CN105555385A - 通过表面活性剂介导的制备型hplc纯化有机化合物 - Google Patents

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Abstract

尽管在产生反相衍生化二氧化硅固定载体方面有新进展，然而仅有两种方式增大可以通过制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)在单次运行中纯化的样品的量：(1)传统方法是使用较大的柱(较大量的固定相)；以及(2)使用置换色谱法，其(同时劳动密集型开发的)更有效地使用固定相。本发明描述独特的Prep-RP-HPLC技术，其使用涂覆有表面活性剂例如曲通X-100的C-18/C-8衍生化的二氧化硅导致与常规Prep-RP-HPLC技术相比在(包含合成的粗制肽的有机化合物的粗制混合物的)样品负载方面7至10倍的增大。样品负载容量和输出的这种增大是由于C-18/C-8吸附的(结合的)表面活性剂的附加的替代固定相特性。表面活性剂通过与固定相的残余硅醇的范德华力(疏水性相互作用)和离子相互作用被结合至固定相的C-18/C-8链。

Description

通过表面活性剂介导的制备型HPLC纯化有机化合物
发明领域
本发明涉及有机化合物的纯化。更具体地，本发明涉及一种使用制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)纯化包含肽的有机化合物的新颖的方法，所述方法与用于使用表面活性剂作为替代固定相(surrogatestationaryphase)(SSP)/附加固定相(APS)纯化包含肽的有机化合物的传统的Prep-RP-HPLC相比具有其样品负载容量(loadingcapacity)和输出的7倍至10倍。增大的样品负载容量是由于在C-18/C8链上的用作添加的固定相(ASP)的吸附的表面活性剂。
发明背景
反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在学术机构、法医实验室、精细化学、和制药工业等等中被广泛地用于小的有机分子、天然产物和生物活性分子(例如多肽、蛋白质和核苷酸)的分析、表征、分离、纯化和/或离析(isolation)。在制药工业中，分析型RP-HPLC被用于释放和表征原材料、中间体、和活性药物成分(API)。相比之下，制备型色谱法被用于纯化用于另外用途的充分量的物质。同时分析型RP-HPLC的主要目标是分析物的鉴定和定量，而在制药工业和精细化学工业中，Prep-RP-HPLC的主要目的是包含肽API、和没有义务结晶的大部分其他复合API的API、以及精细化学品的商业生产。
在洗脱模式中的Prep-RP-HPLC最广泛地被实践并且是用于纯化粗制肽混合物以及其他小的复合有机分子的优选模式。在洗脱制备型色谱法中，将待纯化的化合物的粗制混合物溶解在合适的溶剂{例如，在水中的0.1％三氟乙酸(TFA)，缓冲液A}中并且结合至C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相载体(support)。当运行流动相(在50％至100％乙腈中的0.1％TFA，缓冲液B)梯度(通常A至B的线性梯度)时，在流动相和固定相之间建立平衡。取决于它们对于固定相的亲合力，各种样品物质以反映它们对于固定相的相对亲合力的速度沿着柱穿过。弱结合物质首先洗脱，随后是较强的粘合剂。总之，有机缓冲液组分的浓度的逐渐增大导致混合物的组分的解吸(desorption)和拆分(resolution)。
洗脱Prep-RP-HPLC模式在可以在单次运行中被纯化的样品的量方面被若干因素限制，包括期望产物及其最近的洗脱相关的物质之间的拆分、容量因子、以及制备型柱的理论塔板数(numberoftheoreticalplate)等等。DonaldA.Wellings在他的书“APracticalHandbookofPreparativeHPLC,Elsevier(2006)”中已经完美地描述许多这些方面。合成的肽的典型的负载容量在1mg每ml填充柱体积至2mg每ml填充柱体积的范围内(即，关于总的柱体积的0.1％至0.2％)。
较早的Prep-RP-HPLC固定载体是用C-18或C-8链衍生化的不规则的二氧化硅颗粒，并且它们经受高背压。高背压限制它们关于可以在单次运行中被纯化的量以及关于相对较小的直径的柱的用途。Prep-RP-HPLC的最近的进步已经集中于生产球形的二氧化硅以及开发新的键合化学以提供具有改进的稳定性和选择性的固定载体。已经被C-18、C-8和其他的配体衍生化的球形的二氧化硅的商业制造已经克服这些挑战并且已经极大地扩展制备型HPLC的实用性。在工艺HPLC仪器和键合二氧化硅载体中的技术进步已经使得以数百千克的量的复合肽例如(36种氨基酸的肽)的商业生产成为可能。遗憾地，这些大规模HPLC仪器和相关的柱硬件是非常昂贵的并且限制方法的可承受性。另外，这些改进中没有一个既处理了给定的柱的负载容量，也没有使它们产生纯化的产物的量的明显提高(填充柱的输出/mL)。
尽管这些上述提及的进步，但是当较早地被洗脱时，仅有两种方式增大可以在单次运行中被Prep-RP-HPLC纯化的样品的量：(1)传统的方法是使用较大的柱(较大量的固定相)；以及(2)使用置换色谱法，其(同时对于开发是费力的)更有效地使用固定相。
置换色谱法利用具有比样品组分更高的对于固定相材料的亲合力的流动相置换剂溶液。区分置换色谱法与洗脱色谱法的关键操作特征是置换剂分子的使用。在洗脱色谱法中，洗脱剂通常具有比待分离的混合物中的组分的任何低的对于固定相的亲合力，而在置换色谱法中，作为置换剂的洗脱剂具有较高的亲合力。置换最好地适合于离子交换模式，并且已经发现大量近期的应用。专利US6239262公开了用于在疏水性相互作用和反相色谱模式中的蛋白质纯化的低分子量置换剂。
本发明通过利用SSP实现较高的输出。SSP和置换色谱法协同地起作用以增大制备型色谱法的输出。
发明人的PCT申请WO2014/118797A1描述了独特的Prep-RP-HPLC技术，其相比于常规的Prep-RP-HPLC技术实现(包含合成的粗制肽的化合物的粗制有机混合物的)样品负载的7倍至10倍的增大。相比于常规的Prep-RP-HPLC技术的输出的增大是由于C-18/C-8吸附的(结合的)季铵盐的附加的替代固定相特征。季铵盐通过与固定相的残余硅醇的范德华力(疏水性相互作用)和离子相互作用结合至固定相的C-18/C-8链。
本发明描述了用中性表面活性剂例如曲通X-100作为ASP涂覆的C-18/C-8衍生化的二氧化硅的用途(请参见图3)。本发明描述了使用Prep-RP-HPLC和中性表面活性剂作为SSP/ASP的用于肽的可扩展的(scalable)分离工艺。本发明是用于肽的简单的、成本效益好的且可扩展的分离工艺。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种使用制备型反相高效液相色谱(Prep-RP-HPLC)技术纯化包含肽的有机化合物的新颖的方法。
本发明的另一个目的是提供纯化包含肽的有机化合物的方法，所述方法与传统的Prep-RP-HPLC技术相比具有其样品负载容量和输出的7倍至10倍。
本发明的另外的目的是提供使用表面活性剂作为替代固定相(SSP)/附加固定相(ASP)的这样的方法。
发明概述
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种包含肽的有机化合物的纯化的方法，所述方法使用替代固定相/附加固定相连同C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相在制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量。C-18/C-8反相柱的制备负载容量通过用替代固定相/附加固定相涂覆/结合C-18/C-8反相柱来增大，其中替代固定相/附加固定相是中性表面活性剂或聚乙二醇化的表面活性剂。
替代固定相/附加固定相表面活性剂可以选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯，其中聚氧化乙烯选自曲通X-100(TritonX-100)、吐温-80(Tween-80)以及布里杰-35(Brij-35)，优选地曲通X-100。
烷基糖苷选自具有下式的化合物
R-O-(CH2)X-CH3，
其中，
当R＝葡萄糖时当R＝麦芽糖时
X＝8，正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝11，十二烷基-β-D-麦芽糖苷
X＝7，正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，十二烷基-β-D-麦芽糖苷
X＝6，正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，癸基-β-D-麦芽糖苷
X＝5，正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
胆汁酸选自具有下式的化合物：
胆汁酸
其中，
X＝H，R＝ONa，脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨脱氧胆酸钠
X＝OH，R＝ONa，胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨胆酸钠。
葡萄糖酰胺选自具有下式的化合物：
葡萄糖酰胺
其中，
X＝8，MEGA-10
X＝7，MEGA-9，
X＝6，MEGA-8
或，下式的化合物：
其中，
X＝H，脱氧BigCHAP
X＝OH，BigCHAP。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)纯化包含肽的有机化合物的多组分样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱系统；
(b)用选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯的替代固定相/附加固定相表面活性剂使色谱固定相饱和；
(c)采用有机溶剂和水的混合物洗涤柱以除去过量的未结合的表面活性剂；
(d)用起始流动相使柱平衡；
(e)将多组分样品应用至包含涂覆有表面活性剂的固定相的色谱床的一个端部；以及
(f)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱多组分样品，其中缓冲液A是在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠，并且缓冲液B是在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠；
(g)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱多组分样品，其中缓冲液A是0.1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸；或
(h)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱多组分样品，其中缓冲液A是1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是1％的在50％含水乙腈中的磷酸；或
(i)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱多组分样品，其中缓冲液A是在水中的25mM至150mM磷酸三乙铵(pH3)，并且缓冲液B是在50％含水乙腈中的25mM至150mM磷酸三乙铵(pH3)；和
(j)回收样品中的所需组分。
在步骤(a)中的疏水性固定相是C-8或C-18烷基链衍生化的二氧化硅并且在步骤(b)中的表面活性剂选自曲通X-100、吐温-80、以及布里杰-35。
在步骤(c)中洗涤柱以除去未结合的表面活性剂包括用含水乙腈、更优选地包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤柱，并且平衡包括用起始流动相、更优选地0.1％至1％磷酸水溶液、0.1％的在水中的TFA、以及在水中的25mM至150mM磷酸三乙铵洗涤使柱平衡。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种纯化包含肽的有机化合物的方法，所述方法使用基于PEG的洗涤剂/表面活性剂在制备反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量，所述基于PEG的洗涤剂/表面活性剂具有作为结合C-18/C-8衍生化的二氧化硅的ASP/SSP的以下结构或作为固定相的其他载体：
其中烷基/芳基等独立地选自包括以下的组：直链的或支链的烷基、环烃、芳族基团、烷基取代的芳族基团、芳基取代的烷基；并且“n”是从1至20、优选地6至12、更优选地9至10的氧化乙烯残基的数目。
当结合至C-18衍生化的二氧化硅的替代固定相是流动的时(如在看到从固定相同时结合和浸出的情况下用基于较低的碳的表面活性剂观察到的)，并且另外，当替代固定相紧紧地永久结合至C-18/C-8反相固定相(其中C-18/C-8反相固定相选自曲通X-100、布里杰-35以及吐温-80)时，发生本发明的样品负载容量的增大。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于通过用能够与残余的硅醇H键合并且具有充分浓度的有机改性剂的缓冲液洗涤柱将替代固定相/附加固定相的涂层从C-18/C-8衍生化的二氧化硅载体除去的方法，其中有机改性剂是在50％至90％含水乙腈中的0.25M至0.5M乙酸铵。
本发明具有多种工业优点，例如有限的溶剂的使用、降低的废物处理、易于操作以及较低的设备规模。
附图简述
图1：结合至C-18和基于PEG的替代固定相的亮丙瑞林。
图2：加载至12g涂覆有曲通X-100的C-18Reveleris柱上的800mg净亮丙瑞林的Prep-RP-HPLC分布。(级分8至级分24包含使用针对亮丙瑞林的修改的EP法通过分析型RP-HPLC为>97.9％纯的亮丙瑞林)
发明详述
表1描述了多种色谱技术的负载容量(条目1至条目4)。条目5和条目6属于当C-18/C-8载体涂覆有替代固定相时的负载容量。
反相柱的典型的负载容量是相对于填充柱的体积的约0.90％(表1，条目#1)。由于用于溶解粗制肽混合物的组分的可用的固定相(PLRP-S，聚苯乙烯柱)的较好的利用，样品负载容量在置换色谱法中是较大的，并且在此情况下，是相对于总柱体积的约2％(表1，条目2)。WO2013/052539描述了使用置换色谱(DC)纯化肽例如血管紧张肽等等。血管紧张肽的DC使用WatersXbridgeBEH130{C-18，5微米，135埃0.46cm(ID)X25cm(L)}。相对于总柱体积的％负载是3.69％并且相对于传统HPLC的相对负载容量是约4。
在使用箱式车注射技术的对映体分离期间的负载容量是约6.11％。这非常接近在正常相PrepHPLC中观察到的样品负载，在该正常相PrepHPLC中整体暴露的二氧化硅表面对于色谱法是可用的。
表1、条目5和条目6揭示出在本发明中描述的ASP/SSP技术具有在7.1％至9.9％的范围内的负载容量。C-8衍生化的二氧化硅具有比C-18衍生化的二氧化硅高的样品负载容量，这归因于空间救济(stericrelief)(C-8链相对C-18链)以及因此的较高量的吸附的SSP。用SSP辅助的Prep-RP-HPLC观察到的较高的样品负载归因于增大的表面积，该增大的表面积作为SSP/ASP自组装到三维点阵中的结果是可用的。
已知C-18/C-8二氧化硅的孔大小影响目标化合物的纯化的负载容量和效力(成功)。例如，大分子例如蛋白质的分离的质量更适于宽孔隙载体，例如或宽孔隙的结果是降低的量的产物，该产物可以在单道次中被纯化，因为较少的固定相可用于结合。
较小孔径的固定相例如至(埃))载体对于较小的分子和小的肽(5个至15个氨基酸)是优选的，而宽孔二氧化硅对于较大的肽(>25个氨基酸)和蛋白质是优选的载体。
分析物和固定相之间的非特异性相互作用还影响样品负载、纯化效率(拆分)、以及输出。由于与残余的硅醇的离子交换/离子成对相互作用(这是不完整的封端(endcapping)的结果)，因此分析物和C-18/C-8固定相之间的真实的反相相互作用被降低。另外，C-18/C-8链之间的空间约束影响碳负载的程度。柱的柱体积(CVo)的空隙体积通过测量未保留的溶质的洗脱体积容易地被测量。其通常是总柱体积的约40％至50％。该空隙体积的一部分用于用ASP/SSP涂覆。表1、条目5和条目6说明相比于SSP涂覆的C-18衍生化的二氧化硅，看到具有SSP涂覆的C-8衍生化的二氧化硅的较大负载。
使用粗制亮丙瑞林的各种负载的对照试验：包含12g的用C-18烷基链衍生化的二氧化硅的Reveleris闪柱被选择，并且用约10种柱体积(CV)的0.1％三氟乙酸水溶液以6mL/分钟的流速平衡。接下来，用如在表2中所示出的各种有限量的粗制亮丙瑞林加载柱(通过HPLC86.4％纯度；通过Edelhoch法进行肽测定)。研究四种参数以评价色谱性能。
1.流过(flowthrough)：测量在加载期间流过的亮丙瑞林的量。这帮助确定在加载期间柱的容量是否超过。
2.包含至少95.0％亮丙瑞林的级分池：制备若干个级分池并且使用Edelhoch法或通过定量HPLC测定法为亮丙瑞林的量定量。
3.最纯的亮丙瑞林级分(拆分的测量)：确定包含最高纯度的亮丙瑞林的级分。这在评价亮丙瑞林从其最接近的洗脱杂质的拆分方面是有帮助的。
4.来自色谱运行的整体洗脱液的质量平衡：这使用Edelhoch法来测量。这在确定亮丙瑞林和相似的类似物的损失方面是有帮助的，由于对存在于反相柱上的残余的硅醇基的非特异性离子结合。
表2的检查揭示出：
1.>95％亮丙瑞林的输出(％纯化收率)的范围为从11.9％至19.1％。简单陈述的80.9％至88.1％的粗制亮丙瑞林不能被纯化，因为分析物和固定相之间的非反相类型的相互作用！
2.单独的色谱运行的质量平衡是在88.4％至96.5％的范围内。这表明“分析物和固定相之间的非反相类型的相互作用”的高的贡献将是关于>95％纯的亮丙瑞林的输出的差的纯化特性的原因。
3.单独级分的纯度的范围为从97.8％(当100mg的粗制亮丙瑞林被加载时)至95.2％(当800mg的粗制亮丙瑞林被加载时)。当1200mg的粗制亮丙瑞林被加载时，纯度是95.5％。这可能是由于“自置换”贡献。
4.如果残余的硅醇基朝向分析物与固定相的离子结合有效地丧失能力，则在“效率”和“效力”方面的较高的纯化特性是可能的。
基于中性PEG的表面活性剂的评价：表3总结了作为ASP的曲通X-100、吐温-80、以及布里杰-35的特性。Reveleris二氧化硅衍生化的C-18柱(12g的固定相、40微米直径的颗粒以及60埃的孔径)被选择并且用12g溶解于水中的曲通X-100或吐温-80或布里杰-35饱和。
用作ASP/SSP的表面活性剂的清单
烷基糖苷
胆汁酸
X＝H，R＝ONa，脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨脱氧胆酸钠
X＝OH，R＝ONa，胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨胆酸钠。
葡萄糖酰胺
其中
X＝8，MEGA-10
X＝7，MEGA-9，
X＝6，MEGA-8。
其中，
X＝H，脱氧BigCHAP
X＝OH，BigCHAP。
聚氧化乙烯
过量的未结合的洗涤剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。当该步骤被省略时，观察到粗制API的过早洗脱，因为过量的洗涤剂以高于其临界胶束浓度的浓度存在。
接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CVo体积的缓冲液A(在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示了不存在亮丙瑞林。
缓冲液B(在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
相比于在传统的Prep-RP-HPLC中观察到的高斯峰，“M形峰”在SSP辅助的Prep-RP-HPLC中被看到。通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的特性/生产量的测量。包括池的单独的级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。单独级分的平均最高纯度(五次纯化运行)是98.84％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的平均重量是409mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是62.6％。
沉积的ASP/SSP通过用50％至80％在水中的乙腈中的0.25mM乙酸铵洗涤柱从反相柱中除去。
用吐温-80(平均2次运行)进行的类似实验提供以下数据：(1)具有最高平均单独纯度的级分是96.25％；(2)>95％纯化的池的平均重量是343.6mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是42.59％。
用布里杰-35(平均2次运行)进行的类似实验提供以下数据：(1)具有最高平均单独纯度的级分是98.15％；(2)>95％纯化的池的平均重量是394.4mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是60.35％。
以上结果表明曲通X-100是针对亮丙瑞林的纯化所评价的三种SSP中最佳的。
下一系列的实验检查C-18衍生化的二氧化硅颗粒的不同的孔径和直径对Prep-HPLC收率的影响，并且被总结在表4中。使用两个Reveleris(柱参数：12g的C-18，40μ，60埃以及柱参数：12g的C-18，20μ，150埃)和一个PeerlessBasicC-18(室内填充，柱参数：约12g的C-18，10μ，100埃)C-18衍生化的二氧化硅柱。用12g的溶解于水中的曲通X-100使柱饱和。过量的未结合的洗涤剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。
用5种CVo体积的缓冲液A(0.1％磷酸水溶液)使柱平衡。接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CVo体积的缓冲液A洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B(0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸水溶液)的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。
单独级分的平均最高纯度(用40μ载体进行两次纯化运行)是99.3％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的平均重量是467mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是71.5％。
单独的级分的平均最高纯度(用RevelerisC-1820μ载体进行一次纯化运行)是99.3％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的重量是528mg(理论量是653.3mg)并且％亮丙瑞林回收率是80.8％。
结果类似于先前使用的PeerlesBasicC-1810μ载体柱的RevelerisC-1820μ载体。
表5揭示了使用磷酸三乙铵的增大的浓度引起纯化收率的降低。
Reveleris(柱参数：12g的C-18，40μ，60埃)用12g的溶解于水中的曲通X-100来饱和。过量的未结合的洗涤剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。
用5种CVo体积的缓冲液A(25mM磷酸三乙铵水溶液，pH3)使柱平衡。接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CVo体积的缓冲液A洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B{在50％含水乙腈中的25mM磷酸三乙铵(pH3)}的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独的级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。
单独级分的最高纯度是98.6％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的重量是314.5mg(理论量是653.3mg)并且％亮丙瑞林回收率是48.1％。
随后的实验用较高浓度的磷酸三乙铵(即在pH3下的150mM磷酸三乙铵水溶液)进行。用5种CVo体积的缓冲液A(150mM磷酸三乙铵水溶液，pH3)使柱平衡。接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CVo体积的缓冲液A洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B{在50％含水乙腈中的150mM磷酸三乙铵(pH3)}的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。
单独级分的最高纯度是98.3％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的重量是280mg(理论量是653.3mg)并且％亮丙瑞林回收率是42.9％。
相比于磷酸缓冲液(71％至80％)，用磷酸三乙铵缓冲液(43％至48％)观察到的较低收率揭示出结合至硅醇的SSP被部分损耗。
如上所述，常规的RP-HPLC硬件系统可以用于分离，并且术语“配置色谱系统”指的是设置如本领域中熟知的柱、或柱、泵和检测器的系统。
术语“使色谱固定相饱和”指的是使溶液中的表面活性剂以特定的浓度传送经过固定相，从而制备替代固定相。
本发明的优选方法在下面被提及：
使用表面活性剂作为替代固定相的用于纯化包含肽的有机分子的说明性方法：
在此强调的是，下文仅为出于说明性目的所描述的实施例并且不意图限制SSP辅助的Prep-RP-HPLC技术的范围和实用性。在这些研究中使用的C-18柱包含12g的C-18衍生化的二氧化硅(10μ、20μ、或40μ直径颗粒，或孔大小)。C-18衍生化的二氧化硅反相柱用表面活性剂(例如，曲通X-100、吐温-80、或布里杰-35或包含氢键受体位点的任何中性表面活性剂)的水溶液来平衡。表面活性剂的重量是在固定相的重量的1％至100％的范围内。为了确保附加的(替代)固定相的最大沉积，使用12g的溶解于500mL的水中的表面活性剂。然后，用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤柱以除去未结合的表面活性剂。
接下来，用起始流动相{10种柱体积(CV)，例如，0.1％磷酸水溶液}使柱平衡，并且加载粗制产物。运行缓冲液B(例如，0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸)的线性梯度。当感兴趣的产物(API)即将洗脱时，梯度保持可以被应用直到所有的API已经从柱洗脱(请参见图2)。
可选择地，如果期望以浓缩的形式洗脱产物，梯度可以被允许按常规运行。将包含>95％纯的API产物的级分组合。在减压下，除去有机挥发物。将含水残余物通过C-18柱(使用含水的乙酸和乙腈)以使反荷磷酸根离子与期望的反荷离子(例如，醋酸根离子)交换。
本发明适于用于在制药工业和精细化学工业中的色谱应用的任何大小的柱或HPLC设备。本公开内容的某些方面和实施方案在下面的实施例中被描述，这些实施例仅出于说明的目的被提供并且不被意图以任何方式限制本公开内容的范围。
实施例：
实施例-1：使用曲通X-100作为附加的固定相和磷酸水溶液缓冲液的醋酸亮丙瑞林的Prep-RP-HPLC：
C-18反相柱(RevelerisC-18，12g，40μ，孔径)用曲通X-100(12g溶解于500mL水中)饱和。过量的未结合的表面活性剂用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤以除去未结合的表面活性剂。接下来，用5种柱体积(CV)的0.1％磷酸水溶液(缓冲液A)使柱平衡。将溶解于缓冲液A中的粗制亮丙瑞林(800mg，通过Edelhoch法的净重)加载至柱上。用5种CV的缓冲液A洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。当该进行步骤被省略时，观察到粗制API的过早洗脱，因为过量的表面活性剂以高于其临界胶束浓度的浓度存在。接下来，开始梯度洗脱过程。缓冲液B是0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸。在60分钟内0％B至100％缓冲液B的线性梯度被用于洗脱。梯度保持被应用直到所有的API已经从柱中洗脱。将包含>95％纯的API产物的级分组合。Prep-HPLC概况在图2中被示出。实验一式双份地进行。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。单独级分的平均最高纯度(两次纯化运行)是99.3％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的平均重量是466.9mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是71.5％。
实施例2：使用曲通X-100作为附加的固定相和0.1mM溴化十六烷基三甲铵缓冲液的醋酸亮丙瑞林的Prep-RP-HPLC：
Reveleris二氧化硅衍生化的C-18柱(12g的固定相，40微米直径颗粒，以及60埃孔径)被选择并且用12g溶解于水中的曲通X-100饱和。
过量的未结合的表面活性剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。当该步骤被省略时，观察到粗制API的过早洗脱，因为过量的表面活性剂以高于其临界胶束浓度的浓度存在。
接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CV的缓冲液A(在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B(在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。单独级分的平均最高纯度(用曲通X-100五次纯化运行)是98.8％。如通过定量HPLC测定法测量的纯化的池的平均重量是408.9mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是62.6％。
实施例3：使用吐温80作为附加的固定相和0.1mM溴化十六烷基三甲铵缓冲液的醋酸亮丙瑞林的Prep-RP-HPLC：
Reveleris二氧化硅衍生化的C-18柱(12g的固定相，40微米直径颗粒，以及60埃孔径)被选择并且用12g的溶解于水中的吐温-80饱和。
过量的未结合的表面活性剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。当该步骤被省略时，观察到粗制API的过早洗脱，因为过量的表面活性剂以高于其临界胶束浓度的浓度存在。
接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CV的缓冲液A(在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B(在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。
实验一式两份地进行，并且其提供以下数据：(1)具有最高平均单独纯度的级分是96.3％；(2)>95％纯化的池的平均重量是343.6mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是52.6％。
实施例4：使用布里杰-35作为附加的固定相和0.1mM溴化十六烷基三甲铵缓冲液的醋酸亮丙瑞林的Prep-RP-HPLC：
Reveleris二氧化硅衍生化的C-18柱(12g的固定相，40微米直径颗粒，以及60埃孔径)被选择并且用12g的溶解于水中的布里杰-35饱和。
过量的未结合的表面活性剂通过用包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤来除去。当该步骤被省略时，观察到粗制API的过早洗脱，因为过量的表面活性剂以高于其临界胶束浓度的浓度存在。
接下来，加载粗制API(800mg的81.7％亮丙瑞林，亮丙瑞林的校正重量是653.3mg)，并且用5种CV的缓冲液A(在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)洗涤柱。“流过”洗脱液的分析型RP-HPLC分析揭示出不存在亮丙瑞林。
缓冲液B(在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠)的线性梯度开始将产物从柱中洗脱。
通过HPLC测定法定量包含>95％纯的亮丙瑞林的级分池。这用作柱的性能/生产量的测量。包括池的单独级分的％纯度通过分析型RP-HPLC来确定。
实验一式两份地进行，并且其提供以下数据：(1)具有最高平均单独纯度的级分是98.2％；(2)>95％纯化的池的平均重量是394.4mg(理论量是653.3mg)并且平均％亮丙瑞林回收率是60.4％。

Claims (19)

1.一种包含肽的有机化合物的纯化的方法，所述方法使用替代固定相/附加固定相连同C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相在制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量。
2.如权利要求1所述的方法，其中C-18/C-8反相柱的制备负载容量通过用替代固定相/附加固定相涂覆/结合所述C-18/C-8反相柱来增大。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述替代固定相/附加固定相是中性表面活性剂或聚乙二醇化的表面活性剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述替代固定相/附加固定相的表面活性剂选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述聚氧化乙烯选自曲通X-100、吐温-80以及布里杰-35。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述表面活性剂是曲通X-100。
7.如权利要求4所述的方法，其中烷基糖苷选自具有R-O-(CH2)X-CH3的式的化合物，
其中，
当R＝葡萄糖时当R＝麦芽糖时
X＝8，正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝11，十二烷基-β-D-麦芽糖苷
x＝7，正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，十二烷基-β-D-麦芽糖苷
X＝6，正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷x＝9，癸基-β-D-麦芽糖苷
X＝5，正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述胆汁酸选自具有下式的化合物：
其中，
X＝H，R＝ONa,，脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺脱氧胆酸钠
X＝H，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨脱氧胆酸钠
X＝OH，R＝ONa，胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2SO3Na，牛磺胆酸钠
X＝OH，R＝NHCH2CH2CO2Na，甘氨胆酸钠。
9.如权利要求4所述的方法，其中葡萄糖酰胺选自具有下式的化合物：
其中，
X＝8，MEGA-10
X＝7，MEGA-9，
X＝6，MEGA-8
或，下式的化合物：
其中，
X＝H，脱氧BigCHAP
X＝OH，BigCHAP。
10.一种通过制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)纯化包含肽的有机化合物的多组分样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱系统；
(b)用选自烷基糖苷、胆汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯的替代固定相/附加固定相表面活性剂使色谱固定相饱和；
(c)采用有机溶剂和水的混合物洗涤柱以除去过量的未结合的表面活性剂；
(d)用起始流动相使所述柱平衡；
(e)将多组分样品应用至包含涂覆有所述表面活性剂的固定相的色谱床的一个端部；以及
(f)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是在水中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠，并且缓冲液B是在50％含水乙腈中的0.1mM溴化十六烷基三甲铵和0.1mM碳酸氢钠；
(g)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是0.1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是0.1％的在50％含水乙腈中的磷酸；或
(h)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是1％的在水中的磷酸，并且缓冲液B是1％的在50％含水乙腈中的磷酸；或
(i)使用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱所述多组分样品，其中所述缓冲液A是在水中的25mM至150mM磷酸三乙铵(pH3)，并且缓冲液B是在50％含水乙腈中的25mM至150mM磷酸三乙铵(pH3)；和
(j)回收所述样品中的所需组分。
11.如权利要求10所述的方法，其中在步骤(a)中的所述疏水性固定相是C-8或C-18烷基链衍生化的二氧化硅。
12.如权利要求10所述的方法，其中在步骤(b)中的所述表面活性剂选自曲通X-100、吐温-80、以及布里杰-35。
13.如权利要求10所述的方法，其中在步骤(c)中洗涤所述柱以除去所述未结合的表面活性剂包括用含水乙腈、更优选地包含0.1％三氟乙酸的90％含水乙腈洗涤所述柱。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述平衡包括用所述起始流动相、更优选地0.1％至1％磷酸水溶液、0.1％的在水中的TFA、以及在水中的25mM至150mM磷酸三乙铵使所述柱平衡。
15.一种纯化包含肽的有机化合物的方法，所述方法使用基于PEG的洗涤剂/表面活性剂在制备型反相高效液相色谱法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的样品负载容量，所述基于PEG的洗涤剂/表面活性剂具有作为结合C-18/C-8衍生化的二氧化硅的ASP/SSP的以下结构或作为所述固定相的其他载体：
其中烷基/芳基等独立地选自包括以下的组：直链的或支链的烷基、环烃、芳族基团、烷基取代的芳族基团、芳基取代的烷基；并且“n”是从1至20、优选地6至12、更优选地9至10的氧化乙烯残基的数目。
16.如权利要求1所述的方法，其中当结合至C-18衍生化的二氧化硅的所述替代固定相是流动的时(如在看到从所述固定相同时结合和浸出的情况下用基于较低的碳的表面活性剂观察到的)，并且另外当所述替代固定相紧紧地永久结合至所述C-18/C-8反相固定相时，发生样品负载容量的增大。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述C-18/C-8反相固定相选自曲通X-100、布里杰-35以及吐温-80。
18.如权利要求1或10所述的方法，还包括通过用能够与残余的硅醇H键合并且具有充分浓度的有机改性剂的缓冲液洗涤所述柱从C-18/C-8衍生化的二氧化硅载体除去所述替代固定相/附加固定相的涂层。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述有机改性剂是在50％至90％含水乙腈中的0.25M至0.5M乙酸铵。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109030669A (zh) * 2018-10-31 2018-12-18 苏州赛分科技有限公司 一种分离peg修饰蛋白样品中游离peg的高效液相色谱方法
CN113924153A (zh) * 2019-06-20 2022-01-11 Ucb生物制药有限责任公司 蛋白质样品中絮凝剂的基于hplc的检测

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265542B1 (en) * 1997-10-24 2001-07-24 Genentech, Inc. Purification of molecules
WO2005044798A1 (en) * 2003-10-29 2005-05-19 Mallinckrodt Inc. Industrial method for separation and purification of fentanyl by reverse phase preparative chromatography
US20090036652A1 (en) * 2005-12-23 2009-02-05 Novo Nordisk A/S Purification of proteins using preparative reverse phase chromatography (rpc)
WO2011107447A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 Novo Nordisk A/S Preparative rp-hplc method for purifying peptides
WO2013052539A2 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Sachem, Inc. Cationic displacer molecules for hydrophobic displacement chromatography
CN104994924A (zh) * 2013-01-29 2015-10-21 诺伊兰健康科学私人有限公司 使用在反相柱上的替代固定相纯化有机化合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5045190A (en) * 1988-11-08 1991-09-03 Carbonell Ruben G Chromatography apparatus
US6056877A (en) * 1997-12-05 2000-05-02 Transgenomic, Inc. Non-polar media for polynucleotide separations
DE112005001838B4 (de) * 2004-07-30 2018-11-29 Waters Technologies Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware) Poröse anorganische/organische Hybridmaterialien mit geordneten Domänen für chromatographische Auftrennungen, Verfahren für deren Herstellung sowie Auftrennvorrichtung und chromatographische Säule
KR101886483B1 (ko) * 2015-12-08 2018-08-07 현대자동차주식회사 차량 간 통신에서 주행 경로 데이터를 이용한 타겟 분류 방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265542B1 (en) * 1997-10-24 2001-07-24 Genentech, Inc. Purification of molecules
WO2005044798A1 (en) * 2003-10-29 2005-05-19 Mallinckrodt Inc. Industrial method for separation and purification of fentanyl by reverse phase preparative chromatography
US20090036652A1 (en) * 2005-12-23 2009-02-05 Novo Nordisk A/S Purification of proteins using preparative reverse phase chromatography (rpc)
WO2011107447A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 Novo Nordisk A/S Preparative rp-hplc method for purifying peptides
WO2013052539A2 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Sachem, Inc. Cationic displacer molecules for hydrophobic displacement chromatography
CN104994924A (zh) * 2013-01-29 2015-10-21 诺伊兰健康科学私人有限公司 使用在反相柱上的替代固定相纯化有机化合物

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109030669A (zh) * 2018-10-31 2018-12-18 苏州赛分科技有限公司 一种分离peg修饰蛋白样品中游离peg的高效液相色谱方法
CN113924153A (zh) * 2019-06-20 2022-01-11 Ucb生物制药有限责任公司 蛋白质样品中絮凝剂的基于hplc的检测

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