JP2008504358A - 造血成長因子での神経学的障害の治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの造血増殖因子を投与することによって、哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法に関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、係属している、２００３年１２月３１日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ０３／００６４４６の一部継続出願であって、放棄されている、２００２年１２月３１日に出願された米国出願第１０／３３１，７５５号の継続出願である、係属している、２００３年９月１１日に出願された米国出願第１０／６５９，２９５号の一部継続出願でもある。

発明の背景
発明の分野
本発明は、少なくとも１つの造血成長因子を投与することによって、哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法に関する。
関連技術の議論
成長因子は、発生するニューロン細胞の生存、増殖、成熟および外植を調節するのに実質的に関与する蛋白質である。例えば、非常に多数の成長因子の発現は、種々の脳傷害に応答して増加する。多くの因子は内因性神経保護および神経向性効果を呈する（Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１；１０６：２７−４１：Ｌａｒｓｓｏｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９９；１９：１２２０−８；Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １９９４；１１：３−３３；Ｓｅｍｋｏｖａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １９９９；３０：１７６−８８参照）。これらの効果は、脳外傷および発作後におけるイン・ビトロおよびイン・ビボでの内因性投与後にも報告されている（Ｓｅｍｋｏｖａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９９９；３０：１７６−８８；Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１９９５；１５：９５３−９；Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３；Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２０００；３１：２２１２−７参照）。高親和性膜受容体への結合の後、成長因子の効果は細胞内シグナル変換事象のカスケードによって媒介され（Ｋｅｒｎｉｅ Ｓｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２０００；５７：６５４−７）、これは、細胞を誘導して成長させ、分化させ；あるいは細胞生存に対して親和性支持体を供する。

腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキンと共に、２０ｋＤａ蛋白質である顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、成長因子のサイトカインファミリーのメンバーである。ＧＣＳＦは、神経向性顆粒球の生産に関与する主な成長因子である。

ＧＣＳＦは、クラスＩサイトカイン受容体ともいわれる、ヘマトポエチン受容体のスーパーファミリーに属する膜受容体（ＧＣＳＦ受容体）の活性化を介して、その機能を発揮する（ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｔｏｕｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９６，３，１８０−４）。

リンホカイン、造血成長因子および成長ホルモン−関連分子に対する多数の受容体が、共通する結合ドメインを有することが判明している。これらの受容体は、ヘマトポエチン受容体と言われ、対応するリガンドはヘマトポエチン（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ）といわれる。さらに、ヘマトポエチンは２つの主な構造的群：大／長および小／短ヘマトポエチンに分けられている。大きなヘマトポエチンについての受容体複合体の一部である個々の受容体鎖の１つのサブセットは、それらの細胞外部分において共通する構造的エレメ
ント：免疫グロブリン−様ドメイン、ヘマトポエチン−受容体ドメイン、および３つのフィブロネクチンタイプ−ＩＩＩドメイン（レクチン受容体においては２つ）を含有する。このサブグループは「受容体のｇｐ１３０ファミリー」と命名され（Ｍｏｓｌｅｙ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，３２６３５−４３）およびレクチン受容体（ＬＰＴＲ）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）、インターロイキン−６／−１１／ＬＩＦ／ＯＳＭ／ＣＮＴＦ共通ベータ鎖（ＧＰ１３０）、白血病阻害因子受容体（ＬＩＦＲ）、オンコスタチン−Ｍ受容体ベータ鎖（ＯＳＭＲ）、インターロイキン−１２受容体ベータ−１鎖（ＩＬ１２ＲＢ１）、インターロイキン−１２受容体ベータ−２鎖（ＩＬ１２ＲＢ２）を含む。これらの受容体鎖は、同族体サイトカインへの結合に際して、ホモ二量体化し（ＧＣＳＦＲ、ＧＰ１３０、ＬＰＴＲ）またはヘテロ二量体化する（ＬＩＦＲまたはＯＳＭＲとＧＰ１３０、ＩＬ１２ＲＢ１とＩＬ１２ＲＢ２）。加えて、プロ部位コンセンサスパターンはこの受容体ファミリーに特徴的である。これは：
Ｎ−ｘ（４）−Ｓ−ｘ（２８，３５）−［ＬＶＩＭ］−ｘ−Ｗ−ｘ（０，３）−Ｐ−ｘ（５，９）−［ＹＦ］−ｘ（１，２）−［ＶＩＬＭ］−ｘ−Ｗ（配列番号：１）である。

ＧＣＳＦは、特異的なＧＣＳＦ受容体（ＧＣＳＦＲ）への結合を介して好中性顆粒球系に委ねられた細胞の増殖、生存、および成熟を刺激する（Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８；５：２２１−５参照）。ＧＣＳＦＲ媒介シグナリングは、核に移動し、転写を調節するシグナルトランデューサおよび転写のアクチベータ（ＳＴＡＴ）蛋白質のファミリーを活性化させる（Ｄａｒｎｅｌｌ ＪＥ Ｊｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７７：１６３０−５）。ＧＣＳＦは、典型的には、ヒトにおける種々の種類の好中球減少症の治療で用いられる。それは、臨床的使用で認可された少数の成長因子の１つである。特に、それは、化学療法（ＣＴ）−誘導細胞減少症を低下させるのに用いられる（Ｖｉｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，２００２：２４−３６）。ＧＣＳＦは、潜在的補助剤として感染症での治療用途にも関連付けされている（Ｈｕｅｂｅｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ． ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｖｏｌ．１８５：１４９０−５０１，２００２）。ＧＣＳＦは、報告されているところによると、ある程度結晶化し（ＥＰ ３４４ ７９６）、ＧＣＳＦの全体的構造は推定されているが、概略レベルに過ぎない（Ｂａｚａｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９０）；Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：１０７−１１０（１９８８））。

近年、ｂＦＧＦのような多数の成長因子、および血小板接着ブロッカー様抗−ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａおよびアブシジマブのような医薬的に有望な物質が臨床試験において神経保護効果についてテストされている。あいにく、これらのいずれも首尾よく神経保護効果を供しない。特に、ＮＭＤＡアンタゴニスト、フリーラジカルスカベンジャーおよびグルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）アンタゴニストは失敗したか、または酷い副作用を示した。抗−ＩＣＡＭのような物質、あるいは増大しなかったグルタメート媒体ＮＯ−シンテターゼの阻害剤のリスト（Ｄｅ Ｋｅｙｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２２，５３５−４０）。

大脳虚血症についてのほとんどの研究、およびイン・ビボの薬理学的物質のテストは、薬物の直後の効果または調査中の範例（すなわち、発作の誘導から２４時間後における梗塞のサイズ）に関連付けたに過ぎなかった。しかしながら、特定の物質の真の効果のより有効なパラメータは機能的回復に対する長期効果であり、これはヒト発作の研究においても反映されており、ここに、臨床的スケール（例えば、スカンジナビア発作スケール、ＮＩＨスケール、Ｂａｒｔｈｅｌ指標）もまた毎日の生活活動を行う能力を反映する。病巣病変から最初の数日後における回復は、浮腫の分解能または虚血性周辺部の再灌流による
ものであろう。急性相後における機能的回復の多くは、脳の可塑性によるようであり、脳の隣接する皮質領域が損傷された領域によって以前行われた機能を受け継ぐ（Ｃｈｅｎ Ｒ．Ｃｏｈｅｎ ＩＬ，Ｈａｌｌｅｔｔ Ｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１１１（４）：７６１−７３）。再組織化を説明するために提唱された２つの主なメカニズムは、以前存在したが機能的に不活性な連結のマスク解除、および対側急速成長のような新しい連結の成長である（Ｃｈｅｎ Ｒ．Ｃｏｈｅｎ ＬＧ，Ｈａｌｌｅｔｔ Ｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１１１（４）：７６１−７３）。短期間可塑的変化は、低下したＧＡＢＡ作動性阻害によるらしい興奮性シナプスへの阻害を取り除くことによって媒介される（Ｋａａｓ ＪＨ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１：１４：１３７−６７；Ｊｏｎｅｓ ＥＧ．Ｃｅｒｅｂ． Ｃｏｒｔｅｘ．１９９３ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；３（５）：３６１−７２）。長期にわたって起こる可塑性変化は、ＮＭＤＡ受容体活性化および増加した細胞内カルシウム濃度を必要とする長期増強（ＬＴＰ）のような潜在的シナプスのマスク解除に加えてメカニズムを含む（Ｈｅｓｓ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４ ７１（６）：２５４３−７）。長期変化は、シナプスの形状、数、サイズおよびタイプの変化を伴う軸索再生および急速成長にも関係する（Ｋａａｓ ＪＨ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１；１４：１３７−６７．，３：）。

発作は死亡の第３の主な原因、および西欧社会における障害の主な原因である。それは大きな社会経済的負担を表す。病因は（大部分の場合の）虚血または出血いずれかであり得る。虚血性発作の原因はしばしば閉塞性であるか、あるいは血栓性である。これまで、発作患者の大部分に関する効果的な治療はない。唯一の臨床的に証明された薬物は、これまで、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）およびアスピリンである。グルコースおよび酸素の結合による直後の梗塞コアにおけるかなりの細胞死滅の後、グルタメート興奮性傷害、アポトーシスメカニズム、およびフリーラジカルの発生のような二次的メカニズムのため、梗塞領域は数日間拡大する。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ロウ−ゲーリック病；シャルコット病）は、１００，０００集団当たり０．４ないし１．７６の年間発生率を持つ神経変性障害である（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ６^ｔｈ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ １０９０−１０９５）。それは、骨格筋の一般化された束形成、進行性萎縮および弱化、痙性および錐体路兆候、構音障害、嚥下困難および呼吸困難の典型的な発現を伴う運動ニューロン病の最も普通の形態である。病理学は、主として、脊髄および下方脳幹脳運動核の前角における神経細胞の喪失よりなるが、皮質における第１オーダーの運動ニューロンも含むことができる。家族性症例におけるスーパーオキシド−ジスムターゼ（ＳＯＤ１）突然変異体の役割はかなり十分に調べられており、これは酸化的ストレス仮説を導くが、この破壊的な病気の病因は依然としてほとんど知られていない。これまで、ＳＯＤ１蛋白質における９０を超える突然変異が記載されており、これはＡＬＳを引き起こしかねない（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｉｎ（２００２）， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，８０６−１９）。また、この病気における神経フィラメントについての役割が示された。過剰なグルタメート刺激によって惹起されるメカニズムである興奮性傷害性もまた、ヒト患者におけるリルゾールの有益な役割によって例示される重要な因子である。ＳＤＯ１突然変異体に最も確実に示されるように、カスパーゼおよびアポトーシスの活性化はＡＬＳにおける共通の最終経路のように見える（Ｉｓｈｉｇａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８２，５７６−８４，Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．（２０００）， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。従って、ＡＬＳも、他の神経変性病および発作でやはり作動する同一の一般的病因パターン、例えば、グルタメート関与、酸化的ストレスおよびプログラムされた細胞死滅に入るようである。

パーキンソン病は最も頻繁な運動障害であり、北米においてほぼ１００万人の患者がおり；６５歳の年齢を超える集団の約１％が罹っている。該病気の中核的兆候は硬直、震顫および運動不能である（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ６^ｔｈ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ １０９０−１０９５）。パーキンソン病の病因は知られていない。それにも拘らず、ヒト脳オートプシー研究からの、および動物モデルからの生化学的データのかなりの部分が、ドーパミン作動性神経変性を開始し得る黒質における酸化的ストレスの継続プロセスを指摘している。ニューロトキシンである６−ヒドロキシドーパミンおよびＭＰＴＰ（Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）によって誘導される酸化的ストレスが動物モデルで用いられて、神経変性のプロセスを調べてきた。兆候的療法が存在するが（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ＋デカルボキシラーゼ阻害剤；ブロモクリプチン、ドーパミンアゴニストとしてのペルゴリド；およびトリヘキシフェニジル（アルタン）のような抗−コリン作動性剤）、現実に病気の進行を停止させる原因的療法、例えば、神経保護療法に対する明瞭な要望が存在する。これらの動物モデルを用いて、ラジカルスカベンジャー、鉄キレーター、ドーパミンアゴニスト、窒素酸化物シンターゼ阻害剤およびある種のカルシウムチャネルアンタゴニストの効果をテストしてきた。アポトーシスメカニズムは動物モデルにおいて、および患者において明らかに操作的である（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１０９１８−２３，Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，６００−６，Ｖｉｓｗａｎａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２１，９５１９−２８，Ｈａｒｔｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８，３０８−１０）。酸化的ストレスおよびアポトーシスの関与に関するこの病理生理学もまたパーキンソン病を他の神経変性病および発作の中に置く。

大脳虚血症は、大脳血流（ＣＢＦ）を損ない、酸素およびグルコースの枯渇に導く種々の原因に由来し得る。他方、外傷脳負傷（ＴＢＩ）は、通常頭蓋骨折を引き起こし、血管および脳組織の剪断および引裂でもって脳実質を突然破壊する一次的機械的インパクトを含む。これは、今度は、二次的負傷に導く分子および細胞応答の活性化によって特徴付けされる事象のカスケードをトリガーする。そのような二次的損傷の発生は、多くの生化学的経路が関与する能動的プロセスである（Ｌｅｋｅｒ ａｎｄ Ｓｈｏｈａｍｉ（２００２）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３９，５５−７３）。境界領域虚血症ゾーンにおける、および二次的外傷後負傷に暴露された領域における二次的細胞死滅に有害な経路の間の多くの同様性が同定されている（例えば、過剰グルタメート放出による興奮性傷害性、酸化窒素、活性酸素種、炎症、およびアポトーシス（Ｌｅｋｅｒ ａｎｄ Ｓｈｏｈａｍｉ（２００２）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３９，５５−７３）。加えて、初期虚血症エピソードは外傷脳負傷後に起こることが報告されており、虚血症のコンポーネントを一次的機械的損傷に加える。

心血管病は、西欧産業化国家における死亡の主な原因である。合衆国においては、毎年ほぼ１００万人の死亡があり、その５０％近くが突然であり、病院外で起こっている（Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０４， ２１５８−６３）。心臓−肺蘇生（ＣＰＲ）が毎年１００，０００の住居者のうち４０ないし９０人で試みられ、自然的循環（ＲＯＳＣ）の回復はこれらの患者の２５ないし５０％で達成される。しかしながら、成功したＲＯＳＣ後の退院率は２ないし１０％に過ぎない（Ｂｏｔｔｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｈｅａｒｔ，８２，６７４−９）。従って、合衆国における毎年の心臓停止犠牲者のほとんど大部分は成功し治療されていない。成功したＣＰＲ後の低い生存率についての、すなわち、停止後入院死亡率についての主な理由は、執拗な脳損傷である。心臓循環停止後における脳損傷は、低酸素ストレスに対する短期間の許容性および特異的な再灌流障害双方に関連する（Ｓａｆａｒ（１９８６），
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ７４，ＩＶ１３８−５３，Ｈｏｓｓｍａｎｎ（１９９３）
， Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ，２６，２２５−３５）。まず、より多数の患者は心臓循環停止後に血流力学的に安定させることができ；しかしながら、それらの多くは中枢神経系負傷のため死亡する。心臓停止後の脳損傷の個人的、社会的および経済的結果は破壊的である。従って、心臓停止および蘇生（「全身虚血症および再灌流」）研究における最も重要な論点の１つは大脳蘇生および停止後の大脳損傷である（Ｓａｆａｒ（１９８６）， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７４，ＩＶ１３８−５３，Ｓａｆａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅｍ ｅｄ，３０，ｐ．１４０−４）。現在、いずれの停止後療法尺度による心臓停止の間における低酸素症によって引き起こされるニューロンに対する一次的損傷を減少させるのは可能でない。主な病理生理学的論点は低酸素症および引き続いての壊死、フリーラジカル形成および細胞カルシウム流入を伴う再灌流負傷、興奮性アミノ酸の放出、大脳微小循環再灌流障害、およびプログラムされたニューロン死滅またはアポトーシスである（Ｓａｆａｒ（１９８６）， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７４，ＩＶ１３８−５３，Ｓａｆａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅｍ Ｍｅｄ，３０，１４０−４）。

いくつかの臨床試験は、心臓停止後の神経学的結果を改良することを試みたが成功していない。（神経保護を増強させるための）バルビツレートの治療的使用、または（虚血症再灌流損傷を低下させるための）カルシウムチャネルブロッカーの使用がテストされた（Ｇｒｏｕｐ（１９８６）， Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．，４，７２−８６，Ｇｒｏｕｐ（１９８６）， Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１４，３９７−４０３，Ｇｒｏｕｐ（１９９１）， Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｌｉｎ．Ｔｒｉａｌｓ，１２，５２５−４５，Ｇｒｏｕｐ（１９９１）， Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４，１２２５−３１）。今日（大規模無作為コントロール臨床試験の結果の中等度低体温および血栓溶解を可能な例外として（Ｓａｆａｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，３０，１４０−４））、臨床的状況における心臓循環停止後の神経学的結果を改善するのに、具体的停止後治療オプションは利用できない。従って、心臓停止後の神経学的結果を改良するための革新的療法は非常に重要である。

多発性硬化症は、中枢神経系のプロトタイプの炎症性自己免疫障害および、４００分の１の生命の危険性がある、潜在的に、若い成人における神経学的不能の最も共通の原因である。世界的には、この病気に罹っている約２００万ないし５００万の患者がいる（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ（２００２）， Ｌａｎｃｅｔ，３５９，１２２１−３１）。全ての複雑な特徴に関しては、該障害は、未だ同定されていない環境因子および罹患性遺伝子の間の相互作用に由来する。考え併わせると、これらの因子は、免疫系の係わり合い、軸索および神経膠の急性炎症性負傷、機能および構造的修復の回復、炎症後神経膠症、および神経変性を含めた事象のカスケードをトリガーする。これらのプロセスの順次の関与が、回復でのエピソード、執拗な欠陥を残すエピソード、および二次的進行によって特徴付けられる臨床的コースの基礎となる。治療の目的は頻度を低下し、および再発の継続効果を制限し、兆候を軽減し、病気進行から生起する障害を防止し、および組織の修復を促進することである。

鬱病は、悲しみ、活動における興味の喪失、および減少したエネルギーによって特徴付けられる普通の精神的障害である。鬱病はその重症度の程度、兆候、および障害の持続によって正常な気分の変化から区別される。自殺は鬱病の共通したおよびしばしば回避できない結果の１つのままである。もし鬱病エピソードが過剰な高揚状態または刺激が交互に起こるならば、それらは二極障害として知られている。鬱病傷害および精神分裂症は全ての自殺の６０％の原因である。鬱病の原因は変化し得る。逆境の生活条件のような心理社会学的因子は鬱病エピソードの開始および執拗性に影響し得る。遺伝的および生物学的因子もまた一部を演じることができる。

見積もって１億２１００万の人々が現在鬱病に罹っている。鬱病は、２０００年における、ＹＬＤ（障害を持って生きた年数）によって測定した障害の主な原因であって、病気の全体的負担に対する４番目に主な寄与体である（ＤＡＬＹ＝障害調整生活年数；未成熟死亡率により失われた潜在的生命の年数および障害により失われた生産的生活の年数の合計）。見積もって男性の５．８％及び女性の９．５％はいずれかの与えられた年において鬱病エピソードを経験するであろう。２０２０年までに、鬱病は、全ての年齢（両性）について計算されたＤＡＬＹのランキングの第２の位置に到達すると推定されている。先進地域においては、従って、鬱病は病気の負担の最高ランキングの原因となろう。

今日、鬱病を持つほとんどの人々での最も重要な治療は、抗鬱剤の投薬、心理療法またはその組合せよりなる。抗鬱剤は、主な鬱病エピソードの重症度の全範囲にわたって効果的である。現在、効果的な抗鬱剤療法は、セロトニン作動性神経伝達の変調または微調整に密接に関連する。脳中のセロトニンのレベルを増大させる薬物は（フルオキセチン、プロザック（登録商標）またはフルクチン（登録商標）のような）最も優れた公知の抗鬱剤である。患者において抗鬱効果を有する治療は、例えば、リチウム、電気−痙攣療法および身体的運動のような薬理学的抗鬱剤である。他の介入は、害を被りやすい個人、家族およびグループに対する支持的ネットワークシステムを設定することを含む。鬱病の予防に関する証拠はより決定的でなく、少数の取り出された研究のみが、鬱病の予防で提案された介入が効果的であることを示す。現存の薬物は病気の兆候を軽減することを願ったものであるが、この病気に対して原因となる基本的な病理生理学的メカニズムに主として取り組むものではないことを銘記するのは重要である。従って、鬱病において新しく発見された原因的態様に具体的に取り組む新しい治療が必要とされる。

精神分裂症は最も普通の精神病の１つである。１００人の人々のうち約１人（人口の１％）が精神分裂症に罹っている。この障害は世界中に、かつ全ての人種および文化圏で見出される。平均して、男性は女性よりも早く精神分裂症を発症するように見えるが、精神分裂症は同等数の男性および女性に罹る。一般には、男性は、その２０代中頃に精神分裂症の最初の兆候を示し、女性はその２０代後半に最初の兆候を示す。精神分裂症は社会に莫大なコストを負担させ、合衆国において１年当たり３２５億ドルと見積もられる。精神分裂症は以下の兆候：妄想、幻覚、秩序のない思考および発言、否定的兆候（社会からの逃避、情動および表現の不存在、低下したエネルギー、動機および活動）、緊張病によって特徴付けられる。精神分裂症についての主な療法は、クロルプロマジン、ハロペリドール、オランザピン、クロザピン、チオリダジンその他のような神経弛緩薬に基づいている。しかしながら、神経弛緩治療は、しばしば、精神分裂症の兆候の全てを低下させない。さらに、抗精神病治療は晩発性運動障害のような酷い副作用を有しかねない。強い遺伝的影響があるように見えるが、精神分裂症の病因は明らかではない。最近、精神分裂症が神経変性病の少なくともいくつかの態様を有することが明らかとなった。特に、ＭＲ研究は、精神分裂症患者における迅速な皮質灰色物質の喪失を明らかとした（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，１１６５０−５；Ｃａｎｎｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９，３２２８−３３）。従って、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦあるいは他の造血因子のような神経保護投薬での精神分裂症の治療は是認されている。

ヒトにおいては、認識能力を増大させ、かつ知性を高める方法に対する要求が存在する。近代の理解における「知性」は純粋に論理的または語義的能力に制限されるものではない。例えば、Ｈｏｗａｒｄ Ｇａｒｄｎｅｒによる複数知性の理論は、進化的および人類学的予見から知性を評価し、運動、音楽、芸術、および感情移入能力、ならびに知性により通常に関連し、かつＩＱテストによって測定される言語的／論理学的能力を含むより広い見解を生じる。知性のこのより広い意味は創造性の領域までも拡大される。加えて、通常、約４０歳で開始し、アルツハイマー病の初期兆候とは異なる、ＡＲＭＬ（年齢−関連
記憶喪失）またはＭＣＩ（軽い認識障害）またはＡＲＣＤ（年齢−関連認識減衰）としてヒトで知られた非−病理学的疾患がある。

一日につき１００，０００ニューロンのように多いと見積もられた成人期を通じての神経細胞の生理学的喪失がある。成人期を通じて、脳の重量および容量の暫時の低下がある。この減衰は１０年当たり約２％である。従前に抱かれた確信とは反対に、該減衰は５０歳後に加速されず、初期成人期からほぼ同一のペースで継続する。この累積的効果は、一般には、より老齢まで認識されない。

脳はサイズが縮小するが、それは均一には縮小しない。ある種の構造はより収縮する傾向にある。例えば、記憶に関与する２つの構造である海馬および前頭葉はしばしばより小さくなる。これは、部分的には、ニューロンの喪失によるものであり、部分的には、いくつかのニューロンの萎縮によるものである。多くの他の脳構造はサイズの喪失を被らない。精神的処理の遅延は、ニューロンの劣化によって引き起こされる可能性があり、ニューロンが喪失され、収縮し、または連結を失うかを問わない。十分に機能しているニューロンのこの枯渇はニューロンのさらなるネットワークを動員して、さもなければ単純または自動的となるであろう精神的仕事を管理することを必要とする。かくして、該プロセスは、ゆっくりとなる。

前頭葉前部皮質と呼ばれる前頭葉の部分は、思考および行動をモニターし、それを制御することに関与する。この脳領域で起こる萎縮は多くのより老齢の成人が経験する言語を見出す困難性を説明し得る。それは、車の鍵をどこに置いたかを忘れること、または一般的うわの空も説明し得る。前頭葉および海馬双方の収縮は、記憶困難性の原因であると考えられている。従って、個人の認識能力を改善し、または増強する必要性も存在する。

過去において、神経保護療法は、パーキンソンおよびアルツハイマー病のような神経変性障害において、および虚血症発作においてほとんどが調べられてきた。しかしながら、より最近では、神経保護は多発性硬化症（ＭＳ）療法に対する重要な目標として示されてきた。神経保護の範囲を広げるための基礎は、ニューロンおよび軸索負傷がＭＳ病巣の鍵となる特徴である証拠である。軸索喪失は進行性ＭＳにおける執拗な神経学的欠陥を最も決定するようである。最近の研究は、軸索損傷が、病気において初期に、および病変の発生の間に起こることを指摘した。軸索変性の２つの異なる相が特徴付けられており、最初の相は活動的なミエリンの破壊の間に起こり、第２の相は慢性的脱髄プラークにおけるものであり、そこでは、裸の軸索がさらなる損傷により罹るようである。しかしながら、変性および虚血症中枢神経系の負傷とは対照的に、ＭＳにおける神経変性は、炎症、恐らくは自己免疫のプロセスによって引き起こされるようである。従って、ＭＳにおける神経保護に対する挑戦は、変性および虚血症障害におけるよりも大きい。なぜならば、ＭＳは神経保護療法および効果的な免疫変調の組合せを必要とするからである。しかしながら、軸索変性の正確なメカニズムおよびエフェクター分子は未だ規定されておらず、軸索保護療法は未だ確立されていない（Ｂｒｕｃｋ ａｎｄ Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ（２００２）Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，２４ Ｓｕｐｐｌ ５，Ｓ２６５−７）（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ（２００３），Ｉｎｔ Ｍｓ Ｊ，１０，１０３−５）。

神経変性障害の１つのグループは、トリヌクレオチドの拡大によって特徴付けられる。それらの神経変性トリヌクレオチド反復障害は慢性的かつ進行性であって、運動、感覚または認識系におけるニューロンの選択的かつ対称的喪失によって特徴付けられる。兆候はしばしば運動失調、認知症または運動機能障害である。最高に知られたトリヌクレオチド反復障害はハンチントン病であり、他のものは脊髄および延髄筋肉萎縮（ケネディ病）、常染色体優性脊髄小脳運動失調：タイプ１のＳＣＡ１、タイプ２のＳＣＡ２、タイプ３（マシャド−ヨセフ病）のＳＣＡ３／ＭＪＤ、タイプ６のＳＣＡ６、タイプ７のＳＣＡ７、
タイプ８のＳＣＡ８、フリードライヒの運動失調および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ＤＲＰＬＡ／ホー−リバー症候群である（Ｈａｒｂｙ ａｎｄ Ｇｗｉｎｎ−Ｈａｒｂｙ（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１０７５−９）（Ｍａｒｔｉｎ（１９９９），Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４０，１９７０−８０）（Ｓｃｈｏｌｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４２，９２４−３２）。

ハンチントン病（ＨＤ）は常染色体優性の遺伝される神経精神病学的病気であり、これは、進行性運動、認識および挙動兆候を生起する。ハンチントン病の進行は手足、胴および顔の反射的な制御されない運動（舞踏病）；精神的能力の進行的喪失；および精神病学的問題の発生によって特徴付けられる。ハンチントン病は１０ないし２５年間にわたって緩解なくして進行し、通常、中年（３０ないし５０歳）で出現する（Ｗｅｓｔｐｈａｌ変種または無動−硬直ＨＤとも呼ばれる）若年ＨＤは２０歳前に発症し、迅速に進行し、筋肉硬直を生じ、そこでは患者は全くできないにせよ、ほとんど動けない（無動症）。１０，０００人当たり１人−合衆国においてはおよそ３０，０００人がハンチントン病を有すると見積もられている。若年ハンチントン病は全ての症例のうちほぼ１６％で起こる。その核心となる病理は脳幹神経節、特に、尾状核および被殻の変性を含み、染色体４上の単一常染色体遺伝子ＩＴ−１５における、グルタミンをコードする、蛋白質フンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）の突然変異した形態をコードする、トリヌクレオチドＣＡＧの不安定な拡大によって引き起こされる。どのようにして遺伝子ＩＴ−１５の突然変異が該蛋白質の機能を変化させるかはよく理解されていない。

ハンチントン病の治療は、兆候を低下させ、合併症を予防し、および患者に指示および援助を供することに焦点を当てている。舞踏病の治療に対して今日入手可能な物質がある。ジストニアのような他の神経学的兆候は治療できるが、治療は有害な事象の高い危険性に関連している。他方、精神病学的兆候を治療に適用することができ、これらの兆候の軽減は生活の質において有意な改善を供することができる（Ｂｏｎｅｌｌｉ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ（２００４）， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，５，７６７−７６）。ＨＤの兆候を治療するのに用いられるほとんどの薬物は、疲労、落ち着きのなさ、または過剰興奮のような副作用を有する。シスタミン（＝デカルボキシシスチン）は、ハンチントン病（ＨＤ）についての遺伝子突然変異で、マウスにおいて、震顫を軽減し、生命を延ばす。該薬物は、変性から神経細胞またはニューロンを保護する蛋白質の活性を増大させることによって働くようである。該研究は、同様の治療がある日には、ＨＤおよび関連障害を持つ患者で有用であろうことを示唆している（Ｋａｒｐｕｊ，ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｎａｔ Ｍｅｄ，８，１４３−９）。

緑内障は、合衆国における予防可能な失明の第１の原因である。緑内障は、視覚の神経（視覚神経）が、通常、増大した眼圧の結果として損傷された疾患の群であるが、緑内障は正常なまたは正常よりも低い眼圧でさえ起こり得る。視覚神経頭部（ＯＮＨ）の篩板（ＬＣ）領域は、緑内障眼神経障害における負傷の主な部位である。それは永久的な視覚の斑点状の喪失であるが、該疾患の進行は、もしそれが十分初期に検出され、治療が開始されるならば最小化することができる。しかしながら、もし治療されないまま放置されれば、緑内障は結局は失明に至り得る。老齢の人々の中で、緑内障が最も普通の眼障害の１つである。世界的には、約６６８０万の人々が緑内障からの視覚障害を有すると見積もられており、６７０万人が失明している。

種々の異なるタイプの緑内障がある。最も普通の形態は原発性開放隅角緑内障；正常眼圧緑内障；原発閉塞隅角緑内障；急性緑内障；色素緑内障；剥離症候群；または外傷−関連緑内障である。

緑内障は点眼剤、丸剤、レーザー外科処置、眼手術、またはそれらの方法の組合せで治
療することができる。治療の全目的は視覚のさらなる喪失を防止することである。緑内障による視覚の喪失は不可逆的であるので緊急なものである。ＩＯＰを制御下に維持することは、緑内障から視覚の喪失を予防するための鍵である。

末梢神経障害は、神経系の原発性病変または機能障害によって開始され、または引き起こされる疼痛である。多くの分類システムが存在するが、典型的には、それを中枢（すなわち、視床、発作後疼痛）、および末梢求心路遮断疼痛（すなわち、大腿痛感覚異常）に分けられる。神経障害は丁度１つの神経（単神経病理）またはいくつかの神経（多神経病理）に影響し得る。それらは異痛症、痛覚過敏、および異感覚症である。普通の兆候はやけど、刺傷、電気ショックまたは深部疼痛感覚である。神経痛の原因は糖尿病性神経障害、三叉神経神経痛、複合領域疼痛症候群および疱疹後神経痛、尿毒症、ＡＩＤＳ、栄養欠乏を含む。他の原因は圧縮または捕獲、直接的外傷、貫通負傷、挫傷、骨折または脱臼した骨のような機械的圧力；クラッチの延長された使用または１つの位置に余りにも長く留まることから、または震顫から由来し得る上神経（尺骨、ぎょう骨、または腓骨）に関係する圧力；神経内出血；冷気または放射線、また稀にはある種の医薬または毒性物質への暴露；アテローム性動脈硬化症、全身エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、慢性関節リウマチ、結節性多発性動脈炎を含む。捕獲神経障害の普通の例は、手根トンネル症候群であり、これはコンピュータの増大する使用によってより普通となった。末梢神経障害の原因は多様なものであるが、それは虚弱、痺れ感、感覚異常（火傷、くすぐり感、刺し感、またはきりきりとした痛み）および腕、手、脚、および／または足における疼痛を含めた通常の兆候を生じる。非常に多数の症例は原因が知られていない。

基本的な疾患の治療は、末梢神経障害のいくつかの症例を軽減し得る。他の場合においては、治療は疼痛を管理することに焦点を当てることができる。抹消神経障害についての療法は原因に応じて異なる。例えば、糖尿病によって引き起こされた末梢神経障害のための療法は、糖尿病の制御を含む。腫瘍または破壊されたディスクが原因である場合は、療法は腫瘍を除くための、または破壊されたディスクを修復するための外科的処置を含むことができる。捕獲または圧縮においては、神経障害治療は尺骨または中央神経の固定または外科的減圧よりなることができる。腓骨およびぎょう骨圧縮神経障害は圧力の回避を 必要とするであろう。物理的用法および／または減圧は、拘縮を予防するのに有用であろう。末梢神経はそれ自体を再生する顕著な能力を有し、神経成長因子または遺伝子治療を用いる新しい治療は、将来において回復のための良好なチャンスさえ提供することができる。

リソソーム貯蔵病は、各々が種々の組織における特異的なリソソーム酵素欠乏によって特徴付けられる約４０の異なる病気の群である。それらは合計して５，０００の出生中約１で起こり、かなりの臨床的および生化学的不均一性を呈する。大部分は常染色体劣性条件として遺伝されるが、２つ（ハンター病およびファブリー病）はＸ−連鎖している。それらはタイ−サシェ病、ガングリオシトージス、およびゴーシェおよびニーマン−ピック病を含み、それらは脂質貯蔵障害である。これらの病気のほとんどが脳に影響し、致命的である（Ｂｒｏｏｋｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９，６２１６−２１）。

これらの病気の兆候を治療するにおいてのみ限定された成功があった。１つの方法は、酵素を置き換えて、骨髄または幹細胞移植または遺伝子治療によって酵素を作ることができる身体へ正常な遺伝子を入れることである。骨髄移植（ＢＭＴ）はいくつかのＬＳＤにおいて成功しており、より酷くない兆候でもって長期生存を可能とした。酵素置換療法（ＥＲＴ）は、１０年間にわたって、ゴーシェ病を持つ患者で利用でき、莫大な利点を提供してきた。

脊髄負傷（ＳＣＩ）は、外傷事象の結果脊髄内の細胞に損傷が生じ、あるいは脊髄を上および下にシグナルをリレーする神経管を切断する場合に起こる。ＳＣＩの最も普通のタイプは挫傷（脊髄の挫傷）および（脊髄への圧力によって引き起こされる）圧縮を含む。他のタイプの負傷は裂傷（拳銃で撃たれた創傷によって引き起こされる損傷のようないくつかの神経線維の切断または引裂）、および中央皮質症候群（脊髄の頸部領域の脊髄皮質管に対する特異的損傷）を含む。酷いＳＣＩは、しばしば、麻痺（身体の随意運動および筋肉に対する制御の喪失）および負傷点の下方での感覚および反射機能の喪失を含み、呼吸のような自律的活動および腸および膀胱制御のような他の活動を含む。疼痛または刺激に対する感覚、筋肉麻痺、および性的機能障害のような他の兆候が経時的に発生し得る。ＳＣＩ患者は膀胱感染、肺感染、および床ずれのような二次的な医学的問題を発生する傾向もある。緊急ケアおよびリハビリにおける最近の進歩は多くのＳＣＩ患者が生存することを可能としたが、負傷の程度を低下させ、および機能を回復するための方法は依然として制限されている。急性ＳＣＩについての直後の治療は、脊髄圧迫を軽減し、メチルプレテドニゾロンのようなコルチコステロイドでの薬物療法を（負傷の８時間以内に）促進させて、細胞損傷を最小化するための技術および脊髄の脊椎を安定化させて、さらなる負傷を防止することを含む。ＳＣＩに関連する障害のタイプは負傷の重症度、負傷が起こった脊髄のセグメント、およびいずれの神経線維が損傷されたかに依存して大いに変化する。

前記に鑑みれば、神経系における可塑性の増強および機能的回復、または細胞死滅に関連する神経学的病気のような神経学的および／または精神病学的疾患の治療に対する要望が存在する。特に、ニューロン喪失から回復するように神経形成を誘導することに関する、または誘導するための神経細胞に対する神経保護を供することによって神経学的病気を治療することに対する要望が存在する。

発明の概要
従って、本発明の１つの目的は、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せのような造血因子、またはそれらの因子を分泌する細胞を哺乳動物に投与して、神経学的にまたは精神医学的疾患を治療することによって、該哺乳動物において該疾患を治療する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティックおよびその組合せのような造血因子で神経幹細胞組成物をコンディショニングし；引き続いて、該神経幹細胞を神経学的疾患の治療のために哺乳動物に投与することによって、該哺乳動物において該疾患を治療する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、ＧＭＣＳＦ受容体、ＧＣＳＦ受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体、またはこれらの組合せに作動して、神経学的疾患を治療することによって、哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティックおよび／またはその組合せをコードする１以上のポリヌクレオチドを、細胞に導入し、しかる後、該細胞を哺乳動物に移植し、それにより、該細胞がポリヌクレオチドの導入に先立っての細胞生存に比較して細胞の生存を増強するのに十分な量で造血因子を発現することによって、哺乳動物に移植された細胞の生存を増強する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティックおよび／またはその組合せを供して、造血因子を供するに先立って
の神経細胞培養に対する該培養の生存性を増強させることによって、神経細胞培養の生存性を増強させる方法を提供させることにある。そのような方法において、造血因子を用いて、培養の細胞を接触させることができるか、あるいは造血因子をコードし、発現するポリヌクレオチドを用いて供することができる。

本発明のもう１つの目的は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５、その組合せ、またはその融合蛋白質のような造血因子で、トリヌクレオチド反復傷害、末梢神経障害、リソソーム貯蔵病、パーキンソン病または緑内障のような神経学的疾患を治療する方法を提供することにある。

発明の詳細な記載
ヒトＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦに対する受容体はヘマトポエチン受容体スーパーファミリーのメンバーである。マルチ−サブユニット受容体は顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびＩＬ−５に対する受容体のような２つのサブユニットタイプよりなることができ、ここに、αサブユニットは各リガンドに対して特異的であって、βサブユニットは全ての３つのβ_ｃにつき共通であり、双方の鎖はシグナリングに参画する。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５受容体サブファミリーにおいて、興味を引く差が出現し始めており、これは造血細胞機能におけるこれらの受容体の役割についての示唆を有することができる。主な差は、β_ｃを持つＩＬ−３Ｒα、およびβ_ｃを持つＩＬ−５Ｒαの二量体化のためのＩＬ−３およびＩＬ−５についての絶対的要件に存し、他方、対照的に、ＧＭ−ＣＳＦＲの少なくともいくつかは、恐らくは、予め形成された複合体として存在する（Ｇｕｔｈｒｉｄｇｅ， ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｌｏｏｄ，１０３，８２０−７）。これは、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦが受容体−サブユニットを共有さえするが、それらはそれらの特異的機能において相違することを示す。

ＩＬ−３
インターロイキン３（ＩＬ−３）はよく知られた造血因子である。本明細書中に記載する本発明の方法で使用することができるＩＬ−３は、公知であって、入手可能なそれらの全長コーディング配列、蛋白質配列、ならびに種々の機能的変種、キメラ蛋白質、ムテインおよびミメティックである。コーディングＤＮＡおよび蛋白質の双方の構造が公知である。例えば、ＩＬ−３およびＩＬ−３蛋白質配列をコードするＤＮＡは配列番号：６８−８４の配列を含む。

ヒトＩＬ−３は１５ないし１７ｋＤａ（１３３アミノ酸）の蛋白質である。それは、１９アミノ酸の疎水性分泌シグナル配列を含有する前駆体として合成される。ＩＬ−３は位置１５および７０において２つの推定グリコシル化部位を含有し、単一のジスルフィド結合（Ｃｙｓ１６／８４）を含有する。細菌−由来組換えＩＬ−３の分析は、グリコシル化がＩＬ−３の活性に必要とされないことを示す。

ＩＬ−３は抗原およびマイトジェンによる細胞活性化に続いて主としてＴ−細胞によって、また、ケラチノサイト、ＮＫ−細胞、肥満細胞、内皮細胞、および単球によっても生産される。ＩＬ−３は、ヘパリン硫酸／プロテオグリカンとの複合体との形態にて細胞外マトリックスにも会合し得る。それは、かくして、生物学的に不活性な形態で貯蔵できるが、それは近傍分泌活性も発揮し得る。細胞外マトリックス貯蔵からの放出の基礎となる分子的メカニズムは未だ知られていない。

ＩＬ−３は、免疫系および造血系の間のリンクを確立する増殖因子である。それは、ほとんど全てのタイプの造血前駆細胞の増殖および発生を支持する。アカゲザルにおいては
、ＩＬ−３は全てのタイプの循環造血前駆細胞の拡大を引き起こす。ＩＬ−３は、初期非−系列に託された造血前駆細胞の、顆粒球、マクロファージ、赤血球系細胞、巨核細胞、および肥満細胞コロニーへの分化も支持する。ＩＬ−３は、骨髄培養における非−造血間質細胞のクローン増殖も刺激する。ＩＬ−３は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおける造血幹細胞のためのプライミング因子の１つであり、それは、該細胞をエリスロポチエン、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ６のような後期作用因子に対して応答性とする。ＩＬ−３はコロニー刺激因子に対する受容体の増大した発現も誘導する。

ＩＬ−３は細胞代謝、分化およびＤＮＡ／ＲＮＡ代謝に関与する酵素の生産も特異的に誘導する。とりわけ、ＩＬ−３は２０−α−ステロイドデヒドロゲナーゼの、およびヒスチジンおよびオルニチンでカルボキシラーゼの発現を誘導する。

もう１つの実施形態において、用いることができるＩＬ−３は、野生型全長ヒトＩＬ−３コーディング配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一性を持つポリヌクレオチド配列によってコードされるものであり、これらのポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、野生型全長ヒトＩＬ−３のコーディングポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能なより大きな程度までその標的配列にハイブリダイズする（例えば、少なくともバックグラウンドの２倍）条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０ないし８．３において約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であって、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０よりも大きなヌクレオチド）については少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、高ストリンジェンシー条件は３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０ないし６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ“，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｏｒ ２， Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）参照）。アミノ酸およびポリヌクレオチド同一性、相同性および／または同様性はＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）， Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎを用いて決定することができる。

種々のＩＬ−３機能的変種、ムテイン、およびミメティックの例は（例えば、野生型蛋白質に対して構造的かつ生物学的に同様であって、少なくとも１つの生物学的に同等なドメインを有する）機能的断片および変種、（例えば、ポリエチレングリコールおよびそのポリエチレングリコール誘導体、および／またはグリコシル化形態のようなさらなる化学的部位を含有する）ＩＬ−３の化学的誘導体およびＩＬ−３のペプチドミメティック（例えば、構造および／または機能においてペプチドを模倣する低分子量化合物（例えば、Ａｂｅｌｌ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ， Ｌｏｎｄｏｎ：ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｇａｎｔｅ， Ｐｅｐｔｉｄｍｉｍｅｔｉｃａ−ｍａｓｓｇｅｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔｅ Ｅｎｚｙｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｎ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０６：１７８０−１
８０２（１９９４）；およびＯｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９−３０４９（１９９３）参照）を含む。

ＩＬ−３の種々の機能的誘導体、変種、ムテイン／またはミメティックは好ましくは野生型哺乳動物ＩＬ−３活性の生物学的活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％および／または最も好ましくは少なくとも９０％を保有し−生物学的活性の量は２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％；およびその間の全て値およびサブ範囲を含む。さらに、ＩＬ−３の機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは野生型哺乳動物ＩＬ−３活性に対して１００％以上の生物学的活性を有することができ−生物学的活性の量は少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。

機能的変種の１つの例はヒト組換えインターロイキン−３（ＩＬ−３；ＳＤＺ ＩＬＥ−９６４；Ｓａｎｄｏｚ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）（Ｌｏｋｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６，１０６２４−３１）である。

ＩＬ−３の生物学的活性を測定するためには、いくつかの公知のアッセイを単独でまたは組み合わせて用いることができる。それらのＩＬ−３機能はその公知の免疫変調機能、および神経保護におけるその役割に関する１以上の機能を含む。ＩＬ−３はこの因子に応答する細胞系（例えば、細胞系：ＡＭＬ−１９３；３２Ｄ；Ｂ６ＳＵｔ−Ａ；Ｂ１３；Ｄａ；Ｅａ３．１７；ＦＤＣＰ１；ＧＦ−Ｄ８；ＩＣ−２；ＫＭＴ−２；Ｌ１３８．８Ａ；ＬｙＤ９；ＭＯ７Ｅ；ＮＦＳ−６０；ＰＴ−１８；ＴＡＬＬ−１０３；ＴＦ−１；ＴＭＤ２；ＵＴ−７）を使用するバイオアッセイで検出することができる。

これらおよび他のアッセイは（Ａｇｌｉｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｌｏｏｄ，８２，２０５４−６１）；（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２８，１２１−６）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ｂｌｏｏｄ， ７３， １８３６−４１）（Ｌｅｍｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２１，１６６８−７２）；（Ｗａｒｒｉｎｇａ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）， Ｂｌｏｏｄ，７７，２６９４−７００）に記載されている。

本発明の他の実施形態において、好ましくはその神経保護作用によってそれらの治療作用を支持するためのＩＬ−３と他の造血因子製剤との組合せを用いることができる。これらの組合せによって発揮される効果は累積的または超相加的／相乗的であり得る。１つの実施形態において、種々のＩＬ−３および／またはＩＬ−３誘導体を相互に組み合わせて用いる。同様に、ＩＬ−３を、最近強い神経保護特性を媒介することが示されている、エリスロポエチン、およびその誘導体のような１以上のさらなる造血増殖因子と組み合わせて用いることができる（例えば、Ｂｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１０５２６−１０５３１；Ｃｅｒａｍｉ ｅｔ
ａｌ（２００２）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １７：８−１２；Ｓｉｒｅｎ ＡＬ，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ（２００１）Ｅｕｒ Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５１：１７９−１８４）。加えて、ＩＬ−３は、例えば、（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦのような）種々のコロニー刺激因子、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＳＣＰＦ（幹細胞増殖因子）、種々のインターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２）、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１−α、ＴＮＦ−α、およびまた多くの他の低分子量因子と組み合わせて用いることができる。

１つの実施形態において、ＩＬ−３の生物学的活性はもう１つの造血因子への融合によって増強される。そのような融合蛋白質についての実施例はＩＬ−３／ＧＭＣＳＦ−融合蛋白質ＰＬＸＹ３２１、Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ（１９９４），Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ，１２，２５３−６１）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｂａｕｍ（１９９４，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ，１，２０３−９）（Ｂｕｅｓｃｈｅｒ，ＭｃＩｌｈｅｒａｎ，Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｇ（１９９３），Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２１，１４６７−７２）；またはプロメガポエチン；ＩＬ−３／トロンボポエチン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆａｒｅｓｅ，Ｓｍｉｔｈ，Ｇｉｒｉ，Ｓｉｅｇｅｌ，ＭｃＫｅａｒｎ ａｎｄ ＭａｃＶｉｔｔｉｅ（２００１），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，３２９−３８）である。増強された活性は前記したように生物学的活性アッセイで測定することができる。１つの実施形態において、ＩＬ−３を修飾し、または処方し、あるいは血液−脳関門を通過し、または脳組織に対するその分布係数をシフトさせるその能力を増加させるＩＬ−３ミメティックとして存在させる。そのような修飾の実施例はＰＴＤまたはＴＡＴ配列の付加である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１；Ｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）。これらの配列は突然変異形態で用いることもでき、蛋白質のアミノ−カルボキシ末端においてさらなるアミノ酸を加えることもできる。また、いずれかのＩＬ−３製剤の静脈内適用にブラジキニンまたは類似の物質を加えると、脳または脊髄へのその送達を支持するであろう（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０：１０５−１２３；Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。

ＩＬ−３およびＩＬ−３Ｒアルファは脳における広い発現を示す。そのｍＲＮＡはニューロンおよび神経膠星状細胞で検出され（Ｆａｒｒａｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｂｌｏｏｄ，７３，１３７−４０）、脳の区別される領域において、例えば、海馬ニューロンにおいて局所化されるが、神経膠細胞では局所化されない（Ｋｏｎｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，１８２，２７１−４）。ＩＬ−３ Ｒはマクロ神経膠細胞および稀突起神経膠細胞、および中隔コリン作動性ニューロンによって発現されることが示された。ＩＬ−３Ｒα−陽性細胞は、主として、中央中隔基底前脳領域に存在する。Ｔａｂｉｒａ ｅｔ ａｌ．は、インターロイキン３（ＩＬ−３）が中枢コリン作動性ニューロンに対して神経向性効果を有することを示し、および中隔コリン作動性ニューロンにおけるＩＬ−３受容体（ＩＬ−３Ｒ）ベータサブユニットの存在を示した。機能的ＩＬ−３受容体は中枢コリン作動性ニューロンで発現され、これらのニューロンの分化および維持のようないくつかの生理学的な役割に寄与する（Ｔａｂｉｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８４０，８０７−１６）。造血因子のいくつかのメンバーは、軸索切断された運動ニューロンの死滅に対して神経保護効果を有することが知られている。Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ−３およびＥＰＯが運動ニューロンの喪失を有意に妨げたことを示した。保護能力はそれらの間で同一である。これらの結果は、ＩＬ−３およびＥＰＯがイン・ビボにて運動ニューロン生存について役割を演じることを示唆し、および運動神経障害および筋萎縮性側索硬化症のような、運動ニューロンの変性および死滅に関する病気を治療するにおけるこれらの造血因子の潜在的使用を示唆する（Ｉｗａｓａｋｉ， ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｓ，２４，６４３−６）。

中枢神経系において、インターロイキン（ＩＬ）−３はイン・ビトロおよびイン・ビボにて中隔コリン作動性ニューロンに対してのみ向性作用を発揮することが示されているが、脳におけるＩＬ−３受容体（ＩＬ−３Ｒ）の広い分布は、リガンドのそのような選択的
な中枢的作用に適合しない。さらに、ＩＬ−３の神経向性作用の基礎となるメカニズムは解明されていない。Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ−３が、ニューロン生存を促進することが知られているＢｃｌ−ｘＬ蛋白質の受容体−媒介発現を通じての海馬ＣＡ１領域での遅延されたニューロン死滅を妨げることを示した。虚血症障害に応答してアップレギュレートされるにも拘らず、海馬ＣＡ１領域におけるＩＬ−３Ｒアルファは、虚血症に対して許容されるＣＡ３領域におけるよりもかなり弱く発現されるので、リガンドと相互作用するＩＬ−３Ｒの不足は、虚血症に対するＣＡ１ニューロンの脆弱性を説明することができる（Ｗｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８８，６３５−４９）。

Ｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，は、対照的に、小神経膠細胞を活性化することによる炎症応答におけるＩＬ−３の役割を示唆する。小神経膠細胞、脳の存在するマクロファージは、中枢神経系（ＣＮＳ）における免疫及び炎症応答を媒介する。小神経膠細胞の活性化、および炎症性サイトカインの分泌は、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、プリオン病、およびＡＩＤＳ認知症を含めたＣＮＳ病気の病因に関連する。ＩＬ−３は小神経膠細胞におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴおよびＭＡＰキナーゼ経路の活性化を誘導し、小神経膠細胞のＩＬ−３−誘導活性化に導く（Ｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｇｌｉａ，４５，１８８−９６）。かくして、神経系におけるＩＬ−３受容体およびリガンドの存在についての証拠がある。

ＩＬ−３については、それは培養中のラット皮質細胞に対して神経保護活性を有することが示されている。ＩＬ−３は、カンプトテシン処理初代皮質培養におけるカスパーゼ−３／７活性−アッセイで神経保護活性を有した（図４６ａ）。これは、ＩＬ−３がニューロン細胞における細胞死滅を低下させる能力を有することを示す。また、我々は、これらの細胞においてＩＬ−３がＡｋｔ−経路を誘導することを示し、これは、典型的には、抗―アポトーシス経路のＩＬ−３でのニューロン細胞の処理で活性化されることを示す（図４７）。

加えて、我々は、ＩＬ−３がヒト神経芽腫細胞に対して効果的であることを示すことができた。カンプトテシン処理ＳＨＳＹ５−Ｙ細胞は、ＩＬ−３を加えた場合に、低下したカスパーゼ３／７活性を示した（図４６ａ）。まとめると、結果は、ラットおよびヒト細胞培養におけるＩＬ−３の神経保護効果を示す。

ＩＬ−５
インターロイキン５（ＩＬ−５）はよく知られた造血因子である。本明細書中に記載する本発明の方法で使用することができるＩＬ−５は、公知であって入手可能である、全長コーディング配列、蛋白質配列ならびに種々の機能的変種、キメラ蛋白質、ムテインおよびミメティックである。コーディングＤＮＡおよび蛋白質双方の構造は知られている。例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−５蛋白質をコードするＤＮＡが配列番号：８５ないし９２の配列を含む。

ヒトＩＬ−５ ｃＤＮＡは１１５のアミノ酸の蛋白質をコードする。インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、Ｎ−グルコシル化ジスルフィド−連結された反平行ホモダイマーとしてリンパ球によって生産される。モノマー形態は生物学的に不活性である。天然蛋白質の可変分子質量は不均一なグリコシル化によって引き起こされる。非−グリコシル化ＩＬ−５もまた生物学的に活性である。ＩＬ−４およびＩＬ−５をコードする遺伝子は密接に連結しており、該蛋白質は共発現されるが、それらは無関係なプロモータの制御下にある。ＩＬ−５は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよび成長ホルモンを含めた構造的に関連するサイトカインのファミリーに属する。

最初は、異なる生化学的態様に基づいて多数のグループによって同定されたが、ＩＬ−５は、今日では、好酸球増加症において支配的なサイトカインであることが知られている。ＩＬ−５は、好酸球の成長および分化を担う特異的な造血成長因子である。ＩＬ−５は未成熟造血前駆細胞ＢＦＵ−Ｅの成長を促進し、他方、それは、その増殖がＩＬ−５によって阻害されるＣＦＵ−Ｅの分化を引き起こす。ＩＬ−５は好酸性顆粒球の増殖、細胞活性化、および分化を強く刺激する。

また、ＩＬ−５は胸腺細胞からの細胞傷害性Ｔ−細胞の発生を促進する。胸腺細胞においては、ＩＬ−５は高親和性ＩＬ−２受容体の発現を誘導する。

１つの実施形態において、全長ヒトＩＬ−５アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である蛋白質は、本発明で使用することができる。もう１つの実施形態において、野生型全長ヒトＩＬ−５コーディング配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ−５を用いることができ、これらのポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、野生型全長ヒトＩＬ−５のコーディングポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう。

用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーションな条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能により大きな程度まで（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０ないし８．３において約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であって、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大）では少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、高ストリンジェンシー条件は３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０ないし６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）参照）。アミノ酸およびポリヌクレオチドの同一性、相同性および／または同様性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）， Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎを用いて決定することができる。

ＩＬ−５の種々の機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは、好ましくは、野生型哺乳動物ＩＬ−５活性の生物学的活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％および／または最も好ましくは少なくとも９０％を保有し−生物学的活性の量は２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％；およびその間の全ての値およびサブ範囲を含む。さらに、ＩＬ−５の機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは野生型哺乳動物ＩＬ−５活性に対して１００％以上の生物学的活性を有することもでき−生物学的活性の量は少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。

本発明を実施するためには、ニューロンを保護するその能力を保有し、また、好酸球に対する減少した作用も有し、それにより、潜在的有害な効果を低下させるＩＬ−５の誘導体、より好ましくはＩＬ−５−ミメティックが好ましい。ＩＬ−５の誘導体、好ましくはＩＬ−５−ミメティックはイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。このアッセイにおいて正の神経保護効果を示す物質を、その免疫変調活性についてさらにテストすることができる。

ＩＬ−５の生物学的活性を測定するためには、いくつかの公知のアッセイを単独で、または組み合わせて使用することができる。ＩＬ−５の機能は、その公知の免疫変調機能、および神経保護におけるその役割に関連する１以上の機能を含む。ＩＬ−５は、この因子に応答する細胞系（例えば、細胞系：Ｂ１３；ＢＣＬ１；Ｔ８８−Ｍ；ＴＡＬＬ−１０３；ＴＦ−１）を使用するバイオアッセイで検出することができる。ＩＬ−５は感度のよいイムノアッセイによって検出することもできる。もう１つのアッセイは、コロニー形成アッセイにおける好酸性コロニー（ＥＤＦ、好酸球分化因子）の検出、または好酸球ペルオキシダーゼの検出を含む。

これらおよび他のアッセイは（Ｋｉｋｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２８９−９８）（ＭｃＮａｍｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １４１，８１−８）Ｏ’Ｇａｒｒａ Ａ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＣＪ Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ：Ｃｌｅｍｅｎｓ ＭＪ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ． Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ．３２３−４３，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ １９８７；（Ｓｃｈｏｅｎｂｅｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １３７，４７−５４）（Ｔａｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２８，６５−７３）に記載されている。

本発明の他の実施形態において、ＩＬ−５と、好ましくはその神経保護作用によってその治療作用を支持する他の造血因子製剤との組合せを用いることができる。これらの組合せによって発揮される効果は累積的または超相加的／相乗的であり得る。１つの実施形態において、種々のＩＬ−５および／またはＩＬ−５誘導体を相互に組み合わせて用いる。同様に、ＩＬ−５は、最近強力な神経保護特性を媒介することが示されているエリスロポエチン、およびその誘導体のような１以上のさらなる造血成長因子と組み合わせて用いることができる（例えば、Ｂｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７；１０５２６−１０５３１；Ｃｅｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １７：８−１２；Ｓｉｒｅｎ ａｌ，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ（２００１）Ｅｕｒ Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５１：１７９−１８４）。加えて、ＩＬ−５は、例えば、（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦのような）種々のコロニー刺激因子、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＳＣＰＦ（幹細胞増殖因子）、種々のインターロイキン（ＩＬ−１，ＩＬ３，ＩＬ４，ＩＬ６，ＩＬ１１，ＩＬ１２）、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１−α、ＴＮＦ−αおよび、また、多くの他の低分子量因子と組み合わせて用いることができる。

１つの実施形態において、ＩＬ−５の生物学的活性は、もう１つの造血因子への融合によって促進される。そのような融合蛋白質の例は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、およびＩＬ−３について与えられている。増強された活性は、前記した生物学的活性アッセイで測定す
ることができる。

また、血液−脳関門を横切る、または脳組織に向けてその分布係数をシフトさせるその能力を増大させる、ＩＬ−５の修飾または処方、またはミメティック物質が好ましい。そのような修飾についての例は蛋白質変換ドメイン（ＰＴＤ）またはＴＡＴ配列の付加である（Ｃａｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１；Ｍｉ Ｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）。また、これらの配列は突然変異形態で用い、蛋白質のアミノ−またはカルボキシ末端においてさらなるアミノ酸を加えることもできる。また、ブラジキニン、またはその類似の物質をいずれかのＩＬ−５製剤の静脈内適用に加えると、脳または脊髄へのその送達を支持するであろう（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０：１０５−１２３；Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。

マウス脳において、ＩＬ−５およびＩＬ−５受容体アルファ鎖（ＩＬ−５ Ｒアルファ）の双方は神経膠星状細胞においてイン・ビトロで発現されるが、ニューロンでは発現されない。ＩＬ−５ Ｒアルファの発現は定量的項目、およびそうでなければスライスされるイソ形態の数の双方において高度に調節された。成人期において、ＩＬ−５ Ｒアルファの発現は正常なマウスでは検出されなかったが、全てのイソ形態は炎症反応にてマウスで生じた。ＩＬ−５は神経膠星状細胞において特異的なオートクリンおよび／またはパラクリン機能を有し、与えられた神経膠星状細胞集団において活性化された状態の均一性を維持する（Ｌｉｎｓ ａｎｄ Ｂｏｒｏｊｅｖｉｃ（２００１），Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９，１４５−５２）（Ｓａｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，１５５，１７５−８）。

本発明者らは、また、ＩＬ−５Ｒがラット脳で発現されることも示した。しかしながら、マウスとは対照的に、ニューロンにおけるＩＬ−５Ｒアルファの支配的発現が見出された（図５６）。

ＩＬ−５は、カンプトテシン処理ラット初代皮質培養におけるカスパーゼ−３／７活性−アッセイで神経保護活性を有した（図４６ｂ）。これは、ＩＬ−５が、ニューロン細胞において細胞死滅を低下させる能力を有することを示す。我々は、これらの細胞においてＩＬ−５がＡｋｔ−経路を誘導することも示したが、これは、典型的には、抗−アポトーシス経路がＩＬ−５でのニューロン細胞の処理によって活性化されることを示す（図４８）。

加えて、我々は、ＩＬ−５がヒト神経芽腫細胞に対して効果的であることを示すことができた。カンプトテシン処理ＳＨＳＹ５−Ｙ細胞は、ＩＬ−５を加えた場合に、低下したカスパーゼ３／７活性を示した。これは、ラットおよびヒト細胞培養におけるＩＬ−５の神経保護効果を示す（図４６ｂ）。

ＧＣＳＦ
顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）はよく知られた増殖因子である。本明細書中に記載された本発明の方法で使用することができるＧＣＳＦは、公知であって、かつ入手可能な、全長コーディング配列、蛋白質配列、ならびに種々の機能的変種、ムテイン、およびミメティックである。以下の議論においては、これらをＧＣＳＦ誘導体という。

コーディングＤＮＡおよび蛋白質双方の構造、ならびに哺乳動物多能性顆粒球コロニー
−刺激因子を組換えにより生産する方法は知られている（ＷＯ ８７／０１１３２；米国特許第４，８１０，６４３号）。例えば、Ｇ−ＣＳＦに対応するいくつかのアミノ酸配列は図１０、および配列表、すなわち、配列番号：２８、２９、３０、３１、３２および３３に示される。

１つの実施形態において、本明細書中に記載された全長ヒトＧＣＳＦアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である蛋白質、例えば、配列番号：２８は本発明で使用することができる。もう１つの実施形態において、使用することができるＧＣＳＦは、野生型全長ヒトＧＣＳＦコーディング配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、および９７％同一性を持つポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号：２８をコードするポリヌクレオチドによってコードされるものであり、これらのポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、野生型全長ヒトＧＣＳＦのコーディングポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう。用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０ないし８．３において約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には、約０．０１ないし１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であって、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大）では少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、高ストリンジェンシー条件は３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０ないし６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）参照）。アミノ酸およびポリヌクレオチドの同一性、相同性および／または同様性はＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標），Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎを用いて決定することができる。

種々のＧＣＳＦ機能的変種、ムテインおよびミメティックの例は、（例えば、野生型蛋白質に対して構造的および生物学的に同様であって、かつ少なくとも１つの生物学的に同等なドメインを有する）機能的断片および変種、（例えば、ポリエチレングリコールおよびそのポリエチレングリコール誘導体、および／またはＬｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ（商標）のようなグリコシル化形態のようなさらなる化学的部位を含有する）ＧＣＳＦの化学的誘導体、ＧＣＳＦのペプチドミメティック（例えば、構造および／または機能においてペプチドを模倣する低分子量化合物）を含む（例えば、Ａｂｅｌｌ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ， Ｌｏｎｄｏｎ：ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｇａｎｔｅ，Ｐｅｐｔｉｄｍｉｍｅｔｉｃａ−ｍａｓｓｇｅｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔｅ Ｅｎｚｙｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｎ
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０６：１７８０−１８０２（１９９４）；およびＯｌｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９−３０４９（１９９３）参照）。

ＧＣＳＦ誘導体のさらなる例が、米国特許第６，２６１，２５０号に開示されたもののような、アルブミンおよびＧＣＳＦの融合蛋白質（Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標））、または他の融合修飾；ＰＥＧ−ＧＣＳＦコンジュゲートおよび他のＰＥＧ化形態；ＷＯ ００／４４７８５およびＶｉｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｌ，Ｎｒ．１，２００２に記載されたもの；米国特許第５，５９９，６９０号に開示されたもののような、ＧＣＳＦのノルロイシンアナログ；ＷＯ ９９／６１４４５、ＷＯ ９９／６１４４６、およびＴｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８１，１９９８；２５７−２５９に記載されたもののようなＧＣＳＦミメティック；米国特許第５，２１４，１３２号および第５，２１８，０９２号に記載された、単一または複数アミノ酸が修飾され、欠失されまたは挿入されたＧＣＳＦムテイン；米国特許第６，２６１，５５０号および米国特許第４，８１０，６４３号に記載されたＧＣＳＦ誘導体；および他の配列断片と組み合わせたＧＣＳＦの全配列または部分を含有するキメラ分子を含む。例えば、Ｌｅｒｉｄｉｓｔｉｍ、例えば、Ｓｔｒｅｅｔａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，４１−５０，Ｍｏｎａｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，４１６−２４．，Ｈｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１３５９８−６０６、Ｆａｒｅｓｅ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，５１４−２１，Ｆａｒｅｓｅ，ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，５２２−３３，ＭａｃＶｉｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，９５，８３７−４５参照。加えて、ＧＣＳＦ誘導体は、米国特許第６，００４，５４８号に記載された、（セリンのような）もう１つのアミノ酸で置換された、（１７４アミノ酸種（配列番号：３７）の、またはさらなるアミノ酸がＮ−末端メチオニンである１７５アミノ酸を有するもの（配列番号：３８）の）位置１７、３６、４２、６４、および７４におけるシステインを持つもの、第１の（Ｎ−末端）位置においてアラニンを持つＧＣＳＦ；ＥＰ ０ ３３５ ４２３に記載されたＧＣＳＦ活性を有するポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸の修飾；ＥＰ ０ ２７２ ７０３に記載された蛋白質のＮ−末端領域において置換されたまたは欠失されたアミノ酸を有するＧＣＳＦ誘導体；ＥＰ ０ ４５９ ６３０に記載された、当該誘導体がＳｅｒ^１７残基によって置き換えられた天然配列の少なくともＣｙｓ^１７、およびＳｅｒ^２７残基によって置き換えられた天然配列のＡｓｐ^２７を有する、天然に生じるＧＣＳＦの生物学的特性の少なくとも１つ、および５ｍｇ／ｍｌにおける少なくとも３５％の溶液安定性を有する天然に生じるＧＣＳＦの誘導体；ＥＰ ０ ４５９ ６３０に記載された、当該蛋白質のアミノ酸配列を変化させることなく、Ｎ−末端が組換え宿主細胞における蛋白質の増強された発現のために修飾された、ＧＣＳＦをコードする修飾されたＤＮＡ配列；ＥＰ ０ ２４３ １５３に記載された、酵母を用いる組換え生産において増大した収率用の少なくとも１つの酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活化することによって修飾されたＧＣＳＦ；米国特許第４，９０４，５８４号に記載されたリシン改変蛋白質；ＷＯ／９０１２８７４（ＵＳ ５，１６６，３２２）に記載された蛋白質のシステイン改変変種；ＡＵ−Ａ−１０９４８／９２に記載された、原核生物発現後の分子の折畳みを助ける目的でのＧＣＳＦ分子のいずれかの末端へのアミノ酸への付加；ＡＵ−Ａ−７６３８０／９１に記載された、１７４アミノ酸でのＧＣＳＦの位置５０ないし５６における、（配列番号：３７）、および１７７アミノ酸でのＧＣＳＦの位置５３ないし５９における、（配列番号：３９）、および／または１７４アミノ酸での成熟ＧＣＳＦの位置４３、７９、１５６および１７０の４つのヒスチジン残基の少なくとも１つにおける、または１７７アミノ酸での成熟ＧＣＳＦの位置４６、８２、１５９または１７３における、配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号：１１）の置換；およびＧＢ ２ ２１３ ８２１に記載された、選択された領域のカセット突然変異誘発を容易とするための制限部位、および所望の発現系への遺伝子の組込みを容易とするためのフランキング制限部位を取り込む合成ＧＣＳＦ−コーディング核酸配列を含む。Ｇ−ＣＳＦアナログのさらなる例は、配列番号：６４および６５、および米国特許第６，６３２，４２６号に記載された他のものを含む。前記の内容をここに引用して援用する。

ＧＣＳＦの種々の機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは、好ましくは、野生型哺乳動物ＧＣＳＦ活性の生物学的活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％および／または最も好ましくは少なくとも９０％を保有し−生物学的活性の量は２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％；およびその間の全ての値およびサブ範囲を含む。さらに、ＧＣＳＦの機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは、野生型哺乳動物ＧＣＳＦ活性に対して１００％以上の生物学的活性を有することもでき−生物学的活性の量は少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。

ＧＣＳＦの生物学的活性を測定するためには、いくつかの公知のアッセイを単独でまたは組み合わせて使用することができる。ＧＣＳＦ機能を決定する１つの例は、実施例１に示される。ＧＣＳＦ機能を決定するための他の方法は公知であって、ネズミ骨髄細胞を使用するコロニー形成アッセイ；Ｇ−ＣＳＦによって誘導される骨髄細胞の増殖の刺激；増殖についてＧ−ＣＳＦに依存し、またはＧＣＳＦに応答する細胞系（例えば、ＡＭＬ−１９３；３２Ｄ；ＢａＦ３；ＧＮＦＳ−６０；ＨＬ−６０，Ｍ１；ＮＦＳ−６０；ＯＣＩ／ＡＭＬ１ａおよびＷＥＨＩ−３Ｂ）での特異的なバイオアッセイを含む。これらおよび他のアッセイはＢｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３９：１９４−２０１（１９９２）；Ｃｌｏｇｓｔｏｎ ＣＬ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０２：３７５−８３（１９９２）；Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７５：１２２８−３３（１９９０）；Ｋｕｗａｂａｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ １５：１２１−９（１９９２）；Ｍｏｔｏｊｉｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１８：１８７−９２（１９８９）；Ｓａｌｌｅｒｆｏｒｓ Ｂ ａｎｄ Ｏｌｏｆｓｓｏｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ４９：１９９−２０７（１９９２）；Ｓｈｏｒｔｅｒ ＳＣ ｅｔ
ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７５：４６８−７４（１９９２）；Ｔａｎａｋａ Ｈ
ａｎｄ Ｋａｎｅｋｏ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ． １５：３５９−６６（１９９２）；Ｔｉｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４９：１１５−２０（１９９２）；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５：３８−４４（１９９１）。

１つの実施形態において、ＧＣＳＦは修飾され、処方され、あるいは血液−脳関門を横切り、あるいは脳組織に向けてその分布係数をシフトさせるその能力を増大させるＧＣＳＦミメティックとして存在させる。そのような修飾の例はＰＴＤまたはＴＡＴ配列の付加である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１；Ｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）。これらの配列は突然変異形態で用いることもでき、蛋白質のアミノ−またはカルボキシ−末端においてさらなるアミノ酸を加えることもできる。また、ブラジキニン、または類似の物質を、いずれかのＧＣＳＦ製剤の静脈内適用に加えると、その脳または脊髄への送達を支持するであろう（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎａｔ ４０：１０５−１２３；Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。

１つの実施形態において、ＧＣＳＦの生物学的活性はもう１つの造血因子への融合によって増強される。増強された活性は、前記したように生物学的活性アッセイで測定するこ
とができる。ＧＣＳＦのそのような好ましい修飾または処方は、増大した抗アポトーシス効果および／または神経形成の増加に導く。そのような修飾のための例はミエロポエチン−１、ＧＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質であり（ＭｃＣｕｂｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１５，１２０３−１６）、あるいはプロゲニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）−１（ＰｒｏＧＰ−１）は、ヒト胎児肝臓チロシンキナーゼｆｌｔ−３およびＧ−ＣＳＦ受容体に結合する融合蛋白質である。

ＧＭ−ＣＳＦ
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）はよく知られた成長因子である（例えば、図１８、配列番号：２５、２６および２７参照）。本明細書中に記載された本発明の方法で使用することができるＧＭＣＳＦは、公知であって、入手可能な、全長コーディング配列、蛋白質配列、および種々の機能的変種、キメラ蛋白質、ムテイン、およびミメティック、例えば、ＰＥＧ化形態またはアルブミン−カップルド形態である。コーディングＤＮＡおよび蛋白質双方の構造、ならびに哺乳動物多能性顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子を組換えにより生産する方法は公知である（米国特許第５，６４１，６６３号）。ＧＭＣＳＦ受容体もまた公知であって、例えば、米国特許第５，６２９，２８３号に記載されている。

１つの実施形態において、全長ヒトＧＭＣＳＦアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である蛋白質を本発明で使用することができる。もう１つの実施形態において、使用することができるＧＭＣＳＦは、野生型全長ヒトＧＭＣＳＦコーディング配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％および９８％同一であるポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号：２５をコードするポリヌクレオチドによってコードされるものであり、これらのポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、野生型全長ヒトＧＭＣＳＦのコーディングポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう。用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能により大きな程度まで（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズするであろう条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０ないし８．３において約１．５Ｍ Ｎａイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であって、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大）については少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、高ストリンジェンシー条件は３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０ないし６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）参照）。アミノ酸およびポリヌクレオチドの同一性、相同性および／または同様性が、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標），Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎを用いて決定することができる。

ＧＭＣＳＦの種々の機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは、好
ましくは、野生型哺乳動物ＧＭＣＳＦ活性の生物学的活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％および／または最も好ましくは少なくとも９０％を保有し−生物学的活性の量は２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％；およびその間の全ての値およびサブ範囲を含む。さらに、ＧＭＣＳＦの機能的誘導体、変種、ムテインおよび／またはミメティックは野生型哺乳動物ＧＭＣＳＦ活性に対して１００％以上の生物学的活性を有することもでき−生物学的活性の量は少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。

本発明を実施するためには、ニューロンを保護するそれらの能力を保有し、また、白血球に対する減少した活性を有し、それにより、潜在的な有害効果を低下させるＧＭＣＳＦの誘導体、より好ましくはＧＭＣＳＦ−ミメティックが好ましい。ＧＭＣＳＦの誘導体、好ましくはＧＭＣＳＦ−ミメティックは実施例１７に記載されたようなイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。このアッセイにおいて正の神経保護効果を示す物質は、さらに、その免疫−変調活性をテストすることができる。

ＧＭＣＳＦの生物学的活性を測定するためには、いくつかの公知のアッセイを単独で、組み合わせて使用することができる。それらのＧＭＣＳＦ機能は、その公知の免疫変調機能、および神経保護におけるその役割に関する１以上の機能を含む。ＧＭＣＳＦ機能を測定するための他の方法は、例えば、マクロファージ、好中球、好酸球、および巨核細胞を含有するコロニーの発生によるコロニー形成アッセイ；ＧＭ−ＣＳＦの存在にその成長が依存し、またはこの因子に応答する細胞系（例えば、細胞系：ＡＭＬ−１９３；Ｂ６ＳＵｔ−Ａ；ＢＡＣ１．２Ｆ５；ＢＣＬ１；Ｄａ；ＦＤＣＰ１；ＧＦ−Ｄ８；ＧＭ／ＳＯ；ＩＣ−２；ＭＯ７Ｅ；ＮＦＳ−６０；ＰＴ−１８；ＴＡＬＬ−１０３；ＴＦ−１；ＵＴ−７）での特異的バイオアッセイを含む。これらおよび他のアッセイはＣｅｂｏｎ Ｊ ｅｔ
ａｌ Ｂｌｏｏｄ ７２：１３４０−７（１９８８）；Ｋａｔｚｅｎ ＮＡ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ３：３６５−７２（１９９２）；Ｌｅｗｉｓ ＣＥ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２７：５１−９）（１９９０）；Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ＢＴ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２１：１３６６−７０（１９９３）；Ｏｅｚ Ｓ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １８：１１０８−１１（１９９０）；Ｒｏｎｃａｒｏｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１９１−６（１９９３）；Ｓａｌｌｅｒｆｏｒｓ Ｂ ａｎｄ Ｏｌｏｆｓｓｏｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ４９：１９９−２０７（１９９２）；Ｚｅｎｋｅ Ｇ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ １２：１８５−２０６（１９９１）。

また、好ましいのは、血液−脳関門を横切り、あるいは脳組織に向けてのその分布係数をシフトさせるその能力を増大させるＧＭＣＳＦの修飾または処方、あるいはミメティック物質である。そのような修飾の例は、蛋白質変換ドメイン（ＰＴＤ）またはＴＡＴ配列の付加である（Ｃａｏ Ｇ． ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１；Ｍｉ Ｚ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）。これらの配列は突然変異形態で用いることもでき、蛋白質のアミノ−またはカルボキシ末端においてさらなるアミノ酸を加えることができる。また、ブラジキニン、または類似の物質をいずれかのＧＭＣＳＦ製剤の静脈内適用に加えると、脳または脊髄へのその送達を支持するであろう（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０：１０５−１２３；Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ
ａｌ（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。異なる適当な形態および誘導体の実施例はサルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、Ｐｒｏｋｉｎｅ（登録商標）、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、またはモルグラモスチム（Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標））である。

ＧＭＣＳＦＲ ｍＲＮＡは単離された小神経膠細胞、神経膠星状細胞、稀突起神経膠細胞およびニューロンで検出されている（Ｓａｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，１６０，１３１−４；Ｂａｌｄｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｂｌｏｏｄ，８２，３２７９−８２）。ＧＭＣＳＦは神経膠星状細胞の増殖を刺激することが示されている（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｇｌｉａ，１６，７１−８０）。ＧＭＣＳＦは、また、小神経膠細胞からのインターロイキン６の放出を誘導する（Ｓｕｚｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，７１３，１９２−８）。最近、出版物は、インターロイキン１がニューロン細胞系ＮＴ２におけるＧＭＣＳＦ蛋白質の生産を増大させたことを示した（Ｄａｍｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ，１３，１２８−３３）。脳におけるＧＭＣＳＦＲの存在は、胎児におけるＧＭＣＦＳ受容体発現についての系統的サーチにおいてヒト胎児からの材料で示された（Ｄａｍｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ，４６，３５８−６６）。Ｄａｍｅ，ｅｔ ａｌ．は、彼らの発見から、ＧＭＣＳＦが胎児において神経発生での役割、および成人脳における免疫監視での役割を有し得ると結論した。重要なことには、彼らはいずれの可能な領域の関連、特に、神経保護への関与に言及していない。ＧＭＣＳＦはイン・ビトロでのコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を増加させ（ＳＮ６．１０．２．２細胞系および培養されたマウス中隔ニューロン）、および線毛−脳弓横断後の病変ラットコリン作動性中隔ニューロンの生存をイン・ビボで増加させる（Ｋａｍｅｇａｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，５３２，３２３−５．）（Ｋｏｎｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，６０９，２９−３５）。重要なことには、この発見はニューロンのある種のサブタイプに関するに過ぎず、著者らによって、他のニューロンまたは神経細胞タイプに一般化されていない。彼らはこれらのデータからＧＭＣＳＦの一般的な神経保護特性を導いておらず、また、彼らはいずれの可能な治療適用性も言及しなかった。ＧＭＣＳＦは進んだグリコシル化最終産物（ＡＧＥ）の添加に際して神経膠星状細胞においてアップレギュレートされる（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ Ｍｅｄ，４，４６−６０）。ＧＭＣＳＦはイン・ビトロで小神経膠細胞増殖を促進することが示されている（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｇｌｉａ，１２，３０９−１８）。最近、ＧＭＣＳＦレベルがアルツハイマー病を持つ患者の脳脊髄液（ｃｓｆ）中で上昇したことが見出された（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ，１０３，１６６−７４）。ＧＭＣＳＦは発作患者のＣＳＦにおいても研究されている（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｏｋｅ，３０，３２１−７．）。後者の研究において、ＦＡＳリガンドであるプロアポトーシス蛋白質のレベルは、２１ないし２６日において、および３ヶ月未満において発作患者の脳脊髄液におけＧＭＣＳＦレベルと正に相関する。しかしながら、発作患者でのこの発見のいずれの治療的有用性に対しても結論が導かれておらず、かつＧＭＣＳＦのいずれの可能な神経保護役割にも言及されていない。発作後におけるＧＭＣＳＦの放出はそれ自体多くの理由を有することができ、いずれの機能的予測をなすのも可能としない。ＧＭＣＳＦは血液−脳−関門を横切る（ＭｃＬａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｂｒａｉｎ，１２０，２０８３−９１）。この研究は、神経学的病気へのＧＭＣＳＦのいずれかの治療的適用を示す目的でなされたのではなく、神経変性病または発作におけるＧＭＣＳＦの可能な有用性の関連する言及はない。

まとめると、刊行物中の前記文献は神経系におけるＧＭＣＳＦ受容体およびリガンドの存在に対する証拠を提供しているが、ＧＭＣＳＦのいずれの一般的神経保護特性も示して
いない。これらの研究は、確かに、発作のような神経変性および虚血性障害の治療のためのＧＭＣＳＦの使用を示唆しない。

１つの実施形態において、ＧＭＣＳＦの生物学的活性は、もう１つの造血因子への融合、例えば、ＩＬ−３／ＧＭＣＳＦ−融合蛋白質ＰＩＸＹ３２１、Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ（１９９４），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１２，２５３−６１）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｅｌｂａｕｍ（１９９４），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ，１，２０３−９）（Ｂｕｅｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２１，１４６７−７２）；プロメガポエチン；ＩＬ−３／トロンボポエチン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆａｒｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，３２９−３８）によって増強される。増強された活性は前記した生物学的活性アッセイで測定することができる。ＧＣＳＦのそのような好ましい修飾または処方は、増大した抗アポトーシス効果および／または神経形成の増加に導く。

他の造血成長因子
本発明の他の実施形態において、その治療的作用、好ましくはその神経保護作用を指示する組合せ製剤を用いることができる。これらの組合せによって発揮される効果は累積的であるか、または超相加的／相乗的であり得る。１つの実施形態において、前記した因子は、相互の組合せで用いられる。同様に、エリスロポエチンおよびその誘導体のような１以上のさらなる造血成長因子は、最近、強力な神経保護特性を媒介することが示されている。（例えば、Ｂｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ（２０００），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１０５２６−１０５３１；Ｃｅｒａｍｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １７：８−１２；Ｓｉｒｅｎ ａｌ，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ（２００１）Ｅｕｒ Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ
Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５１：１７９−１８４）。加えて、例えば（Ｍ−ＣＳＦのような）種々のコロニー刺激因子、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＳＣＰＦ（幹細胞増殖因子）、（前記したもの、例えば、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２以外の）種々のインターロイキン、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１−α、ＴＮＦ−αおよび、また、多くの他の低分子量因子との組合せ。

もう１つの実施形態において、エリスロポエチンを例外として種々の造血成長因子を単独で用いることができる。もう１つの実施形態において、例えば、発作の関連では、１以上の造血因子を血栓溶解活性を有する物質を、例えば、組織−プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、および／またはアンクロドと組み合わせることができる。ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦはアセチルサリチル酸（アスピリン）またはヘパリンいずれかと；メラトニン；および／またはアポトーシスシグナリングに干渉する物質（例えば、カスパーゼの阻害剤）と組み合わせることもできる。また、特に、限定されるものではないが、リルゾール（Ｒｉｌｕｐｅｋ（登録商標））、ビタミンＥのようなビタミン、Ｑ１０、または抗酸化性物質とＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦとの筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）組合せの治療が可能である。パーキンソン病を治療するためには、トリヘキシフェニジル、セレジリン、Ｌ−ＤＯＰＡ、ペルゴリド、および他のもののようなパーキンソン病の治療でも用いられる公知の薬物とＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの組合せを使用することができる。造血増殖因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせることができる他の物質はｂＦＧＦ、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩａ、抗−ＩＣＡＭ、酸化窒素阻害剤、血栓溶解剤、ロタマス阻害剤、カルシニューリン阻害剤、およびサイクロスポリンを含む。加えて、神経変性障害を治療する場合、神経伝達物質レベルを実行する１以上の剤の投与も含めることができる。さらに、認識疾患を治療する場合、１以上のコリン作動性剤、カテコールアミン再接種阻害剤などを投与することもできる。

現存の抗鬱剤との組合せを、有利な場合に用いて、例えば、個人における鬱病を治療することもできる。抗鬱剤の非限定的例はＳＳＲＩ（選択的セロトニン再接種阻害剤）；パキシル（パロキセチン）；プロザック（フルオキセチン）；ゾロフト（セルトラリン）；セレキサ（シタロプラム）；レキサプロ（エスシタロプラムシュウ酸塩）；ルボックス（フルボキサミン）、ＭＯＡＩ（モノアミンオキシダーゼ阻害剤）；ナルジル（フェネルジン）；パルネート（トラニルシプロミン）；ＴＣＡ（三環抗鬱剤）アダピン（ドキセピン）；アナフラニル（クロミプラミン）；エラビル（アミトリプチリン）；エンデップ（アミトリプチリン）；ルジオミル（マプロチリン）；ノルプラミン（デシプラミン）；パメロール（ノルトリプチリン）；ペルトフラン（デシプラミン）；シネクアン（ドキセピン）；スルモンチル（トリミプラミン）；トフラニル（イミプラミン）；ビバクチル（プロトリプチリン）、または他の薬物タイプ：エフェキソール（ベンラファキシン）；シムバルタ（ズロキセチン）；デシレル（トラゾドン）；ブスパール（ブスプロン）；エドロナックス、ベストラ（レボキセチン）；レメロン（ミルタザピン）；セルゾン（ネファゾドン）；ウエルブトリン（ブプロピオン）を含む。

神経学的疾患
本発明に従って治療することができる神経学的疾患は一般に３つのクラス：虚血性または低酸素メカニズムを持つ病気；神経変性病（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９７，６^ｔｈ Ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ １０４８ ｆｆ）；および神経細胞の死滅に関連する神経学的および精神病学的病気に分類される。本発明に従って治療することができる他の神経学的疾患は、認識能力の増強、および神経膠芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、髄膜腫および神経鞘腫のような、脳腫瘍の治療も含む。

虚血性または低酸素メカニズムを持つ病気は、さらに、一般的病気および大脳虚血症に再分類することができる。虚血性または低酸素メカニズムに関連するそのような一般的病気の例は、心筋梗塞、心臓機能不全、心不全、鬱血性心不全、心筋炎、心膜炎、心筋周囲炎、冠動脈心臓病（冠動脈の狭窄）、狭心症、先天性心臓病、ショック、四肢の虚血症、腎臓動脈狭窄、糖尿病性網膜障害、マラリアと関連する血栓症、人工心臓弁、貧血、脾機能亢進症候群、気腫、肺線維症、および肺浮腫を含む。大脳虚血症の病気の例は、発作（ならびに出血性発作）、大脳微小血管症（小血管病）、分娩時大脳虚血症、心臓停止または蘇生の間／後の大脳虚血症、手術内問題による大脳虚血症、頸動脈外科的処置間の大脳虚血症、脳への血液供給動脈の狭窄による大脳虚血症、洞血栓症または大脳静脈の血栓症、大脳血管奇形、および糖尿病性網膜障害を含む。

神経変性病の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、ウィルソン病、多系萎縮症、アルツハイマー病、ピック病、レビー小体病、ハレルボルデン−シュパッツ病、ねじれ失調症、遺伝性感覚運動神経障害（ＨＭＳＮ）、ゲルシュトマン−シュトロイスラー−シャンカー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、マシャド−ヨセフ病、フリートライヒ運動失調、非−フリートライヒ運動失調、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、家族性震顫、オリーブ橋小脳変性、腫瘍随伴性大脳症候群、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性視神経障害（レーバー）、色素性網膜炎、シュタルガルト病、およびキーンズ・セイアー症候群を含む。

神経細胞死滅に関連する神経学的および精神病的病気の例は、敗血症ショック、大脳内出血、クモ膜下出血、多発性梗塞認知症、（血管炎、多発性硬化症、およびギラン−バレー症候群のような）炎症病、（脊髄外傷、および脳外傷のような）神経外傷、末梢神経障害、多発性神経障害、癲癇、精神分裂症、鬱病、代謝性脳障害、および中枢神経系の感染（ウィルス、細菌、真菌）を含む。

「治療する」とは、病気または疾患の進行を遅らせること、中断、阻止または停止を意味し、必ずしも、全ての病気の兆候及び症状の完全な排除を必要としない。「予防する」は神経学的な病気の予防を含めた意図であり、ここに、「予防」は、限定されるものではないが、病気または疾患の完全な予防を含めた、病気または疾患の症状または兆候の開始または重症度の時間のいずれの程度の阻害でもあると理解される。

脊髄における大きな運動ニューロン上のＧＣＳＦ受容体またはＧＭＣＳＦ受容体の強力な発現が見出され（図４ ｉ−ｌ）、かつＧＣＳＦは病変大脳虚血症で効果的である（図１参照）ので、同一の基本的病因メカニズムが、グルタメート関与のようなＡＬＳおよび他の神経変性病におけると同様に働くならば、酸化的ストレスおよびプログラムされた細胞死滅ＧＣＳＦはＡＬＳのような慢性疾患における長期療法に特に適している。というのは、それは慢性的に与えた場合にヒトにおいて良く許容されるからである（Ｏｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８，３５５８−８５）。従って、本発明の１つの実施形態において、単独、相互に組み合わせた、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせたＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血増殖因子を用いて、ＡＬＳを治療することができる。さらなる実施形態において、単独、相互に組み合わせた、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせたＩＬ−３およびＩＬ−５を用いることができる。

酸化的ストレスおよびアポトーシスの関与のようなパーキンソン病に関連する病理生理学は、パーキンソン病も神経変性障害および発作に入れる。ＧＣＳＦは細胞系ＰＣ１２におけるＨ_２Ｏ_２−惹起細胞死滅において強力に神経保護性である（図１ｂ）。ＰＣ１２細胞はドーパミン作動性細胞の特徴、例えば、機能的ドーパミントランスポーターの存在を呈し（Ｍａｒｕｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ，７５，２０９−１３）、パーキンソン病の重要な態様、例えば、ＭＰＴＰ代謝産物ＭＰＰ＋による毒性についてのイン・ビトロモデルとして用いられる（Ｂａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，３２１，８１−４）。Ｈ_２Ｏ_２はＰＣ１２細胞におけるパーキンソン病のいくつかの態様を明確にモデル化するＰＣ１２細胞についての有害な刺激物である。例えば、Ｈ_２Ｏ_２はＭＰＴＰ−惹起細胞事象の中間体の１つである（Ｆａｂｒｅ ｅｔ ａｌ １９９９ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５５（４）：３２５−３１）。ドーパミン作動性ニューロンにおけるＭＰＴＰ−およびＨ_２Ｏ_２−媒介細胞死滅に関与する細胞事象のカスケードおよびシグナリングメカニズムには顕著な重複がある（Ｃｈｕｎ，ＨＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２００１ Ｆｅｂ；７６（４）：１０１０−２１；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９３ Ｆｅｂ ２４；４５（４）：９２７−３３）。Ｈ_２Ｏ_２は、酸化的ストレスおよびアポトーシスに導く活性酸素種（ＲＯＳ）を生産することによって作用する。酸素ラジカルによる損傷は、パーキンソン病における主な病理生理学事象の１つであり（Ｂｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｈｏｕｅｔｏ（１９９９），Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，５３，１１７−２１．，Ｂｅａｌ（２００１），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，３２５−３４）、抗酸化剤療法は患者で効果的である（Ｂｅａｌ（２００２），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ，３６，４５５−６０．，Ｓｈｕｌｔｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，５９，１５４１−５０）。酸化的ストレスおよびアポトーシスの重要な病理生理学的メカニズムであるモデル、ＰＣ１２細胞におけるＨ_２Ｏ_２惹起細胞死滅でのＧＣＳＦの効果は、パーキンソン病（ＰＤ）における効果を予測し：驚くべきことには、パーキンソン病によって侵された領域、黒質（ＳＮ）、特に黒質緻密部（ＳＮＣ）におけるＧＣＳＦ受容体の発現（図４ ｍないしｏ）が示された。細胞モデルにおける効率、受容体のイン・ビボ局所化、および大脳虚血症を伴う病理生理学的メカニズムの重複（酸素ラジカル／アポトーシス）は、ＧＣＳＦおよび／または他の成長因子、例えば、ＧＭＣＳＦを用いてパーキンソン病を治療することができるという無視できない証拠を提供する。げっ歯類モデルにおける効率テストは実施例５に例示したよう
に行うことができる。従って、本発明のもう１つの実施形態においては、単独、相互に組み合わせた、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせたＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血増殖因子を用いて、パーキンソン病を治療することができる。さらなる実施形態において、単独、相互に組み合わせた、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせたＩＬ３およびＩＬ５とを用いることができる。

病理学的には、パーキンソン病は、主として、黒質の色素脱失によって、およびレビー小体の存在によって特徴付けられる神経変性障害と定義される。しかしながら、これらの基準が余りにも制限的過ぎかつ単純であり、それは、各々が恐らくは区別される病因を持つ、パーキンソン病の不均一な臨床的かつ病理学的表示、および他のパーキンソン障害を考慮していない。パーキンソン病についての特異的な生物学的マーカの不存在下では、他のパーキンソン障害からのパーキンソン病の区別は、臨床病理学的基準に依拠する（表２参照；（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｙ（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ ３９
８８９−９０９））。

１つの実施形態において、神経学的疾患はパーキンソニズムであり、パーキンソニズムはパーキンソン病、二次的パーキンソニズム、家族性神経変性病または「パーキンソニズム＋症候群」である。

パーキンソニズムの分類を以下に示す。
・一次（原発性）パーキンソニズム−パーキンソン病（散在性、家族性）
・二次（後天性、症候性）パーキンソニズム−感染性（脳炎後、遅延ウィルス）、薬物−誘導（ドーパミンアンタゴニストおよびデプレター）、片側萎縮（ヘミパーキンソニズム）、水頭症（常圧水頭症）、低酸素症、感染性（脳炎後）、代謝（副甲状腺機能不全）、トキシン（ＭＰＴＰ、ＣＯ、ＭＮ、Ｈｇ．ＣＳ２、メタノール、エタノール）、外傷（ボクシング性脳障害）、腫瘍、および血管（多発性梗塞状態）
・遺伝性変性パーキンソニズム−ハンチントン病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ病、オリーブ橋小脳および脊髄小脳変性、神経有棘赤血球増加症、ルバグ（Ｌｕｂａｇ）（Ｘ−連鎖ジストニア−パーキンソニズム）、および層壊死を伴うミトコンドリア細胞障害
・多発性系変性（パーキンソニズム＋）−皮質−基底神経節変性、認知症症候群（アルツハイマー病、散在性レビー小体病、前頭側頭骨痴呆症）、リティコ−ボディッヒ（Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ）（グアナミアンパーキンソニズム−認知症−ＡＬＳ）、多発性系萎縮症候群（線条体黒質変性、シャイ−ドレーガ症候群、散在性オリーブ橋小脳変性（ＯＰＡＣ）、運動ニューロン病パーキンソニズム）、進行性淡蒼球萎縮、および進行性核上麻痺
本発明者らは、本明細書中に含まれた考察によって、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが神経形成を増強し、虚血性病変後の挙動結果を改善する能力を有することを示した。神経形成は、神経ネットワークの増大した可塑性に至り得、およびニューロンの暫時の喪失を置き換えることができる１つのメカニズムである。従って、本発明の１つの実施形態は、本明細書中での投与の考察に従って本明細書中に記載された１以上の組成物を個人に投与することによって、認知喪失に罹った、それを呈する、および／またはそのあるレベル迄と考えられる個体に対する認知能力の改善または増加を供することである。別の実施形態において、認識増強は、非−病理学的疾患下で有用でさえある個人、例えば、認知損傷が存在しない個人を益することもできる。

認知能力および、従って、増強の決定は当業者によって知られている。認知能力の増大または増強を測定する場合、本発明の組成物の投与前、および投与後に、例えば、同一基準、パラメータ等での同一テストを用いてそれらを比較し、（いくつかの実施形態においては、投与の間に測定することもできる）。

加えて、認知増強における本発明による組成物の使用は精神的能力における非−病理学的減衰に制限されないが、精神的能力の正常な生理学的レパートリーの増大、例えば、記憶増強、微妙な運動調和の増強および／または言語能力の増強に適応することもできる。

鬱病は悲しみ、活動における興味の喪失、および減少したエネルギーによって特徴付けられる。他の兆候は信頼性および自己−尊厳の喪失、不適切な罪悪感、死および自殺の考え、減少した集中、および睡眠および食欲の乱れを含む。種々の体細胞兆候も存在し得る。特に人生において敗北を経験した後に鬱病の感情は普通であるが、鬱病障害は、兆候が閾値に到達し、少なくとも２週間続いた場合にのみ診断される。鬱病は軽度から非常に重症までの重症度で変化し得る。

発生は中年において最高であるが、鬱病は人生スパンのいずれの段階においても個人を侵し得る。しかしながら、青春および若い成人期の間において増大する鬱病の認知が存在する（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９３）、 Ｊ Ａｂｎｏｒｍ Ｐｓｙｃｈｏｌ， １０２． １１０−２０）。鬱病は本質的には偶発的な再発性障害であり、各エピソードは通常は数ヶ月から数年間継続し、その間に正常な期間がある。しかしながら、症例の約２０％において、鬱病には特に適当な治療が利用できない場合、緩解を伴わない慢性的期間が伴う（Ｔｈｏｒｎｉｃｒｏｆｔ ａｎｄ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（１９９３）、 Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｍｅｄ，２３，１０２３−３２）。最初のエピソードから回復する者についての再発率は２年以内で約３５％であって、１２年において約６０％である。再発率は４５歳を超える年齢の者でより高い。鬱病障害の特に悲劇的結果の１つは自殺である。鬱病患者の約１５ないし２０％は自殺をおかすことによってその生命を終える。自殺は鬱病の共通かつ回避可能な結果の１つである。まとめると、鬱病は普通の精神的障害であり、非常に高いレベルの病気負担を引き起こし、来る２０年の間において上昇する傾向を示すと予測される。

鬱病は患者を常に害する可能性があり（一極）、または二極特徴を有する（狂気または二極性鬱病）。二極性鬱病は、過剰エネルギーおよび高揚の「高」から完全な絶望および無気力の「低」の極端な気分の振れによって特徴付けられる。狂気鬱病は、しばしば、気分の振れを均一とするリチウムで治療される。

鬱病は季節性の感情的障害（ＳＡＤ）であり得る。それは、一般に、九月に開始し、春がより長い昼をもたらし、より多くの太陽の光をもたらす迄続く、一般には冬の到来に一致する鬱病のタイプである。

該鬱病は、誕生後約２週間から２年迄に起こり得る出生後鬱病であり得る。
鬱病の重症度を分類しようとする試みが為されており、例えば、（Ａｂｄｅｌ−Ｋｈａｌｅｋ（２００３）， Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｒｅｐ，９３，５４４−６０）は以下の８つの基本的な次元を確認した、すなわち、子供および若者の鬱病のプロフィールを定義するための、悲観主義、弱い集中、睡眠の問題、性的冷感症、疲労、孤独、低い自尊心、および身体的不満。

鬱病は（それに伴う身体の病気を持たない）原発性病気として起こる可能性があり、あるいはそれは身体的障害、特に多数の神経変性障害の精神病学的兆候であり得る。鬱病障害（ＤＤ）は、多発性硬化症、発作、認知症、偏頭痛、パーキンソン病および癲癇のような神経学的障害の頻繁な精神病学的共存症である。これらの神経学的障害におけるＤＤの臨床的発現は原発性気分障害のそれと同一である。神経変性障害は、しばしば、病気の最初の提示としての「古典的な」精神病学的兆候を呈する。神経変性障害の関連における鬱病の兆候学は鬱病単独とは異なるであろう。以下に、兆候としての鬱病を有するいくつか
の神経変性障害をリストする：
１．多発性硬化症
２．外傷的脳負傷：鬱病は外傷的脳負傷（ＴＢＩ）を持つ患者も冒かす：ＴＢＩを持つ患者の３０％および３８％の間は鬱病であると分類することができる（Ｓｅｅｌ ａｎｄ Ｋｒｅｕｚｅｒ ０３）。
３．発作：発作患者のほぼ３０％は臨床的には鬱病とされる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８６）。
４．認知症およびアルツハイマー病
５．偏頭痛
６．パーキンソン病：鬱病兆候はＰＤ患者のほぼ半分で起こり、これは、ＰＤ患者についての機能的損傷のかなりの原因である。ＰＤにおける鬱病は、単純に、心理社会学的ストレスおよび不能に対する反応であるというよりはむしろ、基本となる神経解剖学的変性に対して２次的であることを示唆する蓄積されつつある証拠がある。鬱病の発生は、特別な皮質および皮質下経路の中枢セロトニン作動性機能および神経変性の変化に相関する。従って、ＰＤにおける共病態鬱病の理解は、メランコリーの神経解剖学的基礎の理解を増すことができる。
７．癲癇：癲癇は社会的、職業的および心理学的機能に対する複雑な効果を有する慢性疾患である。いくつかの精神病学的障害は、一般的集団と比較して癲癇を持つ個人における増大した罹患率を有することが示されている。鬱病は最も普通の精神病学的共存症のように見えるが、不安および他の診断は広くは調べられていない。しかしながら、癲癇においては、鬱病障害には、頻繁に、原発性鬱病のそれとは異なり、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに含まれる基準に適合しない臨床的特徴も存在し得る。いくつかの研究は、鬱病または心理学的苦痛が、発作の頻度および重症度、職業または推進状態さえも含めた、健康−関連の生活の質の最も強力な予測体であり得ることを見出している（Ｇｉｌｌｉａｍ， ｅｔ ａｌ．（２００３）， Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ，４ Ｓｕｐｐｌ ４，２６−３０）。癲癇を持つ臨床的に鬱病の人々は、より高いレベルの認識された重症度を報告しており、発作、ならびに同様なタイプの発作を経験している非鬱病の人々よりは総じての発作回復に関してより大きな問題に悩んでいる。発作活性の報告に対する鬱病兆候の広範囲の影響は、癲癇を持つ人々は鬱病についてスクリーニングすべきことを示唆する。これらのデータは、癲癇を持つ人々の間で鬱病を検出し、治療する重要性を強調する（Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｈｅｃｉｍｏｖｉｃ， ａｎｄ
Ｓｈｅｌｉｎｅ（２００３）Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ，４ Ｓｕｐｐｌ ４，２６−３０）。
８．ハンチントン病：ハンチントン病（ＨＤ）は、個人の運動制御、認識および情緒的安定性における劣化として表される神経変性プロセスである。情緒的不安定は、パーソナリティの変化、不安および刺激のような種々の兆候を介して反映される。認識減衰はハンチントン病（ＨＤ）における運動兆候に先行し得る。鬱病はＨＤにおいて普通であり、認識損傷に連結されてきた。鬱病の気分、およびＤＮＡ突然変異の長さを用いることによって計算された病気開始迄の見積もられた時間は、共に、働く記憶性能の有意な予測体であった。知見はＨＤについての前兆候的個人での現存の研究と合致し、それに寄与し、認識減衰（すなわち、鬱病の気分）に対する潜在的に救済可能な寄与を確認する（Ｎｅｈｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１３，３４２−６）。鬱病はここにリストしない他の身体の病気に関しても起こり得る。

最近、新しい刺激的なプログラムが、鬱病の病因に向けて行われており、これは、鬱病が脳構造中での神経変性事象、および海馬構造における正しい成人の神経形成の可能な失敗に関連付けられることを示唆する。従って、本明細書中に記載された（内因性成人神経幹細胞の刺激を含めた）その抗−アポトーシス作用およびプロ−再生作用双方での造血因
子、例えば、Ｇ−ＣＳＦ．ＧＭ−ＣＳＦ．ＩＬ３および／またはＩＬ５処置を用いて、鬱病を治療することができる。

以下に、（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ（２００３）， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，４９９−５０３によってレビューされた）鬱病の神経変性概念に関する研究を記載する。

鬱病患者の形態学的変化の研究は、灰色物質変化を含めた海馬における構造的変化を明らかとした（Ｓｈｅｌｉｎｅ（２０００）Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４８，７９１−８００）。早期−開始再発鬱病、神経学的障害に関連する人生後期鬱病、および二極性病気の研究は、神経解剖学的回路内の構造的脳の変化を明らかとした。この回路は辺縁系−皮質−層−淡蒼球−視床路と呼ばれており、かなり相互連結された構造よりなる。感情的病気の三次元磁気共鳴イメージング研究において、この管を含む構造の多くは容量の喪失または構造の異常を有することが判明している。鬱病における容量喪失を説明するために提案されたメカニズムは、神経傷害が引き起こしたニューロンの喪失、減少した神経変性、および可塑性の喪失を含む。これらの態様は、全て、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５の活性によって治療することができる。１つの好都合な仮説は、成人海馬神経形成における乱れである（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ（２００３）， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，４９９−５０３，Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）， Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５，２６２−９，Ｊａｃｏｂｓ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈｖ Ｉｍｍｕｎ，１６，６０２−９）。鬱病および他の気分障害は、従って、「幹細胞傷害」である。最近の研究は、どのようにして成人海馬神経変性が調節されるかについての新しい態様を向上させた。潜在的に成人神経形成を抑制する因子の１つは、恐らくは、増大したグルココルチコイド放出によるストレスである（Ｊａｃｏｂｓ，Ｐｒａａｇ ａｎｄ Ｇａｇｅ（２０００）， Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５，２６２−９）。

成人海馬神経形成はまず、１９６５年にＡｌｔｍａｎ ａｎｄ Ｄａｓによって記載され、いくつかの再発見を受けた。該現象におけるより広い興味は、まず、成体カナリアの脳における活性相関神経形成についての報告によって１９８０年代の初期に爆発した。トリチウム化チミジンおよびオートラジオグラフィー技術のより面倒な使用の代わりに、共焦点レーザー走査型顕微鏡と組み合わせてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で脳における細胞を顕著に増殖させることは、成人神経形成に対するより直接的な定量的アプローチを可能とした。新しい細胞のサブセットを生存させ、顆粒細胞層に移動させ、ニューロンまで分化させる。それらは、顆粒細胞層における全ての他の顆粒細胞がそうであるように、コケ状繊維管に沿って領域ＣＡ３へと突出し、周囲のより古い細胞から事実的に区別できるようになる。

慢性抗鬱剤治療は成人神経形成の現象を緩和するという知見は、先に概説した仮説を強化させる（Ｂｅｎｎｉｎｇｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ，１０９，９４７−６２，Ｄｒｅｍｅｎｃｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００３），
Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２７，７２９−３９，Ｄ’Ｓａ ａｎｄ Ｄｕｍａｎ（２００２）， Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ，４，１８３−９４，Ｄｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，２９９，４０１−７，Ｄｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４６，１１８１−９１）。

従って、本発明のもう１つの実施形態において、造血成長因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを、単独で、相互に組み合わせて、本明細書中に記載されたさらなる因子と組み合わせて、鬱病を治療することができ、および／または、例えば、鬱病の素因が
ある、または鬱病兆候を発症することが予想される患者への投与による予防的鬱病療法を提供することができる。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。

１つの実施形態において、鬱病は、前記したようなより長い血漿半減期を持つ処方、例えば、ＰＥＧ化形態（ＰＥＧフィルグラスティム）、アルブミン−カップルド形態（アルブグラニン）治療することができる。治療は原発性鬱病に制限されず、兆候性鬱病、および共存症としての鬱病にも使用される。もう１つの実施形態において、治療は毎週の皮下注射を供することができ、これは、脳中の同族体受容体の経口的に利用できるアゴニストと組み合わせることもできる。治療用量は前記した通りとすることができ、１つの好ましい実施形態においては、毎日０．１ないし１０００μｇ／ｋｇ体重の因子（または因子の組合せ）とすることができる。同様に改変された遺伝子転写と共に、虚血症コアおよび外傷の部位の周りの同様な神経化学的媒体は、有害なメカニズムとの干渉を狙った同様な神経保護戦略は、大脳虚血症および外傷脳負傷で効果的なはずであることを示唆する。双方のタイプの負傷におけるそのような療法の目標は、毒性経路活性化を最小化し、内因性神経保護メカニズムの活性を増強することである。というのは、これらの経路の間のバランスは、結局は、危険な組織の運命を決定するからである。事実、実験的発作のモデルで有効なことが判明した神経保護剤もまた、実験的外傷脳負傷（ＴＢＩ）のモデルで有効である。

大脳虚血症および外傷脳負傷において活性な共通の病理学的および保護プロセス、ならびに神経保護戦略に対する共通の応答に鑑みると、ＧＣＳＦ療法は外傷脳負傷で効果的であろうことを示す。外傷脳負傷の条件下でＧＣＳＦを調べたただ１つの研究があった（Ｈｅａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，２６，７４８−５４）。しかしながら、この研究はＧＣＳＦ（フィルグラスチム）のいずれの神経保護効果も狙っておらず、単に、感染パラメータを低下するに過ぎなかった（研究の主な目的：絶対好中球カウントの増加、フィルグラスチムの安全性、院内感染（肺炎、細菌症および泌尿器管感染）の頻度）。その研究においては死亡率の改善はなかった。臨床的安全性の関係では、この研究は、ＧＣＳＦ投与はＴＢＩで安全であることを示し、本発明による神経保護についてのＧＣＳＦ治療の安全な実施可能性が確認される。従って、本発明のもう１つの実施形態において、造血成長因子、例えば、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦを、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて、例えば、負傷した患者においてニューロン細胞を保護する予防的方法を供することによって、大脳虚血症および外傷の負傷を治療することができる。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。

心不全および蘇生による大脳虚血症で働くことができる基本的な病理生理学メカニズムは、血管の閉塞による大脳虚血症下で起こるものに匹敵するので（実施例１参照）、ＧＣＳＦ療法は神経保護についての心臓の問題の条件下でやはり効果的であろう。従って、本発明のもう１つの実施形態において、造血成長因子、例えば、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦを、単独で、相互に組み合わせておよび／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、心臓の問題／病気の結果としての虚血症を治療し、および／または予防的神経保護療法を提供することができる。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。療法は緊急の蘇生が開始されるや否や開始することができる。別法として、心臓の問題（以前の心筋梗塞、高い血中コレステロールレベル、高い血圧、糖尿病、喫煙）についての公知の危険な群に属する患者において、造血成長因子、例えば、ＧＣＳＦでの予防的な継続した療法もまた、因子の遅延放出形態を用いて行うこともできる。

同様に、これらの前記した考慮は、引き続いての大脳虚血症に関する外科的処置を受ける患者の大きな群に適応される。特に、心臓外科的処置（Ｈｏｇｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１００，６４２−７）および供給する大きな血管での外科的処置（例えば、頸動脈血管内膜切除術）は、それらに関連する神経学的合併症の高い危険性を有する。１９８２年にＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏの神経外科教育ユニットで行われた３５８の頸動脈血管内膜切除術の目的遡及レビューは３．９％の手術時発作率および１．５％の死亡率を示した。ほとんどの（８２％）外科神経学的合併症は、直後の手術後期間（２４時間）後に起こった。遅延された発作のこの高い発生率は、ほとんどの手術時発作が血液力学的であるよりはむしろ塞栓的であることを示唆する。５、６％の合わせた罹患率および死亡率は、頸動脈血管内膜切除術で予測されるはずである（Ｇｒｏｕｐ（１９８６）、Ｓｔｒｏｋｅ，１７，８４８−５２）。これらおよび他のデータは、これらの手法における予防的神経保護療法に対する明瞭な要望を示す。従って、本発明のもう１つの実施形態において、造血成長因子、例えば、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦを、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、外科的に誘導された大脳虚血症の結果としての虚血症を治療することができ、および／または予防的神経保護療法を提供することができる。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。１つの実施形態において、治療は、主な外科的手法に先立って危険な患者で開始される。

本発明のもう１つの実施形態において、例えば、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、多発性硬化症（ＭＳ）を治療することができ、および／または多発性硬化症患者における予防的神経保護療法を供することができる。この方法は、稀突起神経膠細胞でのＧＣＳＦ受容体の存在に基づいており、ＭＳの初代標的細胞に対するＧＣＳＦの直接的な効果を支持する。加えて、ＧＣＳＦ受容体は神経細胞およびそれらの突起に存在し、それは病気の後期段階において危うくなり、継続する不能に相関し得る（Ｃｉｄ，ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ，１９３，１０３−９）。事実、最近、免疫変調から神経保護への多発性硬化症に対する治療概念の範例シフトが起こった。というのは、神経変性メカニズムは多発性硬化症の不能態様で最も重要だからである（Ｂｏ， ｅｔ ａｌ．（２００３）， Ｍｕｌｔ Ｓｃｌｅｒ，９，３２３−３１，Ｂｊａｒｔｍａｒ， ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，２０６，１６５−７１，Ｗｕｊｅｋ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，６１，２３−３２，Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５７，１２４８−５２，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５０，３８９−４００，Ｂｊａｒｔｍａｒ ａｎｄ Ｔｒａｐｐ（２００１），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ，１４，２７１−８，Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４８，８９３−９０１，Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，２８，３８３−９５，Ｔｒａｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ，１２，２９５−３０２，Ｔｒａｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍ ｅｄ，３３８，２７８−８５，Ｎｅｕｈａｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２４，１３１−８，Ｐｒｙｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｂｒａｉｎ，１２６，２１９１−２０２，Ｗａｕｂａｎｔ（２００３），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｅｍｅｒｇ Ｄｒｕｇｓ，８，１４５−６１，Ｇｒａｕｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，１３，５５４−７３，Ｇｏｌｄｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１８，２５２７−３７）。白色物質の変化に関連して正常に見える脳中の領域さえ、神経変性の兆候を示す。従って、軸索病理学および神経変性は多発性硬化症における重要な治療標的である。本発明で
示されるような、ニューロンにおけるそれらの抗−アポトーシス活性を持つＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ、および（神経形成および可塑性を増強することによる）それらのプロ−再生能力は、本明細書中に記載された組成物を多発性硬化症を治療するための新しい療法として用いることができるのを裏付ける。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせることができる。

さらに、多発性硬化症における病理生理学的メカニズムは大脳虚血症における重要なメカニズム、例えば、酸化窒素の関連（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４９，４７０−６）、およびグルタメート刺激毒性の関連（Ｐｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ Ｍｅｄ，６，６７−７０）と重複するこの情報に徴すると、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子は多発性硬化症に対する新規な治療オプションであり、これは、いずれかの特定のメカニズムまたは理論に拘束されるものではないが、炎症を低下させる共通の治療とは反対に直接的にニューロンを保護する。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。

本発明のもう１つの実施形態は、精神分裂症の神経保護治療に関する。精神分裂症における進行性灰色物質喪失の最近の驚くべき証拠がある。この証拠は、新規な磁気共鳴イメージング技術によって主として供された。精神分裂症における神経変性プロセスは分子レベルにおいて理解されていないが、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦでの精神分裂症における神経保護治療はこの病気に対する新規なアプローチである。さらなる実施形態において、ＩＬ−３およびＩＬ−５を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いることができる。

初代ニューロンの保護における、ＧＣＳＦのような造血成長因子の効果をテストするために、ニューロンは以下のようにして調製することができる。Ｅ１８期（胚１８日）の胚から１０ないし１２のラット皮質を調製することができる。組織は、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ）中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて解離させることができる。消化が、４部の培地（神経基礎培地＋１ｍｌ ５０× Ｂ−２７補足物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２５μＭグルタメート）を用いて停止させることができ、８００ｇにおいて室温にて５分間遠心することができる。ペレットを５ｍｌの培地に溶解させ、細胞数をカウンティングによって決定することができる（Ｎｅｕｂａｕｅｒスライド）。ポリ−Ｌ−リシンで被覆することができるカバーグラス上の２４−ウェルプレートのウェル当たり２５００００細胞の密度で細胞を平板培養することができる。次いで、これらのニューロンを、保護刺激物（ＧＣＳＦ）および有害刺激物（グルタメート，１００μＭ）の組合せで処理することができる。グルタメートでの培養の処理に３０分先立ってＧＣＳＦを適用する。対照群をＧＣＳＦ無し（丁度生理食塩水）またはグルタメート無しいずれかで処理する。２４時間後、製造業者の推奨に従い、ＬＤＨアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いてニューロン細胞の死滅を測定することができる。別法として、細胞死滅を誘導するための公知の他の有害刺激物、例えば、ＮＭＤＡおよびグリシン、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）、Ｈ_２Ｏ_２、スタウロスポリン、低酸素症／グルコース枯渇、カリウム除去、ＭＰＰ＋、インターロイキン−１ベータ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド、または細胞およびニューロンに有害であることが知られている他のものを用いることができる。また、異なるアッセイ、例えば、細胞死滅ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、アネキシン／ヨウ化プロピジウム染色、続いてのレーザー−走査サイトメトリー分析（Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ（２００１），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，６３，５１−８７）、コンピューサイト（Ｃｏｍｐｕｃｙｔ
ｅ）（Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＤＡＰＩまたはＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２染色に続いてのアポトーシス特徴を持つ細胞核のカウンティング（凝縮、断片化）、切断−特異的抗体（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａカスパーゼ３抗体）での免疫染色後における活性化されたカスパーゼ３に対して陽性の細胞のカウンティング、または細胞溶解物におけるカスパーゼ３活性についてのアッセイ（例えば、ＡｐｏＯｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ；ウェスタンブロット，Ｅｌｉｓａｓ）、または細胞生存またはアポトーシス特徴を測定するのに適したいずれかの他のアッセイを、細胞死滅または相対的細胞生存性を評価するために用いることができる。別法として、他の細胞、例えば、分化したＰＣ１２細胞、ＨＮ３３細胞、ＳＨＳＹ５細胞、初代海馬ニューロン、初代運動ニューロン、初代感覚神経節細胞、初代中脳培養、ニューロン幹細胞、分化したＥＳ細胞、または当該分野で知られた他のニューロン−様細胞、あるいは１以上のニューロン表現型を呈する細胞を用いることができる。本明細書中において例示した時間および濃度も変化させることができ、例えば、ＧＣＳＦは刺激物と同時に、または該刺激物の前または後に適用することができる。因子（または因子の組合せ）の変化させる濃度、例えば、０．１ないし１００μｇ／ｍｌを用いることもできる。原理的には、このアッセイを、脳スライス培養で用いるのに適合させることもできる。

脳外傷（制御された皮質衝撃）のモデルにおいて、ＧＣＳＦのような造血成長因子の有効性をテストするためには、以下のように行うことができる。実験プロトコルは地方の倫理委員会によって認可することができる。２８０ないし３２０ｇの体重の２０匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ドイツ）を以下の群にランダムに割り当てることができる：Ａ（対照群、ｎ＝１０、外傷脳負傷（ＴＢＩ）、３０分のＴＢＩで開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％での処理）；Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝１０、９０分間の虚血、３０分のＴＢＩで開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％に溶解させた６０μｇ／ｋｇ体重組換えＧ−ＣＳＦ，Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダでの処理）；Ｃ（偽−作用ＧＣＳＦ−処理対照群，ｎ＝１０，偽操作，ＴＢＩから３０分後に開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％に溶解させた６０μｇ／ｋｇ体重組換えＧ−ＣＳＦ，Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダでの処理）。

動物は、１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン塩酸塩（ＷＤＴ，Ｇａｒｂｓｅｎ，ドイツ）の腹腔内注射で麻酔することができる。必要であれば、麻酔は５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持することができる。平均動脈血圧、血中ガス、ヘマトクリット、白血球カウント、および血中グルコースレベルの継続的モニタリングのために、ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを右大腿動脈に挿入することができる。処理注入のために、ＰＥ−５０チューブによって右大腿静脈にカニューレを入れることができる。実験の間、直腸温度をモニターし、サーモスタット制御加熱パッド（Ｆｏｅｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ドイツ）によって３７℃に維持することができる。

ＴＢＩのために、次いで、皮膚をプローブの周りで切断し、頭蓋を露出させ、洗浄することができる。ミクロ透析との適合性について修飾して、間接的な衝撃での重力滴下デバイスを用いてＴＢＩを加えることができる（２．０ｍｍ直径のテフロン（登録商標）点を持つＰＶＣシリンダーへ４０ｃｍから滴下した重量１５０ｇ）。偽操作制御は、外傷なくして、ＴＢＩを受けたラットに対して同じく調製することができる。

全ての動物において、結果は、実験群に対して知らされていない調査者によって、外傷脳負傷後１週間のあいだ毎日行って、死亡率、神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）によって測定することができる。神経学的機能は０ないし１６のスケールでグレード分けすることができる（正常なスコア、０；最大欠乏スコア、１６）。ＮＳＳは運動、感覚、および反射テストの複合であって、ビームバランステストを含む。負傷の重症度スコアにおいて、
１スコア点が、テストを行うことができないことに対し、またはテストした反射が欠如することに対して与えられ；かくして、より高いスコアでは、負傷がより重症である。

ＴＢＩから１週間後にラットをケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し断頭することができる。脳を取り出し、０．１モル／ｌリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定することができる。パラフィン−包埋の後、１−μｍ−厚みの切片を切り出し、Ｈ＆Ｅ染色、Ｎｉｓｓｌ染色および免疫組織化学分析で用いることができる。

免疫組織化学実験は、ミエロペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）、およびＧ−ＣＳＦＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に対する抗血清で行うことができる。抗血清は、各々、単離されたヒト蛋白質で（抗−ミエロペルオキシダーゼ）、またはマウス起源のＧ−ＣＳＦＲのカルボキシ末端をマッピングする合成ペプチドで免疫化されたウサギで作製することができる。抗原検索のためには、Ｇ−ＣＳＦＲ免疫組織化学のために供された切片を、９９℃の１０ｍＭクエン酸緩衝液中で２０分間加熱することができる。次いで、切片を、正常なブタ血清（リン酸緩衝化生理食塩水中１０％）中３０分間、次いで、４℃にて一次抗血清中で一晩インキュベートすることができる。一次抗体は１：１５０（ミエロペルオキシダーゼ）、または１：４００（Ｇ−ＣＳＦＲ）希釈することができる。免疫反応性はアビジンビオチン複合体方法によって可視化することができる（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）。切片は、０．０２％過酸化水素を含む０．０２％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で発色させることができる。反応生成物は、０．０２％塩化コバルトおよび硫酸アンモニウムニッケルの添加によって増強させることができる。ＴＢＩ後のニューロン生存は、Ｇ−ＣＳＦ処理動物および対照の海馬において、顕微鏡（倍率×４０）下でニューロンを定量することによって測定することができる。好中性顆粒球（ＮＧ）の侵入は４点スケールにて半定量的に測定することができる（０＝ＭＰを陰性、１＝低ＭＰを発現、２＝中程度ＭＰを発現、３＝強力なＭＰを発現）。

本明細書中で供された記載は、ＧＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦならびにＩＬ−３およびＩＬ−５がニューロン幹細胞を刺激して、ニューロン細胞型に分化させることができることを示し、これらの４つのサイトカインは神経変性病を治療するのにおいて価値がある。病理学的メカニズムとは独立して、患者のニューロン損傷ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦでの処置は、脳中の幹細胞の新しいニューロンへの分化を誘導する。これらの新生ニューロンは失われた機能を回復し、最後には、患者の（少なくとも部分的な）回復に導く。

多発性硬化症では、いくつかのサイトカインが脳においてアップレギュレートされることが示されている（Ｂａｒａｎｚｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６５，６５７６−８２）。多発性硬化症（ＭＳ）は重要な神経変性成分を有するということが明らかとなった。増大する数の報告は、ＭＳ患者におけるニューロンおよび軸索損傷、およびＭＳの動物モデルにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を示す。この神経変性の背後にあるメカニズムは未知であるが、証拠は免疫−媒介損傷を示唆する（Ｇｉｕｌｉａｎｉ ａｎｄ Ｗｏｎｇ（２００３），Ｉｎｔ ＭＳ Ｊ，１０，１２２−３０）。これらのデータは、造血因子の作用様式が、依然として、免疫−媒介されることを示す。

これとは対照的に、本発明の１つの実施形態においては、造血因子の直接的作用はニューロンまたはニューロン幹細胞に直接的であり、造血因子はＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５である。有益な効果が、ニューロンおよび軸索損傷に対する予防、および／または新しいニューロンの形成による損傷からの回復を予防し／治療し／提供することによって与えられる。

ハンチントン病（ＨＤ）は破壊的な遺伝的障害である。効果的な療法が存在しないにもかかわらず、この病気で起こるニューロン死滅を減少させ、または妨げることを狙った治療戦略を開発することに対して興味が爆発してきた。大部分において、神経保護戦略における更新された興味が、ＨＤの基礎となる神経病理学を駆動する遺伝子的および分子的事象の我々の増大する理解によって拍車がかけられた（Ｅｍｅｒｉｃｈ（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，１，４６７−７９）。

細胞死滅がミトコンドリア経路を通じて媒介され、ミトコンドリア欠乏が共通してＨＤに関連するという証拠がＨＤにある。Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．は、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、親水性胆汁酸での治療が、ＨＤの３−ニトロプロピオン酸ラットモデルにおいて、神経病理学および関連する挙動欠陥を妨げたことを従前に報告している。彼らは、ＴＵＤＣＡが、ＨＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて神経を保護し、従って、ＨＤを持つ患者において新規かつ有効な治療を提供することができる非毒性の内因的に生産された親水性胆汁酸であることを示す（Ｋｅｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９，１０６７１−６）。

ＨＤを治療するための他のアプローチは、（ＢＮ８２４５１（Ｋｌｉｖｅｎｙｉ，ｅｔ
ａｌ．（２００３），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８６，２６７−７２）のような）新規な抗酸化剤、大脳内に送達された神経向性因子（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９３，７３４６−５１）；（Ｐｅｒｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７５，２１９０−９）、抗グルタミン作動性薬物の使用（Ｋｉｅｂｕｒｔｚ（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ，５５，９７−１０２）、またはカスパーゼ阻害剤の使用（Ｔｏｕｌｍｏｎｄ，ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１４１，６８９−９７）を含む。

これらの可能性の全ては、ＨＤが神経変性障害であり、ここに、遺伝的検出が神経保護に対する明瞭かつ確実な機会を提供する意味において強調されている（Ｅｍｅｒｉｃｈ（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，１，４６７−７９）。

他の神経変性トリヌクレオチド障害もまた、運動、感覚、または認識系におけるニューロンの選択的かつ対称的喪失によって特徴付けられる。神経保護戦略は全てのこれらの病気に対するチャンスである。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ ＩＬ−３および／またはＩＬ−５の神経保護活性を薬理学的に用いて、ＨＤのような神経変性トリヌクレオチド障害を治療し、または兆候が発生するのを防止さえできる。

現在、緑内障は視覚神経障害として認識されている。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の選択的死滅は緑内障のホールマークであり、これも、視神経頭部における構造的変化に関連付けられている。ＲＧＣ死滅のプロセスは二相であると考えられている：損傷の開始を担う一次負傷、続いての、変性細胞を囲う有害な環境に関連するより遅い二次的変性。例えば、網膜虚血症は、最終的には、細胞の死滅をもたらす変化のカスケードを確立することができ；低酸素症はグルタメート（ｇｕｌｔａｍａｔｅ）の刺激毒性レベルに至り、これは細胞内カルシウムの上昇を引き起こし、これは、今度は、アポトーシスまたは壊死によるニューロン死滅に至る。神経保護は、初期の負傷の間に節約されたが、依然として、損傷を受けやすい細胞を維持しようと試みるプロセスである（Ｋａｕｓｈｉｋ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊ Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ，４９，９０−５）。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５またはＩＬ−３のような造血因子は、死滅からＲＧＣを保護する能力を有し、従って、緑内障の進行を阻止するにおいて少なくとも大いに使用されるであろう。

１つの実施形態において、緑内障を治療するための成長因子は造血因子、例えば、Ｇ−
ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５である。本発明のもう１つの実施形態において、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のような造血成長因子を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、緑内障を治療し、および／または予防的神経保護療法を供することができる。

神経障害疼痛の病理生理学に対して、豊富な理論および多数の動物モデルが存在する。ほとんどの研究は、軸索に対して直接的損傷を引き起こす一次プロセスがあると結論している。その後、曖昧となる。ほとんどの普通の仮定は、軸索損傷が局所的かつ遠位炎症応答を引き起こすと述べている。これらの炎症反応、増大したナトリウムフラックスでのその軸索における神経の過剰興奮性に導き、疼痛の感覚を生じさせる。加えて、疼痛経路のアップレギュレーションは、神経節後根において、脊髄の膠様質において増大した疼痛感覚に至る。最近まで、神経病理学的疼痛を持つ患者は限定された有効な治療オプションしか有しなかった。

歴史的には、治療オプションは多数の副作用（すなわち、ＴＣＡおよびテグレトール）または効果的でない養生法（ＴＥＮＳユニット、ＳＳＲＩ（すなわち、Ｐｒｏｚａｃ，Ｚｏｌｏｆｔ））を伴う効果的な薬物に限定されていた。それらの温和な副作用プロフィールおよび全体的有効性に基づき、より新しい抗−癲癇薬物（ＡＥＤ）は神経病理学的疼痛の治療用の第１線の剤としてＴＣＡおよびより古いＡＥＤに取って代わった（Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ（１９９８），Ｃｌｅｖｅ Ｃｌｉｎ Ｊ Ｍｅｄ，６５ Ｓｕｐｐｌ １，ＳＩ２１−９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ＳＩ４５−７）。

新しい療法はより新しいＡＥＤ、クモ膜下腔内ステロイドでのＮＭＤＡアンタゴニストまたは予防的尺度使用、または神経再生を含む。神経成長因子での神経再生を通じての末梢神経損傷の逆行は、神経障害を治療するための１つの記号である（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ
ａｎｄ Ｖｉｎｉｋ（２００３），Ｅｘｐ Ｄｉａｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓ，４，２７１−８５）。

１つの実施形態において、末梢神経障害を治療するための成長因子は造血因子；例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５である。本発明のもう１つの実施形態において、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のような造血成長因子を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、末梢神経障害を治療し、および／または、例えば、糖尿病患者、またはヘルペスに感染した患者における予防神経保護療法を提供することができる。

末梢神経障害の原因は多様であるが、末梢神経障害における病理生理学的メカニズムは、しばしば、大脳虚血症における重要なメカニズム、例えば、酸化窒素の関与（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４９，４７０−６）、およびグルタメート（ｇｕｌｔａｍａｔｅ）刺激傷害性の関与（Ｐｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ Ｍｅｄ，６，６７−７０）と重複する。この情報に徴すると、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のような造血成長因子は、末梢神経障害および炎症性脳障害についての新規な治療オプションである。

リソソーム貯蔵病は、通常は糖蛋白質、糖脂質またはムコ多糖（ＭＰＳ）を分解する特異的なリソソーム酵素の欠乏に由来する。分解されない場合、これらの物質はリソソームに蓄積され、結局は、細胞がそれが生きている器官を損ない損傷するようにする。

酵素置換療法は、現実には、リソソーム貯蔵病における主要療法である。ムコ多糖ＶＩＩ（ＭＰＳ ＶＩＩ）のネズミモデルにおける散在性中枢神経系（ＣＮＳ）変化、ベータ
−グルクロニダーゼ遺伝子における遺伝的欠陥によって引き起こされたリソソーム貯蔵病の治療における神経幹細胞（ＮＳＣ）。ＮＳＣはヒトリソソーム貯蔵病における散在性ＣＮＳ病巣の治療用の有用な遺伝子導入ビークルとして働き、神経学的障害に罹った患者の治療において潜在的に適応できる（Ｍｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ，７４，２６６−７７）。

早期移植は、広範な中枢神経系負傷が明らかとなる前に酵素置換が起こり得るような目標である（Ｍａｌａｔａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ，２９，３９１−４０３）。造血因子は、神経保護を関連する神経細胞に供することによって支持できる。加えて、神経形成の誘導によって、それは患者が少なくとも部分的に回復するのを助けるであろう。

１つの実施形態において、神経学的および／または精神病学的疾患を治療するための成長因子は造血因子；例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５である。本発明のもう１つの実施形態において、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のような造血成長因子を、単独で、相互に組み合わせて、および／または１以上のさらなる因子と組み合わせて用いて、神経学的および／または精神病学的疾患を治療することができる。

１つの実施形態において、造血因子は、酵素置換療法、例えば、幹細胞移植またはベクター媒介遺伝子導入と組み合わせて与えられる。

脊髄負傷（ＳＣＩ）は、その人生の間にわたって１，０００人の個人において約１人が永久的なハンディキャップを負うであろう。多くの努力が、負傷後に発症する複雑な細胞変化に対して、および自然発生再生のための成人脊髄の貧弱な能力を克服するための発明的方法に払われてきた。損傷した組織内のプログラムされた細胞死滅は、これらの変化の１つである。いくつかの細胞は、ＳＣＩ後まもなくアポトーシスを受ける。発作のような神経変性病の他のモデルにおけるようにいくつかの細胞は負傷後間もなくアポトーシスを受ける。ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５のような造血因子は、ＳＣＩ後に細胞が死滅するのを妨げるのに有益であり得る。造血因子の適応は局所的、または全身的であり得る。

他方、幹細胞を移植する第１の実験は、ＳＣＩからの回復のために有益である点で有望である（Ｇｏｒｉｏ，ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２５，１７９−８９）。造血因子は、病変部位への移植に先立って幹細胞を処理して、発生をニューロン表現型に向けることによって有用であり得る。

脊髄負傷のモデルにおける造血因子の効力をテストするために、サイトカインは以下のように検定することができる：ＳＣＩは、年齢（平均７５日齢）および体重（平均２４ｇ）に全てマッチしたＣ５７ＢＬ−６バックグラウンドにて雌野生型または老齢のマウスで行うことができる。髄骨レベルＴｈ８／９での髄弓切除術の後に、背側脊髄を微細な虹彩切除術ハサミで対称的に傷害を与える。静脈内注射によってマウスをＧＣＳＦで１回手術後処理し、ゲンタマイシン（０．２ｍｇ／ｍｌにおいて５ｍｌ／ｋｇ）で１日１回７日間処理する。自律膀胱機能の回復まで、それらの膀胱を１日１回手で空にした。ＢＢＢ運動を用いる負傷、グリッド−歩行テストおよび水泳スコアの後に動物の全体的運動性能を１ないし４週間評価した。

同様に、テスト物質はＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５であり得る。テスト物質の適用は、病巣部位における単一または反復付着、手術により取り付けたポンプによる一定注射、皮下注射、経口投与によって、あるいは坐薬として行うことができる。開放−野ま
たは運動活性、ロータロッド性能などのような他の運動性能アッセイは、リードアウトとしてやはり有用であり得る。

また、細胞を負傷の部位に移植することができ、それより、細胞は、造血因子での処理後の幹細胞、または造血因子を発現し、放出する細胞であり得る。

ヒトの保護において、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５のような造血成長因子の有効性をテストするためには、例えば、神経芽腫細胞（ＳＨＳＹ５−Ｙ）を本明細書中に記載したように調製することができる。

ニューロンまたはニューロン様細胞（例えば、初代ニューロン細胞、初代ニューロン培養細胞、ＳＨＳＹ５−Ｙ、ＰＣ−１２等）の保護において、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５のような造血成長因子の有効性をテストするもう１つの方法は、ＦＡＣＳ分析によってなすことができる。細胞は以下のように調製することができる：２００，０００初代ニューロン細胞を、ポリ−Ｌ−リシン被覆２４−ウェルプレートに撒く。２週間の培養の後に、細胞を０．５μＭスタウロスポリンおよびＧＣＳＦで処理する。１６時間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシンで収穫し、単一細胞懸濁液をアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ（例えば、ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）染色することができる。細胞をフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって分析することができ、それにより、アネキシンＶは初期およびＰＩ後期アポトーシス細胞を検出する。同様な細胞を、ＮＯＲ３、カンプトテシン、Ｈ２Ｏ２、ＦＡＳ−リガンド等のようなもう１つのストレッサーで処理することができる。アッセイのもう１つの修飾は、造血因子（例えば、ＧＣＳＦの代わりのＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５）を交換し、あるいはその組合せを用いることであろう。同様な誘導体を神経保護における効率についてテストすることができる。また、検出方法をもう１つのアポトーシス−マーカに変化させることができ、例えば、ＴＵＮＥＬ−染色を行うことができるか、あるいは蛍光標識された市販の抗体（例えば、活性化されたカスパーゼ−３、切断されたＰＡＲＰ等）によってアポトーシスのマーカ蛋白質を検出することができる。

統計学的解析
値は平均±ＳＤとして表す。全てのデータを獲得した後、ランダム化コードを解除することができる。ＡＮＯＶＡおよび引き続いてのポストｈｏｃ Ｆｉｓｈｅｒ保護最小有意差検定を用いて、生理学的パラメータのような連続変数の差の統計学的有意性を決定した。ｔ−検定は、ニューロン損傷および免疫組織化学データの比較のために用いることができる。マン−ホイットニーＵ検定は、死亡率およびＭＰＯ免疫組織化学のような非パラメータデータのために行うことができる。Ａｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられる。

ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のような造血因子の効果、およびニューロン細胞上の同族体受容体に拮抗する効果に基づいて、本発明のもう１つの実施形態は、癌性細胞上のＧＭＣＳＦおよび／またはＧＣＳＦ受容体に拮抗することによって、脳腫瘍または他の神経学的癌を治療することである。

ニューロン幹細胞
最近、神経学的病気を治療するための新しい神経細胞を形成する（神経形成）重要性が認識されている。多くの他の組織とは異なり、成熟した脳は制限された再生能力を有し、細胞の特殊化の異常な程度は、残存する健康な組織が損傷した脳の機能を取り得る程度を制限する。しかしながら、大脳ニューロンは成人の脳に常に存在する前駆体細胞に由来し、従って、成人脳における内因性神経前駆体の刺激は治療能力を有する。

神経形成は、側脳室の吻脳室下帯（ＳＶＺ）および歯状回（ＤＧ）のやや顆粒状帯（ＳＧＺ）を含めた成人脳の区別される領域で起こる。神経形成は、特に、特定の神経学的判例（例えば、大脳虚血症（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，４７１０−５，Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｓｔｒｏｋｅ，３２，１２０１−７，Ｋｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．，１３６，３１３−２０，Ｐｅｒｆｉｌｉｅｖａ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，２１，２１１−７））後に成体動物で起こる。また、神経形成はヒトにおいても示されており（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔ Ｍｅｄ，４，１３１３−７．）、事実、機能的ニューロンに導く（ｖａｎ Ｐｒａａｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１５，１０３０−４）。特に、歯状回のやや顆粒状帯、および門は成人の一生の間に新しいニューロンを生じる能力を有する（Ｇａｇｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，３６，２４９−６６）。ＧＣＳＦ受容体がこの領域で発現されるのは驚くべきことである（図４ａ，ｄ）。ＧＣＳＦ処理後の機能的結果の改善を示す驚くべきデータ（図８）、およびＧＣＳＦがもう１つの系（造血）において幹細胞因子であるという事実と一緒に考え合わすと、ＧＣＳＦは、その作用の一部、特に、少なくとも歯状回における成人幹細胞に対するその刺激機能を介して観察される長期効果（図８）を発揮すると予測される。

これは、ラットからの歯状回を含む海馬領域から単離された、成人ニューロン幹細胞上のＧＣＳＦ受容体の存在を示すことによって、本出願において確認される（図１２および１３）。神経形成における重要性は、神経変性病、およびニューロンが死滅する全ての疾患の全ての局面におけるＧＣＳＦ処理の適用性および有用性に対するもう１つの理由を提供する。神経学的疾患の治療のための脳中の内因性幹細胞への作用とは対称的に、ＧＣＳＦは幹細胞のイン・ビトロ操作、例えば、分化および増殖に適用することができる。ヒトにおける幹細胞療法は、現在、多数の病気、特に、パーキンソン病および発作において探求されつつある。特別なタイプの神経細胞、例えば、パーキンソン病の治療のためのドーパミン作動性細胞へと、培養中の幹細胞を分化させるのが望ましい。次いで、分化した、またはそうでなければ新しい環境に対して適合した細胞を、種々の経路を介して生物に投与する。パーキンソン病において、例えば、幹細胞は直接的に脳に注射して、黒質中のドーパミン作動性ニューロンの喪失を置き換えてきた（“ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ”）（Ａｒｅｎａｓ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ，５７，７９５−８０８，Ｂａｒｋｅｒ（２００２），Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１７，２３３−４１）。

従って、本発明の１つの実施形態は、造血成長因子およびその誘導体を用い、哺乳動物への移植に先立って、ニューロン幹細胞またはプレ条件ニューロン幹細胞の成長および分化を刺激することである。この方法のさらなる実施形態は、本明細書中に記載された神経学的病気を治療するための方法において、好ましくは、ニューロン幹細胞を個体に投与する場合、神経保護効果を供する方法において、これらのニューロン幹細胞を利用することである。

１つの実施形態において、幹細胞を静脈内または動脈内投与することができる。例えば、大脳虚血症または外傷脳負傷においては、静脈内注射された骨髄間質細胞は脳中の領域を標的とする方法がある（Ｍａｈｍｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，４９，１１９６−２０３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １２０３−４，Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１８，８１３−９，Ｌｕ，ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１１，２７５−８１，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５９，５１４−２３）。かくして、幹
細胞はイン・ビトロにてＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ、または他の造血因子によって処理することができ、次いで、異なる経路を介して、本明細書中に記載された病気のいずれかを持つ患者に注射することができる。

本発明の１つの実施形態において、移植される幹細胞は、分泌される因子を発現し、および隣接細胞の生存を増強させ、あるいは成人内因性幹細胞の増殖および／または分化を増加させるように導くように遺伝的に設計される。例えば、幹細胞は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、および／またはＩＬ３および／またはＩＬ５のような１以上のさらなる造血因子を安定に発現するように設計することができ；次いで、中枢神経系に送達して、定常的に、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ、あるいは造血因子を局所的環境に分泌させることができる。幹細胞はＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、および／または他の造血因子受容体アゴニストで処理することができる。用いることができる幹細胞は、不滅化幹細胞（例えば、癌遺伝子不滅化）、ニューロスフィア、および胚性幹細胞（ＥＳ）−由来神経細胞（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（２００２），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，３８１−４０７）を含むが、骨髄間質細胞、または臍帯細胞のような細胞を含むこともできる（Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１１，２７５−８１，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５９，５１４−２３）。種々のタイプの幹細胞の移植は、パーキンソン病（Ｉｓａｃｓｏｎ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ，５７，８３９−４６）および発作（Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，９，２２５−３０）。

幹細胞、例えば、ヒトニューロン幹細胞は、移植に先立って、それらを条件付けする因子で処理することができる。条件付け因子の１つの例は成長因子である。条件付けの１つの実施例は、所望の細胞、例えば、ニューロンの指令においてそれらを分化させることである（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，９，４９９−５１３）。幹細胞上のＧＣＳＦ受容体の存在は、これらの細胞を条件付けするためのこの受容体に対するアゴニストの重要性を示す。成人ニューロン幹細胞を異なる濃度のＧＣＳＦ、または他のＧＣＳＦ受容体アゴニストで処理し、定量的ＰＣＲアプローチによって、例えば、ニューロン幹細胞のマーカ（ネスチン）と比較したニューロンマーカ（Ｍａｐ２、ＮＳＥ（ニューロン−特異的エノラーゼ）、ニューロフィラメント、ＮｅｕＮ）の比率を定量することによって、増大した分化能力についてアッセイすることができる。処理後の増大した比率は、ニューロン系統に向けての幹細胞の増大した分化のシグナルを発する。適した濃度および時間ウィンドウを用いて、神経学的病気のための移植に先立って幹細胞を処理することができる。

本発明のもう１つの実施形態において、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、その誘導体ならびにＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ受容体アゴニストを用いて、例えば、神経幹細胞のような神経細胞の培養を容易とすることができる。この方法においては、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、その誘導体ならびにＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ受容体アゴニストを培地に加え、予め混合し、その後、細胞に加えることができるか、あるいは細胞を培養している培地に加えることができる。この方法のもう１つの実施形態において、神経細胞を、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、およびその誘導体をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトし、これは、トランスフェクトされた場合に、細胞において各因子を発現する。

本出願においては、我々は、加えて、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが、ニューロン幹細胞の、細胞のニューロン表現型に向けての分化をトリガーすることを示す。重要性は、神経変性病、およびニューロンが死滅する全ての疾患の全ての局面における、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦ処理の適用性および有用性に対するもう１つの理由を提供する。神経学的疾患の治療のための脳中の内因性幹細胞への作用とは対称的にＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦを、幹細胞のイン・ビトロ操作、例えば、分化および増殖に適用することができる。

神経形成幹細胞をトリガーするにおける造血因子またはその組合せの効率をテストするためには、以下のように細胞を調製することができる：成人神経細胞幹細胞を発生させ、培養する。細胞を４００万細胞の密度にて１５ｃｍ^２培養フラスコ中で平板培養し、１００ｎｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦで１回処理する。刺激から４日後に抗体染色およびＦＡＣＳ−分析のために細胞を収穫する。単一細胞懸濁液は、ニューロスフィアを粉砕することによって作成し、次いで、遠心によって細胞をペレット化する。１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再度懸濁させた後、同一容量の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を加えることによって細胞を固定する。細胞を氷上で１５分間インキュベートし、１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳに溶解させた０．２％ ｔｗｅｅｎ２０への再懸濁させることによって浸透化させる。１５分間の氷上でのインキュベーションの後、ブロッキングのために、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を１：５０希釈にて加える。初代抗体として、抗−ＭＡＰ２抗体を用いて１：１００希釈にて加えることができる。細胞を氷上で２時間インキュベートし、１×ＰＢＳ中の０．１％ ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド二次抗体との氷上での３０分間のインキュベーションの後、細胞を１×ＰＢＳ中の０．１％ ｔｗｅｅｎ２０で再度３回洗浄し、最後に、ＦＡＣＳ分析のために１×ＰＢＳに再度懸濁させる。細胞のフローサイトメトリーはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行うことができる。光の前方および右角度（側）散乱によって、および適切なフィルター系を通じてのＦＩＴＣ蛍光のために細胞を分析することができる。ＦＩＴＣ、例えば、ＭＡＰ２、陽性細胞の数は、ニューロン様表現型を発生した幹細胞の数を与える。

同様な細胞を、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５またはその組合せのようなもう１つの造血因子で刺激することができる。

ＩＬ−３およびＩＬ−５は幹細胞においての神経形成を誘導する能力を有する。造血因子で幹細胞を処理するための記載された方法はＩＬ−３およびＩＬ−５でも当てはまる。投与／処方／用量
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および他の因子、誘導体、遺伝子、およびその組み合わせは、限定されるものではないが、液状溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、坐薬、ポリマーマイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、および注射または注入溶液を含む種々の投与形態にて投与することができる。好ましい形態は、投与の様式および治療的適用に依存する。

組成物は、使用前に滅菌注射培地に溶解させることができる液体、スラリー、または滅菌固体の形態とすることができる。非経口投与は好ましくは静脈内である。この注射はシリンジまたは匹敵する手段を介することができる。これは医薬上許容される担体を含有することができる。別法として、例えば、Ｇ−ＣＳＦを含有する組成物は、粘膜経路を介して、適当な用量にて、および液体形態で投与することができる。経口投与では、例えば、Ｇ−ＣＳＦを含有する組成物は、適当な担体と共に液体または固体形態で投与することができる。

治療すべき哺乳動物は、例えば、モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジ、サルまたはチンパンジーであり得る。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。同様に、１つの実施形態において、療法または予防で用いられるＧＣＳＦ ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭＣＳＦのような造血因子はヒト因子であるか、あるいはヒト源に由来する。

因子が単独でまたは組み合わされて用いる場合に、神経学的病気を治療する方法で用いる造血因子の治療上有効量は、神経保護効果をもたらす量である。そのような量は因子当
たり、または組み合わせとして約１００ｎｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる、年齢、人種、性別、および個々の患者に基づく他の因子に基づいて決定することができる。例えば、本発明の方法で用いられるＧＣＳＦの量は約５ないし約６０μｇ／ｋｇ、およびＧＭＣＳＦでは約５ないし約７５０μｇ／ｋｇ体重であろう。同様に、ＩＬ−３、またはＩＬ−３ミメティック、ＩＬ−５、またはＩＬ−５−ミメティックを、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦについて記載された所与の用量および処方で投与することができ、例えば、治療上有効量のＩＬ−３またはＩＬ−５は約１ないし約１０００μｇ／ｋｇ体重とすることができる。因子を組み合わせて投与する場合、それらは投与に先立って予め混合し、同時に投与し、あるいは直列に単独で投与することができる。

本明細書中に記載された神経学的疾患を治療するある実施形態において、より高い用量の本明細書中に記載されたＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３，ＩＬ−５および／または他の因子は特に有用であり、例えば、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、または少なくとも３ｍｇを用いることができ、約１ないし３ｍｇの範囲が好ましい。これらのより高い用量は、便宜には、現在利用可能なパッケージングユニットを用いることによって成人患者で達成することができない。従って、１つの実施形態において、本発明は、本明細書中の記載に従った神経保護の目的で、例えば、静脈内または皮下投与することができる、特に、２０ないし２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲の用量のパッケージを提供する。高用量組成物の送達でいうようなパッケージドユニットの実施例は、例えば、１．０ｍｌまたは２．０ｍｌの充填容量にて、０．７５ないし２５ｍｇのＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または他の因子を含有する単一使用バイアルおよびプレフィルシリンジを含む。好ましい実施形態においては、パッケージドユニットは、そこに含有された組成物の送達用の、標識または別々の印刷材料上に指示書も含有するであろう。

また、患者の体重に従った各個々の患者のための正確かつ迅速な用量を可能とする、ｋｇ／体重スケールでキャリブレートした、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中記載の他の因子の投与用のプレフィルシリンジも好ましい。これらのパッケージングユニットは、緊急な状況下で、例えば、患者が負傷後に非常に迅速に治療されなければならない発作の場合に非常に有用である。従って、本発明のもう１つの実施形態は、負傷が起こった後短時間で本明細書中に記載された１以上の組成物を投与することによって、例えば、発作または他の神経外傷事象に罹った患者において神経保護を供することである。別の実施形態において、プレフィルシリンジのような本明細書中に記載された組成物は、負傷が負傷後短時間に特に限定されない後のいずれかの時点で投与し／用いることもできる。

この実施形態の意味で用いる場合、「負傷後短時間」は、負傷または負傷を引き起こす事象の発生後約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分または約１時間までさえ内を意味する。組成物は、医学専門家あるいはいくつかの場合には、適当な用量の因子を含有するパッケージングユニットにアクセスできる非−医学専門家によって投与され得る。救急車の技術者、看護士、医師等のような医学専門家の場合には、投与は、例えば、発作のような神経外傷に患者が罹った場所において、救急車または病院（または他の医療施設）に輸送されつつある他の乗り物中で、または救急室におけるように病院において行うことができる。理論に拘束されるものではないが、負傷後短時間以内に、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５のような１以上の造血因子および／または本明細書中に記載した他の因子を含有する組成物の投与において、より大きな神経保護効果を達成することができる。

もう１つの実施形態において、本発明は、（例えば、Ｅｄｉｔｈ Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ；（Ｅｄ．），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｌｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ｖｏｌ．２，ｐｐ．８９６
−９２０，１９９９に記載された）移植されたミニ−ポンプ、好ましくは移植された皮下とすることができる遅延放出および一定長期間適用に特に適したデバイスも提供する。そのようなポンプはインスリン療法で有用であることが知られている。そのようなポンプの例は、Ａｎｉｍａｓ，Ｄａｎａ Ｄｉａｂｅｃａｒｅ，Ｄｉｌｔｅｃ Ｃｏｚｍ，Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，およびＮｉｐｒｏ Ａｍｉｇｏによって製造された／配布されたもの、ならびに、例えば、その関連内容をここに引用して援用する米国特許第５４７４５５２号；第６５５８３４５号；第６１２２５３６号；第５４９２５３４号；および第６５５１２７６号に記載されたものを含む。

また、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の因子の内因性血清レベルを測定し、これに基づき、年齢および体重を考慮して、（例えば、Ｒｅｎａｒｄ Ｅ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；２（６）：７０８−１６に記載されたように）薬物の適当な量を計算し、注射するデバイスも提供する。これは、例えば、前記したミニ−ポンプを用いることによって慢性ベースで、または急性ベースで行うことができる。そのようなデバイスの例は、インスリン療法のために、会社Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ｍｉｎｉｍｅｔ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＭｉｎｉＭｅｄ，１８０００ Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡ ９１３２５−１２１９）によって生産される。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の因子の血清レベルを測定する方法は、例えば、その関連開示をここに引用して援用する、米国特許第６，６３０，３５８号；第６，５３７，７４９号；および第６，４７５，８０９号に記載された蛋白質チップまたはアレイを用いて達成することができる。

ポンプを用いる、および／またはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の因子の血清レベル検出とカップリングさせた薬物送達の前記実施形態は、慢性神経変性病、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症その他の治療で特に有用である。

投与の経路は、例えば、経口、皮下、経皮、皮内、直腸、膣、筋肉内、静脈内、動脈内、脳への直接的注射、および非経口を含めた典型的な経路を含むことができる。加えて、いくつかの状況において、肺投与、例えば、肺スプレイおよび他の吸入形態は有用であろう。

肺スプレイに加えて、（例えば、鼻スプレイによる）鼻腔内（ＩＮ）送達は、神経学的／精神病学的疾患のための本発明の組成物を送達する好ましい適用様式である。鼻腔内送達は、蛋白質およびペプチドの適用様式として働くのによく適しており、特に、長期治療のために用いるのは非常に便利である。ペプチドまたは蛋白質を脳に適用するための鼻腔内送達（鼻スプレイ）の使用の例は：（Ｌｙｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｏｖａｓ（２００２），Ｂｏｎｅ，３０，７１Ｓ−７４Ｓ，Ｄｈｉｌｌｏ ａｎｄ Ｂｌｏｏｍ（２００１），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１，６５１−５，Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ
Ｆｒｅｙ（２００１），Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，４０，９０７−４６，Ｔｉｒｕｃｈｅｒａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，１，４９−６６，Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５３，４０５−９，Ｌｅｍｅｒｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２３，９９１−１０００，Ｌａｗｒｅｎｃｅ（２００２），Ｌａｎｃｅｔ，３５９，１６７４，Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，３０８，９１−４）に見出すことができる。鼻腔内適用では、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物は、溶媒、洗剤、および鼻血管を広げ、灌流を増加させる等を行う薬物のような、鼻上皮の浸透、または血管への送達を増加させる物質と組み合わせることができる。

投与の様式に基づき、かつ関連する重要な薬物動態学を考慮して、用量は、例えば、用量がより低いであろう脳への直接的注射のためにさらに修飾することができ、該量はＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物の局所的利用性に基づいて、絶対用量に特定されるであろう（例えば、５μｇの合計用量）。好ましくは、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物は静脈内、皮下、または浸透圧ポンプで行うことができる直接的大脳内注射によって投与される。

もう１つの実施形態において、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の成分を、これらの因子をコードする１以上の核酸を投与することによって個体に供する。コーディング配列核酸は、好ましくは、ウィルスベクターのような組換えベクターの形態で投与される。適当なベクターおよび発現制御配列ならびにベクター構築の選択が知られている。ウィルスベクターの例はアデノウィルス（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（２）：１２９−１４０（１９９６）；Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（７）：２５８１−２５８４（１９９２）；およびＲａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６１（６４１３）：６４７−６５０（１９９３））、アデノ−関連ウィルスベクター（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（５）：４７０−４７５（１９９８））、レトロウィルスベクター（Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（５）：４４８−４５３（１９９９））、単純疱疹ウィルスベクター（Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｇｅｎｅ ２６４（１）：１−９（２００１））、レンチウィルスベクター、シンドビスウィルスベクター、またはセムリキフォレストウィルスベクターを含む。また、適当なベクターは、神経細胞に付着するであろう蛋白質、例えば、ウィルスエピトープを含有するリポソームでもあり、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の因子をコードする核酸、または蛋白質、またはオリゴヌクレオチドいずれかを含有する。そのような導入系の例はＨＶＪ−リポソーム（Ｋａｎｅｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，６，２１９−２６．Ｋａｎｅｄａ（１９９９），Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，１６，１１９−２２）である。好ましくは、該蛋白質またはポリペプチドをコードし、それを発現する単離され精製された核酸は、神経細胞での発現に適したプロモータに操作可能に連結される。これらおよび他の適当なベクターはＫａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：３３−４０（２００１）；Ｓｏｍｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １：９１−９９（２０００）；およびＶａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ８：１３５−１４８（１９９８）。

単離され精製された核酸への操作可能な連結用の適当なプロモータは当該分野で知られている。好ましくは、ポリペプチドをコードする単離され精製された核酸は、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：２８５５−２８６４（１９８６））、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、テトラサイクリン／デオキシサイクリン−調節可能プロモータ（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２））よりなる群から選択されるプロモータに操作可能に連結される。

一般には、本発明ベクターの効果的な導入を確保するためには、与えられた投与経路を考慮して接触させるべき細胞の概略数に基づいて、ベクターの約１ないし約５，０００コピーを細胞当たりで使用する。約３から約３００ｐｆｕが各細胞に入るのが好ましい。これらのウィルスの量は、イン・ビトロまたはイン・ビボであるかを問わず、必要性および使用に従って変化させることができる。現実の用量およびスケジュールは、組成物を他の
組成物、例えば、医薬組成物と組み合わせて投与するか否かに応じて、あるいは薬物動態学、薬物の性質および代謝の個々の差に応じてやはり変化させることができる。同様に、量は、細胞の特定のタイプ、またはベクターを導入する手段に応じてイン・ビトロ適用で変化させることができる。

前記した蛋白質またはその誘導体、物質または核酸は、当該分野で入手可能な標準的な手法に従って、医学的目的で処方することができ、例えば、医薬上許容される担体（または賦形剤）を加えることができる。担体または賦形剤は固体、半固体、または液体材料であり、これは、有効成分のためのビークルまたは培地として働くことができる。適当な形態および投与の形態は、選択された産物の特定の特徴、治療すべき病気または疾患、病気または疾患の段階、および他の関連する状況に応じて選択することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））。医薬上許容される担体または賦形剤の割合および性質は、選択された投与経路、および標準的な製薬プラクティスにより選択された物質の溶解度および化学的特性によって決定される。医薬製剤は経口、非経口または局所使用に適合させることができ、錠剤、カプセル、坐薬、溶液、懸濁液等の形態で患者に投与することができる。本発明の成長因子、その誘導体、その核酸コーディング配列は、それ自体効果的であるが、安定性結晶化の便宜性、増大した溶解度等の目的で酸付加塩または塩基付加塩のような医薬上許容される塩として処方され、投与される。

いくつかの神経学的病気では、特に、虚血性病気においては、有効な療法を該療法の開始を遅らせないようにするのが非常に重要である。好ましい実施形態においては、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物、またはＳＴＡＴ蛋白質を活性化する物質、あるいはＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３および／またはＩＬ−５受容体に対するアゴニストを、血管の閉塞、または神経学的兆候の開始、あるいは虚血性事象の他の検出された開始から２４時間以内に、好ましくは１０時間以内に、最も好ましくは３ないし６時間以内に投与する方法に関する。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物もまた長期機能的改良のための有益な効果を有するので、治療は、虚血性負傷もまた可能である後に考えられる時点で開始する（例えば、負傷後１日ないし７日）。治療は、我々の長期皮質梗塞モデルで観察された機能的改良と類似して患者の機能的回復を改良する手段として、虚血性事象後数日間および数週間継続することができる（図８参照）。治療は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物、または関連因子の定常トラフレベルに到達するための１日当たり数回の用量（例えば、短い静脈内注入）よりなることができる。治療は、定常血清レベルを保証するための、（例えば、パーフューザーユニットによる）記載された物質の連続的遅延注入を含むこともできる。

パーキンソン病、または筋萎縮性側索硬化症のような慢性神経変性プロセスの場合には治療は、最もありそうには、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物、または関連因子の毎日の１回用量よりなり、好ましくは、遅延放出処方、あるいはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５および／または本明細書中に記載された他の組成物、または関連因子のより安定な組成物を用いる。

神経細胞上のＧＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合する神経保護物質についてのスクリーニング
本発明を実施するためには、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの誘導体（例えば、ＧＣＳＦ−またはＧＭＣＳＦ−ミメティック）、および／またはニューロンを保護するその能力を保有し、また、白血球に対して減少した作用を有し、それにより、潜在的有害効果を低下させる
他の造血因子が好ましい。従って、本発明の１つの実施形態は、神経細胞上のＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合し、本出願で記載されたＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦで観察された神経保護効果を刺激する化合物についてスクリーニングすることである。

ＧＣＳＦの誘導体、例えば、ＧＣＳＦ−ミメティックは、実施例１０に例示されたようなイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。この神経保護アッセイは、例えば、（ｉ）インターロイキン−１、酸素枯渇、Ａ４ペプチド、ＦＡＳリガンドのような他の損傷刺激体、または（ｉｉ）他の細胞、例えば、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、またはＰＣ１２細胞のようなニューロン−様細胞、または（ｉｉｉ）細胞の生存性あるいは細胞の死滅の他のリードアウト、例えば、ＤＮＡ−断片化、核凝縮、共トランスフェクトされたベータ−ガラクトシダーゼの活性、カスパーゼの蛍光発生物質の検出等に適合させることによって、テストの基本的原理を変化させることなく変更することができる。全てのこれらの多数の適合は公知であって、高−スループットシステムで用いることもできる。高―スループットスクリーニング技術は、通常、大規模な細胞の迅速な処理を規定するのに用いられる。このアッセイにおける正の神経保護効果を示す物質は、さらに、例えば、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，２５７−２５９に記載されたそれらの顆粒球形成活性についてテストすることができる。ＧＣＳＦ誘導体の選択は、好ましくは、ＧＣＳＦの公知の形態によって誘導される効果を持つテスト物質によって誘導されるこれらの２つの特異的効果の比較に基づく。同様に、ＧＭＣＳＦの誘導体、例えば、ＧＭＣＳＦ−ミメティックは、ＧＣＳＦについて記載されたイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。

さらなる神経保護物質は、これらの細胞のテスト物質への暴露の後に、ニューロンまたはニューロン−様細胞（例えば、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ｈＮＴ、ＮＴ２、ｈｎ３３）におけるＳＴＡＴ−３およびＳＴＡＴ−５を含めたＳＴＡＴ−蛋白質のような活性化された転写因子の存在を測定することによって得ることができる。従って、本発明のもう１つの実施形態において、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ受容体に対するアゴニストとして作用する特定の物質または化合物の能力は、本明細書中に記載されたニューロン−様細胞において、かつＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）またはＴａｑｍａｎ（商標）分析による定量的ＰＣＲのような慣用的遺伝子発現アッセイを用いて、ＳＴＡＴ蛋白質、例えば、ＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ５の活性化によって評価することができる。

活性化されたＳＴＡＴ蛋白質をリン酸化し（ｐＳＴＡＴ）、ウェスタンブロットにおいて、あるいは免疫組織化学研究、またはＥＬＩＳＡにおいて、市販のｐＳＴＡＴ−特異的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出することができる。

別法として、ＳＴＡＴ活性は、ルシフェラーゼ、ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリ性ホスファターゼ）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、または他の普通の遺伝子発現受容体のようなレポータ遺伝子に連結されたＳＴＡＴ−応答性プロモータエレメント（例えば、多量体化されたＳＴＡＴ−３またはＳＴＡＴ−５−結合エレメントのような多量体化されたＳＴＡＴ−結合エレメント）を含むレポータ構築体を用いて測定することができる。細胞をレポータ構築体でトランスフェクトした後、細胞をテスト物質と接触させ、レポータ発現の量を同定することができる。ＳＴＡＴ活性を測定するこの方法は高−スループット様式に適合させることができる。

典型的なレポータアッセイは、例えば、市販のアッセイシステム（ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＭｅｒｃｕｒｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＰａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔ−Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行うことができる。実行することができるプロトコルの実施例は以下の通りである。

細胞は、マルチプレートで培養する。例えば、９６ウェルプレートにおいてウェル当たり２０，０００細胞。撒いてから２日後、細胞培養基を無血清培地に交換し（ウェル当たり４０μｌ）、細胞を、各細胞型について言われる最適化条件下で、ＳＴＡＴ−結合エレメントおよびレポータ蛋白質をコードするレポータプラスミド（ＳＴＡＴ−３ ホタル−ルシフェラーゼプラスミド；５０ｎｇ／ウェル）、およびトランスフェクション対照プラスミド（レニラ−ルシフェラーゼ発現プラスミド；１０−２０ｎｇ／ウェル）でトランスフェクトすることができる（例えば：ＰＣ−１２細胞は、推奨されるように、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを用いてリポフェクションによって導入することができる）。トランスフェクションから４８ないし７２時間、アッセイを実行することができる。広い範囲の濃度をカバーできる複数濃度にて、テスト物質で細胞を刺激する。刺激から５分以内に開始する複数アッセイ時点を選択すべきである。ルシフェラーゼアッセイを用いる場合、リードアウトはルミノメーター、プレート様式（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ドイツ）で評価することができ、レニラおよびホタルルシフェラーゼの活性を段階的に測定する。２つのルシフェラーゼ−活性の検出は、市販の検出キット（デュアルルシフェラーゼレポータアッセイキット，Ｐｒｏｍｅｇａ；ルシフェラーゼレポータアッセイキット，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いることによってなされる。次いで、ホタルルシフェラーゼの値をレニラルシフェラーゼ値に対して正規化し、レポータ遺伝子の相対的誘導を計算することができる。

スクリーニング方法の別の例において、ニューロン細胞上のＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ受容体に対するアゴニスト活性を利用し、測定することができる。例えば、リガンド結合に際してのホモ二量体化は、蛍光共鳴移動エネルギー測定（ＦＲＥＴ、またはＢＲＥＴ（バイオルミネセンス共鳴エネルギー移動））（Ｓｉｅｇｅｌ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ（２０００）２０００（３８）：Ｌ１；Ｘｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６（１）：１５１−６）、または二量体化事象のためのレポータシステム、例えば、二重スイッチシステム（ＤＥ １０２１１０６３．８）、ベータ−ｇａｌレポータシステム（Ｒｏｓｓｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９７）９４（１６）：８４０５−１０）、または分裂−ユビキチンシステム（ＷＯ ９５４／２９１９５，ＵＳ ５，５８５，２４５、またはＪｏｈｎｓｓｏｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４）９１（２２）：１０３４０−４）を用いてアッセイすることができる。

ニューロン細胞上のＧＣＳＦおよびＧＭＳＣＦに結合する神経保護物質のスクリーニングに対するさらなる代替法において、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの脳−内因性レベルが本発明で提供される。本明細書中に記載し、以下の実施例で示すように、ＧＣＳＦならびにＧＭＣＳＦは、驚くべきことに、脳−内因性リガンドとして発見された。これらのリガンドは、脳のいくつかの虚血性疾患によって誘導された。従って、それらは、脳−内因性神経保護系の一部として作用する。血液−脳関門を横切る外因的に付加されたＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦが、神経保護が有効な治療原理である広い範囲の疾患で有益であるというのと同一の意味において、ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの脳−内因性レベルを増加させる薬物はこれらの疾患で有益であり得る。

そのような物質を同定するためのスクリーニングシステムは、（例えば、大きな小分子ライブラリーからの）物質を、培養中の細胞、例えば、ニューロン細胞、初代細胞、あるいはＰＣ１２細胞、ＳＨＳＹ５−細胞その他のようなニューロン−様不滅化細胞いずれかに加え、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのレベルを測定する基本的方法に設定することができる。

ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦのレベルの測定は、（ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および当業者に知られた他の技術によって）蛋白質それ自体をアッセイすることによって、（定量的ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、ＲＮＡドット−ブロッティング、および当業者に知られた他の技術のような）これらの蛋白質をコードするｍＲＮＡをアッセイすることによって、あるいはＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦについて遺伝子の調節エレメントの活性をアッセイすることによって行うことができる。好ましくは、調節エレメントの活性は、（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質、または容易にアッセイすることができる他のレポーティング遺伝子のような）レポータをコードするｃＤＮＡにカップリングした、プロモータ、エンハンアサおよび／またはイントロンエレメントからのＤＮＡセグメントよりなるレポータ構築体によって評価することができる。これらのレポータ構築体は、安定に、または一過的に細胞にトランスフェクトすることができる。

細胞を生理学的に条件下に維持することができるか、あるいは加えて、（低酸素症／グルコース枯渇、ＮＯドナー、グルタメート（ｇｕｌｔａｍａｔｅ）過剰その他のような）有害刺激体に暴露して、各物質のテストへの同時付加の効果を観察することができる。

同定された物質は、該物質を動物に与え、（例えば、定量的ＰＣＲによって）脳中のＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの含有量を測定することによって、さらに確証することができる。

もう１つの実施形態において、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦに対する受容体の発現レベルの増大は、リガンドに対する細胞の応答性を増加させるのに有用であり得る。従って、上記で概説したスクリーニングアッセイを適合させて、受容体発現の増加についてスクリーニングすることもできる。

ＧＣＳＦの誘導体、例えば、ＧＣＳＦ―ミメティックを、実施例２３に記載されたイン・ビトロアッセイテストすることができる。この神経保護アッセイは、実施例１０に与えられた所与の神経保護アッセイの１つの好ましい変形である、細胞型は初代皮質細胞またはＳＨＳＹ５―Ｙ細胞であり、損傷刺激体はカンプトテシンである。細胞死滅の検出は、カスパーゼの蛍光発生基質によってなされる。

ＪＡＫ／ＳＴＡＴ−経路に加えて、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＥＲＫ−経路はＧＣＳＦによって活性化される（図４３参照）。加えて、神経保護物質は、ＧＣＳＦによって活性化される３つの経路のうち１つの活性化を測定することによって得ることができる。これらの経路の活性化された蛋白質は、ウェスタンブロットにおいて、または免疫組織化学実験において、またはＥＬＩＳＡにおいてそれらのリン酸化状態を検出する市販の抗体（例えば、細胞シグナリング）によって検出することができる（例えば、実施例２１参照）。

誘導体の選択は、ＧＣＳＦの公知の形態によって誘導された効果を持つテスト物質によって誘導された２つの種の比較に基づくことができる。それにより、リン酸化の量または活性化の時間パターンの比較を行うことができる。

経路のいずれかの活性化の異なる時間パターンを用いて、長く継続するまたは一過的活性化の物質を同定することができる。これは、治療される神経学的疾患に関する最適化された効果についての物質、または物質の組合せの選択で有用であり得る。

別法として、活性化された経路は、活性化される下流転写因子（ＴＦ）によって検出することができる（例えば、ｐ５３、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ−経路についてのＦＫＨＲ／ＡＦＸ，またはＥＲＫ−経路についてのＳｔａｔ１／３またはＣｒｅｂ）。ＴＦ活性は、ルシフ
ェラーゼ、ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリ性ホスファターゼ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、または普通の遺伝子発現レポータのようなレポータ遺伝子に連結されたＴＦ応答性エレメントを含むレポータ構築体を用いることによって測定することができる。細胞をレポータ構築体でトランスフェクトした後、細胞をテスト物質に接触させ、レポータ発現の量を同定することができる。

さらなる経路活性化は、市販のキナーゼ活性アッセイ（ＭＡＰキナーゼ）ＥＲＫ１／２）活性アッセイキット，Ｃｈｅｍｉｋｏｎ，キナーゼ−Ｇｌｏ（商標）ルミネセントキナーゼアッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって検出することができる。そのようなアッセイを用いて、ＧＣＳＦの誘導体、またはＧＣＳＦと、より高い活性を有する他の造血因子との組合せを同定することができる。

同様に、ＧＭＣＳＦまたはＩＬ−３またはＩＬ−５の誘導、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３またはＩＬ−５−ミメティックを、Ｇ−ＣＳＦについて記載されたイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。同様に、ＣＧＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５またはその誘導体の組合せまたは融合蛋白質を、ＧＣＳＦについて記載したイン・ビトロ神経保護アッセイでテストすることができる。

また、ニューロン細胞を死滅から保護するにおける、ＧＭＣＳＦまたはＩＬ−３またはＩＬ−５の誘導体、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３またはＩＬ−５ミメティックの効率を前記したＦＡＣＳ分析でアッセイすることができる。誘導体は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５のもう１つの造血因子との融合蛋白質であり得る。

本発明を一般的に記載してきたが、説明のみの目的で本明細書中に掲げ、特記しない限り限定的であることを意図しないある特定の実施例を参照することによって、さらに理解を得ることができる。

〔実施例〕
本発明の基礎となる実験は、ＧＣＳＦはイン・ビトロで神経保護的であり、ＧＣＳＦが一過的病変大脳虚血症後に有意な梗塞低下効果を示す。また対側性側におけるニューロンは、抗ＧＣＳＦＲ−抗体の特異的結合を呈し、これはＧＣＳＦ受容体を示す。ニューロン上のＧＣＳＦＲの存在は新規であって、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、および脳中の詳細な免疫組織化学によって、およびＰＣＲおよび培養した初代ニューロンにおける免疫細胞化学によって確認した。さらに、ＳＴＡＴ３の核トランスロケーションによって判断したＳＴＡＴ３活性化は、対照と比較してＧＣＳＦ処理動物の領域のニューロンにおいて有意に増加した。イン・ビボ虚血症実験において（中央大脳動脈閉塞、ＭＣＡＯ）、双方の群を比較した場合に、レーザードッパーフローメトリー（ｌｄｆ）によって測定された大脳血流に対する効果はなかった。ＭＣＡＯ実験の間における双方の群の間の生理学的パラメータおよび重量減衰の有意な差はなかった。死亡率は、ＭＣＡＯ実験における対照と比較して、ＧＣＳＦ処理した動物において有意に改良された。神経向性血液カウント（ＮＧＣ）、対照と比較して、ＧＣＳＦ処理動物において２４時間後に有意に増加した。神経向性顆粒球（ＮＧ）が虚血性圏内に侵入する尺度としてのミエロペルオキシダーゼ（ＮＰＯ）−染色は、ＧＣＳＦ処理動物および対照の間で有意に異ならなかった。

実験で用いた静脈内送達ＧＣＳＦの用量（６０μｇ／ｋｇ／体重）は、他の実験条件で用いた用量と匹敵した。それを、有意な副作用が観察されない前に、および結果として観察されない前に、初期パイロットプロジェクトにおける安全性についてテストした。この用量（６０μｇ／ｋｇ／体重）は、ヒトミエロジスブラスティック（ｍｙｅｌｏｄｙｓｂｌａｓｔｉｃ）および他の病気の治療で認可された用量よりも６倍高く、ラットモデルに
おいて認識可能な副作用を示さなかった。

ＧＣＳＦで活性化された５０％の梗塞低下効果は、全身適用後におけるｂＦＧＦまたはＩＧＦのような他の成長因子のそれに匹敵する（Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍ ｅｔａｂ．，１９９５；１５：９５３−９：Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１：３２，１２２６−３３）。グルコース枯渇、および細胞の引き続いてのＣａ^２＋過剰負荷での刺激毒性、ならびにアポトーシス、活性酸素種、および（例えば、拡大する鬱病からの）増大した要件に直面した低下したエネルギー貯蔵は、虚血症に続いてのニューロン細胞死滅の主な原因である（Ｌｅｅ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９９：３９９（Ｓｕｐｐｌ）：Ａ７−１４）。実施例に示したように、ＧＣＳＦは、Ｈ_２Ｏ_２誘導細胞死滅に対するイン・ビトロニューロン−様細胞（ＮＧＦ−分化ＰＣ１２細胞）を保護する。Ｈ_２Ｏ_２は、細胞死滅を惹起する活性酸素種（ＲＯＳ）の生産による酸化的ストレスを誘導する。哺乳動物細胞におけるＨ_２Ｏ_２−媒介細胞ストレスは、関連する細胞表現型、用量、時間−コースおよびシグナリング経路の点でよく−特徴付けられている。多数の実験におけるＨ_２Ｏ_２の広く普及した用法は、細胞におけるＨ_２Ｏ_２の効果としてのアポトーシスメカニズムを支持する（例えば、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００２ Ｊａｎ；１６（１）：１１１−３；：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００１；８２（３）：４３７−４４）。例えば、プロ−アポトーシスキナーゼＡＳＫ１およびＦａｓＬｉｇａｎｄの役割は、Ｈ_２Ｏ_２−媒介細胞死滅において確認的に示されている（Ｔｏｂｉｕｍｅ Ｋ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２００１ Ｍａｒ；２（３）：２２２−８；Ｋｗｏｎ，Ｄ．，Ｊ Ｎｕｅｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｆｅｂ １；１１３（１）：１−９；Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ １５；６９（２）：１７８−８８）。従って、ＧＣＳＦは、第２の虚血症において惹起されるアポトーシスメカニズムに干渉するようである。ＧＣＳＦの作用は、恐らくは、高−親和性受容体ＧＣＳＦＲへの結合によって媒介される。この受容体との相互作用はＪａｎｕｓファミリーキナーゼ（ＪＡＫ）およびＳＴＡＴ（Ｄａｒｎｅｌｌ ＪＥ Ｊｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７７：１６３０−５）を活性化する。ＪＡＫは、リガンド−誘導受容体二量体化に際して活性化されるようになる非−受容体−タイプのチロシン蛋白質キナーゼである。ＪＡＫのＧＣＳＦ誘導活性化は、ＳＴＡＴ二量体化を誘導する、保存されたチロシン残基でのＳＴＡＴをリン酸化する（Ｑｕｅｌｌｅ ＦＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：４３３５−４１）。さらに、ＳＴＡＴは核に移動し、引き続いて、遺伝子発現を調節する（Ｓｈｕａｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９３；３６６：５８０−３；Ｓｈｕａｉ Ｋ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２６３８−４４）。ＳＴＡＴ３は、ＧＣＳＦＲによって活性化された主要ＳＴＡＴ蛋白質である（Ｓｈｕａｉ Ｋ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２６３８−４４）。ＳＴＡＴ３は、ｂｃｌ−２を活性化することによって抗アポトーシス機能を媒介し、ｃ−ｍｙｃ遺伝子をアップレギュレートすることによって、顆粒球の増殖および分化を誘導する（Ｆｕｋａｄａ Ｔ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９６；５：４４９−６０；Ｓｉｍｏｚａｋｉ Ｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２５１８４−９）。免疫組織化学を用いることによってここに示すように、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウェスタンブロットＧＣＳＦＲは造血細胞のみならず、ニューロン、神経膠細胞、ニューロン−様細胞、およびニューロン幹細胞に存在する。さらに、該領域のニューロンにおけるＧＣＳＦ誘導ＳＴＡＴ３アップレギュレーションは、ＢＤＮＦまたはｂＦＧＦについて示されたｂｃｌ−２アップレギュレーションのような抗−アポトーシス効果を媒介することができ（Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３）、ニューロンの生存するための向性支持を提供する。梗塞の領域におけるＳＴＡＴ３の密な核標識は、大脳虚血症後に活性化された小神経膠細胞について既に示された、細胞質から核へのＳＴＡＴ３の膜受容体−媒介トランスロケーションを反映し得る（Ｐｌａｎａｓ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６；８：２６１２−８）。ＧＣＳＦは、神経向性顆粒球（Ｎ
ＧＣ）のアポトーシス細胞死滅を遅延させることによって、放出、エフェクター機能の増強、および寿命の延長を刺激することが知られており、これは全ての種類の感染に対する防御の身体の第１線である（Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｎａｔｏｌ １９９８；５：２２１−５）。好中球は微小血管を閉塞しかねず、白血球の引き続いての侵入は、蛋白質分解酵素、酸素フリーラジカル、インターロイキン、および大脳虚血症後の梗塞のサイズおよび結果を劣化させることが知られているＴＮＦ−α−効果の放出をトリガーする（Ｄｅｌ Ｚｏｐｐｏ ＧＪ，Ｓｔｒｏｋｅ １９９１；２２：１２７６−８３；Ｊｅａｎ ＷＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ １９９８；４３：１３８２−９６；Ｍａｔｓｕｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９４；６５６：３４４−５２）。対照的に、ＧＣＳＦは、有意な抗−炎症効果を有し：末梢感染ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−８のモデルで低下し、ＩＬ−１β受容体−アンタゴニストを上昇させる（Ｇｏｒｇｅｎ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４９：９１８−２４；Ｈｅａｒｄ ｓｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９９；２７：１０１９−２１；Ｈｅａｒｄ ＳＯ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９８；２６：７４８−５４；Ｈｅｂｅｒｔ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１９９０；１２５：１０７５−８；Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９６；２４：８２０−６．；Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９７；１２０：３３３−９）。ＧＣＳＦは健康なボランティアにおいてイン・ビトロおよびイン・ビボにおいてＴＮＦ−α放出を低下させ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βに対するアンタゴニストのレベルを上昇させた（Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９８；５：２２１−５；Ｇｏｒｇｅｎ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４９：９１８−２４；Ｈｅａｒｄ ＳＯ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９９；２７：１０１９−２１）。さらに、肺および回腸における低下した好中球浸潤が、ＧＣＳＦの投与および小腸の再灌流から１５分後に、内臓虚血症および再灌流のモデルで観察された（Ｓｑｅａｄｒｉｔｏ Ｆ，ｅｔ
ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９７；１２０：３３３−９）。これらの発見と合致して、虚血症圏への好中球浸潤の増加が発見されたが、全神経向性顆粒球（ＮＧＣ）はＧＣＳＦ処理の後に増加した。

成長因子、特に、ｂＦＧＦの可能なもう１つの作用メカニズムは、大脳血流に対する効果を含む。ｂＦＧＦ処理は、全身低血圧を促進しない用量においてさえ虚血症帯周辺における側副枝を膨張させ、従って該領域のニューロンの血流を増加させる。（Ｔａｎａｋａ
Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ １９９５；２６：２１５４−８；ｄｉｓｕｃａｔｉｏｎ ２１５８−９）。しかしながら、ここに示したように、ＧＣＳＦ処理は全身血圧を低下させず、あるいはＬＤＦによって測定されたように対照群と比較して大脳血流を変化させなかった。

光血栓（ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ)ベンガルローズモデルにおいて、ポスト虚血症静脈内ＧＣＳＦ処理は、光血栓性発作から６週間後に、感覚運動機能結果を明瞭に改善し、さらに、成長因子がイン・ビボにて外傷脳病変後に回復および再生を誘導するという仮説を支持する。２つの他の化合物、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および骨形成性プロテインー１（ＯＰ−１）は、以前、感覚運動機能を改善し、病変大脳虚血症後のニューロン発芽を誘導することが報告されている（Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｍａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４：８１７９−８４；Ｋａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １９９８；９：１４４１−５；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００３；３９：８６０−５）。これらの研究のほとんどにおいて、成長因子は、臨床的に関連しない大脳の脳質に投与された。Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，）（１９９９），Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１０，１２０１−４）のみが、ｂＦＧＦの静脈内投与が
病変―誘導海馬発芽を支持することを報告したが、著者らは機能的結果の尺度を研究しなかった。ここに示す結果は、臨床的に重要な用量のプロトコルのＧＣＳＦ投与が大脳虚血症後の機能的回復を誘導することを示す。可塑性の増強に対する能力は虚血症の損傷に明瞭には制限されないのみならず、蘇生または分娩時問題のため、また恐らくは、アルツハイマー病のような認知症のため、および精神分裂症の神経変性態様のため、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、トリヌクレオチド反復病、大脳虚血症のような神経変性病についても重要である。

結果は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の作用の様式における同様性も示し、ニューロン損傷の場合におけるそれらの有益な活性を支持する。
大脳虚血症についての実験のための方法の概観
虚血症は、ラットにおいて、中央大脳動脈の縫合閉塞モデルを用いて誘導した（９０分）。虚血症の誘導から３０分後に、動物（群当たりｎ＝１２）は、９０分間の静脈内での６０μｇ−ｋｇ体重のＧＣＳＦ、またはビークルを受けた。梗塞容量は、虚血症から２４時間後に、ＴＴＣ（塩化２、３、５−トリフェニルテトラゾリウム）−染色に基づいて計算した。ＧＣＳＦＲの発現は免疫組織化学によって実験し、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロッティングによって確認した。ＳＴＡＴ３の発現は免疫組織化学によって実験した。機能的回復におけるＧＣＳＦの効果は、ベンガルローズ光血栓モデルにおいて実験した。

統計学的解析
この実験で表した値は平均±ＳＤである。全てのデータを獲得した後、ランダム化暗号を解除した。ＡＮＯＶＡおよび引き続いてのポストｈｏｃ Ｆｉｓｈｅｒ保護最小有意差検定またはボンフェロニー相関を用いて、イン・ビトロデータおよび生理学的パラメータについての差の統計学的有意性またはテストバッテリーにおける機能的結果を決定した。ｔ−検定を、死後梗塞容量、ＭＰＯ、およびＳＴＡＴ３免疫組織化学の比較で用いた。カイ−平方検定を、死亡率データのために行った。ｐ値＜０．０５は統計学的に有意と考えた。

結果
ＧＣＳＦは梗塞容量を１３１．９６ｍｍ^３±１１２．７ｍｍ^３に低下させたのに対して、対照群においては２７８．９ｍｍ^３±９１．５６ｍｍ^３（ｐ＜０．０５）まで低下させた。免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、およびＲＴ−ＰＣＲは、ニューロンおよび神経膠細胞におけるＧＣＳＦ受容体の存在を明らかにした。ＧＣＳＦは、対照と比較して、梗塞の末梢においてＳＴＡＴ３を有意に活性化させた（ｐ＜０．０５）。ＧＣＳＦは、ベンガルローズ光血栓のモデルにおける虚血症の後に、機能的回復を改善するのに効果的である。

従って、ＧＣＳＦは、細胞培養において、および病変大脳虚血症後において、有意な神経保護効果を有することが示された。この効果は、ＧＣＳＦＲとの相互作用、およびＳＴＡＴ３の活性化によって媒介されるように見える。

実施例１−病変大脳虚血症
病変大脳虚血症（ＭＣＡＯ、中央大脳動脈閉塞）を誘導するための手法
実験プロトコルは地方倫理委員会によって認可された。体重が２８０ないし３２０ｇの２４匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ドイツ）をランダムに以下の群に割り当てた：Ａ（対照群、ｎ＝１２、９０分間の虚血症、血管閉塞から３０分後に開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％での処理）；Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝１２、９０分間の虚血症、血管閉塞から３０分後に開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％に溶解させた６０μｇ／ｋｇ体重の組換えヒトＧＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダでの処理。別法として、いずれか
のＧＣＳＦまたは誘導体、または他の源（もう１つの製造業者（例えば、ＲｏｃｈｅによりＬｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ（商標）またはＣｈｕｇａｉによるＧｒａｎｏｃｙｔｅ（商標）またはＨＧＳによるＡｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）またはＲｏｃｈｅ／ＡｍｇｅｎによるＮｅｕｌａｓｔａ（商標））の処方をここで用いることができる。

次いで、動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン塩酸塩（ＷＤＴ，Ｇａｒｂｓｅｎ，ドイツ）の腹腔内注射で麻酔した。必要であれば、麻酔は５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持した。平均動脈血圧、血液ガス、ヘマトクリット、白血球カウント、および血中グルコースレベルの継続的モニタリングのために、ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを右大腿動脈に挿入した。処理注入のためのＰＥ−５０チューブによって右大腿静脈にカニューレを入れた。実験の間、直腸温度をモニターし、サーモスタット制御加熱パッド（Ｆｏｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ドイツ）によって３７℃に維持した。Ｚｅａ Ｌｏｎｇａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｒｏｋｅ １９８９；２０：８４−９１）によって詳細に記載されているように、縫合閉塞モデルを用いることによって、一過性病変大脳虚血症を誘導した。簡単に述べると、右総頸動脈および右外側頸動脈を中線首切開を通じて露出させた。シリコン（Ｂａｙｅｒ，ドイツ）被覆した４−０モノフィラメントナイロン縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎ，ドイツ）を、総頸動脈に動脈切除術を通じて挿入し、内側頸動脈に穏やかに進め、頸分岐からほぼ１７ｍｍに位置させた。この技術を用い、縫合の先端は近位前大脳動脈、ＭＣＡの起源、および後連絡動脈を片側閉塞させる。ＭＣＡの領域における大きな梗塞が典型的には生じる。血管閉塞から９０分後、閉塞フィラメントを取り除くことによって、再灌流を行った。偽−手術動物は、梗塞が起こらないように、ナイロンフィラメントを総頸動脈を超えて進ませなかった以外は前記と同一の実験手法を受けた。外科的処置の後、カテーテルを取り出し、動物を麻酔から回復させ、食料および水を自由に与えた。

領域的大脳血流の測定
レーザー−ドップラーフローメトリー（ＬＤＦ）（Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ４００１ Ｍａｓｔｅｒ，Ｐｅｒｉｍｅｄ ＡＢ，スウェーデン）を用いて、ＭＣＡの閉塞の間および後に、大脳血流（ＣＢＦ）をモニターした。動物を定位フレームに入れた後、動物の頭蓋を露出させ右側４ｍｍ外側およびブレグマに対して２ｍｍ尾側に、顕微鏡下で直径１．５ｍｍの穴をドリルで開けた。硬膜は無傷のまま残し、ＬＤＦプローブ（直径１．４ｍｍ）をバー穴に入れた。ＣＢＦモニタリングについて選択された領域は、ラットにおけるＭＣＡ閉塞モデルの虚血性領域に対応した。

梗塞容量計算
ＭＣＡ閉塞から２４時間後に、ラットをケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し、断頭した。脳を切開し、２ｍｍ厚みの５つの冠スライスに切断し、塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の２％溶液中で３７℃にて３０分間インキュベートし、１０％緩衝化ホルマリン溶液中への浸漬によって固定した。電荷カップルドデバイスカメラ（ＥＤＨ−１０００ＨＲコンピュータカメラ，Ｅｌｅｃｔｒｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、ＴＴＣ−染色切片を写真に撮った。盲検調査者が、コンピュータ化イメージアナライザー（Ｂｉｏ Ｓｃａｎ Ｏｐｔｉｍａｓ，Ｅｄｍｏｎｄｓ，ＷＡ）で梗塞のサイズを測定した。脳浮腫の効果を保障するために、正しい梗塞容量を従前に詳細に記載されているように計算した：但し、梗塞領域は左半球領域−（右半球領域−梗塞領域）と同等である。（Ｓｃｈａｅｂｉｔｚ ＷＡ，ｅｔ
ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３）。梗塞容量は対側性半球のパーセンテージとして表した。

虚血症実験
ＧＣＳＦは、病変大脳虚血症後に優れた神経保護効果を達成した。腹腔内ＧＣＳＦ処理
動物における平均梗塞容量は１３１．９６ｍｍ^３±１１２．７ｍｍ^３であったのに対し、対照群では２７８．９ｍｍ^３±９１．５６ｍｍ^３であり、あるいは全半球の９．９６±８．３１％（ｎ＝１２）対２２．７±６．６９％（ｐ＜０．０５；図１）であった。

ＧＣＳＦ処理は死亡率を有意に低下させた：対照群における４匹の動物、およびＧＣＳＦ−処理群における１匹は２４時間の再灌流期間内に死亡した（ｐ＜０．０５）。全ての動物についての直腸温度、ｐＨ、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２、ヘマトクリット（ｈｃｔ）、血中グルコース、心拍、平均動脈圧力、および体重について、対照およびＧＣＳＦ−処理群の間で、統計学的差は観察されなかった（表１）。末梢血液中の白血球カウントは、対照と比較してＧＣＳＦ処理動物において虚血症から２４時間後に有意に増加した（ｐ＜０．０５，表１）。

表１はＧＣＳＦ処理動物および対照の生理学的パラメータをリストする。値は平均±ＳＤとして掲げる（ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ；Ｆ−検定）。

ＬＤＦ−モニタリングは２つの処理群の間で統計学的差を明らかにしなかった（データは示さず）。

実施例２−病変大脳虚血症の関係における免疫組織化学
用いた免疫組織化学方法
梗塞下脳におけるＳＴＡＴ３活性化（図６）およびＧＣＳＦＲ分布の形態学的分析、および神経向性顆粒球のカウントのために、ＧＣＳＦ−処理動物および対照の２−ｍｍ−厚みの脳スライスを、０．１モル／ｌのリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで２４時間浸漬固定した（群当たりｎ＝５）パラフィン−包埋の後、１−μｍ−厚みの切片を切り出し、Ｈ＆Ｅ染色、Ｎｉｓｓｌ染色および免疫組織化学分析で用いた。

免疫組織化学実験は、ミエロペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、神経膠細胞原線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧＣＳＦＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する抗血清で行った。抗原検索のために、ＧＣＳＦＲおよびＳＴＡＴ３免疫組織化学のために供された切片を１０ｍＭクエン酸緩衝液中で９９℃にて２０分間加熱した。次いで、切片を正常なブタ血清（リン酸−緩衝化生理食塩水中１０％）中で３０分間、次いで、１次抗血清中で４℃にて１晩インキュベートした。一次抗体を、各々、１：１５０（ミエロペルオキシダーゼ）、１：４００（ＧＦＡＰ）、１：４００（ＧＣＳＦＲ）、および１：１００（ＳＴＡＴ３）希釈した。免疫反応性をアビジンビオチン複合体方法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）によって可視化した。切片を、０．０２％過酸化水素を含む０．０２％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で発色させた。０．０２％塩化コバルトおよび硫酸アンモニウムニッケルの添加によって反応性生物を強化した。対照スライドのサブセットにおいて、ＧＣＳＦＲ抗血清と各ペプチドとのプレ吸収は免疫染色を生じなかった（示さず）。一次抗血清を省略する場合、免疫染色はいずれも生じなかった（示さず）。

神経向性顆粒球（ＮＧ）の侵入は、梗塞した半球当たりのＮＧをカウントすることによって定量的に測定した。ＳＴＡＴ３蛋白質発現は、壁側皮質および対応する対側性の梗塞に隣接する２つの重複する視野のロストロ（ＲＯＳＴＲＯ）−尾において定量した（倍率×４００）。この目的では、核トランスロケーションを伴うニューロンをカウントし、全てのニューロンからのＳＴＡＴ３陽性ニューロンのパーセントとして掲げる。
病変大脳虚血症における免疫組織化学実験の結果
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色は、双方の群の非−虚血性半球における神経向性顆粒球（ＮＧ）を検出しなかった。ＭＰＯ染色は、虚血性半球における定量されたＭＰＯ陽性細胞に基づいて、ＧＣＳＦ処理動物および対照の間で有意に異ならなかった（１４±１７．６対１４．３±１２．５，ｎ．ｓ．）。

ＧＦＡＰ免疫反応性（ＩＲ）は、非−梗塞半球の皮質、層および白色物質を通じて散在する神経膠星状細胞プロセスに存在した。未処理およびＧＣＳＦ処理ラットの双方において、皮質梗塞周囲ゾーンにおいて、ＧＦＡＰ染色のパターンおよび強度の差は検出できなかった。特に、プラセボ群において、またＧＣＳＦ群においても、ＧＦＡＰ ＩＲは皮質領域で増加しなかった（データは示さず）。梗塞コア内で散在するＧＦＡＰ免疫反応性神経膠星状細胞は検出可能であった（データは示さず）。

免疫組織化学的には、未処理およびＧＣＳＦ処理動物双方において、ＧＣＳＦＲについての染色は散在する皮質ニューロンおよび軸索で検出可能であった（示さず）。また、神経膠細胞もＧＣＳＦ−Ｒ抗体で染色された（示さず）。梗塞コアにおいて、ＧＣＳＦ−Ｒ免疫反応性細胞は観察されなかった。ＧＣＳＦ−Ｒ ＩＲのパターンおよび強度の差は、２つの実験群の間で明らかでなかった。

ＳＴＡＴ３ ＩＲは、プラセボおよびＧＣＳＦ処理ラット双方の未梗塞半球内のニューロンおよび神経膠細胞の散在核で見られた。いくつかの細胞質染色もまた少数の散在ニューロンに存在した。未処理対照と比較して、梗塞の領域におけるＧＣＳＦ処理の後に、ＳＴＡＴ３蛋白質発現は有意に増加しなかった（３４．４±７．０５対１３．７±４．４；ｐ＜０．０００３）（図６，７）。対側性側で差は起こらなかった（１６．２±６．９対１３．３±６．９；ｎ．ｓ．）。

実施例３−病変大脳虚血症の関係でのウェスタンブロットおよびＰＣＲ
ウェスタンブロット（図３）
免疫ブロッティングでは脳組織（２時間の一過性虚血症）を、４℃にて２０容量（ｗ／ｖ）のホモゲナイゼーション緩衝液（３２０ｍＭスクロース、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、および２μｇ／ｍｌペプスタチン）中で溶解させた。ホモゲネートを９，２００Ｇにおいて４℃にて１５分間遠心した。ペレットを１／１０のホモゲナイゼーション容量に再懸濁させた後、蛋白質測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質−アッセイ、Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）についてのアリコットを分離し、試料を酸化窒素中で迅速に凍結させ、−７０℃で貯蔵した。レーン当たり１５μｇの蛋白質を、４Ｍ尿素を含有する８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷し、標準条件下で電気泳動に付した。半乾燥ブロッティングによって蛋白質を電気泳動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（商標）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）に移した。室温（ＲＴ）にて１時間、ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の３％無脂肪ドライミルク中でブロッキングした後膜を一次ＧＣＳＦＲ抗体と共に（１：５００）４℃にて１晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中で洗浄した後、適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲーティッド２次抗体の１：２．０００希釈と共に膜をＲＴにて１時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、増強されたケモルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツ）での直線範囲で可視化した。

皮質抽出物での免疫ブロッティング実験において（図３）、抗血清はほぼ１３０ｋＤの蛋白質バンドを検出し、これは、推定される分子量と合致する（Ｆｕｋｕｎａｇａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０；２６５：１４００８−１５）。加えて、小数の低分子量のバンドが見られ、恐らくは分解生成物を反映する。ＧＣＳＦＲ抗血清の各ペプチドとのプレ吸収後に、バンドは消失した（図３）。
脳におけるＧＣＳＦ受容体についてのＰＣＲ（図２Ａ）
ラットを深く麻酔し、経心臓的に灌流した後、脳を迅速に切開した。製造業者の指令に従って、ＲＮＡ−クリーンキット（ＡＧＳ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）によってＲＮＡを脳から抽出した。合計１０μｇのＲＮＡをＭＭＬＶ逆転写酵素およびランダムヘキサマーで逆転写した。ＰＣＲでは、ネズミＧＣＳＦＲのエクソン５および７からの以下のプライマーを用いた：センス、５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＴＧ
ＣＣＴ Ｃ−３’（配列番号：５）；およびアンチセンス、５’−ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＣＧ ＡＡＴ Ｇ−３’（配列番号：６）（Ａｓｈｉｈａｒａ
Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｃｉｏｌ １９９７；１７１：３４３−５６）。ＰＣＲは以下のプロトコルに従って行った：３分９４℃、１分９４℃、１分５８℃、および１分７２℃（４０サイクル）。生成物を２％アガロースゲルで分析した。

マウスＧＣＳＦＲに対して特異的なＲＴ−ＰＣＲを用い、ＧＣＳＦ−Ｒ ｍＲＮＡを脳組織で検出した（図２Ａ）。ＰＣＲ産物は５６７ｂｐの予測されたサイズを有した。同一性は、ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した（図２）。

実施例４−ＡＬＳモデルにおけるＧＣＳＦ効率
ＡＬＳマウスモデルにおける生存テスト
従前の実験は、ＡＬＳのＳＯＤ１マウスモデルはヒトにおける療法の成功を予測する（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）（２００１），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，８０６−１９）。そのような分析における主な評価項目は運動兆候の開始、および死亡率の双方である。例えば、運動兆候の開始は、２０ｒｐｍのスピードにおいてマウスが７分間ロータロッド上に留まることができない最初の日と定義することができる（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ）２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。死亡率は死亡の日、あるいは欠損が余りにひどくて、マウスが犠牲にならざるを得ない日としてスコア取りされる（例えば、無気力および自分自身を直立できないこと）。さらなるパラメータは、グリップ強度テストによる運動強度、脊髄中の運動ニューロンのカウント、神経の厚み（例えば、坐骨神経、横隔膜神経）、および脊髄運動ニューロンにおけるアポトーシス染色の存在の測定によって決定される。ＧＣＳＦは、例えば、６０ｕｇ／ｋｇ体重／日において、予め決定された用量にて浸透圧ポンプを介して大脳室に注入することができる。別法として、ＧＣＳＦは、一日当たり６０ｕｇ／ｋｇ体重の用量、またはより高い用量において静脈内または腹腔内注射を介して与えられる。別法として、ＰＥＧ処方（前記参照）、またはアルブミン処方（前記参照）、または他の遅延放出処方のようなＧＣＳＦの遅延―放出形態を投与する。別法として、いずれかのＧＣＳＦまたは誘導体、他の源の処方（もう１つの製造業者）例えば、ＲｏｃｈｅからのＬＥＮＯＧＡＳＴＲＩＭ（商標）、Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａ、Ｃｏ．Ｌｔｄ．，からのＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（商標）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｎｃｅｓからのＡＬＢＵＧＲＡＮＩＮ（商標）、またはＲｏｃｈｅ／ＡｍｇｅｎからのＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標）））を用いる。処理は、ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ突然変異体の後期プレ兆候段階における６０日において開始する。未処理家族性ＡＬＳマウスにおいて、運動損傷は１２ないし１４週齢に出現し、他方、２０週齢前には麻痺は観察されない。平均余命は１４０ないし１７０日である。効果的な治療は、１５％を超えて対照群と比較して寿命を延長するはずである（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ
＆ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）２００１），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２，８０６−１９）。治療のための対照群として、ビークルおよびｚＶＡＤｆｍｋ（このモデルにおいて有効性を示した優れたカスパーゼ阻害剤）処理動物を共に用いる。各群は各々１０匹の動物を含む。

実施例５−パーキンソンモデルにおけるＧＣＳＦ効率
ＧＣＳＦの効率実験に適した利用できるパーキンソン病の種々のげっ歯類モデルがある（Ｇｒｕｎｂｌａｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ，２４７ Ｓｕｐｐｌ ２，II９５−１０２．）。１つのよく特徴付けられたモデルは１−メチル−４−フェニルー１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の使用である。ＭＰＴＰ−ＨＣｌの４用量（１用量あたり１５ｍｇ／ｋｇ）を２時間の間隔で腹腔内注射を介して８週齢雄マウス（ｎ＝２０）に与えることができる。偽−処理動物は生理食塩水を受ける。最後のＭＰＴＰ処理マウスを犠牲にしてから７日後に、２０匹の動物はＭＰＴＰ処理、およびＧＣＳＦの毎日の用量（静脈内、６０ｕｇ／ｋｇ体重）双方を受ける。その時点まで、マウスを運動パラメータ（ロータロッド性能、自由移動）双方について分析する。１０匹のマウスの脳を、各々、免疫組織化学について処理して、（商業的に入手可能な抗体を用いて）チロシンヒドロキシラーゼまたはドーパミントランスポーターに対して陽性である黒質におけるニューロンの合計数、アポトーシス−陽性ニューロンの数（ＴＵＮＥＬ染色、カスパーゼー３染色）をアッセイする。ＭＰＴＰ処理後の残存するドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ＋ＧＣＳＦを受けるもの、および偽群と比較する。

各群における残りの１０匹の動物を生理食塩水で経心臓灌流し、犠牲にし、層を切開する。層を氷上でホモゲナイズし、電気化学的検出を用いるＨＰＬＣによってドーパミン含有量を測定する。３つの群の比較は、黒質における細胞の喪失のためドーパミン枯渇の良好な尺度を与えるであろう。

また、ＭＰＴＰに対して異なる投与スキームを用いてこの実験を行うこともできる（すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ体重１回；３０ｍｇ／ｋｇ体重２回、等）。

実施例６−光血栓（ｐｈｏｔｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）大脳虚血症後において、ＧＣＳＦは感覚―運動機能を改良する（図８）。

実験群
実験プロトコルは、地方倫理委員会によって認可された。体重が２８０ないし３２０ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ドイツ）を以下の群に割り当てた；Ａ（対照群、ｎ＝６）、虚血症、虚血症から１時間後に開始する静脈内ボーラス注入としての０．５ｍｌ生理食塩水０．９％での処理；Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝６）、虚血症、虚血症から１時間後に開始する静脈内ボーラスとしての０．５ｍｌ生理食塩水０．９％に溶解させた５μｇ脳ＧＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ）での処理。別法として、いずれかのＧＣＳＦまたは誘導体、または他の源の処方（もう１つの製造業者）、例えば、Ｒｏｃｈｅによるレノガストリム（Ｌｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ）（商標）、またはＣｈｕｇａｉによるグラノサイト（商標）、またはＨＧＳによるアルブグラニン（Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ）（商標），またはＲｏｃｈｅ／Ａｍｇｅｎによるニューラスタ（商標））をここで用いることができる。１ないし５日後における尾静脈を介する反復静脈内ボーラス。Ｃ（偽操作群、ｎ＝６）、偽操作、虚血症なし、虚血症から１時間後に開始する静脈内ボーラス注入としての０．５ｍｌ生理食塩水０．９％での処理。

光血栓症による病変大脳虚血症
１００ｍｇ／ｋｇ体重ケタミン塩酸塩（ＷＤＴ，Ｇａｒｂｓｅｎ，ドイツ）の筋肉内注射で動物を麻酔した。必要であれば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔を維持した。平均動脈血圧、および血中ガスの連続的モニタリングのために、ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを右大腿動脈に挿入した。右大腿静脈に、処置注入のためにＰＥ−５０チューブによりカニューレを入れた。実験の間に、直腸温度をモニターし、サーモスタット制御加熱パッド（Ｆｏｅｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ドイツ）によって３７℃に維持した。

Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｔｓｏｎ ＢＤ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＷＤ，Ｂｕｓｔｏ Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＭＳ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ＭＤ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｔｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９８５；１７：４９７−５０４．）の方法に従って、光血栓症虚血症をラット右壁皮質において誘導した。動物をケタミン塩酸塩で麻酔し、定位フレームに入れ、頭蓋表面の露出のために頭皮を切り開いた。照射のために、１．５−ｍｍ開口を持つ繊維―光学束を、ブレグマーから４ｍｍ後に、かつ中線から４ｍｍ側方に、頭蓋上に定位にて置いた。頭蓋に冷白色光ビーム（１５０Ｗ）を２０分間照射した。最初の２分間の照射の間に、染料ローズベンガル（０．１３３ｍＬ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水）を静脈内注射した。偽―操作動物は、ローズベンガルの注入および照射無くして、前記したのと同一の実験手法を受けた。外科的処置の後に、カテーテルを取り出し、動物を麻酔から回復させ、食料および水を自由に与えた。

挙動テスト
全ての動物において、実験群を知らされていなかった調査者によって、虚血症前に、およびベースラインにおいて、虚血症から２、３、４、５および６週間後に、一群の挙動テストを行った。ロータロッドテストのために、ラットを加速ロータロッドシリンダー上に置き、動物がロータロッド上に留まった時間を測定した（Ｈａｍｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎ
ｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １９９４ Ａｐｒ；１１（２）：１８７−９６，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，ＬｕＤ，ＬｕＭ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ
Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５．）。スピードを５分以内で４ｒｐｍから４０ｒｐｍまでゆっくりと増加させた。もし動物がラングから落ちるか、またはデバイスを握り、かつラング上を歩くことを試みることなく２連続回転の間に回れば、実験を終了した。訓練ならびにテスト手法において、任意の時間制限をロータロッドシリンダー上での５００秒においてラットに設定した。虚血症から３日前に、動物を訓練した。デバイスでの平均持続（秒単位）、外科的処置から１日前に３ロータロッド測定で記録した。運動テストデータは、内部ペースライン対照（外科的処置前に）と比較した、ロータロッド上での平均持続（３回のトライアル）のパーセンテージとして表す。

接着―除去テストのために、虚血症の前および後の双方に、体性感覚欠乏を測定した（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ Ｔ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＤＡ，Ｈｕｍｍ ＪＬ，Ｃｏｃｋｅ ＲＲ．Ｕｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９７；７３：２２９−２３８．；Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ Ｚｈａｎｇ Ｚ，ＬｕＤ，ＬｕＭ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｏｍａｌ
Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１００５．）。全てのラットをテスト環境に慣れさせた。最初のテストにおいて、（等しいサイズ、１１３．１ｍｍ^２の）接着剤―裏打ち紙ドットの２つの小さなピースを、各前足の手根の末端側―ぎょう骨を占める両側性触覚刺激体として用いた。ついで、ラットをそのケージに戻した。前足からの各刺激体を除去する時間を各前足について１日当たり５トライアルで記録した。個々のトライアルは少なくとも５分だけ分離した。外科的処置の前に、動物を３日間訓練した。一旦ラットが１０秒以内にドットを取り除くことができれば、それらを虚血症に付した。

Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，ＬｕＤ，ＬｕＭ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ. Ｓｔｒｏｋｅ. ２００１；３２：１００５、およびＳｃｈａｌｌｅｒｔ Ｔ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＤＡ，Ｈｕｍｍ ＪＬ，Ｃｏｃｋｅ ＲＲ．Ｕｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｏｉｏｎ． Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９７；７３：２２９−２３８に従って、神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）を修飾した。神経学的機能は、０ないし１６のスケール（正常スケール、０；最大欠乏スコア、１６）でグレード分けした。ＮＳＳは運動、感覚、反射およびバランステストの複合である（Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，ＬｕＤ，ＬｕＭ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ. Ｓｔｒｏｋｅ． ２００１；３２：１００５．，Ｇｅｒｍａｎｏ ＡＦ，Ｄｉｘｏｎ ＣＥ，ｄ’Ａｖｅｌｌａ Ｄ，Ｈａｙｅｓ ＲＬ， Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ Ｆ．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１９９４；１１：３４５−３５３．）。負傷の重症度スコアにおいて、１スコアポイントを、テストを行うことができないこと、またはテストした反射の
欠乏に対して与え；従って、スコアがより高ければ、負傷はより重症である。

結果
全ての動物についての直腸温度、ｐＨ、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２、ヘマトクリット（ｈｃｔ）、血中グルコース、心拍、平均動脈血脈、体重、死亡率についての群の間で統計学的差は観察されなかった（データは示さず）。

ＧＣＳＦ処理動物における機能的回復は、全ての他の群と比較して、経時的に顕著に良好であった。ＧＣＳＦ処理動物は、対照群と比較して、実験の間にビーム−バランスを含めた有意により低いＮＳＳスコアを有し（ｐ＜０．００１，図８ｂ）、その結果、対照と比較して有意に良好なロータロッド性能をもたらした（Ｐ＜０．０５，図８ａ）。接着テープ除去によって測定した体性機能もまた、対照と比較して経時的に対側性前足について、ならびに６週間において同側の前足についてＧＣＳＦ処理動物においてやはり良好であった（図８ｃ，ｄ参照）。

実施例７−ＧＣＳＦ受容体は、大脳虚血症の光血栓症モデルにおいてアップデギュレートされる。

標準的なプロトコル（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ）１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９）、続いて、病巣側に対して同側―および対側性であるラット皮質領域試料からのＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット精製に従って、ＲＮＡを単離した（組織試料の局所化については図９ａ参照；ここに：３対４）。標準的は条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリットＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用い、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色でのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用い、定量的ＰＣＲを行った。サイクリング条件は以下の通りであった：５分９５℃、５秒９５℃、７秒６６℃、３０秒７２℃；９秒８４℃で５５サイクル。融解曲線は以下のパラメータで行った：９５℃から５０℃へ冷却；０．２℃／秒において９９℃までランピング。以下のプライマー対を用いた：「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−３２ｓ」ＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣ（配列番号：７）、および「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２６５ａｓ」ＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧ（配列番号：８）。製造業者の推奨に従って（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用い、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲを行った。産物の特異性は、融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含有量は、シクロフィリン（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号：９）；「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：１０））の発現レベルに対して正規化した。相対的調節レベルは、シクロフィリンに対する正規化、および偽−操作、動物に対する比較の後に求めた。図９ｂは、対側性側での４８時間後におけるＧＣＳＦＲのアップレギュレーションを示し、誤差バーは標準偏差を示し、これらは３倍に系列的に希釈されたｃＤＮＡ試料から計算し、これは測定の信頼性を反映する。

実施例８−ＧＣＳＦ受容体は初代培養におけるニューロン細胞に存在する：免疫組織化学
ニューロンの調製
１０ないし１２の皮質はＥ１８段階（胚日１８）胚から調製した。組織は、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ）中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて解離した。消化は４部の培地（神経基礎培地＋１ｍｌ ５０×Ｂ−２７補足物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２５μＭグルタメート（ｇｕｌｔａ
ｍａｔｅ））を用いて停止させ、８００ｇにおいて室温にて５分間遠心した。ペレットを５ｍｌの培地に溶解させ、カウンティング（Ｎｅｕｂａｕｅｒスライド）によって細胞数を測定した。ポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーグラス上の２４−ウェルプレートのウェル当たり２５００００細胞の密度にて細胞を平板培養した。

免疫組織化学
調製から１４日後に、ニューロンをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し（３７℃）、氷上において２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳ（４℃）で洗浄し、４℃にて貯蔵した。細胞をＰＢＳ中の５０ｍＭグリシン中で１０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いて、細胞を氷上で浸透させ、室温にてブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．２％トリトン−Ｘ１００、４％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共にインキュベートした。一次抗体（マウスＧＣＳＦＲのＣ−末端に対して向けられたウサギ―抗−ＧＣＳＦ−Ｒｅｚｅｐｔｏｒ−抗体、Ｍ−２０；ｓｃ６９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を、（０．１％トリトンＸ１００／２％ＮＧＳ中の）１：８００の希釈で用い４℃にて一晩インキュベートした。次いで、細胞を１％ＮＧＳ／ＰＢＳで洗浄し、室温にて二次抗体（抗−ウサギ−ＦＩＴＣ，１：４００；ｄｉａｎｏｖａ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中で軽く洗浄し、核を逆染色するためにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＰＢＳ中１：１００００）で染色した。最後に、カバーグラスを１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中で２回、ＰＢＳ中で２回、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．６中で１０分間１回、軽く洗浄した。カバーグラスをＡｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて埋め込んだ。

オリンパスＩＸ８１顕微鏡および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）で写真をデジタル的に撮った。

実施例９−ＧＣＳＦ受容体はニューロン幹細胞に存在し：ＰＣＲおよび免疫組織化学（図１２，１３）；ＧＣＳＦ受容体はＰＣ１２細胞に存在する：ＰＣＲ（図２Ｂ）。

神経幹細胞の創製
神経幹細胞は、記載されているように、公知の自然発生神経形成、４ないし６週齢の雄Ｗｉｓｔｅｒラットの、海馬、嗅球、および脳室下帯で脳領域から単離した（Ｒａｙ Ｊ
ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９０：３６０２−６）。プロトコルは、合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌによって是認された動物の使用に関する方針に合致し、ドイツ国の法律の要件を満たす。簡単に述べれば、動物を１％（ｖ／ｖ）イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏ、２９％酸素で麻酔し、断頭によって犠牲にした。脳を摘出し、４．５ｇ／Ｌグルコース（ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ）を補足した５０ｍＬの氷冷ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で洗浄した。６匹の動物からの海馬、嗅球、および脳室下帯を切り開き、１０ｍＬのＤＰＢＳ／Ｇｌｃ中で洗浄し、１６００×ｇにおいて４℃にて遠心した。上清の除去の後に、組織をハサミおよびノミでホモゲナイズした。組織ピースを、８００ｇにおいて、ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ培地で５分間洗浄し、３つのペレットを、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０．０１％（ｗ／ｖ）パパイン、０．１％（ｗ／ｖ）ディスパーゼＩＩ（中性プロテアーゼ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ、および１２．４ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁させた。組織をプラスチックピペットチップで粉砕し、室温にて４０分間インキュベートしたが、１０分ごとに溶液をよく混合した。懸濁液を８００×ｇにおいて４℃にて５分間遠心し、ペレットを２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬのストレプトマイシンを補足した１０ｍＬのＤＭＥＭ−ハム
Ｆ−１２培地中で３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、Ｂ２７から（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭのＬグルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬのストレプトマイシン２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２、および２μｇ／ｍＬのヘパリンを補足した１ｍＬの神経基礎培地に再懸濁させた。細胞を２５，０００ないし１００，０００細胞／ｍＬの濃度にて６−ウェル皿中で滅菌条件下にて平板培養した皿を５％ＣＯ２中で３７℃にてインキュベートした。細胞培養基を１週間に１回交換し、そこでは、培地の約２／３を交換した（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９０：３６０２−６）。

ＲＴ−ＰＣＲプロトコル：
製造業者の推奨（ＲＮｅａｓｙキット，Ｑｉａｇｅｎ）に従い、凍結したストックから解凍した後に培養にて３週間増殖させた海馬幹細胞（図１２）から標準プロトコルに従ってＲＮＡを単離した。標準条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を以下のサイクリング条件：３分９４°、３０秒９４°、３０秒６０°、１分７２°で３２サイクルにてプライマー対「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−８ｓ」ＧＣＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣ（配列番号：２）、および「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２８７ａｓ」ＣＧＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号：３）を用いて行った。プライマーは、ＴＢＬＡＳＴＸサーチによってラットゲノムデータベースから確認されたラットＧＣＳＦＲの断片から誘導した（図１１参照）。反応条件：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｕＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭ各プライマー１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／２５μＬ。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分解した。特異的ＰＣＲ産物の長さは２７９ｂｐであり、以下の配列（配列番号：４）であった（プライマー配列には下線を施す）：

ＰＣ１２細胞でのＰＣＲでは（図２Ｂ）、前記プロトコルに従った。
ニューロスフィアの免疫細胞化学：
神経幹細胞からなるニューロスフィアをピペットでスライドグラス上に置き、カバーグラスを該細胞の上に置き、該スライドグラスを−８０℃に少なくとも３０分間置いた。カバーグラスを取り除き、直ちに、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）に入れた。細胞を２０分間固定した。細胞を１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３×５分洗浄した。細胞を、０．５％ＴＸ−１００を含有するＰＢＳ中で１０分間浸透させた。抗原を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で６０分間ブロックした。細胞を、ＰＢＳ中の０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度の核染料ＤＡＰＩで１２分間染色した。次いで、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２×５分洗浄した。最初の抗体を２時間適用し、各々、抗−Ｇ−ＧＳＦ １：１０００、抗−Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ
１：１０００、抗−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ １：１０００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の濃度にて、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７、５）で３×５分洗浄した。次いで、第２の抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ，（ＤＡＫＯ））を、１：３０の濃度にて、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ
７．４）中で６０分間適用した。細胞を１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３×５分洗浄した。細胞に最後にＡｑｕａｍｏｕｎｔおよびカバーグラスを設置した。

実施例１０−ＧＭＣＳＦＲアルファは、大脳虚血症の光血栓（ｐｈｏｔｏｔｒｏｍｂｏｔｉｃ）モデルにおいてアップレギュレートされる（ＲＭＤＤによる発見）。

実験プロトコルは地方倫理委員会によって承認された。体重が２８０ないし３２０ｇの雄Ｗｉｓｔｅｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ドイツ）を以下の処理に割り当てた：ａ）種々の時点（６時間、４８時間、２１日）での虚血症；ｂ）一致する時点（６時間、４８時間および２１日）での偽操作、虚血症無し、各時点および処理についてｎ＝２。

光血栓症による病変大脳虚血症
動物を１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン塩酸塩（ＷＤＴ，Ｇａｒｂｓｅｎ，ドイツ）の筋肉内注射で麻酔した。必要であれば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔を維持した。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧、および血中ガスの継続的モニタリングのために右大腿動脈に挿入した。処理注入のためにＰＥ−５０チューブによって、右大腿静脈にカニューレを入れた。実験の間、直腸温度をモニターし、サーモスタット制御加熱パッドによって３７℃で維持した（Ｆｏｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ドイツ）。

Ｗａｔｓｏｎ ＢＤ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＷＤ，Ｂｕｓｔｏ Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＭＳ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ＭＤ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ
ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９８５；１７：４９７−５０４の方法に従って、光血栓症虚血症をラット右壁皮質において誘導した。動物をケタミン塩酸塩で麻酔し、定位フレームに入れ、頭蓋表面の露出のために頭皮を切り開いた。照明のために、１．５−ｍｍ開口を持つ繊維−光学束を、ブレグマに対して４ｍｍ後にかつ中線から４ｍｍ側方に、頭蓋に定位にて置いた。頭蓋に冷白色光ビーム（１５０Ｗ）で２０分間照射した。最初の２分間の照射の間に、染料ローズベンガル（０．１３３ｍｌ／ｋｇ体重，１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を静脈内に注射した。偽−操作動物は、ローズベンガルの注入および照射なくして、前記したのと同一の実験手法を受けた。外科的処置の後、カテーテルを取り出し、動物を麻酔から回復させ、食料および水を自由に与えた。種々の時点（各々、虚血症および偽操作後６時間、４８時間、２１日）に従って動物を殺し、同側および対側性双方の皮質領域の調製は当業者に公知である。

ＲＮＡ単離およびＲＭＤＤ
ＲＮＡは、病巣側に対して同側−および対側性であるラットを皮質領域試料から、標準的プロトコル（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７），１６２，１５６−９）、続いてＱｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙミニキット精製）に従って単離した（組織試料の突き止めについては図１３ａ参照；ここに：３対４）。ＥＰ ０ ７４３ ３６７ Ａ２およびＵＳ ５，８７６９３２に記載されたＲＭＤＤ（制限媒介示差表示）−プロトコルに従い、ｃＤＮＡ合成は１μｇの全ＲＮＡから行った。第１ストランドおよび第２ストランドの合成、およびＭｂｏＩ消化の後、アダプター連結を行った。プライマー組み合わせのサブセットでの２つのＰＣＲ反応を行った。引き続いて、ＰＣＲ反応を変性ゲルに負荷し、ナイロン膜（ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ，Ｋｏｎｓｔａｎｚ，ドイツ）にブロットした。ビオチン−標識バンドを通常のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ反応で可視化した。皮質領域からのＰＣＲ試料を以下の順序でゲルにロードした；同側：ナイーブ（未処理）、偽６時間、偽４８時間、偽２１日
、および６時間、４８時間、２１日光血栓症；対側性：偽６時間、偽４８時間、偽２１日、および６時間、４８時間および２１日光血栓症。同側−および対側性領域において異なる強度を有するバンドをナイロン膜から切り出し、対応するＰＣＲ産物の再増幅を行った。増幅された産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）にクローン化し、Ｔ７およびＭ１３ｒｅｖプライマー（ＡＢＩ ３７００）で配列決定した。得られた配列をＥＭＢＬ−データベースと比較した。同側−および対側性皮質領域双方において４８時間後にアップレギュレートされた配列を同定した（図１４）。同定されたＥＳＴ−配列をＥＳＴ−データベースにおけるＢＬＡＳＴＮ−サーチで拡大し、マウスＧＭ−ＣＳＦＲアルファをコードするマウス相同配列を、スクリーニングプログラム（ＢＬＡＳＴ，ＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５，３３８９−４０２））を用いることによって、ＥＳＴ−およびゲノムデータベース（ｅｎｓｅｍｂｌ；ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）で同定した。

Ｓｈｅｐａｒｄ（（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３１８３−３１８５）のＰＣＲクローニング方法でラットｃＤＮＡライブラリーにおいてスクリーニングを行って、得られたラット配列を確認した。この方法は、ビオチン−カップルドオリゴヌクレオチド配列への、プラスミドライブラリーに由来するｃＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションに基づく。ストレプトアビジン−カップルド磁性ビーズでのプラスミド抽出後に、単一クローンを回収するまでの、得られたプラスミドの再形質転換に続く診断ＰＣＲおよび工程の２倍複製によって結果を確認した。以下のプライマー組合せを用いた：５’ブロック−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＧＣＧＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＴＣＡＡ（配列番号：１２）
２５ｂｉｏ−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＴＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号：１３）
３’ブロック−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＡＣＧＴＣＧ（配列番号：１４）。
（ＯＲＦは単一クローンについて決定し該配列は配列番号：４０として示され、対応するアミノ酸配列は配列番号：４１として示される。）
実施例１１−ＧＭＣＳＦ受容体アルファは大脳虚血症の光血栓モデルにおいてアップレギュレートされる（定量的ＰＣＲによる確認）。

ＲＮＡは、病巣側に対して同側−および対側性であるラット皮質領域試料から、標準的プロトコル（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７），１６２，１５６−９）、続いてＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキット精製）に従って単離した（組織試料の突き止めについては図１３ａ参照；ここに：３対４）。標準条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用い、ｃＤＮＡを１μｇ全ＲＮＡから合成した。ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色でのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。サイクリング条件は以下の通りであった：５分９５℃、５秒９５℃、７秒６２℃、３０秒７２℃、９秒８０℃で５０サイクル。融解曲線は以下のパラメータで行った：９５℃から５０℃まで冷却；０．２℃／秒での９９℃へのランピング。以下のプライマー対を用いた：「ラットＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ（配列番号：１５）、および「ラットＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号：１６）。製造業者の推奨（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従い、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用い、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）ＰＣＲを行った。産物の特異性は融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含有量はシクロフィリンの発現レベルに対して正規化した（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号：１７）；「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴ
ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：１８））。相対的調節レベルは、シクロフィリンへの正規化および偽−操作動物に対する視覚の後に得られた。図１４は、同側−および対側性側での４８時間後におけるＧＮＣＳＦＲアルファのアップレギュレーションを示す。光血栓症の誘導から２１日後に、検出可能な有意な調節はなかった（図１４ｂ）。誤差バーは標準偏差を示し、これらは３倍系列希釈ｃＤＮＡ−試料から計算され、測定の信頼性を反映する。

実施例１２−ＧＭＣＳＦ−受容体アルファは初代皮質培養においてニューロン細胞に存在する：ニューロンの調製。

１０ないし１２の皮質はＥ１８段階（胚日１８）の胚から調製した。組織は、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液，Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ）中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて解離した。消化は４部の培地（神経基礎培地＋１ｍｌ ５０×Ｂ−２７補足物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２５μＭグルタメート（ｇｕｌｔａｍａｔｅ））を用いて停止させ、８００×ｇにおいて室温にて５分間遠心した。ペレットを５ｍｌの培地に溶解させ、カウンティング（Ｎｅｕｂａｕｅｒスライド）によって細胞数を測定した。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーグラス上の２４−ウェルプレートのウェル当たり２５０，０００細胞の密度で平板培養した。

免疫細胞化学
調製から１週間後に、ニューロンをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）（３７℃）で洗浄し、氷上において２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳ（４℃）で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５０ｍＭグリシン中で１０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を氷上で浸透させ、室温にて、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．２％トリトン−Ｘ１００、４％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共にインキュベートした。一次抗体（マウスＧＭＣＳＦＲのＣ−末端に対して向けられたウサギ−抗−ＧＭ−ＣＳＦ−受容体−抗体、Ｍ−２０；ｓｃ−６９１；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を（０．１％トリトン−Ｘ１００／２％ＮＧＳ中の）１：３００の希釈で用い、４℃にて一晩インキュベートした。次いで、細胞を１％ＮＧＳ／ＰＢＳで洗浄し、室温にて二次抗体（抗−ウサギ−ＦＩＴＣ，１：４００；ｄｉａｎｏｖａ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中で軽く洗浄し、核を逆染色するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＰＢＳ中１：１０，０００）で染色した。最後に、カバーグラスを１％ＮＧＳ／ＰＢＳ中で２回、ＰＢＳ中で２回、および１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．６中で１０分間１回、軽く洗浄した。Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてカバーグラスを埋め込んだ。

オリンパスＩＸ顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアで（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）で写真をデジタル的に撮った。

実施例１３−ＧＭＣＳＦ受容体は神経幹細胞に存在する：神経幹細胞の創製（図１３）。

神経幹細胞は、公知の自然発生神経形成、すなわち、記載されているような４ないし６週齢雄Ｗｉｓｔｅｒラットの海馬、嗅球、および脳室下帯にて、脳領域から単離した（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。プロトコルは、合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｏｕｎｃｉｌによって承認された動物の使用についての方針に合致し、かつドイツ国法律の要件を満足する。簡単に述べると、動物を１％（ｖ／ｖ）イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏ、２９％酸素で麻酔し、断頭によって犠牲にした。脳を摘出し、４．５ｇ／Ｌグルコースを補足した５０ｍＬ氷冷ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ）中で洗浄した。６匹の動物からの海馬、嗅球、および脳室下帯を切り開き、１０ｍＬのＤＰＢＳ／Ｇｌｃ中で洗浄し、１６００×ｇにおいて４℃にて５分間遠心した。上清の除去の後、組織をハサミおよびメスでホモジナイズした。組織ピースをＤＰＢＳ／Ｇｌｃ培地で８００ｇにおいて５分間洗浄し、３つのペレットを、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０．０１％（ｗ／ｖ）パパイン、０．１％（ｗ／ｖ）ジスパーゼＩＩ（中性プロテアーゼ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ、および１２．４ｍＭ硫酸マグネシウムに再懸濁させた。組織をプラスチックピンセットチップで粉砕し、室温にて４０分間インキュベートしたが、１０分毎に、溶液を十分混合した。懸濁液を８００×ｇにおいて４℃にて５分間遠心し、ペレットを２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬストレプトマイシンを補足した１０ｍＬのＤＭＥＭ−ハムＦ１２培地中で３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬストレプトマイシン２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、および２μｇ／Ｌヘパリンを補足した１ｍＬ神経基礎培地に再懸濁した。細胞を、２５，０００ないし１００，０００細胞／ｍＬの濃度にて６−ウェル皿中で滅菌条件下に置いた。皿を５％ＣＯ２中にて３７℃でインキュベートした。細胞培養基を１週間に１回交換し、そこでは、培地の約２／３を置き換えた（Ｒａｙ Ｊ
ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。

ＲＴ−ＰＣＲプロトコル
ＲＮＡは、製造業者の推奨（ＲＮｅａｓｙキット，Ｑｉａｇｅｎ）に従い、凍結されたストックからそれらを解凍後に培養にて３週間増殖させた海馬幹細胞から、標準プロトコルに従って単離した。ｃＤＮＡは、標準条件を用いオリゴｄＴプライマースーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いて合成した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマー対「ラットＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ（配列番号：１９）、および「ラットＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号：２０）を用い、以下のサイクリング条件で行った：３分９４°、３０秒９４°、３０秒６０°、１分７２°；で３２サイクル。反応条件：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｕＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭ各プライマー、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／２５μＬ。ＰＣＲは１．５％アガロースゲルで分解した。特異的ＰＣＲ産物の長さは１７６ｂｐであり、以下の配列であった（プライマー配列には下線を施す）：

実施例１４：血液脳関門を通ってのＧＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの血清半減期および通過を測定するためのアッセイ
ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが血液−脳関門を通過するか否かを知るのは望ましい。脳組織におけるケモカリンの検出のために、高度に感受性のアビジン−ビオチン相互作用を利
用するためにＧＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦをビオチニル化する。Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｒｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ）を、ビオチン−ＸＸ−ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂ １６０６）を用いてビオチニル化した。Ｇ−ＣＳＦを、２５０ｍＭソルビトールおよび０．００４％Ｔｗｅｅｎ−８０およびビオチン−ＸＸ−ＳＥを添加した２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８に希釈した。室温での１時間後にトリス−緩衝液ｐＨ８を５０ｍＭ濃度まで加えて、未反応標識試薬をクエンチした。試料をＴＬＡ１１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて４５０００ｒｐｍで３０分間回転させて、凝集物を除去した。

７．５μｇのビオチニル化Ｇ−ＣＳＦを（２５０ｍＭソルビトールおよび０．００４％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む２００μＬの２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８中で）時刻０においてマウスに腹腔内に注射した。マウスを示した時間にクロロヒドレートで麻酔し、血液試料（ほぼ２００μＬ）を右側心臓チャンバーから採取した。ＥＤＴＡを５ｍＭまで加え、試料を１０００ｇにおいて１０分間遠心して、血清を得た。４×試料緩衝液を血清に加え、５分間で９５℃まで加熱することによって蛋白質を変性し、２０μＬをミニゲルに加えた。蛋白質をニトロセルロースに移し、ブロックし、ＴＢＳＴ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートした。洗浄の後、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌケミルミネセンス試薬を用いてシグナルを検出した。

Ｅｌｉｓａ分析のために、血清試料をアッセイ緩衝液中に１：２０希釈し、製造業者の指示（ＩＢＬ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）に従ってアッセイを行った。

このアッセイは脳脊髄液（ｃｓｆ）または脳ホモゲネートに従って適合させて、ＧＣＳＦの血液−脳−関門を横切っての移動を測定することができる。

実施例１５：ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの神経保護作用についてのアッセイ（図１ｂ）
ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの神経保護作用を、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞でイン・ビトロにて測定した。ＰＣ１２細胞を、４０，０００細胞／ウェルの密度にてポリ−ｌ−リシン（０．０１％最終濃度）で被覆した９６ウェルプレートに撒いた。細胞を１０００ｍｇグルコース／ｌおよび１０％ＨＳ（ウマ血清）、５％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中に維持した。次いで、製造業者の推奨に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）（０．２ｕｇ ＤＮＡ／ウェル）を用い、（レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードする）ｐＳＶ４０−ＲＬでトランスフェクトした。トランスフェクション直後に、ＮＧＦ（神経成長因子）を４０ｎｇ／ｍＬの濃度にて加えてＰＣ１２の分化を誘導した。処理後２４時間においてＰＣ１２細胞は拡大した突起を持つニューロン−様形態を発生させる。次いで、細胞を変化させる濃度のＨ_２Ｏ_２（図１ｂ）、および変化させる濃度（１ないし１００ｎｇ／ｍｌ）のＧＣＳＦで処理した。ＥＰＯを、０．０１Ｕ／ｍｌないし１Ｕ／ｍｌの濃度にてイン・ビトロにおける公知の神経保護能力を持つ物質に対する陽性対照として加えた（Ｃｅｒａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７，８−１２．，Ｋａｗａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３９４６９−７５．，Ｓｉｎｏｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０００），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２９０，２１３−５．，Ｃｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２２，５０３−１４）。２４時間後に、培地上清を捨て、受動性溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を溶解させた。次いで、レニラルシフェラーゼ活性をルミノメータ（Ｍｉｔｈｒａｓ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）に記録し、読みを相対的光単位として表した。このアッセイは、検出可能なルシフェラーゼの量として細胞の生存を測定する。従って、相対的光単位がより高いと、より多くの細胞が生存したことになる。このアッセイにおいて、ＧＣＳＦはＰＣ１２細胞の用量−依存性神経保護を示し、これはエリス
ロポエチンよりも優れていた。

実施例１６−ＧＣＳＦ受容体は神経学的病気で重要な種々の脳領域で発現され（図４）；ＧＭＣＳＦは種々の重要な脳領域で発現される（図１９）。

正常なマウス脳におけるＧＣＳＦ受容体の分布に系統的にアクセスするために、ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）（登録商標）およびケタネスト（Ｋｅｔａｎｅｓｔ）（登録商標）の腹腔内注射を用いてＣ５７／ｂｌ６マウス（２ないし３月齢）を麻酔した。次いで、２０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でマウスを経心臓的に灌流した。脳を切り開き、２％ＰＦＡ溶液に一晩貯蔵した。パラフィン包埋組織を細片化し（２ｕｍ）、予め処理したスライド（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上に設置し、一晩風乾し、引き続いて脱パラフィン化した。マイクロ波処理（クエン酸緩衝液；５００Ｗ，１０分）後に抗−ＧＣＳＦＲ抗体（１：４００）を適用し、組織を湿潤チャンバー中で室温にて１時間インキュベートした。製造業者の推奨（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に従い、ルーチン的ＡＢＣ技術および発色原としてのＤＡＢを用いて抗体標識を可視化した。陰性対照は、一次抗体が全く除かれた同様に処理したセクション、ならびに適当な正常な血清が用いられるセクション（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を含んだ。ＧＣＳＦ−Ｒの局所化は、ＣＡ３領域中のニューロンの圧倒的な染色（図４ａ，ｂ）を持つ、ＣＡ３およびＣＡ２領域の間に鋭い境界を持つ（図４ｃ，矢印）海馬（図４ａないしｄ）で観察された。ＧＣＳＦ−Ｒはニューロンの体幹ならびに突起に渡って分布する（図４ｂ，矢印）。受容体は歯状回の門および基礎細胞層に存在する（図４ｄ，矢印）。また、ＧＣＳＦ−受容体は皮質領域：梨状皮質（図４ｅ）、および鼻周囲皮質（ｆ）においても、その実施例として、検出された。小脳においては、プルキニエ細胞が標識された（図４ｇ，矢印）。また、嗅球における大きな僧帽細胞のいくつかはＧＣＳＦ−Ｒ陽性である（図４ｈ，矢印）。強い染色が脊髄中の前柱によって呈され（図４ｉ，ｊ）およびより高い倍率は大きな運動ニューロンをＧＣＳＦ−Ｒ陽性として同定する（図４ｋ，ｌ）。ニューロン突起は強く標識されることに注意されたし。中脳においては、黒質中のニューロンはＧＣＳＦ−Ｒ陽性を示す（図４ｍ，ｎ，ｏ）。ニューロンとは別に、白色物質管中の稀突起神経膠細胞は、例えば、前交連において染色される（図４，ｐ，矢印）。

同一試料はＧＭＣＳＦＲの局所化に適用される（図１９）。ここに、染色は海馬において、皮質において、小脳において、および脈絡叢で見られた。中脳および脊髄はこれまで調べられたことがなかった。

実施例１７：ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの神経保護作用についてのアッセイ（図１ｂ，２３）
ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの神経保護作用は、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞についてイン・ビトロで測定した。ＰＣ１２細胞を、４０，０００細胞／ウェルの密度にて、ポリ−ｌ−リシン（０．０１％最終濃度）で被覆した９６ウェルプレートに撒いた。細胞を、１０００ｍｇグルコース／ｌおよび１０％ＨＳ（ウマ血清）、５％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中に維持した。次いで、製造業者の推奨に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）トランスフェクション剤（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）（０．２ｕｇＤＮＡ／ウェル）を用い、（レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードする）ｐＳＶ４０−ＲＬで細胞をトランスフェクトした。トランスフェニルクション直後に、ＮＧＦ（神経成長因子）を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて、ＰＣ１２細胞の分化を誘導した。処理後２４時間において、ＰＣ１２細胞は、拡大された突起を持つニューロン−様形態を発生する。次いで、変化させる濃度のＨ_２Ｏ_２で（図１ｂ，図２３）、および変化させる濃度（１ないし１００ｎｇ／ｍｌ）のＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦで細胞を処理した。ＥＰＯは、０．０１Ｕ／ｍｌないし１Ｕ／ｍｌ（図１ｂ）、また
は０．５Ｕ／ｍｌ（図２３）の濃度にて、イン・ビトロでの公知の神経保護能力を持つ物質に対する陽性対照として加えた（Ｃｅｒａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７，８−１２．，Ｋａｗａｋａｍｉ．ｅｔ
ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３９４６９−７５．，Ｓｉｎｏｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０００），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２９０，２１３−５．，Ｃｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ
Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２２，５０３−１４）。２４時間後に、培地上清を捨て、受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を溶解させた。次いで、レニラルシフェラーゼ活性をルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）に記録し、読みを相対的光単位として表した。このアッセイは、細胞の生存を検出可能なルシフェラーゼの量として測定する。従って、相対的光単位がより高いと、より多くの細胞が生存したことになる。このアッセイにおいて、ＧＣＳＦならびにＧＭＣＳＦは、エリスロポエチンよりも優れたＰＣ１２細胞の用量−依存性神経保護を示した。

実施例１８：血栓塞栓症大脳虚血症
実験プロトコルは地方倫理委員会によって承認された。２８０ないし３２０ｇの体重の４０匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ドイツ）を以下の群にランダムに割り当てた：Ａ）血栓塞栓症血管閉塞から１時間後における、１時間の間の１０ｍｇ ｒｔ−ＰＡ／ｋｇ体重での初期血栓溶解；Ｂ）血栓塞栓症血管閉塞から３時間後における、１時間の間の１０ｍｇ ｒｔ−ＰＡ／ｋｇ体重での後期血栓溶解；Ｃ）血栓溶解なし、しかし、血栓塞栓症虚血症から３０分後に開始する、９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％中の６０μｇ／ｋｇ体重の組換えＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダ）での処理；Ｄ）血栓塞栓症血管閉塞から３時間後における１時間の１０ｍｇ ｒｔ−ＰＡ／ｋｇ体重での後期血栓溶解と組み合わせた、血栓塞栓症虚血症から３０分後に開始する９０分間の２ｍｌ生理食塩水０．９％中の６０μｇ／ｋｇ体重の組換えＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダ）での処理。

動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン塩酸塩（ＷＤＴ，Ｇａｒｂｓｅｎ，ドイツ）の腹腔内注射で麻酔した。必要であれば、麻酔を５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持する。平均動脈血圧、血中ガス、ヘマトクリット、白血球カウントおよび血中グルコース濃度の連続的モニタリングのために、ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを右大腿動脈に挿入する。処理注入のために、ＰＥ−５０チューブによって右大腿静脈にカニューレを入れる。実験の間に、直腸温度をモニターし、サーモスタット制御加熱パッド（Ｆｏｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ，ドイツ）によって３７℃に維持する。

Ｂｕｓｃｈらによって記載された修飾された方法に従い、血栓塞栓症発作を誘導する（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９７ Ｄｅｃ ５；７７８（１）：１６−２４）。簡単に述べれば、右総頸動脈（ＣＣＡ）、内部頸動脈（ＩＣＡ）および外部頸動脈（ＥＣＡ）を首の中線切開を通じて露出させる。さらなる切開により、翼突口蓋動脈（ＰＰＡ）の起源を同定した。ＥＣＡおよびＰＰＡは６−０絹縫合によって永久的に結紮されるであろう。ＣＣＡは塞栓の時間の間一時的に結紮されるに過ぎない。カテーテルをその結紮に対して近位にあるＥＣＡに挿入し、１２の白血球血餅（各々直径が０．３５ｍｍおよび長さで３ｍｍ）を注射し、その結果、右中央大脳動脈（ＭＣＡ）の塞栓がもたらされた。

梗塞の発生は、拡散−、灌流−、およびＴ２−重み付けイメージニングを用いることにより、１、２、４および２４時間におけるＭＲ−イメージニングによってモニターする。全ての動物において、結果は、虚血症から２４時間後において５点スケールに基づいて、死亡率ならびに神経学的結果によって測定する。虚血症から２４時間後に、ラットをケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し、断頭する。脳を取り出し、０．１モル／ｌリン酸監
視溶液中の４％パラホルムアルデヒトで２４時間固定する。パラフィン−包埋後に、１−μｍ厚みのセクションを切断し、ＴＴＣ、Ｈ＆Ｅ、およびＮｉｓｓｌ染色および免疫組織化学分析のために用いる。

統計学的分析
値は平均±ＳＤである。全てのデータを獲得した後、ランダム化暗号を解除する。ＡＮＯＶＡおよび引き続いてのポストＨＯＣ Ｆｉｓｈｅｒ保護最小有意差検定を用いて、生理学的パラメータおよび梗塞容量のような連続変数の差の統計学的有意性を決定する。マン−ホイットニーＵ検定を死亡率のような非パラメータデータのために行う。ｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられる。

実施例１９：Ｇ−ＣＳＦは、中央大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、げっ歯類発作モデルにおいて拡大された時間ウィンドウで与えた場合に効果的である。

図２４は、虚血症の開始から１２０分後に適用した場合に、ラットＭＣＡＯモデルにおける梗塞容量に対する静脈内適用Ｇ−ＣＳＦの効果を示す。実験は、麻酔を吸入麻酔（１％ハロタン、３０％Ｏ_２、および７０％Ｎ_２Ｏ）によって誘導した以外は実施例１に記載したように行った。また、ここに、６０μｇのＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），ＡＭＧＥＮ）／ｋｇラット体重の用量を用いた。ＴＴＣ染色によって、有意な保護が、梗塞容量を比較した場合に見られた（図２５参照）。実施例１におけるような調査者のもう１つの組によって操作を行い、これは、もう１つの研究上設定における効率を示す。本実施例は、さらに、発作および神経系の他の虚血症障害についての治療としてのＧ−ＣＳＦの有用性を示す。

実施例２０：脳におけるＧＣＳＦおよびその受容体の近接配置
用いた免疫組織化学方法
パラフィン−包埋組織のセクション（２μｍ）をそれらをキシロールで２×５分、１００％エタノールで２×２分処理し、次いで、９６％から７０％まで減少させる濃度のエタノールで処理することによって、脱パラフィン化した。最後に、セクションを蒸留水で洗浄し、マイクロ波で処理した（１５分間の６００Ｗにおけるクエン酸緩衝液）。その後、セクションを蒸留水で洗浄し、抗原を０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で３×５分ブロックした。０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈したＧＣＦＳ−受容体抗血清（ＳＣ６９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を、湿潤チャンバー中で室温にて１時間インキュベートした、次いで、セクションを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３×２分洗浄した。次いで、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で、第２の抗体（ヤギ抗−ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣ，ｄｉａｎｏｖａ，１：５０）を４℃にて適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡでセクションを３×２分洗浄した後、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡに１：１００希釈したＧＣＳＦ抗血清（ＳＣ１３１０２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を室温にて１時間適用した。セクションを前記したように３回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中に１：２００希釈したビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。再度セクションを洗浄した後、ＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（ｄｉａｎｏｖａ；１：２００）を室温にて１．５時間適用した。次いで、セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄し、１×ＴＢＳ中に１：１００００希釈した核染料ＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄し、蛍光用の設置培地を設置した
（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）。オリンパスＩＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔ
Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）でデジタル的に写真を撮った。

全ての二重−蛍光実験は平行単一−染色によって制御し、これは、第２のチャネルにおいていずれかの蛍光キャリーオーバーの不存在についてチェックした。第２の対照として、全ての二重−蛍光染色は二次抗体についてスイッチされたクロモフォアで行った。

結果
ＧＣＳＦ受容体（図２５ａ，ｄ，ｇ）は、海馬（図２５ａないしｃ歯状回、ｄないしｆ門）および皮質（図２５ｇないしｉ）双方において、そのリガンドとの共局所化を示す（図２５ｂ，ｅ，ｈ）。同一ニューロンが受容体およびリガンド双方を発現するという驚くべき発見は、神経系の新規な内因性神経保護システムを支持するＧＣＳＦのオートクリンシグナリングメカニズムを示唆する。

実施例２１：脳におけるＧＣＳＦ受容体およびＧＭＣＳＦ受容体の近接配置
免疫組織化学的方法
免疫組織化学は実施例２０に記載したように行った。ＧＣＳＦＲ抗血清およびヤギ抗−ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣとセクションとのインキュベーションの後に、セクションを１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡで３×２分洗浄した。その後、ＧＭＣＳＦＲ抗血清（ＳＣ６９０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を室温にて１時間適用した。ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）およびＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（ｄｉａｎｏｖａ；１：２００）とのインキュベーションを含めた以下の手法を、実施例２においてＧＣＳＦ検出について記載したように行った。

すべての二重−蛍光実験は平行単一−染色によって制御し、これを第２のチャネルにおけるいずれかの蛍光キャリーオーバーの不存在についてチェックした。第２の対照として、全ての二重−蛍光染色は二次抗体のためのスイッチされたクロモフォアで行った。

結果
ＧＣＳＦ受容体（図２６ａ，ｄ，ｇ）およびＧＭＣＳＦ受容体（図２６ｂ，ｅ，ｈ）は、海馬および皮質（図２６ｃ，ｆ，ｉ）双方において同一ニューロンで発現される。図２６は、海馬の歯状回（ａないしｃ）および門（ｄないしｆ）における、ならびに皮質（ｇないしｉ）における、ニューロン上での双方の受容体の共発現を示す。この知見は、さらに、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが組み合わせて用いて、神経学的疾患を治療し、および造血因子の神経保護特性は組み合わせて起用によって促進され得るという主張を説明する。

実施例２２：ＧＣＳＦはニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用する。

結果
初代培養ニューロンは、作用メカニズムを解明するためのツールである。従って、我々は、Ｇ−ＣＳＦ受容体が培養の２１日後に海馬または皮質ニューロンで発現されるか否かをチェックした。事実、我々は、皮質ならびにほとんどの海馬ニューロン双方での発現をＰＣＲ（先の実施例）および免疫細胞化学によって確認した。発作病理生理学における最も重要なメカニズムのうちの１つは、遅延したニューロン細胞死滅である（Ｃｈｏｉ（１９９６），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，６，６６７−７２，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎａｔ Ｍｅｄ，５，５５４−９，Ｍａｔｔｓｏｎ（２０００），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１，１２０−９）。従っ
て、我々は、Ｇ−ＣＳＦはニューロン中のアポトーシスカスケードに干渉するのではないかと仮説を立てた。Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現することが判明した初代ニューロン培養において、大脳虚血症の間における重要な事象である酸化窒素への暴露は、ＰＡＲＰ−切断（示さず）によって証明されるようにプログラムされた細胞死滅の用量−依存性増加に導く。５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦでの処理は、図２７に例示されるように、ＮＯＲ３処理の後にアポトーシス細胞死滅を劇的に低下させた。造血系の系列の細胞において、ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、Ｊａｎｕｓキナーゼ２（ＪＡＫ２）およびシグナルトランスデューサおよびトランスアクチベータ（ｓｔａｔ）蛋白質（Ｊａｋ−ｓｔａｔ経路）を介してその抗−アポトーシスシグナルを伝達する（例えば、（Ｅｐｌｉｎｇ−Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６，７４８６−９５，Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｔ Ｊ Ｈａｍａｔｏｌ，７７，６０−７０））。我々はｓｔａｔ１またはｓｔａｔ５のリン酸化によって活性化を検出できなかったが（図２７、パートＩＩＩ）、ｓｔａｔ３は、他の細胞型においてＪＡＫ−ｓｔａｔキネティクスに典型的な時間−依存的なＧ−ＣＳＦの添加によって強くリン酸化された（図２７、パートＩＶ）（図２７、パートＶ；のＫｕｒｏｋｉ，Ｍ．＆Ｏ‘Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ＥＲＫ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｐａｔｈｗａｙｓ ｔａｒｇｅｔ ＳＴＡＴ３ ｏｎ ｓｅｒｉｎｅ−７２７ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ３４１（Ｐｔ３），６９１−６（１９９９）：から採取し、適合させた）。培養基へのＧ−ＣＳＦの添加によって惹起されたｓｔａｔ３ ｔｙｒ７０５リン酸化は、Ｇ−ＣＳＦ受容体／ＪＡＫ２経路を介して特異的に媒介された。というのは、阻害剤ＡＧ４９０によるＪＡＫ２／ｓｔａｔ３連結のブロッキングは、Ｇ−ＣＳＦの存在下における劇的に低下したシグナルに導いたからである（図Ｘ）。ｓｔａｔ３活性化は、ｂｃｌファミリーの抗−アポトーシス蛋白質の誘導に導く（Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９６，６４１−５３，Ｓａｋａｉ ａｎｄ Ｋｒａｆｔ（１９９７），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２，１２３５０−８，Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１３，７３５−８）。ニューロン培養へのＧ−ＣＳＦの添加は、ニューロンにおける大脳虚血症の間での、Ｂｃｌ−Ｘ１およびＢｃｌ−２双方、優れた抗−アポトーシス蛋白質の時間−依存性増加に導いた（図２７、パートＶＩ）。興味深いことには、最近の報告は神経負傷後の運動ニューロンについての必須の生存蛋白質としてのｓｔａｔ３を示唆する（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１５６，２８７−９７）。従って、Ｇ−ＣＳＦは、ｓｔａｔ５およびＮＦ−ｋＢ活性化を含むＥＰＯの提案された抗−アポトーシスメカニズムとは異なって作用するようである（Ｄｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ（２００１），Ｎａｔｕｒｅ，４１２，６４１−７）。

方法
ラットからの初代皮質ニューロンは以下のようにして創製した：１０ないし１２の皮質をラット胚Ｅ１８から切り出した。組織は、ＨＢＳＳ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｋｅｒ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシン、５ｍｇ／ｍｌＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて解離した。１×Ｂ−２７補足物を含有する４部の神経基礎培地を用いて消化を停止させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）。遠心後に、ペレットを５ｍｌの培地に溶解させ、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーグラス上の２４−ウェルプレートのウェル当たり２５０，０００細胞の密度にて細胞を平板培養した。培地は、典型的には、５０ｍｌの神経基礎培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）、１ｍｌの補足物Ｂ２７（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μｌのｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ，１９μｇを１００μｌの１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７に溶
解させた）、および５０μｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する。

ＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ５、ｐＳＴＡＴ５，ＧＣＳＦＲ、ＰＡＲＰ、切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、切断されたカスパーゼ３、Ｂｃｌ２、およびＢｃｌ ｘｌの検出はウェスタンブロッティングによって行った。簡単に述べれば、示したように、ニューロンを１５０ｍＭのＮＯＲ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｅｅｌｚｅ，ドイツ）、および５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２４時間処理した。細胞をプレートから掻き落とし、８００ｒｐｍにおいて５分間回転沈降させ、２．５ｍｇ／ｍｌのペプスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｅｅｌｚｅ，ドイツ）およびアプロチニン（１：１０００，Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。ペレットを（１０μｌの１０×ＰＢＳ７９．５μｌのＨ_２Ｏ、１０μｌの１０％ＳＤＳ、０．５μｌの１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０，１μｌのアプロチニン、０．１μｌのロイペプチン、０．１μｌのペプスタチン、０．１μｌのＰＭＳＦ、０．１μｌのベンゾナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を含有する）１００μｌのベンゾナーゼ溶液に再懸濁させた。可溶化の後、１容量のＰＢＳを加え、蛋白質濃度を測定した（ＢＣＴ−Ｔｅｓｔ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）。９５℃にて５分間変性した後、１００μｇを８％ないし１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。半−乾燥−ブロッティングチャンバー（Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｅｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ）を用い、蛋白質をニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔａｎ ＢＡ７９，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に移した。ブロットをＰＢＳ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０中の５％ミルク粉末でブロックし、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、各一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした（抗−切断−ＰＡＲＰ−抗体、細胞シグナリング、１：１０００；抗ＰＡＲＰ、細胞シグナリング、１：１０００；抗切断カスパーゼ３、細胞シグナリング、１：２００；抗カスパーゼ３、細胞シグナリング、１：２００；抗Ｂｃｌ２、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００；抗Ｂｃｌ Ｘ１、ＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００；抗ｐＳＴＡＴ３ｔｙｒ、細胞シグナリング、１：５００；抗ＳＴＡＴ３、細胞シグナリング、１：５００；抗ＧＣＳＦＲ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：２００；抗ｐＳＴＡＴ５、細胞シグナリング、１：５００；抗ｓｔａｔ５、細胞シグナリング、１：２００；抗ｐＳＴＡＴ１、細胞シグナリング、１：５００）。洗浄の後に、ブロットを各二次抗体（抗−ウサギ、または抗−マウス−抗血清ＨＲＰ−カップルド、Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ １：４０００）と共に室温にて１時間インキュベートした。スーパーシグナルケミルミネセンスシステム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いてシグナルを検出し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に暴露した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） Ｉｍａｇｅ Ｊ
ｖ１．２９（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｂ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用い、ＰＡＲＰ切断をスキャンされたオートラジオグラフで定量した。

実施例２３：ＧＣＳＦおよびその受容体は大脳虚血症によって誘導される。
大脳虚血症のＭＣＡＯモデル
病変大脳虚血症（ＭＣＡＯ）、中央大脳動脈閉塞）を誘導する手法は、実施例１に記載したように行った。

全体的虚血症モデル
虚血症／再灌流についてランダム化された動物での実験は、従前に詳細に記載されているように行った（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２０，１４２５−３６）。簡単に述べれば、ラットを
麻酔し（クロラールヒドレート）、経口的にチューブを入れ、機械的に通気した（実験を通じて３５ないし４０ｍｍＨｇにおいてＰａ_ＣＯ２、９５ないし１１０ｍｍＨｇにおいてＰａ_ＣＯ２）。双方の総頸動脈（ＣＣＡ）を露出させ、血液サンプリンクおよびＭＡＢＰ（Ｓｉｒｅｃｕｓｔ ３１０，Ｓｉｅｍｅｎｔｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）の継続的モニタリングのため、ポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）でカテーテル処理した。右側では、一過的大脳虚血症を誘導するために後に用いるＣＣＡの周りにナイロン糸を緩くループとした。動物の頭部をＥＥＧおよびＣＢＦ測定のために定位フレームにて固定した（詳細については、（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｎｏｇａ，Ａｓｔｈｅｉｍｅｒ，Ｇｏｔｚ，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｈｅｉｍａｎｎ，Ｗｅｌｓｃｈｏｆ ａｎｄ Ｋｅｍｐｓｋｉ（２０００），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２０，１４２５−３６）参照）。カルバリウムを、中央切開によって露出させ、塩素化銀ピンＥＥＧ電極を保持するために設計された２つの窪みを作製した（Ｐｒａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ（１９８６）ｂｒａｉｎ ａｔｌａｓに従って左体性感覚皮質および前頭洞に渡って位置させた。高速歯ドリル）。右半球に渡って、約２４ｍｍ^２の頭蓋骨を取り出し、薄い骨層を残した（右側に１．３ないし５．３ｍｍ側方に高く、ブレグマから１．５ないし７．５ｍｍの後頭側）。コンピュータ駆動マイクロマニピュレータで制御されたレーザードップラー−フロープローブ（波長：７８０μｍ，ＢＰＭ ４０３Ａ、ＴＳＩ
Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して、「スキャンニング技術」を用い、３０の位置における領域的大脳血流（ｒＣＢＦ）を測定した（Ｓｏｅｈｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐｌ，７６，１８１−４）。対側性側において（左側に対して３．３ないし５．３ｍｍ側方、ブレグマから５．０ないし７．０ｍｍ後頭側）、より小さい（４ｍｍ^２）ウィンドウを確立して、静止レーザードップラー−フロープローブ（波長：７８０μｍ，ＢＰＭ２，Ｖａｓａｍｅｄｉｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用い、局所的大脳血流（ｌＣＢＦ）を測定した。温度プローブは、従前に記載されているように、（（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９２，１１１−２２））、右側側頭筋肉に、左側耳介管において、および直腸中６ｃｍ深さに入れた。コア温度（サーモスタッド制御加熱ブランケット）および側頭筋肉温度（梗塞下熱ラジエータ近く）を、実験手法を通じて３７．５±０．１℃に制御した。動物の下方体セクションを気密チャンバーに入れた。これは、電子的に調節された真空ポンプによって低圧を確立することを可能とし、それにより、制御された様式で（「低圧低血圧」）動物の動脈血圧を低下させる（静脈プーリング）。外科的安定化期間から３０分後に、右頸動脈の周りの規定された錘に付着させたナイロン糸を引っ張って、血管を閉塞することによって（動脈圧力は左頸動脈に入れられたカテーテルによって測定した）、一過的全大脳虚血症を開始させた；低圧低血圧技術を用い、ＭＡＢＰを同時に３５ｍｍＨｇに低下させた。脳虚血症は、連続的ｌＣＢＦ、ｒＣＢＦ、およびＥＥＧ測定によって確認した。全大脳虚血症の１５分後に、該糸を切断し、真空を停止させて、再灌流を行った。回復から９０分後、ＣＣＡカテーテルを取り除き、切開を閉じ、動物をベンチレータから引き離した。抜管（再灌流の１１０分前後）において、かつ安定した活力のある兆候の存在下で、ラットをそのケージに戻し、加熱ブランケットを用いて、熱喪失を妨げた。

定量的ＰＣＲ
ＲＮＡは、標準的なプロトコル（（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−９）、続いてＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット精製に従って単離した。組織試料は、各々、全大脳虚血症の後に、全ラット脳から、および病変大脳虚血症後の種々の時点に病巣側に対して同側−および対側から採取した。ｃＤＮＡは、標準条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０μｇの全ＲＮＡから合成した。ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色にて、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用い、定量的
ＰＣＲを行った。サイクリング条件は以下の通りであった：ＧＣＳＦＲ：５分９５℃、５秒９５℃、１０秒６６℃、３０秒７２℃；１０秒８４℃で５０サイクル；ＧＣＳＦ：５分９５℃、５秒９５℃、１０秒６４℃、３０秒７２℃；１０秒８８℃で５０サイクル。融解曲線は以下のパラメータで行った：９５℃から５０℃へ冷却；０．２℃／秒にて９９℃までランピング。以下のプライマー対を用いた：「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−３２ｓ」ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＣ（配列番号：４２）、「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２６５ａｓ」ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＣ ＡＴＧ（配列番号：４３）、「ラットＧＣＳＦ−３４５ｓ」ＣＡＣ ＡＧＣ ＧＧＧ
ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＡＡ（配列番号：４４）、および「ラットＧＣＳＦ−８６２ａｓ」ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ ＴＣＧ（配列番号：４５）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲは、製造業者の推奨（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ）に従って、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用いて行った。産物の特異性は、融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含有量はシクロフィリンの発現レベルに対して正規化した（プライマー：「ｃｙｓ５」ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＣ（配列番号：４６）；「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：４７））。相対的調節レベルは、シクロフィリンに対する正規化、および偽−操作動物との比較に由来した。誤差バーは標準偏差を示し、これらは３倍系列希釈されたｃＤＮＡ−試料から計算され、測定の信頼性を反映する。

図２８（パートＩおよびＩＩ）Ａは、同側−および対側性側での病変虚血症から２時間および６時間後におけるＧＣＳＦの非常に強いアップレギュレーションを示し、他方、受容体は６時間後に中程度に調節される（図２８Ｂ）。

ＧＣＳＦの誘導された発現はＭＣＡＯモデルに対して特異的ではないが、全虚血症で程度は低いにもかかわらず観察できた（図２８Ｃ）。この知見は、Ｇ−ＣＳＦが事実脳−内因性神経保護リガンドであり、およびＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦでの処理は神経保護の内因的原理を利用するという仮説を支持する。

実施例２４：ＧＣＳＦおよびその受容体は皮質梗塞の領域帯においてアップレギュレートされる。

方法
光血栓症皮質虚血症の虚血性モデルを前記実施例に記載したように行った。

免疫組織化学：パラフィン−包埋組織（２μｍ）のセクションを脱パラフィン化し、マイクロ波処理した（５００Ｗにおける１０分間のクエン酸緩衝液）。その後、セクションを、湿潤チャンバー中で、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ−受容体抗血清（ＳＣ１３１０２またはＳＣ６９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：５００）と共に室温にて１時間インキュベートした。染色は、クロモゲン（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）としてのＤＡＢでのＡＢＣ技術を用いて可視化した。陰性対照は、一次高血清を省くことによって行った。

結果
光血栓症虚血症の誘導から６時間後に、受容体およびリガンド双方について、図２９中の矢印によって示されるように、原発性虚血症病巣の周囲領域（「領域」）におけるニューロンの増強された染色に対する明瞭な証拠があった。この知見は、我々が、神経系の新規な内因性神経保護システムを発見したという原理の基礎となる。また、それは、領域帯におけるＧＣＳＦの主な作用メカニズムが事実抗アポトーシスらしいことの基礎となる。

実施例２５：海馬におけるＧＣＳＦＲおよびダブルコルチンの共局所化
用いた免疫組織化学方法
実験は実施例２１に記載したように行った。ＧＣＳＦ抗血清の代わりに、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡに１：２００希釈したモルモット抗−ダブルコルチン（ＤＣＸ）ポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ドイツ）を適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡでのセクション３×２分の洗浄後、それを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に１：２００希釈したビオチニル化ヤギ抗−モルモットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。セクションを洗浄した後再度、実施例２１に記載されたプロトコルに従い、ＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（ｄｉａｎｏｖａ；１：２００）を室温にて１．５時間適用した。

結果
図３０は、海馬の歯状回（ａないしｆ）および門（ｇないしｉ）におけるニューロンでのＧＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびダブルコルチン（ｂ，ｅ，ｈ）の発現を示す。Ｇ−ＣＳＦ受容体および初期ニューロンマーカダブルコルチン（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，４７１０−５）双方の発現の重複（図３０ｃ，ｆ，ｉ）は、ニューロン分化初期段階におけるＧ−ＣＳＦの機能的役割を示す。

実施例２６：ＧＣＳＦは成人神経幹細胞のニューロン分化を誘導する。
神経幹細胞（ＮＳＣ）の創製
ラットからの成体神経幹細胞の創製は、実施例９に記載されたように行った。

脳室下帯（ＳＶＺ）に由来する３９のＤＩＶ培養ニューロスフィアを、各々、以下のＧＣＳＦ−濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌで１回刺激した。組換えヒトＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ
Ｂ．Ｖ．，オランダ）の添加から４日後に、細胞を収穫し、ＲＮＡを単離した。未処理細胞を対照として供した。

定量的ＰＣＲ
ＳＶＺのＧＣＳＦ−処理および未処理ニューロスフィアのＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて単離した。ｃＤＮＡは、標準条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用い、２μｇの全ＲＮＡから合成した。定量的ＰＣＲは、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色にてＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｅｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて行った。サイクリング条件は以下の通りであった：
ネスチンおよびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）：３分９５℃、５秒９５℃、１０秒５８℃、３０秒７２℃；１０秒８１℃で５０サイクル；ベータＩＩＩ−チューブリン：３分９５℃、５秒９５℃、１０秒６５℃、３０秒７２℃；１０秒８７℃で５０サイクル；ＰＬＰ：３分９５℃、５秒９５℃、１０秒６２℃、３０秒７２℃；１０秒８４℃で５０サイクル；ＧＦＡＰ：３分９５℃、５秒９５℃、１０秒６０℃、３０秒７２℃；１０秒８１℃で５０サイクル。融解曲線は以下のパラメータを用いて測定した：９５℃から５０℃に冷却；０．２℃／秒において９９℃までランピング。以下のプライマー対を用いた：「ラットネスチン−プラス」ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧ（配列番号：４８）、「ラットネスチン−マイナス」ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＡＴ（配列番号：４９）、「ラットＮＳＥ−プラス」ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＡＴ ＧＴ（配列番号：５０）、「ラットＮＳＥ−マイナス」ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＧＡＣ ＴＴＧ Ａ（配列番号：５１）、「ラットベータＩＩＩ−ｔｕｂ−７１６ｓ」ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＴＣＡ Ａ
ＣＣ ＡＣ（配列番号：５２）、「ラットベータＩＩＩ−ｔｕｂ−１０２２ａｓ」ＧＡＣ
ＡＴＧ ＣＧＣ ＣＣＡ ＣＧＧ ＡＡＧ ＡＣＧ（配列番号：５３）、「ラットＰＬＰ−５１８ｓ」ＴＣＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＧＴＧ（配列番号：５４）、「ラットＰＬＰ−９２７ａｓ」ＴＡＡ ＧＧＡ ＣＧＧ ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ ＴＧＧ（配列番号：５５）、「ラットＧＦＡＰ３’−１１２３ｓ」ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＡＣ ＧＧＡ Ｇ（配列番号：５６）、「ラットＧＦＡＰ３’−１２４５ａｓ」ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＣＴ
Ｃ（配列番号：５７）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲは、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用い、製造業者の推奨（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って行った。産物の特異性は、融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含有量は、シクロフィリン（プライマー：「ｃｙｓ５」ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ
ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＣ（配列番号：５８）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＧ（配列番号：５９））の発現レベルに対して正規化した。相対的調節レベルはシクロフィリンに対する正規化、および未処理細胞に対する比較に由来した。図３１は、ＧＣＳＦ処理から４日後における、ニューロンマーカＮＳＥおよびベータＩＩＩ−チューブリンの強力かつ濃度依存性のアップレギュレーションを示す。ＰＬＰおよびＧＦＡＰはＧＣＳＦ−濃度に依存して中程度に調節される。誤差バーは、３倍系列希釈ｃＤＮＡ−試料から計算された標準偏差を示し、測定の信頼性を反映する。

実施例２７：脳におけるＧＭＣＳＦおよびその受容体の共局所化
用いた免疫組織化学方法
パラフィン−包埋組織（２μｍ）のセクションは、それをキシロールで２×５分、１００％エタノールで２×２分、次いで、９６％から７０％までへの減少させる濃度のエタノールでそれを処理することによって脱パラフィン化した。最後に、セクションを蒸留水で洗浄し、マイクロ波処理した（６００Ｗにおいて１５分間のクエン酸緩衝液）。その後、セクションを蒸留水で洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で抗原を３×５分ブロックした。０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈したＧＭＣＳＦ受容体抗血清（ＳＣ６９０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を、湿潤チャンバー中で室温にて１時間インキュベートした。次いで、セクションを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３×２分洗浄した。次いで、第２の抗体（ヤギ抗−ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣ，ｄｉａｌｏｖａ，１：５０）を、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で４℃にて１晩適用した。セクションを１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡで３×２分洗浄した後、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡに１：１００希釈したＧＭＣＳＦ抗血清（ＳＣ１３１０１；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を室温にて１時間適用した。セクションを前記したように３×洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中に１：２００希釈したビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。セクションを洗浄した後、再度、ＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（ｄｉａｎｏｖａ；１：２００）を室温にて１．５時間適用した。次いで、セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄し、１×ＴＢＳ中に１：１００００希釈した核染料ＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄し、蛍光（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）のために設置培地を設置した。オリンパスＩＸ８０顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）でデジタル的に写真を撮った。

全ての二重−蛍光実験は平行単一−染色によって制御し、これを、第２のチャネルにお
けるいずれかの蛍光キャリーオーバーの不存在についてチェックした。第２の対照として、全ての二重−蛍光染色は２次抗体についてスイッチされたクロモフォアで行った。

結果
ＧＭＣＳＦ受容体（図３２ａ，ｄ，ｇ）およびＧＭＣＳＦ（図３２ｂ，ｅ，ｈ）は、歯状回（図３２ａ−ｃ）、門（図３２ｄ−ｆ）および皮質（図３２ｇ−ｉ）におけるニューロンに共局所化する。これらのデータは、ＧＭＣＳＦがオートクリンリガンドであるという見解を支持する。

実施例２８：ＧＣＳＦおよびその受容体は大脳虚血症によってアップレギュレートされる。

大脳虚血症のＭＣＡＯモデル
病変大脳虚血症（ＭＣＡＯ、中央大脳動脈閉塞）を誘導するための手法は、実施例１に記載されたように行った。
全虚血症モデル
外科的調製および一過的全大脳虚血症は、前記したように行った。
定量的ＰＣＲ
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成は前記したプロトコルに従って行った。サイクリング条件は以下の通りであった：ＧＣＳＦＲ：５分９５℃、５秒９５℃、１０秒６２℃、３０秒７２℃；１０秒８０℃で５０サイクル；ＧＣＳＦ：５分９５℃、５秒９５℃、１０秒６０℃、３０秒７２℃；１０秒８１℃で５０サイクル。融解曲線は以下のパラメータで行った：９５℃から５０℃へ冷却；０．２℃／秒において９９℃へランピング。以下のプライマー対を用いた：ラットＧＣＳＦＲ「ＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＣＴ
ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＧＴ Ｃ（配列番号：６０）、「ＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＧ（配列番号：６１）、「ラットＧＣＳＦ−７２３ｓ」ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＴＣ（配列番号：６２）、および「ラットＧＣＳＦ−９０８ａｓ」ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＧＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＧＧ（配列番号：６３）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲは、製造業者の推奨（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従い、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用いて行った。融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって、産物の特異性を確認した。試料のｃＤＮＡ含有量は、シクロフィリン（プライマー：「ｃｙｓ５」ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＣ（配列番号：５８）；「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：５９））の発現レベルに対して正規化した。相対的調節レベルはシクロフィリンへの正規化、および偽−操作動物に対する比較に由来した。誤差バーは標準偏差を示し、これらは３倍系列希釈ｃＤＮＡ−試料から計算し、測定の信頼性を反映する。

同側−および対側性側での病変虚血症から２時間および６時間後におけるＧＣＳＦの非常に強いアップレギュレーションを図３３Ａに示す。ＧＣＳＦの誘導は、より低い程度にも拘らず同様に全虚血症で示すことができる（図３３Ｂ）ＧＣＳＦ受容体でさえ、全虚血症から６時間後にわずかにアップレギュレートされる（図３３Ｃ）。これらのデータは、ＧＣＳＦが内因性神経保護メカニズムの一部であるという仮説を支持する。

実施例２９：海馬におけるＧＣＳＦＲおよびダブルコルチンの共局所化発現
用いた免疫組織化学方法
実験は前記したように行った。ＧＭＣＳＦ抗血清の代わりに、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡに１：２００希釈したモルモット抗−ダブルコルチン（ＤＣＸ）ポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ドイツ）を適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ＢＳＡでセクションを３×２分洗浄した後、
それらを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中に１：２００希釈したビオチニル化ヤギ抗−ブタＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。セクションを再度洗浄した後、前記したプロトコルに従い、ＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（ｄｉａｎｏｖａ；１：２００）を室温にて１．５時間適用した。

結果
図３４は、海馬の歯状回（ａないしｃ）および門（ｄないしｉ）におけるニューロンでのＧＭＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびダブルコルチン（ｂ，ｅ，ｈ）の発現を示す。Ｇ−ＣＳＦ受容体および初期ニューロンマーカダブルコルチン（Ｊｉｎ，Ｍｉｎａｍｉ，Ｌａｎ，Ｍａｏ，Ｂａｔｔｅｕｒ，Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，４７１０−５）（図３４ｃ，ｆ，ｉ）の双方の発現の重複は、ニューロン分化の初期段階におけるＧＭＣＳＦの機能的役割を示し、発作、パーキンソン病、ＡＬＳおよび多くの他の病気のような、影響する神経形成が治療剤であり得る全ての神経変性病へのＧＭＣＳＦの適用の基礎となる。

実施例３０：ＧＭＣＳＦは、成体神経幹細胞のニューロン分化を誘導する。
神経幹細胞の創製
ラットからの成体神経幹細胞の創製は実施例９に記載したように行った。細胞を８００×ｇにおいて５分間遠心し、上清を除去し、それを１×ＰＢＳで１回洗浄することによって、細胞を２ないし３週間毎に継代した。１ｍｌのアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ）中への再懸濁、および３７℃における１５分間のインキュベーションの後、細胞をカウントし、６ウェルプレート中のウェル当たり１．５ないし２．０×１０^５細胞の密度で平板培養した。海馬に由来する神経幹細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｂｅｒｌｅｘ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ ドイツ）での第４継代後に刺激し、３日後に、それをＲＮＡ単離のために収穫した。未処理細胞を対照として供した。

定量的ＰＣＲ
ＳＶＺのＧＭＣＳＦ−処理および未処理ニューロスフィアのＲＮＡを、製造業者の推奨に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて単離した。標準的条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用い、ｃＤＮＡを５μｇの全ＲＮＡから合成した。定量的ＰＣＲは、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色でのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて行った。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲの性能、サイクリング条件およびベータＩＩＩ−チューブリン、ＮＳＥ、ＰＬＰ、およびＧＦＡＰで用いたプライマー対は前記した。相対的調節レベルは、シクロフィリンへの正規化、および未処理細胞に対する比較に由来した。神経幹細胞の分化能力、および分化した細胞の特異的マーカ発現は系統的に説明する。１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦでの神経幹細胞の処理の結果、ベータＩＩＩ−チューブリン（ｎ＝３；ｐ＜０．０５，両側ｔ−検定）、および程度は低いが成熟ニューロンについてのマーカであるＮＳＥの有意に誘導された発現をもたらす（図３５Ｂ）。ＰＬＰおよびＧＦＡＰの発現レベルで観察された変化はなかった。

本実施例は、ＧＭＣＳＦの、神経形成の変調への適用性の基礎となる。これは、分化するニューロンのイン・ビトロ創製、ならびに影響する内因性幹細胞双方で有用であり、広い範囲のヒト病気、特に神経変性病に適用可能である。

実施例３１：Ｇ−ＣＳＦは血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過する。
刊行物で入手できるほとんどのデータは、Ｇ−ＳＣＦおよび関連サイトカインの血清レベルについての情報を含む。しかしながら、神経学的障害の療法でのＧ−ＣＳＦの効果的
な使用のための１つの重要なパラメータは、血液−脳−関門（ＢＢＢ）の通過である。この問題は特に興味深いものである。なぜならば、多くのタンパク質性薬物は血液およびニューロンの間のこの天然の境界を横切ることができないことが知られているからである。他方、エリスロポエチンおよび顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような造血因子を含めたいくつかの蛋白質については、それらはＢＢＢを通過することができ、ＣＮＳ中のニューロンに対して効果的となることが示された（ＭｃＬａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｂｒａｉｎ，１２０，２０８３−９１．，Ｂｒｉｎｅｓ，ｅｔ
ａｌ．（２０００），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７，１０５２６−３１）。

Ｇ−ＣＳＦが血液−脳関門を通過できることを証明するために、我々は、ラット脳における注射されたＧ−ＣＳＦの出現をテストした。従って、我々は、極端に感受性のヨウ素化アッセイを適用した。Ｇ−ＣＳＦおよび対照としてのＢＳＡをＩｏｄｏｇｅｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）方法によって^１３１Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ ドイツ）で放射性標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ ドイツ）カラムで精製した。サイズ排除クロマトグラフィーによって分析すると、精製された蛋白質は正しい分子量の単一ピークとして未標識標準化合物と共に溶出された。放射性標識蛋白質は雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ないし３００ｇ）の尾静脈を介して注射した。競合的摂取実験のために、冷蛋白質を標識された化合物と混合し、共注射した。少し前に、切開ラットをロンプン／ケタネストで麻酔し、（注射から１、４および２４時間後に）下腹部大動脈を介して１００ｍｌの生理食塩水を灌流して、血液を取り出した。全脳および血液を切開し、乾燥ブロットし、重量を測定した。血液を遠心して、血清を得た。注入物の試料と共に、放射能をγ−カウンター（ＬＢ９５１Ｇ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ドイツ）で測定して、組織の％ＩＤ／ｇを計算した。結果は、Ｇ−ＣＳＦが脳に存在することを示し、アルブミンと比較して、血液脳関門の通過は経時的に４ないし５のファクターだけ増大した。放射性標識の注射から２４時間後に採取した試料は、１および４時間と比較して増大したレベルを示す（図３６）。これらの観察は、血液に静脈内注射されたＧ−ＣＳＦがＢＢＢを横切り、主として、ＣＮＳ−ニューロン上の特異的受容体を活性化することができるのを示す。

血清および脳中の放射性標識Ｇ−ＣＳＦの量を測定し、脳／血清の比率を時間に対してプロットした。対照として、ウシ血清アルブミンを用いた。脳組織の血液汚染を回避するために、ラットを切開に先立って１００ｍｌの生理食塩水を灌流した。

実施例３２：ＧＭ−ＣＳＦは血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過する。
ＧＭ−ＣＳＦは血液−脳−関門を通過できることを示すために、我々は、Ｇ−ＣＳＦの代わりに実施例３１に記載されたヨウ素化されたＧＭ−ＣＳＦでラットを注射した。実験は同様な結果を示し、静脈内投与後におけるラット脳でのＧＭ−ＣＳＦおよびアルブミン存在の比較は、ＧＭ−ＣＳＦレベル（脳対−血清の比率）は、アルブミンよりも３ないし４倍高いことを示す。データは、ＧＭ−ＣＳＦは血液−脳−関門を通過できることを示す（図３７）。

図３７。血清および脳における放射性標識ＧＭ−ＣＳＦの量を測定し、脳／血清の比率を時間に対してプロットした。対照として、ウシ血清アルブミンを用いた。脳組織の血液汚染を回避するために、切開に先立って、ラットを１００ｍｌの生理食塩水で灌流した。

実施例３３：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のためのＧ−ＣＳＦ
Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦはＡＬＳの治療で有益であるという考えは２つの方法から由来した：最初に、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ双方に対する受容体およびリガンドは、
共に、脊髄の前角において大きな運動ニューロンで発現される。第２に、Ｇ−ＣＳＦがアポトーシスカスケードを逆反応させることによって部分的に作用するという証明は、ＡＬＳで作動するアポトーシスメカニズムに対する証拠に照らして非常に魅力的である（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。ＡＬＳについての最も普通に用いられるマウスモデルは、家族性ヒトＡＬＳを担うことが示されたＳＯＤ１遺伝子における突然変異を運ぶトランスジェニックマウスである。それらのうち最も頻繁に用いられるのはＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニック系列である。典型的には、これらのマウスは低下したライフスパンを有し、運動弱点の進行性兆候を示し、これは、挙動テスト（例えば、グリップ強力テスト、ロータロッドテスト）によって容易にアクセスすることができる。治療効果についての多数のテストがこれらのマウスで行われており、リルゾール、ミノサイクリン、カルニチンその他のような物質について生命−延長効果を示している。これらのマウスは臨床的に予測される重要性を有すると考えられる。というのは、ヒトにおいて唯一認可された薬物であるリルゾールはこれらのマウスで保護効果を有し、他方、ヒト試験で失敗したＢＤＮＦは有しないからである。従って、我々は、ＡＬＳのＳＯＤ１−トランスジェニックマウスモデルにおいて、Ｇ−ＣＳＦが平均余命または機能的結果を延長するかをテストした。ＳＯＤ１および野生型マウスに、生後６０日から出発し、１０μｇ／ＫＧのＢＷ Ｇ−ＣＳＦまたはビークルを同時に注射し、経時的にモニターした。結果は、Ｇ−ＣＳＦ処理群におけるより長い平均余命についての明瞭な傾向（図３８Ａ）、ならびに運動機能（グリップ強度テスト（図３８Ｂ））の改善を示し、これは、経時的にいくつかの測定点において有意性に到達した。さらに、処理群において増大した体重の傾向があった。

図３８Ａ：生後６０日で出発し、ＳＯＤ１−ｔｇマウスに１０μｇ／ＫＧのＢＷを注射した。Ｇ−ＣＳＦ処理ＳＯＤ１−ｔｇマウスにおいて延長された平均余命についての明瞭な傾向がある（塗り潰した線対ダッシュ線）。いくつかの点において、この差は有意性に到達した。

図３８Ｂ：生後６０日から出発し、ＳＯＤ１−ｔｇマウスに１０μｇ／ＫＧのＢＷを注射した。グリップ強度アッセイは、Ｇ−ＣＳＦ処理ＳＯＤ１−ｔｇマウスにおける運動強度についての改善を示す（塗り潰ぶしていない四角対塗り潰ぶしていない三角）。いくつかの点において、この差は有意性に到達した。

実施例３４：パーキンソン病（ＰＤ）のげっ歯類モデルにおけるＧＣＳＦの効果
ＭＰＴＰモデル：
パーキンソン病（ＰＤ）の最も特徴付けられているモデルは、ニューロトキシン、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を用いて開発された。パーキンソンモデルにおいてＧＣＳＦの効率を調べるために、我々は、８週齢雄マウスにおいてＭＰＴＰを投与した。マウスの各群（ｎ＝１５）にＭＰＴＰ−ＨＣｌまたは生理食塩水の反復した腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇの濃度において５連続日の間毎日１回）、および緩衝液、ＧＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ／；５ｍｇ／ｋｇ）またはミノサイクリン（４５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ）の反復皮下（２２連続日の間毎日１回）投与を与えた。ＧＣＳＦの最初の適用はＭＰＴＰ（または群０については生理食塩水）の直後に行ったが、双方の化合物の可能な相互作用のため、ミノサイクリンはそれから３０分後に投与した。各群の全ての動物は２２日に犠牲にした。その時点まで、マウスは運動活性（加速ロータロッドについて共に分析し、体重を毎日測定した。さらに、層および座核におけるドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）およびホモバニリン酸（ＨＶＡ）の濃度を測定するために、各脳を電気化学的検出でのＨＰＬＣ分析に付す。

しかしながら、そのモデルにおける神経保護薬物の作用についての最も重要かつ直接的
パラメータは、そのトキシン後に生存するニューロンの数である。従って、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学およびＴＨ−陽性ニューロンの血清学的定量は各動物の中脳セクションで行った（Ｔｒｉａｒｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，１７，２２１−３２）。

結果は、ＧＣＳＦ処理群についての体重の増加の傾向を示した（データは示さず）。さらに、運動活性の改善は、加速ロータロッドにおけるテストの後に観察される（データは示さず）。マウスにおけるＭＰＴＰ誘導パーキンソンでの最近の研究は、ミノサイクリンがこれらの動物において黒質線条体ドーパミン作動性神経変性を妨げることを示した（Ｄｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，１４６６９−７４）。我々の研究において、我々は、我々のデータを確証するための神経保護効果参照としてミノサイクリンを選択した。５連続日にわたるＭＰＴＰでの亜急性処置は、黒質緻密部内のチロシンヒドロラーゼ（ＴＨ）−陽性ニューロンを有意に減少させた（図３９Ａ）。ＧＣＳＦおよびミノサイクリンでの処理は、ＴＨ−陽性ニューロンの黒質レベルのこの低下に逆作用するほとんど同一の効果を示した（図３９Ｂ）。さらに、ＧＣＳＦおよびミノサイクリンは、ドーパミン（図３９Ｂ）、およびその代謝産物の線条体レベルを考慮した場合に、ほとんど同一の治療効果を示した。

実施例３５：パーキンソン病のためのモデルにおけるＧＭＣＳＦの効果
ＭＰＴＰモデル
ＧＣＳＦについて記載したように、パーキンソンモデルにおけるＧＭＣＳＦの効果は以下の実験で確認される（これまでの実施例参照）。

マウスの各群（ｎ＝１５）に、ＭＰＴＰ−ＨＣｌまたは生理食塩水の反復腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇの濃度において５連続日の間毎日１回）、および緩衝液、ＧＭＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ／；５ｍｌ／ｋｇ）またはミノサイクリン（４５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｌ／ｋｇ）の反復された皮下（２２連続日の間、毎日１回）投与を与えた。ＧＣＳＦの最初の適用はＭＰＴＰ（または群０については生理食塩水）の直後に行ったが、双方の化合物の可能な相互作用のため、ミノサイクリンはその後３０分に投与した。各群の全ての動物は２２日に犠牲にする。

体重の増加の改善、および加速ロータロッドでの運動活性の緩和は、ＧＣＳＦによってスコア取りされた結果と同様に、ＧＭＣＳＦの適用後に観察された（データは示さず）。従って、ＧＭＣＳＦの治療効果は、ＴＨ−陽性ニューロンの黒質レベルを考慮した場合、ＧＣＳＦと比較して良好である（図３９Ｂ）。線条体ドーパミンレベルおよびその代謝産物の低下は、ＧＣＳＦと匹敵して、ＧＭＣＳＦの投与後に逆作用することができる（データは示さず）。

実施例３６：ラットにおけるパーキンソン病についての６−ヒドロキシドーパミン（６ＯＨＤＡ）モデルでのＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦの効果
前記にて例示したように、ＧＣＳＦならびにＧＭＣＳＦはマウスにおけるＭＰＴＰモデルで強い神経保護特性を有した。これはヒトパーキンソン病に対する適用性について非常に強い証拠である。というのは、ＭＰＴＰは、ヒトにおいてＰＤを引き起こすその能力のため発見されたトキシンだからである。

パーキンソン病についての造血因子の効果を研究するための１つのさらなるモデルは６−ＯＨＤＡモデルである。このモデルは、黒質への、または線条体への直接的な６ＯＨＤＡの注射に基づく。該薬物は、ドーパミン作動性ニューロンに選択的に蓄積し、これらの細胞のアポトーシスに至る。ラットにおいては、６ＯＨＤＡは、片側病巣を生じさせるのに圧倒的に用いられてきた効果的なニューロトキシンである。ドーパミン枯渇の程度は、
アンフェタミンまたはアポモルフィン（Ｕｎｇｅｒｓｅｔｅｄｔ １９７１）に応答しての回転挙動を調べることによって評価することができる。容易にかつ良好な定量可能な運動欠乏は、このモデルの主な利点を構成する。挙動パラメータに加え、免疫組織化学後のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性ニューロンの線条体レベル、およびＨＰＬＣ分析後におけるドーパミンおよびその代謝産物レベルもまた測定することができる。６ＯＨＤＡは、ＰＤラットモデルにおいてＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦの効果を確認するのに用いることができる。成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０ｇ）は、黒質または線条体への２μｌ ６ＯＨＤＡ中の８μｇの１回の定位注射後に片側が病変する。異なる用量のＧＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ；０．１ｍｇ／ｋｇ、またはその他）を、２週間の間の病変直後に毎日皮下投与することができる。処理した動物の他の群は、６ＯＨＤＡの注射直後に単一用量の層内または黒質内ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ（３００μｇ／ｋｇ）を受ける。ＭＰＴＰモデル実験に関しては、ミノサイクリンは神経保護参照化合物（４５ｍｇ／ｋｇ、毎日１回、皮下）として用いることができる。偽動物および緩衝液で処理した病変動物を対照群として用いる。病変から２週間後に、動物を回転挙動テストに付す。ラットにアポモルフィンを皮下注射し、ボールケージに入れ、１時間に渡る対側性回転の数を記録する。各動物群についての回転の数は、標準統計学的テストを用いて比較する。挙動テストの後、動物を殺し、ＴＨ−陽性ニューロンの合計数をアッセイするための免疫組織化学のために、およびドーパミンのレベルを測定するためのＨＰＬＣのために処理する。

実施例３７：ＧＭＣＳＦは、ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ニューロンにおいて抗−アポトーシス的に作用する。

前記にて既に例示したように（実施例２２）、ＧＣＳＦは、初代ニューロンにおいてアポトーシスを阻害することによって優れた活性を有した。我々は、ＧＭＣＳＦが強い抗−アポトーシス作用メカニズムをやはり有するであろうと考えた。従って、実施例２２に例示されたのと同一タイプの実験をＧＭＣＳＦで行った。ここに、ニューロンに適用された濃度は５０ｎｇ ＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ，Ｉｍｍｕｎｅｘ）／ｍｌ培地であった。

図４０パートＩは、ＧＭＣＳＦが、アポトーシスの兆候として特異的に起こっているＰＡＲＰ切断を阻害することを示す。細胞の死滅は、ＮＯ−ドナーＮＯＲ−３を用いることによって初代ニューロンで誘導された。

図４０パートＩＩは、ＧＭＣＳＦがＳＴＡＴ１（「ｐＳＴＡＴ１」）またはＳＴＡＴ５（「ｐＳＴＡＴ５」）の増大したリン酸化に導かないが、該蛋白質それ自体がニューロンで発現されることを示す。

図４０パートＩＩＩＡは、ＧＭＣＳＦ刺激体に続いてＧＭＣＳＦが５分において最大であるＳＴＡＴ３の時間−依存性活性化に導く。６０分において、ｐＳＴＡＴ３のレベルは初期レベル、造血系の細胞から知られた応答キネティック未満まで降下する。Ｂ、３つの独立した実験の定量。Ｃ、リン酸化によるＳＴＡＴ３の活性化は、ＪＡＫ２阻害剤ＡＧ４９０によって阻害することができる。ＧＭＣＳＦを与えてから５分後に、ｐＳＴＡＴ３のレベルは阻害剤の存在下でかなり異なる。

図４０パートＩＶは、ＧＭＣＳＦがｓｔａｔ３標的遺伝子Ｂｃｌ２およびＢｃｌＸ１の発現を強く誘導することを示す。これらの遺伝子は抗アポトーシスであるとして知られている。

この実験は、１）ＧＭＣＳＦはニューロンに対して抗アポトーシス的に作用し、２）これはｓｔａｔ３経路によって媒介されることを示す。従って、これは、ｇｃｓｆまたはｇ
ｍｃｓｆの新規なミメティックスを含めた、新規な神経保護薬物を見出すためのスクリーニングツールとして、ニューロン中のｓｔａｔ３系を用いる可能性も示す。

実施例３８：ＧＭＣＳＦは、げっ歯類発作モデルにおける梗塞容量を低下させる。
我々は、ラットにおける発作についての最も認められたモデル、中央大脳動脈閉塞モデル（ＭＣＡＯ）においてＧＭＣＳＦで実験を行った。

原理的には、実験は実施例１および１９に例示されたように行った。簡単に述べれば、雄Ｗｉｓｔａｒラットは、吸入麻酔剤（ハロタン／Ｎ_２Ｏ／Ｏ_２）を用いて麻酔した。頸動脈を露出させ、被覆されたナイロンフィラメントを総頸動脈に挿入し、それが血液がＭＣＡまで流れるのをブロックするまで進めた。フィラメントの正しい位置はレーザードップラーフローメトリーによってモニターした。閉塞から９０分後に、フィラメントを取り出し、再灌流を可能とした。ＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ，Ｉｍｍｕｎｅｘ）を、虚血症の開始後３０分または３時間いずれかにおいて、注入ポンプによって、ほぼ２０分の期間にわたって、静脈内カテーテル（大腿静脈）を介してラットに２５０μｇ／ｋｇ体重の用量で適用した。梗塞容量は、ＴＴＣ−染色の標準方法、およびコンピュータベースのボリューメトリーで２４時間後に測定した。

図４１は、初期において（図４１、パートＩ）および３時間の後期時間ウィンドウにおいて（図４１、パートＩＩ）、ＧＭＣＳＦ−処理動物において梗塞容量の有意な低下があることを示す。

これは、一般には神経変性障害への、および特に発作治療へのＧＭＣＳＦの適用性を例示する。

実施例３９−ＩＬ−５は病変虚血症のＭＣＡＯモデルにおいてアップレギュレートされる。

ＲＮＡは、標準プロトコル（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−９）に従い、続いてＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット精製に従い、病変側に対して同側−および対側性側のラット皮質領域試料から単離した（組織試料の位置については図９ａ参照；ここでは：３対４）。ｃＤＮＡは、標準条件を用い、オリゴｄＴプライマー、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用い、１μｇの全ＲＮＡから合成した。ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲ−緑色染色でのＬｉｇｈｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて定量的ＰＣＲを行った。サイクリング条件は以下の通りであった：５分９５℃、５秒９５℃、７秒６２℃、３０秒７２℃；９秒８３℃で５０サイクル。融解曲線は以下のパラメータで行った：９５℃から５０℃へ冷却；０．２℃／秒にて９９℃へランピング。以下のプライマー対を用いた：「ラットＩＬ−５−３８ｓ」ＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＴ（配列番号：６６）、および「ラットＩＬ−５−３１８ａｓ」ＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号：６７）。製造業者の推奨（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）に従い、ＳＹＢＲ緑色マスターミックスを用い、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲを行った。産物の特異性は、融解点分析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含有量はシクロフィロン（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号：９）；「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：１０））の発現レベルに対して正規化した。相対的調節レベルは、シクロフィリンへの正規化、および偽−操作動物に対する比較に由来した。図４２は同側での２時間および６時間後におけるＩＬ−５のアップレギュレーション、および対側性側での６時間後における僅かなアップレギュレーションを示し、誤差バーは標準偏
差を示し、これらは３倍系列希釈ｃＤＮＡ−試料から計算され、測定の信頼性を反映する。

実施例４０−Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５はニューロン細胞培養において抗アポトーシス経路を誘導する。

皮質はラット胚Ｅ１８から切開した。ＨＢＳＳ中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシン、５ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて組織を解離させた。消化は、１×Ｂ−２７補足物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、および２５μＭグルタメート（ｇｕｌｔａｍａｔｅ）を含有する４部の神経基礎培地を用いて停止させた。遠心の後、ペレットを５ｍｌ培地に溶解させ、細胞を、ポリ−Ｌ−リシンで被覆した６ｃｍ皿上で２ｍｉｏ細胞の密度で平板培養した。

経路マッピングのために、培養基を培養２１日後に取り除き、５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦまたは２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を加えた。ＩＬ３およびＩＬ−５の場合には、３ｍｌの培養基を除去し、ＩＬ−３またはＩＬ−５を含有する新鮮な培地を加えて、各々，１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。細胞を、開始後５分で出発し、サイトカイン処理の開始後に異なる時点で収穫した（以下および図面参照）。

ウェスタンブロットでは、細胞を収穫し、細胞をＳＤＳ−ベンゾナーゼ緩衝液（１％ＳＤＳ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ＰＢＳ，阻害剤１：１０００：アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、ＰＭＳＦ、ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭ，ベンゾナーゼ１：１００）に溶解させた。試料当たり１００μｇのニューロン蛋白質を含有するブロットを、４Ｍ尿素を含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、標準条件下で電気泳動に付した。蛋白質を、半―乾燥ブロッティングによって、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（商標）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）に電気泳動により移した。該膜を、ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．６．１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の３％無脂肪ドライミルクにおいて室温（ＲＴ）にて１時間ブロックした。

検出では、ブロットを、各一次（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの全ての抗体）および二次抗体（Ｄｉａｌｏｎｏｖａ）と共に室温にて１時間インキュベートした。スーパーシグナルケミルミネセンスシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出した。

Ｇ−ＣＳＦ
多数の成長因子受容体によって活性化することができるもう１つの優れた抗―アポトーシス形質導入経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路（Ｄｕｄｅｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，６６１−５）である。ＡｋｔはＰＩ３−キナーゼおよびキナーゼＰＤＫを介して活性化され、活性なＡｋｔはＳｅｒ^４７３。リン酸化のレベルによって測定することができる。未処理細胞において、リン酸化Ａｋｔに対応する目に見えるかすかなバンドのみがあった（図４３Ａ、第１のレーン）。２０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを加えてから５分後に、Ｇ−ＣＳＦ添加後少なくとも１時間安定に出現したリン酸化Ａｋｔの実質的な増加があった（図４３Ａ）。Ａｋｔ総レベルは一定のままであった（図４３Ａ、第２列）。Ａｋｔの誘導と平行して、我々はわずかなサイズの差がある２つのバンドとして出現した上流キナーゼＰＤＫ１のなおより強いリン酸化を観察した（図４３Ｂ）。興味深いことには、ＰＤＫおよびＡｋｔ双方の活性化は、２層で出現し１５分においてシグナルは一時的に減少した。Ｇ−ＣＳＦ添加から５分後のＡｋｔ５のリン酸化はＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２によって完全にブロックすることができた（図４３Ｃ）。かくして、Ａｋｔはニューロン中のＧ−ＣＳＦによって誘導された顕著なシグナルであり、公
知のＰＩ３−キナーゼＰＤＫ経路を介して活性化されるように見える。

最後に、我々は、ニューロンにおいて保護機能をやはり有するキナーゼのＥｒｋファミリーの活性化レベルを測定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｋｏｖｓｋｙ（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９，６６４−７３）。Ｅｒｋ１／２は一過的に活性化されたに過ぎないが（図４３Ｄ）、Ｅｒｋ５はより強くかつより長く継続する活性化を有した（図４３Ｄ、下側の列）。興味深いことには、最近の報告はＥｒｋ５の活性化を、ｔｒｋ受容体によって誘導された生存シグナルに結び付けている（Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３５３６−４２）。

一緒にすると、Ｇ−ＣＳＦは、ニューロンにおける３つの抗―アポトーシス経路の誘導に導く。

ＧＭ−ＣＳＦ
ＧＭ−ＣＳＦもまた、ＧＭ−ＣＳＦ添加後少なくとも１時間安定に出現したリン酸化Ａｋｔの実質的増加に導いた（図４４Ａ）、Ａｋｔの誘導と平行して、我々は、上流キナーゼＰＤＫ１のなおより強いリン酸化を観察した（図４４Ａ）。ＧＭ−ＣＳＦ添加から５分後のＡｋｔのリン酸化は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２によって完全にブロックすることができた（図４４Ａ）。かくして、Ａｋｔはニューロン中のＧＭ−ＣＳＦによって誘導された顕著なシグナルであり、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に由来する、その同族ＰＩ３−Ｋキナーゼ−ＰＤＫ経路を介して活性化される。サイトカイン受容体において由来し得る第３の経路はＲａｆ−Ｅｒｋ経路である。Ｅｒｋ １／２はニューロン生存を促進することが示されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｋｏｖｓｋｙ（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９，６６４−７３，Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１３２６−３１）、虚血症モデルにおいてＢＤＮＦの保護作用を媒介する（Ｈａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｔｚｍａｎ（２０００），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０，５７７５−８１）。事実、ＧＭ−ＣＳＦもまた、リン酸化によるＥｒｋ１／２の迅速であるが一過性の活性化を誘導した（図４４Ｂ）。驚くべきことに我々もまた、ＧＭ−ＣＳＦ添加後少なくとも１時間より強く出現し、継続した新しく発見されたＥｒｋ５の活性化を検出した（図４４Ｂ）。Ｅｒｋ５もまたニューロン生存シグナルの媒介に関連付けられている（Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，４，９８１−８）。

一緒にすると、ＧＭ−ＣＳＦは、ニューロンにおける少なくとも３つの主な独立した生存経路の誘導に導く。

ＩＬ−３
また、ＩＬ−３は、ＩＬ−３添加後５分および１時間に検出されたリン酸化されたＡｋｔ，の実質的な増加に導いた（図４７）。かくして、Ａｋｔはニューロン中のＩＬ−３によって誘導された顕著なシグナルである、その同族ＰＩ３−キナーゼ−ＩＬ−３受容体に由来するＰＤＫ経路を介して活性化される。ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦについては、我々もまた、ＰＤＫがニューロン細胞のＩＬ−３刺激によってリン酸化されることを示すことができた（図４７）。該リン酸化はＩＬ−３刺激の開始後５分および１時間に検出できた。

ＩＬ−５
ＩＬ−５は、ＩＬ−５添加後５分および１時間に検出された、ＩＬ−３について記載されたような、リン酸化されたＡｋｔおよびＰＤＫの実質的増加に導いた（図４７）。かくして、ＡｋｔおよびＰＤＫはニューロン中のＩＬ−５によって誘導された顕著なシグナルである、ＩＬ−５受容体に由来するその同族ＰＩ３−キナーゼーＰＤＫ経路を介して活性
化される。

実施例４１：ＧＭ−ＣＳＦは、イン・ビトロにて細胞死滅後にアップレギュレートされる。

ラットからの初代皮質ニューロンは実施例１２に記載したように作製した。調製から２週間後に、ニューロンを種々の濃度のＨ_２Ｏ_２（０μＭ、３００μＭ、４５０μＭ、６００μＭおよび９００μＭ）で６時間処理した。培地を捨て、溶解緩衝液を加えることによって、かつＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットによるＲＮＡ−調製についての製造業者の推奨に従って、細胞をプレートから掻き落とした。原理的には、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ測定は実施例２３に記載したように行った。ＰＣＲは「ラットＧＭ−ＣＳＦ−９４ｓ」ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）および「ラットＧＭ−ＣＳＦ−３５９ａｓ」ＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）を用いて行い、以下のサイクリング条件を用いた：１０分９５℃、１０秒９５℃、１０秒６３℃、３０秒７２℃；１０秒８６℃でサイクル。

結果
Ｈ_２Ｏ_２の濃度を増大させて、ＧＭ−ＣＳＦの発現は、未処理ニューロンと比較して同様に４倍まで増加する（図４５）。細胞死滅の刺激後におけるＧＭ−ＣＳＦのこの濃度―依存性誘導により、ＧＭ−ＣＳＦが脳損傷後に内因性神経保護因子として作用するであろうという示唆が確認される。

実施例４２：ＩＬ−３およびＩＬ−５は、細胞を、ラット初代皮質細胞培養およびヒト神経芽腫細胞（ＳＨＳＹ５−Ｙ）におけるカンプトテシン誘導死滅から保護する。

ＳＨＳＹ５−Ｙ細胞はＤＭＥＭ（高グルコース；４５００ｍｇ／ｍｌ）＋２０％ＦＣＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で培養した。カスパーゼ３／７活性アッセイのために、４５０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに撒いた。平板培養から１日後に、培養基を９０μｌ／ウェルに調製し、１０μｌのカンプトテシンを加えるか、あるいは細胞を未処理のままとした。次いで、１０μｌの希釈されたサイトカインをカンプトテシン処理細胞に加えて、０、１、１０、２０、５０または１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。３７℃、５％ＣＯ_２における１６時間のインキュベーションの後、カスパーゼ３および７−活性をプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した（指示書に従ってのカスパーゼ３／７活性アッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。

皮質培養は前記したように調製した。３００００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに蒔き、２週間培養した。次いで、培養基を９０μｌ／ウェルに調整し、１０μｌのカンプトテシンを加えるか、あるいは細胞を未処理のままとした。次いで、１０μｌの希釈されたサイトカインをカンプトテシン処理細胞に加えて、０、１、１０、２０、５０または１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。３７℃、５％ＣＯ_２における１６時間のインキュベーションの後、カスパーゼ３および７−活性をプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した（指示書に従ってのカスパーゼ３／７活性アッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。

結果は、サイトカインが種々の濃度においてそれらの最高の抗―アポトーシス活性を有することを示す（図４６）。

ＩＬ−３は、ニューロン培養に対する１ないし２０ｎｇ／ｍｌの濃度においてその最高の抗―アポトーシス活性を有し、１ｎｇ／ｍｌにおいてＳＨＳＹ５−Ｙ細胞に対して最も保護的であった（図４６ａ）。

ＩＬ−５は、ラットニューロン細胞およびヒトＳＨＳＹ５−Ｙ双方に対して１ｎｇ／ｍｌにおいて最も保護的であった（図４６ｂ）。

実施例４３：Ｇ−ＣＳＦは皮質虚血症において保護的である。
虚血症モデル
遠位ＭＣＡ／ＣＣＡ閉塞モデル。一過的左総頚動脈／ＭＣＡ（ＣＣＡ／ＭＣＡ）閉塞は従前に記載されているように達成された。簡単に述べれば、一晩絶食させた動物をクロラールヒドレート（０．４５ｇ／ｋｇ ＩＰ）で麻酔した。右大腿静脈および動脈に、動脈血圧記録および薬物投与のためにカニューレを入れた。コア体温を、虚血症および最初の１時間の再灌流の間、フィード−前方温度コントローラの使用を通じて３６．５±０．５℃に維持した。同側ＣＣＡを単離し、腹側頸部中線切開を通じてタグを付した。０．００５−インチ直径のステンレス鋼ワイヤー（Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ Ｉｎｃ）を、ＭＣＡの主な分岐に対して近位の、およびレンズ核線条体動脈に対して遠位である、嗅脳溝に対して吻側の左ＭＣＡ真下に置いた。次いで、動脈をリフトし、ワイヤーを時計回りに回転させて、閉塞を確実とした。次いで、ＣＣＡを無外傷動脈瘤クリップで閉塞させた。ＭＣＡ閉塞の座に対して３ｍｍ遠位である皮質表面の大脳灌流を、レイザードップラーフローメーター（ＬＤＦ）（モデルＢＰＭ２、Ｖｅｓａｍｅｄｉｃ）測定した。（大脳灌流の相対的値を表す）ＬＤＦスケールで初期値の１０％ないし１５％の大脳灌流を呈する動物のみを実験に含めた。虚血症誘導後６０分に開始し、５０μｇ／ｋｇのＧ―ＣＳＦを２０分間に渡って静脈内に注入した。ＭＣＡ／ＣＣＡ閉塞の１８０分後に、閉塞手法を逆に行うことによって再灌流を確立した。再灌流から７２時間後に、動物を再度麻酔し、５０ｍＬの生理食塩水で経心臓的に灌流した。灌流された単離の脳をセクショニングのために氷冷ＰＢＳに移した。ＴＴＣ染色によって梗塞容量を測定した。全ての手法は動物の人道的世話のためのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに適合し，動物福祉制度委員会によって認可された。

実施例４４：Ｇ−ＣＳＦは成体神経幹細胞において神経形成を誘導する。
神経幹細胞（ＮＳＣ）の創製
ラットからの成体神経幹細胞の創製は、実施例９に記載したように行った。神経幹細胞のルシフェラーゼレポータでのトランスフェクションのために、それらを１週間に１回継代し、ルシフェラーゼ実験をイン・ビトロにて１４週間後に行った。

分化実験では、細胞を４００万細胞の密度にて１５ｃｍ^２培養フラスコ中で平板培養し、１００ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒａｎｄｓ）で１回処理した（ｎ＝６）。対照細胞を未処理のまま残し（ｎ＝４）、刺激から４日後に、細胞を抗体染色およびＦＡＣＳ−分析のために収穫した。

ルシフェラーゼアッセイ
イン・ビトロでの成体神経幹細胞に対するＧ−ＣＳＦ処理の効果を、さらに、適当なβ―ＩＩＩ−チューブリンプロモータ断片の制御下でルシフェラーゼを用いてレポータ戦略によって調べた。（従前に記載された）クラスＩＩＩ β―チューブリン遺伝子プロモータ（断片―４５０ないし＋５４）を、ＰＣＲのために鋳型としてゲノムＤＮＡを用いることによって増幅し、次いで、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃホタルルシフェラーゼレポータベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ部位に該断片を挿入した。ｐＲＬ ＳＶ４０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部対照ベクターとして供した。ＤＮＡトランスフェクションのために、細胞を解離し、３５０００細胞／ウェルの密度にてポリーＬ−オルニチン／ラミニンー被覆９６−ウェルプレート上で平板培養した。２４時間の培養の後、細胞を１×ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した
。ｐＧＬ３−Ｐ−ｐ−βＩＩＩチューブリンベクター（１５０ｎｇ／ウェル）およびｐＲＬ ＳＶ４０ベクター（１００ｎｇ／ウェル）での共トランスフェクションを、リポフェクトアミン方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って行った。ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃホタルルシフェラーゼレポータベクターを陰性対照して供し、陽性対照として、細胞をｐＣＭＶ−ルシフェラーゼで共トランスフェクトした。神経基礎培地を加えることなく、ＤＰＢＳを除去した後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体を各ウェルに加えた。２４時間のトランスフェクトされた細胞のインキュベーションに続き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを除去し、細胞を神経基礎培地中の種々の濃度のＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標），Ａｍｇｅｎ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，オランダ）（５ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。イン・ビトロ分化についての対照として５％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を培地に加え、マイトジェンを取り除くことによって、幹細胞を処理した。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａの指令に従い、細胞を収穫して、ルシフェラーゼアッセイのための細胞抽出物を調製した、細胞をホタルおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼで共トランスフェクトしたので、デュアルールシフェラーゼレポータアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、レニラルシフェラーゼによって媒介される反応からのものに対するホタルルシフェラーゼによって媒介される反応からのルミネセンズシグナルの比率を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｃｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０）で測定した。

図５０に示すように、ルシフェラーゼ活性は５ないし１００ｎｇ／ｍｌの範囲で用量―依存的に増加した。興味深いことには、１００ｎｇ／ｍｌは、培地からｂＦＧＦおよびＥＧＦを除き、ＦＣＳを加える標準分化手法と比較してより強い分化―誘導効果を有した。

ＦＡＣＳ分析
１ｍｌプラスチックピペッド中のニューロスフィアを粉砕することによって単一細胞懸濁液を作製し、次いで、細胞を遠心によってペレット化した。１×リン酸―緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中への再懸濁後に、１×ＰＢＳ中の同一容量の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を加え、１％ＰＦＡの最終濃度をもたらすことによって、細胞を固定した。細胞を氷上で１５分間インキュベートし、１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳに溶解させた０．２％ｔｗｅｅｎ２０中への再懸濁によって浸透させた。氷上での１５分間のインキュベーションの後、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）をブロッキングのために１：５０希釈で加えた。一次抗体を、１：１００希釈で加えたモノクローナルマウス抗―ラットＭＡＰ２抗体（Ｓｉｇｍａ）として供した。細胞を氷上で２時間インキュベートし、１×ＰＢＳ中の０．１％ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ロバ抗―マウスＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）との氷上での３０分間のインキュベーションに続き、細胞を、１×ＰＢＳ中の０．１％ｔｗｅｅｎ２０で再度３回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために、最後に１×ＰＢＳに再度懸濁させた。細胞のフローサイトメトリーをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。細胞を、光の前方および右角度（側方）散乱によって、およびＦＩＴＣ蛍光について、適切なフィルターシステムを介して分析した。

成体神経幹細胞のＧ−ＣＳＦでの４日間の処理の後、ニューロンマーカＭＡＰ−２を発現する細胞のパーセンテージは３２．８±６．４ないし６５．０±３．３％に増加した（ｐ＜０．００５；各々、Ｎ＝４および６）（図４５）。一緒にすると、Ｇ−ＣＳＦは、実施例２６において先に示したように、ニューロン表現型に向けての神経幹細胞の分化を誘導する。

実施例４５：成体神経幹細胞においてＧＭ−ＣＳＦは神経形成を誘導する。
神経幹細胞（ＮＳＣ）の創製
ラットからの成体神経幹細胞の創製は、実施例９に記載したように行った。神経幹細胞
のルシフェラーゼレポータでのトランスフェクションのために、それを１週間に１回継代し、イン・ビトロにて１４週間後にルシフェラーゼ実験を行った。

分化実験のために、細胞を４００万細胞の密度にて１５ｃｍ^２培養フラスコ中で平板培養し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｂｅｒｌｅｘ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ ドイツ）で１回処理した（ｎ＝３）。対照細胞を未処理のまま残し（ｎ＝３）、刺激から４日後に、抗体染色およびＦＡＣＳ−分析のために細胞を収穫した。

ルシフェラーゼアッセイ
イン・ビトロにて成体神経幹細胞に対するＧＭ−ＣＳＦ処理の効果を調べるために、β−ＩＩＩ−チューブリンプロモータ断片の制御下でルシフェラーゼを用いるレポータ戦略を実施例４４に記載するように用いた。神経幹細胞を、神経基礎培地中の種々の濃度のＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｂｅｒｌｅｘ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ ドイツ）（０．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）で神経幹細胞を４８時間刺激した。図５１において、ルシフェラーゼ−活性の濃度−依存性増加が、神経幹細胞のＧＭ−ＣＳＦ処理の後に示される。１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの濃度では、同一分化−誘導効果が、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを除き、標準分化プロトコルとして知られたＦＣＦを加えることにより達成することができる。
ＦＡＣＳ分析
ニューロンマーカＭＡＰ２についての抗体染色を実施例４４に記載したように行った。ＭＡＰ２−陽性細胞のカウントは、未処理における２８．３６±２．２６％からＧＭ−ＣＳＦ処理幹細胞における５６．８６±８．３６まで図５２に示すように増加する（ｐ＜０．０３；Ｎ＝３）。かくして、ＧＭ−ＣＳＦは、成体神経幹細胞において神経形成を有意に誘導する。

実施例４６：ＧＭ−ＣＳＦおよびその受容体はヒト脳で発現される。
免疫組織化学方法
パラフィン−包埋組織（２μｍ）のセクションを、それをキシロールで２×５分、１００％エタノールで２×２分処理し、次いで、９６％から７０％まで減少させる濃度のエタノールで処理することによって脱パラフィン化した。最後に、セクションを蒸留水で洗浄し、マイクロ波処理した（６００Ｗにおける１５分間のクエン酸緩衝液）。その後、セクションを蒸留水で洗浄し、抗原を、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で３×５分ブロックした。０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈したＧＭ−ＣＳＦ抗血清（ＳＣ１３１０１；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を湿潤チャンバー中にて室温で１時間インキュベートした。次いで、セクションを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３×２分洗浄した。次いで、ビオチニル化二次抗体（ヤギ抗−ウサギ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１：２００）を、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で３０分間適用した。０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）でセクションを３×２分洗浄した後、セクションを、飽和量のＴＲＩＴＣ−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ １：２００）と共に室温にて１時間インキュベートした。０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３×２分洗浄した後再度、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ抗血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：１００）を適用した。１時間後、セクションを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３×２分洗浄した。前記したように、ビオチニル化二次抗体（ヤギ抗−マウス、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１：２００）を適用することによって検出を行い、その後、セクションをＣｙ５−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ １：２００）と共にインキュベートした。セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄した後、それを、１×ＴＢＳ中に１：１００００希釈した核染料ＤＡＰＩ
で１０分間染色した。最後に、セクションを１×ＴＢＳで３×２分洗浄し、蛍光（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）のために設置培地を設置した。オリンパスＩＸ８０顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔａｇａｒｔ，ドイツ）でデジタル的に写真を撮った。

全ての二重蛍光実験は平行単一−染色によって制御し、これを、第２のチャネルにおけるいずれかの蛍光キャリーオーバーの不存在についてチェックした。

結果
ヒト前頭皮質において、図５３ｃ、ｆに示すように、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ（図５３ａ，ｄ）がＧＭ−ＣＳＦと同一ニューロンで発現され（図５３ｂ，ｅ）、ここに、２つの染色は合わされる。かくして、ＧＭ−ＣＳＦおよびその受容体の発現はマウスおよびラット脳に制限されないが、ヒト脳においても見出すことができる。
実施例４７：Ｇ−ＣＳＦ受容体はヒト脳で発現される。
免疫組織化学方法
パラフィン−包埋組織（２μｍ）のセクションを実施例４６に記載したように処理した。簡単に述べれば、クエン酸緩衝液での脱パラフィン化およびマイクロ波処理の後、セクションを、０．２％ＢＳＡを含有する１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）でブロックした。洗浄の後、Ｇ−ＣＳＦ受容体抗血清（ＳＣ６９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を湿潤チャンバー中で１時間適用した。ビオチニル化二次抗体（ヤギ抗−ウサギ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１：２００）とのインキュベーションおよびＣｙ５−コンジュゲーテッドストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ １：２００）での検出に続き、核を、１×ＴＢＳ中に１：１００００希釈したＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、セクションを設置し、オリンパスＬＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）でデジタル的に写真を撮った。

結果
ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファについて実施例４６に示したように、Ｇ−ＣＳＦ受容体はヒト脳の前頭皮質で発現された（図５４）。

実施例４８：Ｇ−ＣＳＦはイン・ビトロにて細胞死滅後にアップレギュレートされる。
ラットからの初代皮質ニューロンを実施例１２に記載したように作製した。調製から２週間後にニューロンを種々の濃度のＨ_２Ｏ_２（０μＭ、３００μＭ、４５０μＭ、６００μＭおよび９００μＭ）で６時間処理した。培地を捨て、溶解緩衝液を加えることによって、かつＱｉａｇａｎ ＲＮｅａｓｙミニキットによるＲＮＡ−調製のための製造の業者の推奨に従い、細胞をプレートから掻き落とした。Ｇ−ＣＳＦに関するＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ測定を実施例２３に記載するように行った。

結果
増大させる濃度のＨ_２Ｏ_２で細胞死滅が生起するにつれ、Ｇ−ＣＳＦの発現は同様に増加した（図５５）。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦが、脳損傷後に内因性神経保護因子として作用するであろうという示唆を確認する。

実施例４９：ラット脳におけるＩＬ−５受容体の発現
正常なラット脳におけるＩＬ−５受容体の分布を系統的に評価するために、パラフィン−包埋組織（２μｍ）のセクションを脱パラフィン化し、マイクロ波処理した（５００ｗにおける１０分間のクエン酸緩衝液）。その後、セクションをＩＬ−５受容体アルファ抗
血清（ＡＦ５３３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１：１００）と共に湿潤チャンバー中で室温にて１時間インキュベートした。クロモゲン（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）としてのＤＡＢでのＡＢＣ技術を用いて染色を可視化した。陰性対照を一次抗血清を省くことによって行った。

結果
ＩＬ−５受容体アルファの発現は、前頭皮質（図５６ａ）において、歯状回（図５６ｂ）において、嗅球の僧帽細胞（図５６ｃ）において、および小脳のプルキニエ細胞（図５６ｄ）において検出された。

実施例５０：ヒト細胞に対するＧ−ＣＳＦの神経保護効果
本実施例において、我々は、ヒト起源の細胞に対するＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの神経保護能力をテストした。従って、我々は、ヒト神経芽腫細胞系ＳＨＳＹ５Ｙを用いた。酸化的ストレスをモデル化するために、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在または不存在下で細胞をＮＯ−ドナーＮＯＲ３で処理し、増加したカスパーゼ３／７活性を損傷についての尺度として用いた。細胞を９６ウェルプレートに（５×１０^４細胞／ウェル）２日間で撒いた。酸化的ストレスを誘導するために、Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｍｌ）の有りまたは無しにて、細胞を１５０μＭのＮｏｒ３で５時間処理した。次いで、製造業者のプロトコルに従って、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏｗアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってカスパーゼ３／７活性を測定し、プレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でルミネセンスを検出した。図５７は、Ｇ−ＣＳＦ［６０ｎｇ／ｍｌ］およびＧＭ−ＣＳＦ［２０ｎｇ／ｍｌ］が、共に、ヒト神経芽腫細胞においてＮＯＲ３惹起カスパーゼ活性を低下させることを示す。これは双方のサイトカインの神経保護効果の基礎となり、ヒトニューロン細胞がそれらに対して感受性であることを示す。

実施例６０：ヒトおよびげっ歯類ＧＭ−ＣＳＦはラット初代ニューロンに対して神経保護的である。

ヒトおよびげっ歯類ＧＭ−ＣＳＦ起源からのＧ−ＣＳＦの異なる効率についてのテスト。我々は、胎児ラットから調製した初代ニューロンに対する、組換えマウスＧＭ−ＣＳＦおよび組換えヒトＧ−ＣＳＦの神経保護効果を比較した。ニューロン調製物においてアポトーシスを誘導するために、我々は、カスパーゼ活性を測定する前５時間、トポイソメラーゼ阻害剤カンプトテシン［２０μＭ］で細胞を処理した。図５８は、実験の結果を示し、ＧＭ−ＣＳＦ［２０ｎｇ／ｍｌ］の添加は、ＣａｓｐａｓｅＧｌｏｗアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でのルミネセンス増加によって測定して、カンプトテシン誘導カスパーゼ３／７活性を有意に低下させた。我々は、マウスおよびヒトＧ−ＣＳＦでの処理の間でいずれの有意な差も観察できず、これは、Ｇ−ＣＳＦの異なる種がラットニューロン上のＧ−ＣＳＦ−受容体を活性化できることを示す。

特許、特許出願、および刊行物を含めた本明細書中で引用した文献の全ては、ここに、引用してその全体を援用する。

明らかに、本発明の多数の修飾および変形が前記教示に照らして可能である。従って、添付の請求の範囲の範囲内で、本発明は本明細書中に具体的に記載された以外のものを実施することができると理解される。

イン・ビボおよびイン・ビトロでのＧＣＳＦによる効果的な神経保護を示す。Ａ．ＴＴＣ−染色によって測定した、病変大脳虚血症（フィラメントモデル；中央大脳動脈閉塞、ＭＣＡＯ）後におけるＧＣＳＦの神経保護の程度。全半球の梗塞のパーセントに対するｙ−軸の値（データは平均±ＳＤ；Ｔ−検定；ｐ＜０．０５）。Ｂ．Ｈ_２Ｏ_２（０ｕＭ、４００ｃＭ、７５０ｕＭ）による増大する酸化的ストレス下におけるＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞における細胞生存アッセイ。ＧＣＳＦ処理は、細胞生存において劇的な増加を生じる。比較において、公知の神経保護物質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）での細胞の処理の後における細胞生存を与える。Ｙ−軸：相対的（Ｒｅｌ．）細胞生存（ルシフェラーゼ活性の光ユニット）。 マウスＧＣＳＦＲに特異的なＲＴ−ＰＣＲを示す。ＧＣＳＦ−Ｒ ＲＮＡは、５６７ｂｐの予測されたサイズを持つ脳組織で検出された。同一性は、ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認された。 ＧＣＳＦ−Ｒの代表的な免疫ブロット。ＧＣＳＦ−Ｒ抗血清を用い、約１３０ｋＤａにおけるバンドがラット皮質の組織で検出可能である（レーン１）。より低い分子量のさらなるバンドは、おそらくは、分解した産物を反映するらしい。各ペプチドでの抗血清のプレ吸収後に、バンドは検出できない（レーン２）。 マウスにおける異なる脳領域におけるＧＣＳＦ−受容体の分布を示す免疫組織化学（パラフィンセクション、２μｍ）。ａ−ｄ：海馬におけるＧＣＳＦ−Ｒの局所化。抗体は、ＣＡ３領域（ａ，ｂ）におけるニューロンを圧倒的に染色し、ＣＡ３およびＣＡ２領域の間には鋭い境界がある（ｃ，矢印）ことに注意されたし。ＧＣＳＦ−Ｒは体幹、ならびにニューロンの突起にわたって分布する（ｂ，矢印）。歯状回の門および基底細胞層における受容体の存在に注意されたし（ｄ，矢印）。ＧＣＳＦ−受容体は皮質領域：例えば、梨状皮質（ｅ）、および鼻周囲皮質（ｆ）にも検出された。小脳においては、プルキニエ細胞が標識される（ｇ，矢印）。また、嗅球中の大きな僧帽細胞のいくつかはＧＣＳＦ−Ｒ陽性である（ｈ，矢印）。強い染色が脊髄中の前柱によって呈され（ｉ，ｊ）、より高い倍率はＧＣＳＦ−Ｒ陽性として大きな運動ニューロンを同定する（ｋ，ｌ）。ニューロン突起は強く標識されることに注意されたし。中脳において、黒質中のニューロンは、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性を示す（ｍ）。特に、緻密部（ＳＮＣ）中の全てのニューロンは標識される（ｍおよびｎにおける矢印）。また、網様部において、いくつかのニューロンはＧＣＳＦ−Ｒを発現する（ｏ）。ニューロンとは別に、白色物質管中の稀突起神経膠細胞は、例えば、前交連において染色される（ｐ，矢印）。驚くべきことには、ＧＣＳＦリガンドの染色（抗体ｓｃ１３１０２，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は、その受容体（抗体ｓｃ６９４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の発現と共に共局所化する（図４ｑ−ｕ）。これは、有害刺激体に対するニューロン保護尺に対してのオートメカニズムに対して議論を差し挟む。海馬において、同一のサブ視野特異性がＧＣＳＦリガンドについて観察される（ｑ：ＧＣＳＦＲ，ｒ：ＧＣＳＦ，サブ視野ＣＡ２−３の間のボーダーを矢印は指摘し、ｃａ３およびｃａ２標識はサブ視野を示す）。この特異性は、虚血症損傷に対するこれらの領域の感受性の公知の差と合致し、再度、ＧＣＳＦシステムの神経保護機能については議論を差し挟む。また、歯状回においては、門および亜顆粒状帯における発現の同一の興味深いパターンが観察され（図４ｓ，ＧＣＳＦ受容体；図４ｔ，ＧＣＳＦ；矢印は亜顆粒帯中の１つのニューロンを指し示し、標識：ｓ：亜顆粒帯，ｈ：歯状回の門）、これは神経形成についてのＧＣＳＦシステムの重要性の基礎となり、ニューロスフィア上の受容体およびリガンドの発現と好適に平行する（図１３参照）。興味深いことには、ＧＣＳＦには、その受容体にもそこで発現される（図４ｉ−ｌ）脊髄の大きな運動ニューロンにおいても発現される（図４ｕ）。 皮質（ａ，ｂ）および海馬培養ニューロン（ｃ，ｄ）上のＧＣＳＦＲについての染色を示す。受容体は、ニューロンの幹および突起双方に存在する。スライド上の全てのニューロンが標識されたのではない。各ペプチドと抗体とのプレインキュベーション、または一次抗体の省略の結果、特異的染色の結果は起こらなかった（示さず）。 ＳＴＡＴ３に対する抗体で得られた免疫組織化学の結果を示す。ＳＴＡＴ３免疫組織化学。多数のニューロン核は、プラセボ処理動物の皮質梗塞周囲領域（ａ，矢印；左：梗塞；右：領域；元の倍率×２００）と比較して、ＧＣＳＦ処理ラットの皮質領域（ｂ，矢印）において正に染色されることに注意されたし。 ＳＴＡＴ３に対する抗体で得られた免疫組織化学の結果を示す。梗塞（ＩＬ）の近隣における影響されていない対側性側（ＣＬ）および同側における皮質ニューロンは、ＧＣＳＦ処理動物および対照で定量された。ＳＴＡＴ３の核トランスロケーションを持つニューロンをカウントすることによって定量して、ＧＣＳＦ−処理群における梗塞に隣接したニューロンにおいてＳＴＡＴ３の有意な活性化があった（＊ｂ＜０．０５，ｔ−検定）。 大脳虚血症の光血栓症ベンガルローズモデルにおけるＧＣＳＦ処理の効果を示す。Ａ、ロダロッド性能；Ｂ、ビームバランスを含めた神経学的スコア；Ｃ、Ｄ：同側（Ｃ）、ならびに対側性側（Ｄ）で測定された接着テープ除去テスト。脚注：虚血症：虚血症ラット、非−処理の群；虚血症＋ＧＣＳＦ：ＧＣＳＦで処理した虚血症ラットの群；偽＋ＧＣＳＦ：ＧＣＳＦで処理した、偽−操作動物；偽：偽−操作動物、未処理。Ｌ：左足でのテープ−除去テスト：Ｒ：右足でのテープ−除去テスト。テープが同側にある場合には、支配的な運動欠乏、および、テープが対側にある場合には支配的な感欠乏によって恐らくは引き起こされた、テープ−除去テストにおける双方側に対する効果があることに注意されたし（Ｃ，Ｄ）。 大脳虚血症の光血栓症ベンガルローズモデルにおけるＧＣＳＦ処理の効果を示す。Ａ、ロダロッド性能；Ｂ、ビームバランスを含めた神経学的スコア；Ｃ、Ｄ：同側（Ｃ）、ならびに対側性側（Ｄ）で測定された接着テープ除去テスト。脚注：虚血症：虚血症ラット、非−処理の群；虚血症＋ＧＣＳＦ：ＧＣＳＦで処理した虚血症ラットの群；偽＋ＧＣＳＦ：ＧＣＳＦで処理した、偽−操作動物；偽：偽−操作動物、未処理。Ｌ：左足でのテープ−除去テスト：Ｒ：右足でのテープ−除去テスト。テープが同側にある場合には、支配的な運動欠乏、および、テープが対側にある場合には支配的な感欠乏によって恐らくは引き起こされた、テープ−除去テストにおける双方側に対する効果があることに注意されたし（Ｃ，Ｄ）。 虚血症に対して対側での光血栓症の誘導から４８時間後においてベンガル−ローズモデルにおけるＧＣＳＦ−受容体のアップレギュレーションを示す。Ａ、ラット脳の冠セクションのスキーム、組織試料３および４は、偽−操作ラットからの同一組織試料と比較したＧＣＳＦ受容体ｍＲＮＡの定量で用いた。Ｂ、皮質境界領域試料におけるＧＣＳＦ受容体ｍＲＮＡの定量（Ａからの試料３および４）。同側での虚血症誘導から６時間後の初期アップレギュレーションに続いて梗塞後４８時間における対側でのアップレギュレーションが起こる。この対側アップレギュレーションはＧＭＣＳＦ受容体でも観察された（後記参照）。 ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いる異なる種からのＧＣＳＦの整列を示す（配列番号：２８ないし３３）（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標），Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。 ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いるマウスおよびヒトからのＧＣＳＦ受容体、およびラットの断片の整列を示す（配列番号：３４ないし３６）（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標），Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。 ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）による成体ニューロン幹細胞（ｎｓｃ）上のＧＣＳＦ受容体の存在を示す。アガロースゲルが示される。レーン１：サイズマーカ；レーン２：ニューロン幹細胞（ｎｓｃ）からのＰＣＲ産物、目に見えるのはラットＧＣＳＦＲ−特異的バンド（２７９ｂｐ）である；レーン３：陰性対照。 神経幹細胞上のＧＣＳＦ−受容体およびＧＣＳＦの存在を示す。Ａ、全ての細胞の可視化のためのニューロスフィアのＤＡＰＩ染色、Ｂ、ＧＣＳＦ受容体に対して向けられた抗体で染色された同一ニューロスフィア。Ｃ、Ｄ、ＤＡＰＩで染色されたニューロスフィア（Ｃ）およびＧＣＳＦについての抗体（Ｄ）。 マウスへの腹腔内注射後におけるビオチニル化ＧＣＳＦの迅速な摂取を示す。Ａ、７．５ｕｇのＧＣＳＦ／マウスの注射から１、２、４、６、２０、２８時間後に犠牲にしたマウスからの血清のウェスタンブロット。Ｂ、腹腔内注射後の血清ＧＣＳＦのＥＬＩＳＡ。２時間において血清のピークレベルとなる腹膜からのＧＣＳＦの迅速な摂取があり、これは、この投与経路の適用性を示す。 虚血症に対して同側および対側での光血栓症の誘導（ベンガルローズモデル）後のアップレギュレートされたｍＲＮＡとしてのＧＭＣＳＦ−受容体の同定を示す。Ａは、マウス脳の虚血症冠セクションを示し、注目する領域は灰色でマークする；Ｂは、その上で、ＧＭＣＳＦ−受容体の転写体が調節されるものとして同定されたＲＭＤＤ−ゲルのセクションを示す。レーンは、マウス脳ＲＮＡ試料でのＲＴ−ＰＣＲ−産物を表す。試料は、発作後の異なる時点における皮質境界領域から採取した（各々、Ａにおいて３および４）。 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−システムを適用することによる、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる４８時間におけるベンガル−ローズモデルでのＧＭＣＳＦ受容体のアップレギュレーションの確証を示す。試料は、光血栓症の誘導から６時間、４８時間および２１日後に採取し、誘導レベルは偽−操作動物と比較した。同側半球では、ＧＭＣＳＦ受容体のアップレギュレーションは皮質虚血症後初期に最大であり、２１までは定常的に降下する。対応する対側皮質−試料では、アップレギュレーションは梗塞から２日後に最も明瞭に見られ、２１日において依然として中程度にアップレギュレートされる。対側でのこの調節パターンはＧＣＳＦ受容体を示唆する（前記参照）。 ヒト、マウスからのＧＭＣＳＦ受容体、およびアップレギュレートされた転写体と同定されたラットからの配列の整列を示す（配列番号：２２、２３および２４）（ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。この相同性から、同定された配列はラットＧＭＣＳＦ受容体であると結論される。 ヒト、マウスおよびラットからのＧＭＣＳＦの整列を示す（配列番号：２５、２６および２７）（ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。 マウスにおける異なる脳領域でのＧＭＣＳＦ−受容体アルファ（ａ−ｄ）およびＧＭＣＳＦ（ｅ−ｇ）の分布を示す免疫組織化学（パラフィンセクション，２μｍ）。ａ：小脳においては、プリキニエ細胞が標識される（矢印）。ｂ−ｄ：海馬におけるＧＭＣＳＦ−Ｒアルファの局所化。歯状回の門における受容体の存在に注意されたし（ｂ，矢印）。該抗体は、ＣＡ３およびＣＡ２領域の間に鋭い境界があるＣＡ３領域（ｃ）中のニューロンを圧倒的に染色する（ｃ，矢印）。ＧＭＣＳＦ−Ｒアルファは、ニューロンの幹（ＣＡ３）、ならびに突起（ＣＡ２）にわたって分布する。ＧＭＣＳＦ−受容体は内側嗅皮質（ｄ）にも検出される。ＧＭＣＳＦは、ＧＭＣＳＦ−受容体アルファと比較した同様な分布を示す。ＧＭＣＳＦ抗体は同様にプルキニエ細胞（ｅ，矢印）、ＣＡ３領域（ｆ）中のニューロンを染色し、ＣＡ３およびＣＡ２領域の間には鋭い境界があり（ｆ，矢印）、および内側嗅皮質中のニューロン（ｇ）を染色する。図１９ｈ−ｍ：ここに示されるのは、ニューロンにおけるＧＭＣＳＦ受容体およびそのリガンドの驚くべき共局所化である。ｈ、海馬サブ視野ＣＡ３におけるニューロンでのＧＭＣＳＦの受容体の局所化（抗体ｓｃ６９０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、矢印は隣接するＣＡ２領域との境界の鋭い発現を指摘する。ｉ、ＧＭＣＳＦリガンド（抗体ｓｃ１３１０１）は同一のサブ視野−特異的発現を示し、矢印はＣＡ３領域における１つのニューロンを指し示す。ｊ、歯状回の門およびやや顆粒状の帯におけるＧＭＣＳＦ受容体の発現。矢印はやや顆粒状の帯におけるニューロンを指し示す。ｋ、その領域におけるＧＭＣＳＦリガンドの発現。ここに、リガンドはその受容体と比較して僅かに異なる発現を示す。ＣＡ３領域には明瞭な発現がある（矢印）が、歯状回領域では明瞭でない。ｌ，ｍ：脊髄の大きな運動ニューロンにおけるＧＭＣＳＦ受容体（ｌ）およびリガンド（ｍ）の発現。この驚くべき発現は、運動ニューロンの病気、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）についてのＧＭＣＳＦシステムの治療適用性に対する明瞭な示唆である。 皮質ニューロン培養でのＧＭＣＳＦＲアルファに対する染色を示す。受容体はニューロンの幹および突起双方に存在する（これは、図面には含めていない、核エピトープＮｅｕＮに対して向けられた抗体、およびシナプトフィシンに対する抗体での二重標識によって証明される）。抗体と各ペプチドとのプレインキュベーション、または一次抗体の省略の結果、特異的染色は起こらなかった（示さず）。 成体ニューロン幹細胞（ｎｓｃ）およびＰＣ１２細胞（ＰＣ１２）上のＧＭＣＳＦ−受容体アルファの存在をＲＴ−ＰＣＲによって示す。示されるのはアガロースゲルである。レーン１：サイズマーカ（ｍ）、レーン２：ニューロン幹細胞（ｎｓｃ）でのＰＣＲ；レーン３：ＰＣ１２細胞（ＰＣ１２）でのＰＣＲ；レーン４：陰性対照（ｎｅｇ）である。ラットＧＭ−ＣＳＦＲアルファ−特異的バンド（１７６ｂｐ）はレーン２および３で目に見える。 免疫細胞化学によって、成体ニューロン幹細胞（ｎｓｃ）上のＧＭＣＳＦ−受容体アルファの存在を示す。ＤＡＰＩ（Ａ、全ての細胞核を染色）、およびＧＭＣＳＦ受容体に対して特異的な抗体（Ｂ）で染色される１つのニューロスフィアがある（倍率１０×）。 イン・ビトロにおけるＧＭＣＳＦによる効果的な神経保護を示す。Ｈ_２Ｏ_２（０ｕＭ、４００ｕＭ、７５０ｕＭ）による増大する酸化的ストレス下でのＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞での細胞生存性アッセイ。ＧＭＣＳＦ処理は、生存細胞において劇的な増加を生じる。比較において、公知の神経保護物質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ；０．５Ｕ／ｍｌ）での細胞の処理後における細胞生存が与えられる。Ｙ−軸：Ｒｅｌ．細胞生存（ルシフェラーゼ活性の光ユニット）。 Ｃ−ＣＳＦを投与しない（対照）と比較した、虚血症の開始から１２０分後に適用した場合のラットＭＣＡＯモデルでの梗塞容量に対する静脈内適用されたＧ−ＣＳＦの効果を示す。 Ｇ−ＣＳＧ受容体およびＧ−ＣＳＦについての海馬および皮質でのＴＴＣ―染色を示す。データは、ＧＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）が、海馬（ａ−ｃ歯状回，ｄ−ｆ門）および皮質（ｇ−ｉ）双方におけるそのリガンド（ｂ，ｅ，ｈ）との共局所化を示すことを示す。 海馬の歯状回（ａ−ｃ）および門（ｄ−ｆ）における、ならびに皮質（ｇ−ｉ）における、ニューロンでのＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ受容体双方の共発現を示す。ＧＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびＧＭＣＳＦ受容体（ｂ，ｅ，ｈ）は、海馬および皮質（ｃ，ｆ，ｉ）双方において同一ニューロンで発現される。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ｇ−ＣＳＦがニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって抗−アポトーシス的に作用することを示す。 Ａは同側および対側での病変虚血症から２時間および６時間後におけるＧＣＳＦの非常に強いアップレギュレーションを示し、他方、受容体は６時間後に中程度に調節される（Ｂ）。 ＧＣＳＦの誘導された発現はＭＣＡＯモデルに特異的でないが、全体的虚血症において程度は低いにもかかわらずやはり観察することができた（Ｃ）。 梗塞の領域におけるＧ−ＣＳＦおよびその受容体を示す（ベンガルローズ）。 海馬の歯状回（ａ−ｆ）および門（ｇ−ｉ）におけるニューロンでのＧＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびダブルコルチン（ｂ，ｅ，ｈ）の発現を示す。 ＧＣＳＦ処理から４日後におけるニューロンマーカＮＳＥおよびベータＩＩＩ−チューブリンの強力かつ濃度依存性のアップレギュレーションを示す。ＰＬＰおよびＧＦＡＰはＧＣＳＦ−濃度に依存して中程度に調整される。誤差バーは、３倍系列希釈されたｃＤＮＡ−試料から計算された標準偏差を示し、これは測定の信頼性を反映する。 脳におけるＧＭＣＳＦおよびその受容体の共局所化を示す。ＧＭＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびＧＭＣＳＦ（ｂ，ｅ，ｈ）は歯状回（ａ−ｃ）、門（ｄ−ｆ）、および皮質（ｇ−ｉ）におけるニューロンで共局所化される。 ＧＣＳＦおよびその受容体が大脳虚血症によってアップレギュレートされることを示す。 ＧＣＳＦおよびその受容体が大脳虚血症によってアップレギュレートされることを示す。 海馬の歯状回（ａ−ｃ）および門（ｄ−ｉ）におけるニューロンでのＧＭＣＳＦ受容体（ａ，ｄ，ｇ）およびダブルコルチン（ｂ，ｅ，ｈ）の発現を示す。 神経幹細胞の分化能力、および分化した細胞の特異的マーカ発現を示し、また、神経幹細胞の１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦでの処理の結果、ベータＩＩＩ−チューブリン（ｎ＝３；ｐ＜０．０５、両側ｔ−検定）および、ＮＳＥの程度は低いが、成熟ニューロンに対するマーカ（Ｂ）が有意に誘導された発現をもたらすことを示す。 Ｇ−ＣＳＦが血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過することを示す。 ＧＭ−ＣＳＦが血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過することを示す。 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に対するＧ−ＣＳＦの効果を示す。 パーキンソン病（ＰＤ）のげっ歯類モデルにおけるＧＣＳＦの効果を示す。 ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ＧＭＣＳＦが抗アポトーシス的にニューロンにおいて作用することを示し、パートＩは、アポトーシスの兆候として特異的に起こっているＰＡＲＰ切断をＧＭＣＳＦが阻害することを示す。細胞死滅は、ＮＯ−ドナーＮＯＲ−３を用いることによって初代ニューロンで誘導された。 ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ＧＭＣＳＦが抗アポトーシス的にニューロンにおいて作用することを示し、パートＩＩは、蛋白質それ自体はニューロンで発現されるが、ＧＭＣＳＦはＳＴＡＴ１（「ｐＳＴＡＴ１」）またはＳＴＡＴ５（「ｐＳＴＡＴ５」）の増大したリン酸化に導かないことを示す。 ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ＧＭＣＳＦが抗アポトーシス的にニューロンにおいて作用することを示し、パートＩＩＩ Ａは、ＧＭＣＳＦが、ＧＭＣＳＦ刺激後５分において最大となるＳＴＡＴ３の時間−依存性活性化に導くことを示す。Ｂ、３つの独立した実験の定量。Ｃ、リン酸化によるＳＴＡＴ３の活性化はＪＡＫ２阻害剤ＡＧ４９０によって阻害することができる。 ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ＧＭＣＳＦが抗アポトーシス的にニューロンにおいて作用することを示し、パートＩＶは、ｓｔａｔ３標的遺伝子Ｂｃｌ２、およびＢｃｌＸ１の発現をＧＭＣＳＦが強く誘導することを示す。これらの遺伝子は抗アポトーシスであることが知られている。 ３時間の初期（パートＩ）、および後期ウィンドウ（パートＩＩ）の双方において、ＧＭＣＳＦ−処理動物において梗塞容量の有意な低下があることを示す。 ３時間の初期（パートＩ）、および後期ウィンドウ（パートＩＩ）の双方において、ＧＭＣＳＦ−処理動物において梗塞容量の有意な低下があることを示す。 Ｌｉｇｈｔ―Ｃｙｃｌｅｒ−Ｓｙｓｔｅｍを適用することによる、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる２時間および６時間での病変虚血症におけるＩＬ−５のアップレギュレーションを示す。試料はラットにおけるＭＣＡＯの誘導後２時間、６時間および２０時間に採取し、誘導レベルを偽−操作動物と比較した。同側半球では、ＩＬ−５ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは病変虚血症後初期に上昇し、発作から６時間後にその最大に到達する。開始から２０時間後に、正常なＩＬ−５レベルに到達する。対応する対側皮質−試料では、梗塞から６時間後に僅かなアップレギュレーションが見られる。 Ｇ−ＣＳＦ−処理後におけるニューロンでの、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＥＲＫ―経路双方の誘導を示す。図４３Ａ、ＢおよびＤにおいて、レーンはＧ−ＣＳＦ処理開始後の種々の時点を示す。図４３Ａにおいて、全Ａｋｔ−蛋白質と比較したＡｋｔのリン酸化（上方レーン）が示される。ＡｋｔはＧＣＳＦの添加から５分後にリン酸化される。図４３Ｂにおいて、全ＰＤＫ１−蛋白質と比較したＰＤＫ１（上方レーン）のリン酸化の量が示される。ＰＤＫ１は、Ｇ−ＣＳＦ添加から５分後にリン酸化され、Ｇ―ＣＳＦ暴露の３０分後にピークがあった。図４３Ｃは、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２が、Ｇ−ＣＳＦ添加の５分後にＡｋｔのリン酸化を完全にブロックしたことを示す。図４３Ｄは、Ｇ−ＣＳＦ添加から２および５後のＥＲＫ１のリン酸化を示す。リン酸化されたＥＲＫ１／２の量はＧ−ＣＳＦ添加から５ないし１５分後にピークとなり、他方、ほとんどのＥＲＫ５は暴露の３０分においてリン酸化された。 ＧＭ−ＣＳＦ−処理後のニューロンにおける、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＥＲＫ−経路の双方の誘導を示す。図４４ＡおよびＢにおいて、レーンはＧ−ＣＳＦ処理の開始後における種々の時点を示す。図４４Ａにおいて、全Ａｋｔ−（第２のレーン）およびＰＤＫ１−蛋白質（第４のレーン）と比較したＡｋｔ（上方レーン）のリン酸化およびＰＤＫ１（第３のレーン）のリン酸化が示される。ＡｋｔおよびＰＤＫ１はＧＣＳＦ添加から５分後にリン酸化された。ブロットもまた、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２が、ＧＭ−ＣＳＦ添加から５分後にＡｋｔのリン酸化を完全にブロックしたことを示す。図４４Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ添加から５後におけるＥＲＫ１／２のリン酸化を示す。リン酸化されたＥＲＫ１／２の量はＧＭ−ＣＳＦ添加から５分後にピークとなり、他方、ＥＲＫ５は暴露から５分後にリン酸化され、一定に留まった。 ＧＭ−ＣＳＦがイン・ビトロにて細胞死滅後にアップレギュレートされることを示す。 ＩＬ−３およびＩＬ−５が、（１から１００ｎｇ／ｍｌへ上昇する）特定濃度でのカンプトテシン処理後に細胞に対して抗−アポトーシス効果を有することを示す。アポトーシス（カスパーゼグロー）アッセイのためのディテクタ（Ｐｒｏｍｅｇａ）としての検出されたカスパーゼ−３および７カスパーゼルミネセンスの値が与えられる。この図は、ラットニューロン培養およびヒト神経芽腫細胞（ＳＨＳＹ５−Ｙ）における１ないし２０ｎｇ／ｍｌの濃度においてＩＬ−３が保護的であることを示す。 ＩＬ−３およびＩＬ−５が、（１から１００ｎｇ／ｍｌへ上昇する）特定濃度でのカンプトテシン処理後に細胞に対して抗−アポトーシス効果を有することを示す。アポトーシス（カスパーゼグロー）アッセイのためのディテクタ（Ｐｒｏｍｅｇａ）としての検出されたカスパーゼ−３および７カスパーゼルミネセンスの値が与えられる。この図はラットニューロン培養およびヒトＳＨＳＹ５−Ｙにおいて１ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ−５がその最高保護性を有することを示す。 ＩＬ−３処理後におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の誘導を示す。ＩＬ−３処理の開始後の異なる時点が与えられる（開始後５および６０分）。図４７中の最初のレーンはＡｋｔのリン酸化を示す。ＡｋｔはＩＬ−３添加から５分後にリン酸化され、１時間後に依然としてリン酸化された。第２のレーンは、ＰＤＫがＩＬ−５の５分後にリン酸化され、１時間後に依然としてリン酸化されたことをやはり示す。図４８は、ＩＬ−５処理後のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の誘導を示す。ＩＬ−５処理の開始後の種々の時点が与えられる（開始後５分および６０分）。図４８中の最初のレーンは、Ａｋｔのリン酸化を示す。ＡｋｔはＩＬ−５添加の５分後にリン酸化され、依然として、１時間後にリン酸化された。第２のレーンは、ＰＤＫがＩＬ−５の５分後にリン酸化され、依然として、１時間後にリン酸化されたことをやはり示す。 ＩＬ−３処理後におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の誘導を示す。ＩＬ−３処理の開始後の異なる時点が与えられる（開始後５および６０分）。図４７中の最初のレーンはＡｋｔのリン酸化を示す。ＡｋｔはＩＬ−３添加から５分後にリン酸化され、１時間後に依然としてリン酸化された。第２のレーンは、ＰＤＫがＩＬ−５の５分後にリン酸化され、１時間後に依然としてリン酸化されたことをやはり示す。図４８は、ＩＬ−５処理後のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の誘導を示す。ＩＬ−５処理の開始後の種々の時点が与えられる（開始後５分および６０分）。図４８中の最初のレーンは、Ａｋｔのリン酸化を示す。ＡｋｔはＩＬ−５添加の５分後にリン酸化され、依然として、１時間後にリン酸化された。第２のレーンは、ＰＤＫがＩＬ−５の５分後にリン酸化され、依然として、１時間後にリン酸化されたことをやはり示す。 皮質虚血症のさらなるモデルにおける梗塞容量がＧＣＳＦ処理後に低下したことを示す。各々５匹の動物の６つの測定された梗塞容量の平均値が与えられる。もしＧＣＳＦが虚血症の開始から１時間後に与えられれば、梗塞容量は有意に低下する。 ＧＣＳＦが、ニューロン表現型に向けてのニューロン幹細胞の分化を刺激したことを示す。細胞は、β−チューブリン−プロモータの制御下でルシフェラーゼでトランスフェクトした。異なる濃度のＧＣＳＦでの刺激後の相対的ルシフェラーゼシグナルが与えられる。より多くのＧＣＳＦが培養基に加えられれば、ルシフェラーゼシグナルはより多く検出することができる。これは、ＧＣＳＦがニューロン表現型に向けての分化をトリガーすることを示す。 ニューロン表現型に向けてのニューロン幹細胞の分化をＧＭＣＳＦが刺激したことを示す。細胞は、β−チューブリン−プロモータの制御下でルシフェラーゼでトランスフェクトした。異なる濃度のＧＭＣＳＦでの刺激後の相対的ルシフェラーゼシグナルが与えられる。より多くのＧＭＣＳＦが培養基に加えられれば、より多くのルシフェラーゼシグナルが検出することができる。これは、ＧＭＣＳＦがニューロン表現型に向けての分化をトリガーすることを示す。 ニューロン表現型に向けての分化をＧＭＣＦＳがトリガーすることを示す。ＧＭＣＳＦ処理後のＮＳＣのＦＡＣＳ分析の結果が与えられる。ニューロンマーカ蛋白質としてのＭＡＰ−２が蛍光標識抗体によって検出される。バーは、分析された試料におけるＭＡＰ−２−陽性細胞のパーセンテージを与える。これは、ＧＭＣＳＦが典型的なニューロン蛋白質の発現を誘導することを示した。 ヒト脳スライスにおけるＧＭＣＳＦ受容体（ＧＭＣＳＦＲ）およびＧＭＣＳＦの検出を示す。５３ａおよびｄはＧＭＣＳＦＲの検出を示し、ｂおよびｅはＧＭＣＳＦを示し、ｃおよびｆは、各々、ａおよびｂおよびｄおよびｅの重複を反映する。合わせた図面は、ヒト脳において、ＧＭＣＳＦおよびその受容体が同一細胞で発現されることを示す。 皮質からのヒト脳スライスにおけるＧＣＳＦ受容体（ＧＣＳＦＲ）の検出を示す。５４ａおよびｄはＧＣＳＦＲの検出を示し、ｂおよびｅは細胞核のＤＡＰＩ−染色を示し、ｃおよびｆは各々、ａおよびｂおよびｄおよびｅの重複を反映する。図面は、ＧＭＣＳＦがヒト皮質で発現されることを示す。 ＧＣＳＦが細胞死滅誘導後にアップレギュレートされたことを示す。Ｈ_２Ｏ_２処理後におけるニューロン細胞でのＧＣＳＦ−ｍＲＮＡ発現の相対的値が与えられる。上昇させる濃度のＨ_２Ｏ_２での刺激は、これらのストレスが与えられた細胞でのＧＣＳＦ−ｍＲＮＡ合成の増大する量に導く；ＧＣＳＦ−ｍＲＮＡは３倍までアップレギュレートされた。 ラット脳のスライスにおける免疫組織化学によるＩＬ−５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）の検出を示す。ＩＬ−５受容体アルファの発現は前頭皮質（図５６ａ）、歯状回（図５６ｂ）、嗅球の僧帽細胞（図５６ｃ）、および小脳のプルキニエ細胞（図５６ｄ）で検出された。これは、ラット脳におけるＩＬ５Ｒａの広く行き渡った発現を反映する。 Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦはＮｏｒ３誘導アポトーシスからヒト神経芽腫細胞を保護する。カスパーゼグローアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した，６０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦまたは２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下および不存在下における１５０μＭのＮｏｒ３での５時間の処理後のＳＨＳＹ５Ｙ細胞のカスパーゼ３／７活性。 ヒトおよびネズミＧＭ−ＣＳＦは、共に、ヒト神経芽腫細胞におけるカンプトテシン誘導細胞死滅を誘導する（ＳＹＳＹ５Ｙ）。カスパーゼグローアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定して、ヒトまたはネズミＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下における５時間のカンプトテシンでの処理後のＳＨＳＹ５Ｙ細胞のカスパーゼ３／７活性。

Claims (57)

1. ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される造血因子を、神経学的疾患を治療するのに十分な量で、それを必要とする哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法。
2. 該神経学的疾患が、虚血症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気、低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気、神経変性病、および神経細胞死滅が伴う神経系の病気よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
3. 該神経学的疾患が、虚血症または低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気である請求項１記載の方法。
4. 虚血症または低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気が発作である請求項３記載の方法。
5. さらに、１以上のさらなる造血因子を投与することを含む請求項１記載の方法。
6. 該神経学的疾患が精神医学的疾患である請求項１記載の方法。
7. 該精神医学疾患が鬱病である請求項６記載の方法。
8. 該精神医学的疾患が認知症または多発性硬化症である請求項１記載の方法。
9. 該造血因子がＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、その誘導体、そのミメティック、その組合せよりなる群から選択され、ここに、該さらなる造血因子がエリスロポエチンである請求項５記載の方法。
10. ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、およびそのミメティックよりなる群から選択される少なくとも２つの造血因子を含む組合せを含み、ここに、該さらなる造血因子がエリスロポエチンである請求項５記載の方法。
11. 該神経学的疾患が発作、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、神経外傷、心臓停止による大脳虚血症、手術手法の間における大脳虚血症、多発性硬化症、ハンチントン病、緑内障、神経障害、リソソーム貯蔵病、または脊髄負傷である請求項１記載の方法。
12. 該造血因子がＩＬ−３、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項１記載の方法。
13. 該造血因子がＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項１記載の方法。
14. さらに、血流力学的に活性な化合物を投与することを含む請求項１記載の方法。
15. さらに、組織プラスミノーゲンアクチベータを哺乳動物に投与することを含む請求項１記載の方法。
16. さらに、血液脳関門の通過を容易とする剤を投与することを含む請求項１記載の方法。
17. さらに、抗−アポトーシス剤を投与することを含む請求項１記載の方法。
18. 該神経学的疾患が発作である請求項１５記載の方法。
19. さらに、組織プラスミノーゲンアクチベータを哺乳動物に投与することを含む請求項１０記載の方法。
20. 該造血因子がヒト因子であるか、またはヒト因子に由来する請求項１記載の方法。
21. 該哺乳動物がヒトである請求項１記載の方法。
22. 該造血因子が直接的大脳内注射、静脈内、動脈内、経口及び皮下よりなる群から選択される１以上の投与様式によって投与される請求項１記載の方法。
23. 該造血因子の投与が、哺乳動物に投与した場合、神経学的疾患を治療するのに十分な量の造血因子を発現するポリヌクレオチドを投与することを含む請求項１記載の方法。
24. 該ポリヌクレオチドがウィルスベクターまたはリポソームと共に投与される請求項２３記載の方法。
25. 神経幹細胞組成物を、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される造血因子と接触させ；引き続いて、神経幹細胞を哺乳動物に投与することを特徴とする、それを必要とする哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法。
26. 該神経学的疾患が、虚血症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気、低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気、神経変性病、および神経細胞死滅を伴う神経系の病気よりなる群から選択される請求項２５記載の方法。
27. 該神経学的疾患が虚血症または低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ神経学的病気である請求項２６記載の方法。
28. 虚血症または低酸素症に関係する病理生理学的メカニズムを持つ該神経学的病気が発作である請求項２７記載の方法。
29. 該神経学的疾患が精神医学的疾患である請求項２５記載の方法。
30. 該精神医学的疾患が鬱病である請求項２９記載の方法。
31. 該精神医学的疾患が認知症または多発性硬化症である請求項２５記載の方法。
32. さらに、神経幹細胞組成物を１以上のさらなる造血因子と接触させることを含む請求項２５記載の方法。
33. 該造血因子がＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、その誘導体、そのミメティック、その組合せよりなる群から選択され、ここに、該さらなる造血因子がエリスロポエチンである請求項３２記載の方法。
34. 該神経幹細胞組成物を、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、およびそのミメティックよりなる群から選択される少なくとも２つの造血因子；およびエリ
    スロポエチンの組合せと接触させる請求項３３記載の方法。
35. 該神経学的疾患が発作、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、神経外傷、心臓停止による大脳虚血症、手術手法の間における大脳虚血症、多発性硬化症、ハンチントン病、緑内障、神経障害、リソソーム貯蔵病、または脊髄負傷である請求項２５記載の方法。
36. 該造血因子がＩＬ−３、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項２５記載の方法。
37. 該造血因子がＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項２５記載の方法。
38. 該造血因子がヒト因子であるか、またはヒト因子に由来する請求項２５記載の方法。
39. 該哺乳動物がヒトである請求項２５記載の方法。
40. 該神経幹細胞組成物がヒト神経幹細胞を含む請求項２５記載の方法。
41. ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される造血因子をコードする１以上のポリヌクレオチドを哺乳動物に移植された細胞に導入することを含み、ここに、該細胞は該１以上のポリヌクレオチドを導入するに先立っての細胞生存に対して細胞の生存を増強するのに十分な量で造血因子を発現することを特徴とする、哺乳動物に移植された細胞の生存を増強させる方法。
42. 該細胞が、さらに、１以上のさらなる造血因子を発現し、それを分泌する請求項４１記載の方法。
43. 該さらなる造血因子がＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、エリスロポエチン、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される請求項４２記載の方法。
44. 該造血因子がＩＬ−３、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項４１記載の方法。
45. 該造血因子がＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、またはその組合せである請求項４１記載の方法。
46. 該哺乳動物がヒトである請求項４１記載の方法。
47. 該細胞が神経細胞である請求項４１記載の方法。
48. 該神経細胞が神経幹細胞である請求項４７記載の方法。
49. 該細胞が幹細胞である請求項４７記載の方法。
50. 該細胞が、さらに、ＩＬ−３受容体およびＩＬ−５受容体の一方または双方を発現する請求項４１記載の方法。
51. 該細胞が哺乳動物の神経組織に移植される請求項４１記載の方法。
52. 神経細胞培養を、造血因子と接触させるに先立っての培養に対して神経細胞培養の生存
    性を増強させる量の、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される造血因子と接触させることを特徴とする神経細胞培養の生存性を増強させる方法。
53. 該神経細胞培養が神経幹細胞を含む請求項５２記載の方法。
54. １以上のポリヌクレオチドを神経細胞培養の細胞に導入することを含み、ここに、該ポリヌクレオチドはＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティック、およびその組合せよりなる群から選択される造血因子を発現させ、ここに、該ポリヌクレオチドは、造血因子との接触に先立っての培養に対して神経細胞培養の生存性を増強させるのに十分な量の造血因子を発現させることを特徴とする、神経細胞培養の生存性を増強させる方法。
55. 該ポリヌクレオチドがウィルスベクターまたはリポソームで投与される請求項５４記載の方法。
56. 投与に先立っての哺乳動物に対して哺乳動物の認識能力を増強させるのに十分な量の、ＩＬ−３、ＩＬ−５、その誘導体、そのミメティックおよびその組合せよりなる群から選択される造血因子を投与することを特徴とする、それを必要とする哺乳動物の認識を増強させる方法。
57. 該哺乳動物がヒトである請求項５６記載の方法。

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