JP2008185534A - エタノールの測定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】真核微生物によりエタノールを代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、エタノールを含有する溶液中のエタノール量を検出または定量するエタノールの測定法において、真核微生物がエタノールを代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型のメディエーターを電極により検出または定量する。
【選択図】 なし
Description
A.N.Reshetilov et al, Biosens. Bioelectron., 13, 787(1998)
J.Tkac et al., Biosens. Bioelectron., 18, 1125(2003)
凍結乾燥されたパン酵母菌体(日清製粉製品)をスパーテルで極少量取り、18mm径×180mmの試験管に入れたYPD液体培地(酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20gを純水に溶解し、全量を1,000mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)2mlに接種し、シリコ栓で蓋をして28℃、180rpm、好気条件下で18時間振とう培養を行った。次いで、YPD寒天培地(酵母エキス2g、ポリペプトン4g、グルコース4g、寒天4gを純水に溶解し、全量を200mlにした後、121℃、15分間の条件下でオートクレーブ滅菌したもの)を、クリーンベンチ内でシャーレに約20mlずつ入れ、恒温器(アーンスト・ハンセン商会製品BARNSTEAD/THERMOLYNE LAB-LINE 120-5JPN)内で乾燥させたものに、乾燥酵母から培養を行った酵母液を白金耳で網目模様に接種し、28℃で二晩前培養を行った。
実施例1において、フェリシアン化カリウムの代わりに同量のpH 7.0、100mM PBで調製した濃度が合計で40mMになるそれぞれ異なる濃度のフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウム(和光純薬工業製品)の混合液(FF混合液)が、また酵母液として同量のOD600=61.9のものが、また反応時間が0分間に変更されて測定が行われた。得られた結果は、図1に示される。この図に示されるように、フェロシアン化カリウムの濃度の増加に伴い、電極応答値が直線的に大きくなる結果が示された。ここで、各濃度のFF混合液を3回ずつ測定して得た検出の上限は10mM、下限は0.03mM、変動係数(CV値)の平均値は1.74%、相関係数は0.1〜10mMの範囲でr = 0.9995であった。以上より、親水性メディエーターであるフェロシアン化カリウムに対しては極めて広い範囲(0.1〜10mM)で正の相関を示す応答が得られることが示された。
実施例1において、反応液として純水290μl、0.05%(w/v)Triton-X 100 5μl、pH 7.0、100mMリン酸緩衝液で調製した0.4Mフェリシアン化カリウム(和光純薬工業製品)50μl、DMSOに溶解した20mMメナジオン5μlおよび濃度が0、0.015、0.035、0.05、0.15、0.35、0.5、1.5、3.5、5、10、15、35、50、75および100%のエタノール標準液100μlが、また酵母液として0.9%生理食塩水で調製されたOD600=67.5のものが同量用いられた。得られた結果は、図2に示される。この図に示されるように、エタノールの増加に伴う微生物の代謝活性の高まりを、電極応答値により測定できることが示された。ここで、各標準溶液を3回測定して得た検出の上限は50%、下限は0.015%(150ppm)、変動係数(CV値)の平均値は4.53%、相関係数は0.05〜0.5%の範囲でγ=0.995、また0.035〜1.5%の範囲でr=0.971であった。以上より、エタノールに対しては極めて広い範囲(0.015〜50%)で正の相関を示す応答が得られることが示された。
実施例1において、反応液として純水330μl、0.05%(w/v)Triton-X 100 5μl、純水で調製した40mMフェリシアン化カリウム水溶液50μl、pHが5.0、6.0、7.0、8.0および9.0の100mM リン酸緩衝液 50μl、DMSOに溶解した20mMメナジオン5μlおよび100%のエタノール標準液10μlを用い、酵母液として同量のOD600=73.1のものが用いられた。得られた結果は、図3に示される。この図に示されるように、pHに対して大きな影響を受けないことが示された。この結果により、試料液が酸性の強い果汁を含むアルコール飲料水であっても、試料体積を現状の10μl程度で行うのであれば、反応液内の緩衝液による緩衝能によりpHが今回試した範囲に緩衝されるため、十分な感度を持ってエタノールの定量が出来ることが示された。
実施例1において、反応液として100%エタノールの代わりに濃度が0.01、0.03、0.07、0.1、0.3、0.7、1.0、3.0および7.0%アスコルビン酸水溶液または純水10μlを、また酵母液の代わりに0.9%生理食塩水が同量用いられ、さらに反応時間が0分間に変更されて測定が行われた。得られた結果は、図4に示される。この図に示されるように、アスコルビン酸濃度の増加に伴う電極応答値の高まりを測定できることが示された。ここで、各標準溶液を3回測定して得た検出の上限は10%、下限は0.03%、変動係数(CV値)の平均値は2.76%、相関係数は0.03〜7%の範囲でr=0.998であった。以上より、アスコルビン酸に対して、極めて広い範囲(0.03〜7%)で正の相関を示す応答が得られることが示された。
実施例1において、反応液として純水440μl、100mM(pH 7.0)リン酸緩衝液50μl、試料液10μlを用い、酵母液を用いずに反応時間を0分間に変えて測定が行われた。試料液としては、10%エタノール、純水、1%アスコルビン酸溶液、0.5M過酸化水素溶液、0.5Mグルコース溶液または炭酸水が用いられた。得られた結果は、次の表2に示される。この参考例は、果汁などを含むアルコール飲料中のエタノール濃度を測定するに当り、この果汁などに含まれるに含まれるビタミンC(アスコルビン酸)が測定妨害物質となり得ることは実施例4に示される通りであるので、これをアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)により処理した場合に発生する過酸化水素、酵母がエタノールとともに最も好んで資化する有機物であるグルコースおよびお酒を割るのに使用する炭酸水(アサヒ飲料製品ウィルキンソン)が電極へ影響を及ぼすか否かについて検討を行ったものである。その結果、試料液として純水を用いた場合に対する電極応答と比較して、アスコルビン酸の電極応答は約25倍、また、過酸化水素の電極応答は約2.5倍であり、これらの成分の影響が確認された。一方、それ以外の成分については影響が見られなかった。なお、SDは標準偏差、RSDは相対標準偏差(変動係数 CV)を示している。
表2
実施例1において、反応液として純水390μl、100mM(pH 7.0)リン酸緩衝液50μl、純水に溶解させた50mMフェロシアン化カリウムと350mMフェリシアン化カリウム(FF)溶液50μl、試料液10μlを用い、酵母液を用いずに反応時間を0分間に変えて測定が行われた。なお、試料液としては、参考例1と同じものが用いられた。得られた結果は、次の表3に示される。この参考例は、水溶性メディエーターを含む緩衝液内に添加した成分の電極への影響を調べたものであるが、試料液として純水を用いた場合に対する電極応答と比較して、参考例1ほど大きな電極応答を示した成分はないものの、アスコルビン酸および過酸化水素の電極応答はやや大きい値を示した。
表3
実施例1において、反応液として純水量が380μlに、エタノール標準液の代わりに参考例1と同様の試料液10μlに、酵母懸濁液の代わりに0.9%生理食塩水にそれぞれ変更されて用いられ、酵母のみ含まない反応液に添加した成分の電極への影響についての検討が行われた。得られた結果は表4-iおよびiiに示される。この結果、参考例2の結果と類似して、試料液として純水を用いた場合に対する電極応答と比較して、アスコルビン酸および過酸化水素の電極応答は大きい値を示した。
表4-i
表4-ii
参考例3において、試料液として0.5M過酸化水素水20μlを2単位のカタラーゼ(和光純薬製品Cat)を含む水溶液20μlとを10分間振とうして処理したもの、0.5Mグルコース20μlを20単位カタラーゼ(Cat)と20単位GOD(アマノエンザイム社製品)を含む酵素混合液20μlとを10分間振とうして処理したもの、および1%アスコルビン酸20μlを1単位のカタラーゼ(Cat)とAOD(和光純薬製品)を含む酵素混合液20μlとを10分間振とうして処理したものが用いられた。得られた結果は、次の表5に示される。この結果より、参考例3において電極応答に影響を及ぼしていた成分が酵素処理によって完全にその影響を取り除くことができることが示され、酵素処理された試料液であればその試料液中に含まれるエタノールの濃度を実施例1と同じ条件で正確に定量できる可能性が示された。
表5
Claims (12)
- 真核微生物によりエタノールを代謝させ、該真核微生物の代謝活性を測定することにより、エタノールを含有する溶液中のエタノール量を検出または定量するエタノールの測定法において、
真核微生物がエタノールを代謝する際に、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、生成する還元型の親水性メディエーターを電極により検出または定量することを特徴とするエタノールの測定法。 - 真核微生物の有機物質の代謝が、10mM以上のリン酸イオン存在下で行われる請求項1記載のBODの測定法。
- 酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターに加えて、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させることを特徴とする請求項1記載のエタノールの測定法。
- 真核微生物が酵母である請求項1記載のエタノールの測定法。
- 脂溶性メディエーターがジメチルスルホキシドに溶解されて用いられる請求項1記載のエタノールの測定法。
- 酸化型の脂溶性メディエーターが、キノン類またはベンゾアミン類である請求項1記載のエタノールの測定法。
- キノン類が、2-メチル-1,4-ナフトキノン、ベンゾキノンまたは1,2-ナフトキノンである請求項6記載のエタノールの測定法。
- ベンゾアミン類が、2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミンまたはN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンである請求項6記載のエタノールの測定法。
- 酸化型の親水性メディエーターが、ヘキサシアノ鉄(III)カリウム、ヘキサメチレンテトラミンルテニウムまたはカルボキシメチル化フェロセンである請求項1記載のエタノールの測定法。
- 呼気中のエタノールの計測またはバイオエタノール燃料またはバイオエタノール燃料の製造工程におけるモニタリング時の計測に用いられる請求項1及至9のいずれかに記載のエタノールの測定法。
- 電極上に、真核微生物、酸化型の脂溶性メディエーターおよび酸化型の親水性メディエーターを存在させ、これにエタノールを含有する溶液を添加することにより、エタノールの検出または定量が行われるエタノールセンサー。
- 電極上に、さらにスーパーオキシドジスムターゼを存在させた請求項11記載のエタノールセンサー。
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