって調製される、請求項５０に記載の組成物。
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