JP2008220198A

JP2008220198A - カサゴ細胞株

Info

Publication number: JP2008220198A
Application number: JP2007059375A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Konishi; 聡史小西; Junko Hayashi; 純子林; Munehiko Nagahama; 統彦長濱; Yoshihiro Koyama; 純弘小山; Tetsuya Miwa; 哲也三輪
Original assignee: Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Current assignee: Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-09-25

Abstract

【課題】カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ組織から樹立した細胞株を提供すること。
【解決手段】カサゴ細胞株は、カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ由来の繊維芽様細胞である。リン酸緩衝食塩水で、培養容器壁から剥離可能である。
この細胞株を用いれば、カサゴの薬物耐性や、環境変化に対する応答性などを短時間且つ低コストで調査することが可能となり、しかも再現性の高いデータの取得が可能になる。この細胞株を用いれば、細胞にダメージを与えることなく細胞培養や継代操作を行うことができる。
カサゴ細胞に関する研究の進展を促進することができ、カサゴの生態解明やカサゴの養殖の実現に有効であり、食料としての利用性も向上できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、いわゆるカサゴの組織細胞に由来する細胞株に係り、更に詳細には、カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴ（Ｓｅｂａｓｔｉｓｃｕｓｍａｒｍｏｒａｔｕｓ）の尾ヒレ組織から樹立した細胞株に関する。

従来、カサゴは、いわゆる高級魚として知られているが、岩礁地帯を生息場とし、移動が余り大きくなく、地元優先に連なるとの理由から、近年は栽培漁業の放流魚の対象になってきている（非特許文献１参照）。
改訂版新水産ハンドブック、第１７１頁、川島利兵衛、田中昌一、塚原博、野村稔、隆島史夫、豊水正道、浅田陽治、講談社、１９９０年９月１０日改訂版第３刷発行

また、カサゴについては、健康な産出仔魚を安定して大量に確保することが困難であることを背景として、活力の高い仔魚を早期に選別して、その後の飼育に供したいという要請があり、これに対して、早期に仔魚の活力を定量的に評価可能な活性評価法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００２−３２５５２１号公報

ところで、カサゴ組織細胞の細胞株を樹立した旨の報告は見当たらない。
よって、カサゴの薬物耐性や環境変化に対する応答性などを調べるには、カサゴの生体を使用して試験しなければならず、そのため、大規模な飼育設備とランニングコストがかかっていた。
しかも、かかる試験で得られる結果は、カサゴの個体差や飼育環境に大きく依存するため、再現性の高いデータが得られないのが実情である。

本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ組織から樹立した細胞株を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、カサゴの尾ヒレ組織を所定条件下で培養することにより、上記目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の細胞株は、カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ由来の繊維芽様細胞であることを特徴とする。

また、本発明の細胞株の好適形態は、リン酸緩衝食塩水で、培養容器壁から剥離可能であることを特徴とする。

本発明によれば、カサゴの尾ヒレ組織を所定条件下で培養することとしたため、カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ組織から樹立した細胞株を提供することができる。
本発明の細胞株を用いれば、カサゴの薬物耐性や、環境変化に対する応答性などを短時間且つ低コストで調査することが可能となり、しかも再現性の高いデータの取得が可能になる。

以下、本発明のカサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴ（Ｓｅｂａｓｔｉｓｃｕｓｍａｒｍｏｒａｔｕｓ）の尾ヒレ組織から樹立した細胞株（以下、「ＫＳＧ−１」と略すことがある）につき詳細に説明する。
なお、本明細書において、濃度、含有量及び配合量などについての「％」は、特記しない限り体積百分率を表すものとする。

本発明の細胞株（ＫＳＧ−１）は、ＦＥＲＭＡＰ−２１１６１として平成１９年１月１８日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託してある。

ここで、一般に、動物細胞では、その培養や株化の際、培養容器の内壁、特にＴＣフラスコ（組織培養フラスコ；Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｆｌａｓｋ）の底面に接着した当該動物細胞を剥離させるに当たって、トリプシンなどの酵素を用いなければならないが、このような酵素の使用は、培養細胞にダメージを与える。
これに対し、本発明の細胞株は、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）と接触させたり浸漬することにより、培養容器の壁部、特にＴＣフラスコの底面などから容易に剥離させることができる。よって、本発明の細胞株を用いれば、細胞にダメージを与えることなく細胞培養や継代操作を行うことができる。

なお、本発明の細胞株を用いた細胞培養は、代表的には、以下の手順で行うことができる。

［細胞培養手順］
解凍及び播種
凍結されたＫＳＧ−１が入ったセラムチューブを１５℃のウォーターバスで暖めて解凍する。以下の操作は、すべてクリーンベンチ内で無菌的に行う。
解凍したＫＳＧ−１懸濁液１ｍＬを１０ｍＬの培地が入った遠沈管に入れて十分にピペッティングし，１０００ｒｐｓで２分間遠心分離する。上澄みをアスピレータで取り除いて、１０ｍＬの培地を加えてピペッティングし、ＫＳＧ−１を十分に懸濁させる。
７５ｃｍ^２のＴＣフラスコに播種し、１５〜２５℃、大気組成のインキュベータ内に静置する。ＫＳＧ−１はＴＣフラスコの底面に接着して伸展し、増殖を始める。

継代操作
ＫＳＧ−１を培養しているＴＣフラスコの培地をアスピレータで吸引し、培養温度に暖めたリン酸緩衝食塩水を５ｍＬ注ぐ。１５分程度静置してＫＳＧ−１が剥がれてきたら、ピペッティングによってすべてのＫＳＧ−１を剥がす。
ＫＳＧ−１懸濁液を遠沈管に移し、１０００ｒｐｓで２分間遠心分離する。上澄みをアスピレータで取り除いて、１０ｍＬの培地を加えてピペッティングし、ＫＳＧ−１を十分に懸濁させる。所定の数の７５ｃｍ^２のＴＣフラスコに播種し、１５〜２５℃、大気組成のインキュベータ内に静置する。

凍結保存
継代と同様な操作でＫＳＧ−１をＴＣフラスコから剥離させ、凍結保存液にＫＳＧ−１が１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬになるように懸濁させる。セラムチューブに１ｍＬずつ分注し、−８０℃のディープフリーザに入れて凍結させる。１日後に液体窒素凍結保存設備に移し、保管する。

凍結保存液の組成
（１）ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＣａｔ．Ｎｏ．２９１６８５４）
（２）４ｇ／ＬのＮａＣｌ（和光純薬工業試薬特級Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１−０１６６５）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚＬ−１５Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＣａｔ．Ｎｏ．１０５１１２０）に２００ｇ／Ｌの濃度になるようにＤ（＋）−グルコース（和光純薬０４１−００５９５）を添加した液
（３）ＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅ（和光純薬０４６−２１９８１）
上記（１）、（２）、（３）を体積比７５：１５：１０で混合する。

以下、本発明を実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
［株化］
神奈川県横浜市福浦岸壁付近（水深５ｍ程度）で捕獲したカサゴの尾ヒレ組織を５ｍｍ角の大きさに切り出して、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ抗生物質入りＰＢＳに２０分浸した。尾ヒレ組織を取り出して１ｍｍ角程度に細かく刻み、維持培地が入ったＴＣフラスコに投入して、１５℃のインキュベータ内に静置して培養した。
維持培地（Ｌ−１５培地，１０％ＦＢＳ，４ｇ／Ｌ−ＮａＣｌ，ＰＮ−ＳＴ（５０Ｕ／ｍＬ−５０μｇ／ｍＬ））は３日ごとに交換した。３日程度で尾ヒレ組織から繊維芽様細胞が遊走した。

繊維芽様細胞はＴＣフラスコの底面に接着した状態で増殖した。５ヶ月間培養を続けると、繊維芽細胞の急激な増殖が確認され、サブコンフルエント（容器が細胞で満杯になる一歩手前の状態）になったので、酵素（トリプシン−ＥＤＴＡ）で細胞を剥離させ、継代操作を行った。播種濃度は１×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬである。
この作業を繰り返し、株化した細胞を選別した。その後、継代操作を繰り返し、３２代までの生存を確認した。

（実施例２及び比較例１）
［ＫＳＧ−１と３Ｔ３Ｌ１（マウス繊維芽細胞）との剥離率の比較］
ＴＣフラスコで培養し、サブコンフルエントになったＫＳＧ−１細胞（実施例２）とマウス繊維芽細胞３Ｔ３Ｌ１（比較例１）を酵素（トリプシン−ＥＤＴＡ）又はＰＢＳに１５分間浸漬し、液相を除去した後、ＴＣフラスコ底面に残存した細胞数を計測して剥離率を測定した。なお、剥離率は以下の式から求めた。

剥離率（％）＝｛（剥離前の細胞数）−（底面に残存した細胞数）｝／（剥離前の細胞数）×１００

各例の細胞の剥離率を表１に示した。３Ｔ３Ｌ１（比較例１）はＰＢＳでは全く剥離せず、酵素では１００％近く剥離するのに対し、ＫＳＧ−１（実施例２）の剥離率はいずれもほぼ１００％であった。

（実施例３）
［酵素とＰＢＳのダメージ比較］
ＴＣフラスコで培養してサブコンフルエントになった２種のＫＳＧ−１細胞Ａ及びＢをそれぞれ継代した。
Ａは酵素（トリプシン−ＥＤＴＡ）に浸して細胞を剥離させ、ＢはＰＢＳに浸して細胞を剥離させた。剥離操作の際に酵素又はＰＢＳに浸漬する時間を変えて、細胞が受けたダメージを調べた。剥離させたそれぞれの細胞を遠心分離器で剥離液から分離抽出し、新しいＴＣフラスコに播種した。細胞はＴＣフラスコ底面に接着し、増殖を開始した。
剥離前の細胞数と、播種後の細胞数を数えて生存率を求め、図１に示した。
酵素で剥離させた場合、３０分後で生存率が１０％以下であるのに対し、ＰＢＳでは９０％以上を示し，ダメージを与えることなく剥離できることが確認された。

カサゴ細胞に関する研究の進展を促進することができ、カサゴの生態解明やカサゴの養殖の実現に有効であり、食料としての利用性も向上できる。また、カサゴ由来のコラーゲンなど、有用物質の生産も可能になる。

剥離の際におけるＫＳＧ−１の生存率を示すグラフである。

Claims

カサゴ目フサカサゴ科カサゴ属カサゴの尾ヒレ由来の繊維芽様細胞であることを特徴とする細胞株。
リン酸緩衝食塩水で、培養容器壁から剥離可能であることを特徴とする請求項１に記載の細胞株。