JP2008292456A - 静電的反発作用−親水性相互作用クロマトグラフィーによる帯電溶質の分離 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質、ペプチド又はアミノ酸で静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法であり、該方法は、約4未満のpHでアニオン交換材料のカラムを準備すること、及び、固定相の静電的反発作用と親水性相互作用とを実質的に平衡させるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離させることを含む。本発明の別の態様は、核酸またはヌクレオチドで静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法であり、該方法は、約3.4未満のpHでカチオン交換材料のカラムを準備すること、及び、固定相の静電的反発作用と親水性相互作用とを実質的に平衡させるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離させることを含む。
【選択図】図4
Description
本発明は、クロマトグラフィー法、特に親水性相互作用クロマトグラフィーによる荷電溶質の分離の分野に関する。
混合物中の溶質はその特性が大きく異なることがある。逆相クロマトグラフィー(RPC)では、これは極性の差に関係する。イオン交換クロマトグラフィーに関しては、これは荷電の差に関係する。一般に、混合物中の全ての溶質を同じ時間枠で確実に溶離するためには、ある種の勾配溶離液が用いられる。
一側面において、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸で静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法は、約4未満のpHでアニオン交換材料のカラムを準備すること;及び固定相による静電的反発作用と実質的に平衡する親水性相互作用を与えるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離することを含む。本方法は、たとえばリンタンパク質を定組成的に、または塩勾配を使用して選択的に単離するのに有用である。別の側面において、核酸またはヌクレオチドでERLICを実施する方法は、約3.4未満のpHでカチオン交換材料のカラムを準備すること;及び固定相による静電的反発作用と実質的に平衡する親水性相互作用を与えるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離することを含む。
本発明の目的、特徴及び有利な点は、付記図面中に示されている本発明の特定の態様に関するより詳細な説明から明らかになろう。
本発明は、HILICの間に非常に保持されにくいか又は非常に強く保持される高荷電溶質をもつ混合物を分離するためにクロマトグラフィー分析法を実施する新規な方法を紹介する。この戦略は、イオン交換と親水性相互作用の原理を組み合わせることを含む。本発明の方法を使用することにより、HILICでもイオン交換クロマトグラフィーのいずれでも固定相によって保持されないか又は非常によく保持されるアミノ酸、ペプチド、核酸またはヌクレオチドを適当な時間枠で効率的に分離することができる。本方法は親水性相互作用と静電的相互作用の両方の分離能力を重ね合わせたものであり、これによっていずれかの方法のみで得られる極端な保持時間を中和(相殺)することができる。特定の溶質に関する長短の保持時間を両方とも排除することによって、本方法は複雑な勾配による溶離が必要な異成分からなる混合物を定組成的に分離することができる。このクロマトグラフィー法の新しい組み合わせは、静電的反発作用−親水性相互作用クロマトグラフィーと呼ばれる。
一般的な定組成条件を使用することにより、ERLICは、通常、勾配を必要とする種々の小分子または巨大分子(macromolecule:高分子)の分離または分析を可能にする。ERLICは通常、HILIC(たとえば、10〜40容積%の水を含む移動相と、化合物が空隙容積よりも大きい容積で溶離するように移動相よりも極性の高い固定相材料を使用する)条件下で固定相によって保持されるのに十分な極性をもつ任意の化合物に適用することができる。ERLICは一つ一つの化合物の分析にも、混合物からの化合物の分離にも一様に適している。分析モードでは、化合物は標準に対するその溶離位置を基準として同定することができるか、又は、化合物の混合物の純度または組成は、混合物の全体の溶離プロフィールによって評価することができる。分取モードでは、ERLICは個々の化合物を物理的に分離することによって化合物から特定の化合物を単離または精製するために適用することができる。個々の化合物は、カラムから溶離する時に、その溶離プロフィールの区別可能なピークに対応する。ERLICは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの分離または分析に適用することができる。
HILICと同様に、ERLICでは固定相は親水性材料から構成される。さらにERLICでは、固定相材料は移動相のpHにおいて正又は負のいずれかに帯電されなければならい。具体的な材料については実施例で記載する。
HILICと同様に、ERLICにおける移動相は固定相よりも極性が低い(より疎水性である)。固定相材料が結合水の停滞層を形成できるように、移動相は少なくとも2容積%の水を含まなければならない。これが極性の低い溶質よりも極性の高い溶質を長時間保持する際に役に立つ。通常、移動相はアセトニトリル、メタノール、プロパノールまたは水と混和性の同様の極性をもつ別の溶媒などの有機溶媒を約40〜90容積%含む。有機溶媒の濃度は、当該化合物の保持時間を変動させるために望み通りに調節することができる。移動相のpHは固定相と溶質の正味荷電を設定する際の重要な因子であり、これは当該化合物の保持時間にも影響する。
ERLIC法は、HILICで直面する数個の極端な保持時間に対処するのに特に適している。上記のように、ERLICのHILIC成分は早く溶離する分子種を後方の溶離時間へシフトさせて、うまく分離させることができる。移動相をうまく調節すると、ERLICの静電的反発成分は遅れて溶離する分子種をより早く溶離させて、実行時間を短縮しつつ、分離には殆どまたは全く悪影響を与えない。以下のケースが例示となる。
非常に酸性の強いペプチドは、固定相に対する静電的誘引力のため、HILICを使用するアニオン交換クロマトグラフィーの最中に過度に保持されてしまう可能性がある。この問題を解決する一つの方法は、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基とを帯電させないような十分に低いpHの移動相を使用して、殆どのペプチドを中性または塩基性にすることである。本発明の定組成方法を使用して、親水性相互作用がクロマトグラフィーを制御し、且つ静電的誘引力が不足しているにもかかわらず酸性ペプチドの保持時間を確保するレベルまで移動相の有機溶媒含量を増やすことができる。
非常に塩基性のペプチドはHILICモード中で極性カラムから遅れて遊離する。固相による静電的反発作用、即ちERLIC法を使用すると、そのようなペプチドは中性または穏和な酸性ペプチドと同じ時間枠内で溶離させることができる。この作用は、固定化塩勾配(immobilized salt gradient)の場合と同様であろう。
正に帯電した固定相を使用してAEXモードでペプチドを分離する場合、塩基性ペプチドは静電的反発作用によって空隙容積中またはそれ以前に溶離する(図1参照)。これにより分画範囲が狭くなってしまい、利用が制限されてしまう。しかしながら、十分量の有機溶媒が移動相内に含まれていれば、親水性相互作用は静電的反発作用に打ち勝つのに十分に強くなるため、より長く、より適切な保持時間と改善された分離が得られる。
全てのカラムは、以下に記載したものを除いて、PolyLC Inc.(Columbia,MD)の製品であった。PolyWAX LP(商標)、弱アニオン交換材料をペプチド及びアミノ酸に関して使用した。ペプチドに関してはカラムは次のいずれかであった:1)100×4.6mm,5μm粒径、300Å孔径(アイテム#104WX0503)、または2)200×4.6mm,5ミクロン、300Å(アイテム#204WX0503)。アミノ酸に関しては、カラムは200×4.6mm、5μm、100Å(アイテム#204WX0501)であった。ヌクレオチドのERLICに関しては、強カチオン交換材料PolySULFOETHYL Aspartamide(商標)(PolySULFOETHYL A:商標)の200×4.6mmカラムを使用した;5μm、300Å(アイテム#204ES0503)。ペプチド(図2及び4)、ヌクレオチド及び核酸に関するHILICデータは、PolyHYDROXYETHYL Aspartamide(商標)(PolyHYDROXYETHYL A:商標)[1]の200×4.6mmカラム、5μm、300Å(アイテム#204HY0503)で得た。アミノ酸のHILICデータは、5μm、100Å、PolyHYDROXYETHYL A(商標)(アイテム#204HY0501)の200×4.6mmカラムで得た。
試薬:以下のもの:9(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO);15、16(Peninsula Laboratories,Belmont,CA);及び13、18〜20(California Peptide Research,Napa,CA)を除いて、ペプチド標準1〜20は、Bachem(Torrance,CA)から購入した。アミノ酸、ヌクレオチド及び核酸標準はSigma社から入手した。リン酸及びアセトニトリル(ACN)[いずれもHPLCグレード]はFischer Scientific社(Pittsburgh,PA)から入手した。トリエチルアミン(99.5%)はAldrich Chemical社(Milwaukee,WI)から入手した。メチルホスホン酸はAlfa Aesar/Lancaster Synthesis社(Ward Hill,MA)から入手した。HPLCグレードの水を使用した。
A.標準の選択
1)トリプシンペプチド:His-残基または切断ミス(missed cleavage)を含むものを除き、トリプシンペプチドは二つの塩基性基だけ、N-末端とC-末端Arg-またはLys-残基を含む。このため、過度に塩基性のペプチドは全く存在しないので、分析が簡略化される。従って多くのトリプシンペプチドを標準に含めて、予想される溶離時間範囲についての知見を得た。標準1〜5は0または1個の酸性残基をもつ通常の配列であった。標準6は、非常に酸性のトリプシン配列である。標準18〜20は、一つの位置でAsp-、isoAsp-またはphosphoSer-残基で置換されたトリプシン配列である。このサンプルセットにより、保持時間におけるこれらの残基の効果が評価できる。
2)酸性ペプチド:標準7〜9はN-末端以外には、塩基性基を全く持たない酸性ペプチドである。phosphoTyr-残基を取り囲む配列にはよくあることであるが、標準10は非常に酸性のホスホペプチドである。標準11〜13、DSIPペプチドは、C-末端Lys-の代わりにGlu-残基が置換されていることを除き、標準18〜20と同じ配列をもつ。置換されている残基だけがペプチド中の酸性残基ではないので、標準18〜20よりも制御されていなくても、これにより、Asp-をisoAsp-またはphosphoSer-残基と置き換える効果を評価することができる。
3)塩基性配列:標準15〜17は非常に塩基性のペプチドである。標準14、ACTHは、塩基性残基とほぼ同数の酸性残基をもつ。これにより、ペプチドの全保持時間におけるそのような残基の相対的重要度を評価し易くなる。
表1は、TEAP対ナトリウムメチルホスホネート(Na-MePO4)緩衝液の場合の保持時間の予備的な比較を示す。TEAP緩衝液を使用すると、酸性ホスホペプチド(標準10及び13)の保持時間は他のペプチドの保持時間よりも著しく長くはなかったが、塩基性標準13〜17の保持時間は他の殆どのペプチドよりも長かった。この選択性、通常のHILICの特徴は所望のものと正反対であった。対照的にNa-MePO4緩衝液の選択性はERLICの所望の特徴を示し、塩基性ペプチドを迅速に溶離させ、ホスホペプチドを遅れて溶離させた。従って、Na-MePO4緩衝液をペプチドのERLICの詳細な検討のために選択した。
図2は、HILICでのペプチド標準1〜20の定組成保持時間における%ACNの効果を示す。塩基性ペプチド(標準14〜17)は群を抜いてよく保持される。ホスホペプチドを含む他のものは概して同じ時間枠で溶離する。図3は、ERLIC条件下での同じ標準を示す。静電的反発力のせいで、塩基性ペプチドは、ACNレベル70%以下で他のペプチドと同じ時間枠で溶離する。HILICとERLICにおけるこの相違は図4において明らかである。図4では、両方のモードにおいて実施したペプチド標準セットのクロマトグラフを比較する。HILICモードでは、100分未満で塩基性標準15と17を定組成的に溶離させるACNレベルでは、酸性標準と中性標準の保持時間が適当でなくなる。ERLICモードでは、15と17の静電的反発作用により、50分以内でこの例の全てのサンプルを適当な保持時間を与え、定組成的に溶離できるレベルにACN濃度を高めることができる。
図5はERLICでの保持時間に対するpHの効果を示す。カルボキシル基はpH2.0で実質的にイオン化されていないので、最も良く保持されるペプチドはホスホペプチド13であり、適当な範囲はトリプシンホスホペプチド20である。カルボキシル基は高pH値でイオン化するので、保持時間はあらゆる酸性基の総数を反映するようになり、ホスホペプチドの選択性は失われる。これらの条件は、通常のアニオン交換クロマトグラフィーの条件に収束する。中性のトリプシンペプチドは、親水性相互作用によって殆ど完全に保持される。その保持時間は、移動相が適当な濃度の塩を含む限り、pHによって殆ど影響されない。酸性ペプチドの保持時間はpH5.0で最大に到達し、高pH値では低下する。これは、弱アニオン交換(WAX)材料の電荷密度の低下を反映する。そのような材料の懸濁液の滴定曲線から、pH9.5〜pH5.0で電荷密度が連続して上昇することが明らかになった[48]。
図6は、選択性を決定する際のこの変数の重要性を示す。塩濃度を増加させると、全ての静電効果、誘引力と反発力のいずれからも溶質を保護し、選択性はHILICと同じになる。かくして酸性ペプチドに対しては保持は減少し、塩基性ペプチドに対しては保持時間は増加し、塩基性ペプチドが再び高い塩レベルで最もよく保持されるようになる。塩の増加につれて中性トリプシンペプチドの保持時間は緩やかに増加する。おそらくこれは、そのC-末端の塩基性残基とN-末端の反発力の減少を反映している。
先のデータは、一つのリン酸基をもつペプチドは、70%ACNを含む20mM Na-MePO4、pH2.0でトリプシン消化物を溶離したときに一番最後であるか、または一番遅れて溶離するペプチド群の中に存在することを示唆した。二つ以上のリン酸基をもつトリプシンペプチドは、勾配溶離が必要であることが証明された。塩を増加させ、ACN濃度を緩やかに減少させる勾配法を選択した。勾配法に選択した塩はTEAPであり、これはホスホペプチドの溶離の際にNa-MePO4よりも効果的である(表1)。
A.選択性に対する塩の固有性及び濃度の効果
図10の結果は図6のペプチドに比肩している。TEA-MEPO4に関しては、Na-MEPO4と同様に、酸性アミノ酸は顕著に保持され、塩基性アミノ酸は比較的早く溶離する。塩濃度を高めると、静電的反発作用と誘引力のいずれも抑制され、酸性アミノ酸は早く溶離し、塩基性アミノ酸は遅れて溶離する。塩濃度を高めるにつれて、中性アミノ酸の保持時間がやや減少する。これは、ERLICとHILICはいずれも順相クロマトグラフィーの改良型であり、移動相の極性を高めると溶離が促進されるということを意味する。また中性トリプシンペプチドと違って、中性アミノ酸は、高い塩レベルによって遮蔽される顕著な静電的反発作用を持たない。TEAP(図11)の結果は、表1のペプチドに比肩している。塩基性アミノ酸の保持時間は大きく、酸性アミノ酸は比較的保持時間が小さい。しかしながら、20mM未満の塩濃度は明らかに、対イオン層、または下の移動相を効果的に遮蔽する電気的二重層を維持するには低すぎる。結果としては、溶質は移動相のより多くの正の電荷に暴露されて、塩基性アミノ酸は静電的に反発を受けて早く溶離し、一方、酸性アミノ酸は引きつけられて、遅れて溶離するということである。これにより、同じ時間枠で酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸のいずれをも定組成的に溶離することができる(図12)。塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸との保持時間は、10〜20mMの範囲内の電解質濃度に対して非常に感受性であり;高い塩レベルは静電的反発作用から塩基性アミノ酸を保護してこれらを後で溶離させ、一方、この保護は酸性アミノ酸の静電的誘引力を低下させ、酸性アミノ酸を早く溶離させる。中性アミノ酸の保持時間はこの範囲では殆ど影響を受けない。これらの条件下では、Phe-、Trp-及びTyr-はLeu-、Ile-及びVal-から完全には分離されないので、混合物からは省略した。Gln-はpH2.0でピログルタミン酸に転換され、転換の半減期は約24時間である。
A.HILIC対ERLIC
ヌクレオチド及び核酸は負に帯電したリン酸基をもつ。従ってこれらの化合物のERLICはカチオン交換カラムで実施した。図15は、中性材料、PolyHYDROXYETHYL A(商標)のカラムでのこれらの化合物のHILIC結果を比較する。親水性相互作用が無視し得る低ACN濃度では、ADPはその大きな静電的反発作用によりカチオン交換カラムからAMPよりも早く溶離する。リン酸基との親水性相互作用が顕著である高ACNレベルでは、その溶離順は逆になる。ATPは低ACNレベルではADPよりも早く溶離すると予想される。一見して異常な長い保持時間については後述する。中性カラムでは、静電的反発作用がなく、リン酸基の極性が大きいため、AMP、ADP及びATPの間の保持時間の差はずっと大きい。これは特に、ADPの場合である(ATPはこれらの条件下では適当な時間で中性カラムから溶離しなかった)。
リン酸基が第二の負の電荷を獲得しようとしているpH6では、静電的反発力が非常に大きいので、ヌクレオチドもオリゴヌクレオチドも全く保持されない(図16)。pHが低下するにつれて、特にリン酸基がその単一の負の電荷を失い始めるpH3.4未満では、保持時間は増大する。この効果は、特に殆どのホスフェートを含む溶質、ATP及びd(A)5に関しては顕著である。あまりリン酸化されていない溶質に関しては、アデニン環上の正電荷が増加する効果(+1〜+2)と他のリン酸基上の負電荷が減少する効果とは分離することが困難である(pKa@3.6〜4.0、ヌクレオチドに依存する)。
図17は、ERLICでの保持時間における塩基の効果がU〜T<A<G<Cであることを示す。ここで使用するACNレベルでは、リン酸化は全ての場合において保持を促進する。塩濃度が高くなるとUMP、AMP及びGMP(しかしCMPではない)の保持時間も増大するが、このことは、静電的反発作用がこの範囲を通じて保持時間に対して特筆すべき要因であることを示している。対照的に、ジ-及びトリホスホヌクレオチドの保持時間は、40mMで最大に到達し、その後は降下する。可能な解釈としては、40mMの塩は反発作用の殆どを遮蔽するのに十分であり、それよりも高濃度では固定相の正に帯電した塩基の静電的誘引力を遮蔽するということである。この効果のメカニズムについては後述する。
汎用の定組成条件を使用すると、ERLICは通常、勾配を必要とする電解質混合物の分離を実現することができる。標準化された通過条件で定組成的に所定の分離を実施するクロマトグラフィーの他の唯一のモードは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)である。SECの分離は、V0とVtとの間の範囲に入るピーク数に制限されている。そのような制限はERLICにはない。溶離ウィンドウは、移動相中の有機溶媒量を増加させることのみによって拡大することができる。極性作用は静電的作用よりも重要であるので、このことが選択性に影響する。従って、このアプローチの有用性は個別に評価されるべきである。それでもなお、特定の汎用通過条件は、広範囲の溶質に十分なようである。これによって方法の開発がかなり簡単になるはずであるが、すべての混合物がそのような処理に向くとは限らない。たとえば50種以上ものペプチドを含むタンパク質の消化物中の全成分を完全に分離するクロマトグラフィー法は一つもない。しかしながら、すべての場合に完全な分離が必要となるわけではない。たとえばマススペクトロメーターを検出器として使用する場合、互いのイオン化に干渉しない程度まで同時に溶離するペプチド数を減らすだけでよい。その場合、自動サンプルインジェクターを使用して多くの種類のサンプルを迅速に分析して、先行するサンプルのERLICウィンドウの後に各サンプルを注入する。定組成溶離法を使用すると、必要な装置を簡略化できる。ERLICは、多くのサンプルが微小スケールで多チャンネルで同時に分析され得るシリカウエハまたはチップ上で実施する分離に有用であろう。そのような用途での流速は、1分当たりナノリットルオーダーであろう。この分離を定組成的に実施できたならば、そのような分離に必要な装置を非常に簡略化する。最後に、ボトムアップまたはショットガンプロテオミクスの出現により多次元アプローチでペプチドの複雑な混合物を分画する代替的方法に対する要求が増加してきた。ERLICは、現行モードのクロマトグラフィーをうまく補完するものとなりそうである。
ERLICにおける塩の選択は、選択性に大きな影響を与え得る。もしこれらの溶質が、小さいけれどもHPLCカラムを通ってそれらが移動する間に剛直な態様で配向していると仮定すると、このことは説明することができる。これはたとえばHILICで二糖類については既に示されている[11]。図20は、ERLICにおけるアミノ酸の配向図である。対イオンとしてホスフェートを使用すると、その潜在的な第二の負電荷により、表面に対して塩基性アミノ酸を引きつける手段を提供する。メチルホスホネートイオン中の第二の接近可能な負電荷を誘発するためのポテンシャルはかなり低い。このことは、塩基性アミノ酸とペプチドは、対イオンとしてメチルホスホネートを用いるERLICよりもホスホネートを用いるERLICでよく保持されるという観察結果を説明する。対照的に、TEAPの濃度が表面を完全に覆うのには低すぎる場合を除き、酸性アミノ酸は、固定相の表面のリン酸イオンの負に帯電した層から反発を受けて、TEAP緩衝液と一緒にすぐに溶離する。図12は、これが20mM未満のTEAPの場合であてはまることを示す。
Claims (20)
- タンパク質、ペプチド、アミノ酸及びその帯電誘導体からなる群から選択される化合物で静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法であって、
約4未満のpHでアニオン交換材料のカラムを準備すること;及び
固定相の静電的反発作用と親水性相互作用とを実質的に平衡させるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して前記化合物を溶離させること、
を含む前記方法。 - 前記化合物を定組成的に溶離させる、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物を塩濃度勾配、pH勾配、極性勾配又はそれらの勾配の組み合わせを用いて溶離させる、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸からなる群から選択される帯電誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記帯電誘導体がリン酸基または硫酸塩基を含む、請求項4に記載の方法。
- 水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール及びHILIC用に適した他の溶媒からなる群から選択される溶媒の移動相での濃度を調節することによって、前記移動相の極性を増加又は減少させる、請求項1に記載の方法。
- 前記移動相のpHを変えることによって前記固定相の正味荷電を増減する、請求項1に記載の方法。
- 前記塩がトリエチルアミンホスフェート、トリエチルアミンメチルホスホネート、ナトリウムメチルホスホネート、及びHILIC移動相と適合可能な他の塩からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 核酸、ヌクレオチド及びその帯電誘導体からなる群から選択される化合物で静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法であって、
約3.4未満のpHでカチオン交換材料のカラムを準備すること;及び
固定相の静電的反発作用と親水性相互作用とを実質的に平衡させるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離させること、
を含む前記方法。 - 前記化合物を定組成的に溶離させる、請求項9に記載の方法。
- 塩濃度勾配、pH勾配、極性勾配、減少有機溶媒量勾配又はそれらの勾配の組み合わせを用いて前記化合物を溶離させる、請求項9に記載の方法。
- 前記化合物が、核酸及びヌクレオチドからなる群から選択される分子の帯電誘導体である、請求項9に記載の方法。
- 水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール及びHILIC用に適した他の溶媒からなる群から選択される溶媒の移動相の濃度を調節することによって、前記移動相の極性を増加又は減少させる、請求項9に記載の方法。
- 前記移動相のpHを変えることによって前記固定相の正味荷電を増加又は減少させる、請求項9に記載の方法。
- 前記塩がトリエチルアミンホスフェート、トリエチルアミンメチルホスホネート、ナトリウムメチルホスホネート、及びHILIC移動相と適合可能な他の塩からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- ホスホペプチド化合物で静電的反発作用-親水性相互作用クロマトグラフィーを実施する方法であって、
約4未満のpHでアニオン交換材料のカラムを準備すること;及び
固定相の静電的反発作用と親水性相互作用とを実質的に平衡させるのに十分な有機溶媒の量を含む移動相を使用して、前記化合物を溶離させること、
を含む前記方法。 - 前記化合物を定組成的に溶離させる、請求項16に記載の方法。
- 塩濃度勾配、pH勾配、極性勾配、またはそれらの勾配の組み合わせを用いて前記化合物を溶離させる、請求項16に記載の方法。
- 水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール及びHILIC用に適した他の溶媒からなる群から選択される溶媒の移動相での濃度を調節することによって、前記移動相の極性を増加又は減少させる、請求項16に記載の方法。
- 前記塩がトリエチルアミンホスフェート、トリエチルアミンメチルホスホネート、ナトリウムメチルホスホネート、及びHILIC移動相と適合可能な他の塩からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
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