JP2008507279A - アデノウイルスベクター中への導入遺伝子の付加 - Google Patents

Abstract

生来的なプロセシングシグナル、調節シグナルまたは異種の転写シグナル（例えば、分岐点部位、スプライスアクセプター部位、内部リボソーム進入部位、自己プロセシング切断部位および／またはポリＡシグナルなど）の１つまたは複数が導入遺伝子の発現に寄与するように新規な部位においてウイルスゲノムに挿入された導入遺伝子を含有するアデノウイルスベクターが提供される。本発明は、アデノウイルス（Ａｄ）のゲノムを遺伝子送達ビヒクルおよび／または遺伝子発現ビヒクルとして使用する新規な遺伝子送達システムに関連する。アデノウイルスのゲノムは複製可能または複製不能（欠陥）のいずれかであり得る。

Description

（発明の背景）
本出願は、２００４年７月２２日に出願された米国仮出願第６０／５８９，８０４号および２００５年３月１１日に出願された米国仮出願第６０／６６０，５４２号からの優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、導入遺伝子の発現が生来的なアデノウイルスのプロセシングシグナルおよび／または調節シグナルあるいは異種の転写シグナルのいずれかに依存するように様々な場所においてゲノムに挿入された導入遺伝子を含むアデノウイルスベクター、ならびに、そのようなアデノウイルスベクターを作製するための方法に関連する。

（技術の背景）
様々なアデノウイルスベクターが、遺伝子を送達し、インビトロ、エクスビボおよびインビボで哺乳動物細胞において遺伝子を発現させるために広範囲に利用されている。アデノウイルスベクターは遺伝子送達のための多くの利点を提供する。例えば、野生型のアデノウイルスは健康な個体においてほんの軽度の病気を引き起こすだけであり、また、高い力価に増殖することが容易であり、また、その成長状態にかかわらずほとんどの細胞タイプに感染することができ、また、目的とするタンパク質をコードする核酸を様々な細胞に送達することができ、そして、その最も最近の実施形態では、特定の細胞において選択的に複製するように操作することができ、また、リガンドをキャプシドタンパク質内に組み込むことによって、または、リガンドをキャプシドタンパク質に結合することによって標的化することができる。

アデノウイルスベクターには、複製不能（複製欠陥）および複製可能の２つの大きなタイプが存在する。複製欠陥ベクターは従来より、複製に不可欠な１つまたは複数の遺伝子を有していない。このような複製不能ウイルスは、失われている不可欠な遺伝子を相補する細胞で増殖する。複製可能なアデノウイルスベクターは従来より、複製に不可欠なアデノウイルス遺伝子のどれも失っていない。複製可能なアデノウイルスの１つのタイプは特定の細胞において選択的に複製する。例えば、特定の細胞タイプにおいて優先的に複製する（従って、特定の細胞タイプを破壊する）非常に多数の様々な細胞特異的および組織特異的な複製可能アデノウイルスベクターが記載されている。細胞特異的な複製可能ウイルスを構築する１つの方法は、不可欠なアデノウイルスコード配列との機能的な連結で異種の転写調節エレメント（ＴＲＥ）を設置することである。別の方法は、欠失または不活性化されたとき、特定の細胞タイプ（例えば、腫瘍細胞）におけるウイルスの優先的な複製をもたらすアデノウイルスコード配列を欠失または不活性化することである。

アデノウイルスベクターはそのゲノムのサイズによる制限を受ける（非特許文献１）。このことにより、ベクターに挿入することができる異種ＤＮＡの量が制限され、従って、アデノウイルスのゲノムに組み込まれ得る異種のコード配列の量および／または長さが制限される。従って、複製欠陥ウイルスは非常に長い異種ＤＮＡの挿入が可能であり、しかし、アデノウイルスのゲノムＤＮＡのサイズおよび欠失されたアデノウイルスＤＮＡの量による制限を依然として受ける。

複製可能ウイルスの場合、複製可能ウイルスは、アデノウイルスのコード配列の大部分を含有するためだけでなく、異種ＤＮＡのための挿入部位の数でもまた制限されるために制限を受ける。従来、ＤＮＡの異種への挿入は、複製可能なウイルスにおいてアデノウイルスのＥ３コード配列（１つまたは複数）に代わって挿入されている（特許文献１、特許文献２）。このことは、異種へのＤＮＡ挿入のサイズをＥ３欠失のサイズよりもわずかに大きいサイズに制限する。また、特定の適用のためには、Ｅ３コード配列（１つまたは複数）を欠失すること、または、異種のＤＮＡをＥ３領域に挿入することは所望されないか、または好都合でない場合がある。

アデノウイルスの感染は、ウイルスＤＮＡの複製によって分かれる初期段階および後期段階に分けられる。ウイルス遺伝子がウイルスＤＮＡの複製前（初期段階）および／またはウイルスＤＮＡの複製後（後期段階）に発現する。一般に、初期の遺伝子は、ウイルス増殖のために細胞を準備するタンパク質をコードし、後期のタンパク質はキャプシドタンパク質であるか、または、ビリオンのパッケージングおよび組み立てに関与する。導入遺伝子を発現させるために広範囲に使用されている１つの方法は、発現が構成的であり、かつ、ウイルス自身によって調節されないような方法で発現カセットをウイルスゲノムに挿入することである。そのような場合、典型的には、導入遺伝子は非必須遺伝子に代わって挿入されるか、または、不可欠な遺伝子に代わって挿入され、この場合には、その不可欠な遺伝子が、ウイルスベクターの増殖のために使用される細胞株によって相補される。

アデノウイルスにおいて、後期の転写は、ＤＮＡ複製が開始された後、主に主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から開始される。その後の様々な時点で、ＭＬＰからの転写がＲＮＡ合成全体の約３０％を占める。すべてのアデノウイルスにおいて、ＭＬＰから開始された一次転写物は約２８ｋｂにわたって右方向に拡がり、ウイルスゲノムにおける９９マップ単位に近い位置で停止する。それぞれの領域がそれ自身のポリアデニル化シグナル配列により特徴づけられ、通常、数個の異なってスプライシングされたメッセージからなる。一次転写物は切断され、ゲノムに沿った５つの場所のうちの１つでポリアデニル化され、これにより、それぞれが３’の共終端を有する５つのｍＲＮＡファミリー（Ｌ１〜Ｌ５）が生じる。３’末端の選択後、一次転写物は、それぞれの成熟ＲＮＡが、１６．８マップ単位、１９．８マップ単位および２６．９マップ単位に由来する三成分リーダー（ＴＰＬ）配列と呼ばれる３つの短い５’リーダーセグメントの共通した１組を得るような方法でのスプライシングによってプロセシングされる。５つのファミリーのそれぞれが、一部のアデノウイルス血清型でのＬ５を除いて、２つ以上のタンパク質を発現する。Ａｄ４０およびＡｄ４１は２つ以上のタンパク質をＬ５領域から発現する。ファミリー内のｍＲＮＡは、三成分リーダーが、ゲノムの後期領域におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流側に位置するスプライスアクセプター部位にスプライシングされる位置によって互いに異なる。例えば、４つのタイプのｍＲＮＡがＬ２領域から産生され、すべてが共通の３’末端を有する。これらのメッセージはポリシストロン性であるが、５’末端に存在するＯＲＦのみが生来的なＡｄ転写物で翻訳されると考えられる。Ｆｕｅｒｅｒら（非特許文献２）は、少なくとも２つの方法を使用してシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）についてのコード配列を複製可能ウイルスに挿入することを記載する。１つの方法は、Ｌ５転写物を二シストロンｍＲＮＡに変換するために、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用に依存する。Ｆｕｅｒｅｒらはまた、ＣＤカセットを主要後期転写物の三成分リーダーエキソンにスプライシングするために、Ａｄ４１の長繊維遺伝子に由来するスプライスアクセプター部位配列を使用する方法を記載する。
国際公開第０２／０６７８６１号パンフレット 国際公開第０１／０２５４０号パンフレット Ｂｅｔｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１９９３年、第６７巻、ｐ．５９１１−５９２１ Ｆｕｅｒｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００４年、第１１巻、ｐ．１４２−１５１

（発明の要旨）
本発明は、アデノウイルス（Ａｄ）のゲノムを遺伝子送達ビヒクルおよび／または遺伝子発現ビヒクルとして使用する新規な遺伝子送達システムに関連する。アデノウイルスのゲノムは複製可能または複製不能（欠陥）のいずれかであり得る。

本発明は、導入遺伝子が、生来的なアデノウイルスプロセシングを生かし、かつ／または、生来的なアデノウイルスプロセシングを利用するために効果的な場所および様式で、大きな調節配列（例えば、プロモーターなど）を加える必要性がなく、異種のＤＮＡ（導入遺伝子）をＡｄゲノムに挿入することを可能にする様々な場所（例えば、存在する遺伝子の上流側または下流側）においてアデノウイルスゲノムに挿入されるアデノウイルスベクターを提供する。

本発明のいくつかの態様では、転写シグナル（例えば、分岐点部位、スプライスアクセプター部位、ＩＲＥＳ、自己プロセシング切断部位および／またはポリＡシグナル）が本発明のアデノウイルスベクターに加えられる。プロセシングシグナル（例えば、分岐点部位など）を有する遺伝子をスプライスアクセプター配列と一緒に加えることにより、生来的なアデノウイルスによって利用されるｍＲＮＡプロセシングシステムおよび発現システムが生かされる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、存在する（生来的な）転写調節エレメントおよび／または翻訳調節エレメントを１つまたは複数の導入遺伝子の発現のために使用することに依存する組換えアデノウイルスベクターを提供する。１つの例において、主要後期プロモーターが、１つまたは複数の導入遺伝子を後期領域に挿入することによって導入遺伝子を感染の後期段階の期間中に発現させるために使用される。別の例では、この方法は、導入遺伝子をアデノウイルスの初期領域に挿入するために使用される。導入遺伝子は、不可欠なアデノウイルス遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および生来的なアデノウイルスのプロセシングシグナル（例えば、内因性のポリアデニル化シグナルおよび転写シグナルなど）が乱されず、かつ、ウイルスが効果的に複製することができる限り、任意の内因性のアデノウイルスプロモーターとの機能的な連結で挿入することができる。

導入遺伝子に加えて、分岐点、スプライスアクセプター部位または他の類似する配列を、転写物の正しいプロセシングを可能にするために本発明のアデノウイルスベクターに含めることができる。導入遺伝子の発現の量および速度論を、所望の速度論が得られるようにプロセシングシグナルの特定の配列を変化させることによって操作することができる（例えば、スプライシング効率、翻訳開始効率またはシグナルの効率など）。多数の導入遺伝子を、ゲノムの同じ領域または異なる領域のいずれかで、同じベクターに含めることができる。他の内因性のアデノウイルス遺伝子を、所望の効果を達成するために、または、外因性ＤＮＡのより長い配列を含むことを可能にするために欠失することができる。

１つの態様において、本発明はアデノウイルスベクターに「転写シグナルを戻す」。「転写シグナルを戻す」ことによって、生来的でない転写シグナルが、類似する機能を行わせるために、または、生来的な転写シグナルの様式と類似する様式で転写に影響を及ぼすために使用されることが意味される。例えば、Ｌ５領域において、繊維の停止コドンがＬ５のポリＡシグナルの中に埋め込まれる。繊維コード領域の下流側での導入遺伝子の挿入は通常、生来的なＬ５ポリＡ部位の機能を破壊する変異を含み、しかし、繊維の停止コドンを維持する。従って、ポリＡ部位をＬ５メッセージの正しいプロセシングのために元に戻さなければならない。このことは、ポリＡシグナルをＬ５領域に加えることを必然的に伴う。このポリＡシグナルは、破壊された配列と同じ配列であってもよく、あるいは、非生来的なポリＡシグナルまたは異種のポリＡシグナルであってもよい。導入遺伝子が繊維のコード領域の下流側に挿入される例示的な実施形態において、ポリＡシグナルは導入遺伝子のコード領域の下流側に挿入される。導入遺伝子が既存のアデノウイルスコード配列の間に挿入される本発明の異なる実施形態では、さらなるスプライスアクセプター部位の復活／付加が典型的には用いられる。例えば、導入遺伝子は、導入遺伝子コード配列の下流側の次のアデノウイルスコード配列のための生来的なスプライス部位であったと考えられるアデノウイルスの生来的なスプライス部位を使用することができる。この場合、スプライス部位は、導入遺伝子コード配列の下流側の次のアデノウイルスコード配列のために復活されなければならない。この「復活された」スプライス部位は、導入遺伝子配列の上流側でのスプライシングのために今回利用される生来的な配列と同じ配列にすることができ、または、異種のスプライス部位にすることができる。種々のスプライス部位が、異なるスプライス効率を有することがこの分野では知られている。従って、当業者は、特定の適用のために所望されるような種々の効率を有するスプライス部位を選ぶことができる。

本発明によって提供される利点は幾通りかである。すなわち、ａ）存在する発現シグナルを利用することにより、より大きなサイズの導入遺伝子を、サイズが制限されたベクターに組み込むことができる；ｂ）アデノウイルス遺伝子の既知の発現パターンまたは予測可能な発現パターンにより、発現が導入遺伝子の性質に依存して細かく調節される所望する導入遺伝子発現速度論（例えば、発現レベルおよび発現時期など）を有するアデノウイルスベクターの設計が可能になる；ｃ）本発明のアデノウイルスベクターでは、アデノウイルスゲノム内の所定位置に既に存在する生来的な調節システムが生かされる；ｄ）本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の発現のために典型的に使用される他のエレメントと比較して小さい導入された調節配列（例えば、自己プロセシング切断部位、分岐点配列およびスプライスアクセプター配列など）を含む；および、ｅ）異種の転写因子の選択を、発現をさらに調節するために使用することができる。本明細書中においてさらに記載されるように、導入遺伝子の候補となり得る数多くの導入遺伝子および／または導入遺伝子カテゴリーが存在する。

本発明の実施では、別途示されない限り、この技術分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の様々な従来の技術が用いられる。そのような技術が、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”ｓｅｃａｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９１）などの文献に詳しく説明されている。

（定義）
別途示されない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、当業者に対するのと同じ意味を有し、本発明の実施では、当業者の知識の範囲内である微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技術が用いられる。

「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」および「ビリオン」の用語は交換可能に使用され、かつ、例えば、本発明のウイルスベクターが感染性粒子の作製のために適切な細胞または細胞株に形質導入されたときに形成される感染性のウイルス粒子を意味するとして広く理解される。本発明によるウイルス粒子は、ＤＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで細胞に移すために利用することができる。本発明の目的のために、これらの用語は、本発明のアデノウイルスベクターがアデノウイルスキャプシドに包まれるときに形成される組換えアデノウイルスを含めて、様々なアデノウイルスを示す。

「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルスのベクター」（これらは交換可能に使用される）は、本明細書中で示されるとき、複製可能または複製不能（欠陥）であるポリヌクレオチド構築物である。

本発明の例示的なアデノウイルスベクターには、ＤＮＡ、アデノウイルスのコートに包まれたＤＮＡ、別のウイルス形態またはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスおよびＡＡＶなど）にパッケージングされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームに包まれたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリシンと複合体化されたアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合体化されたアデノウイルスＤＮＡ、トランスフェリンとコンジュゲート化されたアデノウイルスＤＮＡ、あるいは、抗原性を免疫学的に「遮蔽」するために、かつ／または、半減期を増大させるためにＰＥＧなどの化合物と複合体化されたアデノウイルスＤＮＡ、非ウイルスタンパク質とコンジュゲート化されたアデノウイルスＤＮＡが含まれる。従って、本明細書中で使用される用語「アデノウイルスウイルス」または用語「アデノウイルスのベクター」はアデノウイルスまたはアデノウイルス粒子を包含する。

用語「ポリヌクレオチド」および用語「核酸」は本明細書中では交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであっても任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を示す。これらの用語には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン塩基およびピリミジン塩基、または、他の天然ヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾された非天然型ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。好ましくは、本発明のベクターはＤＮＡを含む。本明細書中で使用される「ＤＮＡ」は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの塩基を含むだけでなく、それらのアナログまたはこれらの塩基の修飾された形態のいずれか、例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間修飾体（例えば、非荷電連結およびチオアートなど）、糖アナログの使用、ならびに、修飾された骨格構造および／または代替の骨格構造（例えば、ポリアミドなど）などをも含む。

下記はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなど）、ウラシル、他の糖および連結基（例えば、フルオロリボースおよびチオアートなど）、ならびに、ヌクレオチド分枝物を含むことができる。ヌクレオチドの配列はヌクレオチド以外の成分によって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば、標識化成分とのコンジュゲート化などによってさらに修飾される場合がある。この定義に含まれる他のタイプの修飾には、キャップ、アナログによる天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の置換、および、タンパク質、金属イオン、標識化成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体にポリヌクレオチドを結合するための手段の導入がある。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される「ＤＮＡ」は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの塩基を含むだけでなく、それらのアナログまたはこれらの塩基の修飾された形態のいずれか、例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間修飾体（例えば、非荷電連結およびチオアートなど）、糖アナログの使用、ならびに、修飾された骨格構造および／または代替の骨格構造（例えば、ポリアミドなど）などをも含む。核酸配列は、別の核酸配列との機能的な関係性に置かれているとき、「機能的に連結される」か、または「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター配列または調節ＤＮＡ配列は、プロモーター配列または調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列または構造的ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすようにこれら２つの配列が置かれたならば、ＲＮＡおよび／またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「機能的に連結される」か、または「作動可能に連結される」と言われる。機能的に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が一般には連続しており、また、２つのタンパク質コード領域をつなぐために必要な場合には、連続し、かつ、同じ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは一般には、プロモーターから数キロ塩基ほど離れたときに機能し、イントロン配列は長さが一定していない場合があり、一部のポリヌクレオチドエレメントは機能的に連結され得るが、連続していない場合がある。

本明細書中で使用される用語「コード領域」は、コード配列を含有する核酸の領域を示す。コード領域は、イントロンを含む対応する遺伝子に由来する他の領域を含有する場合がある。用語「コード配列」（ＣＤＳ）は、タンパク質をコードするコドンを含有する核酸配列を示す。コード配列は一般に、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）により始まり、翻訳停止コドンにより終わる。コード配列の上流側であると言われる配列は、翻訳開始コドンに対して５’側であり、ＣＤＳの下流側の配列は翻訳停止コドンの３’側である。

用語「ＯＲＦ」はオープンリーディングフレームを意味する。

用語「遺伝子」は、ゲノム内に位置する規定された領域であって、前記のコード配列に加えて、発現（すなわち、コード部分の転写および翻訳）の制御に関わる他の、主に調節核酸配列を含む領域を示す。遺伝子はまた、他の５’非翻訳配列および３’非翻訳配列ならびに終結配列を含む場合がある。遺伝子の供給源に依存して、存在し得るさらなるエレメントには、例えば、イントロンがある。

用語「異種」および用語「外因的」は、プロモーターおよび遺伝子コード配列などの核酸分子に関して本明細書中で使用される場合、特定のウイルスまたは宿主細胞に対して外来的（非生来的）な供給源に由来する配列を示すか、あるいは、同じ供給源に由来するならば、その元の形態から改変される配列を示す。従って、ウイルスまたは細胞における異種の遺伝子には、特定のウイルスまたは細胞に対して内因的であるが、例えば、コドン最適化によって改変されている遺伝子が含まれる。これらの用語にはまた、天然に存在する核酸配列の天然に存在しない多数のコピー体も含まれる。従って、これらの用語は、ウイルスまたは細胞に対して外来的または異種である核酸セグメント、すなわち、核酸セグメントが通常的には見出されない宿主ウイルスゲノムまたは宿主細胞ゲノムにおける位置を除いてウイルスまたは細胞に対して同族的である核酸セグメントを示す。

用語「生来的」は、野生型のウイルスまたは細胞のゲノムに存在する遺伝子を示す。

用語「天然に存在する」または用語「野生型」は、人間によって人為的に作製されていることとは異なるとして自然界において見出すことができる対象物を記述するために使用される。例えば、生物（ウイルスを含む）において存在するタンパク質またはヌクレオチド配列で、自然界の供給源から単離することができ、かつ、実験室において人間によって意図的に改変されていない配列は天然に存在する。

用語「相補体」および用語「相補的」は、相補的な塩基残基の間での水素結合が逆平行のヌクレオチド配列において形成されるときに互いに対形成することができる逆平行のヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を示す。核酸分子に関して本明細書中で使用される用語「組換え」は、組換えＤＮＡ技術を使用して子孫核酸分子に一緒になっている核酸分子の組合せを示す。ウイルス、細胞および生物に関して本明細書中で使用される場合、「組換え」、「形質転換（された）」および「トランスジェニック」の用語は、異種の核酸分子が導入されている宿主ウイルス、宿主細胞または宿主生物を示す。核酸分子は宿主のゲノムに安定に組み込まれ得るか、または、核酸分子はまた、染色体外分子として存在し得る。そのような染色体外分子は自己複製性であり得る。組換えウイルス、組換え細胞および組換え生物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、その組換え子孫をも包含することが理解される。「非形質転換（の）」、「非トランスジェニック」または「非組み換え」宿主は、異種の核酸分子を含有しない野生型のウイルス、細胞または生物を示す。

「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現を制御することに関与する配列である。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが含まれる。調節エレメントはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために要求される配列を包含する。

用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位を含有し、かつ、ＤＮＡの転写を開始させる、コード領域の上流側に通常の場合には位置する非翻訳ＤＮＡ配列を示す。プロモーター領域にはまた、遺伝子発現の調節因子として作用する他のエレメントが含まれる場合がある。用語「最小プロモーター」は、上流側の活性化エレメントの非存在下では不活性であるか、または、非常に低下したプロモーター活性を有するプロモーターエレメント（特に、ＴＡＴＡエレメント）を示す。

用語「エンハンサー」は、本発明の意味することの範囲内では、任意の遺伝子エレメント（例えば、コード配列に機能的に連結されたとき、プロモーターに機能的に連結されたコード配列の転写を、プロモーターそのものによって達成される転写活性化よりも大きな程度に増大させるヌクレオチド配列）であり得る。すなわち、エンハンサーはプロモーターからの転写を増大させる。

「キメラなアデノウイルス領域」は、生来的なアデノウイルスゲノムの部分と、異種ＤＮＡ配列の部分との両方を含有するアデノウイルスベクターの一部分として定義される。例えば、「キメラなアデノウイルスリーダー領域」は、生来的なアデノウイルスリーダー領域（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５など）の部分を少なくとも含み、かつ、異種のＤＮＡ配列をさらに含み。１つの実施形態において、異種ＤＮＡ配列は導入遺伝子のＣＤＳを含む。別の実施形態において、異種ＤＮＡ配列は、導入遺伝子のＣＤＳ、分岐部位およびスプライスアクセプター部位を含む。

用語「転写調節エレメント」および用語「翻訳調節エレメント」は、核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼすそのようなエレメントである。これらのエレメントには、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、翻訳停止コドンおよび翻訳開始コドン、ならびにポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される「転写応答エレメント」または「転写調節エレメント」または「ＴＲＥ」は、機能的に連結されたポリヌクレオチドの転写を、ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞において増大させる１つまたは複数のエンハンサーおよび／またはプロモーターおよび／またはプロモーターエレメント（例えば、転写調節タンパク質応答配列など）を含むポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。

「転写制御下」は、この分野では十分に理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列（通常、ＤＮＡ配列）の転写が、転写の開始に寄与するエレメント、または、転写を促進するエレメントに作動可能にポリヌクレオチド配列が連結されていることに依存することを意味する。

本明細書中で使用される用語「ベクター」は、異なる宿主細胞の間での移送のために設計された核酸構築物を示す。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計されている「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計されている「発現ベクター」、または、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子を生成させるために設計されている「ウイルスベクター」、あるいは、２つ以上のタイプのベクターの属性を含む「シャトルベクター」である場合がある。遺伝子導入において使用されるベクターはどれも基本的には、所望する配列を有するＤＮＡが導入されることになる「ベクター」として使用することができる。プラスミドベクターは、本発明を実施することにおいて用途が見出される。用語ベクターは、この用語が本発明に適用される場合、組換えベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（複製欠陥ウイルスまたは複製可能ウイルスを含む））を記述するために使用される。用語「ベクター」、用語「ポリヌクレオチドベクター」、用語「ポリヌクレオチドベクター構築物」および用語「核酸ベクター構築物」は、当業者によって理解されるように、遺伝子移入のための任意の核酸構築物を意味するために本明細書中では交換可能に使用される。

本発明のウイルスベクターに関して本明細書中で使用される用語「複製欠陥」は、ウイルスベクターがそのゲノムをさらに複製およびパッケージングすることができないことを意味する。例えば、対象の細胞に、Ｅ１コード領域全体およびＥ４コード領域が欠失または不活性化されているアデノウイルスが感染するとき、導入遺伝子が細胞において転写活性であるならば、異種の導入遺伝子が患者の細胞において発現される。しかしながら、患者の細胞はＡｄのＥ１コード配列およびＥ４コード配列を有しないという事実のために、そのようなＡｄベクターは複製欠陥であり、ウイルス粒子がこれらの細胞では形成され得ない。

用語「複製可能」は、ベクターが特定の細胞タイプ（「標的細胞」、例えば、ガン細胞）において複製することができ、かつ、そのような細胞の細胞溶解を優先的に行うことができることを意味する。ガン細胞における選択的な複製により、そのような細胞を優先的に破壊する具体的な複製可能ウイルスベクターが開発されている。ある種の細胞タイプにおいて優先的に複製する（従って、ある種の細胞タイプを破壊する）様々な細胞特異的な複製可能アデノウイルス構築物が開発されている。そのようなウイルスベクターは「腫瘍崩壊性ウイルス」または「腫瘍崩壊性ベクター」と呼ぶことができ、「細胞溶解性」または「細胞傷害性」であると見なすことができ、また、標的細胞の「選択的な細胞溶解」を行うと見なすことができる。「複製可能」ウイルスベクターまたは「腫瘍崩壊性」ウイルスベクターの様々な例が、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３９４６６、同ＷＯ９５／１９４３４、同ＷＯ９７／０１３５８、同ＷＯ９８／３９４６７、同ＷＯ９８／３９４６５、同ＷＯ０１／７２９９４、同ＷＯ０４／００９７９０、同ＷＯ００／１５８２０、同ＷＯ９８／１４５９３、同ＷＯ００／４６３５５、同ＷＯ０２／０６７８６１、同ＷＯ９８／３９４６４、同ＷＯ９８／１３５０８、同ＷＯ２００４／００９７９０；米国仮特許出願第６０／５１１，８１２号、同第６０／４２３，２０３号および米国特許出願公開第２００１／００５３３５２号に記載される（これらはそれぞれが参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

用語「複製条件的ウイルス」、用語「優先的に複製するウイルス」、用語「特異的に複製するウイルス」および用語「選択的に複製するウイルス」は、交換可能に使用される用語であり、ある種のタイプの細胞または組織において優先的に複製し、しかし、他のタイプではより低い程度に複製するか、または、全く複製しない複製可能なウイルスベクターおよびウイルス粒子である。本発明の１つの実施形態において、ウイルスベクターおよび／またはウイルス粒子は腫瘍細胞および／または異常に増殖している組織（例えば、充実性腫瘍および他の新生物など）において選択的に複製する。そのようなウイルスは「腫瘍崩壊性ウイルス」または「腫瘍崩壊性ベクター」と呼ぶことができ、「細胞溶解性」または「細胞傷害性」であると見なすことができ、また、標的細胞の「選択的な細胞溶解」を行うと見なすことができる。「優先的複製」および「選択的複製」および「特異的複製」は交換可能に使用され、ウイルスが、非標的細胞よりも標的細胞において多く複製することを意味する。ウイルスは、非標的細胞よりも標的細胞において大きい速度で、例えば、少なくとも約３倍大きい速度で、少なくとも約１０倍大きい速度で、少なくとも約５０倍大きい速度で、また、場合により、少なくとも約１００倍大きい速度で、少なくとも約４００倍大きい速度で、少なくとも約５００倍大きい速度で、少なくとも約１０００倍大きい速度で、または、１ｘ１０^６倍大きい速度で複製する。１つの実施形態において、ウイルスは標的細胞においてだけ複製する（すなわち、非標的細胞では、全く複製しないか、または、非常に低いレベルで複製する）。

本明細書中で使用される用語「プラスミド」は、染色体外で、または宿主細胞染色体の一部としてのいずれかであっても、宿主細胞内での自律的複製が可能であるＤＮＡ分子を示す。本明細書中における出発プラスミドは市販されており、また、規制を受けることなく公的機関から入手可能であり、あるいは、本明細書中に開示されるように、かつ／または、発表された手法に従ってそのような入手可能なプラスミドから構築することができる。いくつかの場合においては、当業者には明らかであるように、この分野で知られている他のプラスミドを本明細書中に記載されるプラスミドと交換可能に使用することができる。

用語「発現」は、内因性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の細胞における転写および／または翻訳を示す。

「ポリアデニル化シグナル配列」は、ポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが続く、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断のための認識領域である。ポリアデニル化シグナル配列は、「ポリＡ部位」、すなわち、アデニン残基が転写後のポリアデニル化によって付加されるＲＮＡ転写物における部位を提供する。一般に、ポリアデニル化シグナル配列には、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントからなるコアポリ（Ａ）シグナルが含まれる（例えば、ＷＯ０２／０６７８６１およびＷＯ０２／０６８６２７の図１）。好適なポリアデニル化シグナル配列の選択では、ポリアデニル化プロセスの完了がポリ（Ａ）部位の強さと相関するので（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１９：５５８８−５６００）、ポリアデニル化シグナル配列の強さが考慮される。例えば、強いＳＶ４０後期ポリ（Ａ）部位は、より弱いＳＶ４０初期ポリ（Ａ）部位よりも迅速に切断を果たす。当業者は、所望する場合、より強いポリアデニル化シグナル配列を選ぶことを検討する。原理的には、任意のポリアデニル化シグナル配列が本発明の目的のために有用であり得る。しかしながら、本発明の一部の実施形態では、終結シグナル配列がＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列またはＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列である。通常、終結シグナル配列はその遺伝子源から単離されるか、または、合成的に構築され、好適な位置において本発明のベクターに挿入される。

「多シストロン転写物」は、２つ以上のタンパク質コード領域（すなわち、シストロン）を含有するｍＲＮＡ分子を示す。２つのコード領域を含むｍＲＮＡは「二シストロン転写物」として示される。「５’近位側」のコード領域またはシストロンは、その翻訳開始コドン（通常、ＡＵＧ）が多シストロンｍＲＮＡ分子の５’末端に一番近いコード領域である。「５’遠位側」のコード領域またはシストロンは、その翻訳開始コドン（通常、ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に対して一番近い開始コドンでないコード領域である。用語「５’遠位側」および用語「下流側」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接していないコード領域を示すために同義的に使用される。

本明細書中で使用される「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン（例えば、ＡＴＧなど）に対する直接的な内部リボソーム進入を促進し、それにより、遺伝子のキャップ非依存的翻訳を生じさせるエレメントを示す（Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＪ，Ｈｏｗｅｌｌ ＭＴ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９０）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，１５（１２）：４７７−８３；Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＪ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９５）ＲＮＡ１（１０）：９８５−１０００）。本発明は、シストロンの開始コドンに対する直接的な内部リボソーム進入を促進することができる任意のＩＲＥＳエレメントの使用を包含する。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５５３６９は、合成配列を含むＩＲＥＳ配列の様々な例を記載しており、これらの配列もまた本発明に従って使用することができる。本明細書中で使用される「ＩＲＥＳの翻訳制御下」は、翻訳がＩＲＥＳに関連し、かつ、キャップ非依存的様式で進行することを意味する。この分野で知られている「ＩＲＥＳ」の例には、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ１５（１２）：４７７−４８３）；ならびに、ウイルスまたは細胞のｍＲＮＡ源から得ることができるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリンの重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、繊維芽細胞増殖因子２およびインスリン様増殖因子、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、酵母転写因子のＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４などから得ることができるＩＲＥＳが含まれるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などの種々のウイルスにおいても報告されている。本明細書中で使用される「ＩＲＥＳ」は、変化が、シストロンの開始コドンに対する直接的な内部リボソーム進入を促進することができる限り、ＩＲＥＳ配列の機能的な変化体を包含する。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは哺乳動物由来である。他の実施形態では、ＩＲＥＳはウイルス由来または原生動物由来である。１つの実施形態において、ＩＲＥＳを脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）から得ることができる（これはＮｏｖｏｇｅｎから市販されている；Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６６（３）：１６０２−１６０９）。本明細書中に開示される他の例示的な実施形態において、ＩＲＥＳはＶＥＧＦに由来する。ＩＲＥＳ配列の様々な例が米国特許第６，６９２，７３６号に記載される。

本明細書中で示される「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、翻訳されたとき、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断が生じて、異なった成熟タンパク質産物または成熟ポリペプチド産物の発現をもたらすＤＮＡ配列またはアミノ酸配列である。そのような「自己プロセシング切断部位」はまた、翻訳後プロセシング切断部位または翻訳時プロセシング切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメイン）と呼ばれる場合がある。２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインは、エステル連結の加水分解を促進するようにリボソームの活性を調節し、それにより、異なった下流側の翻訳産物の合成が進行することを可能にする様式でポリペプチドを翻訳複合体から放出することによって翻訳効果を明らかにする（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，２００１）。あるいは、２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインは、それ自身のＣ末端をシス作用で切断して、一次切断産物を生じさせることによって「自己タンパク質分解」または「切断」を明らかにする（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。

用語「スプライスアクセプター部位」または用語「３’スプライスアクセプター部位」（以降、３’ＳＡＳとして示される）は、野生型Ａｄ５ゲノムの種々の場所に操作して入れることができる配列である。この部位の導入は、アデノウイルスの内因性の選択的スプライシング機構を利用することによって異種のＤＮＡ範囲（すなわち、導入遺伝子）の発現を促進させるための手段を提供する。例示的な３’ＳＡＳ部位は、

（配列番号４５）であり、この配列において、下線部の塩基はコンセンサスな分岐部位（これは一定していない）であり、太字のＡは、高度に保存されている分岐点を示し、下向きの矢印は、（矢印の５’側（矢印より前方側）の配列が切断されて除かれ、矢印より後方の配列がエキソンの一部であるように）スプライス部位を示す。

用語「分岐点」および用語「分岐点配列」は交換可能に使用され、スプライシングに関与するヌクレオチド配列を示し、ラリアート形成部位のための認識シグナルであることがこの分野では理解されている。ＤＮＡベクターを示すとき、分岐点配列は、ＲＮＡ分岐点配列をコードするＤＮＡ配列である。

本明細書中で使用される「導入遺伝子」は、適切な条件のもとで非生来的な環境または異種の細胞において組換え技術によって発現させることができるポリヌクレオチドを示す。本発明では、導入遺伝子コード領域がウイルスベクターに挿入される。１つの実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。導入遺伝子は、導入遺伝子が発現させられる同じタイプの細胞に由来する場合があり、しかし、外部の供給源から導入され、対応する生来的な形態と比較して改変され、かつ／または、非生来的な部位から発現される場合があり、あるいは、導入遺伝子は異種の細胞に由来する場合がある。「導入遺伝子」は、「外因性遺伝子」、「外来遺伝子」、「異種のコード配列」および「異種の遺伝子」と同義である。本発明を実施する際に使用されるベクターに関連して、「異種のポリヌクレオチド」または「異種の遺伝子」または「導入遺伝子」は、対応する野生型のベクターまたはウイルスに存在しない任意のポリヌクレオチドまたは遺伝子である。導入遺伝子コード配列は、ある種のタンパク質をコードする自然界に見出される配列である場合がある。あるいは、導入遺伝子コード配列は非天然のコード配列である場合がある。例えば、当業者は、コドン使用表を使用してある種の生物種における発現についてコドンを最適化するためにコード配列を容易に再コード化することができる。１つの実施形態において、再コード化された配列は依然として、導入遺伝子についての天然のコード配列と同じアミノ酸配列をコードする。本発明のベクターに含まれる好ましい導入遺伝子の様々な例が本明細書中に提供される。導入遺伝子は治療的遺伝子である場合がある。導入遺伝子は必ずしもタンパク質をコードしない。

本明細書中で使用される「治療的」遺伝子は、発現したとき、有益な作用を、その遺伝子が発現させられる細胞、組織または哺乳動物に与える導入遺伝子を示す。有益な作用の例には、状態または疾患の徴候または症状の改善、状態または疾患の防止または阻害、あるいは、所望する特性の付与が含まれる。治療的遺伝子の数多くの例がこの分野では知られており、その多数が下記においてさらに記載される。

本発明を実施する際に使用されるベクターに関連して、「異種の」配列またはエレメントは、対応する野生型のベクターまたはウイルスと関連しない配列またはエレメント、あるいは、対応する野生型のベクターまたはウイルスに由来しない配列またはエレメントである。

本発明を実施する際に使用されるベクターに関連して、「内因性の」配列またはエレメントは、対応する野生型のベクターまたはウイルスに対して生来的であるか、あるいは、対応する野生型のベクターまたはウイルスに由来する。

「複製」および「繁殖」は交換可能に使用され、本発明のウイルスベクターが再生産または増殖することができることを示す。これらの用語はこの分野では十分に理解されている。本発明の目的のために、複製はウイルスタンパク質の産生を伴い、一般には、ウイルスの再生産に関する。複製は、この分野において標準的であり、また、本明細書中に記載される様々なアッセイ（例えば、ウイルス産出アッセイ、バーストアッセイまたはプラークアッセイなど）を使用して測定することができる。「複製」および「繁殖」は、ウイルス製造のプロセスに直接的または間接的に関与する任意の活性を包含し、これには、ウイルス遺伝子の発現；ウイルスタンパク質の産生、核酸または他の構成成分の複製；完全なウイルスへのウイルス構成成分のパッケージング、および、細胞溶解が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される「パッケージング細胞」は、ウイルス粒子を産生するためにアデノウイルスゲノムまたは改変されたゲノムをパッケージすることができる細胞である。パッケージング細胞は、失われている遺伝子産物またはその同等物を提供することができる。従って、パッケージング細胞は、相補する機能をアデノウイルスゲノムにおいて欠失された遺伝子に与えることができ、アデノウイルスゲノムをアデノウイルス粒子にパッケージングすることができる。そのような粒子の産生では、ゲノムが複製されること、および、感染性ウイルスを組み立てるために必要なそのようなタンパク質が産生されることが要求される。粒子はまた、ウイルス粒子の成熟化のために必要なある種のタンパク質を必要とし得る。そのようなタンパク質がベクターまたはパッケージング細胞によって提供され得る。

ウイルスベクターのための「プロデューサー細胞」がこの分野で広く知られている。プロデューサー細胞は、アデノウイルスベクターが送達され、そのアデノウイルスベクターが複製され、かつ、ビリオンにパッケージングされる細胞である。ウイルスベクターが、欠失または不活性化された不可欠な遺伝子を有する場合、プロデューサー細胞はその不活性化された遺伝子を相補する。アデノウイルスベクターのプロデューサー細胞の例には、ＰｅｒＣ．６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８（Ｓｅｐ １）９（１３）：１９０１−１７）および２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９７７（Ｊｕｌ）；３６（１）：５９−７４）がある。選択的に複製するウイルスの場合、プロデューサー細胞は、ウイルスが選択的に複製する細胞タイプであり得る。あるいは、または、加えて、プロデューサー細胞は、ウイルスベクターにおいて選択的に抑制または不活性化される遺伝子を発現することができる。

用語「ＨｅＬａ−Ｓ３」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能であり、かつ、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２．２として指定されるヒト子宮頸部腫瘍由来の細胞株を意味する。ＨｅＬａ−Ｓ３は親ＨｅＬａ株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）のクローン誘導体である。ＨｅＬａ−Ｓ３は１９５５年にＴ．Ｔ．Ｐｕｃｋ他（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０３：２７３−２８４（１９５６））によってクローン化された。

「個体」は、脊椎動物、哺乳動物またはヒトである。哺乳動物には、家畜、競技動物、齧歯類、霊長類およびペットが含まれるが、これらに限定されない。「宿主細胞」には、本発明のアデノウイルスベクターを受け入れることができるか、または、本発明のアデノウイルスベクターを受け入れている個体の細胞または細胞培養物である。宿主細胞には、１つの宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然、偶発的または意図的な変異および／または変化のために元の親細胞と（形態学またはＤＮＡ相補体全体において）完全に同一である必要は必ずしもなくてもよい。宿主細胞には、本発明のアデノウイルスベクターによるインビボまたはインビトロでのトランスフェクション細胞または感染細胞が含まれる。

本明細書中で使用される「細胞毒性」は、この分野では十分に理解されている用語であり、細胞の通常的な生化学活性または生物学的活性が損なわれる（すなわち、阻害される）状態を示す。これらの活性には、代謝；細胞複製；ＤＮＡ複製；転写；翻訳；様々な分子の取り込みが含まれるが、これらに限定されない。「細胞毒性」には、細胞死および／または細胞溶解が含まれる。細胞毒性を示す様々なアッセイがこの分野では知られている（例えば、色素排除、３Ｈ−チミジン取り込みおよびプラークアッセイなど）。

本明細書中で使用される用語「新生物細胞」、用語「新生物」、用語「腫瘍」、用語「腫瘍細胞」、用語「ガン腫」、用語「ガン腫細胞」、用語「ガン」および用語「ガン細胞」（これらは交換可能に使用される）は、比較的自律的な成長を示し、その結果、細胞増殖の制御の著しい喪失によって特徴づけられる異常な成長表現型を示す細胞を示す。新生物細胞は悪性または良性であり得る。

（アデノウイルスベクター）
本明細書中で使用される用語「アデノウイルス」および用語「アデノウイルス粒子」は、知られている群、亜群および血清型ならびに今後発見される群、亜群および血清型のすべてを含む、ヒトまたは動物に感染する任意のアデノウイルスを含めて、アデノウイルスとして分類され得るありとあらゆるウイルスを包含するために使用される。従って、本明細書中で使用される「アデノウイルス」（「Ａｄ」）および「アデノウイルス粒子」はウイルスそのものまたはその誘導体を示し、別途示される場合を除き、すべての血清型およびサブタイプ、ならびに、天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。そのようなアデノウイルスは野生型であり得るか、あるいは、この分野で知られている様々な方法、または、本明細書中に開示されるような様々な方法で改変され得る。そのような改変には、感染性粒子を作製するために粒子にパッケージングされるアデノウイルスゲノムに対する変化が含まれる。そのような改変にはまた、この分野で知られている欠失、例えば、複製のために不可欠なアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４のコード領域など）の１つまたは複数における欠失などが含まれる。用語「複製のために不可欠な遺伝子」は、ウイルスベクターが標的細胞において複製するためにその転写が要求される核酸配列を示す。例えば、本発明のアデノウイルスベクターにおいて、複製のために不可欠な遺伝子は、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ２ｂ遺伝子およびＥ４遺伝子からなる群から選択することができる。これらの用語にはまた、複製特異的アデノウイルス、すなわち、ある種のタイプの細胞または組織において優先的に複製し、しかし、他のタイプの細胞または組織ではより少ない程度に複製するか、または、全く複製しないウイルスが含まれる。そのようなウイルスは「細胞溶解性」または「細胞傷害性」のウイルス（またはベクター）と呼ばれることがあり、また、そのようなウイルスがそのような作用を新生物細胞に対して有するならば、「腫瘍崩壊性」のウイルス（またはベクター）と呼ばれる。

本発明の例示的なアデノウイルスベクターには、ＤＮＡ、アデノウイルスのコートで包まれたＤＮＡ、他のウイルス形態またはウイルス様形態（単純ヘルペスおよびＡＡＶなど）にパッケージングされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームで包まれたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリシンと複合体形成したアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体形成したアデノウイルスＤＮＡ、トランスフェリンとコンジュゲート化されたアデノウイルスＤＮＡ、あるいは、抗原性を免疫学的に「遮蔽」し、かつ／または、半減期を増大させるために、ＰＥＧなどの化合物と複合体形成したアデノウイルスＤＮＡ、あるいは、非ウイルスタンパク質にコンジュゲート化されたアデノウイルスＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

アデノウイルスベクターに関連して、用語「５’」は「上流側」と交換可能に使用され、左側の逆方向末端反復（ＩＴＲ）の方向であることを意味する。アデノウイルスベクターに関連して、用語「３’」は「下流側」と交換可能に使用され、右側ＩＴＲの方向であることを意味する。

挿入された配列を発現させるためにアデノウイルスベクターを作製するための様々な標準的なシステムがこの分野で知られており、商業的供給元から入手することができる：例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から得られるＡｄｅｎｏ−Ｘ発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００２年１月）、１０頁〜１２頁）。

本発明のアデノウイルスベクターには、複製欠陥ベクターおよび複製可能ベクターが含まれる。複製欠陥ベクターは標的細胞において複製しないか、または、標的細胞において非常に低いレベルで複製する。１つの実施形態において、複製欠陥ベクターは、通常的にはコード領域の一部またはすべてを欠失または変異することによって、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂまたはＥ４における少なくとも１つの領域が不活性化されている。このようなベクターを増殖させるための様々な方法がこの分野では広く知られている。

本発明では、本発明によるアデノウイルスベクターおよびウイルス粒子を構築するために、すべてのアデノウイルス血清型の使用が意図される。本発明に従って用いることができるアデノウイルスストック物には、任意のアデノウイルス血清型が含まれる。アデノウイルスの血清型１〜血清型４７が現在、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能であり、本発明では、任意の供給元から入手可能な任意の他の血清型のアデノウイルスが含まれる。本発明に従って用いることができるアデノウイルスはヒト起源またはヒト以外の起源のものであり得る。例えば、アデノウイルスは、Ａ亜群（例えば、１２、１８、３１の各血清型）、Ｂ亜群（例えば、３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５の各血清型）、Ｃ亜群（例えば、１、２、５、６の各血清型）、Ｄ亜群（例えば、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４７の各血清型）、Ｅ亜群（血清型４）、Ｆ亜群（４０、４１の各血清型）、または、任意の他のアデノウイルス血清型が可能である。本明細書中を通して、アデノウイルスのタイプ５において具体的なヌクレオチドが参照される。当業者には一般に得られる知識に基づいて、他の血清型における対応するヌクレオチドを決定することができ、従って、血清型５以外のアデノウイルス血清型における類似するアデノウイルスベクターを構築することができる。１つの好ましい実施形態において、アデノウイルス核酸骨格は、アデノウイルスの血清型２（Ａｄ２）、血清型５（Ａｄ５）または血清型３５（Ａｄ３５）に由来するか、あるいは、アデノウイルスの血清型２（Ａｄ２）または血清型５（Ａｄ５）の一部分とアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）の一部分との組合せを含むキメラなアデノウイルス骨格に由来する。

アデノウイルスの血清型２および血清型５のＤＮＡ配列およびタンパク質配列がＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセション番号ＮＣ＿００１４０５（Ａｄ２）および同ＡＹ３３９８６５（Ａｄ５）で見出され得る（これらはともにその全体が本明細書中に組み込まれる）。完全なゲノムＤＮＡ配列と一緒に、ＧｅｎＢａｎｋ登録では、有用な詳細情報、例えば、参考文献、スプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、ＴＡＴＡシグナル、イントロン、それぞれの特定された遺伝子についての開始コドンおよび停止コドンの存在位置、タンパク質配列、それぞれの遺伝子についてのｃＤＮＡ、ならびに、文献全体を通して存在する配列変化の一覧などが含まれる。また、本発明に関して特に注目されることには、それぞれの領域についてのｍＲＮＡ構造が、示されたスプライシング部位、および、それぞれの遺伝子または領域についてのポリアデニル化切断部位、ならびに、これらのＧｅｎＢａｎｋ記録における関連した刊行物の参考文献一覧から推定できる。

下記の参考文献は、アデノウイルスの遺伝子の存在位置、遺伝子のスプライシング、転写エレメント（例えば、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル配列）の存在位置の詳細情報を提供する：Ｎｅｖｉｎｓ ａｎｄ Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ，Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９８１；２６：１−３５；Ａｋｕｓｊａｒｖｉ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｉｎ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２７２：２５３−８６（２００３）；Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９９４ １４：４６８２−４６９３；Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９５Ｊ Ｖｉｒｏｌ６９：７３２４−７３２７；Ｎｅｖｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８１Ｍａｒ ｌ２；２９０（５８０２）：１１３−８；Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６７：８１７５；１９９２；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ａｎｄ Ａｋｕｓｊａｒｖｉ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２２５：２８７；１９９２；Ｆａｒｌｅｙ，Ｂｒｏｗｎ， ａｎｄ Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７８：１７８２；２００４。アデノウイルスはそのゲノムの両方の鎖（上側および下側）に様々な遺伝子および遺伝子のためのプロセシングシグナルをコードする。

何らかの変化体を作製するときには、望ましくない変化が相補鎖に存在しないように配慮される。また、場合により、導入遺伝子は比較的小さく、従って、多数の導入遺伝子が潜在的には、１つのアデノウイルスベクターゲノムに挿入され得る。両方のＤＮＡ鎖における不可欠な遺伝子およびプロセシングシグナルが無傷に保たれる限り、導入遺伝子は本質的にはＡｄ遺伝子間のどこにでも挿入することができる。あるいは、一部の状況では、ウイルス遺伝子の発現を変化させて、ベクターの目的に合わせるために、既存の遺伝子および／またはシグナルを変化させることが望ましい場合がある。また、分岐点およびスプライスアクセプター部位または他のプロセシングシグナルを、新しいＣＤＳについての新しく導入されたｍＲＮＡの適正なプロセシングのために導入遺伝子と一緒に加えることが必要である場合もある。

１つの好ましい態様において、アデノウイルスベクターは複製可能または複製条件的である。そのようなベクターは標的細胞において複製することができる。複製可能ウイルスには、野生型ウイルス、および、標的細胞において複製するように操作されたウイルスが含まれる。これらには、他のタイプの標的細胞と比較して、１つのタイプの標的細胞において特異的または優先的に複製するように設計されたベクターが含まれる。標的細胞は、ある種の細胞タイプまたは組織タイプの細胞が可能であるか、あるいは、ある種の細胞状態を有する。複製が細胞タイプまたは組織タイプまたは細胞状態に依存する複製可能なアデノウイルスベクターが下記においてさらに記載される。

１つの実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、選択的な複製をアデノウイルスにもたらす異種の転写調節エレメント（ＴＲＥ）の転写制御下での複製のために不可欠な１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子を含む。複製のために不可欠なアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂおよびＥ４からなる群から選択される初期遺伝子である。さらなる実施形態において、１つまたは複数のさらなるＴＲＥが、複製のために不可欠な１つまたは複数のさらなるアデノウイルス遺伝子に、あるいは、導入遺伝子（例えば、治療的遺伝子）に機能的に連結される。

アデノウイルスのＥ１Ｂの１９ｋＤａ領域は、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ産物をコードするアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子のゲノム領域を示す。野生型Ａｄ５によれば、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域は、ヌクレオチド（ｎｔ）１７１４とｎｔ２２４４との間に位置する２６１ｂｐの領域である。Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域は、例えば、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７７４２−７７４６に記載されている。１つの実施形態において、本発明は、欠失または変異が、Ｅ１Ｂ−１９ｋＤａに関連したアポトーシスの阻害を弱めるか、または除去しない限り、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が変異される実施形態と同様に、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域の一部またはすべての欠失を包含する。

本発明の１つの実施形態において、アデノウイルスベクターはガン腫の標的細胞において優先的に複製する。この場合、複製の優先は、ガン腫の標的細胞における複製レベル（例えば、細胞溶解または細胞殺傷および／または力価）を、非標的の非ガン腫細胞、正常な細胞またはコントロール細胞における複製レベルと比較することによって示される。標的細胞における特定のアデノウイルスの力価を非標的（または「ＴＲＥ」不活性細胞）におけるアデノウイルスの力価と比較することにより、複製の優先が標的細胞において強化され、かつ／または、非標的細胞において抑制されることが示される。

アデノウイルスウイルスは１つまたは複数の異種のＴＲＥをさらに含むことができ、この場合、これらのＴＲＥは同じ遺伝子に機能的に連結されてもよく、または、機能的に連結されなくてもよい。例えば、細胞タイプ特異的ＴＲＥ、細胞状態特異的ＴＲＥまたは組織タイプ特異的ＴＲＥ（すべてが「細胞特異的」ＴＲＥまたは「標的細胞特異的」ＴＲＥの形態として本明細書中では記載される）を同じタイプまたは異なるタイプの第２のＴＲＥに対して並置することができる。「並置される（する）」は、第１のＴＲＥおよび第２のＴＲＥが同じ遺伝子を転写制御することを意味する。これらの実施形態について、２つ以上のＴＲＥは数多くの形態のいずれかで存在することができ、それらには、下記の形態（これらに限定されない）が含まれる：（ａ）互いに隣り合う（すなわち、隣接する）；（ｂ）転写制御される遺伝子に対してともに５’側（この場合、ＴＲＥは間に介在配列を有することができる）；（ｃ）１つのＴＲＥが遺伝子の５’側であり、他方のＴＲＥがその遺伝子の３’側であり得る。

本発明のウイルスベクターは、この分野において標準的である組換え技術を使用して調製することができる。複製可能または複製不能なウイルスベクターを改変する様々な方法がこの分野では広く知られており、本明細書中および本明細書中に引用される刊行物に記載される。導入遺伝子および所望される転写エレメントをアデノウイルスにクローン化するための様々な方法が本明細書中に記載され、そのような方法は標準的であり、かつ、この分野では広く知られている。導入遺伝子および所望される転写エレメントは、アデノウイルスベクターゲノムにおいて、本明細書中で記載されるように様々な部位にクローン化される。例えば、アデノウイルスゲノム全体を含有するプラスミドを含めて、アデノウイルスゲノムの種々の部分を含有する様々なプラスミドがこの分野では存在する。これらのプラスミドの構築もまたこの分野では十分に記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００３０１０４６２５号）。部位が導入遺伝子挿入のために選択されると、適切なプラスミドを、改変を行うために使用することができる。その場合、改変を、例えば、相同的組換えまたはインビトロ連結によって全長のアデノウイルスベクターゲノムに導入することができる。相同的組換えを哺乳動物細胞（例えば、ＰｅｒＣ６）または細菌細胞（例えば、大腸菌、ＷＯ９６１７０７０を参照のこと）において行うことができる。あるいは、または、加えて、ウイルスベクターゲノムの操作では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲ−ＳＯＥｉｎｇ、制限消化（これらに限定されない）を含めて、様々な広く知られている分子生物学方法が含まれ得る。相同的組換えが用いられる場合、２つのプラスミドは典型的には、少なくとも約５００ｂｐの配列重なりを互いに有する。だが、それよりも小さい重なりでも組換えが生じるが、通常、効率は一層低い。それぞれのプラスミドは、所望される場合、独立して操作することができ、その後、コンピーテントな宿主に同時トランスフェクションされ、これにより、アデノウイルスベクターの繁殖のために適するような相補する遺伝子が提供される。プラスミドは一般に、形質導入の適切な手段（例えば、カチオン性リポソームまたはリン酸カルシウムなど）を使用して好適な宿主細胞（例えば、２９３細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞）に導入される。あるいは、アデノウイルスゲノムの右側部分および左側部分のインビトロ連結もまた、アデノウイルスゲノムの複製不可欠な部分のすべてを含有する組換えアデノウイルス誘導体を構築するために使用することができる。Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１：６００３−６０２０；Ｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：６３１−６３８。

便宜上、アデノウイルスの必要な部分を提供するプラスミドを利用することができる。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ１９：３３−４２）はＡｄ５の野生型の左側端部を含有する。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）；Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）はＡｄ５の右側端部を提供し、Ｅ３における欠失部を有する。Ｅ３の欠失は、異種の配列を挿入するためのウイルスベクター内のより大きな余地を提供する。Ｅ３についての遺伝子は、Ｅ４に由来する反対側の鎖（ｒ鎖）に存在する。ｐＢＨＧ１１はさらに一層大きなＥ３欠失を提供する。すなわち、さらに０．３ｋｂが欠失される（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４））。あるいは、ｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）の使用は、全長のＥ３を伴ったＡｄ５の右側端部を提供する。

ポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子にパッケージングする様々な方法がこの分野では知られており、これらもまたＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０に記載される。好ましいパッケージング細胞は、野生型のアデノウイルス粒子を生じさせ得る相同的組換えを制限するように設計されている細胞である。本発明のアデノウイルス粒子を産生させるために使用することができる細胞には、ヒト胚性腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２（１９７７））、ヒト胚性網膜芽細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（米国特許第５，９９４，１２８号および同第６，０３３，９０８号；Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９０９−１９１７（１９９８））、および、ヒト子宮頸部腫瘍由来細胞株ＨｅＬａ−Ｓ３（ＰＣＴ出願番号ＵＳ０４／１１８５５）が含まれる。ウイルスベクターは様々な方法で標的細胞に送達することができ、そのような方法には、リポソーム、この分野では広く知られている一般的なトランスフェクション方法（例えば、リン酸カルシウム沈殿またはエレクトロポレーションなど）、直接的な注入、および、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。送達手段は、主として、具体的なベクター（その形態を含む）、ならびに、標的細胞のタイプおよび場所（すなわち、標的細胞がインビトロまたはインビボであるかどうか）に依存する。

本発明はさらに、本発明による組換えウイルスベクターを含む組換えアデノウイルス粒子を提供する。１つの実施形態において、アデノウイルス粒子のキャプシドタンパク質は標的化リガンドを含む。１つの方法において、キャプシドタンパク質は繊維タンパク質またはｐＩＸである。１つの態様において、キャプシドタンパク質は繊維タンパク質であり、リガンドが繊維タンパク質のＣ末端（カルボキシル端）またはＨＩループに存在する。アデノウイルスベクター粒子はまた、繊維タンパク質に対する他の変異を含むことができる。さらなる実施形態において、ウイルスは、繊維のノブを別のアデノウイルス血清型に由来する繊維のノブで置き換えることによって標的化される。このような変異の例には、米国特許出願第１０／４０３，３３７号；米国特許出願公開第２００４／０００２０６０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０７８７７、同ＷＯ９９／３９７３４、同ＷＯ００／６７５７６、同ＷＯ０１／９２２９９；ならびに、米国特許第５，５４３，３２８号、同第５，７３１，１９０号、同第５，７５６，０８６号、同第５，７７０，４４２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，９６２，３１１号、同第５，９２２，３１５号、同第６，０５７，１５５号、同第６，１２７，５２５号、同第６，１５３，４３５号、同第６，４５５，３１４号、同第６，５５５，３６８号および同第６，６８３，１７０号、ならびに、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３（Ｊｕｌ １）；７７（１３）：７２２５−７２３５）に記載される変異が含まれるが、これらに限定されない。これらには、特定の細胞タイプまたは２つ以上の細胞タイプに対するウイルスベクター粒子の結合を低下させる変異、特定の細胞タイプまたは２つ以上の細胞タイプに対するウイルスベクター粒子の結合を強化する変異、および／あるいは、哺乳動物においてアデノウイルスベクター粒子に対する免疫応答を低下させる変異が含まれるが、これらに限定されない。

アデノウイルスの主要後期転写ユニット（ＭＬＴＵ）はＣ群アデノウイルスでは５つの領域に分けられる。それぞれの領域がそれ自身のポリアデニル化シグナル配列によって特徴づけられ、通常、数個の異なってスプライシングされたメッセージからなる。すべての後期メッセージが三成分リーダー（ＴＰＬ）に対してその５’末端でスプライシングされる。それぞれの領域の説明を次に示す。

本発明の例示的な実施形態において、導入遺伝子は下記の場所の少なくとも１つに挿入される：Ａ）Ｌ１領域、５２，５５ＫおよびＩＩＩａのＣＤＳの間、または、ｐＩＩＩａのＣＤＳの後で、Ｌ１領域のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（図３）；Ｂ）Ｌ２領域：ｐＶおよびＭｕについてのＣＤＳ、または、ｐＶＩＩおよびｐＶについてのＣＤＳのいずれかの間、および／あるいは、ペントンの後で、ｐＶＩＩの前方に挿入される（図４）；Ｃ）Ｌ３領域：ｐＶＩの上流側、または、ｐＶＩとヘキソンとの間、または、ヘキソンと２３Ｋとの間、または、２３Ｋ遺伝子の後で、ポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（図５〜図７）；Ｄ）Ｌ４領域：他の領域について記載されたのと類似する方針を使用してＬ４領域のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入され得る。しかしながら、Ｌ４およびＥ２の転写ユニットおよびプロセシングシグナルの間には著しい重なりが存在する。従って、当然のことではあるが、破壊が所望されない限り、当業者は、それ以外の転写ユニットおよびプロセシングシグナルが著しく破壊されない方法で導入遺伝子を挿入する。Ｅ）Ｌ５領域：１つだけのタンパク質がＡｄ５のＬ５領域においてコードされる（繊維遺伝子）。停止コドンがポリアデニル化シグナル配列の中に埋め込まれている。Ｌ５に挿入された導入遺伝子は繊維ＣＤＳの上流側に存在するか、または、下流側に挿入されたならば、ポリアデニル化シグナル配列が再構築／付加され、生来的なポリアデニル化シグナル配列は、繊維ＣＤＳのための停止コドンを維持するように、かつ、ポリアデニル化機能を不活性化するように変異させられる。Ｆ）Ｅ３領域：導入遺伝子が、Ｅ３領域における欠失を伴うことなく挿入される。例えば、導入遺伝子挿入部位には、Ｅ３遺伝子の上流側部位または下流側部位が含まれる。Ｇ）Ａｄゲノムに存在する他の転写ユニット（例えば、ｐＩＸおよびＩＶａ２をコードする中間の領域など）を類似する様式で使用することができる。Ｈ）新しい転写ユニットをゲノムに加えることができる。例えば、新しい後期領域を後期転写ユニットに加えることができ、これにより、「Ｌ６領域」を作製することができる。

１つの実施形態において、導入遺伝子は、Ｌ１転写物、Ｌ２転写物、Ｌ３転写物、Ｌ４転写物またはＬ５転写物の１つの一部として発現される。

１つの実施形態において、ベクターにおける導入遺伝子は、ウイルスｍＲＮＡの少なくとも１つによって使用される同じポリＡシグナルを利用する（すなわち、ウイルスｍＲＮＡの少なくとも１つによって使用される同じポリＡシグナルに機能的に連結される）。例えば、導入遺伝子を主要後期転写ユニットに挿入するとき、導入遺伝子を挿入するための方法は新しいリーダー配列または６番目のリーダー配列を作らない。同じポリＡシグナルは生来的なＡｄポリＡシグナルまたは異種のポリＡシグナルであり得る。

ポリアデニル化シグナル配列の近くでの配列の改変は切断効率に影響を及ぼす場合がある。従って、これらの領域に対する改変は、増大した切断効率、低下した切断効率、または、同等な切断効率をもたらし得る。当業者は、挿入部位を選択するとき、導入遺伝子の所望する発現時期および発現量を考慮することができる。

本発明の１つの実施形態において、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列が、ポリアデニル化シグナル配列の上流側およびアデノウイルスのコード配列の下流側に挿入される導入遺伝子に機能的に連結される。ポリアデニル化シグナル配列は通常的にはアデノウイルスのポリアデニル化シグナル配列であり、しかし、異種のポリアデニル化シグナル配列にすることができる。１つの実施形態において、前記異種のポリアデニル化シグナル配列はアデノウイルスのポリアデニル化シグナル配列の機能に取って代わる。本発明の１つの実施形態において、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列および導入遺伝子が、（異なったスプライシングのために）２つ以上のタンパク質をコードするアデノウイルス転写ユニットまたはリーダー配列（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）の中に挿入される。この実施形態では、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列が前記転写物またはリーダー領域からのそれぞれのｍＲＮＡに関して機能的であるという利点がもたらされる。すなわち、前記転写ユニットからのそれぞれのｍＲＮＡが、アデノウイルスのコード配列（ＣＤＳ）に加えて、導入遺伝子を機能的にコードし、かつ、発現するはずである。１つの例において、導入遺伝子が続くＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列がＬ２のポリアデニル化シグナルの上流側に導入され、Ｌ２領域から産生された４つすべてのタイプのｍＲＮＡが挿入配列を含有し、従って、４つすべてのタイプのｍＲＮＡが導入遺伝子を発現する。理論によって拘束されないが、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列および導入遺伝子の設置がポリアデニル化シグナルの近くになるほど、導入遺伝子の発現レベルが大きくなると考えられている。当業者は、挿入部位を選択するとき、導入遺伝子の所望する発現時期および発現量を考慮することができる。例えば、ウイルスの複製サイクルに関連して中間の時期での導入遺伝子の発現が所望されるならば、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列の導入遺伝子カセットもまたｐＩＸまたはＩＶａ２のいずれかのポリＡシグナルの上流側に挿入することができる。様々なタイプのＩＲＥＳおよび自己プロセシング切断配列を利用することができ、それぞれが、翻訳を媒介するためのその効率において異なる。当業者は、目的に合わせて調節された導入遺伝子発現効率のための知られている効率を有する特定のＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列を選ぶことができる。ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列および導入遺伝子を加えるとき、特定のアデノウイルス遺伝子の発現の破壊が所望されない限り、他方の鎖（すなわち、アンチセンス鎖）にコードされる配列を含めて、他のアデノウイルス配列を破壊しないように配慮しなければならない。アデノウイルス遺伝子の発現が詳細に特徴づけされているので、当業者は、アデノウイルス遺伝子の発現を破壊する部位、および、アデノウイルス遺伝子の発現を破壊しない部位を決定することができる。

（Ｌ１領域）
Ｌ１領域には、図１〜図３に示されるように、５２／５５ＫおよびＩＩＩａについてのコード領域が含まれる。両方の遺伝子はスプライスアクセプター部位の後のＡＴＧの上流側にわずかに１個の塩基を有するだけである。すべての後期領域において、それぞれの領域においてコードされるｍＲＮＡがそれらのスプライスアクセプター部位において三成分リーダーに結合する。５２／５５Ｋコード領域とＩＩＩａコード領域との間におけるスプライシングエンハンサー配列（２５塩基対の配列）の存在および存在位置が特定されている。加えて、スプライスリプレッサー領域がスプライスエンハンサーのすぐ上流側に存在する。Ｌ１領域の上流側には、ＶＡ ＲＮＡコード領域と、Ｅ２Ｂをコードする領域（これは相補鎖上に存在する）とが存在する。実際、ＶＡのＲＮＡＩＩは、５２／５５ＫのｍＲＮＡについてのスプライスアクセプター部位から約１０塩基対のところで終わる。下流側のＬ２領域についてのスプライスアクセプター部位がＬ１ポリアデニル化シグナル配列の上流側にある。これらの重なっている特徴は考慮しなければならず、また、通常、導入遺伝子をＬ１領域に挿入するときには無傷のままにしておかれる。Ｌ１のｍＲＮＡは感染の初期段階の期間中に合成され始めるが、５２／５５Ｋ遺伝子のほんの検出可能なレベルが作製されるだけである。後期段階に入った後、ＩＩＩａコード領域が翻訳され、５２／５５Ｋ翻訳レベルは一層より低くなる。再度ではあるが、調節におけるこの変化の機構は、感染の後期段階に入ることによって影響される、差のあるスプライス部位使用のためである。

導入遺伝子は潜在的には、２つのＬ１コード領域の間に、または、５２／５５Ｋコード領域の上流側に、または、ＩＩＩコード領域のすぐ下流側で、Ｌ１のポリアデニル化シグナル配列の上流側に設置することができる。１つの実施形態において、分岐点配列およびスプライスアクセプター部位が導入遺伝子のために加えられ、かつ／または、アデノウイルスコード領域のために下流側に加えられる。別の実施形態において、自己プロセシング切断部位がＩＩＩａ領域の下流側に加えられ、かつ、ＩＩＩａ領域に機能的に連結され、次いで、自己プロセシング切断部位は、自己プロセシング切断部位の下流側に位置する導入遺伝子に機能的に連結される。また、ＩＩＩａコード領域の下流側での挿入を設計するとき、Ｌ１のポリアデニル化シグナル配列およびＬ２のスプライスアクセプター部位の破壊を避けるように配慮しなければならない。あるいは、これらのシグナルは、所望されるならば、タンパク質発現を変化させるために復活または変化させることができる。ウイルスタンパク質と類似して、５２／５５Ｋの上流側および下流側に挿入された導入遺伝子は初期段階で発現され、ＩＩＩａの下流側に挿入された導入遺伝子は感染の後期段階の期間中に発現されることが考えられる。このことは、例えば、スプライスエンハンサー領域およびスプライスリプレッサー領域の配置に依存して変化し得る。

別の実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳが、ＩＩＩａコード領域の下流側で、Ｌ１のポリアデニル化シグナル配列または異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｌ１のポリアデニル化シグナル配列または異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。

（Ｌ２領域）
Ｌ２領域は、図１〜図２および図４に示されるように、ペントン（ａｋａ ＩＩＩ）、プロＶＩＩ（ａｋａ ｐＶＩＩ）、ｐＶおよびｐＸ（これはｐＶ前駆体または「ｍｕ」と呼ばれることがある）の４つの特定されたコード領域をコードする。ペントンはその開始コドンの２塩基上流側にスプライスアクセプター部位を有する。プロＶＩＩのｍＲＮＡについてのスプライス部位がペントンコード領域の中に埋め込まれており、その開始コドンがペントンについての停止コドンの７塩基対下流側にある。プロＶＩＩについての停止コドン、ｐＶのｍＲＮＡについてのスプライス部位、および、ｐＶについての開始コドンが、それぞれ、４６塩基対および２３塩基対によって離れている。ｐＸ、すなわち、そのＡＴＧ開始コドンがｐＶ停止コドンの１２４塩基下流側である。Ｌ２領域についてのポリアデニル化シグナル配列はｐＸの停止コドンの後の２６塩基であり、切断がポリＡシグナル後の約１２塩基のところで生じる。

導入遺伝子挿入のための選択肢には、ａ）ｐＶまたはｐＸのＣＤＳの後で、Ｌ２ポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入すること、ｂ）ｐＶのｍＲＮＡについてのスプライスアクセプター部位の下流側で、ｐＶのＣＤＳの上流側に挿入すること、およびｃ）ペントンの停止コドンとｐＶＩＩの開始コドンとの間に挿入することが含まれるが、これらに限定されない。導入遺伝子の挿入方法および発現が選択的スプライシングに依存するとき、コード領域が既存の配列または外部から加えられた配列であっても、それぞれのコード領域のためのスプライスアクセプター部位を有することが望ましい。Ｌ２のｍＲＮＡメッセージのすべてが通常的にはＬ２のポリアデニル化シグナルを使用するが、しかし、一部の実施形態では、非生来的なポリＡシグナルを利用することができる。

導入遺伝子はまた、自己プロセシング切断部位を使用してＬ２領域のこれらの領域から発現させることができる。１つの実施形態において、自己プロセシング切断部位がＡｄのＣＤＳ（例えば、ペントン、プロＶＩＩ、ｐＶおよびｐＸ）の３’末端に機能的に連結され、導入遺伝子のＣＤＳが自己プロセシング切断部位の３’末端に機能的に連結される。代わりの実施形態では、導入遺伝子がＡｄのＣＤＳの上流側に挿入され、この場合、自己プロセシング切断部位が導入遺伝子の３’末端に機能的に連結され、ＡｄのＣＤＳが自己プロセシング切断部位の３’末端に機能的に連結される。この場合において、導入遺伝子は、導入遺伝子がベクターから転写されるように、（本明細書中に記載されるような）適正な転写エレメントとともに挿入される。これには、導入遺伝子がＡｄのスプライス部位および分岐点に機能的に連結されるように導入遺伝子を挿入することが含まれ得る。１つの実施形態において、Ａｄのスプライス部位および分岐点は、生来的なウイルスにおいて下流側のＡｄのＣＤＳの連結されたスプライス部位および分岐点である。別の実施形態において、導入遺伝子は、いずれか一方または両方が異種であるスプライス部位および分岐点に機能的に連結される。

別の実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳが、ｐＶコード領域の下流側で、Ｌ２のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｌ２のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。

（Ｌ３領域）
Ｌ３領域は、図５〜図７に示されるように、ｐＶＩ、ヘキソン（ＩＩ）および２３Ｋ（ウイルスプロテアーゼ）についてのコード領域を含有する。ｐＶＩのｍＲＮＡについてのスプライスアクセプター部位が、Ｌ２のポリアデニル化部位の下流側で、ｐＶＩの開始コドンの１塩基上流側にある。ｐＶＩについての停止コドンがヘキソンメッセージについてのスプライスアクセプター部位の約５０塩基上流側にあり、ヘキソンの開始コドンがそのｍＲＮＡスプライスアクセプター部位から約３５塩基のところにある。２３ＫのｍＲＮＡについてのスプライスアクセプター部位がヘキソンについてのコード配列に含有され、ヘキソンの停止コドンの約９５塩基上流側にある。２３Ｋについての開始コドンがヘキソンの停止コドンの３２塩基下流側にある。２３Ｋについての停止コドンがＬ３のポリＡシグナルの約２５塩基上流側にある。Ｌ３のポリアデニル化領域が、相補鎖に位置するＥ２Ａについてのポリアデニル化シグナルと重なっている。ほとんどの場合において、両方の鎖におけるポリアデニル化シグナル配列を効率的なプロセシングのために無傷に保つことが望ましい。

Ｌ３領域への導入遺伝子の挿入にはいくつかの選択肢がある：ａ）ｐＶＩコード領域の上流側、ｂ）ｐＶＩコード領域とヘキソンコード領域との間、ｃ）ヘキソンコード領域と２３Ｋコード領域との間、およびｄ）２３ＫのＣＤＳの末端において。Ｌ３のポリＡシグナルは非常に強いこと、および、ヘキソンのｍＲＮＡが非常に多量に発現されることに留意すること。Ｌ３に挿入された導入遺伝子もまた多量に発現されることが予測される。また、ヘキソンコード領域と２３Ｋコード領域との間での挿入については、ヘキソンコード領域内のスプライスアクセプター部位（これは通常、２３ＫｍＲＮＡのために使用される）を導入遺伝子ｍＲＮＡのために使用し、かつ、新しい分岐点およびスプライスアクセプター部位を２３Ｋメッセージの合成のために加えることが望ましい場合がある。別の実施形態において、導入遺伝子は、自己プロセッシング切断部位を伴うヘキソンＣＤＳに連結される。別の実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳが、２３Ｋコード領域の下流側で、Ｌ３のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｌ３のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。

（Ｌ４領域）
Ｌ４領域は、図１および図２に示されるように、１００Ｋタンパク質、３３Ｋタンパク質およびｐＶＩＩＩタンパク質についてのコード領域を含有する。３３ＫについてのＣＤＳの一部が１００ＫについてのＣＤＳと重なる。これらの２つの遺伝子の間には非コード塩基対が存在するが、それは、導入遺伝子を挿入するための望ましい場所ではない。これは３３Ｋについてのイントロンを破壊し得るか、または、その使用を変化させ得るからである。ｐＶＩＩＩのＣＤＳおよびポリＡ領域がＥ２プロモーターおよびＥ３プロモーターと重なる。相補鎖には、Ｅ２Ａ転写ユニットおよびＥ２Ｂ転写ユニットについてのリーダー配列が存在する。従って、この領域を導入遺伝子挿入のために利用するときには、設計者はこのことに気をつけなければならない。この領域における何らかの挿入または破壊は、Ｅ２領域、Ｅ３領域および／またはＬ４領域における不可欠な遺伝子の発現を変化または破壊し得る可能性がある。

別の実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されるＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断部位が、１００Ｋコード領域の下流側で、Ｌ４のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｌ４のポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。この場合において、そのＣＤＳがＬ４ポリＡ配列と重なるので、Ｅ３の１２．５ＫのＣＤＳが中断される可能性がある。しかしながら、この遺伝子を欠失させているいくつかの変異型は表現型の変化をインビトロで示しておらず、従って、導入遺伝子挿入のためのこの場所／方法は機能的なアデノウイルスベクターをもたらすことができる。

（Ｌ５領域）
Ａｄ５におけるＬ５領域は、図１および図２に示されるように繊維タンパク質をコードするだけである。繊維ｍＲＮＡについてのスプライスアクセプター部位が繊維の開始コドンの２ヌクレオチド（ｎｔ）上流側にある。繊維の停止コドンがＬ５のポリＡシグナルの中に埋め込まれている。導入遺伝子を繊維コード領域の上流側または下流側のいずれかに挿入することができる。しかしながら、下流側での挿入については、生来的なＬ５ポリアデニル化シグナル配列が、その配列がもはやポリアデニル化機能を提供しないように改変される。１つの実施形態において、スプライスアクセプター部位および導入遺伝子がｍＲＮＡの合成のために挿入される。その場合、ポリアデニル化シグナルが、変化したＬ５領域による使用のために、挿入された導入遺伝子の下流側で復活される。別の実施形態において、自己プロセシング切断部位が繊維のＣＤＳの下流側末端に機能的に連結され、導入遺伝子のＣＤＳが自己プロセシング切断部位の下流側に挿入され、かつ、自己プロセシング切断部位に機能的に連結される。

（さらなる後期領域）
導入遺伝子をウイルスベクター（例えば、Ａｄなど）に挿入するための別の方法は、さらなる後期領域を挿入することである。これは、例えば、分岐点およびスプライスアクセプター部位、導入遺伝子、ならびにポリアデニル化シグナル（および任意の他の必要なシグナル）からなるカセットを既存の領域または転写ユニット（例えば、Ｌ３など）のすぐ下流側に挿入することによって行うことができる。このカセットはまた、第２の導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断部位からなり得る。第２の導入遺伝子は、第１の導入遺伝子と同じタンパク質または異なるタンパク質をコードすることができる。同じタンパク質の場合、これらの導入遺伝子のうちの１つのコード配列を「再コード化」することが好ましい。すなわち、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンが使用される。これは、ＤＮＡレベルでの２つの導入遺伝子の間における相同性の量を低下させ、従って、２つの導入遺伝子の間での相同的組換えを低下または除去するために行われる。

（Ｅ３領域）
アデノウイルスにおけるＥ３領域は、１２．５Ｋ、６．７Ｋ、ｇｐ１９Ｋ、ＡＤＰ、ＲＩＤ−α、ＲＩＤ−βおよび１４．７Ｋの特定されたタンパク質についての遺伝子をコードする。１つの実施形態において、導入遺伝子が、ｇｐ１９Ｋコード領域の下流側で、ＡＤＰのＣＤＳの上流側に挿入される。興味深いことに、Ａｄ５ウイルスにおいて、１２８ｂｐがｇｐ１９Ｋコード領域とＡＤＰコード領域との間に存在する（Ａｄゲノムのアクセション番号ＡＹ３３９８６５における塩基対２９２０９〜２９３３６；配列番号４１）。

本発明の１つの実施形態において、これらの１２８ｂｐまたはこれらの１２８ｂｐの大部分がＡｄ５ベクターから欠失される。１つの実施形態において、ベクターはｇｐ１９Ｋコード領域および／またはＡＤＰコード領域を含有し、Ａｄ５ベクターにおけるこれらの１２８ｂｐについて欠失される。Ａｄ２ウイルスはこれらの１２８ｂｐまたは類似する配列をこの領域に含有しない。別の実施形態において、導入遺伝子が、１４．７Ｋコード領域の後で、Ｅ３Ｂポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される。別の実施形態において、導入遺伝子がＡＤＰコード領域の後に挿入される。しかしながら、ＡＤＰの停止コドンがＥ３ＡのポリＡ部位の中に埋め込まれている。従って、このポリＡ部位は、その配列がもはやポリアデニル化機能を提供しないように改変され、しかし、ＡＤＰコード配列と読み枠が一致する停止コドンを含有する。導入遺伝子をＡＤＰのＣＤＳの下流側に（例えば、スプライスアクセプター部位または自己プロセシング切断部位と一緒に加えることができる。その場合、ポリアデニル化シグナル配列が導入遺伝子コード領域の下流側に挿入される。挿入されたポリアデニル化シグナル配列は生来的なＥ３ＡポリＡ部位または別のポリＡ部位（例えば、ＳＶ４０ポリＡ部位）であり得る。

Ｅ３コード領域はウイルス複製のために要求されない。従って、Ｅ３コード領域はアデノウイルスベクターでは必ずしも必要でない。結果として、本発明のウイルスベクターは１つまたは複数のＥ３コード領域を欠失させることができ、あるいは、Ｅ３コード領域のすべてを含有することができる。本発明の実施形態において、Ｅ３の１４．７コード領域、１４．５コード領域または１０．４ｋコード領域あるいはそれらの組合せがアデノウイルスベクターにおいて保持される。本発明の１つの実施形態において、導入遺伝子はＥ３のＣＤＳに代わって挿入されない。例えば、導入遺伝子が２つの生来的なＥ３ ＣＤＳの間に挿入され、この場合、前記２つの生来的なコード配列は天然ウイルスでは互いに隣接しており、別のＥ３ ＣＤＳがそれらの間に存在していない。一部の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ３転写ユニットの一部として転写される導入遺伝子に機能的に連結された異種のスプライスアクセプター部位を含有する。例えば、異種のスプライスアクセプター部位が導入遺伝子に機能的に連結され、両者がＥ３領域に挿入される。

別の実施形態において、導入遺伝子のＣＤＳに機能的に連結された自己プロセシング切断部位が、この自己プロセシング切断部位もまたアデノウイルスのＥ３ ＣＤＳに機能的に連結されるように挿入される。導入遺伝子のＣＤＳを自己プロセシング切断部位の下流側にし、Ｅ３のＣＤＳを自己プロセシング切断部位の上流側にすることができる。別の実施形態において、Ｅ３のＣＤＳを自己プロセシング切断部位の下流側にし、導入遺伝子のＣＤＳを自己プロセシング切断部位の上流側にすることができる。

別の実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳが、１４．７Ｋコード領域の下流側で、Ｅ３ＢのポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｅ３ＢのポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。１つの実施形態において、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳが、ＡＤＰコード領域の下流側で、Ｅ３ＡのポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入される（すなわち、Ｅ３ＡのポリＡシグナルまたは異種のポリアデニル化シグナル配列に機能的に連結される）。Ｅ３領域は、ウイルス複製のために必ずしも必要でない、従って、アデノウイルスベクターのある種のタイプおよび使用を不要にするタンパク質をコードする。従って、別の実施形態において、１つまたは複数のＥ３コード配列が欠失または変異され、導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳから構成される異種のＤＮＡが、Ｅ３ＡまたはＥ３Ｂのポリアデニル化シグナル配列と、Ｅ３ＡまたはＥ３Ｂのポリアデニル化シグナル配列のすぐ５’側に存在するＥ３コード配列との間にそれぞれ挿入される。

本明細書中に記載される導入遺伝子挿入のための方法はどれも、挿入部位が適合性である限り、本明細書中または他のどこかで記載される導入遺伝子挿入の任意の他の方法と組み合わせることができる。例えば、スプライスアクセプター部位および分岐点に機能的に連結された第１の導入遺伝子を転写ユニットに挿入することができる。挿入された第１の導入遺伝子は、その後、前記第１の導入遺伝子の下流側に挿入された自己プロセシング切断部位に機能的に連結することができ、その後、第２の導入遺伝子が自己プロセシング切断部位の下流側に挿入され、自己プロセシング切断部位に機能的に連結される。当業者は本明細書中の教示に頼ることができ、かつ、導入遺伝子の開示された挿入方法および発現方法の組合せを使用して導入遺伝子を挿入することができることが理解され、そのような方法および挿入部位のすべてが本発明によって包含される。

アデノウイルスベクターＤＮＡがウイルスビリオンにパッケージングされるならば、ウイルスのパッケージング能力を超えないように注意しなければならない。例えば、Ａｄ５については、ゲノムＤＮＡが野生型Ａｄ５ゲノムのサイズの約１０５％よりも大きいとき、パッケージング効率が大きく低下する（Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３Ｏｃｔ；６７（１０）：５９１１−２１）。しかしながら、より大きいサイズを有するＡｄ５ベクターが安定であることが報告されている。

簡略化のために、本明細書中上記の説明は、別途言及されない限り、Ａｄの血清型５を示す。当業者は、過度な実験を用いることなく、他のアデノウイルスまたは他のウイルスにおける導入遺伝子についての同等の挿入部位を容易に推定することができる。

導入遺伝子の性質に依存して、導入遺伝子を感染の初期段階または後期段階の期間中に発現させることが望ましい場合がある。加えて、高レベルまたは低レベルのいずれかの発現を有することが望ましい場合がある。例えば、場合により、ウイルスＤＮＡの複製の後の、感染の後期段階の期間中での発現が好ましい場合がある。ベクターが、初期遺伝子の発現を行わせる腫瘍特異的なプロモーターを有する腫瘍崩壊性のＡｄベクターであるならば、後期遺伝子の発現はＤＮＡ複製を要求するので、後期発現は別の調節機構を可能にする。導入遺伝子が後期転写物に挿入されるならば、発現は特異的になる。これは、Ａｄベクターが選択的に複製するように設計されるならば、ウイルス複製が標的細胞について特異的であるからである。

導入遺伝子の発現を調節すること、または、ウイルス遺伝子の発現を変化させることを助けるために使用できる別の機構は、コンセンサスな配列と比較して、加えられたエレメント（例えば、分岐点配列および／またはスプライスアクセプター部位または自己プロセシング切断部位）の配列を改変することである。これにより、使用効率が変化する。例えば、スプライスアクセプター部位の場合、高い発現レベルが所望されるならば、コンセンサスなスプライスアクセプター配列に非常に近い配列が使用される。コンセンサスなスプライスアクセプター部位配列が、（Ｔ／Ｃ）_８，Ｎ，Ｃ／Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｇであることが明らかにされていた（Ｍｏｕｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１０：４５９；１９８２）。切断効率を変化させる変異分析が行われている（Ｒｏｓｃｉｇｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６８：１１２２２；１９９３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１１：９４；２００４）。一般に受け入れられているコンセンサスな配列定義および使用が、ウイルスが後期段階に入った後では変化し得るし、実際に変化することに留意しなければならない（Ａｋｕｓｊａｒｖｉ ａｎｄ Ｓｖｅｖｅｎｉｎ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２７２：２５３；２００３；Ｎｅｖｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ２９０：１１３；１９８１；Ａｋｕｓｊａｒｖｉ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ３８：４６９；１９８１）。例えば、コンセンサスでないスプライスアクセプター部位の使用が感染の後期段階の期間中に高まる（Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ６９：７３２４；１９９５）。これらの変化のほとんどが、ウイルスタンパク質が転写および翻訳のための細胞装置に対して有する作用のためである。

スプライスアクセプター部位に加えて、分岐点配列を本発明のアデノウイルスベクターに含めることができる。分岐点配列はイントロンの効率的なスプライシングのために必要である（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３：１３；２００２；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８５：７０４−７０８；１９８８；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ１８（１０）３０１５−３０１９ １９９０）。分岐点からスプライスアクセプター部位までの距離もまたスプライシング効率に影響を及ぼし、通常の場合、しかし、必ずしも常にではないが、スプライスアクセプター部位の１０塩基対〜５０塩基対上流側であり、さらにより高頻度には１８塩基対〜３７塩基対上流側である（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９０）。分岐点配列のコンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＹ（配列番号４０）（式中、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）であると考えられ、下線部のＡは変化しない（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３２３：１３１；２００４）。この配列における任意のずれが分岐点およびスプライスアクセプター部位の使用効率の変化をもたらし得る。

本発明の１つの実施形態において、分岐点＋スプライスアクセプター部位の配列は、

（配列番号３９）である。下線部の配列は分岐点配列であり、矢印は、スプライシング規則に従ったスプライス部位の存在位置を示す。このコンセンサスな配列を支配する規則は不変ではないので、規則に一致する他の類似する配列を使用することができる。１つの実施形態において、分岐点＋スプライスアクセプター部位が別のＡｄ血清型から使用される。言い換えれば、分岐点＋スプライスアクセプター部位は異種であり、すなわち、Ａｄベクターが基づく天然アデノウイルスからではなく、異なるＡｄ血清型に由来する。

導入遺伝子のスプライシングおよび／または発現の効率を所望するように変化させる他の随意的な配列を加えることができる。例えば、スプライシングを強化または抑制することができる、エキソンに存在するシス作用エレメントが特定されている。これらの配列はエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）またはエキソンスプライシングサプレッサー（ＥＳＳ）と呼ばれている（Ｚｈｅｎｇ，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ１１：２７８；２００４に総説される）。コンセンサスな配列がこれらのエレメントについては存在しないが、ＥＳＳおよびＥＳＥの多くの例が他のウイルス性および非ウイルス性の生物で特定されており、これらを使用することができる。当業者は、文献およびデータを調査し、適切な配列を選ぶことができる。

まとめると、本発明は、導入遺伝子コード領域をウイルスベクターゲノムの特定の領域に挿入するための様々な方法を提供する。これらの方法では、Ａｄ遺伝子の発現のための知られているウイルス転写エレメントおよび機構が利用され、かつ、さらなるプロモーターが必要でなく、また、調節シグナルがより小さいＤＮＡフラグメントを包含するので、Ａｄゲノムに挿入される導入遺伝子発現のためのＤＮＡ配列のサイズが小さくされ、かつ、導入遺伝子の時間的調節における柔軟性が提供され（例えば、感染の初期段階対後期段階；感染の初期段階対中間段階）、かつ、発現した導入遺伝子の量を調節するための技術が提供される。例えば、より大きな量の導入遺伝子を、通常の場合に高レベルで発現される転写物に導入遺伝子を挿入することによって、かつ／または、高効率のスプライスアクセプター部位を導入遺伝子コード領域に機能的に連結することによって発現させることができる。発現レベルはまた、調節シグナルがそのコンセンサスな配列に対してどのくらい近いかによって影響を受ける。様々な変化を、所望するように発現を細かく調節するために行うことができる。

場合により、導入遺伝子の発現が、複製可能なウイルスの生活環を阻害することがある。この場合、導入遺伝子は、導入遺伝子が（ウイルスＤＮＡの複製の後の）感染の後期段階においてもっぱらまたは主に発現される方法で挿入することができる。例えば、導入遺伝子を本発明に従ってＬ３に挿入することができる。一部の導入遺伝子については、導入遺伝子をウイルスの生活環の初期で発現させることが所望され得る場合がある。例えば、導入遺伝子を、初期領域のいずれか（例えば、Ｅ３）において、または、上流側のＬ１領域に挿入することができる。

（転写調節エレメント（ＴＲＥ））
様々な転写調節エレメント（ＴＲＥ）、ならびに、機能的に連結されたコード配列を調節するためのそれらの同定、単離、特徴づけ、遺伝子操作および使用のための様々な方法がこの分野では知られている。ＴＲＥは１個の遺伝子の転写調節配列に由来し得るか、または、種々の遺伝子に由来する配列を、機能的なＴＲＥを作製するために組み合わせることができ、または、ＴＲＥを合成的に作製することができる（例えば、ＣＴＰ４プロモーター）。

ＴＲＥは、標的の組織または腫瘍に存在する細胞のタイプに依存して、組織特異的、腫瘍特異的、発達段階特異的、細胞状態特異的などであり得る。そのようなＴＲＥはまとめて、本明細書中では組織特異的または標的細胞特異的として示される。より詳しくは下記において記載されるように、標的細胞特異的なＴＲＥはかなり多数の形態を含むことができ、これらには、標的細胞特異的プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；異種のプロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；標的細胞特異的プロモーターおよび異種のエンハンサー；異種のプロモーターおよび異種のエンハンサー；ならびに前記の多量体が含まれるが、これらに限定されない。標的細胞特異的ＴＲＥのプロモーター成分およびエンハンサー成分は、所望の細胞特異的な転写活性が得られる限り、任意の配向であり、かつ／または、目的とするコード配列から任意の距離であり得る。

転写活性化を、この分野で知られている（また、より詳しくは下記において記載される）数多くの方法で測定することができ、しかし、一般には、標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある（すなわち、標的細胞特異的ＴＲＥに機能的に連結された）コード配列のｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。

本明細書中でさらに議論されるように、標的細胞特異的ＴＲＥは様々な長さおよび様々な配列組成が可能である。標的細胞特異的ＴＲＥは、限定された集団（またはタイプ）の細胞（例えば、前立腺細胞、肝臓細胞、メラノーマ細胞など）において優先的に機能的である。従って、一部の実施形態において、使用されるＴＲＥは下記の細胞タイプのいずれかにおいて優先的に機能的である：前立腺；肝臓；乳房；尿路上皮（膀胱）；結腸；肺；卵巣；膵臓；胃；子宮など。

当業者によって容易に理解されるように、ＴＲＥはポリヌクレオチド配列であり、そのため、様々な配列順列について機能を示し得る。ヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加およびヌクレオチド欠失の様々な方法がこの分野では知られており、容易に利用することができる機能的アッセイ（例えば、ＣＡＴまたはルシフェラーゼのレポーター遺伝子アッセイなど）により、当業者は、配列変化体が、要求された細胞特異的な転写調節機能を示すかどうかを明らかにすることができる。従って、核酸の置換、付加および／または欠失を含む、ＴＲＥの機能的に保存された変化体を、本明細書中に開示されるベクターにおいて使用することができる。それによれば、変化体ＴＲＥは標的細胞において機能を保持し、しかし、最大の機能を示す必要はない。事実、ＴＲＥの最大の転写活性化活性は、所望する結果を達成するために必ずしも常に必要でない場合があり、ＴＲＥのフラグメントによってもたらされる誘導レベルがいくつかの適用のためには十分である場合がある。例えば、疾患状態の処置または緩和のために使用される場合、最大でない応答性が、例えば、標的細胞が特に悪性でなく、かつ／または、疾患の範囲が比較的限定されているならば、十分である場合がある。

ある種の塩基改変により、高まった発現レベルおよび／または細胞特異性がもたらされる場合がある。例えば、ＴＲＥ内における核酸配列の欠失または付加は、この分野では知られているように、転写調節タンパク質結合部位を、それらがその正常な形態で存在するよりも近くに、または、互いに遠くに移動させることができ、あるいは、ＤＮＡらせんの反対側に存在するように転写調節タンパク質結合部位を回転させ、それにより、ＴＲＥと結合した転写因子同士の間での空間的関係性を変化させることができ、その結果、転写の減少または増大を生じさせることができる。従って、理論によって拘束されることを望まないが、本開示では、ＴＲＥのある種の改変が、高まった細胞特異性を含めて、ＴＲＥによって導かれるような調節された発現レベルをもたらすという可能性が包含される。高まった発現レベルの達成は、より攻撃的な形態の新生物成長の場合において／あるいは、より迅速かつ／または攻撃的なパターンの細胞殺傷が（例えば、免疫が低下した対象において）正当化されるときには望ましいかもしれない。

本発明のベクターにおいて使用されるＴＲＥはサイレンサーを含んでよく、または含まなくてもよい。サイレンサー（すなわち、この分野で知られている負の調節エレメント）の存在は、転写（従って、複製）を非標的細胞において止めることを助けることができる。従って、サイレンサーの存在は、非標的細胞における複製をより効果的に防止することによって細胞特異的ベクターの強化された複製をもたらすことができる。あるいは、サイレンサーの非存在は標的細胞における複製を刺激することができ、従って、高まった標的細胞特異性をもたらすことができる。

ＴＲＥによって導かれる転写活性（阻害および強化の両方を含む）を、この分野で知られている数多くの方法によって測定することができ、しかし、一般には、ＴＲＥの制御下にある（すなわち、ＴＲＥに機能的に連結された）配列によりコードされるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。

本明細書中で議論されるように、ＴＲＥは様々な長さおよび様々な配列組成が可能である。異種ＴＲＥのサイズは、部分的にはウイルスベクターの収容能力（これは、意図されたベクター形態に依存する）によって決定される。一般に、最小サイズがＴＲＥについては好ましい。これにより、望ましい場合がある他の配列（例えば、導入遺伝子および／またはさらなる調節配列など）を挿入するための潜在的な余地が提供されるからである。好ましい実施形態において、そのようなさらなる調節配列は、ＩＲＥＳ、自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列など）、スプライシング配列または分岐部位である。

例として、アデノウイルスベクターは、合計でゲノムサイズの約１０５％までのさらなる配列、または、ウイルス配列の欠失を必要とすることなくおよそ１．８ｋｂの配列とパッケージングすることができる。不可欠でない配列がアデノウイルスゲノムから除かれるならば、さらに４．６ｋｂの挿入体が許容され得る（すなわち、合計で約６．４ｋｂの挿入収容能力について許容され得る）。

複製可能なアデノウイルスベクターの場合、非特異的な複製を最小限に抑えるために、内因性の（アデノウイルス）ＴＲＥ（すなわち、生来的なＥ１Ａプロモーターおよび／またはＥ１Ｂプロモーター）が好ましくはベクターから除かれる。標的細胞特異的な複製を容易にすることのほかに、内因性ＴＲＥの除去はまた、ベクターにおけるより大きい挿入体収容能力を提供し、このことは、アデノウイルスベクターがウイルス粒子内にパッケージングされることになるならば、特に重要である。さらにより重要なことは、内因性ＴＲＥの欠失は、異種のＴＲＥが欠失され、内因性ＴＲＥがそのそれぞれのアデノウイルスコード配列の転写制御を引き受ける（従って、非特異的な複製を可能にする）組換え事象の可能性を防止する。１つの実施形態において、アデノウイルスベクターが、１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子の内因性の転写制御配列が欠失され、１つまたは複数の異種ＴＲＥによって置き換えられるように構築される。しかしながら、もし十分な細胞特異的複製の優先が保存されるならば、内因性ＴＲＥをアデノウイルスベクターにおいて維持することができる。これらの実施形態は、内因性ＴＲＥと、複製のために要求される遺伝子コードセグメントとの間に異種のＴＲＥを挿入することによって構築される。要求される細胞特異的複製の優先は、異種ＴＲＥの機能を可能する細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を、異種ＴＲＥが機能しない細胞における複製と比較するアッセイを行うことによって明らかにされる。

一般に、ＴＲＥは、ＴＲＥの非存在下での基礎的な複製レベルと比較して、標的細胞におけるウイルスの複製を、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、さらに一層より好ましくは少なくとも約４００倍〜約５００倍、さらに一層より好ましくは少なくとも約１０００倍増大させる。許容可能な差は、（例えば、この分野で知られているＲＮＡブロットアッセイ、ＲＮａｓｅ保護アッセイまたは他のアッセイを使用するｍＲＮＡレベルの測定によって）経験的に決定することができ、ベクターの予想される使用および／または所望される結果に依存する。

特定の標的細胞に向けられたアデノウイルスベクターを、標的細胞において優先的に機能的であるＴＲＥを使用して作製することができる。本発明の１つの実施形態において、標的細胞特異的または細胞状態特異的な異種ＴＲＥは腫瘍細胞特異的である。ベクターは１つだけの腫瘍細胞特異的ＴＲＥを含むことができ、または、同じ細胞において腫瘍細胞特異的かつ機能的である多数の異種ＴＲＥを含むことができる。別の実施形態において、ベクターは、腫瘍細胞特異的である１つまたは複数の異種ＴＲＥを含み、加えて、組織特異的である１つまたは複数の異種ＴＲＥを含み、それにより、すべてのＴＲＥが同じ細胞において機能的である。

腫瘍崩壊性のアデノウイルスプラットホームのための好ましい実施形態において、ＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列など）を含有する二シストロンカセットまたは多シストロンカセットは、アデノウイルスの初期ウイルス遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４）、または、ウイルスの生活環において後期で発現される遺伝子（繊維、ペントンおよびヘキソン）を含む。

いくつかの場合においては、例えば、ガン性標的細胞の比較的不応的な性質または特定の攻撃性のために、細胞傷害活性の程度および／または割合を高めることが望ましい場合がある。細胞毒性に寄与するウイルス遺伝子の一例には、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子が含まれるが、これに限定されない。本明細書中に開示される別の実施形態において、アデノウイルスは、その内因性プロモーターにおける欠失またはその内因性プロモーターの欠失を有するアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子を含む。本明細書中に開示される別の実施形態において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が欠失される。

標的細胞に対する高まった細胞毒性を提供するために、細胞傷害作用を有する１つまたは複数の導入遺伝子をベクターに存在させることができる。加えて、または、あるいは、細胞毒性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子など）を、場合により異種ＴＲＥの選択的転写制御下、および、場合によりＩＲＥＳまたは自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列など）の翻訳制御下でベクターに含むことができる。これは、標的細胞特異的な細胞傷害活性を異種の遺伝子または導入遺伝子の細胞特異的な発現と結びつけることによって達成することができる。

数多くの異種の治療的な遺伝子または導入遺伝子はどれも、下記においてさらに記載されるように、本発明の複製可能ウイルスベクターに含めることができる。

典型的には、上記の二シストロンカセットまたは多シストロンカセットが転写応答エレメント（一般には、ガン細胞または腫瘍細胞において優先的に発現される、細胞タイプまたは細胞状態に関連した転写制御エレメント）の制御下に設置される。従って、所与の構築物に含まれる治療的遺伝子は、標的細胞のタイプに依存して変化する。

この分野では知られているように、ＴＲＥの活性は誘導可能であることが可能である。誘導可能なＴＲＥは一般に、誘導因子の非存在下では低い活性を示し、誘導因子の存在下でアップレギュレーションされる。誘導因子には、例えば、核酸、ポリペプチド、小分子、有機化合物および／または環境的条件（例えば、温度、圧力または低酸素状態など）が含まれる。誘導可能なＴＲＥは、発現が特定の時間または特定の場所においてだけ所望されるとき、あるいは、誘導剤を使用して発現レベルを設定することが望ましいときに好ましい場合がある。例えば、ＰＳＥ−ＴＲＥ、ＰＢ−ＴＲＥおよびｈＫＬＫ２−ＴＲＥからの転写活性が、本明細書中およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）に記載されるように、アンドロゲンによって誘導可能である。従って、本発明の１つの実施形態において、アデノウイルスベクターは誘導可能な異種ＴＲＥを含む。

本発明において使用されるようなＴＲＥは様々な形態で存在させることができる。ＴＲＥは多量体を含むことができる。例えば、ＴＲＥは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの標的細胞特異的ＴＲＥのタンデム列を含むことができる。このような多量体はまた、異種のプロモーター配列および／またはエンハンサー配列を含有することができる。

あるいは、ＴＲＥは１つまたは複数のプロモーター領域を１つまたは複数のエンハンサー領域と一緒に含むことができる。ＴＲＥ多量体はまた、異なる遺伝子に由来するプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を含むことができる。ＴＲＥのプロモーター成分およびエンハンサー成分は、所望する細胞特異的な転写活性が得られる限り、相互に関して任意の向きが可能であり、かつ、任意の配向および／または目的とするコード配列からの任意の距離が可能である。

本明細書中で使用される場合、特定の遺伝子に由来するＴＲＥは、そのＴＲＥが得られた遺伝子によって示され、その遺伝子を発現する宿主細胞における機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列である。例えば、本明細書中で使用される「ヒト腺様カリクレイン転写調節エレメント」または「ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ」は、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、さらに一層より好ましくは、ヒト細胞）（例えば、前立腺細胞など）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。従って、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥはアンドロゲン受容体の結合に対して応答性であり、ｈＫＬＫ２プロモーターおよび／またはｈＫＬＫ２エンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。ヒト腺様カリクレインエンハンサー、および、このエンハンサーを含むアデノウイルスベクターがＷＯ９９／０６５７６に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「プロバシン（ＰＢ）転写調節エレメント」または「ＰＢ−ＴＲＥ」は、ＰＢ−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、さらに一層より好ましくは、前立腺細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。従って、ＰＢ−ＴＲＥはアンドロゲン受容体の結合に対して応答性であり、ＰＢプロモーターおよび／またはＰＢエンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。アンドロゲンを発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターがＷＯ９８／３９４６６に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）転写調節エレメント」または「ＰＳＡ−ＴＲＥ」は、ＰＳＡ−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、さらに一層より好ましくは、前立腺細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。従って、ＰＳＡ−ＴＲＥはアンドロゲン受容体の結合に対して応答性であり、ＰＳＡプロモーターおよび／またはＰＳＡエンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。前立腺において活性な組織特異的エンハンサー、および、アデノウイルスベクターにおける使用がＷＯ９５／１９４３４およびＷＯ９７／０１３５８に記載される（これらはそれぞれが参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）転写調節エレメント」または「ＣＥＡ−ＴＲＥ」は、ＣＥＡ−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、ＣＥＡを発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、さらに一層より好ましくは、ヒト細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。従って、ＣＥＡ−ＴＲＥは、ＣＥＡ産生細胞に関連した転写因子および／または共因子に対して応答性であり、ＣＥＡのプロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。ガン胎児性抗原を発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターがＷＯ９８／３９４６７に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）転写調節エレメント」または「ＡＦＰ−ＴＲＥ」は、ＡＦＰ−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、ＡＦＰを発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、さらに一層より好ましくは、ヒト細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。ＡＦＰ−ＴＲＥは、ＡＦＰ産生細胞に関連した転写因子および／または共因子に対して応答性であり、ＡＦＰのプロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。α−フェトタンパク質を発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターがＷＯ９８／３９４６５に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「ムチン遺伝子（ＭＵＣ）転写調節エレメント」または「ＭＵＣ１−ＴＲＥ」は、ＭＵＣ１−ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、ＭＵＣ１を発現する細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、さらに一層より好ましくは、ヒト細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。ＭＵＣ１−ＴＲＥは、ＭＵＣ１産生細胞に関連した転写因子および／または共因子に対して応答性であり、ＭＵＣ１のプロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。

本明細書中で使用される「尿路上皮細胞特異的転写調節エレメント」または「尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ」は、尿路上皮特異的ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、すなわち、標的細胞における機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。様々な尿路上皮細胞特異的ＴＲＥが知られており、これらは、尿路上皮細胞に関連した細胞タンパク質（転写因子および／または共因子）に対して応答性であり、尿路上皮特異的プロモーターおよび／または尿路上皮特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。例示的な尿路上皮細胞特異的転写調節配列には、ヒトまたは齧歯類のウロプラキン（ＵＰ）（例えば、ＵＰＩ、ＵＰＩＩおよびＵＰＩＩＩなど）が含まれる。ヒトの尿路上皮細胞特異的ウロプラキン転写調節配列、および、この転写調節配列を含むアデノウイルスベクターがＷＯ０１／７２９９４に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。

本明細書中で使用される「メラノサイト細胞特異的転写調節エレメント」または「メラノサイト細胞特異的ＴＲＥ」は、メラノサイト細胞特異的ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、すなわち、標的細胞における機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。様々なメラノサイト細胞特異的ＴＲＥが知られており、これらは、メラノサイト細胞に関連した細胞タンパク質（転写因子および／または共因子）に対して応答性であり、メラノサイト特異的プロモーターおよび／またはメラノサイト特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。様々な方法が、メラノサイト細胞特異的ＴＲＥの活性を測定するために、および、従って、所与の細胞がメラノサイト細胞特異的ＴＲＥを機能させることができるかどうかを明らかにするために本明細書中に記載される。本発明を実施する際に使用されるメラノサイト特異的ＴＲＥの例には、チロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域に由来するＴＲＥ、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子の５’隣接領域に由来するＴＲＥ、チロシナーゼ関連タンパク質−２遺伝子の５’隣接領域に由来するＴＲＥ、ＭＡＲＴ−１遺伝子の５’隣接領域に由来するＴＲＥ、または、メラノーマにおいて異常に発現する遺伝子の５’隣接領域に由来するＴＲＥが含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結されたＰＲＬ−３遺伝子由来の転移性結腸ガン特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で使用される「ＰＲＬ−３遺伝子由来の転移性結腸ガン特異的ＴＲＥ」または「ＰＲＬ−３ＴＲＥ」は、ＰＲＬ−３ＴＲＥが機能することを可能にする宿主細胞、例えば、細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、さらに一層より好ましくは、転移性結腸ガン細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。転移性結腸ガン特異的ＴＲＥは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来し得る１つまたは複数の調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーターおよび転写因子結合部位など）を含むことができる。１つの好ましい態様において、ＰＲＬ−３ＴＲＥはＰＲＬ−３プロモーターを含む。ＰＲＬ−３プロテインチロシンホスファターゼ遺伝子が転移性結腸ガンにおいて高レベルで特異的に発現することが見出されている（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４：１３４３）。ＰＲＬ−３遺伝子は、転移性結腸ガンのライブラリーにおける一群のアップレギュレーションされた遺伝子の１つとして最初に特定され、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）によって特定されたが、原発性ガンまたは前悪性腺腫においてではなく、転移物だけにおいて上昇していることが確認された。ＰＲＬ−３転写調節配列を含む複製可能なアデノウイルスベクターがＷＯ２００４／００９７９０に記載される。関係した配列の例が、ＰＲＬ−３遺伝子についての翻訳開始コドンの上流側の０．６ｋｂ配列および１ｋｂ配列として示される（これらはＷＯ２００４／００９７９０において配列番号１および配列番号２として特定される）。

別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結されたＣＲＧ−Ｌ２遺伝子由来の肝臓ガン特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で使用される「ＣＲＧ−Ｌ２遺伝子由来の肝臓ガン特異的ＴＲＥ」または「ＣＲＧ−Ｌ２ＴＲＥ」は、ＣＲＧ−Ｌ２が機能することを可能にする宿主細胞、例えば、細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、さらに一層より好ましくは、肝細胞ガン細胞）などにおける機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）である。肝細胞ガン特異的ＴＲＥは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来し得る１つまたは複数の調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーターおよび転写因子結合部位など）を含むことができる。１つの好ましい態様において、ＣＲＧ−Ｌ２ＴＲＥは、ＣＲＧ−Ｌ２遺伝子についての翻訳開始コドンの上流側の０．８ｋｂ配列、または、その０．８ｋｂ配列に含有される０．７ｋｂ配列、または、米国仮特許出願第６０／５１１，８１２号（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）に記載されるように、その０．８ｋｂ配列に由来するＥｃｏＲＩ〜ＮｃｏＩフラグメントに由来し得る。

別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結されたＥＢＶ特異的な転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含むアデノウイルスベクターを提供する。１つの態様において、ＥＢＶ特異的ＴＲＥは、米国仮特許出願第６０／４２３，２０３号（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）においてさらに記載されるように、ＬＭＰ１遺伝子、ＬＭＰ２Ａ遺伝子またはＬＭＰ２Ｂ遺伝子についての翻訳開始コドンの上流側の配列に由来する。ＥＢＶ特異的ＴＲＥは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来し得る１つまたは複数の調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーターおよび転写因子結合部位など）を含むことができる。

さらに別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結された低酸素状態応答エレメント（「ＨＲＥ」）を含むアデノウイルスベクターを提供する。ＨＲＥは、転写複合体ＨＩＦ−１または低酸素状態誘導因子−１（これは、血管内皮細胞増殖因子をはじめとするいくつかの遺伝子、および、エノラーゼ−１をはじめとする解糖系酵素をコードするいくつかの遺伝子の調節領域と相互作用する）についての結合部位を含む転写調節エレメントである。従って、１つの実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＷＯ００／１５８２０（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）においてさらに記載されるように、細胞状態特異的なＴＲＥ（例えば、ＨＲＥなど）の転写制御下にアデノウイルス遺伝子（好ましくは、複製に不可欠なアデノウイルス遺伝子）を含む。

さらに別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結された「テロメラーゼプロモーター」または「ＴＥＲＴプロモーター」を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で使用される用語「テロメラーゼプロモーター」または用語「ＴＥＲＴプロモーター」は、天然のＴＥＲＴプロモーター、ならびに、その機能的なフラグメント、変異体および誘導体を示す。ＴＥＲＴプロモーターは全長または野生型のプロモーターである必要はない。当業者は、フラグメントをＴＥＲＴプロモーターから得て、そのフラグメントを所望の活性について試験する方法を理解している。本発明のＴＥＲＴプロモーターフラグメントは腫瘍細胞に対して選択的なプロモーター活性を有する。すなわち、本発明のＴＥＲＴプロモーターフラグメントは、機能的に連結されたコード配列の選択的な発現を行わせる。１つの実施形態において、本発明のＴＥＲＴプロモーターは哺乳動物ＴＥＲＴプロモーターである。別の実施形態において、哺乳動物ＴＥＲＴプロモーターはヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）プロモーターである。本発明の組成物および方法において有用性が見出される例示的なＴＥＲＴプロモーターについては、例えば、ＷＯ９８／１４５９３およびＷＯ００／４６３５５を参照のこと。

さらに別の態様において、本発明は、アデノウイルスの複製のために不可欠な遺伝子に、または、導入遺伝子に機能的に連結された「Ｅ２Ｆプロモーター」を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で使用される用語「Ｅ２Ｆプロモーター」は、天然のＥ２Ｆプロモーター、ならびに、その機能的なフラグメント、変異体および誘導体を示す。Ｅ２Ｆプロモーターは全長または野生型のプロモーターである必要はない。当業者は、フラグメントをＥ２Ｆプロモーターから得て、そのフラグメントを所望の活性について試験する方法を理解している。本発明のＥ２Ｆプロモーターフラグメントは腫瘍細胞に対して選択的なプロモーター活性を有する。すなわち、本発明のＥ２Ｆプロモーターフラグメントは、機能的に連結されたコード配列の選択的な発現を行わせる。本明細書中で使用される用語「腫瘍選択的プロモーター活性」は、腫瘍細胞における本発明のプロモーターフラグメントのプロモーター活性が非腫瘍細胞タイプの場合よりも大きいことを意味する。Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは少なくとも２つのＥ２Ｆ結合部位を有する。１つの実施形態において、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは哺乳動物Ｅ２Ｆプロモーターである。別の実施形態において、哺乳動物Ｅ２ＦプロモーターはヒトＥ２Ｆプロモーターである。例えば、Ｅ２ＦプロモーターはヒトＥ２Ｆ−１プロモーターであり得る。さらに、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターは、例えば、配列番号４３に記載されるような配列を有するＥ２Ｆ−１プロモーターであり得る。Ｅ２Ｆプロモーターの数多くの例がこの分野では知られている（例えば、Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１９９７：３（１０）１１４５−１１４９，ＷＯ０２／０６７８６１、米国特許出願公開第２００１００５３３５２号およびＷＯ９８／１３５０８）。Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは典型的には、そのＥ２Ｆ部位の近くにおけるＳｐＩ部位および／またはＡＴＴ７部位（これらは転写開始部位の近くに頻繁に位置する）、ならびに、認識可能なＴＡＴＡボックスを有しないことなどの共通する特徴を互いに有する。Ｅ２Ｆ応答性プロモーターには、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、ＤＮＡポリメラーゼＡ（ＤＰＡ）プロモーター、ｃ−ｍｙｃプロモーターおよびＢ−ｍｙｂプロモーターが含まれる。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、血清飢餓細胞において転写調節エレメントとして作用する４つのＥ２Ｆ部位を含有する。１つの実施形態において、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは少なくとも２つのＥ２Ｆ部位を有する。別の実施形態において、Ｅ２ＦプロモーターはアデノウイルスのＥ１ａ領域に機能的に連結される。さらなる実施形態において、Ｅ２ＦプロモーターはアデノウイルスのＥ１ｂ領域に機能的に連結される。さらにさらなる実施形態において、Ｅ２ＦプロモーターはアデノウイルスのＥ４領域に機能的に連結される。

本発明の１つの実施形態において、本発明の組換えウイルスベクターはＲｂ経路欠損細胞において選択的に複製し、Ｒｂ経路欠損細胞を溶解する。１つの実施形態において、本発明のＥ２Ｆプロモーターは哺乳動物Ｅ２Ｆプロモーターである。別の実施形態において、哺乳動物Ｅ２ＦプロモーターはヒトＥ２Ｆプロモーターであり、例えば、配列番号４３を含むか、または、配列番号４３から本質的にはなるヒトＥ２Ｆプロモーターである。本発明の実施形態には、下記の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＥ２Ｆプロモーターを含むアデノウイルスベクターが含まれる：（ａ）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列のフラグメントで、腫瘍選択的プロモーター活性を有するフラグメント；（ｃ）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の％同一性を有するヌクレオチド配列で、腫瘍選択的プロモーター活性を有するヌクレオチド配列；および（ｄ）配列番号４３に示される配列に対してストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする全長の相補体を有するヌクレオチド配列で、腫瘍選択的プロモーター活性を有するヌクレオチド配列。本発明の別の実施形態において、Ｅ２Ｆプロモーターは配列番号４３のヌクレオチド７〜ヌクレオチド２７０を含む。本発明の別の実施形態において、Ｅ２Ｆプロモーターは、配列番号４３のヌクレオチド７５がＣの代わりにＴである配列番号４３のヌクレオチド７〜ヌクレオチド２７０を含む。

他の実施形態において、本発明によるＥ２Ｆプロモーターは、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または、目視検査によって測定されるように、最大の一致について比較およびアラインメントされたとき、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。１つの実施形態において、示された％配列同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドである、配列の一部の領域にわたって存在する。別の実施形態において、示された％配列同一性は、長さが少なくとも約１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。別の実施形態において、示された％配列同一性は、長さが少なくとも約２００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。別の実施形態において、示された％配列同一性は配列の全長にわたって存在する。

Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは全長または野生型のプロモーターである必要はなく、しかし、少なくとも３倍の腫瘍選択性、少なくとも５倍の腫瘍選択性、少なくとも１０倍の腫瘍選択性、少なくとも２０倍の腫瘍選択性、少なくとも３０倍の腫瘍選択性、少なくとも５０倍の腫瘍選択性、少なくとも１００倍の腫瘍選択性、または、少なくとも３００倍の腫瘍選択性さえも有するはずである。腫瘍選択性は、知られている技術を使用する数多くのアッセイによって、例えば、ＷＯ０２／０６７８６１の実施例４において用いられる技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、または、選択された細胞タイプにおける複製の比較などによって明らかにすることができる。

理論によって拘束されないが、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（以降、Ｅ２Ｆプロモーターとして示されることがある）の選択性は、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞におけるＥ２Ｆプロモーター／トランス活性化因子の抑制に基づくことが報告されている。休止細胞において、Ｅ２Ｆは三成分複合体で腫瘍抑制因子タンパク質ｐＲＢに結合する。

タンパク質のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、および、その細胞表面受容体であるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）が、最も頻繁に出現する新生物の多くで発現しており、ガン転移における重要なタンパク質であるようである。両方のタンパク質は、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、肺ガンおよび卵巣ガンにおいて関係している。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの転写を調節する配列エレメントが広範囲に研究されている（Ｒｉｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２７５９−２７７１；Ｃａｎｎｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２３０３−２３０８；ＷＯ９８／３９４６４もまた参照のこと）。

（不可欠なＡｄコード領域に機能的に連結される異種ＴＲＥ）
初期遺伝子の操作のために、Ａｄ５のＥ１Ａの転写開始部位がウイルスゲノムにおいて４９８位に存在し、Ｅ１ＡコードセグメントのＡＴＧ開始部位が５６０位に存在する。この領域を、異種のＴＲＥを挿入するために使用することができる。図１はＡｄ５の生来的なゲノム構成を示し、図２は生来的なＡｄ５転写ユニットを示す。

制限部位を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって導入することができ、この場合、用いられるプライマーはＡｄ５ゲノムに限定され得るか、または、Ａｄ５のゲノムＤＮＡを有するプラスミドの一部分を伴い得る。例えば、ｐＢＲ３２２が使用される場合、プライマーはｐＢＲ３２２骨格内のＥｃｏＲＩ部位およびＡｄ５のｎｔ１３３９でのＸｂａＩ部位を使用することができる。ＰＣＲを、領域の中心部における重なるプライマーにより、１つしか存在しない制限部位をもたらすヌクレオチド配列変化が導入される２工程で行うことによって、その部位における異種ＴＲＥの挿入がもたらされ得る。

類似する方法もまた、異種のＴＲＥエレメントをＥ１Ｂに対する機能的な連結で挿入するために使用することができる。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは、Ｓｐ１についての１つだけの高親和性の認識部位と、ＴＡＴＡボックスとからなる。この領域はＡｄ５のｎｔ１６３６からｎｔ１７０１まで及ぶ。細胞特異的な異種ＴＲＥをこの領域に挿入することによって、Ｅ１Ｂ遺伝子の細胞特異的な転写がもたらされ得る。Ｅ１Ａを調節する細胞特異的な応答エレメントにより改変された左側領域を、Ｅ１Ｂを調節するために異種のＴＲＥを導入するためのテンプレートとして用いることによって、得られるアデノウイルスベクターは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの両方の発現のための細胞特異的な転写因子に対して依存性となる。一部の実施形態では、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域の一部またはすべてが欠失される。

同様に、異種のＴＲＥを、その発現を細胞特異的にするためにＥ２遺伝子の上流側に挿入することができる。Ｅ２初期プロモーターはＡｄ５において約２７０５０〜２７１５０に位置しており、主転写開始部位および副転写開始部位（後者はＥ２転写物の約５％を占める）、２つの非正統的ＴＡＴＡボックス、２つのＥ２Ｆ転写因子結合部位、ならびに、ＡＴＦ転写因子結合部位からなる（Ｅ２プロモーターの構造の詳細な総説については、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１９９（ｐａｒｔ ３）：１７７−１９４を参照のこと）。

Ｅ２後期プロモーターは、反対鎖によってコードされる遺伝子のコード配列と重なっており、従って、遺伝子操作のために使用できない。しかしながら、Ｅ２初期プロモーターは、反対鎖上の３３ｋＤタンパク質をコードする配列とほんの数塩基対にわたって重なるだけである。特筆すべきことに、ＳｐｅＩ制限部位（Ａｄ５の２７０８２位）は上記３３ｋＤタンパク質についての停止コドンの一部であり、主Ｅ２初期転写開始部位およびＴＡＴＡ結合タンパク質部位を上流側の転写因子結合部位（Ｅ２ＦおよびＡＴＦ）から都合良く分離する。従って、ＳｐｅＩ末端を有する異種ＴＲＥのＳｐｅＩ部位への挿入はＡｄ５の内因性のＥ２初期プロモーターを破壊することになり、また、Ｅ２転写物の細胞特異的な発現を可能にするはずである。Ｅ４については、アデノウイルスゲノムの右側部分を使用しなければならない。Ｅ４転写開始部位がＡｄ５については主としておよそｎｔ３５６０５にあり、ＴＡＴＡボックスがおよそｎｔ３５６３１にあり、ＯＲＦＩの最初のＡＵＧ／ＣＵＧがおよそｎｔ３５５３２にある。Ｖｉｒｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：８２２−８３１。上記方針のいずれかをそれ以外の遺伝子のために使用して、異種のＴＲＥを転写開始部位の上流側に導入することができる。異種のＴＲＥがＥ４領域に挿入された全長型アデノウイルスを構築するために、同時トランスフェクションおよび相同的組換えを、これらのタンパク質の合成における欠陥を補うためにＥ４のタンパク質をトランス作用で提供するＷ１６２細胞において行うことができる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：５３８３−５３８６）。

「Ｅ３領域」（これは「Ｅ３」と交換可能に使用される）は、この分野では十分に理解されている用語であり、Ｅ３遺伝子産物をコードするアデノウイルスゲノムの領域を意味する。Ｅ３領域は、例えば、Ｗｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９：２３７−２７４をはじめとする様々な刊行物に記載されている。Ｅ３領域の「部分」は、全体でないＥ３領域を意味し、そのため、ポリヌクレオチド欠失、ならびに、Ｅ３領域の１つまたは複数のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドを包含する。図６、図７および図８を参照のこと。

Ｅ３領域を含有するアデノウイルス構築物を作製することができ、この場合、Ｅ３含有アデノウイルスプラスミド（例えば、ＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ））と、Ｅ３非含有アデノウイルスプラスミドとの間での相同的組換えが行われる。

あるいは、Ｅ３領域を含むアデノウイルスベクターを、Ｅ３領域を含有するアデノウイルスを生じさせるために相同的組換えを受けることができるアデノウイルス構築物またはアデノウイルスプラスミド構築物と一緒に細胞（例えば、２９３細胞）に導入することができる。この場合、Ｅ３含有アデノウイルスベクターおよびアデノウイルス構築物またはアデノウイルスプラスミド構築物はアデノウイルスの相補的領域を含有する。例えば、相同的組換えを可能にするような十分な配列重なりを伴って、１つが左側領域を含有し、他方が右側領域を含有する。

あるいは、本発明のＥ３含有アデノウイルスベクターは、標準的な組換え方法（例えば、制限ヌクレアーゼおよび／またはＰＣＲを使用する方法）、化学合成、または、これらのいずれかの組合せを含む他の従来の方法を使用して構築することができる。さらに、Ｅ３領域の様々な部分の欠失体を、分子生物学の標準的な技術を使用して作製することができる。

一部の実施形態では、Ｅ３領域内にコードされるアデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）がアデノウイルスベクターにおいて維持される。ＡＤＰ遺伝子（これは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある）は、宿主細胞の溶解を促進させることにおいて重要であるタンパク質（ＡＤＰ）をコードするようである。Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（４）：２２９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（６）：３６３３。従って、ＡＤＰ遺伝子を含有するアデノウイルスベクターはアデノウイルスベクターをより強力にし、これにより、より効果的な処置および／またはより少ない投薬量要求を可能にし得る。

従って、１つの実施形態において、本発明は、アデノウイルス遺伝子が第１のＴＲＥの転写制御下にあり、ＡＤＰをコードするポリヌクレオチド配列が第２のＴＲＥエレメントの制御下にあり、かつ、好ましくは、前記アデノウイルス遺伝子が複製のために不可欠であるアデノウイルスベクターを提供する。ＡＤＰをコードするＤＮＡ配列およびＡＤＰのアミノ酸配列を公に入手することができる。簡単に記載すると、ＡＤＰコード配列が、この分野で知られている技術（例えば、ＰＣＲなど）を使用してＡｄから得られる。好ましくは、Ｙリーダー（これは、後期遺伝子を正しく発現させるための重要な配列である）もまた得られ、ＡＤＰコード配列に連結される。その後、ＡＤＰコード配列（Ｙリーダーを伴う配列、または、Ｙリーダーを伴わない配列）を、例えば、（ＡＤＰコード配列がＭＬＰによって駆動される）Ｅ３領域において、アデノウイルスゲノムに導入することができる。ＡＤＰコード配列はまた、アデノウイルスゲノムの他の場所（例えば、Ｅ４領域など）に挿入することができる。あるいは、ＡＤＰコード配列を、別のウイルスＴＲＥ（これに限定されない）をはじめとする異なるタイプのＴＲＥに機能的に連結することができる。１つの実施形態において、本発明のベクターは、その生来的なＴＲＥに機能的に連結されたＡＤＰを有した。

（内部リボソーム進入部位）
２つ以上のタンパク質を１つのウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターから発現させるために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が、第２の遺伝子、第３の遺伝子、第４の遺伝子などの発現を行わせるために一般に使用される。本発明のアデノウイルスベクターは、２つ以上のコード配列の翻訳をつなぐ１つまたは複数の遺伝子間ＩＲＥＳエレメントを含むことができる。２つのアデノウイルスコード領域をつなぐＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターは安定であり、ＩＲＥＳを含有しないベクターよりも良好な特異性を提供することができる。第２のＴＲＥではなく、遺伝子間ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターは、さらなる遺伝子（例えば、治療的遺伝子）を含むためのベクター内のさらなる空間を提供することができる。ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターの例が米国特許第６，６９２，７３６号に記載される（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）。本発明の１つの態様において、ウイルスベクターは少なくとも１つのＩＲＥＳを多シストロン転写物内に含み、この場合、多シストロン転写物の産生が、異種の細胞タイプ特異的ＴＲＥ、組織タイプ特異的ＴＲＥまたは細胞状態特異的ＴＲＥによって調節される。第２のアデノウイルスコード領域をＩＲＥＳの制御下に含むアデノウイルスベクターについては、ＩＲＥＳの翻訳制御下にあるコード領域の内因性プロモーターを、内因性プロモーターが第２のコード領域の転写を妨害しないように欠失することが好ましい。第２のコード領域は、ＩＲＥＳが開始コドンを含有するならば、ＩＲＥＳと読み枠が一致していることが好ましい。開始コドン（例えば、ＡＴＧなど）がＩＲＥＳに存在するならば、第２のコード配列の開始コドンが除かれ、かつ、ＩＲＥＳおよび第２のコード配列は読み枠が一致していることが好ましい。あるいは、ＩＲＥＳが開始コドンを含有しない場合、または、開始コドンがＩＲＥＳから除かれる場合、第２のコード領域の開始コドンが使用される。１つの実施形態において、アデノウイルスベクターはアデノウイルスの不可欠な遺伝子（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）を異種ＴＲＥの転写制御下に含み、ＩＲＥＳがＥ１ＡとＥ１Ｂとの間に挿入される。従って、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂはともに共通の転写制御を受け、Ｅ１Ｂコード領域の翻訳がＩＲＥＳの存在によって得られる。１つの実施形態において、Ｅ１Ａはその内因性プロモーターが欠失される。別の実施形態において、Ｅ１Ａは内因性エンハンサーが欠失され、さらにさらなる実施形態において、Ｅ１Ａはその内因性プロモーターが欠失され、かつ、Ｅ１Ａエンハンサーが欠失される。別の実施形態において、Ｅ１Ｂはその内因性プロモーターが欠失される。さらにさらなる実施形態において、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域の一部またはすべての欠失を有する。

ＩＲＥＳのベクター内への挿入が、制限酵素消化、連結およびＰＣＲ（これらに限定されない）を含む、この分野で知られて、また、本明細書中上記に記載される様々な方法および技術によって達成される。ＩＲＥＳのＤＮＡコピーを、化学合成によって、または、例えば、ピコルナウイルスのＩＲＥＳのｃＤＮＡコピーを作製することによって得ることができる。例えば、ＥＭＣＶのＩＲＥＳの記載については、Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（３）：１６０２−９を参照のこと。ＶＥＧＦのＩＲＥＳの記載については、Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−９０を参照のこと。内部翻訳開始配列が、多シストロンｍＲＮＡにおける５’遠位側コード領域の上流側に位置するような部位においてベクターゲノムに挿入される。例えば、二シストロンのＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ ｍＲＮＡの産生が異種ＴＲＥの制御下にあるアデノウイルスベクターの１つの実施形態において、Ｅ１Ｂプロモーターが欠失または不活性化され、ＩＲＥＳ配列がＥ１ＡとＥ１Ｂとの間に設置される。他の実施形態において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域の一部またはすべてが欠失される。カルジオウイルスおよびある種のアフトウイルスのＩＲＥＳ配列は、リボゾーム進入部位および翻訳開始部位の両方として役立つＡＵＧコドンをＩＲＥＳの３’末端に含有する。従って、このタイプのＩＲＥＳは、ＩＲＥＳによってその翻訳が調節されるタンパク質の翻訳開始コドンの代わりに使用されるようにベクターに導入される。しかしながら、エンテロウイルス／ライノウイルスの種類のＩＲＥＳでは、ＩＲＥＳの３’末端におけるＡＵＧがリボゾーム進入のために使用されるだけであり、翻訳はその次の下流側のＡＵＧコドンから開始される。従って、エンテロウイルス／ライノウイルスのＩＲＥＳが下流側のコード領域の翻訳調節のためにベクターにおいて使用されるならば、下流側の遺伝子のＡＵＧ（または他の翻訳開始コドン）はベクター構築物において保持される。

別の実施形態において、ＩＲＥＳが、ポリＡシグナルのすぐ上流側に存在しないアデノウイルスＣＤＳの下流側に挿入された導入遺伝子に機能的に連結される。例えば、ＩＲＥＳ導入遺伝子はリーダー配列内の最も下流側のＡｄ ＣＤＳの後には挿入されない。例えば、ＩＲＥＳ導入遺伝子カセットが下記のＡｄ ＣＤＳの１つ（５２／５５Ｋ、ｐＶ、ペントン、ｐＶＩまたはヘキソン）に機能的に連結される。

多数のコード配列を、ＩＲＥＳを用いてつなぐことができる。１つの実施形態において、ＡｄのＣＤＳが第１の導入遺伝子に対する第１のＩＲＥＳによって機能的に連結され、前記第１の導入遺伝子は第２の導入遺伝子に対する第２のＩＲＥＳによって機能的に連結される。１つの実施形態において、第１および第２の導入遺伝子は同じタンパク質または異なるタンパク質をコードする。同じタンパク質の場合、導入遺伝子のうちの１つのコード配列が「再コード化」されることが好都合である。すなわち、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンが使用される。これは、ＤＮＡレベルでの２つの導入遺伝子の間における相同性の量を低下させ、従って、２つの導入遺伝子の間での相同的組換えを低下または除去するために行われる。他の実施形態には、ＩＲＥＳによって機能的に連結された２つのアデノウイルスＣＤＳが含まれる。これには、アデノウイルスＤＮＡ配列の欠失が伴う場合がある。例えば、同じリーダー領域に位置し、互いに隣接する２つのアデノウイルスＣＤＳをＩＲＥＳによって機能的に連結することができ、かつ、欠失がウイルスベクターの産生のために必要な他の配列またはエレメントを破壊しない限り、相補鎖に特に留意して、間に存在するＡｄ配列の一部またはすべてを欠失することができる。欠失部分は、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチド（ｎｔ）、６ｎｔ〜１５ｎｔ、１６ｎｔ〜２５ｎｔ、２６ｎｔ〜３５ｎｔ、３６ｎｔ〜４０ｎｔまたは４０ｎｔ超であり得る。１つの実施形態において、第１の導入遺伝子ＣＤＳが、Ａｄ ＣＤＳに対する第１のＩＲＥＳによって機能的に連結され、第２のＩＲＥＳが、前記Ａｄ ＣＤＳに対する第２の導入遺伝子を機能的に連結する。他の実施形態には、Ａｄ ＣＤＳの様々な組合せ、ならびに、ＩＲＥＳおよび／または自己プロセシング切断配列に機能的に連結されたＡｄ ＣＤＳおよび導入遺伝子ＣＤＳの両方が含まれる。

多数のＩＲＥＳ配列をベクターにおいて使用するとき、２つのＩＲＥＳ配列は、相同的組換えの頻度を低下させるために、ＤＮＡレベルでの相同性最小限であるか、または、全くないことが好ましい。

（自己プロセシング切断部位または自己プロセシング切断配列）
本発明の別の態様において、「自己プロセシング切断部位」（例えば、２Ａ様配列）が、２つのポリペプチドを１つのｍＲＮＡから発現させるために利用される。「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、翻訳されたとき、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断が生じて、異なった成熟型のタンパク質産物またはポリペプチド産物の発現をもたらすＤＮＡ配列またはアミノ酸配列として定義される。そのような「自己プロセシング切断部位」はまた、翻訳後プロセシング切断部位または翻訳時プロセシング切断部位（本明細書中では、２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインによって例示される）と呼ばれることがある。本明細書中で使用される「自己プロセシングペプチド」は、翻訳されたとき、自己プロセシング切断部位を含むタンパク質またはポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断を媒介して、異なった成熟型のタンパク質産物またはポリペプチド産物をもたらす、自己プロセシング切断部位または自己プロセシング切断配列をコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物として本明細書中では定義される。２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインは、エステル連結の加水分解を促進し、それにより、異なった下流側の翻訳産物の合成が進行することを可能にする様式でポリペプチドを翻訳複合体から放出するためにリボソームの活性を調節することによって、翻訳作用を明らかにすることが報告されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｍａｙ；８２（Ｐｔ ５）：１０１３−２５）。あるいは、２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインは、それ自身のＣ末端をシス作用で切断して、一次切断産物を生じさせることによって、「自己タンパク質分解」または「切断」を明らかにすることもまた報告されている（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。

機構は本発明の一部ではないが、２Ａ様配列の活性は、ペプチド結合の形成を妨げるコドン間でのリボソーム跳躍を伴う場合がある（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１９２１−１９３１（２０００）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｍａｙ；８２（Ｐｔ ５）：１０２７−４１）；Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５８９−５９４ ａｎｄ ７６０（２００４））。だが、このドメインがより自己分解酵素らしく作用することが考えられている（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．１７３：３５−４５（１９８９））。口蹄疫病ウイルス（ＦＭＤＶ）の２Ａコード領域が発現ベクターにクローン化され、標的細胞にトランスフェクションされた研究において、人工的なレポーターポリタンパク質の、ＦＭＤＶの２Ａによる切断が、コムギ胚芽溶解物およびトランスジェニックタバコ植物（Ｈａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，８４６，７６７号、１９９８；Ｈａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ １７：４５３−４５９，１９９９）；Ｈｓ６８３ヒト神経膠腫細胞株（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８−２０８，１９９９）（以降、「ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ＩＩ」として示される）；ウサギ網状赤血球溶解物およびヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：９２８−９３３（１９９４））；ならびに昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７０３−１７１１，１９９０）において示された。異種ポリタンパク質の、ＦＭＤＶの２Ａにより媒介される切断が、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ３５のヘテロ二量体；Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９：２３５−２４１，１９９９）について示されている。この参考文献では、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞において、ＦＭＤＶの２Ａが、ＩＬ−１２に関連した活性を有する生物学的に機能的なサブユニット（ｐ４０およびｐ３５）へのｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質の切断を媒介したことが明らかにされている。

ＦＭＤＶの２Ａ配列が、二シストロンベクター、三シストロンベクターおよび四シストロンベクターを構築するために、単独で、または、種々のＩＲＥＳ配列との組合せでレトロウイルスに組み込まれている。動物における２Ａ媒介の遺伝子発現の効率が、ＦＭＤＶの２Ａ配列を介してつながれたａ−シヌクレインおよびＥＧＦＰまたはＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）およびＥＧＦＰをコードする組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１ Ｊｕｎ；８（１１）：８６４−７３）によって明らかにされた。ＥＧＦＰおよびａ−シヌクレインが、対応するＩＲＥＳ型ベクターと比較して、２Ａ配列を含むベクターから実質的に高いレベルで発現され、一方、ＳＯＤ−１が匹敵するレベルまたはわずかに大きいレベルで発現された。Ｆｕｒｌｅｒはまた、２Ａ配列が、２Ａ含有ＡＡＶベクターをラットの黒質に注入した後、インビボでの二シストロン遺伝子の発現をもたらすことを明らかにした。Ｓｙｚｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５８９−５９４＆７６０（２００４））は、４つのコード領域が３つの２Ａ配列を用いてつながれたレトロウイルスベクターを記載する。

本発明のために、自己プロセシング切断部位をコードするＤＮＡ配列が、エンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルスまたは口蹄疫病ウイルス（ＦＭＤＶ）（これらに限定されない）をはじめとするピコルナウイルスに由来するウイルス配列によって例示される。好ましい実施形態において、自己プロセシング切断部位をコードする配列はＦＭＤＶに由来する。自己プロセシング切断部位には、２Ａおよび２Ａ様の部位、配列またはドメイン（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１））が含まれるが、これらに限定されない。

ＦＭＤＶの２Ａはポリタンパク質領域であり、これは、それ自身のＣ末端での１回の切断を行うようにＦＭＤＶゲノムにおいて機能する（従って、シス作用で機能する）。ＦＭＤＶの２Ａドメインは典型的には、長さが約１９アミノ酸であることが報告されている：（（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２（１９９１））。しかしながら、１４アミノ酸残基もの小さいオリゴペプチド（（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３））もまた、生来的なＦＭＤＶポリタンパク質プロセシングにおけるその役割と類似した様式で２ＡのＣ末端での切断を媒介することが示されている。２Ａ配列の様々な変化が、ポリタンパク質の効率的なプロセシングを媒介するそれらの能力について研究されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１））。様々な相同体および変化型２Ａ配列が本発明の範囲に含まれ、これらには、配列番号１〜３２として示される配列が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、本発明によるベクターに含まれるＦＭＤＶの２Ａ配列は、配列番号１として示される配列を含むアミノ酸残基をコードする。あるいは、本発明によるベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１）において議論されるような他の２Ａ領域についてのアミノ酸残基をコードする場合があり、これらには、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列または細菌（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）に由来する２Ａ様ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

本発明では、自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａポリペプチドまたは２Ａ様ポリペプチドなど）をコードする核酸配列変化体、および、親（生来的）ヌクレオチドのコドンに対してアミノ酸の１つまたは複数について異なるコドンを有する核酸コード配列の使用が意図される。そのような変化体は本発明によって特に意図および包含される。自己プロセシング切断ペプチドおよび自己プロセシングポリペプチドの様々な配列変化体が同様に本発明の範囲に含まれる。

本発明によれば、自己プロセシング切断ペプチドをコードする配列変化体、および、生来的配列に対する配列同一性が８０％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である自己プロセシングポリペプチドそのものもまた包含される。

本発明の１つの実施形態において、自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列）がアデノウイルスタンパク質コード領域および導入遺伝子に機能的に連結される。アデノウイルスタンパク質ＣＤＳを自己プロセシング切断部位の上流側に存在させ、導入遺伝子を下流側に存在させることができる。あるいは、導入遺伝子ＣＤＳを自己プロセシング切断部位の上流側に存在させ、アデノウイルスタンパク質ＣＤＳを下流側に存在させることができる。

多数のＣＤＳを、自己プロセシング切断部位を用いてつなぐことができる。１つの実施形態において、Ａｄ ＣＤＳが第１の導入遺伝子に対する自己プロセシング切断部位によって機能的に連結され、前記第１の導入遺伝子が第２の導入遺伝子に対する自己プロセシング切断部位によって機能的に連結される。１つの実施形態において、第１および第２の導入遺伝子は同じタンパク質または異なるタンパク質をコードする。同じタンパク質の場合、導入遺伝子のうちの１つのコード配列が「再コード化」されることが好都合である。すなわち、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンが使用される。これは、ＤＮＡレベルでの２つの導入遺伝子の間における相同性の量を低下させ、従って、２つの導入遺伝子の間での相同的組換えを低下または除去するために行われる。他の実施形態には、自己プロセシング切断部位によって機能的に連結された２つのＡｄ ＣＤＳが含まれる。これには、アデノウイルスＤＮＡ配列の欠失が伴う場合がある。例えば、同じリーダー領域に位置し、互いに隣接する２つのアデノウイルスＣＤＳを自己プロセシング切断部位によって機能的に連結することができ、かつ、欠失がウイルスベクターの産生のために必要な他の配列またはエレメントを破壊しない限り、相補鎖に特に留意して、間に存在するＡｄ配列の一部またはすべてを欠失することができる。欠失部分は、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチド（ｎｔ）、６ｎｔ〜１５ｎｔ、１６ｎｔ〜２５ｎｔ、２６ｎｔ〜３５ｎｔ、３６ｎｔ〜４０ｎｔまたは４０ｎｔ超であり得る。

１つの実施形態において、第１の導入遺伝子ＣＤＳが、Ａｄ ＣＤＳに対する第１の自己プロセシング切断部位によって機能的に連結され、前記Ａｄ ＣＤＳは、第２の導入遺伝子に対する第２の自己プロセシング切断部位によって機能的に連結される。他の実施形態には、Ａｄ ＣＤＳの様々な組合せ、ならびに、ＩＲＥＳおよび／または自己プロセシング切断配列により機能的に連結されたＡｄ ＣＤＳおよび導入遺伝子ＣＤＳの両方が含まれる。

２つ以上の自己プロセシング切断部位をベクターにおいて使用するとき、自己プロセシング切断部位は、相同的組換えの頻度を低下させるために、ＤＮＡレベルでの相同性最小限であるか、または、全くないことが好ましい。例えば、自己プロセシングペプチド配列は種々の起源に由来することができ、この場合、自己プロセシングペプチド配列についての多数のコード配列は最小限の相同性を有するか、または、相同性を全く有しない。他の実施形態において、自己プロセシングペプチド配列についてのコード配列が再コード化される。すなわち、異なるコドンが、自己プロセシングペプチド配列の同じアミノ酸をコードするために使用される。これは、２つ以上の自己プロセシングペプチドコード配列の間における相同性の量を低下させ、従って、２つの導入遺伝子の間での相同的組換えを低下または除去するために行われる。

自己プロセシングペプチド配列は、自己プロセシングペプチド配列をコードする配列が上流側ＣＤＳおよび下流側ＣＤＳと読み枠が一致して挿入されるとき、ＣＤＳに機能的に連結される。

（自己プロセシングペプチド配列の除去）
自己プロセシングペプチド（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列など）の使用に関連する１つの懸念は、発現したポリペプチドのＣ末端が、自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸（すなわち、２Ａ由来のアミノ酸残基）を含有することである。これらのアミノ酸残基は宿主にとって「外来」であり、組換えタンパク質がインビボで発現されるか、あるいは、インビトロ発現またはエクスビボ発現の後でインビボに送達されるときには免疫応答を誘発する場合がある。加えて、除かれないならば、自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸残基がタンパク質の機能を妨害し、かつ／または、タンパク質の立体配座を変化させ、その結果、組換えタンパク質の最適でない発現レベルおよび／または低下した生物学的活性をもたらす場合がある。すなわち、適用に依存して、生じたタンパク質が２Ａ由来のアミノ酸残基のすべてを含有しないことが好都合である場合がある。

本発明は、さらなるタンパク質分解的切断部位が、発現したタンパク質産物に存在する自己プロセシング切断部位由来のアミノ酸残基を除去するための手段として、第１のタンパク質コード配列またはポリペプチドコード配列（第１または５’側のＯＲＦ）と、自己プロセシング切断部位との間に提供されるように操作されたベクターを包含する。

さらなるタンパク質分解的切断部位の例が、内因性のズブチリシン様プロテアーゼ（例えば、フリンおよび他のセリンプロテアーゼなど）によって切断され得るコンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号３３）を有するフリン切断部位である。米国特許出願第１０／８３１３０４号の実施例６において示されるように、本発明者らは、第１の発現タンパク質のＣ末端における自己プロセシング性２Ａのアミノ酸残基が、フリン切断部位ＲＡＫＲ（配列番号６３）を第１のポリペプチドと自己プロセシング性２Ａ配列との間に導入することによって効率的に除かれ得ることを明らかにしている。加えて、２Ａ配列と、２Ａ配列に隣接するフリン切断部位とを含有するプラスミドの使用は、２Ａ配列だけを含有するプラスミドを使用して達成されるよりも高レベルのタンパク質発現をもたらしている。この改善は、米国特許出願第１０／８３１３０４号（これは参考として本明細書中に特に組み込まれる）に記載されるように、２Ａのアミノ酸残基がタンパク質のＣ末端から除かれたとき、より長い２Ａ配列もしくは２Ａ様配列または他の自己プロセシング配列が使用できるという点でさらなる利点を提供する。

本明細書中に詳述されるように、２Ａペプチド配列は、翻訳プロセス時における免疫グロブリンの両方の鎖または他のタンパク質の生成を容易にする「切断」部位を提供する。１つの例示的な実施形態において、第１のタンパク質（例えば、免疫グロブリン重鎖）のＣ末端は、２Ａ配列そのものに由来する約１３個のアミノ酸残基を含有する。残留アミノ酸の数は、使用された２Ａ配列に依存する。上記に示され、また、実施例において示されるように、フリン切断部位配列（例えば、ＲＡＫＲ（配列番号６３））が第１のタンパク質と２Ａ配列との間に挿入されているとき、２Ａの残基が第１のタンパク質のＣ末端から除かれる。しかしながら、質量分析のデータは、ＲＡＫＲ−２Ａ（配列番号６３として開示されるＲＡＫＲ）構築物から発現した第１のタンパク質のＣ末端が、フリン切断部位ＲＡＫＲ（配列番号６３）に由来する２つのさらなるアミノ酸残基（ＲＡ）を含有することを示す。

１つの実施形態において、本発明は、これらの残留アミノ酸を除去するための方法、および、これらの残留アミノ酸を発現させるための組成物を提供する。これらのさらなるアミノ酸をタンパク質のＣ末端から除去することをもたらす数多くの新規な構築物が設計されている。フリンによる切断が、コンセンサス配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒ（配列番号３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を有する切断部位のＣ末端で生じる。１つの態様において、本発明は、新たに露出した塩基性アミノ酸残基（ＲまたはＫ）を、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）と呼ばれる一群の酵素（これには、カルボキシペプチダーゼＤ、ＥおよびＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）が含まれるが、これらに限定されない）から選択される酵素の使用によってタンパク質のＣ末端から除去するための手段を提供する。ＣＰはタンパク質のＣ末端における塩基性アミノ酸残基を除くことができるので、もっぱら塩基性アミノ酸（ＲまたはＫ）を含有するフリン切断部位（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号６４）、ＲＫＲＲ（配列番号６５）、ＲＲＲＲ（配列番号６７）など）に由来するすべてのアミノ酸残基をＣＰによって除くことができる。２Ａ配列およびフリン切断部位を含有し、かつ、塩基性アミノ酸残基をＣ末端において有する一連の免疫グロブリン発現構築物が、切断および残基除去の効率を評価するために構築されている。例示的な構築物設計は下記の通りである：Ｈ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号６４）、ＲＫＲＲ（配列番号６５）、ＲＲＫＲ（配列番号６６）またはＲＲＲＲ（配列番号６７））−２Ａ−Ｌ鎖またはＬ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号６４）、ＲＫＲＲ（配列番号６５）、ＲＲＫＲ（配列番号６６）またはＲＲＲＲ（配列番号６７））−２Ａ−Ｈ鎖。

当業者には明らかであるように、塩基性アミノ酸残基（Ｋ）が免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）のＣ末端に存在し（これにより、免疫グロブリン重鎖はカルボキシペプチダーゼによる切断を受けやすくなっている）、一方、免疫グロブリン軽鎖（Ｌ鎖）は非塩基性アミノ酸のＣで終わっている。本発明の１つの好ましい実施形態において、フリン部位および２Ａ配列を含む抗体発現構築物が提供され、この場合、免疫グロブリンＬ鎖は、翻訳後、さらなるフリンアミノ酸残基がカルボキシペプチダーゼにより切断されるように免疫グロブリンＨ鎖の５’側に存在する。

完全にヒト型の特徴を有する治療用のタンパク質、ポリペプチド、そのフラグメントまたはアナログを産生することは多くの場合に好都合である。これらの試薬は、異なる種に起源を有するタンパク質、ポリペプチド、そのフラグメントまたはアナログによって誘導される望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸残基に対する可能性のある宿主免疫応答に対処するために、タンパク質分解的切断部位についてのコード配列を、自己プロセシングペプチド配列を発現したタンパク質またはポリペプチドから除くように、第１のタンパク質についてのコード配列と、自己プロセシングペプチドについてのコード配列との間に（この分野で知られている標準的な方法論を使用して）挿入することができる。

組換えＤＮＡ技術を使用して発現させることができるこの分野で知られている任意のさらなるタンパク質分解的切断部位を、本発明を実施する際に用いることができる。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列と、自己プロセシング切断配列との間に挿入することができる例示的なさらなるタンパク質分解的切断部位には、下記が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）フリンのコンセンサス配列またはコンセンサス部位：ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号３３）；
ｂ）第Ｘａ因子の切断配列または切断部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号３４）；
ｃ）シグナルペプチダーゼＩの切断配列または切断部位：例えば、ＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号３５）；
および
ｄ）トロンビンの切断配列または切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号３６）。
ｅ）アデノウイルスのコンセンサスなプロテアーゼ配列またはプロテアーゼ部位（Ｍ，Ｌ，Ｉ）ＸＧＧ／Ｘ（配列番号３７）および（Ｍ，Ｌ，Ｉ）ＸＧＸ／Ｇ（配列番号３８）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、７０：３２１５−３２２３（１９８９）；Ｗｅｂｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９１：２２７−２３５（１９９５）およびＢａｌａｋｉｒｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ７６：６３２３−６３３１（２００２）を参照のこと。

アデノウイルスのプロテアーゼ配列またはプロテアーゼ部位の場合、本発明は、上記に示されたコンセンサスな配列に限定されることは意図されない。本発明では、任意のアデノウイルスプロテアーゼの使用が意図される。１つの実施形態において、アデノウイルスプロテアーゼは、アデノウイルスベクターゲノムが由来するのと同じアデノウイルス血清型に由来する。

（導入遺伝子）
本発明のベクターは１つまたは複数の導入遺伝子を含むことができる。このようにして、様々な遺伝的能力を標的細胞に導入することができる。１つの実施形態において、導入遺伝子は選択マーカーをコードする。別の実施形態において、導入遺伝子は細胞傷害性タンパク質をコードする。細胞傷害性タンパク質をコードする本発明のベクターは、特定の細胞を研究状況で排除するために、または、治療効果を達成するために使用することができる。例えば、特定の場合においては、細胞傷害性活性の割合を高めることによって治療効力の程度を高めることが望ましい場合がある。これは、細胞特異的な複製的細胞傷害性活性を１つまたは複数の代謝酵素（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ、ニトロレダクターゼ、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を化学療法剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に代謝することができるチトクロームＰ４５０またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｙ ６；４７（１０）：２６５１−２６５８）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）あるいはキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）など）の発現と結びつけることによって達成することができる。このタイプの導入遺伝子はまた、バイスタンダー効果を与えるために使用することができる。

本発明のベクターに導入することができるさらなる導入遺伝子には、アポトーシスを開始させることができる因子、アンチセンスまたはリゾザイム（これらは、他の可能性の中でも、細胞または病原体の増殖に不可欠なタンパク質（例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼなど）をコードするｍＲＮＡに向けられ得る）、ウイルスまたは他の病原体のタンパク質（この場合、病原体は細胞内で増殖する）、細胞傷害性タンパク質（例えば、ジフテリア、リシン、アブリンなどの鎖）、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ａ）またはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼなど）の操作された細胞質変化体をコードする遺伝子、ケモカイン（例えば、ＭＣＰ３αまたはＭＩＰ−１など）、ウイルス、細菌または哺乳動物細胞に由来する細孔形成タンパク質、融合誘導遺伝子、化学療法感作剤および放射線感作剤が含まれる。注目される他の遺伝子には、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質などが含まれ、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８またはｆｌｔ３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＭＤＡ−７（メラノーマ分化関連遺伝子−７、ｍｄａ−７／インターロイキン−２４）などが含まれる。さらなる例には、前アポトーシス遺伝子、例えば、Ｆａｓ、Ｂａｘ、カスパーゼ、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンドおよび一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）など；細胞融合を引き起こすか、または、細胞融合を促進させる融合遺伝子、例えば、Ｖ２２およびＶＳＶなど；腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、ＲＢ、ｐ１６、ｐ１７およびＷ９など；細胞周期に関連する遺伝子、および、抗血管形成タンパク質（例えば、エンドスタチンおよびアンギオスタチンなど）をコードする遺伝子が含まれる。

特定の遺伝子改変のための他の機会には、Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などが含まれ、この場合、ＴＩＬは、例えば、拡大を高めるために、細胞毒性を高めるために、増殖阻害に対する応答を低下させるために、リンホカインの発現を高めるために改変することができる。特定の表面膜タンパク質（例えば、Ｂ７、ＳＶ４０Ｔ抗原変異体など）の発現を提供することによって標的細胞の脆弱性を高めることもまた望まれる場合がある。

関連性のある任意の遺伝子またはコード配列を本発明の実施において使用することができるが、特定の遺伝子またはそのフラグメントが特に好適である。例えば、免疫原性ポリペプチド、毒素、免疫毒素およびサイトカインをコードするコード領域が本発明の実施において有用である。これらのコード領域には、本明細書中上記のコード領域が含まれ、また、さらなるコード領域には、下記のものをコードするコード領域が含まれる：免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質、例えば、Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、種々のＴＡＰ、腫瘍関連抗原、例えば、下記に由来する免疫原性配列：ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラノサイト刺激ホルモン受容体、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０、ａ−フェトタンパク質、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、ガン胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、ＰＳＭＡ、阻害性シグナルを遮断する抗体のｃＤＮＡ（ＣＴＬＡ４遮断）、ケモカイン（ＭＩＰ１、ＭＩＰ３、ＣＣＲ７リガンドおよびカルレチクリンなど）、抗血管形成遺伝子（ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳフラグメントをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない）、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、ＰＥＤＦ、バソスタチン、細胞外マトリックスタンパク質および増殖因子／サイトカインインヒビターの様々なフラグメント、細胞外マトリックスタンパク質の様々なフラグメント（アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、ツムスタチン、カンスタチン、レスチンが含まれるが、これらに限定されない）、増殖因子／サイトカインインヒビター（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ＳＮＲＲ１、マウスＦｌｔ３リガンド（ｍＦＬＴ３Ｌ）、アンギオポイエチン／ｔｉｅアンタゴニスト、ｓＴｉｅ−２が含まれるが、これらに限定されない）、ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮ、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト（ｓＦＧＦＲ）、エフリン／Ｅｐｈアンタゴニスト（ｓＥｐｈＢ４およびセフリンＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦおよびＩＧＦ−１など。本発明の実施における使用のために好適な遺伝子は、酵素（例えば、ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテアーゼ、一酸化窒素シンターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、および、当業者に知られている他の酵素など）、酵素インヒビター（例えば、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、細胞プロテアーゼインヒビターまたはウイルスプロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１、メタロプロテアーゼの組織インヒビターなど）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、インスリン、ジストロフィン、あるいは、クラスＩもしくはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原をコードすることができる。対応する遺伝子の発現を変化／調節することができるポリペプチドをコードする遺伝子、細菌、寄生虫またはウイルスの感染またはその発達を阻害することができるポリペプチド（例えば、生来的タンパク質の作用を競合によって阻害する抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープおよびトランスドミナントタンパク質変化体）、アポトーシス誘導因子またはアポトーシスインヒビター（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸ、および、当業者に知られている他のもの）、細胞増殖抑制因子（例えば、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂなど）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど）、酸素ラジカルスカベンジャー、抗腫瘍作用を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、あるいは、臨床的状態の処置または防止のために有用であるとしてこの分野で認識される注目される任意の他の遺伝子もまた有用である。さらなる導入遺伝子には、細胞分裂またはシグナル伝達を阻害するポリペプチド、腫瘍抑制因子タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３など）、宿主の免疫系を活性化するポリペプチド、腫瘍関連抗原（例えば、ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶの初期抗原または後期抗原（例えば、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２など））を場合によりサイトカインの組合せでコードする導入遺伝子が含まれる。

ＴＲＡＩＬは、広範囲の様々な形質転換された細胞株においてアポトーシスを誘導することが示されている（Ｊｅｒｅｍｉａｓ Ｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９８，２８：１４３−１５２およびＷａｌｃｚａｋ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ１９９９，５：１５７−１６３）。ＴＲＡＩＬの生理学的役割は先天性免疫応答および養子免疫応答（ウイルス感染細胞および形質転換細胞のＮＫ細胞調節およびＴ細胞調節）の両方に関わることであるようである。ＴＲＡＩＬの発現は広範囲にわたるが、正常な細胞は、アポトーシスのシグナル伝達応答を和らげる細胞内タンパク質（ｂｃｌ−２、種々のＩＡＰ、ＦＬＩＰなど）の発現のためであると主張されているが、ＴＲＡＩＬ誘導のアポトーシスに対して抵抗性であるようである。

ＴＲＡＩＬの抗腫瘍特異性の正確な分子的機構は現在依然として不明であるが、ＴＲＡＩＬの数多くの特徴が文献に記載されており、また、アデノウイルスによるＴＲＡＩＬの後期発現が細胞殺傷を高めるに違いないことを示唆するために、ＴＲＩＡＬが、注目される導入遺伝子として選ばれた。Ｅ１Ａが、ＴＲＡＩＬによる殺傷を高めることができるとして記載されている（Ｅ１ＡおよびＴＲＡＩＬ：Ｒｏｕｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｏｃｔ １５；１６５（８）：４５２２−７）；Ｅ１Ｂの１９Ｋタンパク質および５５Ｋタンパク質は報告によれば、ＴＲＡＩＬの作用を低下させる（Ｅ１Ｂ １９ＫおよびＴＲＡＩＬ：Ｒｏｕｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｏｃｔ １５；１６５（８）：４５２２−７；抗アポトーシス活性：Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｏｃｔ；７５（１９）：８８７５−８７）；Ｅ３：１０．４Ｋおよび１４．５Ｋ（ＲＩＤ）は、リソソームにおけるそれらの分解を誘導することによって細胞表面上のＦＡＳ受容体およびＴＲＡＩＬ受容体を除く（ＲＩＤ、ＦＡＳおよびＴＲＡＩＬ：Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８ Ａｐｒ １６；３９２（６６７７）：７２６−３０；Ｓｈｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９７ Ｎｏｖ；７１（１１）：８２９９−３０６；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；７６（２２）：１１３２９−４２；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１；Ｅ３：１４．７Ｋは、ＴＮＦ、ＦａｓおよびＴＲＡＩＬによるアポトーシスを阻害し、カスパーゼ８に結合する（Ｅ３ １４．７ＫおよびＴＲＡＩＬ：Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｍａｒ ６；２７３（１０）：５８１５−２０およびＴｏｌｌｅｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１）；Ｅ３：６．７ＫはＴＲＡＩＬによるアポトーシスを妨げ、ＥＲのＣａ恒常性を維持する（Ｅ３ ６．７ＫおよびＴＲＡＩＬ／ＥＲ Ｃａ２＋＋恒常性：Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ Ｆｅｂ ２；２７６（５）：３２７０−８およびアデノウイルスのＥ３−６．７Ｋタンパク質／小胞体での局在化：Ｗｉｌｓｏｎ−Ｒａｗｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９３ Ｊｕｌ；１９５（１）：６−１５）。

本発明はさらに、２つ以上の導入遺伝子を、相乗的、相補的および／または非重複的な毒性および作用方法と組み合わせることを含む。まとめると、本発明は、導入遺伝子コード領域をウイルスベクターゲノムの特定の領域に挿入するための様々な方法を提供する。これらの方法では、Ａｄ遺伝子の発現のための知られているウイルス転写エレメントおよび機構が利用され、かつ、さらなるプロモーターが必要でなく、また、調節シグナルはより小さいＤＮＡフラグメントを包含するので、Ａｄゲノムに挿入される導入遺伝子発現のためのＤＮＡ配列のサイズが小さくされ、かつ、導入遺伝子の時間的調節における柔軟度が提供され（例えば、感染の初期段階対後期段階；感染の初期段階対中間段階）、かつ、発現した導入遺伝子の量を調節するための技術が提供される。例えば、より多くの量の導入遺伝子を、通常の場合に高レベルで発現される転写物に導入遺伝子を挿入することによって、かつ／または、高効率のスプライスアクセプター部位を導入遺伝子コード領域に機能的に連結することによって発現させることができる。発現レベルはまた、調節シグナルがそのコンセンサスな配列に対してどのくらい近いかによって影響を受ける。様々な変化を、所望するように発現を細かく調節するために行うことができる。

本発明のアデノウイルスベクターを設計することにおいて、導入遺伝子の生物学的活性が考慮される。例えば、一部の場合において、導入遺伝子は、導入遺伝子が（ウイルスＤＮＡの複製の後の）感染の後期段階において発現されるだけであるか、または、（ウイルスＤＮＡの複製の後の）感染の後期段階で主に発現されるようにベクターに挿入することが好都合である。例えば、導入遺伝子を、本明細書中においてさらに記載されるように、Ｌ３に挿入することができる。一部の導入遺伝子については、導入遺伝子をウイルスの生活環の初期で発現させることが好ましい場合がある。そのような場合、導入遺伝子は、初期領域のいずれか（例えば、Ｅ３）に、または、上流側のＬ１領域に挿入することができる。

（治療的方法）
本発明のベクターの効果的な量が、下記の１つまたは複数を含むことができる医薬的に許容され得る賦形剤における組成物として哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される：生理的食塩水溶液、好適な緩衝剤、保存剤および安定化剤など。本発明のベクターは、好適な薬剤（例えば、制吐剤など）との併用で投与することができる。効果的な量は、臨床的効能を含めて、有益な結果または所望される結果を達成するために十分な量である。効果的な量を１回または複数回の投与または服用で投与することができる。本発明の目的のために、ベクターの効果的な量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、鈍化または遅延させるために、あるいは、疾患の１つまたは複数の症状を軽減するために十分な量である。与えられる量は、個体の状態、疾患の程度、投与経路、投薬回数、および、所望される目的によって決定される。

本発明のベクターの送達は、多くの場合、部位特異的注射または静脈内注射のいずれかによって達成される。ベクターの部位特異的注射には、例えば、腫瘍内への注射、ならびに、腹腔内注射、胸膜内注射、クモ膜下注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射または局所的適用が含まれ得る。これらの方法は、ベクターを単独で使用するか、または、ベクターおよび化学療法剤の組合せを使用する処置において容易に受け入れられる。本発明ではまた、対象から得られた細胞にエクスビボで感染させるためのベクターの使用が意図される。例えば、細胞が哺乳動物から単離される。単離された細胞は腫瘍細胞および非腫瘍細胞の混合物を含有する場合がある。細胞に、複製可能であるウイルスを感染させ、ウイルスが腫瘍細胞において特異的に複製する。従って、腫瘍細胞が排除され、そして、所望されるならば、残っている非腫瘍細胞を同じ哺乳動物に戻すことができ、または、所望されるならば、異なる哺乳動物に投与することができる。

パッケージングされたアデノウイルスとして使用されるならば、アデノウイルスベクターは約１０^４個〜約１０^１４個の用量で適切な生理学的に許容され得るキャリアにおいて投与することができる。ポリヌクレオチド構築物として投与されるならば（すなわち、ウイルスとしてパッケージングされていないならば）、約０．０１ ｇ〜約１００ ｇのアデノウイルスベクターを投与することができる。投与される正確な投薬量は、患者の年齢、体重および性別、ならびに、処置されている腫瘍のサイズおよび重篤度を含む様々な要因に依存する。アデノウイルスベクターを、意図された使用および宿主の免疫応答能に依存して１回または複数回投与することができ、また、多数の同時注射として投与することもできる。免疫応答が望ましくないならば、免疫応答を、様々な免疫抑制剤を用いることによって、または、強い免疫応答を伴うことなく反復投与を可能にするようにアデノウイルス抗体を血液から除く免疫吸着手法（例えば、免疫アフェレーシス）などの技術を用いることによって弱めることができる。別のウイルス形態（例えば、ＨＳＶなど）としてパッケージングされるならば、投与される量は、その特定のウイルスに関する標準的な知識（これは、例えば、発表された文献から容易に得ることができる）に基づいており、また、経験的に決定することができる。

１つの実施形態において、宿主生物はヒト患者である。ヒト患者については、治療的なコード領域がベクターに含められるならば、その治療的なコード領域はヒト起源であり得る。だが、遺伝子が有害な免疫反応を被投与者において生じさせないならば、大きい相同性およびヒトにおける生物学的に同一または同等な機能を示す近縁種の遺伝子を使用することができる。核酸配列または治療的遺伝子の治療性な量は、所望される結果を達成するために必要な投薬量において、また、所望される結果を達成するために必要な期間にわたって効果的な量である。この量は、対象の性別、年齢および体重など（これらに限定されない）を含む様々な要因に依存して変化し得る。

本発明の実施形態には、米国特許出願公開第２００３００６８３０７号に詳しく記載されるように、本発明のガン特異的ベクターと、第２の抗生物治療（これには、放射線、抗新生物剤または化学療法剤の投与などが含まれ得る）との組合せを、新生物を有する個体に施すための方法が含まれる。ガン特異的ベクターおよび化学療法剤を同時または連続的に投与することができ、連続投与については様々な時間間隔で投与することができる。一部の実施形態において、効果的な量のベクターおよび効果的な量の少なくとも１つの抗新生物剤または化学療法剤が賦形剤および／または緩衝剤の好適な溶液と一緒にされ、本明細書中に列挙された方法またはこの分野で知られている方法のいずれかによって同じ溶液から同時に投与される。これは、化学療法剤がベクター自体の実現可能性および／または活性を損なわないときに適用することができる。

２つ以上の化学療法剤が投与される場合、これらの薬剤は同じ組成物において一緒に投与することができ、または、任意の順序で連続して投与することができ、あるいは、異なる組成物において同時に投与することができる。これらの薬剤が連続して投与されるならば、投与はさらに時間遅延を含むことができる。連続投与は任意の順序が可能であり、それによれば、効果的な量のベクターを最初に投与し、その後、効果的な量の化学療法剤を投与することを包含する。ガン特異的ベクターおよび化学療法剤の投与の間隔は、少なくとも数分、数時間または数日（あるいは、数分未満、数時間未満または数日未満）の単位であり得る。連続投与はまた、選ばれた抗新生物剤を投与し、その後、ベクターを投与することを包含する。投与間隔は、少なくとも数分、数時間または数日（あるいは、数分未満、数時間未満または数日未満）の単位であり得る。

上記方法を施すことにはまた、特に個体の応答および個体の疾患の特徴に依存する、ガン特異的ベクターおよび化学療法剤の反復した服用またはクールが含まれ得る。反復した服用を、最初の処置クールの直後に（すなわち、１日以内に）、あるいは、腫瘍成長の抑制を達成および／または維持するために、数日、数週間または数ヶ月の間隔の後で着手することができる。上記方法による特定の処置クール（例えば、組み合わされたガン特異的ベクターおよび化学療法剤）に続いて、後で、放射線およびガン特異的ベクターの混合治療を続けることができる。

抗新生物（化学療法）剤には、化学療法剤の主要な種類のそれぞれに由来する薬剤が含まれ、それらには、アルキル化剤、アルカロイド、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア剤、ホルモンアゴニスト／アンタゴニストおよびアナログ、免疫調節剤、光増感剤、ならびに酵素などが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗新生物剤は、アルカロイド、代謝拮抗剤、抗生物質またはアルキル化剤である。特定の実施形態において、抗新生物剤には、例えば、チオテパ、インターフェロンα−２ａおよびＭ−ＶＡＣ組合せ（メトトレキサート−ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド）が含まれる。好ましい抗新生物剤には、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、５−アザシチジンおよびゲムシタビンが含まれる。特に好ましい実施形態には、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ミロキサントロン、マイトマイシン、ダカルバジン、カルムスチン、ビンブラスチン、ロムスチン、タモキシフェン、ドセタキセル、パクリタキセルまたはシスプラチンが含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤の具体的な選択は、特に、処置される疾患の特徴に依存する。このような特徴には、腫瘍の場所、疾患の段階、および、存在するならば、以前の処置に対する個体の応答が含まれるが、これらに限定されない。

特定のガン特異的ベクターとの組合せでの１つの抗新生物剤の使用に加えて、本発明ではまた、ガン特異的ベクターとの併用での２つ以上の薬剤の使用が含まれる。新生物を処置するために使用されるときの抗新生物剤の組合せは、混合化学療法と多くの場合には呼ばれ、多くの場合、個体のガンの特徴に依存して手術および／または放射線をも含む場合がある併用モダリティー処置の一部である。本発明の組み合わされたガン特異的ベクター／化学療法もまた、併用モダリティー処置プログラムの一部として使用され得ることが意図される。

抗新生物剤を投与するための様々な送達方法があり、これらはこの分野では広く知られており、これらには、経口投与および非経口投与が含まれる。非常に多数の抗新生物剤についての経口投与には、低い生物利用能、消化管の刺激、および、薬物の複雑な組合せを忘れずに投与しなければならないことをはじめとする数多くの欠点がある。筋肉内注射および皮下注射は組織に対する刺激または損傷を引き起こすことが多いので、抗新生物剤の非経口投与の大部分は静脈内である。非経口注射の局所的変法には、動脈内注射、嚢内注射、腫瘍内注射、クモ膜下注射、胸膜内注射、腹腔内注射および腔内注射が含まれる。

化学療法剤についての送達方法には、静脈内方法、非経口方法および腹腔内方法、ならびに、経口投与が含まれる。静脈内方法にはまた、四肢の静脈を介する方法、ならびに、より部位特異的な送達（例えば、門脈内への静脈内滴注など）が含まれる。他の非経口送達方法には、抗新生物剤の直接的な注入（例えば、皮下、腔内または腫瘍内）が含まれる。

特定の処置様式の効力の評価を、この分野で知られている様々な技術のいずれかによって明らかにすることができ、これらには、診断的方法、例えば、画像化技術、血清腫瘍マーカーの分析、生検、腫瘍関連症状の存在、非存在または改善などが含まれる。所与の処置様式は、効力を最大にするために適すように改変され得ることが理解される。

本発明のさらなる態様において、本発明の組換えウイルスベクターおよび／または組換えウイルス粒子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、効果的な量の本発明のガン特異的ベクターおよび／またはガン特異的ウイルス粒子を医薬的に許容され得るキャリアにおいて含んでおり、単位投薬形態物、無菌の非経口用の溶液または懸濁物、無菌の非腸管外溶液または経口用の溶液もしくは懸濁物、水中油型または油中水型のエマルションなどでの個体への局所投与または全身投与のために好適である。非経口薬物送達および経口薬物送達のための様々な配合物がこの分野で知られている。組成物はまた、本発明のガン特異的ベクターまたはガン特異的粒子の凍結乾燥形態および／または再構成形態が含まれる。許容され得る医薬用キャリアは、例えば、生理的食塩水溶液、硫酸プロタミン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）水、水性緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液など）、または、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水およびスクロースである。好適な医薬用キャリアの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者には明らかであると考えられる。これらの溶液は無菌であり、かつ、一般には、所望されるガン特異的ベクターのほかには粒状物を含有しない。組成物は、生理学的条件に近づけるために要求されるような医薬的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含有することができる。細胞によるガン特異的ベクターの取り込みを高める賦形剤を含めることができる。

下記の実施例は、本発明の実施方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように示され、本発明者らが本発明者らの発明として見なすものの範囲を限定することは意図されず、また、下記の実験が、行われた実験のすべてまたは行われた実験のみであることを表すことも意図されない。様々な努力が、使用された数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するためになされているが、ある程度の実験誤差およびずれを考慮しなければならない。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物または特許出願が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように、参考として本明細書中に組み込まれる。

本発明は、発明を実施するための好適な態様を構成するために、本発明者らによって見出されるか、または、本発明者らによって提案される特定の実施形態に関して記載されている。数多くの改変および変化が、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態においてなされ得ることが、本開示に照らして当業者によって理解される。例えば、コドン縮重性のために、様々な変化を、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、基礎となるＤＮＡ配列において行うことができる。さらに、生物学的な機能的等価性を考慮することにより、様々な変化を、種類または量において生物学的作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において行うことができる。そのような改変のすべてが、好ましい実施形態の範囲に含まれることが意図される。

本発明の方法および組成物は様々な実施形態の形態で組み込むことができ、そのうちの少数のみが本明細書中に開示されることが理解される。様々な他の実施形態が存在し、かつ、本発明の精神から逸脱しないことが当業者には明らかである。従って、記載されている実施形態は例示であり、限定であるとして解釈すべきではない。

下記の実施例は例示として提供され、限定として提供されない。下記の実施例において、分岐点＋スプライスアクセプター配列の配列は、

（配列番号３９）である。下線部の配列が分岐点配列であり、矢印は、スプライシング規則に従ったスプライス部位を示す。このコンセンサス配列を支配する規則は不変ではないので、規則と一致する他の類似する配列を使用することができる。あるいは、別のＡｄ血清型に存在する分岐点＋スプライスアクセプター部位を使用することができる。下記の実施例は、ヒトＡｄ５血清型に由来する例示的なアデノウイルスベクターに関する。類似する構築物を他のアデノウイルスから作製することができる。

（実施例１：Ａｄベクターの構築および導入遺伝子をコードするＡｄベクタービリオンの増殖）
下記の実施例は、アデノウイルスベクターゲノムの一部またはアデノウイルスベクターゲノムの全体のいずれかと、挿入された導入遺伝子とを含有するベクターにおいて少なくとも１つの導入遺伝子を挿入することを記載する。ベクターがアデノウイルスベクターゲノムの全体および挿入された導入遺伝子をコードする場合、標準的な技術を使用して、ベクターはアデノウイルスのプロデューサー細胞株にトランスフェクションされ、ウイルスがパッケージングされる。トランスフェクションの前に、ベクターは、ウイルスベクターのゲノムの内部を切断しないが、ベクター（例えば、プラスミド）の骨格を切断する制限酵素により消化することができる。

あるいは、導入遺伝子が、ウイルスゲノムの一部を含有するベクターに挿入される。この場合、ウイルスゲノムの一部を含有するベクターの一部分が、ウイルスベクターゲノムの残り部分を含有するベクターにクローン化される。従って、完全なウイルスベクターをコードするベクターが作製される。次いで、完全なウイルスベクターゲノムがプロデューサー細胞株にトランスフェクションされ、ウイルスがパッケージングされる。別の方法では、導入遺伝子とウイルスゲノムの一部とを含有するベクターが、ウイルスベクターゲノムの適切なフラグメントと一緒にプロデューサー細胞株にトランスフェクションされ、これにより、相同的組換えの結果として、完全なウイルスベクターゲノムが形成され、完全なウイルスベクターゲノムがプロデューサー細胞株において複製および増殖する。

下記の参考文献はウイルスベクターの構築およびウイルスの増殖のより詳細を提供する：Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．１９８６；５０（１−３）：１６１−７１；Ｔｏｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００２ Ｆｅｂ；５（２）：２０４−１０（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。本実施例では、導入遺伝子（１つまたは複数）をＡｄのＬ２領域における様々な場所に挿入することが記載される。

（実施例２：改変を有し、かつ、さらなる改変をＬ２領域にクローニングするためのＡｄベクターのクローン化）
細菌システムを使用する組換えのためには、変化させられる領域において少なくとも１つの特有の制限部位を含有する（何らかの特定の改変を有する）全長型Ａｄゲノムプラスミドを有することは好都合である。下記のいくつかの例では、標的化された領域がＬ２領域である。しかしながら、特有の部位が存在しない。従って、これらの特徴を有するプラスミドを下記の方法によって作製した。野生型Ａｄの塩基１５６７２〜塩基２１５６２に対応するＡｄのＢａｍＨＩ〜ＡｓｃＩ領域をクローニングプラスミドｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入した。このプラスミドをＣＰ１５６３と呼ぶ。部位特異的変異誘発を行って、特有のＳｗａＩ部位を１６５３０位（Ａｄ野生型に対応する塩基）に組み込み、このプラスミドをＣＰ１５６４と呼んだ。１３２５９から２１５６２までのＡｄ５配列（ＢａｍＨＩ〜ＰｍｅＩフラグメント）をクローニングプラスミドｐＭＣＳ５に挿入されて含有するプラスミドを作製した。これをｃｐ１１６５と呼ぶ。ｃｐ１１６５を、クローニングベクターに存在するＡｓｃＩ部位をもはや含有しないように変化させ、ＣＰ１１６６にする。ＣＰ１５６４からのＳｗａＩ含有のＡｄフラグメントを、ＡｓｃＩおよびＢａｍＨＩによる消化によって取り出し、ＡｓｃＩおよびＢａｍＨＩにより切断されたＣＰ１５６６に挿入した。このプラスミドをＣＰ１５６７と呼ぶ。これは、Ｌ２領域内への組換えのための切断のために使用することができる特有のＳｗａＩ部位をＬ２領域に含有するゲノムプラスミドを作製するために、任意の全長型Ａｄゲノムプラスミドに戻される。

（実施例３：ｐＶＩＩのＣＤＳとｐＶのＣＤＳとの間でのＬ２領域における導入遺伝子の挿入）
下記のクローニング工程を、アデノウイルスベクターゲノムの全体（すなわち、ＩＴＲ〜ＩＴＲ）を含有するベクター（例えば、プラスミド）、あるいは、アデノウイルスゲノムのＬ２領域またはその関連した部分を含有するベクターのいずれかにおいて行う。導入遺伝子のＣＤＳ、すなわち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはｃＤＮＡをｐＶＩＩのＣＤＳの下流側で、ｐＶのＣＤＳの上流側に挿入した。スプライスアクセプター配列がこれら２つの遺伝子の間に既に存在しており、これはｐＶの発現のために使用される；付随する分岐点配列は正確には位置付けられていない。導入遺伝子のＣＤＳまたはｃＤＮＡを内因性のｐＶスプライス部位の上流側に挿入し、さらなる分岐点およびスプライスアクセプター部位を導入遺伝子の上流側に挿入する。これらのさらなるスプライシング配列は導入遺伝子の発現のために使用される。Ｌ２領域のための例示的なスプライスアクセプターについての配列は、Ｌ３領域のために使用される配列とは異なる。新しいスプライスアクセプター部位を、

（配列番号４２）を得るために強い塩基を変換することによって、ｐＶＩＩについての存在するスプライス部位：

（配列番号６８）に従って選んだ。あるいは、導入遺伝子ＣＤＳに機能的に連結されたさらなる分岐点およびスプライスアクセプター部位をｐＶの生来的な分岐点およびスプライスアクセプター部位の上流側に挿入する。

（実施例４：ペントンのＣＤＳとｐＶＩＩのＣＤＳとの間でのＬ２領域における導入遺伝子の挿入）
導入遺伝子のＣＤＳを、ペントンのＣＤＳの下流側で、ｐＶＩＩのＣＤＳの上流側に挿入する。ｐＶＩＩについての推定される分岐点およびスプライスアクセプター部位がペントンについてのコード領域に存在する。従って、挿入された導入遺伝子は、ペントンのＣＤＳに存在する内因性のスプライシングシグナルを使用し、さらなる分岐点およびスプライスアクセプター部位が、ｐＶＩＩ遺伝子についてのｍＲＮＡを合成するために、導入遺伝子のＣＤＳの後で、ｐＶＩＩのＣＤＳの上流側に設置され（かつ、ｐＶＩＩのＣＤＳに機能的に連結される）。

（実施例５：ＭｕのＣＤＳとＬ４のポリＡシグナルとの間でのＬ２領域における導入遺伝子の挿入）
導入遺伝子を、Ｍｕ（ａｋａ ｐＸ）のＣＤＳの下流側で、Ｌ２のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入する。分岐点、スプライスアクセプター部位および導入遺伝子ＣＤＳを、ＭｕのＣＤＳの下流側で、Ｌ２のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入する。挿入された分岐点およびスプライスアクセプター部位は導入遺伝子のＣＤＳに機能的に連結される。

（実施例６：ＭｕのＣＤＳおよびＬ４のポリＡシグナルの下流側でのＬ２領域における導入遺伝子の挿入）
導入遺伝子に機能的に連結されたＩＲＥＳを、ＭｕのＣＤＳの下流側で、Ｌ２のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入する。

（実施例７：２３ＫのＣＤＳとＬ３のポリＡとの間でのＬ３領域へのスプライシングエレメントおよびｈＩＬ−２４のクローン化）
ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、１つのＥｃｏＲＩ部位を除くために、ＥｃｏＲＩにより切断し、再連結する。その後、このプラスミドを、ＢｓｐＨＩ部位を除くために、ＢｓｐＨＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め、再連結する。その後、このプラスミドをＡｐａＩおよびＲｓｒＩＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め、再連結して、これらの部位の間にある余分な配列を除く。アンピシリン耐性遺伝子を含有する部分は保持される。このプラスミドをＣＰ１６０１と呼ぶ。ｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩにより切断し、野生型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド１８３１８〜ヌクレオチド２４７９５を含有するＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＣＰ１６０１のＨｉｎｄＩＩＩ消化およびＸｈｏＩ消化のフラグメント（ベクター骨格）に連結する。得られるプラスミドをＣＰ１６０３と呼ぶ。

導入遺伝子のヒトＩＬ−２４（ｈＩＬ−２４、これはまたＭＤＡ−７として知られている）を２３ＫのＣＤＳの下流側で、Ｌ３のポリアデニル化シグナル配列の上流側に挿入し、かつ、スプライシング機構による発現を可能にするために、下記の工程を行う：ＰＣＲ ＳＯＥｉｎｇ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９０ Ｍａｙ；８（５）：５２８−３５）を使用して、分岐点およびスプライスアクセプター部位ならびにｈＩＬ−２４のＣＤＳを含有するフラグメントを増幅する（ＩＬ−２４のＣＤＳはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプラスミドから得られる；「ｐｏｒｆ−ｈｉｌ２４」を参照）。分岐点およびスプライスアクセプター部位がＰＣＲプライマーにコードされている。上記で概略された同じ分岐点およびスプライスアクセプター部位配列が使用される。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にＴＡクローン化し、これにより、ＣＰ１６０２を作製する。その後、ＡｄおよびｈＩＬ−２４の配列を含有するＣＰ１６０２由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ領域をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化のＣＰ１６０１に連結し、これにより、プラスミドＣＰ１６０６Ｒｅｖ（配列番号４８）を得る。ＣＰ１６０６ＲｅｖのＫｐｎＩ／ＳｆｉＩフラグメントをＫｐｎＩ／ＳｆｉＩ切断のＣＰ１５２４に連結して、ＣＰ１６１０を作製する。ＣＰ１６１０は、改変されたＬ３領域を完全なアデノウイルスベクターゲノムに「移し替える」ためのシャトルベクターである。このプラスミドを用いて、任意の導入遺伝子を、導入遺伝子フラグメント（これは、多くの場合、適切な末端を伴ってＰＣＲによって作製される）およびＣＰ１６１０をＢｓｐＨＩおよびＮｈｅＩにより消化した後、ここに挿入することができる。Ａｄベクターまたはウイルスの作製が、ＣＰ１６０６Ｒｅｖ（配列番号４８）とアデノウイルスベクターゲノム骨格プラスミドとの相同的組換えにより達成される。アデノウイルスベクターゲノム骨格は、他の必要なアデノウイルス遺伝子のすべて、および、挿入される領域との相同性を提供するＤＮＡ領域を含有しており、それにより、Ｌ３領域に対する改変を含むアデノウイルスベクターゲノムの完全な配列を含有するベクターを生じさせる。組換えを、所望の変化を有する全長のＡｄゲノムを含有するプラスミドを生じさせるために、大腸菌の菌株において行うことができる。その後、このベクターを、哺乳動物細胞へのトランスフェクションおよびウイルスの増幅によってアデノウイルスのウイルス粒子を作製するために使用する。

他の導入遺伝子を、この同じ方法を使用して、Ｌ２のポリアデニル化部位のすぐ上流側でＬ３領域に挿入することができる。あるいは、導入遺伝子を、ＢｓｐＨＩおよびＮｈｅＩの制限部位をその５’末端および３’末端にそれぞれ伴って増幅し、ＣＰ１６０６Ｒｅｖ（配列番号４８）に挿入することができ、対応するＡｄウイルスの作製を、同じ方法を使用して行うことができる。

（実施例８：ヘキソンのＣＤＳと２３ＫのＣＤＳとの間でのＬ３領域へのｍＩＬ２１のクローン化）
Ｌ３のヘキソンのＣＤＳの下流側で、スプライシングを発現のために利用する２３ＫのＣＤＳの上流側でのマウスインターロイキン−２１導入遺伝子の挿入を下記のように行う：当業者によって日常的に用いられる方法を使用して、スプライスアクセプター部位およびｍＩＬ２１ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ｐｏｒｆ−ｍＩＬ２１を参照）を、ヘキソンのＣＤＳの下流側で、２３ＫのＣＤＳの上流側に挿入する。分岐点およびスプライスアクセプター部位がＰＣＲプライマーにコードされている。上記で概略された同じ分岐点およびスプライスアクセプター部位配列が使用される。この場合、正常な２３ＫスプライシングシグナルがヘキソンについてのＯＲＦに存在し、また、そのようなものとして、導入遺伝子が挿入され得る場所の上流側に存在するので、分岐点＋スプライスアクセプター部位が導入遺伝子の３’末端に付加される。この方法では、この内因性（生来的ウイルス）のスプライシング配列が導入遺伝子のために利用され、さらなる分岐点＋スプライスアクセプター部位が、２３ＫのＣＤＳの発現のために利用されるように付加される。Ａｄ５ゲノムのＬ３領域のフラグメントを含有するＰＣＲ産物（これはクローニングのための制限酵素部位および／またはスプライスプロセシングシグナルを伴って改変される）、および、ｈＩＬ２４のｃＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼにより消化する。その後、フラグメントをＣＰ１６０１同等ベクターに連結して、ＣＰ１６２３を作製する。その後、ＣＰ１６２３のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩフラグメントをＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断のＣＰ１５２４（実施例７）に連結して、ＣＰ１６３１（これは、操作されたカセット（３’スプライスアクセプター部位の前にｈＩＬ２４のｃＤＮＡがある）がヘキソンについての停止コドンおよび２３Ｋについての開始コドンの後に挿入されるシャトルである）を作製する。ＣＰ１６２３は、他の導入遺伝子をこの様式で発現させるために使用することができるシャトルプラスミドである。挿入されたｍＩＬ２１導入遺伝子を含有する完全なアデノウイルスベクターを、ＣＰ１６３１と、所望のアデノウイルスゲノム骨格を含有する所望の全長型ベクターとの相同的組換えによって得る。その後、得られるプラスミドＣＰ１６３１を、導入遺伝子を発現する新しいＡｄウイルス、ＯＶ１１５３を作製するために使用する。

（実施例９：２３ＫのＣＤＳとＬ３のポリＡシグナルとの間でのＬ３領域へのＩＲＥＳおよびｈＩＬ−２４のクローン化）
導入遺伝子（例えば、ｈＩＬ−２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ｐｏｒｆ−ｈｉｌ２４）を参照）を、Ｌ３のポリアデニル化部位のすぐ上流側で、かつ、ＩＲＥＳを発現のために使用するすべてのＬ３コード領域の下流側でＬ３領域に挿入することができる。ＩＲＥＳおよび導入遺伝子がすべてのＬ３ｍＲＮＡに含まれ、かつ、すべてのＬ３ｍＲＮＡから翻訳されることが予想される。ＰＣＲ ＳＯＥｉｎｇ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９０ Ｍａｙ；８（５）：５２８−３５）を使用して、ＰＣＲ産物を、ＩＲＥＳ（例えば、ＦＭＤＶまたはＥＣＭＶから得られるＩＲＥＳなど）がｈＩＬ−２４のＣＤＳに機能的に連結され、かつ、２３ＫのＣＤＳの下流側で、Ｌ３のポリアデニル化シグナル配列の下流側に挿入されるように作製する。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にＴＡクローン化し、これにより、ＣＰ１６０４を作製する。その後、ＡｄおよびｈＩＬ−２４の配列を含有するＣＰ１６０４由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ領域をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化のＣＰ１６０１−ＮｏｔＩに連結し、これにより、ＣＰ１６０７を得る。ＣＰ１６０１−ＮｏｔＩは、ＣＰ１６０１をＮｏｔＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて末端を埋め、次いでプラスミドを再連結し、その結果、ＮｏｔＩ部位が破壊されるようにすることによって作製された。ＣＰ１６０７のＢａｍＨＩ／ＳｆｉＩフラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｆｉＩ切断のＣＰ１６０３に連結して、プラスミドＣＰ１６０９を作製する。ＣＰ１６０７は、他の導入遺伝子をこの様式で発現させるために使用することができるシャトルプラスミドである。挿入されたｍＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含有する完全なアデノウイルスベクターを、ＣＰ１６０９と、所望の全長型アデノウイルスゲノム骨格プラスミドとの相同的組換えによって得る。その後、得られたプラスミドを、哺乳動物細胞へのトランスフェクションによってＡｄウイルスを作製するために使用する。

（実施例１０：ＯＶ１１６５コントロールウイルスの構築）
ＯＶ１１６５は、Ｅ１Ａに機能的に連結されたＥ２Ｆ−１プロモーターを含むコントロールウイルスである。このベクターはパッケージングシグナルを生来的な場所に有し、かつ、ポリアデニル化シグナルを、ＬＩＴＲからの転写読み過しを阻止するためにＥ２Ｆ−１プロモーターの上流側に有する。ＯＶ１１６５に含有されるこれらの配列はプラスミドｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆに由来した。

全長の組換えアデノウイルスゲノム（ｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆ）を下記のように作製した。最初に、全長型プラスミドｐＦＬＡｄ５を、ＰＣＲにより導入されたＩ−ＳｃｅＩ制限部位を含有するＳｍａＩ線状化ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａＩシャトルプラスミドをＡｄ５のゲノムＤＮＡと組み合わせることによって大腸菌において作製した。これにより、Ｉ−ＳｃｅＩ部位を境界とするＡｄ５ゲノムを含有するｐＦＬＡｄ５を得た。次いで、ｐＦＬＡｄ５をＳｍａＩにより消化し、Ａｄ５の左末端フラグメントおよび右末端フラグメントを含有するフラグメントをゲル精製し、自己連結して、ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａＩを作製した。Ａｄ５の左末端制限フラグメント（１００６ｂｐ）および右末端制限フラグメント（５８２ｂｐ）を含有するプラスミドｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａＩをＳｍａＩにより消化し、大腸菌においてＡｒ２１ｐＡＥ２ｆのゲノムウイルスＤＮＡと組合せて、全長型プラスミドｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆを作製した。

上記で記載されたタイプの全長のアデノウイルス由来ゲノム（ｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆ）を含有するＣＰ１５８５と呼ばれるプラスミドを下記のように作製した：
４６４８ｂｐのＳｍａＩフラグメントを、Ｅ２ＦプロモーターをＥ１Ａの上流側に含有するｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２ｆＦプラスミド（ｐＦＬＡｒ２１Ｓｍａシャトル）から得た。ＢａｍＨＩ部位を、ＢａｍＨＩにより消化し、その部位を破壊するためにＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いて埋め、再連結することによってｐＦＬＡｒ２１Ｓｍａシャトルから除いた。ｐＥ２ｆＬｔＲＴシャトルと呼ばれる４６４６ｂｐのプラスミド産物を単離した。プラスミドＣＰ１５８５（３８９９８ｂｐ）を、野生型Ａｄ５ゲノムを含有するＣＶ８０２ウイルスＤＮＡおよび線状化されたｐＥ２ｆＬｔＲｔシャトルを使用するＢＪ５１８３細胞における細菌での相同的組換えによって作製した。最終生成物のＣＰ１５８５は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターがＥ１Ａに機能的に連結された全長の組換えアデノウイルスゲノムを有する。ＣＰ１５８５はまた、後期領域における遺伝子挿入を容易にするために使用することができる特有のＢａｍＨＩ部位（マップ部位２１７９６）をＬ４領域の近くに有する。

ＯＶ１１６５ウイルスを、Ａ５４９細胞と、ＣＰ１５８５由来の３６，２４６塩基対のＩ−ＳｃｅＩフラグメントとのリポフェクタミンによるトランスフェクションによって作製した。ＯＶ１１６５をＡ５４９細胞上で成長させ、５本のローラーボトルにスケールアップした。

ウイルスをＣｓＣｌ遠心分離によって精製し、ＡＲＣＡ緩衝液に配合した。収量が４．９７ｍｌであり、粒子力価が２．３３ｘ１０^１２ｖｐ／ｍｌ（２．３ｘ１０^１２ｖｐ／ローラーボトル）であった。

（実施例１１．Ｌ３ベクターの作製）
導入遺伝子を、選択的スプライシング機構を利用してＡｄ５のＬ３領域から発現するベクターを作製する際に使用されるシャトルプラスミドを下記のように構築した：
組換えの全長アデノウイルスゲノムを含有するプラスミドを、ＢＪ５１８３細菌組換えシステムを使用して作製した。

組換えの全長アデノウイルスゲノムを含有するプラスミドを、ＢＪ５１８３細菌組換えシステムを使用して作製した。このシステムのこの適用において、改変を、アデノウイルスゲノムのより小さいフラグメントを含有するＣＰ１６０６シャトルプラスミドおよびＣＰ１５２４シャトルプラスミドに対して行った。

Ｌ３ベクターもまた、ＢＪ５１８３細菌組換えシステムによって作製した。全長のアデノウイルスゲノムをプラスミド骨格に含有する大きい線状化ベクターを、類似するアデノウイルスゲノムに由来するＤＮＡのより小さいフラグメントとともに、ＢＪ５１８３細菌（機能的なｒｅｃＢ遺伝子、ｒｅｃＣ遺伝子、ｓｂｃＢ遺伝子およびｓｂｃＣ遺伝子を有する菌株）に同時形質転換した。このより小さいフラグメントは、ＴＲＡＩＬについてのコード配列の側面に位置する、より大きいベクターに対して相同的なヌクレオチド配列の重要な拡がりを含有する。大きい線状化ベクターおよびＤＮＡのより小さいフラグメントのＢＪ５１３５細胞への同時形質転換を、大きい方の線状化ベクターへの小さい方のフラグメントの相同的組換えを促進させるために使用した。得られた子孫プラスミドは、ＴＲＡＩＬコード配列（ｃＤＮＡ；配列番号４６）を取り込む全長のアデノウイルス由来ゲノムを含有する。

フラグメントを最終的なシャトルプラスミド（ＣＰ１５８１、これはＣＰ１５２４に由来する）から切り出し、全長の組換えアデノウイルスゲノム（ｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆ）を含有する線状化プラスミドと同時形質転換した。子孫プラスミドはｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆの誘導体である。組換えの前に、ＣＰ１５２４に含有されるＡｄ配列に対する意図的な変化の導入をより小さい基本ベクターＣＰ１６０６Ｒｅｖ（配列番号４８）において行った。ＣＰ１５２４（配列番号４７）およびＣＰ１６０６Ｒｅｖを下記においてさらに説明する。

ＣＰ１５２４（配列番号４７）は、野生型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド１８３１８〜ヌクレオチド２４７９５をｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来プラスミド骨格に含有する基本シャトルベクターである。ヌクレオチド１８３１８〜ヌクレオチド２４７９５のＡｄ５ゲノムの範囲はｗｔ型Ａｄ５のＬ３領域の一部を含有する。

ＣＰ１５２４を、当業者により日常的に用いられる分子クローニング方法を使用することによって構築した。最初に、ｐｃＤＮＡ３．１＋を制限エンドヌクレアーゼのＢｓｔＺ１７ＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。得られた消化ベクターをＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により処理して、ＸｂａＩ消化により生じたＤＮＡの一本鎖部分を埋めた。得られた「平滑」末端を連結して、余分な配列が除去されている改変されたｐｃＤＮＡ３．１＋由来ベクターのＣＰ１５２３を作製した。ＣＰ１５２４のＡｄ５配列は、Ｅ１領域における大きな欠失を除いて、ｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）（ｗｔ型Ａｄ５ゲノムを含有する市販のプラスミド）に由来した。ヌクレオチド１８３１８〜ヌクレオチド２４７９５のｗｔ型Ａｄ５配列を表す領域を制限エンドヌクレアーゼのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりｐＢＨＧＥ３から切り出し、同様に切断されたＣＰ１５２３に連結して、子孫プラスミドＣＰ１５２４を得た。

（実施例１２．２３ＫのＣＤＳとＬ３のポリＡシグナルとの間でのＬ３領域へのスプライシングエレメントのクローン化（ＣＰ１６０６Ｒｅｖの構築））
ＣＰ１６０６Ｒｅｖは、ｗｔ型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド２２１８１〜ヌクレオチド２３００８を表すｗｔ型Ａｄ５のＬ３領域の改変されたセグメントを短縮型ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏプラスミド骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含有する。この領域に対する改変には、３’スプライスアクセプター部位（以降、３’ＳＡＳとして示される）をｈＩＬ２４のｃＤＮＡに先行させることが含まれる。ｈＩＬ２４のｃＤＮＡの両側には、異なるｃＤＮＡ配列（例えば、ＴＲＡＩＬ）との置換のためのＢｓｐＨＩ部位（ＮｃｏＩとの適合性を有する）およびＮｈｅＩ部位がある。

ＣＰ１６０６Ｒｅｖを標準的な分子クローニング方法によって構築した。最初に、ｗｔ型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド２２１８１〜ヌクレオチド２３００８を包含するＰＣＲフラグメントを作製し、３’ＳＡＳおよびｈＩＬ２４ｃＤＮＡを、ｗｔ型Ａｄ５の２３Ｋ遺伝子（以降、２３Ｋとして示される）についての停止コドンと、Ｌ３のポリＡとの間に含むように改変した。このフラグメントをＰＣＲスプライス重複伸長によって構築した。

簡単に記載すると、３つの前駆体ＰＣＲフラグメントを作製した。フラグメントＰＣＲｐ１６１８．９５．１／２は、プライマー１６１８．９５．１（配列番号５２）およびプライマー１６１８．９５．２（配列番号５６）を用いてｐＢＨＧＥ３から増幅されたヌクレオチド２２１８１〜ヌクレオチド２２３５４のｗｔ型Ａｄ５ゲノム部分を含有する。ＰＣＲｐ１６１８．９５．１／２は３’ＳＡＳ（配列番号４５）をその下流側端部に含む。

フラグメントＰＣＲｐ１６１８．９７．１（配列番号５４）／１６１８．９７．２（配列番号５５）は、プライマー１６１８．９７．１およびプライマー１６１８．９７．２を用いてｐＯＲＦ９−ｈＩＬ２４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）から増幅されたｈＩＬ２４のｃＤＮＡを含有する。ＰＣＲｐ１６１８．９７．１／２は３’ＳＡＳおよびｗｔ型Ａｄ５のＬ３領域の一部をその上流側端部および下流側端部にそれぞれ含む。

ｗｔ型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド２２３５５〜ヌクレオチド２３００８を、プライマー１６１８．９５．５（配列番号５６）およびプライマー１６１８．９５．６（配列番号５３）を用いて増幅した。フラグメントＰＣＲｐ１６１８．９５．１／２およびフラグメントＰＣＲｐ１６１８．９７．１／２は重複末端を有する。これら２つのフラグメントの混合物を、隣接するプライマー１６１８．９５．１（配列番号５２）およびプライマー１６１８．９７．２（配列番号５５）とともにＰＣＲ反応液に入れた。得られた生成物ＰＣＲｐ１６１８．９５．１／１６１８．９７．２はヌクレオチド２２１８１〜ヌクレオチド２２３５４のｗｔ型Ａｄ５ゲノム部分を３’ＳＡＳおよびｈＩＬ２４ｃＤＮＡとつないでいた。

同様に、フラグメントＰＣＲｐ１６１８．９７．１／２およびフラグメントＰＣＲｐ１６１８．９５．５／６は重複末端を有する。これら２つのフラグメントの混合物を、隣接するプライマー１６１８．９７．１およびプライマー１６１８．９５．６とともにＰＣＲ反応液に入れた。得られた生成物ＰＣＲｐ１６１８．９７．１／１６１８．９５．６は３’ＳＡＳおよびｈＩＬ２４ｃＤＮＡを２２３５５位〜２３００８位のｗｔ型Ａｄ５ゲノム部分とともに有する。

従って、ＰＣＲｐ１６１８．９５．１／１６１８．９７．２およびＰＣＲｐ１６１８．９７．１／１６１８．９５．６は、操作された３’ＳＡＳおよびｈＩＬ２４ｃＤＮＡにおいて重なる。これら２つのフラグメントの混合物を、隣接するプライマー１６１８．９５．１（配列番号５２）およびプライマー１６１８．９５．６（配列番号５３）とともにＰＣＲ反応液に入れた。得られた生成物ＰＣＲｐ１６１８．９５．１／６は、操作された３’ＳＡＳおよびｈＩＬ２４ｃＤＮＡを元の２２３５４位と２２３５５位との間に取り込む（その結果、これらの導入された特徴が、２３Ｋについての停止コドンと、Ｌ３のポリＡ部位との間に存在する）元のｗｔ型Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド２２１８１〜ヌクレオチド２３００８を表す。ＰＣＲｐ１６１８．９５．１／６をＴｏｐｏ ＴＡクローニングによってベクターｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏに入れ、これによりプラスミドＣ１６０２を得た。

導入遺伝子の除去および上記の改変された２３Ｋ領域への導入遺伝子の挿入のための基本シャトルを作製するために、プラスミド骨格をｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏの改変によって構築した。最初に、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化し、再連結して、ＥｃｏＲＩ部位の１つ、および、元のこれら２つの部位の間の余分なヌクレオチド配列を除き、これにより、ｐＣＲ２．１ＴｏｐｏＥｃｏＲＩを得た。導入遺伝子を下流側にクローニングすることを容易にするために、ＢｓｐＨＩ制限部位を、制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による消化およびＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）による処理によってｐＣＲ２．１ＴｏｐｏＥｃｏＲＩから除き、続いて、処理したベクターを連結して、ｐＣＲ２．１ＴｏｐｏＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＨＩを得た。下流側へのクローニング作業を軽減するために、余分な配列を、制限エンドヌクレアーゼのＡｐａＩおよびＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による消化、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）による処理、続いて、処理したベクターの連結によってｐＣＲ２．１ＴｏｐｏＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＨＩから除いて、ＣＰ１６０１を得た。

最終的な基本シャトルＣＰ１６０６Ｒｅｖ（配列番号４８）を、ＣＰ１６０２のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＸｈｏＩフラグメントを切り出し、そのフラグメントを同様に切断されたＣＰ１６０１ベクターに入れることによって構築した。

線状化ベクターｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆとの組換えのために好適なより大きいシャトルプラスミドを作製するために、ＫｐｎＩ〜ＳＦｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）フラグメントをＣＰ１６０６Ｒｅｖから切り出し、同様に切断されたＣＰ１５２４ベクターに入れ、これによりプラスミドＣＰ１６１０を得た。

（実施例１３．スプライスアクセプター（ＳＡ）部位およびＴＲＡＩＬを２３ＫのＣＤＳとＬ３のポリＡとの間においてＬ３領域に有する腫瘍崩壊性ベクター（ＯＶ１１６０）の作製）
操作された３’ＳＡＳおよびＴＲＡＩＬｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；ｐＯＲＦ−ＴＲＡＩＬを参照）を含有するｐＦＬＡｒ２１ｐＡＥ２Ｆｆの組換え誘導体を作製するために、２回のサブクローニングを行った。プラスミドＣＰ１５８０を、ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ（配列番号４６）をＰＣＲによってｐＯＲＦ−ｈＴＴＲＡＩＬから増幅することによって構築した。このフラグメントを、ＮｃｏＩ−ＮｈｅＩ部位を使用する制限消化に供し、ＢｓｐＨＩ−ＮｈｅＩにより消化した後のＣＰ１６０６Ｒｅｖに連結した。ＢｓｐＨＩ部位はＮｃｏＩ部位との適合性を有する。ＣＰ１５８１プラスミドを、２３Ｋタンパク質のスプライス部位の３’側にＴＲＡＩＬを含有するＣＰ１５８０のＫｐｎＩ−ＳｆｉＩフラグメントから構築し、組換えにおいて使用されるＣＰ１５２４シャトルプラスミドに連結した。プラスミドＣＰ１５８２を、ＣＰ１５８１のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、全長型ｐＦＬａｒ２１ｐａＥ２ｆとの組換えの後に得た。操作された３’ＳＡＳ（配列番号４５）およびＴＲＡＩＬｃＤＮＡ（配列番号４６）を含有するｐＦＬＡＲ２１ｐＡＥ２Ｆｆの組換え誘導体を単離し、ＣＰ１５８２と称した。

ＯＶ１１６０ウイルス（配列番号５１）を、全長のアデノウイルス配列（これは新しいスプライスアクセプター部位およびＴＲＡＩＬを含有する）を放出するＩ−ＳｃｅＩ酵素によるＣＰ１５８２の制限消化によって作製した。

（実施例１４．ＩＲＥＳおよびＴＲＡＩＬを２３ＫのＣＤＳとＬ３のポリＡとの間においてＬ３領域に有する腫瘍崩壊性ベクター（ＯＶ１１６４）の作製）
ＯＶ１１６４（配列番号５０）はＩＲＥＳをヘキソンコード配列の停止コドンに後に有する。ＯＶ１１６４の作製に関与したプラスミドは、ＣＰ１５９０、ＣＰ１５９１およびＣＰ１５９２（全長型）である。

全長型ＣＰ１５９２プラスミドを３回のサブクローニングの後で作製した。ＨｅｘｏｎＦｍｄｖＴｒａｉｌ含有プラスミドの組み立てをＰＣＲＳｏｅｉｎｇによって行った。次工程でのプラスミドを組換えにより生じさせるために十分な重なりを有するフラグメントを作製するために、Ａｄ５由来の１ｋｂの配列をその配列の両側に含めた。ＰＣＲＳＯＥｉｎｇを下記のように行った。

（１）ｐＢＨＧ３由来のＡｄ５配列を、１７０６．８３．１（配列番号５７）／１７０６．８３．２（配列番号５８）を使用して増幅した；（２）ｐｍｃｓＨｅｘＦｍｄｖＴＲＡｌＬ由来のＨｅｘＦｍｄｖＴＲＡＩＬフラグメントを、オリゴ１７０６．９５．１（配列番号５９）／１６１８．１１６．３（配列番号６０）を使用して増幅した；および（３）これらのフラグメントを、１７０６．８３．１および１６１８．１１６．３を使用して組み立て、新しいフラグメントをＰＣＲｓｔｏｐｏにクローン化した。

（２）ＣＰ１５９０は、ＰＣＲにより組み立てられたフラグメント（ａｄ５ＨｅｘＦｍｄｖＴＲＡＩＬＡｄ５）を含有するＰＣＲ．２．１ｔｏｐｏベクターである。ＣＰ１５９１を、ＣＰ１５９０のＨｐａＩ−ＸｈｏＩフラグメント（Ａｄ５ＨｅｘＦｍｄｖＴＲＡＩＬＡｄ５）と、ＢａｍＨＩにより線状化されたＣＰ１５２４との組換えによって作製した。最終的な全長型ＣＰ１５９２プラスミドを、ＣＰ１５９１のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、ＳｇｆＩにより線状化されたｐＦＬａｒ２１ｐａＥ２ｆとの組換えによって作製した。

ＴＲＡＩＬを、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼを使用する、オリゴ１６１９．１４４．１（配列番号６１）／１６１９．１４４．３（配列番号６２）を用いたｐＯＲＦ−ｈＴＲＡＩＬからのＴＲＡＩＬの増幅によってｐｍｃｓＨｅｘＦＭＤＶにクローン化した。増幅フラグメントをＢＳＴＺ１７１により消化し、ＣＰ１５５７（ｐｍｃｓＨｅｘＦｍｄｖ ｂａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ）に連結して、ｐｍｃｓＨｅｘＦｍｄｖＴｒａｉｌを作製した。

ウイルスを、全長のアデノウイルス配列（これはＩＲＥＳおよびＴＲＡＩＬを含有する）を放出するＩ−ＳｃｅＩ酵素によるＣＰ１５９２の制限消化によって作製した。

（実施例１５．ウイルス産生、Ｔｒａｉｌ発現およびインビボでの生物学的活性）
Ａ５４９細胞（１〜２Ｘ１０ｅ７個の細胞）を、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地において１日目にプレートからローラーボトル（通気キャップを有するＦａｌｃｏｎ（３５−３０６９）ひだ付き表面ローラーボトル）に移した。４日目に、細胞を５ウイルス粒子／細胞〜１０ウイルス粒子／細胞により３時間〜６時間感染させた。細胞を感染後７２時間〜９６時間で集め、ＣｓＣｌ遠心分離による精製まで−８０℃で保存した。２．５５ｅ１２、２．０５ｅ１２および２．１１ｅ１２の力価が、（ＨＰＬＣによって測定されたとき）ＯＶ１１６０（ロット１）、ＯＶ１１６０（ロット２）およびＯＶ１１６４についてそれぞれ得られた。力価を２６０ｎｍでのＯＤによって求めた（ウイルスを、０．１％のＳＤＳを含有するＴＥにおいて１：１０および１：２０で希釈し、５６℃で２０分間インキュベーションし、吸光度を分光光度計で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて読み取った）。

ウイルス生産を、Ａ５４９細胞、ＳＷ７８０細胞およびＨｅＬａＳ３細胞に対して各ウイルスについて５０ｐｐｃで行った。感染を４時間行い、その後、細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、その後、３ｍｌの新鮮な完全培地を加えた。細胞を３日目（形質導入後７２時間）に集め、凍結解凍を３回行い、分析した。表１は３日目のウイルス収量を示す。

ウイルス収量を３日目（形質導入後７２時間）に求め、コラーゲン被覆の１２ウエルプレートでの２９３細胞に対するＨｅｘｏｎアッセイを使用して力価測定した。表１は３日目のウイルス収量を示す。

Ｈｅｘｏｎアッセイは、細胞の所与の培養物におけるアデノウイルスのヘキソンタンパク質の産生を免疫染色によって測定するための生物学的アッセイである。簡単に記載すると、細胞を連続希釈物のＣＶＬまたは精製ウイルスにより感染させ、３７℃でインキュベーションする。感染後４８時間で、細胞をメタノールにより固定処理し、その後、抗ヘキソン一次抗体によりプローブし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以降、ＨＲＰとして示される）コンジュゲート化二次抗体によりプローブする。その後、ヘキソン産生細胞を、固定処理された培養物を、顕微鏡下で容易に見える暗い沈殿物に二次抗体のＨＲＰによって変換されるジアミノベンジジン（以降、ＤＡＢとして示される）基質にさらすことによって可視化する。その後、暗い沈殿物が形成されているスポットを目視によりスコア化する。感染性単位／ミリリットル（以降、ＩＵ／ｍＬとして示される）を、顕微鏡視野あたりのスコア化されたスポット、培養ディッシュにおける視野の総数、感染のために使用された連続希釈ウイルスの体積、および、スポットがスコア化された希釈係数に基づいて計算した：
ＩＵ／ｍＬ＝［（視野あたりのスコア化スポット）^＊（総視野）］／［（希釈ウイルスの体積）^＊（希釈係数）］
この場合、２９３細胞に、連続希釈されたＯＶ１１６０（ロット１）、ＯＶ１１６０（ロット２）またはＯＶ１１６４を感染させた。抗ヘキソン一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；ＭＡＢ８０４３）、二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＮＡ９３１Ｖ）およびＤＡＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ；１８５６０９０）を、アッセイを行うために使用した。１％のＢＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；１００−３５０）が補充されたＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ；１−０３１−ＣＶ）を抗体のための希釈液として使用し、また、すべての中間洗浄工程のために使用した。

ＯＶ１１６５、ＯＶ１１６０の２つのストック物、ＯＶ１１６４、ＯＶ８０２、実験室由来の野生型Ａｄ５単離体（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）およびＡｄｄｌ３１２（Ｅ１ａ欠失の複製欠陥ウイルス）のＥＣ５０を、ＭＴＳアッセイを７日目に使用して数多くの細胞株について求めた。結果を、細胞の５０％が殺される用量（ＰＰＣとして報告される）として下記の表２に示す。

（ＴＲＡＩＬ発現についてのウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析）
ウエスタンブロット分析を、この分野で広く知られている方法（例えば、Ａｎｔｏｎ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６９，４６００−４６０６，１９９５，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｓｕｐｒａ）を使用して行った。第１の一連のウエスタンブロットを、Ａ５４９細胞感染後、ＯＶ１１６４およびＯＶ１１６０のＣＶＬ（粗ウイルス溶解物）を使用して行った。ＯＶ１１６４については、Ａ５４９細胞を、２４時間、４８時間および７２時間にわたって、１０００個、１００個または１０個の粒子／細胞（ｐｐｃ）で感染させた。ＨＰＬＣによって測定されたときのウイルス粒子（ｖｐ）数は８．６ｅ９ｖｐ／ｍｌであった。

様々な体積の力価測定されていないＯＶ１１６０のＣＶＬもまた、Ａ５４９細胞を７２時間感染させるために使用した。感染後、Ａ５４９細胞を、細胞スクレーパーを使用して集め、１４，０００で３分間遠心分離し、細胞ペレットをＯＶ１１６０感染細胞から分離し、または、ＯＶ１１６４を２００ｕｌの冷ウエスタン溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベーションし、使用まで−８０℃で保存した。各サンプルにおけるタンパク質の量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して評価した。ＯＶ１１６０感染細胞またはＯＶ１１６４感染細胞からの１０ｕｇ／ｍｌまたは３０ｕｇ／ｍｌの総細胞タンパク質を、１００ｍＭのＤＴＴおよび負荷用色素を含有する溶液において一緒にし、８５℃で５分間変性し、４〜１２％勾配のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＮｏｖｅｘ）に負荷した。

第２の一連のウエスタンブロットを、Ａ５４９細胞に感染させるための精製されたＯＶ１１６０ウイルス、ＯＶ１１６４ウイルスおよびＯＶ１１６５ウイルスを使用して行った。Ａ５４９細胞の感染を１０および１００のＰＰＣで行い、上清を感染後６時間、２４時間および４８時間で集めた。細胞を感染後２４時間および４８時間で集めた。３０ｕｇの総タンパク質または３０ｕｌの上清を４〜１２％勾配のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＮｏｖｅｘ）に負荷した。ゲルを１Ｘ ＭＯＰＳ緩衝液において１００ボルトに１．５時間供し、その後、１０％のＭｅＯＨを含む１Ｘ ＭＯＰＳ緩衝液において４００ｍＡｍｐで１時間、ＰＤＶＦメンブランに転写した。使用した第１の抗体はヤギＩｇＧ抗ヒトＴＲＡＩＬポリクローナル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ３７５）であった。ヤギ抗ＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ ＳＣ−２０５６）を使用した。結果を、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、Ｂｉｏｍａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ）での感光の後で検出した。

ＴＲＡＩＬタンパク質を、１０、１００および１０００のＰＰＣでＯＶ１１６０およびＯＶ１１６４を２４時間、４８時間または７２時間にわたって感染させたＡ５４９細胞からの細胞溶解物におけるウエスタンブロットによって検出した。ＴＲＡＩＬの１９ｋＤａ切断部分（可溶性形態）もまた、１００のＰＰＣでＯＶ１１６０により４８時間感染させたＡ５４９細胞の上清において検出された。

ＴＲＡＩＬ発現をＥＬＩＳＡによって定量し、ウイルス感染細胞によって生じたＴＲＡＩＬのバイスタンダー作用を、（下記にさらに記載されるバイオアッセイで評価されるような）アポトーシスの程度を評価することによって行った。分析を、ＴＲＡＩＬがウイルス感染後に産生されるか否か、および、ＴＲＡＩＬが生物学的に活性であるかどうかを明らかにするために行った。

Ａ５４９細胞に、ＯＶ１１６０、ＯＶ１１６４およびＯＶ１１６５を１００のＰＰＣで２４時間および４８時間それぞれ感染させた。上清を集め、上清中のＴＲＡＩＬの量をＥＬＩＳＡによって測定するためにアッセイが行われるまで−８０℃で凍結した。

馴化培地を集め、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してｓＴＲＡＩＬの発現についてアッセイした。９６ウエルマイクロタイタープレートを０．１Ｍ重炭酸塩（ｐＨ９．６）緩衝液中でマウス抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）により被覆し、４℃で一晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０により徹底的に洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液により１時間ブロッキング処理した。組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、連続希釈後、標準曲線のために使用した。サンプルをウエルにおいて１時間インキュベーションし、徹底的に洗浄し、ヤギ抗ヒトＴＲＡＩＬポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と１時間インキュベーションした。徹底的に洗浄した後、サンプルをＨＲＰコンジュゲート化抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と１時間インキュベーションし、再び洗浄し、４５０／６５０ｎｍの光学濃度においてＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して検出した。標準曲線を、組換えヒトＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３７５ＴＥＣ）を使用して作製した。このアッセイの結果を下記の表３Ａに示す。

第２のＥＬＩＳＡを、それらのそれぞれのＥＣ５０（これは７日目にＭＴＳによって測定された）でＯＶ１１６０またはＯＶ１１６４を４０時間感染させた６つの細胞株（ＳＷ７８０、Ａ５４９、ＤＬＤ−Ｉ、ＳＫＭｅ１２８、ＨＴ２９、Ｈ４６０）に対して行った。この研究を、多数の異なる細胞株により産生されるＴＲＡＩＬの量を評価するために行った。表３Ｂに示される結果は、ＯＶ１１６０を感染させたＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＨＴ４６０細胞が最大量のＴＲＡＩＬを産生させたことを示している。

ＯＶ１１６０感染細胞、ＯＶ１１６４感染細胞およびＯＶ１１６５感染細胞により産生されたＴＲＡＩＬのバイスタンダー作用を、感染細胞由来の上清を新鮮な非感染細胞に移すことによって評価した。アポトーシスの程度を、ＥＬＩＳＡキット（細胞死検出キットＥｌｉｓａプラス／Ｒｏｃｈｅ １７７４４２５）を使用してＤＮＡ断片化によって評価した。

第１のアッセイを、一般的なカスパーゼインヒビター（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＦＭＫ００１）の存在下または非存在下での、ＯＶ１１６５、ＯＶ１１６４、または、ＯＶ１１６０の２つのロットの１つによる１００のＰＰＣでの４８時間にわたるＡ５４９細胞の感染後に集めた１００ｕｌの上清に対して行った。分析を上清添加後１６時間で行った。表４に示される結果は、ＯＶ１１６５ではなく、ＯＶ１１６０がＳＷ７８０細胞に対してアポトーシスを誘導することができ、また、カスパーゼインヒビターが培地に含まれるとき、作用が低下することを示している。

第２のアッセイを、７日目にＭＴＳによって測定されたときのそれらのそれぞれのＥＣ５０でＯＶ１１６５およびＯＶ１１６０を感染させた６つの細胞株（ＳＷ７８０、ＤＬＤ−Ｉ、ＨＴ２９、ＳＫＭｅ１２８、Ｈ４６０およびＡ５４９）を使用して行う。それぞれのウイルス感染細胞株からの新しく集めた上清を、ＥＬＩＳＡを行う前の４０時間、カスパーゼインヒビターの存在下または非存在下で対応する非感染細胞に加える。表３Ｂに示されるように、産生されたＴＲＡＩＬのレベルは細胞株毎に異なっていた。この研究は、特定の細胞株により産生されたＴＲＡＩＬの生物学的活性を評価するために設計される。

（実施例１６．皮下でのヒト膀胱ＳＷ７８０異種移植片腫瘍モデルにおける抗腫瘍効力）
研究を、ヒト膀胱ＴＣＣ細胞株ＳＷ７８０を使用してＴＲＡＩＬ発現ウイルス（ＯＶ１１６０）およびコントロールウイルス（ＯＶ１１６５）の抗腫瘍効力を評価するために行った。本研究では、ヌードマウスにおけるＳＷ７８０細胞の異種移植片腫瘍がＯＶ１１６０およびＯＶ１１６５の５回の腫瘍内注射によってそれぞれ処置される。測定されたパラメーターには、生存、腫瘍体積の変化、体重、ならびに、腫瘍におけるウイルス感染の範囲、ＴＲＡＩＬ発現およびアポトーシスの程度が含まれる。

腫瘍を、２ｘ１０^６個のＳＷ７８０細胞をメスのマウス（群あたり１０匹）に皮下注射することによって樹立する。腫瘍内ウイルス処置を、平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ^３に達したときに開始する。研究日（ＳＤ１）に開始するとき、腫瘍に、合計で５回の投与のために１日おきに、１回の注射あたり１ｘ１０ｅ８個、１ｘ１０ｅ９個または１ｘ１０ｅ１０個のウイルス粒子（ｖｐ）の用量で５回注射する。腫瘍体積［（Ｗ^２ｘＬ）／２］を１週間に２回測定する：体重を１週間に１回測定する。ヘキソン染色およびＴＲＡＩＬのＥＬＩＳＡを感染後の様々な時点で行う。

（配列の簡単な説明）
下記は、本発明を実施する際に用いられた配列の記載である。

図１は、Ａｄ５の生来的ゲノム構成の概略図である。 図２は、生来的なＡｄ５転写ユニットの概略図である。 図３は、Ａｄ５のＬ１領域の概略図である。 図４は、Ａｄ５のＬ２領域の概略図である。 図５は、Ａｄ５のＬ３領域の概略図である。 図６は、Ｅ３転写ユニットの概略図である。 図７は、Ｅ３Ａ領域の概略図である。星印は、アデノウイルスベクターから頻繁に欠失されるＡｄ５内の１９２塩基対を示す。 図８は、Ｅ３Ｂ領域の概略図である。 図９は、Ｌ３領域の挿入部位がキメラなアデノウイルスリーダー領域の一例とともに示される本発明の例示的な実施形態の概略図であり、この場合、導入遺伝子がヘキソンコード配列と２３Ｋプロテアーゼコード配列との間に挿入される。導入遺伝子は、Ａｄ５におけるヘキソン停止コドンの約９５塩基上流側に位置する２３Ｋ ｍＲＮＡのための生来的なスプライスアクセプター部位に機能的に連結される（すなわち、Ａｄ５におけるヘキソン停止コドンの約９５塩基上流側に位置する２３Ｋ ｍＲＮＡのための生来的なスプライスアクセプター部位を発現のために利用する）。異種のスプライスアクセプター部位が導入遺伝子コード配列と２３Ｋコード配列との間に挿入され、かつ、異種のスプライスアクセプター部位が２３Ｋコード配列に機能的に連結される。これにより、４つの異なるｍＲＮＡがＬ３領域から転写されることが可能になる。この例では、生来的なＬ３ポリアデニル化配列が無傷で残され、キメラなＬ３領域の４つすべてのｍＲＮＡによって利用される。 図１０は、Ｌ３領域の挿入部位がキメラなアデノウイルスリーダー領域の一例とともに示される本発明の例示的な実施形態の概略図である。この場合、導入遺伝子がＬ３領域において２３Ｋプロテアーゼコード配列とＬ３ポリアデニル化配列との間に挿入される。導入遺伝子は２Ａ様配列またはＩＲＥＳに機能的に連結される（すなわち、２Ａ様配列またはＩＲＥＳを発現のために利用する）。２Ａ様配列またはＩＲＥＳはまた、２３Ｋコード配列に機能的に連結される。生来的なＬ３領域と同様に、このキメラなアデノウイルスＬ３領域は３つのＬ３ｍＲＮＡの産生をもたらす。この場合、３つすべてのＬ３ｍＲＮＡがＩＲＥＳ（または２Ａ様配列）を含有しており、従って、これらのｍＲＮＡの３つすべての翻訳により、導入遺伝子の発現がもたらされる。この例については、生来的なＬ３ポリアデニル化配列が無傷で残され、キメラなＬ３領域の３つすべてのｍＲＮＡによって利用される。 図１１は、５’から３’の方向で、Ｅ１Ａに機能的に連結されたＥ２Ｆ−１プロモーター、ならびに、Ｌ３領域において、ｐＶＩ、ヘキソン、スプライスアクセプターおよびＴＲＡＩＬコード配列を含むＯＶ−１１６０の概略図を示す。このベクターはパッケージングシグナルを本来の場所に有し、かつ、ＬＩＴＲからの転写読み過しを阻止するためにポリアデニル化シグナルをＥ２Ｆ−１プロモーターの上流側に有する。 図１２は、５’から３’の方向で、Ｅ１Ａに機能的に連結されたＥ２Ｆ−１プロモーター、ならびに、Ｌ３領域において、ｐＶＩ、ヘキソン、ＩＲＥＳ、ＴＲＡＩＬコード配列および２３Ｋ遺伝子を含むＯＶ−１１６４の概略図を示す。このベクターはパッケージングシグナルを本来の場所に有し、かつ、ＬＩＴＲからの転写読み過しを阻止するためにポリアデニル化シグナルをＥ２Ｆ−１プロモーターの上流側に有する。

Claims (42)

1. 導入遺伝子コード配列（ＣＤＳ）を含むアデノウイルスベクターであって、該ＣＤＳは、キメラなアデノウイルスリーダー領域から発現され、該キメラなアデノウイルスリーダー領域の生来的部分が、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４のアデノウイルスリーダー領域からなる群より選択される、アデノウイルスベクター。
2. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、分岐点およびスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳおよびアデノウイルスＣＤＳを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
3. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、第１のアデノウイルスＣＤＳ、分岐点、第１のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳ、第２の分岐点、第２のスプライスアクセプター部位および第２のアデノウイルスＣＤＳを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
4. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、アデノウイルスＣＤＳ、分岐点、スプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
5. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、アデノウイルスＣＤＳ、導入遺伝子ＣＤＳに作動可能に連結されたＩＲＥＳ、および、ポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
6. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライスアクセプター部位または異種のスプライスアクセプター部位である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
7. 前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライスアクセプター部位または異種のスプライスアクセプター部位である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
8. 前記第１の分岐点が内因性のアデノウイルス分岐点または異種の分岐点である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
9. 前記第２の分岐点が内因性のアデノウイルス分岐点または異種のアデノウイルス分岐点である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
10. 前記スプライスアクセプター部位が異種のスプライスアクセプター部位である、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
11. 前記分岐点が異種の分岐点である、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
12. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、自己プロセシング切断部位に作動可能に連結されたアデノウイルスＣＤＳ、および、該自己プロセシング切断部位に作動可能に連結された導入遺伝子ＣＤＳをこの順で含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
13. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、自己プロセシング切断部位ＣＤＳに作動可能に連結された導入遺伝子ＣＤＳ、および、該自己プロセシング切断部位に作動可能に連結されたアデノウイルスＣＤＳをこの順で含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
14. 前記自己プロセシング切断部位ＣＤＳが２Ａ配列または２Ａ様配列である、請求項１２に記載のアデノウイルスベクター。
15. 前記自己プロセシング切断部位ＣＤＳが、配列番号１〜配列番号３２からなる群より選択される、請求項１２に記載のアデノウイルスベクター。
16. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域の前記生来的部分がＬ２のアデノウイルスリーダー領域に由来する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
17. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、ｐＶＩＩ ＣＤＳ、第１のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳ、第２のスプライスアクセプター部位、および、ｐＶ ＣＤＳをこの順で含む、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。
18. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位である、請求項１７に記載のアデノウイルスベクター。
19. 前記第１のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位である、請求項１７に記載のアデノウイルスベクター。
20. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、ペントンＣＤＳ、第１のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳ、第２のスプライスアクセプター部位、および、ｐＶＩＩ ＣＤＳをこの順で含む、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。
21. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位である、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
22. 前記第１のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位である、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
23. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、Ｍｕ ＣＤＳ、スプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。
24. 前記ポリアデニル化シグナルがアデノウイルスのＬ２ポリアデニル化シグナルまたは異種のポリアデニル化シグナルである、請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。
25. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、Ｍｕ ＣＤＳ、ＩＲＥＳ、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。
26. 前記ポリアデニル化シグナルがアデノウイルスのＬ２ポリアデニル化シグナルまたは異種のポリアデニル化シグナルである、請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
27. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域の前記生来的部分がＬ３アデノウイルスリーダー領域に由来する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
28. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、２３Ｋ ＣＤＳ、スプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。
29. 前記ポリアデニル化シグナルがアデノウイルスのＬ３ポリアデニル化シグナルまたは異種のポリアデニル化シグナルである、請求項２８に記載のアデノウイルスベクター。
30. 前記導入遺伝子ＣＤＳがヒトＴＲＡＩＬタンパク質をコードする、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
31. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、ヘキソンＣＤＳ、第１のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳ、第２のスプライスアクセプター部位、および、２３Ｋ ＣＤＳをこの順で含む、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。
32. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位である、請求項３１に記載のアデノウイルスベクター。
33. 前記第１のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位である、請求項３１に記載のアデノウイルスベクター。
34. 前記キメラなアデノウイルスリーダー領域が、２３Ｋ ＣＤＳ、ＩＲＥＳ、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、請求項２７に記載のアデノウイルスベクター。
35. 前記導入遺伝子がヒトＴＲＡＩＬタンパク質をコードする、請求項３５に記載のアデノウイルスベクター。
36. 導入遺伝子についてのコード配列（ＣＤＳ）を含むアデノウイルスベクターであって、該導入遺伝子ＣＤＳがキメラなアデノウイルスリーダー領域から発現され、該キメラなアデノウイルスリーダー領域の生来的部分がＬ５領域に由来し、該キメラなアデノウイルス領域が、第１のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳ、第２のスプライスアクセプター部位、繊維ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、アデノウイルスベクター。
37. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位である、請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
38. 前記第１のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位である、請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
39. 導入遺伝子についてのコード配列（ＣＤＳ）を含むアデノウイルスベクターであって、該導入遺伝子ＣＤＳがキメラなアデノウイルスリーダー領域から発現され、該キメラなアデノウイルスリーダー領域の生来的部分がＬ５領域に由来し、該キメラなアデノウイルス領域が、第１のスプライスアクセプター部位、繊維ＣＤＳ、第２のスプライスアクセプター部位、導入遺伝子ＣＤＳおよびポリアデニル化シグナルをこの順で含む、アデノウイルスベクター。
40. 前記第１のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位であり、前記第２のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位である、請求項３９に記載のアデノウイルスベクター。
41. 前記第１のスプライスアクセプター部位が異種のスプライス部位であり、かつ、前記第２のスプライスアクセプター部位が内因性のアデノウイルススプライス部位である、請求項３９に記載のアデノウイルスベクター。
42. 前記ポリアデニル化シグナルがＬ５ポリアデニル化シグナルである、請求項３９に記載のアデノウイルスベクター。