JP2008504539A - HBHAを使用した結核の検出およびMycobacteriumtuberculosisによる感染の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
a)現在のワクチンであるBCG(カルメットとゲランの桿菌)よりも有効な予防をもたらすワクチンの開発による予防;
b)結核の迅速な診断手法の改良;および
c)管理を容易にして多剤耐性細菌種の発生を避ける迅速な治療法の発見。
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK(配列番号1)
を有するアミノ酸161-199が含まれる。
TB0:結核因子に曝露していない;感染なし:
TB1:Mycobacterium tuberculosisに曝露、感染の程度は不明:
TB2:結核因子に感染、症状は発症していない(ツベルクリン皮膚試験では陽性反応:陽性PPD):
TB3:活動性の結核、完全な診断:
TB4:臨床的には不活動性の結核、適切に治療または寛解期:
TB5:結核の可能性あり、診断中(結核を「除外」)。
a)前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;
b) 2つの異なる形態のHBHAタンパク質に対する抗体(IgG)であって、前記生物学的サンプル中に含まれている抗体の量を、抗体-HBHA相互作用の形成に適した条件下で測定すること;および
c) 2つの形態のHBHAタンパク質について得られた抗体のタイターを比較すること、
を含み、潜在性の結核を示す哺乳類における2つの異なる形態について得られた抗体タイターの比較が、活動性の結核を示す哺乳類において得られた抗体タイターとは異なる方法に関する。
・前記した2つの異なる形態のHBHA(1つは、天然型HBHAと組換え型HBHA、他方は、rHBHAΔC断片とHBHAのメチル化C末端断片);
・前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに含まれる抗体と異なる形態のHBHAとの免疫反応を行うための媒体を構成するのに必要な試薬(本試薬には、抗体と異なる形態のHBHAとの相互作用に必要な全ての化合物だけでなく、前記相互作用を増加または改善することができる任意の化合物または前記相互作用をより特異的にする任意の化合物が含まれる);
・前記免疫反応の間に形成される免疫複合体の検出を可能とする試薬(本試薬には、前記した抗体と異なる形態のHBHAとの反応を示すことができる、または検出することができる任意の化合物が含まれる。本試薬には、場合によっては放射線で標識された、または蛍光色素とカップリングした二次抗体だけでなく、検出シグナルを増強できる、または調節することができる任意の分子が含まれる)、
を含むキットを提供する。
a)前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;
b)独立した方法で、前記生物学的サンプルを、IFN-γの分泌をもたらす条件下で、天然型HBHAおよびESAT-6と接触させること;
c)HBHAに特異的なIFN-γ分泌およびESAT-6に特異的なIFN-γ分泌を測定すること;ならびに
d)HBHAに特異的なIFN-γ分泌とESAT-6に特異的なIFN-γ分泌との比率を計算すること、
を含み、潜在性の結核を示す哺乳類で得られた比率が、活動性の結核を示す哺乳類で得られた比率、またはM. tuberculosisに感染していない哺乳類で得られた比率よりも高い方法に関する。
・天然型HBHAおよびESAT-6;
・独立した方法で、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、天然型HBHAおよびESAT-6との接触を行うための媒体を構成するのに必要な試薬(本試薬には、前記キットのための試薬が含まれる);
・接触後のIFN-γ分泌を検出するための試薬(分泌したIFN-γは、任意の既知の方法を使用して測定され、そして、場合によっては標識されているIFN-γに特異的な一次抗体、または一次抗体を認識することができる場合によっては標識されている二次抗体だけでなく、検出シグナルを増強できる、もしくは調節することができる任意の分子を、キットに含むことができる)、
を含むキットに関する。
a)前記哺乳類の局所的な感染部位から生物学的サンプルを得ること;
b)前記サンプルを、IFN-γへの効果を得るのに適した条件下で、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと接触させること;
c)HBHAに特異的なIFN-γに対する前記接触の効果を測定すること、
を含み、HBHAに特異的なIFN-γの効果が、活動性の結核を示す哺乳類では、M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類よりも高い方法に関する。
・天然型HBHAまたは組み換え型HBHA;
・前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞を、天然型または組換え型HBHAと接触させるのに適した媒体を構成するための試薬(本試薬には、前記キットにおける試薬が含まれる);
・接触後のIFN-γの検出を可能とする試薬(分泌したIFN-γまたは細胞質内IFN-γは、任意の既知の方法を使用して測定され、そして、標識されていてもよいIFN-γに特異的な一次抗体、一次抗体を認識することができる標識されていてもよい二次抗体、検出シグナルを増強できる、または調節することができる任意の分子を、キットに提供することができる)、
を含むキットに関する。
血液サンプルを、同意を得てから、結核患者および潜在性の結核患者から入手した。結核患者は、直接的な試験での陽性および/またはMycobacteriumm tuberculosisの培養での陽性に基づいて選択した。全ての患者を、治療の最初の3週間の終了前に入院させた。潜在性の結核を有する患者は、ツベルクリンに対する遅延型過敏性試験の陽性(診断時での18mmを超える硬結直径)に基づいて選択した。活動性の結核は、通常の胸部レントゲン写真に基づいて除外した。全ての患者は、HIVについて血清反応陰性であり、いずれの患者も免疫抑制治療を受けていなかった。全ての患者は、募集時にヨーロッパに在住していた。
肺胞洗浄液(BAL)を、約200mlの生理水を注入後に、内視鏡によって取り出した。その後、取り出した液を遠心した(約10ml)。
他の文献(14)に記載されているように、天然型のHBHA(nHBHA)を、M. bovis BCGから、ヘパリン-セファロースクロマトグラフィーに続き、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。HPLCクロマトグラム、およびSDS-PAGE分析後のCoomassie Blueを用いた染色により、調製物はタンパク質の混入が無かったことが証明された。ガスクロマトグラフィーを使用して、糖脂質が混入していないことを確認した。リムルス試験によって、リポ多糖の濃度が10pg/ml未満であることが示された。
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK(配列番号1)
を有する(12、13)。Pethe et al(2000, Journal of Biological Chemistry 275 (19): 14273-14280)およびTemmerman(Nat. Med. 2004 Sep, 10(9): 935-941)を、参照により本明細書に組み込む。
ELISAを、抗-nHBHA-IgG、抗-rHBHA-IgG、抗-rHBHAΔC-IgGおよび抗-Cペプチド(単離したC末端ペプチド)-IgGを検出するために使用した。詳細には、PBSで希釈した1.5μg/lの抗原溶液(nHBHA、rHBHA、rHBHAΔCまたはCペプチド)を50μl/ウェルで用いて、96穴ポリスチレンプレート(Maxisorp Nunc)を一晩4℃でインキュベートした。プレートを、PBS-Tween20(0.05%)を用いて三回洗浄し、PBSに溶かした1%のカゼイン溶液を用いて、1時間37℃で飽和させた。洗浄後、PBS-Tween20溶液(0.05%)で希釈した患者由来の血清(1:50から1:12800に希釈)を、各ウェルに30分間室温で添加し、攪拌した。PBS-Tween20(0.05%)で250倍に希釈した、ビオチンで標識したヤギ抗-ヒトIgG抗体を、二次抗体として使用し(biotinylated goat anti-human IgG - Southern Biotechnologies Associates, Birmingham, USA 2040-08)、二次抗体の検出を、1:1000(0.5%カゼイン)で希釈したペルオキシダーゼ溶液(extravidin peroxidase-conjugated E2886 - Sigma)を50μl/ウェルで添加して確認した。50μlの基質溶液(0.1Mクエン酸ナトリウム, pH5に溶かした0.1mg/mlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンおよび1μl/mlの30%過酸化水素)を、洗浄後に、暗黒下で10から30分間添加した。反応を、25μl/ウェルの塩酸(2mMol/l)によって停止した。抗体タイターを、陰性の血清プールに対して陽性であると判断した最終的な血清希釈率で示す。
PBMCを、末梢血サンプルの密度勾配遠心分離によって入手した(lymphoprep - Nycomed Pharma)。前記PBMCを、培養培地(40μg/mlのゲンタマイシン、50μM 2-メルカプトエタノール、1×非必須アミノ酸(Life Technologies)および10%のウシ胎児血清(FCS)を添加した完全RPMI:RPMI 1640(BioWhittaker))を用いて2×106細胞/mlで再懸濁した。細胞を、2μg/mlのnHBHAと、並行して5μg/mlのearly secreted antigen target 6(ESAT-6)(Statens Serum Institut, Denmark)とを用いて、96時間、5%のCO2の雰囲気下37℃で刺激した。幾つかの実験においては、ブロッキング抗体:抗-TGF-β 1, 2, 3(mouse IgG1, R&D System)を、5μg/mlの濃度で添加し、結果を、コントロール抗体(mouse IgG1; R&D System)の存在下で得られた結果と比較した。上清を、培養4日後に回収し、ELISA(IFN-γ Cytoset, Biosource)を使用して、分泌したIFN-γを測定した。
<実施例6a:生物学的液体および解剖学的パーツ>
分析した生物学的液体は、胸膜液、関節液および腹水であった。分析した解剖学的パーツは、神経節または様々な疑わしい塊から切除した生検であった。生物学的液体からの有核成分の単離を、最初のろ過(cellular sieve, Nylon 100μm Falcon(登録商標)352360)に続き、15分間の2300rpmの遠心によって行なった。必要であるならば、細胞残渣に存在する赤血球を溶解した。その後、細胞を、完全RPMI溶液で再懸濁した。解剖学的サンプルに由来する有核成分を、そのパーツの切除、および、完全RPMI溶液内で、37℃、5%CO2雰囲気下で一晩インキュベーションすることによって単離した。上清を回収し、そのパーツをリンスし、まだ入手可能な任意の細胞を回収した。その後、これらの回収した液体を、2300rpmで15分間遠心した。必要であるならば、細胞残渣に存在する赤血球を溶解した。細胞残渣を、完全RPMI溶液で再懸濁した。
単離した細胞が十分である場合は(胸膜液)、それらを、PBMCと同じ方法でin vitroで刺激し、HBHAによる96時間のin vitro刺激後の培養上清における分泌したIFN-γの濃度を測定した。PBMCに関しては、肺胞洗浄液、関節液または腹水、神経節等について、これらの細胞によるIFN-γ合成の分析も、以下に記すHBHAによる短時間のin vitro刺激後に、フローサイトメトリーによって実施した。単離した細胞(2×106/ml)を、10μg/mlの濃度でHBHAによって、16から18時間in vitroで刺激した。その後、細胞からのサイトカイン分泌を、Brefeldin A(10μg/ml-Brefeldin A - Sigma)の存在下で4時間インキュベーションすることによってブロックし、細胞内でのIFN-γの存在を、細胞を標識した後で、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を固定後、細胞を透過処理し(Fix and Perm; Cell Permeabilization Kit - Caltag Laboratories)、洗浄し、その後、暗黒下で30分間、蛍光色素とカップリングした抗体(抗-CD3 PerCP、抗-CD4 APC、抗-IFN-γ PE、全てはBecton, Dickinsonから入手)の存在下でインキュベートした。その後、陽性細胞の割合を、FACSCalibur cytometerを用いて、最初に、大きさおよび粒度に基づいて標的リンパ球を分析し、その後で、表面マーカー発現の作用として、異なるリンパ球亜群を分析した。
対になっていないデータについて、Mann-Whitney non parametric U testまたはnon parametric Kruskall-Wallis testを実施し、その後、Dunn testを使用して事後試験を実施した。対になったデータを、Wilcoxon testまたはFriedman testによって分析した。
-感度:陽性診断の患者における、試験で陽性となった患者の確率:真陽性(TP);
-特異度:陰性診断の患者における、試験で陰性となった患者の確率:真陰性(TN);
-(1-特異度):陰性診断の患者における、試験で陽性となった患者の確率:擬陽性(FP);
-(1-感度):陽性診断の患者における、試験で陰性となった患者の確率:偽陰性(FN)。
<1.液性応答>
nHBHAに特異的なIgGは、良好な健康(初期感染(primo-infected)対象または潜在性)である場合であろうと、罹患し結核の症状を示す(活動性)場合であろうと、Mycobacterium tuberculosisで感染した対象の約40%に由来する血清から検出された。これら2つの対象群で観察された抗体タイターは差異がなかった(図1)。
a.我々は、以前に、PBMCによる天然型HBHAに応答するIFN-γの分泌が、結核患者よりも初期感染(primo-infected)対象のほうが顕著に高いことを以前に示している。しかしながら、得られる区別は、診断目的のために使用するには十分ではなかった。試験を行った対象の数が増したので、初期感染(primo-infected)対象の中から、感染の予想される日が5年以内であるという選択が可能となった。図4の結果により、2つの群間の差異は僅かに存在するが、まだ不十分であることが示された。
潜在性結核(IP)を示すヒトは、症状を示さないが、コッホ桿菌の転移源となり、試験により、健康な集団におけるそのようなヒトを同定できなければならない。それ故、コントロール対象(M. tuberculosisに感染していない - n=14)、およびツベルクリン(PPD)陽性皮内反応の結果に基づく潜在性結核を示すヒト(n=46)から、HBHAによって誘導され、PBMCによって分泌したIFN-γの濃度に基づいて、ROC曲線を作成した。これを、参考用診断基準とする(表1)。
-TP:陽性のツベルクリン皮内反応を有する患者における、陽性結果(最適カットオフより高い)を示す患者の確率;
-FP:陰性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陰性結果(最適カットオフより低い)を示す患者の確率;
-FN:陰性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陽性結果(最適カットオフより高い)を示す患者の確率;
-TN:陽性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陰性結果(最適カットオフより低い)を示す患者の確率。
患者が結核に対応する診断履歴を有し、ツベルクリン皮内反応が陽性である場合、潜在性結核も有する患者に生じる可能性がある他の疾患から、結核を区別することは重要である。それゆえ、試験は、M. tuberculosisに感染した患者の集団の中から、潜在性結核の患者を同定しなければならない。それゆえ、一方はツベルクリン皮内反応の結果に基づいて定義された潜在性結核を示す患者(重要な診断参考である)(n=46)に由来し、他方は非治療の活動性結核を示す患者(n=50)に由来する、HBHAによって誘導され、PBMCによって分泌したIFN-γの濃度に基づいて、ROC曲線を作成した(表2)。
-TP:結核の症状を示す患者の中で、陽性結果(最適カットオフより高い)を示す患者の確率;
-FP:結核の症状を示さない患者の中で、陰性結果(最適カットオフより低い)を示す患者の確率;
-FN: 結核の症状を示さない患者の中で、陽性結果(最適カットオフより高い)を示す患者の確率;
-TN: 結核の症状を示す患者の中で、陰性結果(最適カットオフより低い)を示す患者の確率。
結核の患者において、nHBHAに応答するPBMCによるIFN-γの分泌が生じないこととは対照的に、胸膜液、関節液、肺胞液および腹腔液などの局所感染部位に由来する細胞の刺激により、nHBHAまたはrHBHAによる刺激に応答する主要なIFN-γ応答を観察することできた。これは、Mycobacterium tuberculosisに感染していないが、結核に対応する臨床的兆候およびX線の兆候を示すコントロール対象とは対照的である。局所的サンプルの量により、十分量のリンパ球の単離が可能となる場合は、これらの細胞を天然型HBHAによって刺激し、培養上清のIFN-γの量をELISAによって測定した。
Claims (42)
- 潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをin vitroで検出し区別する方法であって、
a)前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;
b)前記生物学的サンプル中に含まれている、2つの異なる形態のHBHAタンパク質に対する抗体(IgG)の量を、抗体-HBHA相互作用の形成を可能とする適切な条件下で測定すること;
c)2つの形態のHBHAタンパク質について得られた抗体のタイターを比較すること、
を含み、潜在性の結核を示す哺乳類における2つの異なる形態について得られた抗体タイターの比較が、活動性の結核を示す哺乳類において得られた抗体タイターの比較とは異なる方法。 - 前記2つの形態が、メチル化の程度によって区別される、請求項1に記載の方法。
- 前記2つの異なる形態のHBHAタンパク質が、天然型HBHAおよび組換え型HBHAである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルが、2つの形態のHBHAに対する比較可能な量の抗体を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルが、組換え型HBHAに対する抗体の量よりも多い量の天然型HBHAに対する抗体を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記2つの異なる形態のHBHAタンパク質が、rHBHAΔC断片およびHBHAのメチル化されたC末端断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルが、HBHAのメチル化されたC末端断片に対する抗体の量よりも多い量のrHBHAΔC断片に対する抗体を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルが、rHBHAΔC断片に対する抗体の量よりも多い量のHBHAのメチル化されたC末端断片に対する抗体を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血液血清である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、
・以下のa)およびb)からなる群から選択される2つの異なる形態のHBHA、
a)天然型HBHAおよび組換え型HBHA、
b)rHBHAΔC断片およびHBHAのメチル化されたC末端断片、
・前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに含まれる抗体と異なる形態のHBHAとの免疫反応を行うための媒体を構成するのに必要な試薬、ならびに
・前記免疫反応の間に形成される免疫複合体の検出を可能とする試薬、
を含むキット。 - 少なくとも1つのリファレンス組織または生物学的サンプルも含む、請求項10に記載のキット。
- 潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをin vitroで検出し区別する、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定する方法であって、
a)前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;
b)独立した方法で、前記生物学的サンプルを、天然型HBHAおよびESAT-6と、IFN-γの分泌が可能となる条件下で接触させること;
c)HBHAに特異的なIFN-γ分泌およびESAT-6に特異的なIFN-γ分泌を測定すること;ならびに、
d)HBHAに特異的なIFN-γ分泌とESAT-6に特異的なIFN-γ分泌との比率を計算すること、
を含み、潜在性の結核を示す哺乳類で得られた比率が、活動性の結核を示す哺乳類で得られた比率、またはM. tuberculosisに感染していない哺乳類で得られた比率よりも高い方法。 - 潜在性の結核を示す哺乳類またはM. tuberculosisに感染していない哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、1より大きい、請求項12に記載の方法。
- 潜在性の結核を示す哺乳類またはM. tuberculosisに感染していない哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、100から400の範囲である、請求項12に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、1未満である、請求項12に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、0.5未満である、請求項12に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、気管支吸引物、肺胞洗浄液(BAL)、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液ならびに他の身体の液体などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿または血液サンプル、ならびに膿吸引物からなる群から選択される、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程b)が、天然型HBHAおよびESAT-6を、独立した方法でPBMCと接触させることを含む、請求項12から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程b)の前に、生物学的サンプルを培養するという補足的な工程を含む、請求項12から18のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別する、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定するキットであって、
・天然型HBHAおよびESAT-6;
・独立した方法で、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、天然型HBHAおよびESAT-6との接触を行うための媒体を構成する試薬;ならびに、
・接触後のIFN-γ分泌を検出するための試薬、
を含むキット。 - 少なくとも1つのリファレンス組織または生物学的サンプルも含む、請求項20に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルのための培養培地も含む、請求項20または21に記載のキット。
- 活動性の結核を示す哺乳類と、M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とをin vitroで検出し区別する方法であって、
a)前記哺乳類の局所的な感染部位から生物学的サンプルを得ること;
b)前記生物学的サンプルを、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと、求めるIFN-γに対する効果が可能となる条件下で接触させること;
c)HBHAに特異的なIFN-γの分泌に対する前記接触の効果を測定すること、
を含み、HBHAに特異的なIFN-γの効果が、活動性の結核を示す哺乳類では、M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類よりも高い方法。 - 前記工程c)が、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと前記生物学的サンプルとの接触後における、分泌したIFN-γの量を測定することからなる、請求項23に記載の方法。
- HBHAに特異的なIFN-γの分泌量が、M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類で得られる量と比較して、活動性の結核を示す哺乳類では多い、請求項24に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFN-γの前記量が、1000pg/mlより多い、請求項25に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFN-γの前記量が、5000pg/mlより多い、請求項25に記載の方法。
- M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFN-γの前記量が、1000pg/ml未満である、請求項25に記載の方法。
- M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFN-γの前記量が、100pg/ml未満である、請求項25に記載の方法。
- 前記工程c)が、リンパ球群またはリンパ球亜群における、細胞をHBHAと接触させた後での細胞質内IFN-γを含む、前記生物学的サンプル中の細胞の割合を計算することからなる、請求項23に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類における細胞の前記割合が、M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類で得られた細胞の割合よりも大きい、請求項30に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の前記割合が、0.3%よりも大きい、請求項30に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の前記割合が、0.5%よりも大きい、請求項30に記載の方法。
- M. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の前記割合が、0.3%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記工程b)の前に、生物学的サンプルを培養するという補足的な工程を含む、請求項23から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、気管支吸引物、肺胞洗浄液(BAL)、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿サンプル、ならびに膿吸引物からなる群から選択される、請求項23から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、CD3+CD4+Tリンパ球である、請求項23から36のいずれか一項に記載の方法。
- 活動性の結核を示す哺乳類とM. tuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、
・天然型HBHAまたは組み換え型HBHA;
・前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、HBHAとの接触を行うのに適した媒体を構成する試薬;
・接触後のIFN-γを検出する試薬、
を含むキット - 少なくとも1つのリファレンス組織または生物学的サンプルも含む、請求項38に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルのための培養培地も含む、請求項38または39に記載のキット。
- 前記検出試薬が、IFN-γ分泌を定量することができる、請求項38から40のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出試薬が、細胞質内IFN-γを定量することができる、請求項38から41のいずれか一項に記載のキット。
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