JP2004501896A - ＰＰＡＲγアゴニストとしてのＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンおよびその誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、式ＩのＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンおよびその誘導体を治療効果のある量投与することから成る、ＰＰＡＲ−γに仲介される疾患または症状を治療または予防するための方法に関するものである：前記方法は、特に食欲不振、高脂血症、インスリン抵抗性、炎症性疾患、ガン、および皮膚疾患の治療または予防に有益である。

Description

【０００１】
本発明は、ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシン（Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン）またはその誘導体を、治療効果のある量投与することから成る、ＰＰＡＲ−γが仲介する疾患または症状を治療または予防するための方法に関するものである。
【０００２】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲｓ）は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合し、数多くの標的遺伝子、とくに脂質代謝に関与するものを活性化する核ホルモン受容体である。ＰＰＡＲｓは多面的な生物活性を有し、代謝不全への使用から、場合によっては炎症、およびガンへの適用まで、広範囲の医学的用途分野がある（Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ　ａｎｄ　Ｗａｈｌｉ，１９９９；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ　ａｎｄ　Ｆｌｉｅｒ，１９９６）。とくにＰＰＡＲγが注目を集めているのは、ＰＰＡＲγ活性化薬が２型糖尿病を治療する新たな機会を示しているからである。ＰＰＡＲγは天然リガンドによって、例えば、長鎖脂肪酸誘導体、１５−デオキシ−Δ１２、１４−プロスタグランジン　Ｊ２、Δ１２−プロスタグランジン　Ｊ２（ＰＧ Ｊ２）、および９−と１３−シス−ヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）によって活性化される（Ｆｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５；Ｋｌｉｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５；Ｎａｇｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。しかしながら、もっとも興味深いのは、すべてがチアゾリジンジオン環を有する（図１，図版Ａ）グリタゾン群の抗糖尿病活性が、それらのＰＰＡＲγ活性化特性の結果であるという所見である（Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｗｉｌｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。しかしながら、２型糖尿病における現在のチアゾリジンジオン（ＴＺＤｓ）の治療効果は、好適なものからはほど遠く、この医薬品種についていくつかの不所望の副作用が報告されている（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ　ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，２０００）。結果として、非ＴＺＤ系の代わりのＰＰＡＲγリガンドが必要になっている。
【０００３】
最近、チアゾリジンジオン環をカルボン酸で置換し、またパラヒドロキシベンジル部を維持しながら隣接する炭素にアミン基を導入することによって、一連のＬ−チロシン系のＰＰＡＲγリガンドが設計された（図１、設計１経路）。好適なＰＰＡＲγ活性は、Ｌ−チロシンリガンドのアルファ炭素上のアミンをベンゾイルフェニル基で置換し、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｌ−チロシン誘導体としたときに得られた（図１、図版Ｂ，左側）（Ｃｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。フェニル−フェニル結合を追加して、このアルファ−アミノ置換体のベンゾイルおよびフェニル部分を固定することにより（図１、図版Ｂ，右側）、効力の優れた化合物が得られた（Ｃｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。
【０００４】
本発明との関連において、意外なことに判明したのだが、ＦＭＯＣ−Ｌ−チロシン誘導体にはＰＰＡＲγ活性が欠落する一方で、ＴＺＤｓおよび先に得たＬ−チロシン系ＰＰＡＲγリガンドの両方に存在するパラヒドロキシベンジル部が欠落した構造であるＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシン（以下に、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕと記することもある）（図１）は、独自のＰＰＡＲγ活性化およびＰＰＡＲγ結合特性を備えた、新規な効力のあるインスリン感受性改善化合物である。
【０００５】
ＮＰＣ１５１９９と呼ばれるＦ−Ｌ−Ｌｅｕは、未知の抗炎症メカニズムを介して各種の炎症モデルに作用する医薬品として記載されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）（Ｂｕｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１）。しかしながら本発明は、この化合物とその誘導体のＰＰＡＲγアゴニストとしての新規な用途分野を提供する。
【０００６】
【本発明の簡単な説明】
本発明は、式Ｉを有する化合物を治療効果のある量投与することから成る、ＰＰＡＲ−γが仲介する疾患または症状を治療または予防するための方法に関するものである：
【式７】

この式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、
Ｘは、一から四個のヘテロ原子を含むことができる、１から６個の炭素原子から成る鎖である、
Ｒ２は、少なくとも二つの環を含む縮合多環基である。
【０００７】
第一の実施態様において、Ｒ２基は、炭素環とヘテロ環から選択した少なくとも二つの環を含む。
【０００８】
Ｒ２基は、有利には下記から選択することができる：
【式８】

ここで、前記基はハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいる。
【０００９】
第二の実施態様において、Ｘ鎖は、オキソ基によって置換可能な一つまたは二つの炭素原子から成る。
【００１０】
本発明の推奨実施態様は、式Ｉの化合物を治療効果のある量投与することから成る、ＰＰＡＲ−γが仲介する疾患または症状を、治療または予防するための方法を対象とし、前記化合物が
【式９】

で、
上記の式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、
Ｒ２は、下記から選択された多環基であり：
【式１０】

ここで、前記基は、ハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいる。
【００１１】
さらにとくに好適な化合物は下記の式を有し：
【式１１】

上記の式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、またここで前記三環基は、ハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいる。
【００１２】
例えば、推奨化合物は
【式１２】

であり、ここで前記三環基は、ハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいる；例えばＮ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン。
【００１３】
本発明による方法は、食欲不振の治療または予防、体重の増減、高脂血症の治療または予防、インスリン感受性の改善、また糖尿病で発生する、インスリン抵抗性の治療または予防に有益である。
【００１４】
上述の化合物で治療または予防が可能なその他の疾患または症状には、慢性炎症性疾患、とくに炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、とくに慢性関節リウマチ、多発性関節炎および喘息が挙げられる。
【００１５】
本発明は、またガン、とくに大腸、前立腺および血液ガン、ならびにアテローム性動脈硬化症および皮膚疾患、とくに乾癬のために実施することもできる。
【００１６】
我々は、ＰＰＡＲγ結合と活性化について、多数のＦＭＯＣアミノ酸系を試験した。興味深いことに、Ｌ−チロシン系ＰＰＡＲγリガンドに構造的にもっとも類似しているＦＭＯＣ−Ｌ−チロシン（Ｃｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）は、ＰＰＡＲγ活性化特性が欠落し、ＦＭＯＣアミノ酸系の他の一つであるＦ−Ｌ−Ｌｅｕは、インビトロおよびインビボ試験の包括的なセットにおいて、ＰＰＡＲγと結合、活性化した。
【００１７】
立体選択的ＰＰＡＲγアゴニストリガンドとしてのＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンを裏付ける証拠は、下記の論拠によって提供される：
１）ＥＳＩ−質量分析（図５）とプロテアーゼ保護分析（図４）によって証明されるように、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕはインビトロでＰＰＡＲγと結合する；
２）Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、ＰＰＡＲγタンパク質に対するコアクチベーターの動員を促進する（図６）；
３）Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、コトランスフェクション研究においてＰＰＡＲγを活性化する（図３）；
４）Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、高まった脂質蓄積、およびＬＰＬやａＰ２などの脂肪細胞標的遺伝子の誘導から判断される脂肪細胞の分化を誘発する（図７）；
５）Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、糖尿病、またもっと興味深いことに糖尿病でないマウスモデルの両方において効力のあるインスリン感受性改善剤として作用する（図８）；
６）最後に、ＴＺＤｓと同様に（（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕも有意の抗炎症活性を有し、炎症性腸疾患を予防することができる（図９）。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、チアゾリジンジオンやＬ−チロシン系ＰＰＡＲγリガンドと明らかに構造的に異なり（Ｃｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、またＦ−Ｌ−Ｌｅｕは、部分的アゴニストＧＷ００７２（Ｏｂｅｒｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）、Ｌ−７６４４０６（Ｅｌｂｒｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）およびアンタゴニストＢＡＤＧＥ（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル）とほとんど、あるいはまったく構造的な類似性を示さないので（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕはＰＰＡＲγリガンドの化学的に新規なクラスを規定する。
【００１８】
Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、既知のＰＰＡＲγリガンドと共通のいくつかの機能特性を有するが、後述する数多くの特徴がＦ−Ｌ−Ｌｅｕとこれらの化合物を区別する。
【００１９】
Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、そのカルボキシル基によって提供されたプロトンを遊離させることができる酸の作用を有する。この特徴は、天然リガンド、ＰＧ　Ｊ２、ならびに先に得られたＬ−チロシン系リガンドと共通である。かかる酸の作用は、二つのカルボニル基の間に位置する窒素の部位でＴＺＤ環の中にも存在する。カルボン酸塩群は、脂肪細胞の分化に拮抗するものの、しかしその側鎖の置換がカルボキシレートから約１０個の炭素原子の距離である、弱い部分アゴニスト、ＧＷ００７２など他のＰＰＡＲγリガンドでも回収される（Ｏｂｅｒｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。この距離は、側鎖の置換がアルファ−アミノの位置で起きるチロシン由来リガンドやＦ−Ｌ−Ｌｅｕなどのアゴニストとは対照的である。ＦＭＯＣ　Ｌ−およびＤ−ロイシンでのＰＰＡＲγの活性化の立体選択性（Ｌ−は、Ｄ−エナンチオマーよりもはるかに効力がある）は、８−ＨＥＴＥ（Ｓ＞Ｒ）およびアルファ−トリフルオロエトキシ−プロパン酸誘導体（Ｓ＞Ｒ）などの、不斉炭素を有する他のリガンドで得られた先の所見と一致する（Ｒａｎｇｗａｌａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。
【００２０】
実験的証拠は、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕが、ＴＺＤｓおよびチロシン系リガンドの両方と異なる仕様で、ＰＰＡＲγのリガンド結合部位と相互作用することを示している。核受容体は一般的に、一つのリガンド分子を、リガンドの周囲にかなり強固に適合するそれらのリガンド結合ポケット内に結合させるだけである。ＴＺＤｓおよびチロシン系ＰＰＡＲγリガンド双方の結合は、この「１リガンド／１受容体」の典型に従う（Ｗｉｌｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。しかしながら、ＰＰＡＲγのかなり広いリガンド結合ポケットは、チロシン系リガンドのような大きなリガンドの結合を可能にするだけでなく、場合によっては複数のリガンド分子を一つの受容体に結合させることも可能にする。我々の行ったＥＳＩ−質量分析のデータにより、このことがＦ−Ｌ−Ｌｅｕにも実際に当てはまることが確認され、ここでは二つの分子がＰＰＡＲγリガンド結合ドメインに結合することが示された。
【００２１】
ＰＰＡＲγが二分子のＦ−Ｌ−Ｌｅｕと結合する能力は、事実このリガンドのいくつかの特定の生物学的特徴の基礎となっているのかもしれない。事実、トランスフェクション実験において、双方の化合物の最大効力は類似していたが、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕはＴＺＤ、ロジグリタゾンよりも効力が二桁低かった。効力が低く、用量反応曲線が急なことは、したがって、受容体に対してより高いモル比のリガンドが、その構造を変えるために要求されるという事実によって説明でき、この所見は我々のプロテアーゼ保護分析（図４）および補因子の相互作用評価（図６）の両方と一致する。
【００２２】
インビトロでの効力は低いが、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、インビボでの抗糖尿病活性についてはロジグリタゾンなどのＴＺＤｓと比べてむしろ好適である。糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスに対してＦ−Ｌ−Ｌｅｕを投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日）すると、ロジグリタゾンを同量投与したときよりも劇的にインスリン感受性が改善された。このことは、ＩＰＧＴＴでＡＵＣがより強固に減少し、絶食状態のインスリンレベルがそれにほぼ相当して減少することから推定されるであろう。さらに、３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは正常な動物のインスリン感受性を有意に改善することができ、このような効果はグリタゾンでは決して認められなかった。Ｆ−Ｌ−ＬｅｕのＴＺＤｓとのインビボでの効力のこの比較についての一つの注意点は、ここで使用した薬剤投与が腹腔内投与であったことにある。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕに有効なものとして現在記載された投与法はこれだけであるが、それは容易に経口で生物学的に利用可能なＴＺＤｓには最適なものではないことがわかっている。この潜在的な不都合はあるが、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕが可能性のある抗糖尿病医薬品であるという、得られた結果は、しかしながら、依然注目すべきものである。加えてＦ−Ｌ−Ｌｅｕの構造は、ＴＺＤ環を共有しないが、カルボキシル基によって（図１参照）この化学基と立体的に同じものを提供し、そしてそれにはＴＺＤに関連する副作用がない。
【００２３】
要約すると、我々はＦ−Ｌ−Ｌｅｕを小さな合成ＰＰＡＲγリガンドとして記載する。既知のＰＰＡＲγリガンドと異なり、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕの二つの分子が一つのＰＰＡＲγ分子に結合して、その受容体の相互作用形態を新規かつ興味深いものにする。この受容体相互作用の独自の様式が、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕのいくつかの特別な薬理学的特性の基礎となる。一般的にＦ−Ｌ−Ｌｅｕは、効力は低いが最大効力が類似しているという特徴の、独特な薬理学的特性を伴う、ＰＰＡＲγアゴニストの既知の群と類似の生物学的活性を発揮する。この新規な合成分子は、したがって、ＰＰＡＲγの生物学的活性の調節のために、通常の手順に従って最適化できる、新しい薬理作用団にあたる。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１：ＰＰＡＲγリガンド構造の概略図。設計のための異なる経路が示される。
Ａ．抗糖尿病グリタゾン
Ｂ．Ｌ−チロシン系ＰＰＡＲγリガンド
Ｃ．ＦＭＯＣアミノ酸
【００２５】
図２：ＨｅｐＧ２細胞におけるＦＭＯＣアミノ酸によるＰＰＡＲγ２転写活性の調節。ＨｅｐＧ２細胞に、ＰＰＡＲγ２（０．１μｇ／ウェル）、ｐＧＬ３−（Ｊ_ｗｔ）_３ＴＫＬｕｃレポーターコンストラクト（０．５μｇ／ウェル）、およびトラスフェクション効率のコントロールとして（０．５μｇ／ウェル）ｐＣＭＶ−βＧａｌ（０．５μｇ／ウェル）を、発現ベクターでコトランスフェクションした。ついでそれらを表記した化合物の存在下で、または存在しない条件で２４時間成長させた。活性化は、相対的なルシフェラーゼ活性／β−ガラクトシダーゼ活性で表した。それぞれのポイントは三回実施した。この図は三回の独立した実験の代表値である。
【００２６】
図３：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、様々な細胞株においてＰＰＡＲγ２の転写活性を促進する。ＲＫ１３細胞（ＡとＤ）、ＣＶ１細胞（Ｂ）またはＨｅｐＧ２細胞（Ｃ）を、ＰＰＡＲγ２（０．１μｇ／ウェル）、ｐＧＬ３−（Ｊ_ｗｔ）_３ＴＫＬｕｃレポーターコンストラクト（０．５μｇ／ウェル）、およびトラスフェクション効率のコントロールとして（０．５μｇ／ウェル）ｐＣＭＶ−βＧａｌ（０．５μｇ／ウェル）を、発現ベクターでコトランスフェクションした。ついで、それらを表記した化合物の存在下で、または存在しない条件で２４時間成長させた。活性化は、相対的なルシフェラーゼ活性／β−ガラクトシダーゼ活性で表した。それぞれのポイントは三回実施し、それぞれの図は四回の独立した実験の代表値である。
【００２７】
図４：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕリガンドは、ＰＰＡＲγの構造を改変する。^３５Ｓ−ＰＰＡＲγをインビトロ転写／翻訳系で合成した。標識されたＰＰＡＲγを、つづいてＤＭＳＯ（０．１％），ロジグリタゾン（１０^−４Ｍ）またはＦ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０^−４Ｍ）で培養し、ついで蒸留水または段階的に濃度を高くしたトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で培養した。消化産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してからオートラジオグラフにかけた。無傷のＰＰＡＲγの泳動が示され、アステリスクマークは、ＰＰＡＲγの２５−ｋＤａの耐性断片を示している。
【００２８】
図５：二分子のＦ−Ｌ−Ｌｅｕが、一つのＰＰＡＲγ分子に結合する。ＥＳＩ−質量分析。
【００２９】
図６：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、ＰＰＡＲγのｐ３００との相互作用を促進する。精製したｈｉｓ−ｔａｇＰＰＡＲγ２_{ＤＥ２０３−４７７}タンパク質を、ＤＭＳＯ（０．１％）、ロジグリタゾン（１０^−４Ｍ）またはＦ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０^−３Ｍ）の存在下で、精製したｐ３００Ｎｔ−ＧＳＴタンパク質およびグルタチオン−Ｑ−セファローズビーズで培養する。ビーズはつぎに洗浄し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ブロットした。ブロットは抗ヒスチジン抗体で検出した。
【００３０】
図７：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、脂肪細胞の分化を促進する。融合３Ｔ３−Ｌ１細胞を、２μＭインスリン、１μＭデキサメタゾンおよび０．２５ｍＭイソブチルメチルキサンチンで二日間培養した。ついでこれらの細胞を、ＤＭＳＯ（０．１％）、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０^−５Ｍ）またはロジグリタゾン（１０^−７Ｍ）の存在下で４日間培養した。Ａ：分化を誘発した異なる時間の後に、ＲＮＡを３Ｔ３−Ｌ１細胞から単離した。ブロットは、３６Ｂ４（ＲＮＡのロードを確認するため）；ＬＰＬまたはａＰ２のｃＤＮＡｓとハイブリダイズした。Ｂ：細胞は６日後にオイルレッドＯで染色した。ＬＰＬ：リポタンパク質リパーゼ。
【００３１】
図８：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、Ｃ５７ＢＬ／６ｊおよびｄｂ／ｄｂマウスのインスリン感受性を改善する。１０から１２週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊ（Ａ）またはｄｂ／ｄｂ（Ｂ）マウスにおける腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）（ｎ＝８）。菱形は、ＤＭＳＯ処理マウスに；四角は、１０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度でのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ処理マウスに、三角は、３０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度でのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ処理マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス、Ａ）、または１０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度でのロジグリタゾン処理マウス（ｄｂ／ｄｂマウス、Ｂ）に対応する。ＤＭＳＯ、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはロジグリタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で処理したｄｂ／ｄｂマウスの血中インスリン（Ｃ）と体重（Ｄ）。
【００３２】
図９：Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、ＴＮＢＳ処理Ｂａｌｂ／ｃマウスの結腸炎を防ぐ。Ａ：ＤＭＳＯまたはＦ−Ｌ−Ｌｅｕ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかを注射したＴＮＢＳ処理マウスにおけるＡｍｅｈｏ組織学的スコア（左の図版）と生存率（右の図版）。Ｂ：ＤＭＳＯまたはＦ−Ｌ−Ｌｅｕ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を注射したＴＮＢＳ処理マウスの結腸における、ＴＮＦαとＩＬ−１βのｍＲＮＡレベル。結果は平均±ＳＥＭで表した。
【００３３】
下記の実施例を実行するために、次の試料と方法を用いた。
【００３４】
試料と方法
ＦＭＯＣ誘導体は、Ｓｅｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｄｉｅｌｓｄｏｒｆ，スイス）で入手した。ロジグリタゾンとピオグリタゾンは、Ｒ．Ｈｅｙｍａｎ博士の寄贈である（Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＰＰＡＲγのＡＢドメインに対する抗体は、当研究所で生産した（Ｆａｊａｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。プロテアーゼ阻害剤混合物は、ＩＣＮ（Ｏｒｓａｙ，フランス）で購入した。
【００３５】
細胞培養と一過性トランスフェクション分析
ＣＶ１、ＲＫ−１３、およびＨｅｐＧ２細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼ（ｌｕｃ．）レポーターコンストラクトによるトランスフェクションは、先に述べたごとく正確に実施した（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。ｐＧＬ３−（Ｊ_ｗｔ）_３ＴＫＬｕｃおよびｐＧＬ３−（Ｊ_ｗｔ）_３ＴＫＣＡＴレポーターコンストラクトはそれぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの上流にクローニングされたアポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーターのＪ部位の三つのタンデム反復と、ルシフェラーゼまたはＣＡＴレポーター遺伝子とを両方含んでいる（Ｖｕ−Ｄａｃ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。次の発現ベクターを使用した：ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２、ヒトＰＰＡＲγ２の全ｃＤＮＡを含むコンストラクト（ｈＰＰＡＲγ２）（Ｆａｊａｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）；ｐＳＧ５−ｍＰＰＡＲα（Ｉｓｓｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）；およびトランスフェクション効率のコントロールとしてｐＣＭＶ−βＧａｌ。
【００３６】
タンパク質の生産と質量分析
ｐ３００Ｎｔ−ＧＳＴ、融合タンパク質を、ｐＧｅｘ−Ｔ１ベクター内のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質の下流に、ｐ３００タンパク質のＮ−末端部分（ａ．ａ．２から５１６）をクローニングして生産した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｏｒｓａｙ，フランス）。融合タンパク質をつぎに大腸菌内に発現させ、グルタチオンアフィニティーマトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。ヒトＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲγのａａ．２０３から４７７）をｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）発現ベクターにサブクローニングした。ｈｉｓ−ｔａｇＰＰＡＲγ２_{ＤＥ２０３−４７７}タンパク質は次のように生産した。タンパク質を、アフィニティーカラムＣｏ^２＋結合アガロース（Ｈｉｇｈ　Ｔｒａｐ　ｃｈｅｌａｔｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに、金属キレートアフィニティーカラムを用いて精製した。タンパク質を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１３０ｍＭイミダゾールおよび１−２プロパンジオール２．５％（ｐＨ８．５）で溶出した。第二の精製過程は、ゲル濾過で行った（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１６／６０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。タンパク質を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＤＴＴおよび１−２プロパンジオール２．５％（ｐＨ８．５）で溶出した。
【００３７】
液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−質量分析は、先に述べたごとく実施した（Ｒｏｇｎｉａｕｘ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。
【００３８】
プロテアーゼ保護分析とプルダウン実験
プロテアーゼ保護実験。ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２プラスミドを使用して、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の手順に従って、^３５Ｓで放射線標識したＰＰＡＲγを転写／翻訳系で合成した。転写／翻訳産物はつぎに、２２．５μｌに等分し、２，５μｌのリン酸緩衝生理食塩水±化合物を添加した。混合物は４．５μｌずつに分け、０．５μｌの蒸留水または蒸留水に溶解したトリプシンを添加した。プロテアーゼ消化を１０分間２５℃で進行させ、変性ローディングバッファーの添加によって終結させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１２％アクリルアミドゲルで消化産物を分離した後、ゲルを１０％酢酸（ｖ／ｖ）：３０％エタノール（ｖ／ｖ）で３０分間固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｏｒｓａｙ，フランス）で処理し、乾燥した。放射線標識した消化産物は、オートラジオグラフで視覚化した。
【００３９】
プルダウン実験。精製したｈｉｓ−ｔａｇＰＰＡＲγＤＥタンパク質を、プルダウンバッファー（リン酸緩衝生理食塩水１ｘ、グリセロール１０％、ＮＰ４０　０．５％）内でＧＳＴまたはｐ３００Ｎｔ−ＧＳＴ融合タンパク質のいずれか、グルタチオン−Ｑセファローズビーズ、また必要ならばＦ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０^−３Ｍ）またはロジグリタゾン（１０^−４Ｍ）とともに１時間２２℃で培養した。つぎにビーズを、プルダウンバッファーで４回洗浄し、２ｘサンプルバッファー内で煮沸した。サンプルは、１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットは、ポリヒスチジンアミノ酸配列に対する抗体で検出した。
【００４０】
脂肪細胞分化
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、培地Ａ（１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったダルベッコ変法イーグル培地）で集密化するまで生長させた。集密化した細胞は、２μＭインスリン、１μＭデキサメタゾンおよび０．２５ｍＭイソブチルメチルキサンチンを含む培地Ａで二日間培養した。ついで細胞は、培地を２日ごとに交換しながら、ＰＰＡＲγアゴニストの存在下、あるいは存在しない条件で、培地Ａで４日間培養した。脂質生成は、脂肪細胞に特異的なマーカーの発現分析と、オイルレッドＯによる脂質の染色によって評価した（Ｃｈａｗｌａ　ａｎｄ　Ｌａｚａｒ，１９９４）。
【００４１】
ＲＮＡ調製と分析
ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン／フェノール／クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，１９８７）によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞から単離した。全細胞ＲＮＡのノーザンブロット分析を、記載の通りに実施した（Ａｕｗｅｒｘ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。プローブとしてリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ａＰ２と３６Ｂ４を使用した（Ｇｒａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２；Ｌａｂｏｒｄａ，１９９１；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。ＲＴ−競合ＰＣＲのために、全ＲＮＡ（５−１０μｇ）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した（Ｄｅｓｒｅｕｍａｕｘ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｆａｊａｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。ＲＴ反応混合物は、β−アクチン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βに特異的なセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。サンプルは、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ９７００を用いて４０のＰＣＲサイクルにかけたが、それは９４℃で１分間の変性、５２−５８℃で１分間のプライマーアニーリング、および７２℃で１．５分間のプライマー伸長からなる（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ｍＲＮＡの量は、β−アクチンｃＤＮＡ分子当たりのＴＮＦαまたはＩＬ−１βのｃＤＮＡの数で表した。
【００４２】
動物実験、グルコース代謝と炎症
すべてのマウスは、厳密な１２時間の明暗サイクルで、温度を制御した（２５℃）施設内に維持し、飼料と水は自由摂取とした（標準的なマウス飼料；ＤＯ４、ＵＡＲ、フランス）。動物へ腹腔内注射でＦ−Ｌ−Ｌｅｕまたはロジグリタゾンを投与した。
【００４３】
Ｃ５７Ｂ１／６Ｊとｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）は、Ｊａｎｖｉｅｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌａｖａｌ−Ｌｅ　Ｇｅｎｅｓｔ，フランス）から入手した。腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）は、記載の通りに実施した（Ｋａｋｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８）。簡潔に言うと、マウスは一晩絶食させ（１８ｈ）、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中の２５％グルコースを、２ｇグルコース／ｋｇ体重の用量で腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。つづいて、注射の前および注射後指示された時間に、血液を尾から採取して、Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ　Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ４（Ｂａｙｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｐｕｔｅａｕｘ，フランス）でグルコース量を測定した。インスリン測定のための血液は、絶食中のマウスをクロロホルムで麻酔して後眼窩静脈叢から採取した。血漿を分離し、ラジオイムノアッセイキットを用いてインスリンを測定した（Ｃｉｓ　ｂｉｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ，フランス）。
【００４４】
オスのＢａｌｂ／ｃマウス（各群８匹）を、結腸炎研究に用いた（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）。結腸炎は、０．９％ＮａＣｌ内に溶解し、等量のエタノール（５０％エタノール）と混合したＴＮＢＳ（１５０ｍｇ／ｋｇ，Ｆｌｕｋａ，Ｓａｉｎｔ　Ｑｕｅｎｔｉｎ　Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）溶液４０μｌを投与して誘発した。この溶液は、麻酔したマウスの肛門の近位に４ｃｍ挿入した３．５Ｆカテーテル（Ｒｅｆ　ＥＯ　３４１６−１，Ｂｉｏｔｒｏｌ，Ｃｈｅｌｌｅｓ，フランス）を介して直腸内に投与した［キシラジン（５０ｍｇ／ｋｇのＲｏｍｐｕｎ（登録商標）２％，Ｂａｙｅｒ　Ｐｈａｒｍａ，Ｐｕｔｅａｕｘ，フランス）およびケタミン（５０ｍｇ／ｋｇのＩｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）１０００，Ｒｈｏｎｅ　Ｍｅｒｉｅｕｘ，フランス）］。動物は、ＴＮＢＳ投与から二日後にエーテル麻酔して頚椎脱臼によって屠殺した。結腸をすぐに除去して、開き、洗浄した。肛門管の２ｃｍ上に正確に位置する２ｃｍの結腸標本を、４つの部分に体系的に切り分けた。一つの部分は、４％パラホルムアルデヒド酸内で４℃で一晩固定し、アルコール内で脱水し、パラフィン内に包埋した。つぎに切片（５μｍ）をキシレンで脱パラフィンし、エタノール処理で再水和した。ヘマトキシリン−エオシンで染色した切片を、病理学者が盲検試験して、Ａｍｅｈｏ基準に従って点数を付けた（Ａｍｅｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。結腸の他の部分は、ＴＮＦαとＩＬ１βのｍＲＮＡ発現の定量化のためのＲＮＡ単離に使用した。
【００４５】
統計分析
値は平均±標準偏差で表した。統計上の差は、マン・ホイットニーのＵ検定で決定した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
【００４６】
実施例１：ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンは、細胞トランスフェクション実験においてＰＰＡＲγを活性化する。
置換されていない（Ｌ−チロシン、Ｄ−ロイシン、およびＬ−ロイシン）アミノ酸の各種のＦＭＯＣ誘導体を試験し、ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲγ２発現プラスミドとＪ_３ＴＫｐＧｌ_３レポータプラスミドを用いてのＨｅｐＧ２細胞での一過性トランスフェクション実験において、ＰＰＡＲγを活性化するそれらの能力について（ポジティブ内部コントロールとしての）ロジグリタゾンまたはピオグリタゾンと比較した。Ｌ−チロシンＰＰＡＲγリガンドとは対照的に（Ｃｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、ＦＭＯＣ置換Ｌ−チロシン誘導体はＰＰＡＲγを活性化しなかった。しかしながら有意のＰＰＡＲγ活性が、１０^−５Ｍの濃度のＦ−Ｌ−Ｌｅｕで検出できた（図２）。対照的に、ＦＭＯＣ−Ｄ−ロイシン誘導体では有意のＰＰＡＲγ活性化は検出されず、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕのＰＰＡＲγ活性化特性は立体選択的であることが証明された。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕでのさらなるトランスフェクション実験を、異なる細胞株で実施した（ＲＫ１３，ＣＶ１およびＨｅｐＧ２細胞）（図３Ａ、ＢおよびＣ）。ウサギの腎臓ＲＫ１３細胞において、ロジグリタゾンが１０^−８から１０^−７Ｍの間で最も良い活性を有することがわかった。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕについて、ＰＰＡＲγ活性化は１０^−５Ｍの濃度で発生した（図３Ａ）。先の結果と一致して、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、サルの腎臓細胞ＣＶ１（図３Ｂ）でも、ヒトＨｅｐＧ２細胞（図３Ｃ）でも、ＰＰＡＲγが最も良く活性化するのには、１０^−５Ｍの濃度が必要であった。ＰＰＡＲγ活性化のためのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ最適濃度はＰＧ　Ｊ２のそれに類似し、同じ効果に至るのに必要なロジグリタゾン（図３Ｃ）またはピオグリタゾン（データは示されていない）の濃度より１００倍高かった。
【００４７】
最後に、ＦＭＯＣアミノ酸誘導体が、ＲＫ１３細胞内のＰＰＡＲγのロジグリタゾンによる活性化と、共同作用あるいは拮抗するかを試験した（図３Ｄ）。ロジグリタゾンの飽和濃度までＦ−Ｌ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ　Ｌ−チロシンまたはＦＭＯＣ　Ｄ−ロイシン（１０^−５Ｍ）のいずれかを添加した場合でも、ＰＰＡＲγ活性の有意の変化は認められなかった。これらの結果は、１０^−７Ｍと１０^−５Ｍのそれぞれの濃度でロジグリタゾンとＦ−Ｌ−Ｌｅｕを用いることによって、最大のＰＰＡＲγ活性化に達したことをさらに裏付けるものである（図３Ａ参照）。
【００４８】
実施例２：ＦＭＯＣ　Ｌ−ロイシンはＰＰＡＲγ構造を変える
チアゾリジンジオンは、組換え受容体を部分的にトリプシン消化した後、プロテアーゼ耐性バンドが発生することによって評価されるように、ＰＰＡＲγ構造の改変を誘発することができる（Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｅｌｂｒｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。ＰＰＡＲγをＤＭＳＯ溶媒で培養したときには保護が認められなかったのに対し、ＰＰＡＲγをロジグリタゾンと培養すると、およそ２５ｋＤａの断片がトリプシン消化から保護された（図４）。興味深いことに、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは、ロジグリタゾンに類似のプロテアーゼ保護パターンを示し、このことは、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕがＰＰＡＲγ構造を改変したことを示している（図４）。
【００４９】
実施例３：二分子のＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンがＰＰＡＲγと相互作用する
ｈＰＰＡＲγＬＢＤ（アミノ酸２０３から４７７）のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析を用いて、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕのＰＰＡＲγとの特異的結合を識別した（図５）。精製したＰＰＡＲγＬＢＤ断片を、溶媒のみ、あるいはＰＰＡＲγ当量につき１または８当量のＦ−Ｌ−Ｌｅｕのいずれかで培養した。受容体の質量は、ＥＳＩ−質量分析によって培養後に求めた。ＰＰＡＲγの当量につき１当量のＦ−Ｌ−Ｌｅｕで、下記に対応するＰＰＡＲγの三群を判別できた：１／リガンドと結合していないＰＰＡＲγ；２／１つのＰＰＡＲγＬＢＤ分子と１つのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ分子で形成された複合体；および３／１つのＰＰＡＲγＬＢＤ分子と２つのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ分子で形成された複合体。興味深いことに、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ濃度を増加させると（ＰＰＡＲγ１当量につき８当量のＦ−Ｌ−Ｌｅｕ）、２つのＦ−Ｌ−Ｌｅｕ分子と結合したＰＰＡＲγＬＢＤに対応する複合体しか検出されなかった。これらの結果は、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕの二つの分子が非常に特異的な様式で、ＰＰＡＲγの一つの分子と相互作用することを示している。
【００５０】
実施例４：ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンはＰＰＡＲγ／ｐ３００相互作用を促進する
ＰＰＡＲγは、補因子ｐ３００と相互作用することが先に報告されている。全体的な分子のＰＰＡＲγ／ｐ３００相互作用は、ＰＰＡＲγＡＢＣドメインに対するｐ３００のリガンド非依存的結合と、ＰＰＡＲγＤＥドメインとのｐ３００のリガンド依存的相互作用の結果である（Ｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。したがって、精製されたＰＰＡＲγＤＥタンパク質は、リガンド結合の際にｐ３００を動員するその能力の点で、ＰＰＡＲγリガンド結合特性の効果を研究する道具になる。ＤＭＳＯコントロールと比較して、ロジグリタゾンとＦ−Ｌ−Ｌｅｕはともに、ＰＰＡＲγＤＥ／ｐ３００Ｎｔ−ＧＳＴ複合体の形成を効果的に誘発した。これは、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕがＰＰＡＲγリガンドであること、ＰＰＡＲγＤＥドメインに対するその結合が、ｐ３００との結びつきに必要な構造変化を引き起こすことが可能であることとを裏付けるものである。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ化合物の効力は、この分析においてはロジグリタゾンの２分の１から３分の１であった。
【００５１】
実施例５：ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンは脂肪細胞分化を刺激する
つぎに、マウスの前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化を促進するＦ−Ｌ−Ｌｅｕとロジグリタゾンの能力を比較した。脂質生成を、脂肪細胞分化のマーカーであるリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）およびａＰ２のｍＲＮＡレベルの分析と、分化過程に関連する形態変化の研究によって観測した。濃度１０^−５ＭのＦ−Ｌ−Ｌｅｕは、ＬＰＬとａＰ２のｍＲＮＡレベルの両方を、濃度１０^−７Ｍのロジグリタゾンで培養した細胞で見られるのに近い程度にまで有意に刺激した（図７Ａ）。蓄積した中性脂肪を染色するオイルレッドＯによる３Ｔ３−Ｌ１細胞の染色は、ＤＭＳＯ、または二つのＰＰＡＲγリガンドであるＦ−Ｌ−Ｌｅｕ、またはロジグリタゾンのいずれかと共に細胞を６日間培養した後に実施した（図７Ｂ）。ここでも二つの薬品は中性脂肪蓄積を誘発することができた。したがって、ロジグリタゾンと同様に、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕは３Ｔ３−Ｌ１細胞での脂質生成薬品である。
【００５２】
実施例６：ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンはインビボでインスリン感受性を改善する
Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕがインスリン感受性を改善させることができるかを評価するために、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕで処理したＣ５７ＢＬ／６ｊマウスのグルコース耐性を、溶媒のＤＭＳＯだけを投与したコントロール動物で見られるものと比較した（図８Ａ）。マウスは、７日間Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕの２つの異なる用量（１０および３０ｍｇ／ｋｇ／日）で処理し、ついでＩＰＧＴＴを実施した。腹腔内投与したグルコースは、溶媒または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｌ−Ｌｅｕを投与したマウスと同等の割合でなくなった。１０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｌ−Ｌｅｕとコントロールでは、グルコース注射後にグルコースレベルが４４０ｍｇ／ｄｌまで上昇したのに対し、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｌ−Ｌｅｕで処理したマウスでは、最大グルコースレベルは３２０ｍｇ／ｄｌまでしか増加しなかった。加えて、曲線の下の面積は、コントロールのマウスまたは低用量でＦ−Ｌ−Ｌｅｕを投与したマウスのいずれかと比較して、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｌ−Ｌｅｕで処理したマウスでは有意に小さかった。
【００５３】
つぎに、ＤＭＳＯ、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはロジグリタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で７日間処理したｄｂ／ｄｂマウスにおけるグルコース耐性を比較した。コントロールのマウス（ＤＭＳＯ群）において、血糖はグルコース負荷の後に、急速に増加して、注射後４５から６０分の間に５００ｍｇ／ｄｌの最大値に達し、その後ゆっくり減少した。ロジグリタゾンで処理したマウスでは、コントロールの動物よりもグルコース負荷に対して「耐性」が高く、最大血糖は低下し（３５０ｍｇ／ｄｌ）、これらの過剰値はより急速に回復した。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ処理動物は、注射から２０分後の最高グルコースレベル（４２０ｍｇ／ｄｌ）、またそれに続き１２０分以内での即座のおよび急速な正常（１００ｍｇ／ｄｌ）値への低下で、最良のグルコース負荷試験を示した。くわえて、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕおよびロジグリタゾンで動物を７日間処理すると、用量に依存して絶食時の血清インスリンレベルが低下する結果になった（ＤＭＳＯ群の１８０μＵＩ／ｍＬに対して、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕまたはロジグリタゾンのいずれかで処理したｄｂ／ｄｂマウスは７０μＵＩ／ｍＬの平均値）（図８Ｃ）。これらのデータは、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕが糖尿病、および正常なマウスの両方において、インスリン感受性を改善することを明らかに示している。興味深いことに、ロジグリタゾンはマウスの体重を増加させる傾向があったのに対して、８日間Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕ処理したマウスでは、コントロールのマウスと比較した際に、体重の差は認められなかった（図８Ｄ）。加えて、コントロール、またはロジグリタゾンで処理したマウスに対し、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕで処理したマウスでは、肝臓の重量が減少する傾向が認められた（データは示されていない）。
【００５４】
実施例７：ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンは結腸炎を防ぐ
ＴＮＢＳを直腸内投与することにより、ＴＮＰ残基が自己宿主タンパク質と共有結合して、多核細胞による粘膜浸潤、ＴＮＦαの産生、およびＮＦκＢの活性化が起こり、その結果マウスにおける結腸炎が迅速かつ再現性をもって誘発されるということが明らかになった（Ａｌｌｇａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９；Ｓｔｅｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２；Ｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。コントロール動物または５０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｌ−Ｌｅｕで４日間処理した動物への直腸内ＴＮＢＳ投与から２日後に、生存率を計算し、結腸損傷ならびにサイトカイン産生に点数を付けた（図９）。興味深いことに、炎症誘発後に生き残ったコントロールのマウスは７６％に過ぎなかったのに対し、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕで処理したマウスの１００％が結腸炎症でも生存し続けた。Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕの投与はさらに、組織学的スコアを大幅に下げ、そのことはＦ−Ｌ−Ｌｅｕが炎症によって誘発される潰瘍形成、糜爛および壊死を減らすことを示している。最後に、Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕの投与の結果、前炎症性サイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βの発現したｍＲＮＡレベルが有意に低下したので、ロジグリタゾンの場合と同様に、Ｆ−Ｌ−ＬｅｕによるＰＰＡＲγ活性化が、ＴＮＦαシグナル経路の阻害によって結腸炎を防ぐことが窺われる。
【００５５】
参照文献
Ａｌｌｇａｙｅｒ，Ｈ．，Ｄｅｓｃｈｒｙｖｅｒ，Ｋ．ａｎｄ　Ｓｔｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９８９）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　１６，１６’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｉｔｉｓ　ｗｉｔｈ　ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９６，１２９０−１３００．
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Ｃｈａｗｌａ，Ａ．ａｎｄ　Ｌａｚａｒ，Ｍ．Ａ．（１９９４）Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｎｄ　ｒｅｔｉｎｏｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１７８６−１７９０．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９．
Ｃｏｂｂ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｂｏｓｗｅｌｌ，Ｅ．Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｃｈａｒｉｆｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｄｅｚｕｂｅ，Ｍ．，Ｈｅｎｋｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｈｕｌｌ−Ｒｙｄｅ，Ｅ．Ａ．，Ｌａｋｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｗ．，Ｊｒ．，Ｏｐｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｐｅｎｔｔｉ，Ｍ．，Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｌｕｎｋｅｔ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ　Ｔｏｎｇ，Ｗ．Ｑ．（１９９８）Ｎ−（２−Ｂｅｎｚｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ＰＰＡＲ　ｇａｍｍａ　ａｇｏｎｉｓｔｓ．３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ−ａｒｙｌ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，４１，５０５５−５０６９．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｂｏｓｗｅｌｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｃｈａｒｉｆｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｏｂｂ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｅｎｋｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｈｕｌｌ−Ｒｙｄｅ，Ｅ．Ａ．，Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，Ｗ．Ｍ．，Ｌａｋｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｌｅｅｓｎｉｔｚｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｒｂａｎｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｇｒａｙ−Ｎｕｎｅｚ，Ｙ．，Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ　Ｔｏｎｇ，Ｗ．Ｑ．（１９９８）Ｎ−（２−Ｂｅｎｚｏｙｌｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ＰＰＡＲ　ｇａｍｍａ　ａｇｏｎｉｓｔｓ．２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｙｌ　ａｌｋｙｌ　ｅｔｈｅｒ　ｍｏｉｅｔｙ．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，４１，５０３７−５０５４．
Ｄｅｓｒｅｕｍａｕｘ，Ｐ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｏ．，Ｇｅｂｏｅｓ，Ｋ．，Ｇａｍｂｉｅｚ，Ｌ．，Ｂｅｒｒｅｂｉ，Ｄ．，Ｍｕｌｌｅｒ−Ａｌｏｕｆ，Ｈ．，Ｈａｆｒａｏｕｉ，Ｓ．，Ｅｍｉｌｉｅ，Ｄ．，Ｅｃｔｏｒｓ，Ｎ．，Ｐｅｕｃｈｍａｕｒ，Ｍ．，Ｃｏｒｔｏｔ，Ａ．，Ｃａｐｒｏｎ，Ｍ．，Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．ａｎｄ　Ｃｏｌｏｍｂｅｌ，Ｊ．Ｆ．（１９９９）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　Ｃｒｏｈｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１７，７３−８１．
Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ，Ｂ．ａｎｄ　Ｗａｈｌｉ，Ｗ．（１９９９）Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｕｃｌｅａｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２０，６４９−６８８．
Ｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ａｄａｍｓ，Ａ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．，Ｋｌａｔｔ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｍｅｎｋｅ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ　Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９９）Ｌ−７６４４０６　ｉｓ　ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇａｍｍａ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｃｙｓ３１３　ｉｎ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２７４，７９１３−７９２２．
Ｆａｊａｓ，Ｌ．，Ａｕｂｏｅｕｆ，Ｄ．，Ｒａｓｐｅ，Ｅ．，Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｓａｌａｄｉｎ，Ｒ．，Ｎａｊｉｂ，Ｊ．，Ｌａｖｉｌｌｅ，Ｍ．，Ｆｒｕｃｈａｒｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｅｅｂ，Ｓ．，Ｖｉｄａｌ−Ｐｕｉｇ，Ａ．，Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｔａｅｌｓ，Ｂ．，Ｖｉｄａｌ，Ｈ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（１９９７）Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＰＰＡＲγ　ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８７７９−１８７８９．
Ｆｏｒｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｂｒｕｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９５）１５−Ｄｅｏｘｙ−Δ１２，１４　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｊ２　ｉｓ　ａ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＰＰＡＲγ．Ｃｅｌｌ，８３，８０３−８１２．
Ｇｅｌｍａｎ，Ｌ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｆａｊａｓ，Ｌ．，Ｒａｓｐｅ，Ｅ．，Ｆｒｕｃｈａｒｔ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（１９９９）ｐ３００　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｎ−　ａｎｄ　Ｃ−　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ＰＰＡＲγ２　ｉｎ　ａ　ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，７６８１−７６８８．
Ｇｒａｖｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ａｎｄ　Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（１９９２）Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｈａｎｃｅｒ：ＡＲＦ６　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１２，１２０２−１２０８．
Ｉｓｓｅｍａｎ，Ｉ．，Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ａ．，Ｔｕｇｗｏｏｄ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．（１９９３）Ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ　ｉｓ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｆｉｂｒａｔｅ　ｈｙｐｏｌｉｐｉｄａｅｍｉｃ　ｄｒｕｇｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１，３７−４７．
Ｊｉａｎｇ，Ｃ．，Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｔ．ａｎｄ　Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９９８）ＰＰＡＲγ　ａｇｏｎｉｓｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８２−８６．
Ｋａｋｕ，Ｋ．，Ｆｉｅｄｏｒｅｋ，Ｆ．Ｔ．，Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｍ．ａｎｄ　Ｐｅｒｍｕｔｔ，Ｍ．Ａ．（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　Ｉｎｂｒｅｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ｓｔａｉｎｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７，７０７−７１３．
Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｐａｔｅｌ，Ｉ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ　Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）Ａ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｊ２　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｂｉｎｄｓ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，８３，８１３−８１９．
Ｌａｂｏｒｄａ，Ｊ．（１９９１）３６Ｂ４　ｃＤＮＡ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍＲＮＡ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ａｃｉｄｉｃ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＯ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９，３９９８．
Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ａ．−Ｍ．，Ｐｅｉｎａｄｏ−Ｏｎｓｕｒｂｅ，Ｊ．，Ｌｅｉｔｅｒｓｄｏｒｆ，Ｉ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒｕｃｈａｒｔ，Ｊ．−Ｃ．，Ｆｉｅｖｅｔ，Ｃ．，Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．ａｎｄ　Ｓｔａｅｌｓ，Ｂ．（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｂｙ　ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ　ｏｃｃｕｒｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ，ｂｕｔ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｆｉｂｒａｔｅｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１７，１７５６−１７６４．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈｏｔｉｎａｒｕｅｍｏｌ，Ｓ．，Ｓａｄｏｗｓｋａ−Ｋｒｏｗｉｋｃａ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｊ．，ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ　Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ａ．（１９９３）Ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｉｌｅｉｔｉｓ　ｉｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｌｅｕｍｅｄｉｎ　Ｎ−（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−９−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−ｌｅｕｃｉｎｅ（ＮＰＣ　１５１９９）．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ，２６６，４６８−４７２．
Ｎａｇｙ，Ｌ．，Ｔｏｎｔｏｎｅｚ，Ｐ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）Ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＬＤＬ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｌｉｇａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＰＡＲγ．Ｃｅｌｌ　９３，２２９−２４０．
Ｏｂｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．Ｐ．，Ｇｏｒｅｈａｍ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｂｂ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｌｌ−Ｒｙｄｅ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｈｒ，Ｃ．Ｐ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｂ．，Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｌｕｎｋｅｔ，Ｋ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ　Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）Ａ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇａｍｍａ　ｌｉｇａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，９６，６１０２−６１０６．
Ｒａｎｇｗａｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｖ．，Ｌｏｎｇｏ，Ａ．，Ｌｏｉｏｄｉｃｅ，Ｆ．，Ｎｏｏｎａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ　Ｆｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９７）Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｈｉｒａｌ　ｃｌｏｆｉｂｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎａｌｏｇｓ　ｏｎ　ｒａｔ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ（ｒＰＰＡＲ　ａｌｐｈａ）ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｅｔａ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，９，３７−４７．
Ｒｏｇｎｉａｕｘ，Ｈ．，Ｖａｎ　Ｄｏｒｓｓｅｌａｅｒ，Ａ．，Ｂａｒｔｈ，Ｐ．，Ｂｉｅｌｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｂａｒｂａｎｔｏｎ，Ｊ．，ｖａｎ　Ｚａｎｄｔ，Ｍ．，Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｂ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｅ．，Ｍｉｔｓｃｈｌｅｒ，Ａ．，Ｐｏｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｕｒｚｈｕｍｔｓｅｖａ，Ｌ．，Ｍｏｒａｓ，Ｄ．ａｎｄ　Ｐｏｄｊａｒｎｙ，Ａ．（１９９９）Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１０，６３５−６４７．
Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（２０００）Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ：ａｎ　ｕｐｄａｔｅ．Ｌａｎｃｅｔ，３５５，１００８−１０１０．
Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．，Ｓｔａｅｌｓ，Ｂ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（１９９７）Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｏｒｐｈａｎｓ　ｗｉｔｈ　ｌｉｇａｎｄｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，８，１５９−１６６．
Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．，Ｐｅｉｎａｄｏ−Ｏｎｓｕｒｂｅ，Ｊ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｙｍａｎ，Ｒ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．，Ｄｅｅｂ，Ｓ．，Ｓｔａｅｌｓ，Ｂ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（１９９６）ＰＰＡＲα　ａｎｄ　ＰＰＡＲγ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｄｉｒｅｃｔ　ａ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｖｉａ　ａ　ＰＰＲＥ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｐａｓｅ　ｇｅｎｅ．ＥＭＢＯ　Ｊ．，１５，５３３６−５３４８．
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ　Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．（１９９６）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ：ｒｏｕｎｄｉｎｇ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｂｉｇ　ｐｉｃｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ，８７，３７７−３８９．
Ｓｔｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｃｏｒｔ，Ｄ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｊ．，Ｂｕｒａｋｏｆｆ，Ｒ．，ＤｅＳｃｈｒｙｖｅｒ−Ｋｅｃｓｋｅｍｅｔｉ，Ｋ．，Ｇｒａｍｌｉｃｈ，Ｔ．Ｌ．　ａｎｄ　Ｂｅｅｋｅｎ，Ｗ．（１９９２）Ｄｉｅｔａｒｙ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｉｓｈ　ｏｉｌ　ｉｎ　ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ　ｃｏｌｉｔｉｓ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１６，６０９−６１４．
Ｓｕ，Ｇ．Ｃ．，Ｗｅｎ，Ｘ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｒａｎｇｗａｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｅｉｌｂａｕｇｈ，Ｓ．Ａ．，Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ａ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，Ｌａｚａｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ　Ｗｕ，Ｇ．Ｄ．（１９９９）Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｃｏｌｉｔｉｓ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ＰＰＡＲｇａｍｍａ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，３８３−３８９．
Ｖｕ−Ｄａｃ，Ｎ．，Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．，Ｋｏｓｙｋｈ，Ｖ．，Ｄａｌｌｏｎｇｅｖｉｌｌｅ，Ｊ．，Ｆｒｕｃｈａｒｔ，Ｊ．−Ｃ．，Ｓｔａｅｌｓ，Ｂ．ａｎｄ　Ａｕｗｅｒｘ，Ｊ．（１９９５）Ｆｉｂｒａｔｅｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｈｕｍａｎ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−ＩＩ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，７４１−７５０．
Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｔｅｒｎｂａｃｈ，Ｄ．Ｄ．ａｎｄ　Ｈｅｎｋｅ，Ｂ．Ｒ．（２０００）Ｔｈｅ　ＰＰＡＲｓ：ｆｒｏｍ　ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｔｏ　ｄｒｕｇ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，４３，５２７−５５０．
Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｏｂｂ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｏｗａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｉｅｔｈｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｃｏｒｒｅａ，Ｉ．Ｄ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｅｃｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｂ．，Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ　Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　γ　ａｇｏｎｉｓｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９，６５５−６６８．
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｌｉｓｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｉｋａｍｉ，Ｔ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉ，Ｋ．，Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｒ．，Ｓｅｒｈａｎ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ　Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．（２０００）Ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇａｍｍａ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２７５，１８７３−１８７７．
Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．Ｗ．，Ｂｕｃｋｌｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｃａｎｔｅｌｌｏ，Ｂ．Ｃ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｈ．，Ｃｌａｐｈａｍ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｙｌｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｉｇｈ，Ｄ．，Ｈｉｎｄｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｋａｌｌｅｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｌａｔｔｅｒ，Ａ．Ｊ，Ｌａｗｒｉｅ，Ｋ．Ｗ．Ｍ．，Ｍｏｓｓａｋｏｗｓｋａ，Ｄ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｒｏｘｂｅｅ　Ｃｏｘ，Ｌ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ａ．（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ　ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＢＲＬ−４９６５３）ｉｎ　ｒｏｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇａｍｍａ．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ，２８４，７５１−７５９．
Ｙｕ，Ｋ．，Ｂａｙｏｎａ，Ｗ．，Ｋａｌｌｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｈ．Ｐ．，Ｒａｖｅｒａ，Ｃ．Ｐ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．ａｎｄ　Ｌａｚａｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｂｙ　ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２３９７５−２３９８３．
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＰＡＲγリガンドの構造と、設計のための経路を示した図。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞におけるＦＭＯＣアミノ酸によるＰＰＡＲγ２の転写活性を示したグラフ。
【図３】Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕが様々な細胞株でＰＰＡＲγ２の転写活性を促進することを示したグラフ。
【図４】Ｆ−Ｌ−ＬｅｕリガンドがＰＰＡＲγの構造を改変することを示すオートラジオグラフ。
【図５】ＥＳＩ−質量分析結果を示すグラフ。
【図６】Ｆ−Ｌ−ＬｅｕがＰＰＡＲγのｐ３００との相互作用を促進することを示す、電気泳動の結果を示した図。
【図７】Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕが脂肪細胞の分化を促進することを示した図。
【図８】Ｆ−Ｌ−Ｌｅｕがインスリン感受性を改善することを示したグラフ。
【図９】Ｆ−Ｌ−ＬｅｕがＴＮＢＳ処理Ｂａｌｂ／ｃマウスの結腸炎を防ぐことを示したグラフ。

Claims (19)

1. 式Ｉを有する化合物を治療効果のある量投与することから成る、ＰＰＡＲ−γが仲介する疾患または症状を治療または予防するための方法であって：
   【式１】

   

   この式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、
   Ｘは、一から四個のヘテロ原子を含むことができる１から６個の炭素原子から成る鎖であり、
   Ｒ２は、少なくとも二つの環を含む縮合多環基である：
   ことを特徴とする方法。
2. Ｒ２基は、炭素環とヘテロ環から選択された少なくとも二つの環を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. Ｘ鎖が、オキソ基によって置換できる一つまたは二つの炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. Ｒ２が、下記から選択された多環基であり：
   【式２】

   

   ここで、前記基はハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
5. 式Ｉの化合物を治療効果のある量投与することから成り、前記化合物が
   【式３】

   

   であり、
   この式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、
   Ｒ２は、下記から選択された多環基であり：
   【式４】

   

   ここで、前記基はハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 式Ｉの化合物を治療効果のある量投与することから成り、前記化合物が
   【式５】

   

   であり、
   この式において、Ｒ１は、１から６個の炭素原子から成る直鎖または分岐アルキル、アルケニル、およびアルキニル基から選択され、
   前記三環基は、ハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 式Ｉの化合物を治療効果のある量投与することから成り、前記化合物が
   【式６】

   

   であり、
   この式において前記三環基は、ハロゲン、Ｎ、ＯおよびＳから選択された一から四個のヘテロ原子を随意に含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシンを治療効果のある量投与することからなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 前記疾患または症状が、食欲不振であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
10. 体重を増減するための、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
11. インスリン感受性を増すための、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
12. 糖尿病で発生するインスリン抵抗性の治療または予防のための、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
13. 前記疾患または症状が、慢性炎症性疾患であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
14. 前記疾患または症状が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
15. 前記疾患または症状が、関節炎、とくに慢性関節リウマチ、多発性関節炎および喘息であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
16. 前記疾患が、ガンであることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
17. 前記疾患が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
18. 前記疾患が、皮膚疾患、とくに乾癬であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。
19. 前記疾患が、高脂血症であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。

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