JP2008197108A - オリゴマープローブアレイ - Google Patents

Abstract

【課題】反応収率が向上し、プローブと標的分子とのハイブリダイゼーション反応によるハイブリダイゼーションのシグナルの検出感度を上げることができるオリゴマープローブアレイを提供する。
【解決手段】基板と、前記基板上の固定化層と、前記固定化層にカップリングして光結晶構造を形成するナノ粒子と、前記ナノ粒子とカップリングするオリゴマープローブと、を含むオリゴマープローブアレイであって、前記固定化層は、前記ナノ粒子がカップリングする複数のプローブセル領域を含み、前記プローブセル領域はプローブセル分離領域によって離隔されてなる、オリゴマープローブアレイである。
【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、オリゴマープローブアレイ及びその製造方法に関し、より詳しくは、反応収率を上げて、プローブと標的分子とのハイブリダイゼーション反応によるハイブリダイゼーションのシグナルの検出感度を上げることができるオリゴマープローブアレイ及びその製造方法に関する。

最近、ゲノムプロジェクトが発展し、多様な生物のゲノムヌクレオチド配列が明らかになるにつれて、バイオポリマーマイクロチップ、なかでもオリゴマープローブアレイに関する関心が高まっている。オリゴマープローブアレイは、遺伝子発現分析、遺伝子型分析、ＳＮＰのような突然変異及び多型の検出、蛋白質及びペプチド分析、潜在的な薬のスクリーニング、並びに新薬の開発及び製造などに広く使用されている。

このようなオリゴマープローブアレイを開発するためには、生体物質とシリコンのような半導体との分子結合を効率的に実現させ、生体物質に固有の機能を効果的に利用できるようにすることが重要である。特にＤＮＡチップや蛋白質チップなどのようなオリゴマープローブアレイでは、関連する生体物質をマイクロメータースケールの制限された領域に固定化させるのが何より重要である。

オリゴマープローブアレイを使用して分析しようとする遺伝情報の形態が、遺伝子からＤＮＡの最小構成単位であるヌクレオチド水準まで多様化することによって、プローブセルのデザインルールが数十μｍから数μｍ以下へと減少している。したがって、オリゴマープローブアレイは反応収率が向上する方向に高集積化されることが要求され、これに応えるための新たな生体物質を固定化する方法が摸索されている。

それだけでなく、オリゴマープローブアレイを使用した標的サンプルとのハイブリダイゼーション後の検出感度（蛍光強度）を上げるための方法も摸索されている。従来のオリゴマープローブアレイの場合、たいてい標的サンプル（例えば、ＤＮＡ）に蛍光物質を標識し、これをオリゴマープローブアレイ上のオリゴマープローブとハイブリダイズさせた後、共焦点顕微鏡やＣＣＤカメラを使用して、マイクロアレイ表面に残っている蛍光物質から発散される蛍光シグナル（蛍光強度）を検出する。

このような光学的検出方法において共焦点顕微鏡を使用する場合、解像度に優れるものの、検出時間が比較的長くなる。その反面、ＣＣＤカメラを使用する場合、検出速度は大きいものの、解像度が多少落ちる。したがって、ハイブリダイゼーションのシグナルを検出する際、比較的高価な共焦点類型のスキャナーのみならず、比較的低価でかつ検出速度の大きいＣＣＤ類型のスキャナーでも検出可能にするために、標的ＤＮＡに付着する蛍光物質の量を増加させるための多様な研究が行われている。なお、本明細書における蛍光強度の測定方法や条件については、後述の実施例において詳説する。

前記光学的検出方法においては、少量のハイブリダイゼーションシグナルを検出し難く、また、スポット周辺で発生する背景シグナルに起因するノイズ（ＳＮＲ：ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｎｏｉｓｅ）によって、ハイブリダイゼーションのシグナルを正確に検出するのも困難である。例えば、ビオチン−ストレプトアビジンを利用したシグナル増幅法がある（特許文献１）。
特開２００４−３１７３１４号公報

しかしながら、上記シグナル増幅法は、蛍光標識の個数を増加させることによって、全般的な蛍光の強度を増加させることはできるものの、化学的反応過程でのノイズも増加しうるという問題があった。

そこで本発明の目的は、反応収率と検出感度とを同時に向上させうるオリゴマープローブアレイを提供することである。

また、本発明の他の目的は、基板上に前記のようなオリゴマープローブアレイの製造方法を提供することである。

上記目的を達成するための本発明は、基板と、前記基板上の固定化層と、前記固定化層にカップリングして光結晶構造を形成するナノ粒子と、前記ナノ粒子とカップリングするオリゴマープローブとを含むオリゴマープローブアレイであって、前記固定化層は、前記ナノ粒子がカップリングする複数のプローブセル領域を含み、前記プローブセル領域はプローブセル分離領域によって離隔されてなるオリゴマープローブアレイである。

上記目的を達成するための本発明のオリゴマープローブアレイの製造方法は、基板を提供する段階と、前記基板上に固定化層を形成する段階と、前記固定化層にナノ粒子をカップリングして光結晶構造を形成する段階と、前記ナノ粒子にオリゴマープローブをカップリングする段階とを含む製造方法であって、前記固定化層は、前記ナノ粒子がカップリングする複数のプローブセル領域を含み、前記プローブセル領域はプローブセル分離領域によって離隔されてなる。

本発明のオリゴマープローブアレイによれば、ナノ粒子を固定化層に固定して反応収率を向上させることができる。さらに、ナノ粒子によって形成された光結晶構造によって、標的分子のハイブリダイゼーション反応による検出感度を顕著に上げることもできる。

以下、添付した図面を参照し、本発明による最良の実施形態を説明する。なお、本発明の利点及び特徴、並びにそれらを達成する方法は、添付する図面とともに、後述する実施形態を参照することにより明確になる。しかし、本発明の目的は、以下に開示される実施形態に限定されず、相異なる多様な形態によっても達成可能である。したがって、以下の
実施形態は単に、本発明の開示を十全たるものとし、当業者に本発明の範囲を認識させるために提供するものである。すなわち、本発明の範囲はあくまで、請求項に記載された発明によってのみ規定される。なお、いくつかの実施形態において、公知の工程、段階、構造及び技術は、本発明が不明瞭に解釈されるのを避けるために、説明を省略する。

また、本明細書に記載された実施形態は、本発明の例示的な断面図及び／または概略図を参照しつつ説明される。ここで、製造技術及び／または許容しうる誤差などによって例示的な図の形態は変形しうる。したがって、以下の実施形態は、文言通りの特定の形態に制限されず、様々に変形された形態も含みうる。また、本明細書に示された各図面における各構成要素は、説明の便宜上、拡大または縮小して示す場合もある。以下、添付する図面を参照しつつ、本発明のいくつかの実施形態によるオリゴマープローブアレイについて説明する。

＜第１実施形態＞
まず、図１Ａ〜図１Ｅを参照しながら、本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００について説明する。

図１Ａは、本実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図であり、図１Ｂは、図１Ａの配置図をＡ−Ａ’方向に切断した断面図である。図１Ｃ及び図１Ｄは、他のナノ粒子によって形成された光結晶構造を示すプローブセル領域の部分図（部分平面図）である。図１Ｅは、蛍光物質で標識された標的分子とカップリングするオリゴマープローブアレイの断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００は、基板１１０と、基板上の固定化層１２０と、固定化層１２０にカップリングして光結晶構造２００、２０１を形成するナノ粒子１４０と、ナノ粒子１４０とカップリングするオリゴマープローブ１６５とを含むオリゴマープローブアレイであって、固定化層１２０は、ナノ粒子１４０がカップリングする複数のプローブセル領域Ａを含み、プローブセル領域Ａはプローブセル分離領域Ｂによって離隔されてなる。

図１Ａを参照すると、複数のプローブセル領域パターン１が、行方向及び列方向へとマトリックス状に配列されている。具体的に、複数のプローブセル領域パターン１は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に沿って、各々第１ピッチＰｘ及び第２ピッチＰｙ中に配列される。図１Ａでは、第１ピッチＰｘ及び第２ピッチＰｙの各ピッチが等しく示されているが、異なっていてもよい。なお、以下では、プローブセル領域パターンを「セルアクティブパターン」ともいう。

まず、基板１１０について説明する。基板１１０は可撓性または剛性の基板でありうる。可撓性基板として、以下に限定されることはないが、例えば、ナイロンまたはニトロセルロース製のメンブレンまたはプラスチックフィルムなどが挙げられる。また、剛性基板として、以下に限定されることはないが、例えば、シリコン基板、ソーダ石灰ガラス製の透明ガラス基板などが挙げられる。好ましくは、シリコンまたはガラスである。かかる場合、強度が高くなって、移動や使用の際の利便性が向上しうる。シリコン基板または透明ガラス基板を用いた場合、ハイブリダイゼーション過程を通じて、非特異的な結合はほとんど生じないからである。また、シリコン基板または透明ガラス基板を用いると、半導体素子の製造工程またはＬＣＤパネルの製造工程などで既に安定的に確立されて採用されている、多様な薄膜の製造工程及び写真エッチング工程などがそのまま利用できるという利点もある。

次に、固定化層１２０について説明する。固定化層１２０は基板１１０上に存在し、ナノ粒子１４０とカップリングする複数のプローブセル領域Ａに含まれ、プローブセル領域Ａはプローブセル分離領域Ｂにより離隔される。プローブセル領域Ａは、固定化層１２０でナノ粒子１４０とカップリングできるように、ナノ粒子１４０の表面に官能基を含みうる。すなわち、ナノ粒子１４０がその表面に官能基を有することにより、ナノ粒子１４０におけるカップリングが好適に行われうる。なお、本明細書における「プローブセル領域」とは、少なくとも基板、固定化層、ナノ粒子及びオリゴマープローブを含む領域を意味するが、説明の便宜上、上記した全ての要素を含まない、いわば「途中段階」のものもプローブセル領域として指称する。また、本明細書における「プローブセル分離領域」とは、少なくとも基板を含む、前記プローブセル領域以外の領域を指称する。

各プローブセル領域Ａは、プローブセル分離領域Ｂを基準として互いに離隔されている。同じ配列のオリゴマープローブ１６５が、ナノ粒子１４０を介して、一のプローブセル領域Ａとカップリングされうる。なお、図面において、「ＰＲＯＢＥ」に付された番号は、同じ番号を有するもの同士が同じ配列からなることを意味する。異なるプローブセル領域Ａには、異なる同一配列のオリゴマープローブ１６５とカップリングしたナノ粒子１４０が存在しうる。プローブセル領域Ａの表面に残った官能基は、キャッピング基１５５によって不活性となりうる。キャッピングの例として、アセチル化などが挙げられる。

固定化層１２０は、ハイブリダイゼーション分析の条件、例えばｐＨ６〜９のリン酸またはＴｒｉｓバッファーと接触する際に加水分解されず、実質的に安定な物質で形成されるのが好ましい。具体的には、固定化層１２０は、ＰＥ−ＴＥＯＳ膜（絶縁膜）、高密度プラズマ（ＨＤＰ）酸化膜、Ｐ−ＳｉＨ_４酸化膜及び熱酸化膜などのシリコン酸化膜、ハフニウムシリケート及びジルコニウムシリケートなどのシリケート、シリコン酸窒化膜、ハフニウム酸窒化膜及びジルコニウム酸窒化膜などの金属酸窒化膜、チタニウム酸化膜、タンタル酸化膜、アルミニウム酸化膜、ハフニウム酸化膜、ジルコニウム酸化膜及びインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）膜などの金属酸化膜、ポリイミド、ポリアミン、並びに金、銀、銅及びパラジウムなどの金属、並びにポリスチレン、ポリアクリル酸及びポリビニルなどのポリマーよりなる群から選択される一種以上の物質で形成可能である。なかでも好ましくは、シリコン酸化物及びチタニウム酸化物よりなる群から選択される一種以上の物質である。かかる物質は、半導体またはＬＣＤを製造する際に特に安定であり、製造工程上、好適であるためである。

プローブセル領域Ａは、固定化層１２０でナノ粒子１４０とカップリングする。ここで、固定化層１２０を形成する物質とナノ粒子１４０の表面に形成されうる官能基とについて説明する。

固定化層１２０がシリコン酸化膜、シリケートまたはシリコン酸窒化膜からなる場合、ナノ粒子１４０における官能基は、固定化層１２０表面のシラノール基（−Ｓｉ（ＯＨ））と反応してシロキサン（Ｓｉ−Ｏ）結合を生成しうるシリコン系の基を含みうる。シリコン系の基として、例えば、−Ｓｉ（ＯＭｅ）_３、−ＳｉＭｅ（ＯＭｅ）_２、−ＳｉＭｅＣｌ_２、−ＳｉＭｅ（ＯＥｔ）_２、−ＳｉＣｌ_３、−Ｓｉ（ＯＥｔ）_３基が挙げられる。シロキサン結合を生成しうるシリコン系の基を含む物質としては、Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）−プロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピル−トリエトキシシラン、アセトキシプロピル−トリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、国際公開第００／０２１９６７号パンフレットに開示されたシリコン化合物などが挙げられ、前記国際公開の内容は、参照により本明細書に採用されうる。

固定化層１２０が金属酸化膜からなる場合、ナノ粒子１４０のカップリング基は、金属アルコキシドまたはカルボン酸金属塩の基を含みうる。

固定化層１２０がシリコン窒化膜、シリコン酸窒化膜、金属酸窒化膜、ポリイミドまたはポリアミンなどからなる場合、ナノ粒子１４０のカップリング基は無水物、塩酸、アルキルハロゲン化物またはクロロ炭酸塩の基を含みうる。

固定化層１２０が金属からなる場合、ナノ粒子１４０のカップリング基は硫化物、セレン化物、ヒ化物、テルル化物またはアンチモン化物の基を含みうる。

固定化層１２０がポリマーからなる場合、ナノ粒子１４０のカップリング基はアクリル基、スチリル基またはビニル基を含みうる。

プローブセル分離領域Ｂは、プローブセル領域Ａを包囲し、ナノ粒子１４０とカップリングしない不活性化領域１３０を含む。本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００では、プローブセル分離領域Ｂにおいて、基板１１０の表面が露出している。その結果、プローブセル分離領域Ｂにおける、好ましくないナノ粒子１４０のカップリングを防止できるため、オリゴマープローブ１６５のカップリングに起因した、所望でないノイズをほとんど生じない。

プローブセル領域Ａにおいて、固定化層１２０にカップリングして光結晶構造を形成するナノ粒子１４０について説明する。

ナノ粒子１４０は、サイズの点で、実質的にナノメートルレベルの範囲内に属する小さな粒子でありうる。ナノ粒子１４０は、オリゴマープローブ１６５と標的分子１７０とのハイブリダイゼーションのための空間マージンを提供し、光結晶構造２００、２０１を形成ししうる。そして、光結晶構造２００、２０１は、オリゴマープローブ１６５とハイブリダイズする標的分子１７０に付着された蛍光物質１８０から放出される光の波長を増幅させることができる。

ナノ粒子１４０は、オリゴマープローブ１６５と標的分子１７０とのハイブリダイゼーションのための空間マージンを提供する、リンカーまたはスペーサーを介しうる。すなわち、ナノ粒子１４０は、リンカーまたはスペーサーを介してオリゴマープローブ１６５と表面でカップリングしてもよい。オリゴマープローブ１６５は、固定化層１２０と直接カップリングしてもよいが、ナノ粒子１４０を介してカップリングすることによって、以後、標的分子１７０とのハイブリダイゼーションを容易にすることができる。

その際、ナノ粒子１４０は、リンカー１５０とカップリングするように構成された官能基を表面に含むことが好ましい。また、ナノ粒子１４０は、表面に固定化層１２０及びオリゴマープローブ１６５とカップリングするように構成された官能基を含むことがより好ましい。具体的にいえば、ナノ粒子１４０は、固定化層１２０のプローブセル領域Ａとカップリングできる官能基と、リンカー１５０を介する場合にリンカー１５０とカップリングできる官能基と、リンカーを介しない場合にオリゴマープローブ１６５とカップリングできる官能基とを、ナノ粒子１４０の表面に有しうる。これら３つの官能基は、全て同一であってもよく、それぞれ異なっていてもよい。ここで、本明細書における官能基の例として、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、ハロ基またはスルホン酸基などが挙げられるが、これらに制限されることはない。

ナノ粒子１４０とプローブセル領域Ａ（固定化層１２０）とのカップリングは、共有結合によるものとなりうる。したがって、静電気的な力や毛細管力を利用した場合よりも強固な結合力で、ナノ粒子１４０を固定化層１２０、すなわちプローブセル領域Ａに固定させることができる。ナノ粒子１４０がカップリングされる場合、ナノ粒子１４０の官能基がエーテル結合、エステル結合またはアミドペプチド結合など、結合の種類が異なれば、得られる構造が変化するのは、当業者にとって自明なことである。ナノ粒子１４０の表面に残った官能基は、キャッピング基１５５によって、不活性となるようにキャッピングされてもよい。キャッピングの例として、アセチル化などが挙げられる。

ナノ粒子１４０は、それ自体がリンカーなどの役割を果たすこともできるが、別途のリンカー１５０またはスペーサーを介してオリゴマープローブ１６５とカップリングすることもできる。その際のリンカー１５０またはスペーサーは、ナノ粒子１４０とオリゴマープローブ１６５とに同時にカップリングできる官能基を含みうる。リンカー１５０の一端はナノ粒子１４０とカップリングし、リンカー１５０のもう一方の端はオリゴマープローブ１６５とカップリングする。リンカー１５０は、オリゴマープローブアレイ１００が標的サンプルと自由に相互作用するように、例えばハイブリダイゼーションが起こるような空間マージンを提供しうる。したがって、リンカー１５０の分子は、オリゴマープローブ１６５と標的サンプルとの間の自由な相互作用を可能にするための十分な長さ、例えば４〜５０ａｔｏｍｓを有しうる。ハイブリダイゼーションのための空間マージンがもともと十分に確保されている場合、リンカー１５０が不要となりうることはいうまでもない。なお、リンカー１５０には、以下に限定されることはないが、γ−アミノプロピルトリエトキシシランまたはγ−アミノプロピルトリメトキシシランが使用可能であり、好ましくはγ−アミノプロピルトリエトキシシランである。また、スペーサーには、以下に限定されることはないが、ＮＰＰＯＣ−トリエチレングリコールカルボキシ酸、ＮＰＰＯＣ−ヘクサエチレングリコールカルボキシ酸またはＮＰＰＯＣ−オクタエチレングリコールカルボキシ酸が使用可能であり、好ましくはＮＰＰＯＣ−ヘクサエチレングリコールカルボキシ酸である。上記した材料を使用する場合、固体表面の反応効率が向上しうる。

一方、オリゴヌクレオチド自体をリンカー１５０として用いてもよい。ナノ粒子１４０の官能基と最初に結合する１〜５ｍｅｒ程度の核酸がハイブリダイズしないように処理されて空間マージンを確保する目的で、オリゴヌクレオチドを使用できる。但し、リンカー１５０として使用するオリゴヌクレオチドの長さが１〜５ｍｅｒに制限されることはなく、上記目的を達成可能な長さであればよい。

リンカー１５０の表面に残った官能基は、キャッピング基１５５によって不活性となるようにキャッピングされたものでありうる。所望のカップリングを完了した後、残った官能基はキャッピング基１５５により不活性化される。キャッピングの例として、アセチル化などが挙げられる。

ナノ粒子１４０は固定化層１２０（プローブセル領域Ａ）にカップリングして光結晶構造を形成する。換言すれば、かかる場合、プローブセル領域Ａは光結晶構造を有する。

光結晶構造２００、２０１とは、屈折率または誘電率の互いに異なる２種以上の物質が規則的に配列されて、特定の周波数または波長を有する電磁気波が光結晶構造２００、２０１の内部に伝播するのを防ぐ光バンドギャップを形成しうる構造をいう。光バンドギャップが形成される光結晶構造２００、２０１は、特定波長の光のみを反射または透過させて、増幅・減少させることができる光フィルターとしての機能を発揮することができる。

光結晶構造２００、２０１はナノ粒子１４０によって形成される。ナノ粒子１４０は、図１Ｂでは球状で示しているが、かかる形状に制限されず、楕円状、くさび状、ストライプ状などの多様な形状を有しうる。ナノ粒子１４０により形成される光結晶構造には、面心立方構造、ダイヤモンド、逆オパール構造などがありうる。

光結晶構造２００、２０１において光の伝達がなされる原理は、ブラッグ（Ｂｒａｇｇ）によって明らかになった周期的な原子配列によってＸ線が散乱する方式に類似している（ブラッグ条件は、ｄｓｉｎθ＝ｎλ／２であって、θは入射角、λは波長、ｄは原子間の距離、ｎは整数である）。すなわち、光が光結晶構造２００、２０１に接すると、所定波長領域の光は第１誘電体の表面で反射し、その他の波長領域の光は光結晶構造２００、２０１内の第２誘電体を透過する。その際、光結晶構造２００、２０１を透過できずに反射される光の波長領域を光バンドギャップという。一般的に、光結晶構造２００、２０１は、第１誘電体と第２誘電体との屈折率の差が大きいほど広い光バンドギャップを有する。すなわち、制御しうる光の領域が広くなる。ナノ粒子１４０同士の間に供給される上記した２つの誘電体として、空気、水、バッファー及び有機・無機誘電体よりなる群から選択される一種以上を使用することができる。前記２つの誘電体の種類は同一であっても異なっていてもよい。

ナノ粒子１４０のサイズ及び誘電率によって、光結晶構造２００、２０１のエネルギーバンドギャップが異なりうる。ナノ粒子１４０は、以下に制限されることはないが、球状のポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート共重合体、シリカ、ガラス、マグネット、ワング樹脂、メリフィールド樹脂、金属、プラスチック、セルロース、セファデックス及びセファロースよりなる群から選択される一種以上から形成されてなることが好ましい。また、ナノ粒子１４０はシリカ及びポリスチレンよりなる群から選択される一種以上から形成されてなることがより好ましい。上記した材料を使用した場合、粒子の大きさを調節するのが容易となりうる。ナノ粒子１４０は、その誘電率が１〜１６のものを使用することが好ましく、１．０〜４．０のものを使用することがより好ましく、１．０〜２．５のものを使用することが特に好ましい。上記した範囲内の場合、屈折率の調節が容易となりうる。また、ナノ粒子１４０は、無機物質または有機高分子を含んでもよい。ここで、前記無機物質には、シリコン、ポリシリコン、金属、シリコン酸化物またはシリコン窒化物などが含まれ、前記有機高分子には、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンまたはポリジメチルシロキサンなどが含まれうる。

図１Ｃに示すように、ナノ粒子１４０によって形成される光結晶構造２００は、自己組織化単分子膜形態を採りうる。換言すれば、ナノ粒子１４０は自己組織化によって配列されてなることができる。この場合、ナノ粒子１４０の中心から中心までの距離はナノ粒子１４０の平均粒径と一致するため、ナノ粒子１４０の平均粒径はλ／２に該当しうる（但し、λは蛍光物質から放出される光の波長である）。ナノ粒子１４０は球状粒子であることが好ましく、その際の平均粒径は１００〜１，０００ｎｍであることが好ましく、２００〜３００ｎｍであることがより好ましく、１５０〜２５０ｎｍであることが特に好ましい。上記した範囲内の場合、屈折率の調節が容易となりうる。なお、本明細書における「平均粒径」の測定方法として、ダイナミックライトスキャッタリング（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を採用する。

図１Ｄに示すように、ナノ粒子１４０は一定間隔で配列されてもよい。この場合、ナノ粒子１４０の中心から中心までの距離はλ／２に該当しうる（但し、λは蛍光物質から放出される光の波長である）。一のナノ粒子の中心から、隣接する他のナノ粒子の中心までの距離は、１００〜１，０００ｎｍであることが好ましく、１５０〜３００ｎｍであることがより好ましく、２００〜２５０ｎｍであることが特に好ましい。上記した範囲内の場合、屈折率の調節が容易となりうる。

次に、ナノ粒子１４０とカップリングするオリゴマープローブ１６５について説明する。

オリゴマープローブ１６５は、共有結合した２つ以上のモノマーからなるポリマーであって、モノマーの重量平均分子量は、特に限定されることはないが、約１０００以下であることが好ましく、９００以下であることがより好ましく、６００〜８００であることが特に好ましい。上記した範囲内の場合、反応効率が向上しうる。別の観点から見ると、オリゴマープローブ１６５におけるオリゴマーを構成するモノマー数は、特に限定されることはないものの、好ましくは約２〜５００個、より好ましくは５〜６０個、特に好ましくは２５〜６０個のモノマーを含みうる。前記モノマーの種類としては、オリゴマープローブアレイに固定されるプローブの種類により、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸及びペプチドなどが挙げられる。

オリゴマープローブ１６５は、リンカーを介する場合、リンカー１５０にカップリングしている官能基１５２とカップリングし、リンカー１５０はナノ粒子１４０を介してプローブセル領域Ａ中の固定化層１２０に連結する。オリゴマープローブ１６５は、リンカーを介しない場合には、ナノ粒子１４０と直接カップリングし、ナノ粒子１４０がプローブセル領域Ａ中の固定化層１２０に固定される。

ヌクレオシド及びヌクレオチドは、公知のプリン塩基またはピリミジン塩基だけでなく、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジンなどを含んでもよい。また、ヌクレオシド及びヌクレオチドは、公知のリボース糖またはジオキシリボース糖だけでなく、一以上のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族で置換されたり、エーテルやアミンなどの官能基が結合した改変された糖を含んでもよい。

アミノ酸は、天然に発見される、Ｌ−、Ｄ−、及び非キラル型のアミノ酸だけでなく、改変アミノ酸、またはアミノ酸のアナログなどであってもよい。

ペプチドとは、アミノ酸のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合によって生成された化合物をいう。

オリゴマープローブ１６５は、２つ以上のヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸またはペプチドなどからなりうる。

以上が、本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００についての説明である。以下では、図１Ｅを参照しつつ、本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００において、ナノ粒子１４０により形成される光結晶構造２００、２０１によって検出感度（強度）が増大することについて説明する。

標的分子１７０とは、オリゴマープローブアレイ１００を使用して分析しようとする生体試料をいう。標的分子１７０として、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質などがありうるが、これらに限定されることはない。

蛍光物質１８０は、標的分子１７０に付着されて、標的分子１７０とオリゴマープローブ１６５とのハイブリダイゼーション反応後の光学的検出方法に使用される。蛍光物質１８０は、ローダミン２００、カルシウムグリーン、シアニン２、シアニン３、シアニン５、マグネシウムグリーン、テトラメチルローダミンまたはフルオレセインなどから選択できるが、これらに限定されることはない。例えば、標的分子１７０とオリゴマープローブ１６５との間での結合反応の有無を確認するために、シアニン３またはシアニン５などの蛍光物質１８０を利用することができる。

例えば、標的分子１７０に付着される蛍光物質１８０としてシアニン３を使用する場合、光を受けて放出する波長は５７０ｎｍであるため、第１誘電体及び第２誘電体が形成する光結晶構造の周期は２８５ｎｍとなる。したがって、図１Ｃに示すような光結晶構造２００を有するナノ粒子１４０の場合、その平均粒径が約２８５ｎｍとなり、図１Ｄに示すような光結晶構造２０１を有するナノ粒子１４０の場合、そのナノ粒子の中心から、隣接する他のナノ粒子１４０の中心までの距離が２８５ｎｍとなりうる。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００は、以後、標的分子１７０の検出に使用できる。オリゴマープローブアレイ１００上に、分析しようとする標的分子１７０を供試してハイブリダイズさせる。オリゴマープローブアレイ１００上のどの位置でどの程度のハイブリダイゼーションが起こったかを検出することにより、標的分子１７０を分析することができる。ハイブリダイゼーションの強度は、主に、蛍光物質１８０で標識された標的分子１７０をプローブ１６５とハイブリダイズさせた後、蛍光物質１８０から発散されるシグナルを検出するという光学的方法により解析される。蛍光物質１８０から発生した蛍光シグナルは、光結晶構造２００、２０１を通過して、特定の波長領域の光を吸収することなく透過及び／または反射させる。すなわち、光結晶構造２００、２０１は、特定の波長にエネルギーバンドギャップを有するため、このような蛍光シグナルがエネルギーバンドギャップ領域内に存在する場合、内部反射効率が増大して蛍光シグナルを増幅しうる。したがって、本実施形態によれば、ＣＣＤなどを用いて、蛍光物質１８０から放出される光の波長を検出する際、ビオチン−ストレプトアビジンを利用したシグナル増幅などが不要となる。ビオチン−ストレプトアビジンのようにバイオアフィニティーを利用したシグナル増幅は、反応や洗浄などの工程を何回も要求するため、化学的ノイズが増加する。しかし、光結晶構造２００、２０１を利用したシグナル増幅の場合、このような化学的ノイズの増加を心配する必要がない。

以下、図面を参照しつつ、本発明の第２〜第６実施形態によるオリゴマープローブアレイを説明する。以下、便宜上、図面に示す各部材と同じ機能を有する部材は同じ符号で示し、重複した説明は省略することとする。

＜第２実施形態＞
図１Ｆを参照しつつ、本発明の第２実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０１について説明する。図１Ｆは本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０１の断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０１は、ナノ粒子１４０によって形成された２次元の光結晶構造を有する。２次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１０１では、１次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１００よりも正確なシグナルが得られ、検出感度を上げることができる。ここで、本明細書における「２次元の光結晶構造」とは、１次元の「平面的な」光結晶構造と比較して、ナノ粒子が高さ方向に積み上げられて構成される構造を意味する。

図示していないが、光結晶構造は、２次元の光結晶構造より３次元の光結晶構造の方がシグナルの増幅が大きくなりうる。したがって、化学的ノイズの増加の虞が一層低減し、検出感度をさらに上げることができる。

＜第３実施形態＞
次に、図２Ａを参照しつつ、本発明の第３実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０２を説明する。図２Ａは本実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。

より具体的に説明すれば、基板１１０上に形成された固定化層１２１は、複数のナノ粒子１４０とカップリングした、複数の活性化プローブセル領域Ｃと、活性化プローブセル領域Ｃを囲み、かつナノ粒子１４０とカップリングしていない、不活性化プローブセル分離領域Ｄとを含む。このように、活性化プローブセル領域Ｃはナノ粒子１４０とカップリングしうる。

機能の点でいえば、活性化プローブセル領域Ｃは、図１Ｂのプローブセル領域Ａについて説明した内容と実質的に同一であり、不活性化プローブセル分離領域Ｄは、図１Ｂのプローブセル分離領域Ｂについて説明した内容と実質的に同一である。

但し、不活性化プローブセル分離領域Ｄは、図１Ｂにおけるプローブセル分離領域Ｂとは異なり、固定化層１２０ではなく離隔のない固定化層１２１を含むので、固定化層１２１の表面の官能基がプローブセル分離領域Ｄの表面上に存在してもよい。そのため、前記官能基の作用を防ぐことが必要となる。不活性化プローブセル分離領域Ｄの官能基は、キャッピング基１５５によって、不活性となるようにキャッピングされてもよい。

＜第４実施形態＞
図２Ｂを参照しつつ、本発明の第４実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０３について説明する。図２Ｂは本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０３の断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０３は、ナノ粒子１４０によって形成される２次元の光結晶構造を有する点で、上記第３実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０２と異なる。２次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１０３では、１次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１０２よりも正確なシグナルが得られ、検出感度を上げることができる。

図示していないが、ナノ粒子１４０によって形成される光結晶構造は３次元形態でありえ、３次元の光結晶構造は２次元の光結晶構造より検出感度が高くなりうる。その結果については上述した通りである。

＜第５実施形態＞
次に、図３Ａ及び図３Ｂを参照しつつ、本発明の第５実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０４を説明する。図３Ａは本実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図であり、図３Ｂは本実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。

図３Ａを参照すると、複数のプローブセル領域パターン１が、行方向及び列方向へとマトリックス状に配列されている。具体的に、複数のプローブセル領域パターン１は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に沿って、各々第１ピッチＰｘ及び第２ピッチＰｙ中に配列される。図３Ａには、第１ピッチＰｘと第２ピッチＰｙの各ピッチが等しく示されているが、異なっていてもよい。セルアクティブパターン１内に、セルアクティブパターン１の表面が３次元となるようにするための複数の溝パターン２が配列される。図面では、溝パターン２を正方形に示しているが、長方形、円形、半円形など多様な形態に代替してもよい。また、溝パターン２は、セルアクティブパターン１を一方向に横切るラインパターン、またはＸ軸方向及びＹ軸方向に延長した交差ラインパターンのいずれであってもよい。

図３Ｂを参照すると、本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０４のうち、固定化層１２２上に形成されたプローブセル領域Ａ’の表面が３次元である点が、本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００のうち、プローブセル領域Ａの表面が１次元である点と異なる。ここで、「３次元の表面」とは、プローブセル領域Ａ’内に形成された一以上の溝Ｇなどによって、プローブセル領域Ａ’の表面が３次元構造を有することをいう。３次元構造を有する構造であれば、溝Ｇの適用に限定されることはない。このような３次元の表面は、ナノ粒子１４０とのカップリングが可能な表面積を増大させて、オリゴマープローブ１６５とのカップリングが可能な領域を増大させ、結果的に検出感度を増大させうる。

図示していないが、一以上の溝Ｇを有する、固定化層１２２の３次元パターン自体が、光結晶構造を形成することもできる。例えば、光結晶構造を形成する２つの誘電体のうちの１つを、固定化層１２２を構成する誘電体にし、もう１つを空気にすることができる。但し、光結晶構造を形成するためには、固定化層１２２のパターンが周期的に配列されていなければならない。具体的に、空気が占める溝Ｇの幅、及び、互いに隣接する溝同士の間の間隔は、各々λ／４でありうる。なお、前記誘電体として、空気層、水または有機・無機誘電体が挙げられる。

＜第６実施形態＞
次に、図４Ａ及び図４Ｂを参照しつつ、本発明の第６実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０５を説明する。図４Ａは本実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図であり、図４Ｂは本実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。

図４Ａを参照すると、複数のプローブセル領域パターン１が、行方向及び列方向へとマトリックス状に配列されている。具体的に、複数のプローブセル領域パターン１は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に沿って、各々第１ピッチＰｘ及び第２ピッチＰｙ中に配列される。図４Ａでは、第１ピッチＰｘ及び第２ピッチＰｙの各ピッチが等しく示されているが、異なっていてもよい。セルアクティブパターン３内には、セルアクティブパターン３が光結晶構造となるように、２つの誘電体１２３ａ、１２３ｂを交互に配列することができる。２つの誘電体は１次元的に配列されてもよく、また、２次元、３次元的に配列されてもよい。

図４Ｂを参照すると、本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０５のうち、固定化層１２３上に形成されたプローブセル領域Ｅそれ自体が光結晶構造である点で、上記第１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００の場合と異なる。ナノ粒子１４０により光結晶構造２００、２０１を形成するだけでなく、固定化層１２３により光結晶構造を形成することによって、検出感度を上げることができる。

基板１１０上の固定化層１２３は、第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂを用いて形成された光結晶層からなる。光結晶層は、第１誘電体１２３ａと第２誘電体１２３ｂとが第１方向に交互に配列された、ストライプ状の層からなる。１次元の光結晶構造は一の光結晶層からなる。例えば、光結晶層を構成する第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂの各々の幅は、蛍光物質１８０から放出される光の波長の実質的に１／４でありうる。

第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂは、互いに異なる屈折率を有する誘電体からなる。第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂは、例えば、無機物質または有機高分子で構成されうる。ここで、前記無機物質は、シリコン、ポリシリコン、金属、シリコン酸化物またはシリコン窒化物などを含み、前記有機高分子は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンまたはポリジメチルシロキサンなどを含みうる。

＜第７実施形態＞
図４Ｃを参照しつつ、本発明の第７実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０６を説明する。図４Ｃは本実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０６は、固定化層１２３’によって形成される光結晶構造が２次元構造である点で、上記第６実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０５の場合と異なる。２次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１０６では、１次元の光結晶構造を有するオリゴマープローブアレイ１０５よりも正確なシグナルが得られ、検出感度を上げることができる。第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂは、交互に平行方向に配列される。図４Ｃには２層構造が示されているが、これに制限されることなく、より多くの光結晶層が積層された構造であってもよい。

＜第８実施形態＞
図４Ｄを参照しつつ、本発明の第８実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０７を説明する。固定化層１２３が３次元の光結晶構造１２３”である。光結晶層を多層に積層する点では、２次元の光結晶構造と実質的に同一である。しかし、２次元の光結晶構造と比べ、３次元の光結晶構造は、ｎ番目（但し、ｎは自然数）の光結晶層とｎ＋１番目の光結晶層とがそれぞれ、互いに垂直方向に配列されてなる第１誘電体１２３ａと、互いに垂直方向に配列されてなり第１誘電体１２３ａと交互に存在する第２誘電体１２３ｂとを有する点で相違する。したがって、ある光結晶層は、直前の光結晶層に対して垂直方向に配置する。そして、各光結晶層を構成する各誘電体１２３ａ、１２３ｂは、互いに垂直方向に配列され、ｎ番目の光結晶層及びｎ＋１番目の光結晶層を構成する同一の誘電体が１つおきに配列されうる。これにより、３次元の光結晶構造１２３”は、２次元の光結晶構造１２３’よりも検出感度が高くなりうる。

［製造方法］
以下、図５Ａ〜図５Ｉ、及び図１Ａ〜図１Ｆを参照しつつ、図１Ｂに示された本発明の上記第１実施形態であるオリゴマープローブアレイの製造方法について説明する（第９実施形態）。

＜第９実施形態＞
図５Ａ〜図５Ｉは、本発明の第９実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における様々な段階での中間構造物の断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法は、基板１１０上に固定化層１２０を形成し、固定化層１２０にナノ粒子１４０をカップリングして光結晶構造２００、２０１を形成し、ナノ粒子１４０にオリゴマープローブ１６５をカップリングすることを含む。ここで、固定化層１２０は、ナノ粒子１４０がカップリングされる複数のプローブセル領域Ａを含み、プローブセル領域Ａはプローブセル分離領域Ｂによって離隔される。

図１、図５Ａ及び図５Ｂを参照すると、まず基板１１０上に固定化層１２０ａを形成する。固定化層１２０ａの例として、ＰＥ−ＴＥＯＳ膜、ＨＤＰ酸化膜、Ｐ−ＳｉＨ_４酸化膜若しくは熱酸化膜などのシリコン酸化膜、ハフニウムシリケート若しくはジルコニウムシリケートなどのシリケート、シリコン酸窒化膜、ハフニウム酸窒化膜若しくはジルコニウム酸窒化膜などの金属酸窒化膜、チタニウム酸化膜、タンタル酸化膜、アルミニウム酸化膜、ハフニウム酸化膜、ジルコニウム酸化膜若しくはＩＴＯなどの金属酸化膜、ポリイミド、ポリアミン、金、銀、銅若しくはパラジウムなどの金属、またはポリスチレン、ポリアクリル酸若しくはポリビニルなどのポリマーから形成されうる。

好ましくは、半導体製造工程またはＬＣＤ製造工程で利用されている蒸着方法、例えば、ＣＶＤ、ＳＡＣＶＤ、ＬＰＣＶＤ、ＰＥＣＶＤ、スパッタリング、スピンコーティングなどの方法が挙げられる。また、基板１１０上で安定して形成可能な、固定化層１２０ａ用の材料を使用することが好ましい。

例を挙げて説明すると、基板１１０上に熱酸化膜（シリコン酸化膜）パターンの固定化層１２０を形成する場合、基板１１０の表面に反応基を付着させて、アミノシランまたはヒドロキシシランと反応させることが好ましい。ここで、アミノシランの例としては、一以上のアミノ基と、クロロシラン基、アルコキシシラン基またはアミノシラン基などの一以上の加水分解性のシラン基とを有する化合物が挙げられる。具体的には、４−アミノブチルトリエトキシシラン、ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどがありうる。また、ヒドロキシシランの例として、一以上のヒドロキシ基をと、クロロシラン基、アルコキシシラン基またはアミノシラン基などの一以上の加水分解性のシラン基とを有する化合物が挙げられる。具体的には、ヒドロキシメチルトリエトキシシランや前記化合物の縮合オリゴマーなどがありうる。前記反応に際し、シリコン基板をＨ_２ＳＯ_４溶液などに浸漬させた上で１時間程度洗浄し、基板１１０表面のシラノールを活性化させる。１〜２０％程度のアミノシラン溶液を基板１１０に塗布し、５０ｒｐｍ程度で約６０秒間スピンさせる。そして、基板１１０を２０〜３０℃程度で約５〜２０分間放置して、残留溶媒が徐々に揮発されるようにした後、８０〜１２０℃程度で約１０〜６０分間ベークして、シラン化反応を十分に進行させる。ベークされた基板１１０を脱イオン水で約５〜４５分間洗浄する。残留液を除去するために、アセトニトリルなどで約１〜３分間洗浄し、スピン乾燥する。このようにして、基板１１０表面に固定化層１２０を形成して基板表面を改変する。

図５Ｃを参照すると、プローブセル領域形成層１２０ａ上にフォトレジスト膜ＰＲａを形成した後、フォトマスク４００を用いた投影露光機でフォトレジスト膜ＰＲａを露光し、プローブセル領域を規定する。フォトマスク４００の例として、遮光パターン４０４に沿った碁盤状の露光領域を有するマスクが挙げられ、かかるフォトマスク４００が透明基板４０２上にプローブセル領域を規定する。但し、遮光パターンの形態は、使用するフォトレジスト膜の種類によって変化しうる。

図５Ｄを参照すると、露光されたフォトレジスト膜を現像してフォトレジストパターンＰＲａ’を形成した後、これをエッチングマスクとして使用し、プローブセル領域形成層１２０ａをエッチング（パターニング）してプローブセル領域Ａを形成する。

その後、図５Ｅに示すように、フォトレジストパターンを除去してプローブセル領域Ａを完成する。その際、例えば、プローブセル領域Ａがシリコン酸化膜からなる場合であれば、シリコン酸化膜からなるプローブセル領域Ａの表面にはオリゴマープローブとカップリングできるＳｉＯＨ基が露出している。

図５Ｆに示すように、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を、プローブセル領域Ａ上に分散させる。ナノ粒子１４０の代表例としてポリスチレンビーズを使用することができ、分散方法としては、スピンコーティングなどの方法が利用できる。

ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５の調製について例示すると、まず、表面にカルボン酸を有するナノ粒子１４０を、超音波処理などを用いてアセトニトリル中などで分散させる。ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５に、２−ニトロフェニル−プロピロキシ−カルボニル（ＮＰＰＯＣ）−トリエチレン（ＴＥＧ）−アミンとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の１：１混合溶液などを注入し、２５〜６０℃程度で約１〜３時間超音波処理などして、アミンと、ナノ粒子表面のカルボキシル基との間で結合反応を行う。懸濁液１４５中のアセトニトリルを新鮮なアセトニトリルに、好ましくは１〜５回交換して、非反応性のＮＰＰＯＣ−ＴＥＧ−アミンを除去する。その後、光分解性の保護基（後述）であるＮＰＰＯＣスペーサーで表面を改変したナノ粒子１４０の懸濁液を得ることができる。

分散後、図５Ｇに示すように、ナノ粒子１４０をプローブセル領域Ａに整列させる。好ましくは、プローブセル領域Ａの表面に自己組織化単分子膜形態で配列させる。ナノ粒子１４０に存在する官能基は、プローブセル領域Ａとカップリングする。プローブセル分離領域Ｂにもナノ粒子１４０が存在しうるが、プローブセル分離領域Ｂにはナノ粒子１４０とカップリングできる官能基が存在しないため、後の工程でプローブセル分離領域Ｂのナノ粒子１４０は除去される。

図５Ｈを参照すると、その後、洗浄及びキュアリングの工程を行い、プローブセル領域Ａのみにナノ粒子１４０を整列させることができる。

基板表面上において、ナノ粒子１４０を整列させる工程について例示すると、まず、上記で調製された、光分解性の保護基（後述）を表面に有するナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５に、活性化剤（例えば、ＤＣＣ）を添加し、混合する。そして、上記で調製された、アミノシランでパターニングされた基板１１０上に、ナノ粒子１４０とＤＣＣとの混合懸濁液を塗布し、２０〜６０℃程度で約２〜１２時間放置して、基板１１０のアミンとナノ粒子１４０表面のカルボキシル基との反応を誘引させる。ナノ粒子１４０と反応した基板１１０にアセトニトリルなどを塗布して、反応していないナノ粒子１４０及びＤＣＣ分子を除去し、５００〜３，０００ｒｐｍでスピンして残留溶媒を除去する。

ナノ粒子１４０の整列によって光結晶構造（ナノ粒子アレイ）が形成される。図１Ｃに示すように、光結晶構造（２００）とは、屈折率または誘電率が互いに異なる２種以上の物質が規則的に配列されて、特定の周波数または波長を有する電磁気波が光結晶構造（２００）の内部に伝播するのを防ぐ光バンドギャップを形成しうる構造をいう。光バンドギャップが形成される光結晶構造２００は、特定波長の光のみを反射または透過させて、増幅・減少させることができる光フィルターの機能を発揮することができる。なお、かかる点は、図１Ｄにおける光結晶構造２０１においても同様である。

光結晶構造２００はナノ粒子１４０によって形成される。図面ではナノ粒子１４０を球状で示しているが、かかる形状に制限されず、楕円状、くさび状、ストライプ状などの多様な形状を有しうる。ナノ粒子１４０によって形成される光結晶構造には、面心立方構造、ダイヤモンド、逆オパール構造などがありうる。

ナノ粒子１４０によって形成される光結晶構造２００が自己組織化単分子膜形態を採る場合、ナノ粒子１４０として、球状、例えばポリスチレンビーズを使用することができ、その際のナノ粒子１４０の平均粒径はλ／２に該当しうる（但し、λは蛍光物質から放出される光の波長である）。前記自己組織化単分子膜形態である場合、一のナノ粒子１４０の中心から、隣接するナノ粒子１４０の中心までの距離がナノ粒子１４０の平均粒径と一致するためである。したがって、ナノ粒子１４０の平均粒径は１００〜１，０００ｎｍであることが好ましく、２００〜３００ｎｍであることがより好ましく、１５０〜２５０ｎｍであることが特に好ましい。上記した範囲内の場合、屈折率の調節が容易であるという効果が得られる。

図１Ｄに示すように、ナノ粒子１４０は一定間隔で配列されて光結晶構造を形成することができる。この場合、ナノ粒子１４０の中心から中心までの距離はλ／２に該当しうる（但し、λは蛍光物質から放出される光の波長である）。例えば、一のナノ粒子１４０の中心から、隣接するナノ粒子１４０の中心までの距離は１００〜１，０００ｎｍであることが好ましく、２００〜３００ｎｍであることがより好ましく、１５０〜２５０ｎｍであることが特に好ましい。上記した範囲内の場合、屈折率の調節が容易となりうる。

図５Ｉに示すように、続いて、保護基１５３が結合しているリンカー１５０を、プローブセル領域Ａの表面とカップリングしているナノ粒子１４０にカップリングさせる。リンカー１５０の例として、リンカーの官能基１５２を保護基１５３で保護したホスホロアミダイトが使用可能である。

保護基１５３とは、付着部位が化学反応に加わるのを阻害する基をいい、脱保護とは、保護基１５３が前記付着部位から離隔されて、その結果、前記部位が化学反応に加われるようにすることをいう。例えば、リンカー１５０に結合されている官能基１５２として酸分解性または光分解性の保護基１５３が、リンカー１５０とカップリングする官能基１５２に存在しうる。光分解性の保護基１５３は、ｏ−ニトロベンジル誘導体またはベンジルスルホニルのようなニトロ芳香族化合物を含む、多様な形態のポジティブな光分解性基の中から選択することができる。好ましくは、光分解性の保護基１５３として、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）またはα，α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）が挙げられる。上記した物質からなる光分解性の保護基１５３を使用した場合、効果的に官能基を保護することができる。本段階では、各保護基１５３が、リンカー１５０の対応する官能基１５２を保護するのに使用される。しかし、保護基１５３はこれに制限されることなく、ナノ粒子１４０、オリゴマープローブ１６５の固定化層の表面などに存在する官能基を保護する際にも用いられうる。

リンカー１５０とのカップリング後、表面に露出されており、リンカー１５０と結合しない官能基１５２を、キャッピング基１５５を利用して不活性となるようにキャッピングさせ、オリゴマープローブのノイズとして作用しないようにする。キャッピングの例として、アセチル化などが挙げられる。

引き続き、ｉｎ ｓｉｔｕ フォトリソグラフィーなどを用いて、プローブセル領域Ａにオリゴマープローブ１６５をカップリングさせ、図１Ｂに示すオリゴマープローブアレイ１００を完成する。

まず、図５Ｉに示された構造物中の特定領域を露出させて、光分解性の保護基１５３を脱保護させる。光分解性の保護基１５３が結合したヌクレオチドホスホロアミダイトモノマーを露出された官能基１５２にカップリングさせ、該モノマーとカップリングしていない官能基をキャッピングにより不活性化し、ホスホロアミダイトと５’−ヒドロキシ基との間の結合によって生成されたホスファイトトリエステル構造を、ホスフェート構造に変換するために酸化する。このように、所望のプローブセル領域Ａを脱保護する場合、モノマーを所望の配列とカップリングさせ、モノマーとカップリングしていない官能基をキャッピングにより不活性化し、官能基を酸化する方法を順次繰り返し行い、各プローブセル領域Ａに所望な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。

このような基板１１０表面でのオリゴヌクレオチドの合成について例示すると、まず、上記で調製・作製された、プローブセル領域Ａとプローブセル分離領域Ｂとに含まれる基板１１０上で、フォトグラフィーを用いてＩｎ ｓｉｔｕによりオリゴヌクレオチドプローブを合成する。具体的に、水酸基で活性化されたナノ粒子アレイの表面が、アミダイトカップリング反応に対して適切な状態を維持するように、アセトニトリルを塗布した状態で約５〜３０分間放置した後、約５００〜３，０００ｒｐｍでスピンしてアセトニトリルを除去する。ｉ線露光装置などを用いた露光工程により、ＮＰＰＯＣのニトロ芳香族基をヒドロキシル基に変化させる。なお、ｉ線露光装置については後述する実施例において詳説する。次いで、アセトニトリル溶液（アミダイトで活性化された核酸とテトラゾールとの混合比が、例えば１：１）を約２０〜３０℃で処理してカップリングした後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（Ａｃ_２Ｏ／Ｎ−メチルピロール（ｐｙ）／メチルイミダゾールの比率が、例えば１：１：１）、及びＴＨＦをベースとするヨード溶液（濃度：２０〜６０ｍＭ程度）などで処理して、カップリングしていないヌクレオチドのキャッピング及び酸化を行う。このような脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化といった工程を繰り返して、各プローブセル領域中に、互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。

オリゴマープローブのカップリングは、前記のような光リソグラフィ方法以外に、スポッティング方法、圧電プリント方法、マイクロピペッティングなどによっても行える。

以下、第１０実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００の他の製造方法を説明する。

＜第１０実施形態＞
図６は本発明の第１０実施形態によるオリゴマープローブアレイの他の製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。

図６を参照すると、図５Ａ〜図５Ｅに示す製造方法を経て形成した固定化層１２０に、光分解性の保護基１５３で保護されたリンカー１５０とカップリングしたナノ粒子１４０とを含む懸濁液１４５を分散させる。その後、光分解性の保護基１５３で保護されたリンカー１５０とカップリングしたナノ粒子１４０を、固定化層１２０のプローブセル領域Ａに整列させて光結晶構造を形成する。続いて、ｉｎ ｓｉｔｕでオリゴマープローブ１６５をカップリングさせ、図１Ｂに示すようなオリゴマープローブアレイ１００を製造する。その後の工程は、図５Ｆ〜図５Ｉを参照しながら説明した方法と実質的に同一である。

ナノ粒子１４０を配列して光結晶構造２００、２０１を形成した後、リンカー１５０をカップリングさせた上記第９実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法とは異なり、後述する第１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法は、ナノ粒子１４０とプローブセル領域Ａとをカップリングさせる前に、光分解性の保護基１５３及びリンカー１５０、並びにリンカー１５０及びナノ粒子１４０をカップリングするものである。光分解性の保護基１５３とナノ粒子１４０とは同時にカップリングされうるが、順次カップリングされることもありうる。例えば、光分解性の保護基１５３とカップリングしたリンカー１５０がナノ粒子１４０とカップリングし、光分解性の保護基１５３とカップリングしたリンカー１５０にカップリングしたナノ粒子１４０を、固定化層１２０とカップリングさせる。その結果、プローブセル領域Ａのエッジ部分の損傷が減少しうる。

＜第１１実施形態＞
図５Ａ〜図５Ｉ、図１Ｆを参照しつつ、本発明の第１１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０１を製造する方法について説明する。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０１は、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５の濃度を調節して形成されうる。その他、図５Ｈのような１次元の光結晶構造を形成した後、改めて、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を分散して２次元の光結晶構造を形成することにより、図１Ｆに示すようなオリゴマープローブアレイ１０１を製造することができる。なお、図示していないが、３次元の光結晶構造も同様の方法で形成することができる。

＜第１２実施形態＞
図２Ａ、及び図７Ａ〜図７Ｄを参照しつつ、フォトレジスト壁２３１を使用して、本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０２を製造する方法について説明する。

図７Ａ〜図７Ｄは本実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における各段階での中間構造物の断面図である。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法について概説すると、基板１１０を準備し、基板１１０上に固定化層１２１を形成し、固定化層１２１の少なくとも一部にフォトレジスト壁２３１を形成する。一方、フォトレジスト壁２３１が形成されていない固定化層１２１とナノ粒子１４０をカップリングして光結晶構造を形成する。また、ナノ粒子１４０にオリゴマープローブ１６５をカップリングする。以下、詳説する。

まず、図７Ａに示すように、基板１１０を準備し、基板１１０上に固定化層１２１を形成する。そして、図７Ｂに示すように、固定化層１２１の少なくとも一部にフォトレジスト壁２３１を形成する。そして、図７Ｃに示すように、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を図７Ｂに示された構造物上に分散する。

分散後、図７Ｄに示すように、ナノ粒子１４０を活性化プローブセル領域Ｃに整列させる。例えば、活性化プローブセル領域Ｃの表面に自己組織化単分子膜形態で配列させる。その後、洗浄及びキュアリングの工程を行うことで、活性化プローブセル領域Ｃのみにナノ粒子１４０を整列させることができる。

続いて、保護基１５３とカップリングしているリンカー１５０を、活性化プローブセル領域Ｃの表面にカップリングしているナノ粒子１４０とカップリングさせる。例えば、ホスホロアミダイトからリンカー１５０を形成することができ、該リンカーにおいて、リンカー１５０の官能基１５２を保護基１５３で保護する。

フォトレジスト壁２３１は、ナノ粒子１４０を固定化層１２１にカップリングすることを容易にする。より具体的にいえば、フォトレジスト壁２３１は、ナノ粒子１４０の整列時に物理的なバリアとして機能し、これによりナノ粒子１４０の規則的な配列を容易にし、結果として、ナノ粒子１４０から自己組織化単分子膜を形成することができる。フォトレジスト壁２３１が存在する固定化層１２１の部分にナノ粒子１４０を形成することはできず、したがって、ナノ粒子１４０により形成される光結晶構造も存在しない。このように、フォトレジスト壁２３１を使用する場合には、ナノ粒子１４０とカップリングするプローブセル領域と、ナノ粒子とカップリングしないプローブセル分離領域とを設けるための別途のパターニング工程が不要となる。このように、プローブセル領域同士が、隣接するプローブセル分離領域によって、化学的にではなく物理的に離隔されてなってもよい。

続いて、図示していないが、リンカー１５０をナノ粒子１４０にカップリングさせて、フォトレジスト壁２３１を除去した後、ｉｎ ｓｉｔｕ フォトリソグラフィー法を用いてオリゴマープローブ１６５をカップリングする。その後の工程は、図５Ｆ〜図６を参照しながら説明した方法と実質的に同一である。

一方、図示していないが、フォトレジスト壁２３１を使用しない場合、固定化層１２１上にフォトレジストパターンを形成し、フォトレジストパターンによって露出した固定化層１２１を選択的にキャッピングし、フォトレジストパターンを除去して、その後、ナノ粒子１４０をカップリングするという方法により、ナノ粒子１４０とカップリングした活性化領域と、キャッピングされた不活性化領域とを形成することもできる。

ここまで、フォトレジスト壁２３１を使用して、図２Ａに示されるような本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０２の製造方法について説明してきた。しかし、フォトレジスト壁２３１の使用は、かような製造方法の際に限定されることはなく、上記第１０及び第１１実施形態によるオリゴマープローブアレイ１００、１０１の製造方法においても使用することもできる。すなわち、固定化層１２０をパターニングすることによりプローブセル領域Ａを形成した後、プローブセル分離領域Ｂにフォトレジスト壁２３１を形成して、ナノ粒子１４０を整列させることもできる。

＜第１３実施形態＞
図２Ｂに示す、第１３実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０３の製造方法について説明する。

図示していないが、本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０３は、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５の濃度を調節することにより形成されうる。その他、図７Ｅに示すような１次元の光結晶構造を形成した後、改めて、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を分散して２次元の光結晶構造を形成することにより、図２Ｂに示すようなオリゴマープローブアレイ１０３を製造することもできる。なお、図示していないが、３次元の光結晶構造も同様の方法で形成することができる。

＜第１４実施形態＞
図５Ａ〜図５Ｉ及び図８Ａ〜図８Ｅを参照しつつ、第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０４の製造方法について説明する。

図８Ａ〜図８Ｅは本実施形態によるオリゴマープローブアレイにおける各段階での中間構造物の断面図である。

まず、オリゴマープローブアレイ１０５のプローブセル領域Ａ’の表面を３次元に形成する方法について説明する。

まず、上述した、図５Ａ〜図５Ｅを参照しながら説明した方法により、固定化層１２０ａをパターニングする。

図８Ａに示すように、図５Ｅに示される構造物にフォトレジスト膜ＰＲｂを塗布し、溝Ｇパターンを規定するフォトマスク４１０を用いて、フォトレジスト膜ＰＲｂを露光する。溝Ｇパターンを規定するフォトマスク４１０としては、透明基板４１２上にプローブセル領域を規定する遮光パターン４１４が形成されて碁盤状の露光領域を有するマスクが挙げられるが、遮光パターンの形態は使用するフォトレジスト膜の種類によって異なりうる。

図８Ｂを参照すると、露光されたフォトレジスト膜ＰＲｂを現像して、溝Ｇ（図３Ｂ参照）のパターンを規定するフォトレジストパターンＰＲｂ’を形成する。図８Ｃに示すように、フォトレジストパターンＰＲｂ’をエッチングマスクとして用いてエッチングを行い、固定化層１２２の内部に形成された溝Ｇによる３次元表面を備えたプローブセル領域Ａ’を得る。

図８Ｄに示すように、図８Ｃに示された構造物にナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を分散する。図８Ｅに示すように、ナノ粒子１４０をプローブセル領域Ａ’に配列することにより、光結晶構造を形成する。その後の工程は、図５Ｆ〜図６を参照しながら説明した方法と実質的に同一である。

＜第１５実施形態＞
次に、図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図９Ａ及び図９Ｂを参照しつつ、本発明の第１５実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０５について説明する。

本実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０５は、ナノ粒子１４０による光結晶構造に加えて、別途の光結晶構造１２３を有する。

光結晶構造１２３は、公知の半導体製造工程であるエッチングにより形成することができるが、これに制限されることはない。

図９Ａを参照しつつ、１次元の光結晶構造１２３を形成する方法について説明する。まず、基板１１０を準備し、基板１１０の全面に第１誘電体１２３ａを形成する。第１誘電体１２３ａを形成するために、フォトレジスト膜を形成し、露光してフォトレジストパターンを完成させる。該フォトレジストパターンに従って、第１誘電体１２３ａをエッチングする。第１誘電体１２３ａをエッチングする方法としては乾式エッチングまたは湿式エッチングのいずれも使用することができる。精密なパターンを形成するために、異方性エッチングのような乾式エッチングを使用してもよい。光結晶構造を形成する第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂの幅は、蛍光物質１８０から放出される光の波長（λ）の１／４となりうる。すなわち、光結晶構造の周期が、蛍光物質１８０から放出される光の波長（λ）の実質的に１／２になるのが好ましい。次に、第１誘電体１２３ａ上に残っているフォトレジストパターンを除去して、第２誘電体１２３ｂを形成する。第１誘電体１２３ａ上に形成された第２誘電体１２３ｂを化学的機械研磨（ＣＭＰ）工程で平坦化することにより、屈折率の異なる２つの誘電体が１次元的かつ交互に配列された光結晶構造１２３を形成する。なお、プローブセル領域Ｅ及びプローブセル分離領域Ｆの設け方は、上記第９実施形態による方法と同様である。

図９Ｂに示すように、光結晶構造１２３が形成された図９Ａに示される構造物に、ナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５を分散する。その後の工程は図５Ｆないし図６を参照しながら説明した方法と実質的に同一である。

＜第１６実施形態＞
図４Ｃに示されるような、本発明の第１６実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０６の製造方法について説明する。固定化層が２次元の光結晶構造１２３’である場合、上記した図９Ａ及び図９Ｂで説明した工程を繰り返し、繰り返した工程の回数分だけ、複数の光結晶層が積層された（図４Ｃでは２層）光結晶構造を形成することができる。図４Ｃに示すように、第１誘電体１２３ａ及び第２誘電体１２３ｂは、交互に平行方向に配列される。

＜第１７実施形態＞
図４Ｄ、図１０Ａ及び図１０Ｂを参照しつつ、本発明の第１７実施形態によるオリゴマープローブアレイ１０７の製造方法を説明する。３次元の光結晶構造１２３”を形成するために、例えば、フォトリソグラフィーやイオンエッチング技術のような方法に基づく積層（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）工程を利用することができるが、これに限定されることはない。また、図１０Ａ及び図１０Ｂに示される過程では、光結晶構造１２３”の少なくとも一部にフォトレジスト壁２３１、並びに図７Ｂ及び図７Ｃに示されるようなナノ粒子１４０を含む懸濁液１４５の分散を伴う。

図９Ａ及び図９Ｂに示す製造方法を経て、１次元の光結晶層を形成する。図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、２次元の光結晶構造１２３’と異なり、３次元の光結晶構造１２３”は、ｎ番目の光結晶層とｎ＋１番目の光結晶層とが、それぞれ、互いに垂直方向に配列されてなる第１誘電体１２３ａと、互いに垂直方向に配列されてなり第１誘電体１２３ａと交互に存在する第２誘電体１２３ｂとを有する。したがって、ある光結晶層は、直前の光結晶層に対して垂直方向に配置する。そして、各光結晶層を構成する各誘電体１２３ａ、１２３ｂは、互いに垂直方向に配列され、ｎ番目の光結晶層及びｎ＋１番目の光結晶層を構成する同一の誘電体が１つおきに配列されうる。

本発明についてのさらに詳細な内容は、以下の実施例で説明するが、以下に記載されていない内容については、本技術分野において通常の知識を有する者であれば、十分に技術的に類推できるものであるため、説明を省略する。

［実施例１］
基板表面の改変
シリコン基板の特定領域のみにナノ粒子を形成するため、フォトリソグラフィー及びエッチングの工程により、シリコン基板上に熱酸化膜パターンの固定化層を形成した。シリコン基板の熱酸化膜パターンの表面に反応基を付着させて、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させた。具体的には、シリコン基板をＨ_２ＳＯ_４溶液中で１時間洗浄して、基板表面のシラノールを活性化させた。シリコン基板に０．１％ γ−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液を塗布し、５０ｒｐｍで６０秒間スピンさせた。そして、該基板を常温で１４分間放置して残留溶媒が徐々に揮発されるようにした後、１２０℃で４０分間ベークして、シラン化反応を十分に進行させた。ベークされた基板を脱イオン水で３５分間洗浄した。残留液を除去するために、アセトニトリルで３分間洗浄し、スピン乾燥した。

［実施例２］
ナノ粒子を含む懸濁液の調製
表面にカルボン酸を有する平均粒径２４０ｎｍの球状のナノ粒子を、超音波処理を用いてアセトニトリル中で分散させた。ナノ粒子を含む懸濁液に２−ニトロフェニル−プロピロキシ−カルボニル（ＮＰＰＯＣ）−トリエチレン（ＴＥＧ）−アミンとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の１：１混合溶液を注入し、常温で１時間超音波処理して、アミンと、ナノ粒子表面のカルボキシル基との間で結合反応を行った。ナノ粒子を含む懸濁液中のアセトニトリルを新鮮なアセトニトリルに５回交換して、非反応性のＮＰＰＯＣ−ＴＥＧ−アミンを除去した。その後、光分解性の保護基であるＮＰＰＯＣスペーサーで表面を改変したナノ粒子を含む懸濁液を得た。

［実施例３］
基板表面上における光結晶構造（ナノ粒子アレイ）の形成
実施例２で調製された、光分解性の保護基を表面に有するナノ粒子を含む懸濁液に、活性化剤としてＤＣＣを添加し、混合した。実施例１で調製された、アミノシランでパターニングされたシリコン基板上に、ナノ粒子とＤＣＣとの混合懸濁液を塗布し、常温で１時間放置して、基板のアミンとナノ粒子表面のカルボキシル基との反応を誘引させた。ナノ粒子と反応したシリコン基板にアセトニトリルを塗布して、反応していないナノ粒子及びＤＣＣ分子を除去し、１００ｒｐｍでスピンして残留溶媒を除去した。

［実施例４］
基板表面でのオリゴヌクレオチドの合成
実施例１〜３で調製・作製された、プローブセル領域とセル分離領域とを含む基板上で、フォトグラフィーを用いてＩｎ ｓｉｔｕによりオリゴヌクレオチドプローブを合成した。具体的に、水酸基で活性化されたナノ粒子アレイの表面が、アミダイトカップリング反応に対して適切な状態を維持するように、アセトニトリルを塗布した状態で５分間放置した後、１００ｒｐｍでスピンしてアセトニトリルを除去した。ｉ線露光装置によって、ＮＰＰＯＣのニトロ芳香族基をヒドロキシル基に変化させた。ｉ線露光装置として、ＡＳＭＬ ＰＡＳ５５００ １００Ｄ ステッパーを３６５ｎｍの波長で使用し、碁盤状であって１１μｍの開口径を有するクロムオンクォーツマスク（ｃｈｒｏｍｅ ｏｎ ｑｕａｒｔｚ ｍａｓｋ）を用いて、１０００ｍＪ／ｃｍ^２のエネルギーで１分間露光した。次いで、アセトニトリル溶液（アミダイトで活性化された核酸とテトラゾールとの混合比１：１）を常温処理してカップリングした後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（Ａｃ_２Ｏ／Ｎ−メチルピロール（ｐｙ）／メチルイミダゾール＝１：１：１）、及びＴＨＦをベースとするヨード溶液０．０２Ｍで処理して、カップリングしていないヌクレオチドのキャッピング及び酸化を行った。

このような脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化といった工程を繰り返して、各プローブセル領域中に、互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。

蛍光強度測定
実施例１〜４の工程を通じて合成されたオリゴマープローブアレイと、標的分子をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたプローブの蛍光強度をＣＣＤ（Ａｒｒａｙ Ｗｏｒｘ）または蛍光顕微鏡を用いてスキャンした。ＣＣＤスキャニングのために、ハイブリダイズしたＤＮＡチップの表面をＣＣＤの光源方向にローディングし、標的分子で標識された蛍光物質の励起波長に相当する光を照射して、蛍光物質の励起によって得られる蛍光シグナルの強度を測定した。

図１１は、オリゴマープローブとして２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを使用した場合における、オリゴマープローブアレイについてのＣＣＤ測定の結果である。

図１１を参照すると、ナノ粒子によって光結晶構造が形成されたオリゴマープローブアレイ（実施例）の場合、ナノ粒子によって光結晶構造が形成されていないオリゴマープローブアレイ（比較例）と比較して、蛍光シグナルの増幅がより向上したことが分かる。なお、前記比較例については、オリゴマープローブアレイにおいて、ナノ粒子によって光結晶構造が形成されていない点以外は実施例１〜４と同様である。

［実施例５］
ナノ粒子とカップリングしたプローブセル領域の製造
シリコン基板上に（ＣＨ_２）_１０−ＯＨ基を含むシロキサン樹脂をスピンコーティング方法を使用して９０ｎｍ厚さに形成し、２５０℃で６０秒間ベークした。前記基板上にフォトレジスト膜３．０μｍをスピンコーティング法で形成した後、１００℃で６０秒間ベークした。１．０μｍピッチの碁盤状のダークトーンマスクを使用して３６５ｎｍ波長の投影露光装備でフォトレジスト膜を露光した後、２．３８％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド水溶液で現像して、碁盤状の縦横交差する直線領域を露出させるフォトレジストパターンを形成した。フォトレジストパターンをエッチングマスクとして使用して、固定化層をエッチングしてプローブセル領域にパターニングした。

前記基板に、ＯＨを官能基として有する、平均粒径が４９０ｎｍのシリカビーズ（ｓｉｌｉｃａ ｂｅａｄ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ）の懸濁液１０ｍｌを分散させた後、５０ｒｐｍで６０秒間スピンコーティングした後、ＩＰＡで洗浄して１１０℃で１０分間処理した。

［実施例６］
プローブセル領域の製造
シリコン基板上に、スピンコーティング法により、（ＣＨ_２）_１０−ＮＨ_２基を含むシロキサン樹脂を厚さ９０ｎｍとなるように形成し、２５０℃で６０秒間ベークした。該基板上に、スピンコーティング法により、厚さ３．０μｍのフォトレジスト膜を形成した後、１００℃で６０秒間ベークした。ピッチ１．０μｍの碁盤状のダークトーンマスクを用いて、３６５ｎｍの波長の投影露光装置中で該フォトレジスト膜を露光した後、２．３８％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド水溶液を用いて現像して、縦横に交差する直線により分かれた領域を露出した、碁盤状のフォトレジストパターンを形成した。フォトレジストパターンをエッチングマスクとして使用して、固定化層をエッチングしてプローブセル領域にパターニングした。

ナノ粒子については、官能基としてカルボキシル基を有する、平均粒径が９１４ｎｍのポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用した。該ナノ粒子６．４ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ３．１ｍｍｏｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド １３．１ｍｍｏｌを含む脱イオン水懸濁液を分散した後、５０ｒｐｍで６０秒間スピンカップリングし、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で洗浄し、キュアリングを１１０℃で１０分間行った。

以上、添付する図面を参照しつつ本発明の実施形態を説明したが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更することなく変形した他の形態によっても実施できることを理解できる。したがって、上述した実施形態は例示的なものにすぎず、本発明の範囲は、上記実施形態によって限定されることはない。

本発明により得られるオリゴマープローブアレイ用基板及びオリゴマープローブは、遺伝子発現分析、遺伝子型分析またはＳＮＰのような突然変異及び多型の検出、蛋白質及びペプチドの分析、潜在的な薬のスクリーニング、並びに新薬の開発及び製造などに好適に用いられうる。

本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図である。 本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第１実施形態によるナノ粒子で形成された光結晶構造を示すプローブセル領域の部分図である。 本発明の第１実施形態によるナノ粒子で形成された光結晶構造を示すプローブセル領域の部分図である。 蛍光物質を付着した標的分子がカップリングされた本発明の第１実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第２実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第３実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第４実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第５実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図である。 本発明の第５実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第６実施形態によるオリゴマープローブアレイのプローブセル領域の配置図である。 本発明の第６実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第７実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第８実施形態によるオリゴマープローブアレイの断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第９〜１１実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１０実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１２実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１４実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１５実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１５実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１６実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 本発明の第１６実施形態によるオリゴマープローブアレイの製造方法における一段階での中間構造物の断面図である。 オリゴマープローブアレイとＤＮＡとのハイブリダイゼーション後の蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。

符号の説明

１ プローブセル領域パターン（セルアクティブパターン）、
２ 溝パターン、
３ セルアクティブパターン、
１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７ オリゴマープローブアレイ、
１１０ 基板、
１２０ 固定化層、
１２０ａ 固定化層（プローブセル領域形成層）、
１２１ 固定化層、
１２２ 固定化層、
１２３ 固定化層（光結晶構造）、
１２３ａ 第１誘電体、
１２３ｂ 第２誘電体、
１２３’ ２次元の光結晶構造、
１２３” ３次元の光結晶構造、
１３０ 不活性化領域、
１４０ ナノ粒子、
１４５ 懸濁液、
１５０ リンカー、
１５２ 官能基、
１５３ 保護基、
１５５ キャッピング基、
１６５ オリゴマープローブ、
１７０ 標的分子、
１８０ 蛍光物質、
２００ 光結晶構造、
２０１ 光結晶構造、
２０２ ２次元の光結晶、
２３１ フォトレジスト壁、
４００ フォトマスク、
４０２ 透明基板、
４０４ 遮光パターン、
４１０ ３次元の表面を有するプローブセル領域を規定するフォトマスク、
ＰＲａ、ＰＲｂ （露光された）フォトレジスト膜、
ＰＲａ’、ＰＲｂ’ フォトレジストパターン、
Ａ、Ｅ プローブセル領域、
Ｂ、Ｂ’、Ｆ プローブセル分離領域、
Ａ’ プローブセル領域、
Ｃ 活性化プローブセル領域、
Ｄ 不活性化プローブセル分離領域、
Ｇ 溝。

Claims (12)

1. 基板と、
   前記基板上の固定化層と、
   前記固定化層にカップリングして光結晶構造を形成するナノ粒子と、
   前記ナノ粒子とカップリングするオリゴマープローブと、を含むオリゴマープローブアレイであって、
   前記固定化層は、前記ナノ粒子がカップリングする複数のプローブセル領域を含み、前記プローブセル領域はプローブセル分離領域によって離隔されてなる、オリゴマープローブアレイ。
2. 前記ナノ粒子は、前記オリゴマープローブと標的分子とのハイブリダイゼーションのための空間マージンを提供し、
   前記光結晶構造は、前記オリゴマープローブとハイブリダイズする標的分子に付着された蛍光物質から放出される光の波長を増幅させる、請求項１に記載のオリゴマープローブアレイ。
3. 前記ナノ粒子は球状粒子であり、前記ナノ粒子の平均粒径は１００〜１，０００ｎｍである、請求項１または２に記載のオリゴマープローブアレイ。
4. 一の前記ナノ粒子の中心から、隣接する他の前記ナノ粒子の中心までの距離は、１００〜１，０００ｎｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
5. 前記プローブセル領域は３次元の表面を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
6. 前記プローブセル領域は光結晶構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
7. 前記ナノ粒子は自己組織化によって配列されてなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
8. 前記ナノ粒子は、リンカーを介して前記オリゴマープローブと表面でカップリングしてなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
9. 前記ナノ粒子は、前記リンカーとカップリングするように構成された官能基を表面に含む、請求項８に記載のオリゴマープローブアレイ。
10. 前記ナノ粒子は、表面に前記固定化層及び前記オリゴマープローブとカップリングするように構成された官能基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
11. 前記ナノ粒子は、球状のポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート共重合体、シリカ、ガラス、マグネット、ワング樹脂、メリフィールド樹脂、金属、プラスチック、セルロース、セファデックス及びセファロースよりなる群から選択される一種以上から形成されてなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。
12. 前記プローブセル領域同士は、隣接する前記プローブセル分離領域によって物理的に離隔されてなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマープローブアレイ。