JP2008507953A - Vegf発現をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングするための方法および薬剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列はNeRPに機能し得る形で連結され、該NeRPはPTCREに機能し得る形で連結され、該PTCREは配列番号3ではなく、該レポーターポリペプチドの発現を、NeRPの非存在下の場合と比較してモジュレートすることができる、前記核酸構築物を含む。
配列番号1は完全長VEGFの5'UTRを示す。
本明細書で用いる用語「構築物」は人工的に操作された核酸分子を指す。
本発明は、非翻訳領域(UTR)が遺伝子の発現をモジュレートすることができ、そのような発現のモジュレーションが化合物の添加により変化またはモジュレートされ得るという事実を含み、利用するものである。好ましい実施形態においては、UTRはタンパク質に翻訳されないRNAの領域である。より好ましい実施形態においては、UTRは標的化されたタンパク質に翻訳されないRNA転写物の隣接する領域であり、短い、推定オープンリーディングフレームを有する5'UTRを含んでもよい。最も好ましい実施形態においては、UTRは5'UTR、すなわち、コード領域の上流、または3'UTR、すなわち、コード領域の下流である。
当業者であれば、本明細書で考察される公知の技術または等価な技術の詳細な説明のための一般的な参考書に言及することができる。これらの参考書としては、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons, Inc. (1995); Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第2版), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Birrenら、Genome Analysis: A Laboratory Manual, 第1〜4巻, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1997-1999)が挙げられる。もちろん、これらの参考書は、本発明の態様を成し、又は用いる場合に参照することもできる。
本発明は、配列番号3などの転写後調節エレメント(post-transcriptional regulatory element; PTCRE)、配列番号4などのPTCREの負の調節因子(negative regulator of a PTCRE; NeRP)、ならびにその断片および全ての相補体を含むか、またはそれらからなるUTRを有する核酸分子を含む。
本発明は、核酸構築物を含み、これを提供する。本発明の任意の構築物および他の核酸薬剤はDNAまたはRNAであってよいことが理解される。好ましい実施形態においては、構築物はUTR、コード配列、または両方を有する核酸分子であってよい。別の実施形態においては、構築物は少なくとも1種の本発明のUTR、レポーターポリペプチドをコードする配列、およびベクターから構成される。さらに、本発明の核酸分子のいずれかを、本発明の方法と組合わせて用いることができる。
外因性遺伝物質を、そのような目的のために設計されたベクターまたは構築物を用いることにより宿主細胞中に導入することができる。本発明の核酸配列のいずれかを、本発明のベクターまたは構築物中に組込むことができる。本発明のベクターまたは構築物としては、限定されるものではないが、線状または閉環状プラスミドが挙げられる。ベクター系は、1個のベクターもしくはプラスミド、または宿主のゲノム中に導入しようとする全DNAを一緒に含む2種以上のベクターもしくはプラスミドであってよい。好ましい実施形態においては、ベクターは哺乳動物細胞もしくは細菌またはその両方において機能的なプロモーターを含む。ベクターまたは構築物を調製する手段は当業界で公知である。
構築物はプロモーターを含んでもよく、例えば、組換えベクターは、典型的には5'から3'の向きに、目的の核酸分子の転写を指令するプロモーターを含む。
本明細書で用いる、「レポーター遺伝子」はその発現を測定することができる任意の遺伝子である。好ましい実施形態においては、レポーター遺伝子はいかなるUTRも有さない。より好ましい実施形態においては、レポーター遺伝子は連続的なオープンリーディングフレームである。別の好ましい実施形態においては、レポーター遺伝子は検出可能な発現の以前に決定された参照範囲を有することができる。
本明細書で用いる、連結されることとは、物理的に連結されること、機能し得る形で連結されること、隣接すること、またはこれらのいずれかの組合せを意味する。
本発明の薬剤および構築物は、非翻訳領域(UTR)を有する核酸分子を含む。好ましい態様においては、UTRはmRNAのUTR、すなわち、タンパク質に翻訳されないmRNAの領域を指す。好ましい実施形態においては、UTRは遺伝子発現のUTR依存的調節をモジュレートする1個以上の調節エレメントを含む。特に好ましい実施形態においては、UTRは5'UTR、すなわち、コード領域の上流であるか、または3'UTR、すなわち、コード領域の下流である。別の特に好ましい実施形態においては、5'UTRはVEGFプロモーターを含む。より好ましい実施形態においては、5'UTRはVEGFプロモーターおよびPTCREを含む。
本明細書で言及する場合、PTCREは標的遺伝子の発現をモジュレートする転写後調節エレメントである。一態様においては、PTCREは標的UTRの完全長配列ではない。好ましい態様においては、PTCREは完全長VEGFの5'UTRではない。一実施形態においては、1個の標的遺伝子中のPTCREは、異なる標的遺伝子中のPTCREに対する一次核酸配列類似性を有してもよい。あるいは、類似する機能のPTCRE中に任意の一次核酸配列類似性が存在しなくてもよい。好ましい実施形態においては、1個の標的遺伝子中のPTCREは、異なる標的遺伝子中のPTCREと類似する二次、三次、または二次および三次構造を有してもよい。PTCREの例としては、限定されるものではないが、IRESエレメント、上流ORF、およびAREが挙げられる。
遺伝子発現のモジュレーションは、より多いか、またはより少ない遺伝子発現をもたらすものであってよい。本発明の核酸分子を用いて遺伝子発現をモジュレートするための多くの手法は当業者には公知である。例えば、遺伝子産物の過剰発現は、哺乳動物細胞中への本発明の構築物のトランスフェクションの結果であってよい。同様に、下方調節は、哺乳動物細胞中への本発明の構築物のトランスフェクションの結果であってもよい。他の非限定的な例としては、RNA干渉(RNAi)などのアンチセンス技術、トランスジェニック動物、ハイブリッド、およびリボザイムが挙げられる。以下の例は例示を用いて提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
本明細書で用いる用語「UTR依存的発現」とは、mRNA発現のレベルでの、すなわち、遺伝子の転写が開始した後、該遺伝子によりコードされるタンパク質またはRNA産物が分解されるまでの、UTRを介する遺伝子発現の調節を指す。好ましい実施形態においては、用語「UTR依存的発現」は、mRNAの安定性または翻訳の調節を指す。より好ましい実施形態においては、用語「UTR依存的発現」とは、UTR中に存在する調節エレメントを介する遺伝子発現の調節を指す。標的遺伝子のUTR内のPTCREの配列を変化させることにより、その標的遺伝子について観察されるUTR依存的発現の量を変化させることができる。
本発明の一態様においては、化合物と本発明のPTCREまたはNeRPのハイブリッドは、2つの非同一分子間で形成されるハイブリッドである。好ましい態様においては、ハイブリッドを2個の核酸分子間で形成させることができる。例えば、ハイブリッドを、2個のリボ核酸分子間、リボ核酸とデオキシリボ核酸の間、またはいずれかの誘導体の間で形成させることができる。代替的な実施形態においては、ハイブリッドを、本発明の核酸と非核酸分子の間で形成させることができる。好ましい実施形態においては、ハイブリッドを、核酸分子と非核酸分子、例えば、ポリペプチドまたは非ペプチド性治療剤との間で形成させることができる。
本発明の一態様においては、遺伝子の活性または発現を、本発明の核酸分子、例えば、配列番号3および配列番号5〜8に対して特異的に指向するトランス切断触媒RNA(リボザイム)を設計することにより調節する。代替的な態様においては、遺伝子の活性または発現を、本発明の核酸分子、例えば、配列番号4および配列番号9〜12に対して特異的に指向するトランス切断触媒RNA(リボザイム)を設計することにより調節する。
細胞の形質転換またはトランスフェクションに用いることができる核酸分子は、本発明の任意の核酸分子であってよい。本発明の核酸分子を細胞または生物中に導入することができる。好ましい態様においては、この細胞を、VEGFを発現しない細胞、VEGFを発現する細胞、またはVEGFを条件的に発現する細胞からなる群より選択する。より好ましい態様においては、この細胞は癌細胞であり、より好ましくは、形質転換されていない細胞と比較してVEGFが過剰発現される癌細胞である。
化合物
本発明は、遺伝子発現をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングする方法を含む。任意の化合物を、本発明のアッセイにおいてスクリーニングすることができる。
本発明は、遺伝子発現をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングすることができるアッセイを含み、これを提供する。本発明の好ましい態様においては、アッセイはin vitroアッセイである。本発明の別の態様においては、アッセイはin vivoアッセイである。本発明の別の好ましい態様においては、アッセイは翻訳を測定するものである。本発明の好ましい態様においては、アッセイは本発明の核酸分子または本発明の構築物を含む。本発明の核酸分子または構築物としては、限定されるものではないが、配列番号3〜12、または機能を変化させない様式で、核酸配列が欠失、置換、もしくは付加された点で配列番号3〜12中の任意の残基と異なる配列が挙げられる。本発明はまた、本発明の全ての核酸分子の断片および相補体も提供する。
本発明は、遺伝子発現をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングすることができるアッセイを含み、これを提供する。本発明の好ましい態様においては、アッセイはin vitroアッセイである。本発明の好ましい態様においては、in vitroアッセイは翻訳を測定するものである。本発明の好ましい態様においては、in vitroアッセイは本発明の核酸分子または本発明の構築物を含む。
本発明は、遺伝子発現をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングすることができるアッセイを含み、これを提供する。本発明の好ましい態様においては、アッセイはin vivoアッセイである。本発明の好ましい態様は翻訳を測定するアッセイである。本発明の好ましい実施形態においては、in vivoアッセイは本発明の核酸分子または本発明の構築物を含み、細胞または生物内の細胞もしくは組織の使用を含んでもよい。より好ましい実施形態においては、in vivoアッセイは、細胞または生物内の細胞もしくは組織中に存在する本発明の核酸分子を含む。
本発明はまた、標的遺伝子の異常な発現に関連する疾患または障害の1種以上の症状を治療、予防または軽減するための方法であって、本明細書に記載の方法に従って同定された、治療上または予防上有効量の化合物、もしくは製薬上許容し得るその塩を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記方法も提供する。本発明の一実施形態においては、標的遺伝子を異常に発現させる。標的遺伝子を異常に過剰発現させるか、または異常に低レベルで発現させることができる。特に、本発明は、疾患もしくは障害を治療もしくは予防するか、またはその症状を軽減する方法であって、本明細書に記載の方法に従って同定された、該疾患もしくは障害の治療もしくは予防において有益な標的遺伝子の発現を増加させるのに有効な量の化合物、もしくは製薬上許容し得るその塩を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明はまた、疾患もしくは障害を治療もしくは予防するか、またはその症状を軽減する方法であって、本明細書に記載の方法に従って同定された、その発現が該疾患もしくは障害の開始、発達、進行もしくは重篤度と関連するか、またはそれらと関連した標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の化合物、もしくは製薬上許容し得るその塩を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記方法も提供する。特定の実施形態においては、前記疾患または障害は、増殖性障害、炎症性障害、感染症、遺伝子障害、自己免疫障害、心血管疾患、または中枢神経系障害である。前記疾患または障害が感染症である実施形態においては、該感染症は菌類感染、細菌感染、ウイルス感染、または別の型の病原体により引き起こされる感染により引き起こされるものであってよい。
治療上有効量とは、該治療上有効量の非存在下で生じるレポーター遺伝子活性と比較して、レポーター遺伝子の活性を増加させるか、または減少させる活性成分の量を指す。任意の化合物について、治療上有効量を、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて最初に評価することができる。動物モデルを用いて、好適な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定することができる。
翻訳に影響を及ぼす試薬を、in vitroまたはin vivoでヒト細胞に投与して、特定の遺伝子の翻訳活性を特異的に低下させることができる。好ましい実施形態においては、この試薬は遺伝子の5'UTRに結合するのが好ましい。本発明の代替的な実施形態においては、この試薬は本発明のPTCREまたはNeRPに結合するのが好ましい。好ましい実施形態においては、試薬は化合物である。ex vivoでのヒト細胞の治療のために、抗体を、体内から取り出した幹細胞の調製物に添加することができる。次いで、この細胞を、当業界で公知のように、クローン的増殖を用いて、または用いずに、同じか、または別のヒト体内に入れることができる。
本発明の薬剤を、本発明のPTCREもしくはNeRPをコードする核酸配列中の突然変異の存在に関連する疾患および異常または疾患および異常に対する罹りやすさを検出するための診断アッセイにおいて用いることもできる。例えば、疾患に罹患した個体および正常な個体における、PTCREもしくはNeRPをコードするcDNAまたはゲノム配列の間の差異を決定することができる。突然変異が、正常な個体ではなく、罹患した個体のいくらか、または全てにおいて観察される場合、この突然変異は疾患の原因となる薬剤である可能性がある。
モノシストロン性受容体構築物(pLuc/vegf5'+3'UTR)はCMVプロモーターの転写制御下にあり、ルシフェラーゼレポーターを駆動するVEGF IRESを含み、その核酸配列は両方ともVEGFの3'-UTRの上流にある。pLuc/vegf5'+3'UTRを用いて293細胞をトランスフェクトすることにより、安定な細胞系を作製する。安定な細胞系を、ハイグロマイシンB選択下で培養して、当業界で公知のプロトコルと一致するクローン細胞系を作製する。選択の2週間後、クローン細胞系をルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。いくつかのクローン細胞系(以後「クローン」と呼ぶ)のルシフェラーゼ活性を比較し、総タンパク質含量に対して正規化する。クローンを、ルシフェラーゼ活性を周期的にモニターしながら、3ヶ月以上ハイグロマイシンB選択下で維持する。クローンは安定であり、高レベルのルシフェラーゼ発現を維持する。多くのクローン、例えば、約20個のクローンを、ルシフェラーゼ活性に関して互いに比較することができる。クローンB9、D3およびH6と比較して、クローンB9は高レベルのルシフェラーゼ活性を示す。さらに、半定量的PCR分析を行えば、その結果は細胞1個あたり複数コピーのレポーターが組込まれることを示す。転写後の高効率スクリーニング(PTHTS)における使用のための選択の前に、クローンに関する特定のパラメーターを試験する。PTHTSに関する関連パラメーターとしては、限定されるものではないが、細胞数、インキュベーション時間、DMSO濃度、および基質容量が挙げられる。
同定された化合物を全て再合成し、LC/MSおよび燃焼分析により95%を超える純度であることを示す。続いて、再合成された化合物を、UTR特異性を最初に評価するのに用いられる用量応答VEGF ELISAおよびルシフェラーゼアッセイにおいて試験する。同定された化合物は全てUTR特異性を保持し、真正にVEGF発現の阻害剤である。
PTHTSにより同定された化合物は、目の新血管障害の治療のためのVEGF特異的阻害剤である。網膜色素上皮細胞およびマクロファージ細胞に対する同定された化合物の効果を、2つの細胞系:ヒト網膜色素上皮細胞系ARPE-19、およびマウスマクロファージ細胞系RAW264中で試験する。両細胞系は低酸素条件下で高レベルのVEGFを産生する。同定された化合物のサブセットは、これらの2つの細胞系において活性である。化合物1は、マクロファージ(その非限定例はRAW264.7である)および網膜色素上皮細胞(その非限定例はARPE-19である)の両方におけるVEGF産生を阻害する。選択性試験においては、表2に示されるように、化合物1は他の因子(FGF-2、IGF-1、GCSF、TNFα)の発現と比較して、VEGF発現を特異的に阻害する。
薬力学的モデルは、腫瘍内VEGFレベルを評価し、in vivoでの効力について化合物を選択するものである。予備データは、本発明者らの化合物のいくつかが腫瘍組織におけるVEGF産生を効率的に阻害することを示している(図4Aを参照)。簡単に述べると、HT1080細胞(ヒト線維肉腫細胞系)をヌードマウスに皮下移植する。7日後、マウスに2週間、20 mg/kg/日で経口的に化合物を投与する。次いで、腫瘍をマウスから切り出し、プロテイナーゼ阻害剤を含むTris-HClバッファー中でホモジナイズする(Moulder, S.L.ら、Cancer Res. 61(24): 8887-95, 2001)。続いて、ヒトVEGF ELISAキット(R&D System, Minneapolis, MN)を用いて腫瘍内VEGFレベルを測定する。ホモジネートのタンパク質濃度を、Bio-Rad (商標)タンパク質アッセイキットを用いて測定し、腫瘍内VEGFレベルをタンパク質濃度に対して正規化する。同定された化合物を用いる治療は、ビヒクル対照と比較して腫瘍内VEGFタンパク質レベルを有意に低下させる。さらに、2週間の同定された化合物を用いる治療は、ビヒクルにより治療された対照群と比較して腫瘍増殖を阻害する(図4B)。
VEGF-5UTR1および5UTR2をヒトゲノムDNAから増幅する。完全長5'UTRを、2つの断片の連結により作製する(図5を参照)。P2luc/VEGF5UTR-FLを、完全長5'UTRをジシストロン性プラスミド(p2luc)中のSalIおよびSmalI部位間に挿入することにより作製する。他のベクターを、関連する配列を欠失させることによりp2luc/VEGF5UTR-FLから誘導する。これらのプラスミドの全てを、一過性トランスフェクションにより293細胞中で試験する。図6は、VEGF5'UTR断片の各々に関する、相対的なホタルルシフェラーゼ活性(ウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化)を示す。同様の結果が、そのような実験を反復することから得られる。
Claims (47)
- レポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、レポーターポリペプチドをコードする該核酸配列はNeRPに機能し得る形で連結され、該NeRPはPTCREに機能し得る形で連結され、該PTCREは配列番号3ではなく、および該レポーターポリペプチドの発現を、該NeRPの非存在下の場合と比較してモジュレートすることができる、前記核酸構築物。
- NeRP1(配列番号4)がレポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列内に位置する、請求項1に記載の核酸構築物。
- NeRP1(配列番号4)がレポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列の下流に位置する、請求項1に記載の核酸構築物。
- NeRP1(配列番号4)がイントロン内に位置し、該イントロンがレポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列内に位置する、請求項1に記載の核酸構築物。
- 配列番号4の非存在下でレポーターポリペプチドをコードする核酸配列およびVEGFの5'UTR核酸配列を含む核酸分子。
- 配列番号4の非存在下での前記VEGFの5'UTRが内部リボソーム進入部位(「IRES」)を含む、請求項5に記載の核酸分子。
- ゲノム中に無作為に組込むことができる高レベルの哺乳動物発現ベクターをさらに含む、請求項5に記載の核酸分子。
- ゲノム中に部位選択的に組込むことができる高レベルの哺乳動物発現ベクターをさらに含む、請求項5に記載の核酸分子。
- エピゾーム哺乳動物発現ベクターをさらに含む、請求項5に記載の核酸分子。
- レポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列がイントロンを含む、請求項5に記載の核酸分子。
- 配列番号4の非存在下での前記VEGFの5'UTRがイントロンを含む、請求項5に記載の核酸分子。
- 配列番号4の非存在下でVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結されたレポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
- レポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列がイントロンを含む、請求項12に記載の核酸分子。
- レポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、レポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列がNeRPを含むUTRの下流に機能し得る形で連結され、該UTRが機能し得る形で配列番号3の上流にない、前記核酸分子。
- 核酸分子の異種性集団であって、該異種性集団がレポーター核酸配列を含み、レポーターポリペプチドをコードする該核酸配列がNeRP1(配列番号4)の非存在下でVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結される、前記異種性集団。
- 前記異種性集団が安定な細胞系から単離される、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 前記集団をin vitroで産生させる、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 前記集団を用いてポリペプチドを産生させる、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 前記異種性集団を、5'キャップを有する分子を除外するように選択する、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 前記異種性集団がポリアデニル化されている、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 前記異種性集団がポリアデニル化されていない、請求項15に記載の核酸分子の異種性集団。
- 配列番号3の核酸分子、その断片、またはいずれかの相補体と95〜99%の配列同一性を有する実質的に精製された核酸分子。
- 配列番号3、その断片、またはいずれかの相補体からなる実質的に精製された核酸分子。
- ポリペプチドをコードする異種性核酸配列に連結された第1の核酸配列からなる実質的に精製された核酸分子であって、該第1の核酸配列が配列番号3、その断片、およびいずれかの相補体からなる群より選択される、前記核酸分子。
- 配列番号4の核酸分子、その断片、またはいずれかの相補体と95〜99%の配列同一性を有する実質的に精製された核酸分子。
- 配列番号4、その断片、およびいずれかの相補体からなる群より選択される核酸配列の実質的に精製された核酸分子。
- ポリペプチドをコードする異種性核酸配列に連結された第1の核酸配列からなる実質的に精製された核酸分子であって、該第1の核酸配列が配列番号4、その断片、およびいずれかの相補体からなる群より選択される、前期核酸分子。
- 化合物をスクリーニングするための核酸構築物の作製方法であって、
a) 該核酸構築物中のプロモーターの下流に主要なORFを提供すること;
b) 該主要なORFの上流に配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRを機能し得る形で連結すること;および
c) 該主要なORFの下流にVEGFの3'UTRを機能し得る形で連結すること、
を含む、前記方法。 - 前記主要なORFはレポーターポリペプチドをコードする、請求項28に記載の方法。
- UTR依存的発現をモジュレートする化合物をin vivoでスクリーニングする方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRから上流にプロモーターを含み、配列番号4の非存在下での該VEGFの5'UTRがレポーターポリペプチドをコードする核酸配列から上流にあり、レポーターポリペプチドをコードする該核酸配列がVEGFの3'UTRから上流にある、核酸分子を有する細胞を提供すること;
b) 該細胞を化合物と接触させること;
c) レポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含み、配列番号4を含まない核酸分子を産生させること;および
d) 該レポーターポリペプチドを検出すること、
を含む、前記方法。 - レポーターポリペプチドをコードする前記核酸配列がVEGFである、請求項30に記載の方法。
- UTRに影響される発現をモジュレートする化合物をin vitroでスクリーニングする方法であって、
a) in vitro翻訳系を提供すること;
b) 該in vitro翻訳系を、化合物および配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRを含む核酸分子と接触させ、ここで配列番号4の非存在下での該VEGFの5'UTRがレポーターポリペプチドをコードする核酸配列から上流にあり、レポーターポリペプチドをコードする該核酸配列がVEGFの3'UTRから上流にあり;ならびに
c) in vitroで該レポーターポリペプチドを検出すること、
を含む、前記方法。 - 細胞中で核酸分子を発現させる方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFのUTRに隣接するレポーターポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を細胞に提供すること;および
b) 該レポーターポリペプチドを検出すること、
を含む、前記方法。 - 前記核酸分子をin vitro転写により産生させる、請求項33に記載の方法。
- 前記核酸分子が合成的に産生されたRNA分子である、請求項33に記載の方法。
- 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結されたレポーター遺伝子を有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での該安定な細胞系と比較すること;および
c) 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結された主要なORFを有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での該安定な細胞系と比較すること;および
c) 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - VEGFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) in vivoでVEGF遺伝子をレポーター遺伝子と置換し、ここで配列番号3からなるUTRが該レポーター遺伝子に機能し得る形で連結され、該置換が分化した細胞中で起こり;
b) 該分化した細胞を増殖させること;および
c) 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介して該レポーター遺伝子のタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) in vivoで主要なORFをレポーター遺伝子と置換し、ここで配列番号3からなる5'UTRは該レポーター遺伝子に機能し得る形で連結され、および該置換が分化した細胞中で起こり;
b) 該分化した細胞を増殖させること;ならびに
c) 主要なORFに非依存的な、UTRに影響される機構を介して該レポーター遺伝子のタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結されたレポーター遺伝子を有する安定な細胞系を提供し、ここで該安定な細胞系は該化合物の存在下でin vivoで認められるVEGF遺伝子の転写後調節を模倣し;
b) 該安定な細胞系を維持すること;および
c) UTRに影響される機構を介して該レポーター遺伝子のタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - 前記安定な細胞系が形質転換された細胞である、請求項40に記載の方法。
- UTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) 配列番号4の非存在下でのVEGFの5'UTRに機能し得る形で連結されたレポーターポリペプチドをコードする主要なORFを有する安定な細胞系を提供し、ここで、該安定な細胞系は化合物の存在下でin vivoで認められるVEGF遺伝子の転写後調節を模倣し;
b) 該安定な細胞系を維持すること;および
c) UTRに影響される機構を介して該主要なORFのタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) NeRP1(配列番号4)の非存在下での5'VEGF UTRに機能し得る形で連結されたレポーター遺伝子を有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での場合と比較し、ここで、該化合物はNeRP1(配列番号4)の非存在下での該5'VEGF UTRがレポーター遺伝子に機能し得る形で連結される場合、UTR依存的発現をモジュレートせず;および
c) NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介して該レポーター遺伝子のタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - 前記化合物を選択する前記c)が、化合物の存在下での前記安定な細胞系を、該化合物の非存在下での場合と比較することを含み、ここで、該化合物は、前記レポーター遺伝子が前記5'VEGF UTRに機能し得る形で連結される場合、UTR依存的発現をモジュレートする、請求項43に記載の方法。
- NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) NeRP1(配列番号4)の非存在下での5'VEGF UTRに機能し得る形で連結されたレポーターポリペプチドをコードする主要なORFを有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での場合と比較し、該化合物は、NeRP1(配列番号4)の非存在下での該5'VEGF UTRが主要なORFに機能し得る形で連結される場合、UTR依存的発現をモジュレートせず;および
c) NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介して該主要なORFのタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) NeRP1(配列番号4)を有するUTRに機能し得る形で連結されたレポーター遺伝子を有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での場合と比較し、ここで、該化合物は、NeRP1(配列番号4)がレポーター遺伝子に機能し得る形で連結される場合、UTR依存的発現をモジュレートし;および
c) NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介して該レポーター遺伝子のタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。 - NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介してタンパク質発現をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
a) NeRP1(配列番号4)を有するUTRに機能し得る形で連結されたレポーターポリペプチドをコードする主要なORFを有する安定な細胞系を増殖させること;
b) 化合物の存在下での該安定な細胞系を、該化合物の非存在下での場合と比較し、ここで、該化合物は、NeRP1(配列番号4)がレポーターポリペプチドをコードする主要なORFに機能し得る形で連結される場合、UTR依存的発現をモジュレートし;および
c) 該NeRPの効果を媒介するUTRに影響される機構を介してレポーターポリペプチドをコードする該主要なORFのタンパク質発現をモジュレートする該化合物を選択すること、
を含む、前記方法。
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