JP2008267958A - 発癌予知マーカー及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカーが提供される。被験者より採取された検体中における発癌予知マーカーの発現量を指標とすることによって発癌の予知が可能となる。
【選択図】なし
Description
c-RETプロト癌遺伝子は受容体型チロシンキナーゼ(receptor-tyrosine kinase)をコードする(非特許文献5)。最近、GDNF、neurturin、artemin及びpersephon等のグリア細胞由来栄養因子(GDNF)リガンドがRETのリガンドであることが報告された(非特許文献6)。RFP-RET遺伝子はc-RET遺伝子とRFP遺伝子が組み換えをおこしてできたハイブリッド癌遺伝子であり、NIH3T3のトランスフェクション・アッセイによって単離された(非特許文献7、8)。以前に我々は、304/B6系統のマウスを用いてmetallothionein I/RFP-RET-トランスジェニックマウス(RET-マウス)の作製に成功したことを報告した(非特許文献10)。
エンドセリン受容体B(Ednrb)はGタンパク質共役受容体ファミリーに属する分子であり、エンドセリンの多面的な作用を媒介する(非特許文献17〜19)。エンドセリン-1、2及び3(ET-1、ET-2及びET-3)は同等の親和性を有する、Ednrbのリガンドである(非特許文献20、21)。最近、黒色腫ではEdnrbの発現が亢進していることが報告された(非特許文献22、23)。また、Ednrb、ET-1及びET-3が黒色腫の進展に関与することが報告された(非特許文献19、24、25)。一方、近年、黒色腫細胞株では17株中16株においてメラニン細胞及び母斑細胞よりもEdnrbの発現が減少していることが報告された(非特許文献26)。さらに、原発性のブドウ膜悪性黒色腫においてもEdnrbの発現レベルの減少が報告されている(非特許文献27)。また、最近、Ednrbの機能が低下した患者では、黒色腫のリスクが有意に増加することが示された(非特許文献28)。以上のような相矛盾する数々の報告は、黒色腫発症における、Ednrb及びそのリガンドの役割が依然として不明であることを示している。
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実際に、現在迄に様々な腫瘍マーカーが見出され、そのいくつかは臨床応用されている。しかしながら、従来の腫瘍マーカーは既に発症した癌の検知を可能にするものであり、これから発症する癌の予知には利用できない。
そこで本発明は、良性腫瘍が悪性転化することを予知できる指標、即ち発癌予知マーカーを提供することを課題とする。また、発癌予知マーカーの用途を提供することも課題とする。
本発明者らは、黒色腫の発症、進展などを解析する上でRET-マウスが有用であると考え、RET-マウスを用いた種々の検討を行った。まず、RET-マウスにおいて、病理組織学的に良性腫瘍期と悪性腫瘍期の中間にある前癌期(移行期)を定義した。次に、エンドセリン受容体Bに注目して実験を進めた結果、RET-マウスでは、前癌期の腫瘍中のエンドセリン受容体B(Ednrb)及びエンドセリン1(ET-1)の発現レベルが良性腫瘍期の20〜50倍、悪性腫瘍期の2〜5倍であった。また、前癌期のときに血漿ET-1レベルの著明な上昇を認めた。悪性腫瘍期のRET-マウスにおいて、肺転移だけでも65%(13/20)という極めて高い比率で認められたのに対して、前癌期のRET-マウスでは、基本的に転移は認められなかった。これらの結果は、黒色腫の発症(悪性転化)を予知するためのバイオマーカーとしてEdnrb及びET-1が有用であることを示唆する。
以上の結果を得た後、RET-マウスをEdnrbノックアウトマウスと交配することによって部分的にEdnrbを発現するRET-マウス(Ednrb(+/-)RET-マウス)とほとんどEdnrbを発現しないRET-マウス(Ednrb(-/-)RET-マウス)を作出した。これらEdnrb発現調節RET-マウスを用い、黒色腫発症におけるEdnrb及びそのリガンドの生物学的意義を検討することにした。その結果、Ednrb(-/-)RET-マウスでは、良性腫瘍を含め、腫瘍の発症は全く認められなかった。一方、Ednrb(+/-)RET-マウスでは良性腫瘍から悪性腫瘍への移行が認められなかった。興味深いことにEdnrb(+/-)RET-マウスでは、RET-マウスと異なり、Ednrb発現レベルの著明な上昇は観察されなかった。これらの結果は、Ednrb/ET-1シグナルが良性腫瘍の形成及び悪性腫瘍への転化に必須であることを示すとともに、悪性黒色腫の予知マーカーとしてEdnrb及びET-1が有用であることを裏付ける。
ここで、RET-癌遺伝子の導入によって甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、耳下腺癌などの様々な癌が誘導される事実(非特許文献29〜32)、及び、RET癌遺伝子がヒトの多発性内分泌腺種症2A型(MEN2A: 甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、副甲状腺機能亢進症)、多発性内分泌腺種症2B型(MEN2B: 甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、神経節細胞腫、Marfan様体型)、家族性甲状腺髄様癌(FMTC)も誘導する事実(非特許文献5、6、8、11及び33)を考慮すれば、以上の各実験結果は、Ednrb及びET-1が発癌予知マーカーとして広範な種類の癌に適用可能であることを示唆する。
本発明は主として以上の成果・知見に基づくものであり、以下の癌予知マーカー及びその用途を提供する。
[1]エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカー。
[2]被験者より採取された検体中における、[1]に記載の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いることを特徴とする、発癌を予知する方法。
[3]以下のステップ(1)〜(3)を含む、[2]に記載の方法、
(1)被験者より採取された検体を用意するステップ、
(2)前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
(3)発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。
[4]前記ステップ(3)において、ステップ(2)で得られた発現量と、対照検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、[3]に記載の方法。
[5]前記ステップ(3)において、ステップ(2)で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、[3]に記載の方法。
[6]前記発現量がエンドセリン受容体Bタンパク質発現量、エンドセリン-1タンパク質発現量、エンドセリン受容体B mRNA発現量、及びエンドセリン-1 mRNA発現量からなる群より選択される一以上の発現量である、[2]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記検体が腫瘍組織の一部である、[2]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記検体が血漿又は血清である、[2]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[9]前記癌が悪性黒色腫、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽腫、耳下腺癌、多発性内分泌腺種症2A型、多発性内分泌腺種症2B型、又は家族性甲状腺髄様癌である、[2]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記癌が悪性黒色腫である、[2]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[11]抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に検出する核酸プローブ、又はエンドセリン-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする発癌予知用試薬。
[12][11]に記載の発癌予知用試薬を含む、発癌予知用キット。
用語「発癌予知マーカー」とは、癌の発症、即ち腫瘍の悪性転化を事前に知るための指標となる分子のことをいい、癌(又は腫瘍)の発症の指標とされる癌マーカー(又は腫瘍マーカー)とは異なる。発癌の可能性を把握・評価することに「発癌予知マーカー」は使用される。尚、特に言及しない限り、本明細書では癌と悪性腫瘍は同義なものとして扱う。
発癌予知マーカーのmRNA発現量及びタンパク質発現量を包括的に表す表現として用語「発癌予知マーカーの発現量」を使用する。
「発癌を予知する」とは、癌の発症の可能性ないし確率を事前に評価することをいう。評価結果は定性的なものでも定量的なものでもよい。
本発明の第1の局面は発癌予知マーカーに関する。本発明の発癌予知マーカーはエンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる。ここで、エンドセリン受容体B(GeneID: 1910, Entrez Gene, NCBI)とは、Gタンパク質共役受容体ファミリーに属する分子である。エンドセリン受容体Bとして公共のデータベースに登録されているアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号1(DEFINITION: endothelin receptor type B [Homo sapiens]. ACCESSION: AAP32295, Entrez Protein, NCBI)及び配列番号3(DEFINITION: endothelin receptor type B. ACCESSION: AAA52342, Entrez Protein, NCBI)で示す。また、配列番号1のアミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号2(DEFINITION: Homo sapiens endothelin receptor type B (EDNRB) mRNA, complete cds. ACCESSION: AY275463, Entrez Nucleotide, NCBI)で、配列番号3のアミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号4(DEFINITION: Homo sapiens endothelin receptor type B (EDNRB) mRNA, complete cds. ACCESSION: L06623, Entrez Nucleotide, NCBI)でそれぞれ示す。
一方、エンドセリン-1(GeneID: 1906, Entrez Gene, NCBI)とは、エンドセリン受容体Bのリガンドの一つである。添付の配列表において、エンドセリン-1のアミノ酸配列を配列番号5(DEFINITION: endothelin 1 [Homo sapiens]. ACCESSION: NP_001946, Entrez Protein, NCBI)で示し、当該アミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号6(DEFINITION: Homo sapiens endothelin 1 (EDN1), mRNA. ACCESSION: NM_001955, Entrez Nucleotide, NCBI)で示す。
本発明の第2の局面は、発癌を予知する方法(以下、「発癌予知法」ともいう)に関する。本発明の発癌予知法では、被験者より採取された検体中における発癌予知マーカーの発現量が評価の指標として用いられる。このように、被験者由来の検体中の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いる点が本発明の発癌予知法の最大の特徴である。
(1)被験者より採取された検体を用意するステップ、
(2)前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
(3)発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。
悪性転化前の腫瘍が認められた患者に対して本発明の発癌予知法を適用すれば、発癌の徴候を事前に把握でき、適切な治療法の選択及びそれに伴う患者のQOL(Quality of Life、生活の質)向上が可能となる。一方、癌治療後の患者に対して本発明を適用すれば、癌の再発や転移の兆候を事前に把握することが可能である。このように、癌治療後の再発を防ぐ目的に本発明を利用することもできる。
発癌予知マーカーの発現量を厳密に定量することは必須でない。即ち、後続のステップ(3)において発癌の予知が評価可能となる程度に発癌予知マーカーの発現量を測定できればよい。
免疫学的手法では発癌予知マーカーを特異的に認識する抗体(抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン1−抗体)が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標として発癌予知マーカーの発現量が調べられる。尚、文献「Lahav R, Suva ML, Rimoldi D, Patterson PH, Stamenkovic I. Endothelin receptor B inhibition triggers apoptosis and enhances angiogenesis in melanomas. Cancer Res. 2004;64(24):8945-53.」には抗エンドセリン受容体B抗体を使用したウエスタンブロット法の記述があり参考となる。同様に、文献「Abdel-Naser MB, El-Khateeb EA, Sallam TH, Habib MA. Endothelin-1 is significantly elevated in plasma of patients with vitiligo treated with psoralen plus ultraviolet A. Clin Exp Dermatol. 2006;31(4):571-5.」には抗エンドセリン-1抗体を使用したELISA法の記述があり参考となる。
市販の抗体を使用しても或いは免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して新たに調製したものを使用することにしてもよい。尚、抗エンドセリン受容体B抗体としてGSNSSLMRFRTAEVC(配列番号15)をエピトープとした抗体(AbCam Limited社)、C末端をエピトープとした抗体(American Research Products社)等が市販されており、抗エンドセリン-1抗体としてa.a.8-16をエピトープとした抗体(AbCam Limited社)やBiogenesis社の抗体等が市販されている。
当業者であれば、エンドセリン受容体BのmRNAの配列(配列番号2、配列番号4)、エンドセリン-1のmRNAの配列(配列番号6)を基に各方法に適した核酸プライマー又は核酸プローブを常法で設計することができる。以下、エンドセリン受容体BのmRNAをRT-PCRで検出する際に使用可能なプライマーの例を示す。尚、文献「S. Yokoyama et al., FEBS Journal 273(2006)1805-1820及びM. Tsutsumi et al., Gene 228(1999)43-49」には、エンドセリン受容体BのmRNAをRT-PCRで検出する際に使用したプライマーが記載されており参考になる。
(エンドセリン受容体B)
フォワードプライマー:aga gga ctg gcc att tg(配列番号7)
リバースプライマー:act cca aga agc aac agc(配列番号8)
(エンドセリン-1)
フォワードプライマー:tac ttc tgc cac ctg gac(配列番号9)
リバースプライマー:tga gtt ctt ttc ctg ctt g(配列番号10)
血漿又は血清を検体とする場合の陰性対照検体には、癌を罹患していない者の血漿又は血清が好適に用いられる。ここでの「癌を罹患していない者」は典型的には健常者であるが、良性腫瘍を保有する患者もこれに該当する。癌を発症していない状態にある被験者自身から調製した血漿又は血清を陰性対照検体として用いてもよい。この場合、ステップ(2)で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性が評価されることになる。ここでの「癌を発症していない状態」には、腫瘍を全く発症していない状態と良性腫瘍を発症している状態が含まれる。また、「腫瘍を全く発症していないとき」には、治療(典型的には腫瘍組織の切除)によって腫瘍の存在が認められなくなった状態が含まれる。一方、陽性対照検体には前癌期の腫瘍を保有する患者の血漿又は血清を用いることができる。尚、血漿又は血清以外の体液を検体とする場合の陰性対照検体及び陽性対照検体については、血漿又は血清を検体とする場合と同様である。
<例1>
区分1:検体(腫瘍組織)にエンドセリン受容体Bタンパク質の弱い発現を認める:将来の発癌の可能性は低い
区分2:検体(腫瘍組織)にエンドセリン受容体Bタンパク質の中程度の発現を認める:将来の発癌の可能性がある
区分3:検体(腫瘍組織)にエンドセリン受容体Bタンパク質の強い発現を認める:将来の発癌の可能性が高い
区分1:検体(腫瘍組織)中のエンドセリン-1の転写レベルが、陰性対照検体中のエンドセリン-1の転写レベルの3倍未満:将来の発癌の可能性が低い
区分2:検体(腫瘍組織)中のエンドセリン-1の転写レベルが、陰性対照検体中のエンドセリン-1の転写レベルの3倍以上:将来の発癌の可能性が高い
区分1:検体(血漿)中のエンドセリン-1タンパク質量が、陰性対照検体中のエンドセリン-1タンパク質量の1.5倍未満:将来の発癌の可能性が低い
区分2:検体(血漿)中のエンドセリン-1タンパク質量が、陰性対照検体中のエンドセリン-1タンパク質量の1.5倍以上:将来の発癌の可能性が高い
上記のごとき評価を癌治療と並行して行えば、治療効果の確認が行えることはもとより、癌の再発の兆候を事前に把握することができる。これによって、より適切な治療方針の決定が可能となる。このように本発明は、治療効果の最大化及び患者のQOL(生活の質)向上に多大な貢献をする。
本発明の第3の局面は、本発明の発癌予知法に用いられる試薬(発癌予知用試薬)及びキット(発癌予知用キット)に関する。本発明の試薬の一態様は、免疫学的手法で発癌予知法を実施する際に使用される試薬であり、発癌予知マーカーに特異的結合性を示す物質からなる。当該試薬の好適な例は抗発癌予知マーカー抗体(抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体)であるが、これに限られるものではない。抗発癌予知マーカー抗体の調製法ないし入手法については、上記の免疫学的手法についての説明の欄に記載した通りである。尚、ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体(数種〜数十種の抗体の混合物)、及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。標識化などの修飾が施されている抗体であってもよい。
免疫学的手法で発癌予知法を実施するために使用されるキットには、例えば、標識化抗発癌予知マーカー抗体が含まれることになる。当該キットによれば抗発癌予知マーカー抗体の結合量を直接検出することができる。一方、未標識の抗発癌予知マーカー抗体と二次抗体(標識二次抗体)を組み合わせれば、間接的検出によって結果を得るキットが構築される。本発明のキットに発癌予知マーカータンパク質(抗原)を更に含めることにしてもよい。発癌予知マーカータンパク質は検量線の作成や、キットを使用して得られた染色性が抗発癌予知マーカー抗体と発癌予知マーカータンパク質との特異的結合に基づくものであることを確認するために使用される。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫学的操作を実施する上で必要な一以上の試薬(例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など)や器具などを更に含めてもよい。
尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
(1)マウス
以前の報告(参考文献2、9、10)の通り、基本的にはC57BL/6の遺伝的背景をもつmetallothionein-I/RFP-RETトランスジェニックマウス(304/B6系統、RET-マウス)は段階的に皮膚黒色症、良性メラノサイト系腫瘍、及び悪性黒色腫を発症する。一方、Hosodaらはエンドセリン受容体B(Ednrb)欠損マウスを作製した(参考文献18)。また、Ednrbホモ欠損型マウスでは、ヒトドーパミンβヒドロキシダーゼ(DβH)プロモーターによって誘導されたEdnrbの遺伝子導入によってHirschsprung病の発症が抑制されることが示されている(参考文献29)。本研究ではまず、Ednrbヘテロ欠損型マウス(Ednrb(+/-)-マウス)とEdnrbホモ欠損型マウス(Ednrb(-/-)-マウス)を用意した(いずれのマウスも原則としてC57BL/6の遺伝的背景をもつ)。次にEdnrb(+/-)-マウスとEdnrb(-/-)-マウスをそれぞれRET-マウスと交配し、部分的にEdnrbを発現するRET-マウス(Ednrb(+/-)RET-マウス)とほとんどEdnrbを発現しないRET-マウス(Ednrb(-/-)RET-マウス)を新たに作出した。実験に使用したマウスは毎日観察することにした。中部大学の動物実験委員会(受理番号18001)及び組換えDNA実験安全委員会(受理番号06-01)の承認の下、本研究は行われた。
High Pure RNA Isolation Kit(ロッシュ・ダイアグノスティクス)を用いて凍結腫瘍試料及び凍結皮膚試料より全RNAを調製した。操作方法は添付のプロトコールに従った。SupercriptTMIII reverse transcriptase(インビトロジェン。RT enzyme mix、RT reaction mixを含む)を用いて全RNAを逆転写し、cDNAを得た。操作方法は添付のプロトコール通りとした。
SupercriptTMIII(インビトロジェン)Platinum SYBR Green PCR master mixを用い、ABI Prism7700 sequence detection system(パーキン・エルマー)内でリアルタイム定量RT-PCRを行った(参考文献30)。定量RT-PCR(リアルタイムPCR)で測定した、RFP-RET、Ednrb及びET-1の各転写産物の発現レベルは、β-アクチンの発現レベルをコントロールとして調整した。以下、使用したプライマーを示す。
(a)Ednrb用プライマー(マウスEdnrbとヒトEdnrbに共通する)
フォワードプライマー(増幅産物130bp):aga gga ctg gcc att tg(配列番号7)
リバースプライマー(増幅産物130bp):act cca aga agc aac agc(配列番号8)
(b)ET-1用プライマー(マウスEdnrbとヒトEdnrbに共通する)
フォワードプライマー(増幅産物196bp):tac ttc tgc cac ctg gac(配列番号9)
リバースプライマー(増幅産物196bp):tga gtt ctt ttc ctg ctt g(配列番号10)
(c)ET-3用プライマー
フォワードプライマー(増幅産物217bp):tct act att gcc acc tgg a(配列番号11)
リバースプライマー(増幅産物217bp):gtg aca tct ctg gtg cg(配列番号12)
(d)RFP-RET用プライマー
フォワードプライマー(増幅産物139bp):tga cgg aga gtc taa agc ag(配列番号13)
リバースプライマー(増幅産物139bp):gct tta atc ccc cgg ggc(配列番号14)
以前に報告した方法(参考文献11)に従い免疫ブロットを行った。ライセート(細胞溶解物)をSDS-ポリアクリルアミドゲル(10%)電気泳動(SDS-PAGE)に供し、泳動終了後、PDVF(polyvinylidene difluoride)膜に転写した。一次抗体及び二次抗体との反応の後、ウエスタンブロット用化学ルミネセンス試薬で反応性を調べた。抗RET抗体はIBL(藤岡市、日本)より、抗Ednrb抗体はCalbiochem(Darmstadt、ドイツ)よりそれぞれ購入した。
EDTAを使用して血液サンプルを採取した後、プロテアーゼ阻害剤のアプロチニンを添加した(0.6 TIU/ml)。その後、直ちに氷上に移し、1,600 g、15分、4℃の条件下で遠心処理した。上清(血漿)を採取した後、液体窒素で速やかに凍結し、-80℃で保存した。血漿の採取から一月以内に、競合酵素免疫アッセイキット(Phoenix Pharmaceuticals)を用い、添付のプロトコールに従い、血漿ET-1濃度を測定した。全ての試料及びコントロールについて2回の測定を実施し、平均値を算出した。
RET-マウスの各腫瘍期の腫瘍における、核/細胞質(N/C)比率(図1H)の差、核のサイズ(図1I)の差、及び分裂期の細胞数(図1J)の差をKruskal-Wallisテストで統計解析した。各種マウスの皮膚Ednrb発現レベルの統計解析もKruskal-Wallisテストで行った(図4A)。RET-マウスとEdnrb(+/-)RET-マウスの前癌期の腫瘍における、RFP-RET発現レベル(図5B)の差、Ednrb発現レベル(図5D)の差、ET-1発現レベル(図5F)の差をMann-Whitney Uテストで統計解析した。RET-マウス、Ednrb(+/-)RET-マウス及びEdnrb(-/-)RET-マウスにおける腫瘍サイズの差を月毎にMann-Whitney Uテストで統計解析した。RET-マウス、Ednrb(+/-)RET-マウス及びEdnrb(-/-)RET-マウスにおける生後18ヶ月以内の良性腫瘍、前癌期の腫瘍、悪性腫瘍の発症数の差をχ2テストで統計解析した(図4D)。
(1)RET-マウスの黒色腫形成過程における各ステージの定義(病理学的所見に基づく)
最近、ヒトの様々な癌について、良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な組織病理学的特徴を示す腫瘍が報告されている(参考文献31〜36)。良性メラノサイト系腫瘍と悪性黒色腫の特徴に関するこれまでの報告(参考文献10、11、13、14)を精査し、RET-マウスにおける、良性メラノサイト系腫瘍と悪性黒色腫の中間的な特徴を有する前癌腫瘍を以下の通り定義した。
RET-マウスの良性腫瘍期の腫瘍(腫瘍サイズ:<1,500mm3)は、肉眼的所見でヒト良性メラノサイト系腫瘍に類似し(図1A、B)、組織病理学的所見によれば正常な円形の核を有する円形の細胞から構成されており、転移能を有しない(図1E)。潰瘍及び痂皮を有する悪性腫瘍期の腫瘍(腫瘍サイズ:>8,000mm3)の肉眼的所見を図1A及びDに示す。組織病理学的所見では、悪性腫瘍期の腫瘍は異型細胞から構成されており、核の大きさは様々である(図1G)。この腫瘍では細胞分裂が盛んであり、異型分裂も観察される(図1G)。これらの特徴は、既報(参考文献2、10)のヒト悪性黒色腫の特徴に類似する。前癌期の腫瘍(腫瘍サイズ:1,500mm3〜8,000mm3)は良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な肉眼的所見を示す(図1A、C、F)。前癌期の腫瘍では表面に潰瘍や痂皮は認めない。このことは腫瘍の増殖速度が潰瘍形成に至る程は速くないことを示唆する。組織病理学的所見では、前癌期の腫瘍は正常な円形の核を有する円形の細胞と、核の大きさに変化を認める異型細胞から構成される(図1F)。更なる組織病理学的検討の結果、前癌期の腫瘍では細胞核−細胞質(N/C)比率(図1H)及び細胞核の大きさ(図1I)が統計的に良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な値を示すことが明らかとなった。前癌期の腫瘍においても分裂期の細胞はいくつか観察されるものの、異型分裂は認められなかった(図1J)。良性腫瘍期の腫瘍(n=30)及び前癌期の腫瘍(n=18)のいずれにおいても基本的に転移は認められない。一方、悪性腫瘍期の腫瘍(n=20)では肺への転移(65%)が認められた。
以上のように、RET-マウスでは、未腫瘍期、良性腫瘍期、前癌期及び悪性腫瘍期からなる、黒色腫形成の全過程を解析することが可能である(図1A)。黒色腫を移植した動物モデルを利用した解析方法や、ヒトでの母斑と黒色腫の比較研究によっては、このような解析は不可能である。
次に、悪性黒色腫の進展に対する癌遺伝子RET(RFP-RET)及びEdnrbの影響を調べた。その結果、前癌期の腫瘍ではRFP-RETの転写レベル(図2A)及びタンパク質発現レベル(図2B)は良性腫瘍期よりも3〜10倍上昇していた。一方、悪性腫瘍期の初期では良性腫瘍期よりも2〜5倍の上昇を認めた(図2A、B)。悪性腫瘍期の後期にはこれら両レベルの低下を認めた(図2A、B)。
興味深いことに、前癌期の腫瘍におけるEdnrb転写産物の発現レベルは良性腫瘍期の腫瘍に比較して20〜50倍高く、悪性腫瘍期の初期の腫瘍と比較しても2〜5倍高い(図2C)。しかしながら、悪性腫瘍期の後期の腫瘍におけるEdnrbの転写レベルは良性腫瘍期の腫瘍のそれよりも低い。この転写レベルのダイナミクス(変化)は、Ednrbタンパク質の発現レベル解析によって検証された(図2D)。これらの結果は、RET-マウスにおいて、RFP-RET及びEdnrbの発現レベルの上昇が前癌期から悪性腫瘍期への移行に重要な役割を果たすことを示唆する。
次に、悪性黒色腫の進展に対するEdnrbリガンドの影響を調べた。良性腫瘍と比較して、前癌期の腫瘍ではET-1の転写レベルが20〜50倍であった。また、悪性腫瘍期の初期においても良性腫瘍期に比較して3〜10倍の転写レベルの上昇を認めた(図3A)。一方、RET-マウスでは腫瘍形成の全過程を通してET-3の転写産物の発現は認められなかった(データ示さず)。Ednrbの転写レベルの上昇を示したこと(図2C、D)と合わせて考えると、Ednrb/ET-3シグナルではなくEdnrb/ET-1シグナルが、前癌期から悪性腫瘍期への移行に重要な役割を果たしていることが示唆される。
続いて、前癌期の腫瘍におけるET-1の転写レベルの上昇が血漿中のET-1タンパク質発現レベルに反映されるか否かを検討した。図3Bに示す通り、前癌期の血漿ET-1レベルは、良性腫瘍期と比較して有意な上昇を示した。良性腫瘍の存在の如何に拘わらず、コントロールマウス(C57BL/6)とRET-マウスとの間で血漿ET-1レベルに実質的な差異はなかった(データ示さず)。悪性腫瘍期の血漿ET-1レベルは、良性腫瘍期に比較すれば高いものの、前癌期よりも低い。腫瘍形成の全過程を通して血漿ET-1タンパク質レベルの変化は腫瘍内のET-1転写レベルの変化に呼応しており(図3A)、腫瘍においてET-1の産生が亢進した結果として血漿ET-1レベルが上昇したと考えられる。以上の結果は、ELISAで測定可能な血漿ET-1レベルに基づいて、近い将来起きるであろう悪性黒色腫への転化を予知できる可能性を示す。
黒色腫の形成過程におけるEdnrbの役割を更に検討するため、Ednrbの発現を部分的に欠失させたRET-マウス(Ednrb(+/-)RET-マウス)と、完全に欠失させたRET-マウス(Ednrb(-/-)RET-マウス)を作出した。Ednrb(+/-)マウス及びEdnrb(+/-)RET-マウスでは、皮膚でのEdnrb発現レベルがRET-マウスの約半分であった(図4A)。一方、Ednrb(-/-)マウス及びEdnrb(-/-)RET-マウスでは、Ednrbの発現はほとんど認められなかった(図4A)。この結果は、Ednrb(-/-)マウス及びEdnrb(-/-)RET-マウスの皮膚の病態へのDβH/Ednrb導入遺伝子の関与は、過去の報告(参考文献29)通り、限定的であることを示唆する。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは良性腫瘍すら形成されなかったことから(図4C、D)、黒色腫の形成過程における腫瘍の発生(開始)においてEdnrbの発現が必須であると示唆された。一方、Ednrb(+/-)RET-マウスの2/3では良性腫瘍すら形成されなかった(図4D)。また、Ednrb(+/-)RET-マウスにおいては腫瘍の進展も顕著に抑制された(図4B)。更に重要なのは、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、良性腫瘍期又は前癌期を認めたものの、悪性黒色腫が形成されなかったことである。
前癌期から悪性腫瘍期への移行に関してさらに解析を進めるため、RFP-RET、ET-1及びEdnrbの発現レベルをRET-マウスとEdnrb(+/-)RET-マウスの間で比較することにした。Ednrb(+/-)RET-マウスの前癌期腫瘍でのRFP-RET発現レベルはRET-マウスに比較して高かった(図5A、B)。一方、両群の間にET-1発現レベルの差はなかった(図5E、F)。興味深いことに、Ednrb(+/-)RET-マウスの前癌期腫瘍では、RET-マウスの前癌期腫瘍に比べ、Ednrb発現レベルの有意な抑制が認められた(図5C、D)。これらの結果は、Ednrbの発現が高度に亢進することが、良性腫瘍期から悪性腫瘍期への移行に重要であることを示す。
本研究では、まず、RET-マウスでの黒色腫形成過程における前癌期のメラノサイト系腫瘍を定義した。次に、RET-マウスの前癌期では、腫瘍内及び血漿中のEdnrb/ET-1発現レベルが劇的に上昇することを示した。最後に、新たに作出したEdnrb抑制RET-マウスを用いて、Ednrbが良性腫瘍の形成及び悪性腫瘍への転化に必須であることを示した。
様々な癌モデルマウスにおいて前癌状態が認められている(参考文献37〜40)。本研究では、肉眼的観察(図1A〜D)及び病理組織学的所見(図1E〜J)に基づき、RET-マウスの前癌期の腫瘍を定義した。ヒトでは、色素細胞性メラノサイト系母斑(dysplastic melanocytic nevi)は、母斑細胞と黒色腫の中間的な病理組織学的特徴を持つので黒色腫の前癌期と考えられている(参考文献35、41〜43)。従って、RET-マウスにおいても良性メラノサイト系腫瘍(図1A、B、E)が前癌期(図1A、C、F)を経て黒色腫(図1A、D、G)へ転化することは妥当といえよう。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは、Ednrbの発現はほとんど検出されず(図4A)、良性腫瘍すら形成されない(図4C、D)。RET-マウスでは、前癌期及び悪性腫瘍期の腫瘍に比較して、良性腫瘍期の腫瘍におけるEdnrb発現レベルは遙かに低い(図2C、D)。これらの結果より、Ednrbの低レベルでの発現上昇が良性腫瘍形成の開始に必要と思われる。また、悪性腫瘍期の初期では依然としてEdnrbの発現レベルは高い(図2C、D)。しかしながら、悪性腫瘍期の後期にはEdnrbの発現レベルが低下する(図2C、D)。ステージ依存的なこのような発現レベルの変化のために、過去の研究(参考文献22、23、26、27)においてEdnrbの発現レベルに差が観察された可能性がある。一方、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、皮膚でのEdnrb発現レベルがRET-マウスの約半分であり(図4A)、前癌期から悪性腫瘍期への移行は認められなかった(図4D)。RET-マウスでは、前癌期の腫瘍におけるEdnrb及びET-1の発現レベルは良性腫瘍期又は悪性腫瘍期の腫瘍に比較して格段に高い(図2C、D及び図3A)。また、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、RET-マウスの前癌期に観察されたようなEdnrbの発現レベルの顕著な上昇は観察されなかった(図5C、D)。これらの結果より、RET-マウスにおいて、良性腫瘍の形成開始には比較的低いレベルのEdnrbの発現が必要であり、一方で悪性腫瘍への転化には比較的高いレベルのEdnrbの発現が要求されるといえる。
最近、我々はRET-マウスの黒色腫に対する予防療法として、漢方薬及び分子標的免疫療法を組み合わせることを提案した(参考文献2、11、44〜47)。これまでの検討ではRET-マウスの黒色腫を予防するためには、c-Kit分子標的療法が最も効果的であった(参考文献11)。それでも、c-Kitの機能欠損を伴うRET-マウスの約15%に良性腫瘍、同5%に悪性黒色腫が形成された(参考文献11)。本研究によって、Ednrbの発現レベルが極めて低いRET-マウス(Ednrb(-/-)RET-マウス)では良性腫瘍さえ全く形成されないことが明らかとなった(図4C、D)。これらの結果より、RET-マウスにおける悪性黒色腫の発症を予防するための標的分子としてEdnrbは、c-Kitよりもさらに効果的であるといえる。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは良性腫瘍さえ全く形成されなかった理由として、このマウスにおいて、Ednrbが関与するメラニン細胞の増殖及び遊走(参考文献18、48)が大幅に阻害された可能性が考えられる。しかしながら、Ednrbが関与するメラニン細胞の増殖及び遊走は基本的に阻害されていないEdnrbが部分的に欠損したRET-マウス(Ednrb(+/-)RET-マウス)においてもなおメラノサイト系腫瘍の発症及び進展は明らかに抑制された(図4B、D)。これらの結果は、Ednrbは単にメラニン細胞の増殖及び遊走の修飾のみではなく、メラノサイト系腫瘍の発症機構そのものに深く関わっている可能性を示している。Ednrb(+/-)RET-マウスでは前癌期から悪性期への形質転換が抑制された。その一方で、Ednrb(+/-)RET-マウスの前癌期の腫瘍では、RET-マウスの前癌期の腫瘍よりもRFP-RET癌遺伝子の発現レベルが高かった(図4B,D、図5A,B)。これらの結果は、Ednrbが介在するシグナル伝達経路が、RET依存的悪性黒色腫の発症・進展に関わるシグナル経路の下流に位置することを示唆する。今後、RETとEdnrb/ET-1のクロストークの分子的機序に関し、更なる検討が必要であろう。
図3Bに示すように、前癌期のRET-マウスにおいて血漿ET-1レベルの上昇を認めた。様々な種類の癌が既に発症した患者において、血漿/血清ET-1レベルが上昇することが報告されている(参考文献49〜52)。また、肺癌患者又は結腸直腸癌患者の血漿/血清ET-1レベルが、癌を発症した患者の予後を知るための診断マーカーとして有用であるとの提案がなされた(参考文献49、51、52)。しかし、本研究では、これ迄の報告とは異なり、癌発症後ではなく癌の発症前の段階で悪性転化を予知するための指標として血漿ET-1レベルの上昇が有用であるとの知見が得られた(図3B)。Ednrb/ET-1発現レベルの変化に関する実験結果(図2C,D、図3A)を合わせて考えれば、前癌期の腫瘍におけるEdnrb/ET-1の発現レベルの上昇は、病理学者にとって悪性黒色腫の発症を予知するための有益な情報(バイオマーカー)になるであろう。血漿中又は腫瘍内のET-1レベルをバイオマーカーとして前癌期の患者を選抜すれば、多くの患者の癌の発症を予知し、適切な治療を早期に行うことができ、もって発癌を未然に防止できるであろう。
以上をまとめると、本研究によって、悪性黒色腫の進展過程へのEdnrb/ET-1の関与が示された。また、黒色腫の発症を前癌期に予知するためのバイオマーカーとしてEdnrb/ET-1が有用であることが示された。
癌治療において解決すべき大きな問題の一つは、如何にして再発を防ぐかである。様々な治療法の確立によって癌治療の奏功率は向上したものの、治療後数年を経て突然癌を再発し、死亡する例が後を絶たない。癌治療後の再発や転移の兆候を把握するために本発明の発癌予知マーカーを利用することも大いに期待される。
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本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (12)
- エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカー。
- 被験者より採取された検体中における、請求項1に記載の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いることを特徴とする、発癌を予知する方法。
- 以下のステップ(1)〜(3)を含む、請求項2に記載の方法、
(1)被験者より採取された検体を用意するステップ、
(2)前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
(3)発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。 - 前記ステップ(3)において、ステップ(2)で得られた発現量と、対照検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、請求項3に記載の方法。
- 前記ステップ(3)において、ステップ(2)で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、請求項3に記載の方法。
- 前記発現量がエンドセリン受容体Bタンパク質発現量、エンドセリン-1タンパク質発現量、エンドセリン受容体B mRNA発現量、及びエンドセリン-1 mRNA発現量からなる群より選択される一以上の発現量である、請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記検体が腫瘍組織の一部である、請求項2〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記検体が血漿又は血清である、請求項2〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が悪性黒色腫、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽腫、耳下腺癌、多発性内分泌腺種症2A型、多発性内分泌腺種症2B型、又は家族性甲状腺髄様癌である、請求項2〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が悪性黒色腫である、請求項2〜8のいずれかに記載の方法。
- 抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に検出する核酸プローブ、又はエンドセリン-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする発癌予知用試薬。
- 請求項11に記載の発癌予知用試薬を含む、発癌予知用キット。
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