JP2008506713A - 脂質−アミノ酸結合体および使用法 - Google Patents

脂質−アミノ酸結合体および使用法 Download PDF

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Abstract

N-脂肪酸-アミノ酸結合体およびJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体を、そのような結合体の製造法ならびに機能障害性脂質代謝、インスリン感受性、グルコースホメオスタシス、および/または炎症に関与する状態の治療におけるこれらの結合体の使用法と共に開示する。

Description

本発明は、機能障害性脂質代謝、インスリン感受性、グルコースホメオスタシス、および/または炎症に関与する状態の治療における、脂質-アミノ酸結合体ならびに結合体の調製および使用法に関する。本発明は、分子生物学、薬品化学、薬理学、および医学の分野に関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、2004年7月16日提出の米国特許仮出願第60/588,697号の提出日の恩典を主張する。この先行出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府支援研究に関する言明
本発明は、NIH助成番号DA12178およびDA017969からの支援を受けて行った；したがって、政府は本発明において特定の権利を有する。
背景
リポアミノ酸は、初めは細菌中で同定された分子群で、アミノ酸に結合している脂肪酸部分からなる(Kawazoe et al., J. Bacteriol., 173:5470- 5475, 1991(非特許文献1))。次の少なくとも三つの脂肪酸-アミノ酸結合体は哺乳動物の脳の天然成分である：N-アラキドニルグリシン(NAGly)、N-アラキドニル-4-アミノ酪酸(NAGABA)、およびN-アラキドニルアラニン(NAAla)。NAGlyは、脊髄、小腸、腎臓、無毛皮膚、心臓、肺、肝臓、脾臓、精巣、および血液を含む多くの組織の内因性成分である(Huang et al., J. Biol. Chem., 276:46, 2001(非特許文献2))。NAGlyは内因性カンナビノイドアナンドアミドの構造類似体であるが、カンナビノイド受容体CB1およびCB2、バニロイドVR1受容体、ならびにアナンドアミド輸送体に対する親和性を欠くことが報告されている(Huang et al, 2001, supra(非特許文献2)；Burstein et al., Prostaglandins and Other Lipid Mediat., 61:29-41, 2000(非特許文献3))。NAGlyは鎮痛性を有することが報告されている。
Kawazoe et al., J. Bacteriol., 173:5470- 5475, 1991 Huang et al., J. Biol. Chem., 276:46, 2001 Burstein et al., Prostaglandins and Other Lipid Mediat., 61:29-41, 2000
概要
本発明は、脂質-アミノ酸結合体、例えば、N-脂肪酸-アミノ酸結合体(「エルミリ酸(elmiric acids)と呼ぶこともある)およびJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体(「J酸」と呼ぶこともある)、そのような結合体の合成法、ならびにそのような結合体による、例えば、炎症、疼痛、機能障害性脂質代謝に関連する状態、HIV、およびII型糖尿病を含む様々な障害の治療法に関する。
本明細書に開示する特定の結合体は下記の一般式(式I)を有する：
Figure 2008506713
式Iにおいて、R1、R2、R3、およびR4は化学基を表す。開示する結合体は次の特徴の少なくとも一つを有する：(a)R1は非哺乳動物脂肪酸の置換基であるか、または(b)R2およびR3はアミノ酸類似体の置換基である。R1はJ2プロスタノイドの非カルボキシル部分(尾部)、例えば、哺乳動物もしくは非哺乳動物J2プロスタノイド、または脂肪酸、例えば、哺乳動物脂肪酸もしくは非哺乳動物脂肪酸でありうる。本明細書に開示する特定の化合物は式Iの構造を有し、ここでR1は哺乳動物脂肪酸の炭化水素鎖であり、R2、R3、およびR4はアミノ酸類似体の置換基である。本明細書に開示する他の化合物は式Iの構造を有し、ここでR1は非哺乳動物脂肪酸またはJ2プロスタノイドの尾部(非カルボキシル部分)であり、R2、R3、およびR4は(i)天然アミノ酸または(ii)アミノ酸類似体の置換基である。
本明細書に記載する他の結合体には、脂肪酸またはJ2プロスタノイドに結合しているジペプチドが含まれる。これらの結合体は下記の一般式(式II)を有する：
Figure 2008506713
式IIにおいて、R1はJ2プロスタノイドまたは哺乳動物もしくは非哺乳動物脂肪酸いずれかの炭化水素鎖でありうる。置換基対R2およびR3、ならびにR4およびR5は、それぞれのアルファ炭素との組み合わせでアミノ酸残基をそれぞれ形成する。式IIにおいて、アミノ酸はそれぞれ独立に天然アミノ酸またはアミノ酸類似体でありうる。
したがって、一つの局面において、本明細書において開示する結合体は、式Iの構造を有し、R1は哺乳動物脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンテン酸、およびドコサテトラエン酸の炭化水素鎖である。この局面のいくつかの態様において、R4は水素であり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸などのアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。他の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖である。他の態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリン誘導体の側鎖を形成する。異なる態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はセリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であり、CαはDアミノ酸と同じ立体化学を有する。さらなる態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってD-プロリンを形成する。特定の態様において、R4は水素、メチルまたはエチル基でありうる。
もう一つの局面において、本明細書において開示する結合体は、式Iの構造を有し、R1はアラキドン酸の炭化水素鎖である。この局面のいくつかの態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸などのアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。他の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖である。他の態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリン誘導体の側鎖を形成する。異なる態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はセリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であり、CαはDアミノ酸と同じ立体化学を有する。さらなる態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってD-プロリンを形成する。特定の態様において、R4は水素、メチルまたはエチル基でありうる。
異なる局面において、本明細書において開示する結合体は、式Iの構造を有し、R1は非哺乳動物脂肪酸、例えば、ペンタデカン酸；ヘプタデカン酸；ノナデカン酸；ヘンエイコサン酸；9-trans-テトラデカン酸、14:1T；10-trans-ペンタデカン酸、15:1T；9-trans-ヘキサデセン酸、16:1T；10-ヘプタデセン酸、17:1；10-trans-ヘプタデセン酸、17:1T；7-trans-ノナデセン酸、19:1T；10,13-ノナデカジエン酸、19:2；11-trans-エイコセン酸、20:1T；および12-ヘンエイコセン酸、21:1の炭化水素鎖である。この局面のいくつかの態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は一緒になって、アミノ酸類似体の環状側鎖、例えば、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸を形成する。他の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖である。他の態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリンまたはプロリン誘導体の側鎖を形成する。特定の他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンのD-またはL-鏡像異性体の側鎖である。特定の態様において、R4は水素、メチルまたはエチル基でありうる。
もう一つの局面において、本明細書において開示する結合体は、式Iの構造を有し、R1はJ2プロスタノイド、例えば、プロスタグランジンJ2、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、または9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2の非カルボキシル部分である。この局面のいくつかの態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は一緒になって、アミノ酸類似体の環状側鎖、例えば、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸を形成する。他の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖である。さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖である。他の態様において、R3は、例えば、水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリンまたはプロリン誘導体の側鎖を形成する。特定の他の態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2はアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンのD-またはL-鏡像異性体の側鎖である。特定の態様において、R4は水素、メチルまたはエチル基でありうる。
さらにもう一つの局面において、本明細書において開示する結合体は、式IIの構造を有し、R1はJ2プロスタノイドまたは脂肪酸、例えば、哺乳動物脂肪酸または非哺乳動物脂肪酸の炭化水素鎖でありうる。この局面において、化合物がジペプチドに結合している脂肪酸アミドで構成されるように、R2およびR3は天然アミノ酸またはアミノ酸類似体の置換基であり；R4およびR5は天然アミノ酸またはアミノ酸類似体の置換基である。
もう一つの局面において、本発明は本明細書に開示する結合体の一つまたは複数を含む薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、本発明のさらにもう一つの局面を構成する治療法において用いることができる。これらの治療法において、本明細書に記載の一つまたは複数の結合体の治療上有効な量を含む薬学的組成物を、炎症、例えば、乾癬もしくは関節リウマチ、2型糖尿病、および/または抗HIVプロテアーゼカクテルなどの抗ウイルスプロテアーゼ阻害剤に関連する副作用などの医学的状態を患っている被験体に、そのような状態を治療するために投与する。
「脂質-アミノ酸結合体」は、脂質酸、例えば、J2プロスタノイドまたは脂肪酸と、アミノ酸とのN-結合体である。
本明細書において用いられる「エルミリ酸」とは、本明細書において定義する、式Iまたは式IIによって記載される構造を有する、N-脂肪酸-アミノ酸結合体を意味する。
本明細書において用いられる「J酸」とは、本明細書において定義する、式Iまたは式IIによって記載される構造を有する、J2プロスタノイド-アミノ酸結合体を意味する。
「N-脂肪酸-アミノ酸結合体」は、本明細書において、「N-脂肪酸-アミノ結合体」と交換可能に用いられる。
哺乳動物脂肪酸は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンテン酸、およびドコサテトラエン酸を含むが、それらに限定されるわけではない、哺乳動物において天然に産生されるものと構造が同じ、天然または合成脂肪酸である。
非哺乳動物脂肪酸は、ペンタデカン酸；ヘプタデカン酸；ノナデカン酸；ヘンエイコサン酸；9-trans-テトラデカン酸、14:1T；10-trans-ペンタデカン酸、15:1T；9-trans-ヘキサデセン酸、16:1T；10-ヘプタデセン酸、17:1；10-trans-ヘプタデセン酸、17:1T；7-trans-ノナデセン酸、19:1T；10,13-ノナデカジエン酸、19:2；11-trans-エイコセン酸、20:1T；および12-ヘンエイコセン酸、21:1を含むが、それらに限定されるわけではない、哺乳動物によって通常は産生されない、天然または合成脂肪酸である。
本明細書において用いられる、J2プロスタノイドとは、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、および9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2を含むが、それらに限定されるわけではない、プロスタグランジンJ2ならびにその誘導体および類似体を意味する。
本明細書において用いられる「天然アミノ酸」なる用語は、天然に見いだされるL-アミノ酸を意味し、D-アミノ酸およびアミノ酸類似体を除外する。
本明細書において用いられる「アミノ酸類似体」なる用語は、非天然L-アミノ酸および天然か非天然かにかかわらずD-アミノ酸、ならびにN-置換アミノ酸、例えば、N-メチルおよびN-エチルアミノ酸を含む。
本明細書において用いられる、ジペプチドとは、二つのアミド結合した化学基を意味し、ここで化学基はそれぞれ独立に天然アミノ酸またはアミノ酸類似体である。
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の引用文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配することになる。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであると思われる。
詳細な説明
脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸(N-脂肪酸-アミノ酸結合体)およびJ酸(J2プロスタノイド-アミノ酸結合体)、ならびにそれらの製造法および使用法が本明細書において開示される。これらの結合体は下記の化学基の少なくとも一つを含む：非哺乳動物脂肪酸、J2プロスタノイド、アミノ酸類似体、またはジペプチド。本発明の理解を助けるために、結合体は三群に分類することができる。第一群では、結合体は哺乳動物脂肪酸の炭化水素鎖(尾部)を含み、そのカルボキシル基はアミノ酸類似体のアミノ残基と反応してアミド結合N-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成している。第二群では、結合体は非哺乳動物脂肪酸またはJ2プロスタノイドの非カルボキシル部分(尾部)を含み、そのいずれかのカルボキシル基はアミノ酸類似体または天然アミノ酸いずれかのアミノ残基と反応してアミド結合N-脂肪酸-アミノ酸結合体またはアミド結合J2プロスタノイド-アミノ酸結合体を形成している。第三群では、結合体はジペプチドを含み、そのアミノ末端はJ2プロスタノイド、哺乳動物脂肪酸、または非哺乳動物脂肪酸いずれかのカルボキシル基と反応してアミド結合N-脂肪酸-アミノ酸結合体またはアミド結合J2プロスタノイド-アミノ酸結合体を形成している。上で用いられる「と反応して」という語句は、単に構造の可視化を助けるだけであって、どのように化合物が調製されるかについて暗に限定するものではない。これらのエルミリ酸およびJ酸は、機能障害性脂質代謝、インスリン感受性、グルコースホメオスタシス、および/または炎症に関与するものを含む、様々な障害を治療するために用いることができる。
脂質-アミノ酸結合体
開示する特定の脂質-アミノ酸結合体は下記の一般式(式I)で表すことができる：
Figure 2008506713
式Iにおいて、Cαは天然アミノ酸またはアミン酸類似体のアルファ-炭素である。R1、R2、R3、およびR4基は本明細書の他所で定義するとおりである。
1. 哺乳動物脂肪酸を含むエルミリ酸
一つの局面において、エルミリ酸は式Iの構造を有し、R1は哺乳動物脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、14:0；パルミチン酸、16:0；ステアリン酸、18:0；オレイン酸、18:1；リノール酸、18:2；リノレン酸、18:3；エイコサトリエン酸、20:3；アラキドン酸、20:4；エイコサペンテン酸、20:5；またはドコサテトラエン酸、22:4の炭化水素鎖(または尾部)である。例示的哺乳動物脂肪酸を図1に示す。図1に示す化合物はすべて、Nu-Check Prep, Inc. (Elysian, MN)から入手可能である。
この局面の特定の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は一緒になって、例えば、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、または1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸でありうるアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。他の態様において、R4は、例えば、水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル側鎖である。R2およびR3が図3に示すアミノ酸類似体の置換基である、これらの態様両方において、式Iのアルファ-炭素は図3において矢印で印を付けた炭素である。図3の「R」は脂肪酸分子へのアミド結合を形成し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成するために用いることができるアミノ基を示す。図3に示すアミノ酸類似体はすべて、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手可能である。
他の態様において、R2は、R2が下記の一般構造(式III)：
Figure 2008506713
を有するような、フェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体のフェニル側鎖である。これらの態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は式IIIの構造を有し、ここでXは、例えば、H、OH、CH2NH2、およびSO3でありうる。例示的フェニル-グリシン誘導体を図4に示し、これらはすべてRSP Amino Acid Analogues Inc. (Hopkinton, MA)から入手可能である。
さらに他の態様において、R2は、R2が下記の一般構造(式IV)：
Figure 2008506713
を有するような、フェニルアラニン誘導体のメチレン-フェニル側鎖である。これらの態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は式IVの構造を有し、ここでX、Y、およびZに対応する置換基の組は独立に、例えば、H、OH、OCH3、F、Cl、I、CH3、C2H5、i-C3H7、NH-CO-CH3、SH、NH2、CN、CH2NH2、COOH、CHO、NO2、CONH2、COCH3、またはCH2OHでありうる。特定の例において、X、Y、およびZ(X、Y、Z)はそれぞれ下記でありうる：(H、OH、H)；(H、OCH3、H)；(H、H、OH)；(H、H、OCH3)；(I、H、H)；(CH3、H、H)；(NH-CO-CH3、H、H)；(SH、H、H)；(NH2、H、H)；(Cl、H、H)；(CN、H、H)；(CH2NH2、H、H)；(COOH、H、H)；(NO2、H、H)；(CHO、H、H)；(C2H5、H、H)；(i-C3H7、H、H)；(OCH3、H、H)；(CONH2、H、H)；(COCH3、H、H)；(H、NO2、H)；(F、H、H)；(H、NH2、H)、および(CH2OH、H、H)。直前の置換基の組の群において、括弧でくくった置換基の組はそれぞれ、図5に示すフェニルアラニン誘導体と一致して、次の様式(X置換基、Y置換基、およびZ置換基)で配置していることに留意されたい。図5に示す化合物はすべてRSP Amino Acid Analogues Inc.から入手可能である。
さらに他の態様において、R3は、例えば、Hであり、R2およびR4は一緒になって、R2およびR4が一緒になって下記の構造(式V、VI、およびVII)：
Figure 2008506713
の一つを形成するような、プロリン誘導体を形成する。これらの態様において、R2およびR4は一緒になって式V、VI、およびVIIのいずれか一つの構造を形成し、矢印は式Iのα-炭素を示す。脂肪酸のR1炭化水素鎖は式V、VI、およびVIIの環構造の窒素分子にアミド結合し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成する。R2およびR4が式Vの環構造を形成する態様において、Xは、例えば、CN、CHO、CH2OH、CH2NH2、COOH、CH2CN、NH2、またはフェニルでありうる。
さらなる態様において、R3およびR4は、例えば、水素であり、R2は図2に示すD-アミノ酸(グリシン以外)を形成する。R2は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンなどのD-アミノ酸の側鎖でありうる。この局面の他の態様において、R2およびR3は、例えば、Hであり、それによりグリシン結合体を形成する。他の態様において、R3はHであり、R2およびR4は一緒になってD-プロリンを形成する。図2に示すアミノ酸はSigma- Aldrichから入手可能である。
2. 非哺乳動物脂肪酸を含むエルミリ酸
もう一つの局面において、エルミリ酸は式Iの構造を有し、R1は、ペンタデカン酸、15:0；ヘプタデカン酸、17:0；ノナデカン酸、19:0；ヘンエイコサン酸、21:0；9-trans-テトラデカン酸、14:1T；10-trans-ペンタデカン酸、15:1T；9-trans-ヘキサデセン酸、16:1T；10-ヘプタデセン酸、17:1；10-trans-ヘプタデセン酸、17:1T；7-trans-ノナデセン酸、19:1T；10,13-ノナデカジエン酸、19:2；11-trans-エイコセン酸、または20:1T；12-ヘンエイコセン酸、21:1などの非哺乳動物脂肪酸の炭化水素鎖(尾部)である。例示的非哺乳動物脂肪酸を図1に示す。
この局面のいくつかの態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンなどのアミノ酸のD-またはL-異性体の側鎖である。この局面の他の態様において、R2、R3、およびR4はHであり、それによりグリシン結合体を形成する。
他の態様において、R4は例えば、Hであり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、または1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸でありうるアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。他の態様において、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル側鎖である。R2およびR3が図3に示すアミノ酸類似体の置換基である、これらの態様両方において、式Iのアルファ-炭素は図3において矢印で印を付けた炭素である。図3の「R」は脂肪酸分子へのアミド結合を形成し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成するために用いることができるアミノ基を示す。
さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、R2が式IIIの一般構造有するような、フェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖であり、Xは、例えば、H、OH、CH2NH2、またはSO3でありうる。
さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、R2が式IVの一般構造を有するような、フェニルアラニン誘導体の側鎖であり、ここでX、Y、およびZに対応する置換基の組は独立に、例えば、H、OH、OCH3、F、Cl、I、CH3、C2H5、i-C3H7、NH-CO-CH3、SH、NH2、CN、CH2NH2、COOH、CHO、NO2、CONH2、COCH3、またはCH2OHでありうる。特定の例において、X、Y、およびZ(X、Y、Z)はそれぞれ下記でありうる：(H、OH、H)；(H、OCH3、H)；(H、H、OH)；(H、H、OCH3)；(I、H、H)；(CH3、H、H)；(NH-CO-CH3、H、H)；(SH、H、H)；(NH2、H、H)；(Cl、H、H)；(CN、H、H)；(CH2NH2、H、H)；(COOH、H、H)；(NO2、H、H)；(CHO、H、H)；(C2H5、H、H)；(i-C3H7、H、H)；(OCH3、H、H)；(CONH2、H、H)；(COCH3、H、H)；(H、NO2、H)；(F、H、H)；(H、NH2、H)、および(CH2OH、H、H)。直前の置換基の組の群において、括弧でくくった置換基の組はそれぞれ、図5に示すフェニルアラニン誘導体と一致して、次の様式(X置換基、Y置換基、およびZ置換基)で配置していることに留意されたい。
特定の他の態様において、R3は、例えば、Hであり、R2およびR4は一緒になって、プロリンまたは式V、VI、およびVIIのいずれか一つの構造を形成し、矢印は式Iのα-炭素を示す。脂肪酸のR1炭化水素鎖は式V、VI、およびVIIの環構造の窒素分子にアミド結合し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成する。R2およびR4が式Vの環構造を形成する態様において、Xは、例えば、CN、CHO、CH2OH、CH2NH2、COOH、CH2CN、NH2、またはフェニルでありうる。
3. N-脂肪酸-ジペプチドアミノ酸結合体
もう一つの局面において、エルミリ酸は脂肪酸に結合しているジペプチドを含む。これらの結合体は下記の一般式(式II)：
Figure 2008506713
を有する。(R2およびR3)ならびに(R4およびR5)は示したアルファ炭素を含む二つのアミノ酸の置換基であり、それにより脂肪酸にアミド結合しているジペプチドを形成する。ジペプチドは二つの天然アミノ酸、二つのアミノ酸類似体、または一つの天然アミノ酸および一つのアミノ酸類似体で構成されうる。いくつかの態様において、(R2およびR3)ならびに/または(R4およびR5)はD-アミノ酸、L-アミノ酸、またはアミノ酸類似体の置換基である。いくつかの態様において、R2およびR3は一緒になって、環状側鎖を有するアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。いくつかの態様において、R4およびR5は一緒になって、環状側鎖を有するアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。いくつかの態様において、R2およびR3はアミノイソ酪酸の二つのメチル基である。いくつかの態様において、R4およびR5はアミノイソ酪酸の二つのメチル基である。例示的N-脂肪酸-ジペプチドアミノ酸結合体には、グリシン-2-アミノイソ酪酸、アラニン-2-アミノイソ酪酸、グリシン-1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、アラニン-1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、グリシン-グリシン-COOH、グリシン-アラニン-COOH、アラニン-グリシン-COOH、およびアラニン-アラニン-COOHなどのジペプチドが含まれる。
結合体のいくつかの態様において、R1は、ミリスチン酸、14:0；パルミチン酸、16:0；ステアリン酸、18:0；オレイン酸、18:1；リノール酸、18:2；リノレン酸、18:3；エイコサトリエン酸、20:3；アラキドン酸、20:4；エイコサペンテン酸、20:5；ドコサテトラエン酸、22:4などの哺乳動物脂肪酸の炭化水素鎖(尾部)でありうる。
他の態様において、R1は、ペンタデカン酸、15:0；ヘプタデカン酸、17:0；ノナデカン酸、19:0；ヘンエイコサン酸、21:0；9-trans-テトラデカン酸、14:1T；10-trans-ペンタデカン酸、15:1T；9-trans-ヘキサデセン酸、16:1T；10-ヘプタデセン酸、17:1；10-trans-ヘプタデセン酸、17:1T；7-trans-ノナデセン酸、19:1T；10,13-ノナデカジエン酸、19:2；11-trans-エイコセン酸、20:1T；および12-ヘンエイコセン酸、21:1などの非哺乳動物脂肪の炭化水素鎖(尾部)でありうる。
4. J 2 プロスタノイド-アミノ酸結合体
もう一つの局面において、J酸は式Iの構造を有し、R1はJ2プロスタノイド、例えば、プロスタグランジンJ2、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、または9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2(CAY10410)の非カルボキシル部分(尾部)である。例示的J2プロスタノイドを図9に示し、これらはすべてCayman Chemical Company (Am Arbor, MI)から入手可能である。
この局面のいくつかの態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンなどのアミノ酸のD-またはL-異性体の側鎖である。この局面の他の態様において、R2、R3、およびR4はHであり、それによりグリシン結合体を形成する。
他の態様において、R4は例えば、Hであり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、または1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸でありうるアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。他の態様において、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル側鎖である。R2およびR3が図3に示すアミノ酸類似体の置換基である、これらの態様両方において、式Iのアルファ-炭素は図3において矢印で印を付けた炭素である。図3の「R」は脂肪酸分子へのアミド結合を形成し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成するために用いることができるアミノ基を示す。
さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、R2が式IIIの一般構造有するような、フェニル-グリシンまたはフェニル-グリシン誘導体の側鎖であり、Xは、例えば、H、OH、CH2NH2、またはSO3でありうる。
さらに他の態様において、R3およびR4は、例えば、Hであり、R2は、R2が式IVの一般構造を有するような、フェニルアラニン誘導体の側鎖であり、ここでX、Y、およびZに対応する置換基の組は独立に、例えば、H、OH、OCH3、F、Cl、I、CH3、C2H5、i-C3H7、NH-CO-CH3、SH、NH2、CN、CH2NH2、COOH、CHO、NO2、CONH2、COCH3、またはCH2OHでありうる。特定の例において、X、Y、およびZ(X、Y、Z)はそれぞれ下記でありうる：(H、OH、H)；(H、OCH3、H)；(H、H、OH)；(H、H、OCH3)；(I、H、H)；(CH3、H、H)；(NH-CO-CH3、H、H)；(SH、H、H)；(NH2、H、H)；(Cl、H、H)；(CN、H、H)；(CH2NH2、H、H)；(COOH、H、H)；(NO2、H、H)；(CHO、H、H)；(C2H5、H、H)；(i-C3H7、H、H)；(OCH3、H、H)；(CONH2、H、H)；(COCH3、H、H)；(H、NO2、H)；(F、H、H)；(H、NH2、H)、および(CH2OH、H、H)。直前の置換基の組の群において、括弧でくくった置換基の組はそれぞれ、図5に示すフェニルアラニン誘導体と一致して、次の様式(X置換基、Y置換基、およびZ置換基)で配置していることに留意されたい。
特定の他の態様において、R3は、例えば、Hであり、R2およびR4は一緒になって、プロリンまたは式V、VI、およびVIIのいずれか一つの構造を形成し、矢印は式Iのα-炭素を示す。脂肪酸のR1炭化水素鎖は式V、VI、およびVIIの環構造の窒素分子にアミド結合し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体を形成する。R2およびR4が式Vの環構造を形成する態様において、Xは、例えば、CN、CHO、CH2OH、CH2NH2、COOH、CH2CN、NH2、またはフェニルでありうる。
5. J 2 プロスタノイド-ジペプチドアミノ酸結合体
もう一つの局面において、エルミリ酸はJ2プロスタノイド、例えば、プロスタグランジンJ2、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、または9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2(CAY10410)に結合しているジペプチドを含む。これらの結合体は下記の一般式(式II)：
Figure 2008506713
を有する。(R2およびR3)ならびに(R4およびR5)は示したアルファ炭素を含む二つのアミノ酸の置換基であり、それによりJ2プロスタノイドにアミド結合しているジペプチドを形成する。ジペプチドは二つの天然アミノ酸、二つのアミノ酸類似体、または一つの天然アミノ酸および一つのアミノ酸類似体で構成されうる。いくつかの態様において、(R2およびR3)ならびに/または(R4およびR5)はD-アミノ酸、L-アミノ酸、またはアミノ酸類似体の置換基である。いくつかの態様において、R2およびR3は一緒になって、環状側鎖を有するアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。いくつかの態様において、R4およびR5は一緒になって、環状側鎖を有するアミノ酸類似体の環状側鎖を形成する。いくつかの態様において、R2およびR3はアミノイソ酪酸の二つのメチル基である。いくつかの態様において、R4およびR5はアミノイソ酪酸の二つのメチル基である。例示的J2プロスタノイド-ジペプチドアミノ酸結合体には、グリシン-2-アミノイソ酪酸、アラニン-2-アミノイソ酪酸、グリシン-1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、アラニン-1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、グリシン-グリシン-COOH、グリシン-アラニン- COOH、アラニン-グリシン-COOH、およびアラニン-アラニン-COOHなどのジペプチドが含まれる。
脂質-アミノ酸結合体の調製法
下記のプロトコルにおいて、「脂肪酸」とは、例えば、図1に示す脂肪酸のいずれか一つを意味し、「J2プロスタノイド」とは、例えば、図9に示す化合物のいずれか一つを意味し、アミノ酸とは、例えば、図2〜6に示すアミノ酸のいずれか一つを意味する。前述のとおり、R1は脂肪酸またはJ2プロスタノイドの非カルボキシル部分(尾部)を意味し、R2はアミノ酸の側鎖を意味する。反応条件および試薬の濃度は、用いる脂肪酸またはJ2プロスタノイドおよびアミノ酸基の必要性に応じて変動する。非哺乳動物脂肪酸-アミノ酸結合体を調製するために、様々なプロトコルを用いることができる。以下に記載するプロトコルは、量をスケールアップまたはダウンすることもでき、化学的に等価の試薬を示した試薬の代わりに用いることもできる。
アミノ酸メチルエステルは、供給業者、例えば、RSP, Amino Acid Analogues, Inc.から購入することができる。または、アミノ酸メチルエステルはアミノ酸またはアミノ酸類似体(約200mgから約2g)をHCl飽和メタノール(約30から約300ml)に溶解し、6〜12時間還流することにより合成することもできる。次いで、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素塩で分配して、痕跡量の未反応アミノ酸を除去する。
プロトコル#1
下記のプロトコルは、脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸を調製するための一つの方法を記載する。プロトコルの一般スキームについては、図7を参照されたい。例えば、このプロトコルは下記のいずれの製造にも適している：長鎖脂肪酸のD-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-フェニルアラニン、D-アスパラギン、D-グルタミン、およびγ-アミノ酪酸結合体。これらの長鎖脂肪酸には、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、エイコサトリエン酸、エイコサペンテン酸、およびドコサテトラエン酸が含まれる。このプロトコルは脂肪酸、J2プロスタノイド、またはアミノ酸基のいずれと用いるのにも適している。
一般に、このプロトコルは下記の段階を含む。0.5〜1.5mlのトリエチルアミンを含む5〜10mlの塩化メチレン中、10ミリ当量(m当量)のアミノ酸メチルエステルHClの溶液を調製し、0℃に冷却する。2〜5mlの塩化メチレン中、10m当量の脂肪酸塩化物またはJ2プロスタノイド塩化物の溶液をアミノ酸エステル溶液に加え、0〜4℃で、結合を完了するのに十分な時間、例えば、60、120、180、または240分間反応させる。同量の水を加えて反応を停止し、次いで反応混合物を酢酸エチルで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発乾固する。脂質-アミノ酸結合体メチルエステル生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、1.5％メタノール/塩化メチレンで溶出する。他のプロトコルを用いることもできる。
テトラヒドロフラン(約2から約3ml)中、N-脂肪酸またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体メチルエステル(約0.6から約1.0nmol)の溶液を、1M水酸化リチウム水溶液(約0.5〜約1.0ml)で処理する。混合物を窒素雰囲気下、室温で45分間撹拌し、続いて減圧下で蒸発させる。残渣を10〜20mlの水で希釈し、HClでpH3.0まで酸性化し、酢酸エチルで抽出する。合わせた抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させる。エルミリ酸またはJ酸生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、メタノール/塩化メチレンで溶出する。
プロトコル#2
下記のプロトコルは、脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸の代替調製法を記載する。図7はこのプロトコルの一般スキームも提供する。塩化メチレン中の脂肪酸塩化物またはJ2プロスタノイド塩化物の溶液を、5％トリエチルアミンを含む塩化メチレン中のアミノ酸メチルエステルと、室温で2〜8時間反応させる。次いで、混合物を酢酸エチルと希HClとの間で分配し、洗浄し、乾燥し、蒸発させて油状残渣とする。この残渣をテトラヒドロフランに溶解し、LiOHと窒素雰囲気下、室温で4〜10時間撹拌することにより鹸化する。生成物を水で希釈し、HClでpH3.0まで酸性化し、酢酸エチルで抽出する。合わせた抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させ、薄層クロマトグラフィで精製する。
プロトコル#3
下記のプロトコルは、脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸の代替調製法を記載する。このプロトコルの一般スキームについては、図8を参照されたい。10〜100mgの脂肪酸またはJ2プロスタノイドを、5〜50mlの酢酸エチル中のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(4〜40mg)溶液に加え、続いて9〜90mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。混合物を室温で12〜36時間反応させた後、ジオキサン-KOH-NaHCO3混合物(2〜20ml)中、10mgのアミノ酸を加え、40℃でさらに24〜72時間反応させる。次いで、混合物をHClで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、生成物を薄層クロマトグラフィで単離する。
使用法
本明細書に開示する脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸およびJ酸は、ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター(PPAR)ファミリーメンバーPPARγの調節物質として用いることができる。一つまたは複数の脂質-アミノ酸結合体を、いくつかのペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター(PPAR)活性化アッセイ法(下記のとおり)の一つでスクリーニングして、結合体のPPARγ活性化効力を評価することができる。一つまたは複数のエルミリ酸またはJ酸を、PPARγ調節に関与する障害、例えば、糖尿病または脂質代謝およびグルコースホメオスタシスの障害を治療するために用いることができる。エルミリ酸またはJ酸は、特定の抗レトロウイルス療法に関連する脂肪異栄養症およびインスリン耐性を治療するために抗レトロウイルス薬投与を受けている患者に同時投与することもできる。
PPARはステロイド/甲状腺ホルモン/レチノイドレセプタースーパーファミリーに属するトランスデューサータンパク質である。PPARの三つのサブタイプが同定され、PPAR-アルファ(PPAR-α)、PPAR-ベータ(PPAR-β)またはPPAR-デルタ(PPAR-δ)、およびPPAR-ガンマ(PPAR-γ)と命名されている。これらのレセプターは、レチノイドXレセプター(RXR)とのヘテロダイマーとして標的遺伝子の反応性DNA配列に結合することにより、それら遺伝子の発現を制御する、活性化因子調節転写因子として機能する。
PPARαサブタイプがアフリカツメガエル(Xenopus)、ヒト、マウス、およびラットから；PPARβ(またはPPARδ)サブタイプがアフリカツメガエル、ヒト、およびマウスから；およびPPARγサブタイプがアフリカツメガエル、ヒト、およびハムスターからクローニングされている。これらのサブタイプは薬理学的に異なり、様々な物質により区別して活性化される(Yu et al, Cell, 67:1251-1266, 1991)。下記は対応するGenbankアクセッション番号である：PPARα(δ)(AF246303)、PPARβ(AL022721)、およびPPARγ(AY157024)。PPARγは少なくとも二つのアイソタイプ、PPARγ1およびPPARγ2として存在する。PPARγ2は脂肪組織で選択的に発現されるが、PPARγ1は様々な他の齧歯動物およびヒト組織において低いレベルで発現される(Spiegelman, Diabetes, 47:507-514, 1998)。
PPARγは核内レセプタースーパーファミリーの薬理学的に重要なメンバーである(Houseknecht et al., Domest. Anim. Endocrinol., 22:1-23, 2002)。これは脂質代謝、グルコースホメオスタシス、および脂肪細胞分化を含む広範囲の生体プロセスにおいて重要な役割を果たす。PPARγリガンド結合ドメインの結晶構造により、リガンド結合のための大きい疎水性の空洞が明らかにされている(Uppenberg et al., J. Biol. Chem., 273:31108-12, 1998；およびXu et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U S A, 98:13919-24, 2001)。事実、PPARγは、抗生物質チアゾリジンジオン(TZD)(Lehmann et al., J. Biol. Chem., 270:12953-6, 1995；Willson et al., J. Med. Chem., 39:665-8, 1996)、合成チロシン類似体GW347845(Cobb et al., J. Med. Chem., 41:5055-5069, 1998)、多価不飽和脂肪酸(Kliewer et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 94:4318-23, 1997)、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2および他のJ2プロスタノイドを含むアラキドン酸の代謝物(Forman et al., Cell, 83:803-12, 1995；Kliewer et al., Cell, 83:813-9, 1995)、NSAID(Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3406-10, 1997)、ならびに13-ヒドロキシオクタデカジエン酸(13-HODE)および15-ヒドロキシエイコサトラエン酸(15-HETE)などの酸化低密度リポタンパク質の化合物(Nagy et al., Cell, 93:229-40, 1998)を含む広範囲の合成および天然物質に結合する。
これらのPPARγリガンドのいくつかはインビボで抗炎症活性を示し(Kawahito et al., J. Clin. Invest., 106:189-97, 2000；Naito et al., Aliment Pharmacol. Ther., 15:865-73, 2001)、PPARγの活性化は抗炎症(Jiang et al., Nature, 391:82-6, 1998)、および抗腫瘍プロセス(Patel et al., Curr. Biol., 11:764-8, 2001)に直接連関している。したがって、PPARγの活性化はインターロイキン(IL)-1β、腫瘍壊死因子α(TNFα)、および酸化窒素(NO)などのサイトカインの発現を、タンパク質および転写の両方のレベルで阻害する(Jiang et al., Nature, 391:82-6, 1998；Ricote et al., Nature, 391:79-82, 1998)。PPARγは脂肪組織、骨格筋、副腎、結腸上皮、心臓、膵臓、および肝臓で発現される(Mukherjee et al., J. Biol. Chem., 272:8071-6, 1997；Sarraf et al., Nat. Med., 4:1046-52, 1998)。これは脾細胞(Clark et al., J. Immunol., 164:1364-71, 2000；Kliewer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 91:7355-9, 1994)、滑膜細胞(Ji et al., J. Autoimmun., 17:215-21, 2001；Kawahito et al., J. Clin. Invest., 106:189-97, 2000；Simonin et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol., 282:C125-33, 2002)、ヘルパーT細胞(Clark et al., J. Immunol., 164:1364-71, 2000)、ならびに活性化単球およびマクロファージ(Jiang et al., Nature, 391:82-6, 1998；Kawahito et al., J. Clin. Invest., 106:189-97, 2000；Ricote et al., Nature, 391:79-82, 1998)などの免疫系関連細胞でも発現され、PPARγが脂質代謝およびグルコースホメオスタシスにおけるその役割に加えて、炎症の調節においても直接の役割を有することが示唆される。
PPARγは、レセプターを発現する様々な細胞型における増殖および分化の調節に関与する遺伝子の発現を調節する。PPARγは脂肪組織に特異的な様式で発現されることが明らかにされている。その発現はいくつかの前脂肪細胞株の分化過程早期に誘導される。PPARγは脂肪生成シグナリングカスケードにおいて役割を果たし、エネルギーホメオスタシスの調節に関与するob/レプチン遺伝子も調節する。
一つの局面において、PPARγに関与する自己免疫疾患または障害を、新脂質-アミノ酸結合体、例えば、N-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体である、またはこれを含むPPARγ調節物質を用いて治療するために、新しい方法および組成物を用いることができる。一般に、この方法は、真性糖尿病などの自己免疫疾患に関与するタンパク質、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)などの炎症サイトカインをコードする遺伝子の発現、またはIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、およびTNF-αなどの炎症サイトカイン産生の阻害、もしくはそれらの生物活性の阻害を調節するのに十分な量のPPARγ調節物質を提供することを含む。PPARγ調節物質は単独で用いることもできるが、この治療法は既存の天然または合成活性化物質、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤、糖尿病の既存の治療法、ならびに病的細胞におけるアポトーシスを調節する物質などの他の治療法との組み合わせで投与することもできる。
一つの態様において、治療する細胞は炎症障害に関与するものである。これらには、炎症(免疫系)細胞(例えば、Tリンパ球およびマクロファージ)、PPARγ発現細胞、ならびにブドウ膜炎およびブドウ膜網膜炎のすべての型、虹彩炎、毛様体炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、硝子体炎、角膜炎と、結膜炎を含む炎症疾患、全身性自己免疫障害(例えば、1型糖尿病、シェーグレン症候群、および甲状腺機能亢進症)、および膠原血管病(例えば、強直性脊椎炎、関節リウマチ、エリテマトーデス、ライター症候群、ベーチェット病、潰瘍性大腸炎、クローン病、およびウェゲナー肉芽腫症)の病因に関与する組織が含まれる。
もう一つの態様において、治療する細胞は、糖尿病被験体の膵臓β細胞などの自己免疫障害に関与するものである。
1. PPARγ活性化アッセイ法
本明細書に記載の脂質-アミノ酸結合体のPPARγ活性化効力を、下記のアッセイ法の一方または両方を用いてインビトロで試験することができる。
a)オイルレッドOアッセイ法は、Mukherjee et al., J. Biol Chem., 272:8071-6, 1997に記載のとおりに実施することができる、脂肪細胞鑑別アッセイ法である。オイルレッドO(1-[[4-[(ジメチルフェニル)アゾ]ジメチルフェニル]アゾ]-2-ナフトール)は、トリグリセリドおよびコレステリルエステルなどの中性脂質を多く含む領域を可視化するために、組織検査で広く用いられる高親油性色素である。この色素はその吸光特性により強い赤色を生じる；λmax=518nm。培養中の完全細胞をPPAR-γアゴニストで処理すると中性脂質が蓄積されることが多く、これらは光学顕微鏡で観察されることもあるが、四酸化オスミウムで黒く、オイルレッドOで赤く染色することができる。これはPPAR-γ活性化の強い指標と考えられている(例えば、Lenhard et al, Antiviral Res., 47:121-129, 2000；Landsberg et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 100:2456-2461, 2003；Starkey et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 88:55-59, 2003；Tang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 100:850-855, 2003参照)。
一般に、オイルレッドアッセイ法は、3T3 L1線維芽細胞(American Type Culture Collection)などの細胞を、10％ウシ血清を補足したDMEM培地中、コンフルエントになるまで培養することを含む。このアッセイ法において、GW347845は陽性対照として用いることができる強力なPPARγ特異的リガンドであり(Cobb et al., J. Med. Chem., 41:5055-5069, 1998)、一方で媒体処理した細胞を基準線対照として用いる。コンフルエントに達した2日後、細胞を下記と接触させる：(i)1〜100μgの脂質-アミノ酸結合体および媒体(例えば、0.1％DMSO)、(ii)GW347845および媒体、または(iii)媒体単独。10mg/mlのインスリン存在下で1日おきに処理を行う。コンフルエントな状態で、脂質酸-アミノ酸結合体で3〜14日間処理し、GW347845で7日間処理した後、細胞を固定し、オイルレッドO(Sigma)で染色する。
オイルレッドO染色を下記のとおりに行う：(1)培地を除去し、0.5mlのホルマリンを細胞に加え、(2)1時間後、ホルマリンを除去して、細胞を水で2回洗浄し、(3)0.1mlのオイルレッド染色溶液を加えて室温で1時間反応させ、(4)染色した細胞を水で洗浄し、完全に排液し、次いで37℃で1時間乾燥し、(5)色素を1.00mlのイソプロピルアルコールにより振盪機上で15分間抽出し、および(6)510nmの吸光度を測定する。
b)PPARγ活性化効力は、「脂質取り込み」アッセイ法を用いて試験することもでき、これは下記のとおりに実施することができる。細胞、例えば、C6ラット神経膠腫細胞の単層を24穴培養皿に調製する。カルボキシ標識[14C]オレイン酸(150,000dpm/ウェル)(American Radio Chemicals (ARC) St. Louis, MOから入手；比活性：55mCi/mmol)を各単層に加え、4℃で2時間インキュベートする。次いで、細胞を、媒体、例えば、各単層を覆う培地1mlに10μlのDMSOを加えたものの中で、N-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体で処理する。処理を、特に記載がある場合を除いて48時間続け、予備試験で放射性同位体標識した脂質はあったとしても非常に少量であることが判明したため、その時点で培地を除去して廃棄する。PBS(1ml)で洗浄した後、細胞脂質を0.5mlの95％エタノールにより室温で0.5時間抽出する。処理を四つ組で実施することができ；媒体処理細胞を対照とする。
減圧下で蒸発させる前に、[14C]コレステロール(50,000dpm)(ARCから；比活性：50mCi/mmol)を回収マーカーとして加える。次いで、試料残渣を、それぞれ10μgのステロイル-アラキドノイルジグリセリド、トリオレイン、およびホスファチジルコリン(PC)を含むメタノール30μlに溶解し、0.25mmシリカゲル薄層プレートに吸着させる。中性脂質の分析のために、第一溶出をジクロロメタン：アセトン(90:10)で実施する。標準のRf値は次のとおりである：PC=0、コレステロール=0.38、ジアシルグリセリド(DG)=0.64、およびトリアシルグリセリド(TG)=0.81。中性脂質の定量後、リン脂質の分析のための溶離剤としてクロロホルム：メタノール：酢酸：水(50:25:8:2)を用い、第二溶出を行う。PCのRf値は0.33で；DGおよびTGは溶媒前部に移動した。ヨウ素蒸気に曝露することによりすべての標準を検出することができる。
TLCプレートをX線フィルムに48時間曝露することにより、放射能帯域を検出する。登録商標FLUOR-S System(Bio-Rad)を用いて、フィルムのコンピューター画像を得ることができる。クロマトグラムの放射能を、NIH画像ソフトウェアを用いて定量することができる。帯域はすべて狭く鋭いピークを示したため、ディスプレイのピーク高さの値を用いる。各帯域の個々のコレステロール標準値を用いて、これらの回復について調節する。得られた値を各ウェル中の細胞数で除し、結果を指数/細胞百万個で表す。
2. 糖尿病を治療するための脂質-アミノ酸結合体の使用
いくつかの脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸およびJ酸は血糖値および血中トリグリセリド値を低下させることができ、したがって糖尿病および肥満などの障害を治療するために有用である。
一つの態様において、糖尿病などの自己免疫障害の治療において、一つまたは複数のエルミリ酸またはJ酸を用いてPPARγを調節する。糖尿病は、膵臓β細胞の不全および/または破壊を通じて起こる、多因子性疾患である。炎症サイトカインが膵島β細胞に対して細胞毒性を有するとの考え(Rabinovitch, J. Clin. Endocrinol. Metab., 71:152-6, 1990)およびこの細胞毒性はインスリン依存性糖尿病(IDDM)におけるβ細胞破壊において役割を果たすとの考えを支持する多くの証拠がある。
肥満関連非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)の何年も前からインスリン抵抗性が見られ、この時期には膵臓β細胞による有効な代償作用を通じて正常な血糖値が維持される。肥満者の約20％で、代償作用が低下し、高血糖が現れ、顕性INDDMが診断される。β細胞機能の抑制は肥満者の脂肪細胞から放出される過剰の遊離脂肪酸によると考えられ(Campbell et al., Am. J. Physiol., 266:E600-5., 1994；DeFronzo, Diabetes Metab. Rev., 4:727-47, 1988)、β細胞の機能を最初は刺激するが、最終的には障害し、したがってそれらの代償能力を制限する。したがって、β細胞機能障害はIDDMおよびNIDDM両方の特徴である。
エルミリ酸およびJ酸は、インスリン抵抗性(II型糖尿病)、糖耐性障害、異脂肪血症；高血圧、肥満、インスリン抵抗性、高血糖、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、冠動脈疾患、および糖尿病に関連する他の心血管障害などのX症候群に関連する障害の改善、治療、および/または予防のために有用である。糖尿病に関連する他の障害にはPPARγ調節物質の抗アポトーシス作用が含まれ、これは変性性および異栄養性疾患におけるような、早期死滅から細胞、例えば、糖尿病性網膜症ならびに「湿性」(滲出性)および「乾性」(輪紋状)両方の年齢関連性黄斑変性症における網膜 神経および膠細胞を保護し、それらの生存を促進するのに役立つ。
被験体への投与の前に、エルミリ酸またはJ酸の生物活性(すなわち、細胞増殖を低減する能力)についてインビトロとインビボの両方で試験することができる。インビトロ試験は本明細書に記載の実施例において記載するとおりに実施することができる。糖尿病のインビボ動物モデル、例えば、Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)からの肥満マウス(ob/ob)、および糖尿病(db/db)マウスも当技術分野において周知である(例えば、Collins et al., J. Biol. Chem., 271:9437-9440, 1996；Darling, Curr. Opin. Genet. Dev., 6:289-294, 1996；Andersson, Ann. Med., 28:5-7, 1996；Van Heek et al, J. Clin. Invest., 99:385-390, 1997参照)。これらの動物モデルを用いて、糖尿病および肥満に対するN-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体の効果を評価することができる。
3. 脂質代謝およびグルコースホメオスタシス障害を治療するための脂質-アミノ酸結合体の使用
もう一つの態様において、一つまたは複数の脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸を被験体に投与してPPARγを調節し、それにより脂質代謝およびグルコースホメオスタシスに関連する障害を治療または改善する。
脂肪組織は脊椎動物の脂質ホメオスタシスおよびエネルギーバランスの維持において中心的役割を果たす。脂肪細胞は、栄養供給期間中にトリグリセリドの形でエネルギーを貯蔵し、栄養欠乏時には遊離脂肪酸の形でエネルギーを放出する。白色脂肪組織の発生は、生涯を通しての持続的分化プロセスの結果である。多くの証拠が、この細胞分化の開始および調節におけるPPARγ活性化の中心的役割を示している。いくつかの高度に特殊化されたタンパク質が脂肪細胞分化中に誘導され、そのほとんどは脂質の貯蔵および代謝に関与している。したがって、PPARγを調節するいくつかのエルミリ酸およびJ酸を用いて、脂肪細胞組織分化を調節することにより、脂質代謝およびグルコースホメオスタシスを調節することができる。
PPARγの活性化からグルコース代謝における変化、特に筋肉におけるインスリン抵抗性の低下への正確な関連はまだ解明されていない。理論に縛られるつもりはないが、可能性のある関連は遊離脂肪酸を介するものである。PPARγの活性化は脂肪組織においてリポタンパク質リパーゼ(LPL)、脂肪酸輸送タンパク質(FATP)およびアシル-coAシンセターゼ(ACS)を誘導するが、筋肉組織では誘導しない。これは次いで、血漿中の遊離脂肪酸濃度を劇的に低下させ、細胞レベルでの基質競合により、骨格筋や他の代謝率の高い組織は最終的に脂肪酸酸化からグルコース酸化に切りかわり、その結果としてインスリン抵抗性が低下する。PPARγは脂肪酸のβ-酸化の刺激に関与している。したがって、PPARγを調節するいくつかの結合体を用いて、血漿中の脂肪酸濃度を調節することにより、インスリン抵抗性を調節することができる。
4. PPARγに関与する炎症を治療するための脂質-アミノ酸結合体の使用
もう一つの態様において、PPARγ活性を活性化する一つまたは複数の脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸を用いて、PPARγ活性化によって阻害される望ましくない炎症応答反応に関連する障害を治療することができる。したがって、エルミリ酸またはJ酸を、関節リウマチ、エリテマトーデス、乾癬、湿疹、多発性硬化症、糖尿病、および甲状腺炎などの免疫仲介性炎症疾患を含むが、それらに限定されるわけではない疾患の治療のために用いることができる。加えて、本発明の化合物は骨形成/吸収を改善することができ、強直性脊椎炎、痛風、痛風に関連する関節炎、骨関節炎、および骨粗鬆症を含むが、それらに限定されるわけではない状態の治療において有用である。
乾癬は鱗屑剥離および炎症の慢性皮膚疾患である。乾癬は、皮膚細胞が皮膚表面下の起源から急に現れ、成熟する機会を持たずに表面上に蓄積して発症する。典型的には、この動き(代謝回転とも呼ばれる)は約1ヶ月かかるが、乾癬の場合にはほんの数日で起こることもある。その典型的形態において、乾癬は銀色の鱗屑に覆われた厚い炎症性の皮膚パッチを生じる。これらのパッチはプラークと呼ぶこともあるが、通常はそう痒または触痛を伴う。肘、膝、脚の他の部分、頭皮、下背、顔、手掌、および足底に生じることが最も多いが、体のいかなる部分の皮膚にも生じうる。乾癬の診断は主にこれらの特徴的症状に基づく。皮膚生検も診断において有用でありうる。乾癬性関節炎が一部の乾癬患者に認められ、手指および足指の末端の関節を冒すことが多い。脊椎に波及している場合は背痛が起こることもある。PPARγ活性を活性化する脂質-アミノ酸結合体は、乾癬あるいは乾癬の一つもしくは複数の症状または乾癬性関節炎の治療、予防、または軽減において、例えば、局所用薬学的組成物として有用でありうる。
関節リウマチは疼痛、腫脹、硬直、および関節の機能損失を生じる自己免疫炎症疾患である。関節リウマチは対称パターンで現れることが多い。この疾患は手に最も近い手首および手指関節、ならびに体の他の部分を冒しうる。加えて、関節リウマチ患者は疲労、不定期発熱、および全身倦怠感を有することもある。関節リウマチの診断の可能性がある因子には「リウマチ因子」血液抗体およびシトルリン抗体が含まれる。PPARγ活性を活性化する脂質-アミノ酸結合体は、関節リウマチまたは関節リウマチの一つもしくは複数の症状の治療、予防、または軽減において、例えば、局所または全身用薬学的組成物として有用でありうる。
5. 抗レトロウイルス療法における脂質-アミノ酸結合体の使用
さらにもう一つの態様において、一つまたは複数の脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸を、抗レトロウイルス療法、例えば、抗HIV療法と共に用いる。HIV感染患者に投与するプロテアーゼ阻害剤カクテルなどの、強力な抗レトロウイルス療法の使用増大は、抗レトロウイルス療法に関連する合併症の増加を招いている。合併症にはインスリン抵抗性および脂肪異栄養症が含まれる。
脂肪異栄養症は脂質代謝および脂肪再分布における有害な変化を含む。PPARγを活性化する小分子が、先天性脂肪異栄養症の患者に投与されており、これらの分子は報告によれば脂肪生成を刺激し、インスリン感受性を改善した。Arioglu et al., Ann. Intern. Med., 133:263-74, 2000を参照されたい。これに基づき、フィブレートおよびチアゾリジンジオンなどのPPARγ活性化物質も、脂肪異栄養症およびインスリン抵抗性などの関連する合併症を低減するための、HIVプロテアーゼ阻害剤の補助剤として研究されており、例えば、Hadigan et al., Ann Intern Med., 140:786-794, 2004を参照されたい。
したがって、PPARγを活性化する脂質-アミノ酸結合体は、関連する合併症を低減するための抗レトロウイルス療法の補助剤として投与することもできる。例えば、抗HIV治療を必要としている患者に、一つまたは複数のエルミリ酸またはJ酸の有効量を抗HIVプロテアーゼ阻害剤カクテルと同時投与することができる。エルミリ酸またはJ酸の同時投与は、脂肪異栄養症およびインスリン抵抗性などの抗HIV治療に関連する副作用を抑えることができる。
薬学的組成物
一つまたは複数の脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸を含む薬学的組成物は、通常の技術(例えば、Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 19th Ed., 1995に記載のとおり)によって調製することができる。組成物は、カプセル剤、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤、または局所適用などの通常の形であってもよい。
典型的組成物は、担体もしくは希釈剤であってもよく、または担体で希釈されていてもよく、あるいはカプセル、サシェ、紙、または他の容器の形でありうる担体内に封入されていてもよい、薬学的に許容される賦形剤を伴う、エルミリ酸またはJ酸を含む。組成物を製造する際に、薬学的組成物を調製するための技術を用いてもよい。例えば、目的の化合物を典型的には担体と混合する、または担体で希釈する、あるいはアンプル、カプセル、サシェ、紙、または他の容器の形でありうる担体内に封入することになる。担体が希釈剤として役立つ場合、担体は固体、半固体または液体材料であってもよく、これは活性化合物の媒体、賦形剤、または媒質としてはたらく。目的の化合物を顆粒状固体容器、例えば、サシェに吸着させることもできる。適当な担体のいくつかの例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ひまし油、落花生油、オリーブ油、乳糖、白土、ショ糖、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、ペクチン、アカシア、ステアリン酸またはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、ならびにポリビニルピロリドンである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当技術分野において公知の任意の徐放性材料を、単独またはワックスと混合して含んでいてもよい。製剤は湿潤剤、乳化および懸濁化剤、保存剤、甘味料または着香剤を含んでいてもよい。本発明の製剤は、当技術分野において周知の方法を用いることにより、患者への投与後に活性成分の急速、徐放性、または遅延放出を提供するように製剤してもよい。
薬学的組成物は滅菌し、望まれる場合には補助剤、乳化剤、浸透圧に影響をおよぼすための塩、緩衝剤および/または着色物質などであって、活性化合物と有害な反応をしないものと混合することもできる。
投与経路は、経口、鼻内、肺内、経皮、または非経口、例えば、直腸内、デポー、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、点眼液もしくは軟膏などの、脂質-アミノ酸結合体を適当な、または望ましい作用部位に有効に輸送するいかなる経路であってもよく、典型的には経口経路である。
鼻内投与のために、製剤はエアロゾル適用のための液体担体、特に水性担体に溶解または懸濁したエルミリ酸またはJ酸を含んでいてもよい。担体は可溶化剤、。例えば、プロピレングリコール、界面活性剤、レシチン(ホスファチジルコリン)もしくはシクロデキストリンなどの吸収促進剤、またはパラベンなどの保存剤などの添加物を含んでいてもよい。
局所用製剤を調製するために、エルミリ酸またはJ酸を当技術分野において公知の皮膚用媒体中に混合する。そのような局所用薬学的組成物は多くの形、例えば、皮膚に塗布するために適応させた液剤、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー、またはエアロゾル製剤で存在しうる。本明細書に記載の方法において有用な組成物中の活性成分の重量パーセントは、典型的には薬学的に許容される担体との混合物中0.01％から10％、例えば、0.01％から1％、0.1％から10％、0.01％から1％、1％から5％、または5％から10％(組成物の全重量に基づき)の範囲である。本明細書に記載の組成物において、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンAおよびEオイル、鉱油、ならびにポリエチレングリコールなどの様々な担体材料を用いることができる。組成物はジメチルスルホキシド(DMSO)または他の浸透化剤を含むこともできる。他の添加物、例えば、保存剤、芳香剤、日焼け止め剤、または他の美容成分も、組成物中に含まれうる。
眼科適用のために、エルミリ酸またはJ酸を眼への使用に適した液剤、懸濁剤、および軟膏に製剤する。濃度は通常は局所製剤について前述したとおりである。眼科用製剤について(Mitra (ed.), Ophthalmic Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1993およびHavener, W. H., Ocular Pharmacology, C.V. Mosby Co., St. Louis, 1983参照)。
経口投与のために、固体または液体いずれかの単位剤形を調製することができる。錠剤などの固体組成物を調製するために、エルミリ酸またはJ酸を、タルク、ステアリン酸マグネシウム、リン酸2カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、乳糖、アカシア、メチルセルロース、および薬学的希釈剤または担体として機能的に類似の材料などの通常の成分と共に、製剤中に混合する。
カプセル剤は、エルミリ酸またはJ酸を不活性薬学的希釈剤と混合し、混合物を適当なサイズのゼラチン硬カプセルに充填することにより調製する。ゼラチン軟カプセルは、目的の化合物のスラリーを許容される植物油、軽質流動パラフィン、または他の不活性油と共に機械でのカプセル化により調製する。シロップ、エリキシル、および懸濁剤などの経口投与用の液体単位剤形も調製することができる。水溶性の形を糖、芳香着香剤および保存剤と共に水性媒体中に溶解して、シロップ剤を調製することができる。エリキシル剤は、糖およびサッカリンなどの適当な甘味料を含む水性アルコール(例えば、エタノール)媒体を、芳香着香剤と共に用いることにより調製する。懸濁剤は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁化剤を用い、水性媒体により調製することができる。
適当な注射用液剤または懸濁剤の使用などの、非経口使用に適した製剤は当業者には明白である。無菌の製剤は、皮内、筋肉内、血管内、および皮下を含む、様々な局所または非経口経路に適している。
エルミリ酸またはJ酸に加えて、組成物は、所望の製剤および送達様式に応じて、薬学的に許容され、非毒性の担体または希釈剤を含んでいてもよく、これらは動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を形成するために一般的に用いられる媒体を含む。希釈剤は、組み合わせの生物活性に過度に影響をおよぼさないように選択する。注射用製剤のために特に有用である、そのような希釈剤の例は、水、様々な食塩水、有機または無機塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。加えて、薬学的組成物または製剤は、他の担体；補助剤；または非毒性、非治療的、非免疫原性安定化剤などの添加物を含んでいてもよい。
さらに、賦形剤も製剤に含まれうる。例には、共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存剤、安定化剤および抗酸化剤が含まれる。いかなる薬学的に許容される緩衝液、例えば、トリスまたはリン酸緩衝液を含んでいてもよい。希釈剤、添加物、および賦形剤の有効量は、溶解性、生物活性などに関して薬学的に許容される製剤を得るために有効な量である。
エルミリ酸またはJ酸をミクロスフェアに組み込んでもよい。目的の化合物を、鼻内投与用の乾燥粉末として用いることができる、アルブミンミクロスフェアに組み込むことができる。ミクロスフェアの調製に適した他の材料には、寒天、アルギン酸塩、キトサン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、オブアルブミン、アガロース、デキストラン、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、およびカゼインが含まれる。ミクロスフェアは、噴霧乾燥工程または乳化工程などの、当業者には公知の様々な工程によって製造することができる。ミクロスフェアは典型的には直径500μm未満、例えば、200、100、50、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、または0.01μm未満である。ミクロスフェアは、局所および経皮送達を含む、脂質-アミノ酸結合体を送達する複数の方法において用いることができる。
例えば、アルブミンミクロスフェアは、リン酸緩衝液中のウサギ血清アルブミンをオリーブ油に撹拌しながら加えて、油中水乳濁液を生成することにより調製することができる。次いで、グルタルアルデヒド溶液を乳濁液に加え、乳濁液を撹拌してアルブミンを架橋する。次いで、遠心分離し、油を除去し、スフェアを、例えば、石油エーテルと、続いてエタノールで洗浄することにより、ミクロスフェアを単離する。最後に、ミクロスフェアをふるい分けて回収し、ろ過により乾燥する。
デンプンミクロスフェアは、例えば、バレイショデンプンの温水溶液をポリエチレングリコールの加熱水溶液に撹拌しながら加え、乳濁液を生成することにより調製することができる。二相系が形成されれば(デンプン溶液を内相として)、混合物を撹拌し続けながら室温まで冷却し、それにより内相はゲル粒子に変換される。これらの粒子を室温でろ過し、エタノールなどの溶媒中でスラリー化し、その後粒子を再度ろ過して、風乾する。
ミクロスフェアは、熱処理または化学架橋剤の使用などの周知の架橋法により硬化させることができる。適当な架橋剤には、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシニックアルデヒド、アジプアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒドを含むジアルデヒド、ブタジオンなどのジケトン、エピクロロヒドリン、ポリリン酸塩、およびホウ酸塩が含まれる。ジアルデヒドは、アミノ基との相互作用により、アルブミンなどのタンパク質を架橋するために用い、ジケトンはアミノ基とシッフ塩基を形成する。エピクロロヒドリンはアミノまたはヒドロキシルなどの求核基を有する化合物を活性化してエポキシド誘導体とする。
「単位用量剤形」という用語は、被験体、例えば、ヒト被験体または哺乳動物被験体、例えば、イヌ、ネコ、および齧歯動物のための単位用量として適当な、物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望の医薬効果を生じるように計算された、あらかじめ決められた量の活性材料を、必要とされる薬学的希釈剤、担体または媒体と共に含む。本発明の単位用量剤形の仕様は、(a)活性材料の独特の特徴および達成すべき特定の効果、ならびに(b)ヒトおよび動物において用いるための、そのような活性材料の調剤分野に固有の制限によって規定され、それらに依存している。単位用量剤形の例は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末パケット、ウェハース、坐剤、顆粒剤、カシェ剤、茶さじ量、大さじ量、スポイト量(dropperful)、アンプル、バイアル、定量噴霧器つきのエアロゾル、前述のいずれかの分離した複数、ならびに本明細書に記載の他の剤形である。組成物はキットに含まれていてもよく、これは本明細書に記載の一つまたは複数の障害を治療するための、組成物の一つまたは複数の単位用量剤形および使用説明書を含むことができる。
いくつかのバイオポリマー(生体作用に基づく系)のいずれか、リポソーム、コロイド、樹脂、および他のポリマー送達系を用いる系、または区画化レザバーを含む、緩徐または持続放出送達系を本明細書に記載の組成物と共に用いて、治療化合物の持続的または長期供給源を提供することができる。そのような徐放系は、局所、眼内、経口、および非経口経路を介する送達用の製剤に適用可能である。
エルミリ酸またはJ酸の有効量を治療に用いることができる。本発明に従って用いる化合物の用量は、化合物および治療中の状態に応じて変動する。例えば、受容患者の年齢、体重、および臨床状態。他の因子には、投与経路、患者、患者の既往歴、疾患プロセスの重症度、および特定の化合物の効力が含まれる。用量は、患者にとって許容されない毒性を生じることなく、治療する疾患の症状または徴候を改善するのに十分であるべきである。一般に、化合物の有効量は、症状の主観的軽減、または臨床医もしくは有資格観察者による客観的に識別可能な改善のいずれかを提供するものである。脂質-アミノ酸結合体の例示的用量は、患者の体重1kgあたり0.1から50mg、例えば、0.1から20mg、0.5から50mg、0.1から2.0mg、2.0から10mg、または10から50mgである。
エルミリ酸およびJ酸は、ビタミンD受容体に結合するか、もしくはその活性を改善する天然もしくは合成化合物との組み合わせ、またはレチノイドX受容体に結合するか、もしくはその活性を改善する化合物との組み合わせで経口投与して、障害の治療または予防における相乗作用を提供することもできる。本発明に含まれる薬物との組み合わせで投与した場合に相乗作用を提供するような化合物の例には、ビタミンD類似体、様々なレチノイン酸誘導体、およびLG100268、タザロテン、TTNPB、AGN 190121、アダパレン、またはLGD1069(登録商標TARGRETIN)を含むが、それらに限定されるわけではない、レチノイドX受容体またはレチノイン酸受容体の他の活性化物質が含まれる。
実施例
本発明を下記の実施例においてさらに記載することになるが、これらの実施例は特許請求の範囲において記載する本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1 アラキドノイル-D-アラニンの合成
N-脂肪酸-D-アラニン結合体を鏡像異性体として純粋なD-アミノ酸メチルエステル(Aldrich Chemicals)から調製した。塩化メチレン中の塩化アラキドノイル(Nucheck)を、5％トリエチルアミンを含む塩化メチレン中のアラニンメチルエステルと、室温で4時間反応させた。混合物を酢酸エチルと希HClとの間で分配し、洗浄し、乾燥し、蒸発させて、油状残渣を得た。この残渣をテトラヒドロフランに溶解し、窒素雰囲気下、1N LiOHと室温で5時間撹拌することにより鹸化した。生成物を前述のとおりに抽出し、薄層クロマトグラフィにかけた。主生成物を質量分析によりN-アラキドノイル-D-アラニンと同定し、MH+=376.1を示した。円偏光二色性測定は、L異性体と比較して、220から240nmの間の鏡像スペクトルを示した。[α]値はD異性体=-16.6×105、L異性体=+16.5×105であった。
実施例2 他のエルミリ酸の合成
実施例1の合成法を用いて、1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および2-アミノ-イソ酪酸とのアラキドニルおよびパルミチル結合体を調製した。合成した化合物はN-パルミトイル-1-アミノシクロヘキサン-COOH、N-パルミトイル-1アミノ-シクロペンタン-COOH、N-パルミトイル-2-アミノ-イソ酪酸、N-アラキドノイル-1-アミノ-シクロヘキサン-COOH、およびN-アラキドノイル-1-アミノ-シクロペンタン-COOH、およびN-アラキドノイル-2-アミノ-イソ酪酸であった。
実施例3 他のエルミリ酸の合成
アラキドン酸(5Z,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン-5,6,8,9,11,12,14,15酸)(10mg)の溶液を、酢酸エチル(5ml)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(4mg)の溶液に加え、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド(CDI)(9mg)を溶液に加える。混合物を室温で24時間反応させた後、ジオキサン-KOH-NaHCO3の混合物(2ml)中のアミノ酸(10mg)を加える。得られた混合物を4℃でさらに48時間反応させる。次いで、混合物をHClで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、N-アラキドノイル-アミノ酸生成物を薄層クロマトグラフィ(アセトニトリル、96；水、4)で単離する。同定をNMRおよび質量分析で行う。
実施例4 J酸の合成
15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2(10mg)の溶液を、酢酸エチル(5ml)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(4mg)の溶液に加え、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド(CDI)(9mg)を溶液に加える。混合物を室温で24時間反応させた後、ジオキサン-KOH-NaHCO3の混合物(2ml)中のアミノ酸(10mg)を加える。得られた混合物を4℃でさらに48時間反応させる。次いで、混合物をHClで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2-アミノ酸生成物を薄層クロマトグラフィ(アセトニトリル、96；水、4)で単離する。同定をNMRおよび質量分析で行う。
実施例5 脂質-アミノ酸結合体の試験
N-アラキドノイル-D-アラニンを、上で詳細に記載したオイルレッドOアッセイ法にかける。このアッセイ法において、3T3 L1線維芽細胞を10％ウシ胎仔血清を補足したDMEM培地中で培養する。コンフルエントに達した2日後、細胞を0.1％DMSO(媒体)、媒体中の20〜100μM N-アラキドノイル-D-アラニン、または媒体中の1μM GW347845(Cobb et al., J. Med. Chem., 41:5055-5069, 1998)で処理する。三つの処理をそれぞれ10μg/mlのインスリンと共に細胞に行う。GW347845で7日間処理し、N-アラキドノイル-D-アラニンで10〜14日間処理した後、細胞を固定し、オイルレッドOで染色する。Red染色は細胞質中の脂質滴を示す。
脂肪細胞分化の二次試験として、発現された遺伝子のRT-PCR分析を行う。線維芽細胞からのメッセンジャーRNAを回収し、RT-PCRを行って脂肪細胞特異的転写物、例えば、PPARγ2およびaP2、または遍在ハウスキーピング遺伝子の転写物、例えば、GAPDHを増幅する。PCR産物を1％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで染色する。PPARγ2およびaP2は、1μM GW347845処理後、または20〜100μM N-アラキドノイル-D-アラニン処理後に、媒体処理細胞に比べて有意に誘導される。ハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現をアッセイして、すべての試料において等しく発現されていることを確認する。
実施例5 脂質-アミノ酸結合体のインビボ試験
足浮腫
マウスで化学的に誘導した足浮腫の抑制は、物質の抗炎症活性を評価する、長く用いられているアッセイである。化学的に誘導した浮腫に対する脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸の阻害効果をこのモデルで試験する。
食塩水中5％エタノール(50μl)に溶解した血小板活性化因子(PAF)(1μg)またはアラキドン酸(1mg)を、麻酔したマウスの右後足に皮下注射する。足の体積を、処置前およびPAF注射の15分後またはアラキドン酸塩注射の30分後に、水置換によって測定する。脂質-アミノ酸結合体または対照化合物を、浮腫誘導の90分前にベニバナ油中の強制栄養により投与する。
動物に脂質-アミノ酸結合体0.1、0.5、1.0、5.0、25、および50mg/kgの用量、または媒体(ベニバナ油0.05ml)を強制栄養により、基本的には文献記載のとおりに投与する(Burstein et al, J. Med. Chem., 35:3135-3141, 1992)。10匹の雄CD-1マウスを各群で用いる。対照は媒体、インドメタシン2.0mg/kg、およびアジュレミン酸(ajulemic acid)1.0mg/kgである。ED-50値をもとめ、対照値と比較する。足の体積変化を、対応t検定を用いて比較する。足の体積変化を50％低減する脂質-アミノ酸結合体は抗炎症薬の候補である。
皮下空気嚢
皮下空気嚢は、中皮基底膜のない盲結合組織腔を提供することにより滑膜関節窩を模擬する。空気嚢の内層は滑膜に一般的な二つの細胞型(線維芽細胞およびマクロファージ様細胞)を有する。空気嚢は、炎症応答に対する脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸の効果を誘導し、モニターする方法を提供する。IL-1βおよびTNFαへの応答は急性炎症反応に典型的で、嚢壁および腔の多形核白血球浸潤が用量依存的に増大する。
嚢は雌スイス(CD-1)マウスの背に空気5mlを連続3日間皮下注射することにより確立する。6日後、動物(1群10匹)を適当な薬剤、脂質-アミノ酸結合体または対照で3日間処置する(下記参照)。炎症を、処置3日目に嚢腔内に1％カルボキシメチルセルロース(3ml)中のrhuIL-1β(10ng)およびrHuTNFα(0.25ng)を注射することにより誘導する。6時間後に嚢の滲出物量および白血球数を測定することにより、炎症を定量する。
動物に類似体0.1、0.5、1.0、5.0、25、および50mg/kgの用量、または媒体(ベニバナ油0.05ml)を強制栄養により、文献記載のとおりに投与する(Zurier et al., Arthritis Rheum., 41: 163-170, 1998)。対照は媒体、インドメタシン2.0mg/kg、およびアジュレミン酸1.0mg/kgである。ED-50値をもとめ、ANOVAにより対照値と比較する。嚢滲出物量または白血球数を50％低減する脂質-アミノ酸結合体は抗炎症薬の候補である。
慢性炎症および組織傷害のアジュバント誘導関節炎モデル
ラットにおけるアジュバント病の多発関節炎モデルが、抗炎症および免疫抑制剤を評価するために広く用いられている。このモデルを、炎症応答の重症度に対する脂質-アミノ酸結合体、例えば、エルミリ酸またはJ酸の効果を試験するために用いることができる。
慢性多発関節炎を、雄ルイスラット(初期体重125g)の尾基部にフロイント完全アジュバント(鉱油0.1ml中のマイコバクテリウム-ブチリクム(Mycobacterium butyricum)2mg)を皮内投与することにより誘導する(N=8)。動物を処置中にペントバルビタールナトリウムで麻酔する。4本足すべての関節炎を目視により評価し、各足の炎症の程度を0〜4点スケール(0=正常；1=発赤；2=発赤、疼痛、わずかに腫脹；3=発赤、重度の疼痛、重度の腫脹；4=関節強直)を用いて臨床的に採点する。ラットの割り付け処置群について知らされていない試験者が足を評価する。ラットを静かに扱い、重度の関節炎および極度の疼痛があるものは屠殺する。体重変化および活動性も実験期間中を通して記録する。
動物を、未処置、ベニバナ油、または90〜120μl量(動物の体重で調節)の脂質アミノ酸結合体もしくは対照で、アジュバント注射の3日後に始めて毎日処置する。化合物を5cm強制栄養針で投与する。1日おきに関節を評価する。動物を35日目に屠殺し、次いで後肢を切断して組織形態検査にかける。用量範囲0.1、0.5、1.0、5.0、25、および50mg/kgの脂質-アミノ酸結合体を1週間に3回投与する。AJA(1.0mg/kg)およびインドメタシン(2.0mg/kg)を対照として用いる。
動物の後肢を10％緩衝化ホルマリン中に固定し、次いで10％ギ酸中で脱灰する。各脛足根骨関節のいくつかの切片をヘマトキシリン・エオシンで染色する。個々の切片を動物の割り付け処置群について知らせずに試験する。炎症スコアを50％低減する脂質-アミノ酸結合体は抗炎症薬の候補である。
他の態様
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前述の記載は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定することはなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は添付の特許請求の範囲内である。
エルミリ酸を調製するために用いることができる例示的脂肪酸の一覧である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的アミノ酸の一覧である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的環状アミノ酸類似体の一覧である。矢印はアミノ酸類似体のアルファ炭素を示し、Rはアミノ基を示しており、これを用いて脂肪酸分子またはJ2プロスタノイドへのアミド結合を形成し、それによりN-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体を形成することができる。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる、フェニル-グリシンおよびフェニル-グリシン誘導体を含む例示的アミノ酸類似体の一覧である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的フェニル-アラニン誘導体の一覧である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的ジペプチドの一覧である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的合成スキームの図である。 エルミリ酸またはJ酸を調製するために用いることができる例示的合成スキームの図である。 J酸を調製するために用いることができる例示的J2プロスタノイドの一覧である。

Claims (26)

  1. 下記の一般式(式I)を有する化合物：
    Figure 2008506713
    式中、R1はミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、 エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンテン酸、およびドコサテトラエン酸からなる群より選択される脂肪酸の炭化水素鎖であり；かつ
    (a)R4は水素であり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸からなる群より選択されるアミノ酸類似体の環状側鎖を形成するか；
    (b)R4は水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基であるか；
    (c)R3およびR4は水素であり、R2はフェニル-グリシンもしくはフェニル-グリシン誘導体の側鎖であるか；
    (d)R3およびR4は水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖であるか；
    (e)R3は水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリン誘導体の側鎖を形成するか；
    (f)R3およびR4は水素であり、R2はセリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であり、CαはDアミノ酸と同じ立体化学を有するか；または
    (g)R3は水素であり、R2およびR4は一緒になってD-プロリンを形成する。
  2. 脂肪酸がアラキドン酸である、請求項1記載の化合物。
  3. 下記の一般式(式I)を有する化合物：
    Figure 2008506713
    式中、R1はペンタデカン酸；ヘプタデカン酸；ノナデカン酸；ヘンエイコサン酸；9-trans-テトラデカン酸、14:1T；10-trans-ペンタデカン酸、15:1T；9-trans-ヘキサデセン酸、16:1T；10-ヘプタデセン酸、17:1；10-trans-ヘプタデセン酸、17:1T；7-trans-ノナデセン酸、19:1T；10,13-ノナデカジエン酸、19:2；11-trans-エイコセン酸、20:1T；12-ヘンエイコセン酸、21:1；プロスタグランジンJ2；15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2；Δ12-プロスタグランジンJ2；および9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される非哺乳動物脂肪酸またはJ2プロスタノイドの炭化水素鎖であり；かつ
    (a)R4は水素であり、R2およびR3は一緒になって、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロペンタンカルボン酸、および1-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸からなる群より選択されるアミノ酸類似体の環状側鎖を形成するか；
    (b)R4は水素であり、R2およびR3は2-アミノイソ酪酸の二つのメチル基であるか；
    (c)R3およびR4は水素であり、R2はフェニル-グリシンもしくはフェニル-グリシン誘導体の側鎖であるか；
    (d)R3およびR4は水素であり、R2はフェニル-アラニン誘導体の側鎖であるか；
    (e)R3は水素であり、R2およびR4は一緒になってプロリンもしくはプロリン誘導体の側鎖を形成するか；または
    (f)R3およびR4は水素であり、R2はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。
  4. 下記の一般式(式II)を有する化合物：
    Figure 2008506713
    式中、R1はJ2プロスタノイドまたは天然脂肪酸および非哺乳動物脂肪酸からなる群より選択される脂肪酸の非カルボキシル部分であり；化合物がジペプチドに結合している脂肪酸アミドで構成されるように、R2およびR3は天然アミノ酸またはアミノ酸類似体の置換基であり、R4およびR5は天然アミノ酸またはアミノ酸類似体の置換基である。
  5. 請求項1記載の化合物を含む薬学的組成物。
  6. 請求項2記載の化合物を含む薬学的組成物。
  7. 請求項3記載の化合物を含む薬学的組成物。
  8. 請求項4記載の化合物を含む薬学的組成物。
  9. 被験体の体組織の炎症を治療する方法であって、被験体に請求項5記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  10. 被験体の体組織の炎症を治療する方法であって、被験体に請求項6記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  11. 被験体の体組織の炎症を治療する方法であって、被験体に請求項7記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  12. 被験体の体組織の炎症を治療する方法であって、被験体に請求項8記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  13. II型糖尿病の治療を必要としている被験体の治療法であって、被験体にN-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体を含む薬学的組成物の治療量を投与する段階を含む方法。
  14. 薬学的組成物が下記の一般式(式I)を有する化合物を含む、請求項13記載の方法：
    Figure 2008506713
    式中：
    (a)R1はミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、 エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンテン酸、ドコサテトラエン酸、プロスタグランジンJ2、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、および9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される脂肪酸もしくはJ2プロスタノイドの非カルボキシル部分であり；R3およびR4は水素であり、R2はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であるか；または
    (b)R1はアラキドン酸の炭化水素鎖であり；R3およびR4は水素であり、R2はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。
  15. II型糖尿病の治療を必要としている被験体の治療法であって、被験体に請求項5記載の薬学的組成物の治療量を投与する段階を含む方法。
  16. II型糖尿病の治療を必要としている被験体の治療法であって、被験体に請求項6記載の薬学的組成物の治療量を投与する段階を含む方法。
  17. II型糖尿病の治療を必要としている被験体の治療法であって、被験体に請求項7記載の薬学的組成物の治療量を投与する段階を含む方法。
  18. II型糖尿病の治療を必要としている被験体の治療法であって、被験体に請求項8記載の薬学的組成物の治療量を投与する段階を含む方法。
  19. HIVウイルス感染症の治療を必要としている被験体の治療法であって、
    (i)被験体にHIVプロテアーゼ阻害剤カクテルによる治療の有効量を投与する段階と；
    (ii)被験体にN-脂肪酸-アミノ酸結合体またはJ2プロスタノイド-アミノ酸結合体を含む薬学的組成物の治療量を同時投与する段階とを含む方法。
  20. 薬学的組成物が下記の一般式(式I)を有する化合物を含む、請求項19記載の方法：
    Figure 2008506713
    式中：
    (a)R1はミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、 エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンテン酸、ドコサテトラエン酸、プロスタグランジンJ2、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、Δ12-プロスタグランジンJ2、および9,10-ジヒドロ-15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される脂肪酸もしくはJ2プロスタノイドの非カルボキシル部分であり；R3およびR4は水素であり、R2はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖であるか；または
    (b)R1はアラキドン酸の炭化水素鎖であり；R3およびR4は水素であり、R2はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。
  21. 被験体の乾癬または関節リウマチの治療法であって、被験体に請求項5記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  22. 被験体の乾癬または関節リウマチの治療法であって、被験体に請求項6記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  23. 被験体の乾癬または関節リウマチの治療法であって、被験体に請求項7記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  24. 被験体の乾癬または関節リウマチの治療法であって、被験体に請求項8記載の薬学的組成物の抗炎症量を投与する段階を含む方法。
  25. 被験体の炎症、II型糖尿病、乾癬、または関節リウマチの治療において用いるための、請求項1から4のいずれか一項記載の化合物。
  26. 被験体の炎症、II型糖尿病、乾癬、または関節リウマチの治療用薬剤を調製するための、請求項1から4のいずれか一項記載の化合物の使用。
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