JP2008142086A - 改良された予防接種戦略に関する材料及び方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】初回刺激−追加刺激予防接種計画に基づく新規の予防接種戦略を提供すること。
【解決手段】過去に多数のエピトープに対し初回刺激されたことがあるか又はそれらを被曝したことがある患者における免疫応答を追加刺激する改良された様式を決定した。その改良された方法は、追加刺激期において、エピトープが個々に投与されること、即ち別々のペプチド構築物上に保持されたエピトープが投与されることを必要とする。さらに、予防接種戦略を改良するための材料及び方法であって、排他的にではないが、免疫系が、初回刺激組成物により誘導され、そして追加刺激組成物の投与により追加刺激される「初回刺激−追加刺激」予防接種プロトコールに関し、新規の四量体可溶性クラスIMHC／ペプチド複合体とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、予防接種戦略を改良するための材料及び方法に関する。具体的には、排他的にではないが、本発明は、免疫系が、初回刺激組成物により誘導され、そして追加刺激組成物の投与により追加刺激される「初回刺激−追加刺激」予防接種プロトコールに関する。本発明は、さらに、予防接種計画を直接モニタリングし、新規のエピトープを決定するための道具としての、新規の四量体可溶性クラスI MHC／ペプチド複合体に関する。
エクスビボアッセイ法において抗原CTL応答の頻度をモニタリングする能力の最近の進歩によって、異なる予防接種プロトコールを比較するための性能は急速に改良されつつある。特に、四量体可溶性クラスI MHC／ペプチド複合体（四量体）の使用は、ヒトCTL応答の迅速かつ正確な分析を可能にすることにより、新たなワクチンの開発を大きく加速する機会を提供する1-3。
同一の抗原性タンパク質をコードする非交差反応性ベクターの反復注射に基づく異種初回刺激−追加刺激予防接種プロトコールは、おそらくは組換え標的タンパク質に含まれているエピトープへの免疫応答の集束のため、強力なCTL応答をもたらすことが明らかとなっている4。プラスミドDNAによる初回刺激と、組換え欠陥ワクシニアウイルスMVAによる追加刺激との組み合わせが、高レベルの特異的免疫を生成させることが、最近の結果により証明されている5-10。
αウイルスは、予防接種プロトコールにおけるウイルスベクターとして精力的に研究されている11-15。複製能のないαウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（SFV）は、コードされた外来抗原に対する抗体及びCTLを誘導する能力を有することが判明している14、15。少数のウイルス構造タンパク質の発現は、ウイルス構造タンパク質ではなく組換えタンパク質に特異的な免疫応答が生成する確率を最大にすることから、SFVゲノムの小さいサイズ16のため、このウイルスは、予防接種戦略にとって極めて魅力的なベクターである。
ウイルス及び腫瘍細胞が、抗原性タンパク質の変異又は欠失により特異的免疫応答を回避することは、いくつかの研究によって証明されている17、18。ウイルス又は腫瘍の抗原喪失バリアントの生成を最小限に抑えるためには、ワクチンにより誘導される免疫応答が、可能であれば別個のタンパク質によりコードされた、広範囲の異なるエピトープに対して特異的なものであるべきである。この原理によって、異なる特異性を有するCTLを同時に増幅することを目標として、CTLエピトープのストリングをコードするワクチンが作成されている。A2トランスジェニックマウスの予防接種により、ポリエピトープ構築物内にコードされた多数のエピトープが、各々特異的なCTLを初回刺激し得ることが示され、このことから、免疫療法臨床試験のためのこのアプローチの実行可能性が示唆された19-22。しかしながら、これらのマウスにおけるCTL応答を直接モニタリングするためのアッセイ法の技術的な限界のため、多価構築物が、多くの特異性のCTLを有効なレベルにまで増幅する能力を有することは立証されていない。
ポリエピトープワクチンは、ヒトにおける広域性の細胞障害性Tリンパ球（CTL）応答を誘導する能力を有するであろうという期待が存在する。多数のエピトープの投与は、異なる特異性を有するCTLを同時に増幅することを目標としている。そのような多価構築物は、明白に有利な動物において、複数の特異性のCTLを同時に初回刺激する能力を有することが判明しているが、それらが、続いて、これらのCTL応答の各々を有効なレベルにまで追加刺激する能力を有するか否かは未だ不明である。
免疫応答を誘起する効率がエピトープによって異なることは、既知である。ドミナントであると記載される、即ち、強力なCTL応答を刺激するエピトープも存在するし、比較的弱い応答を刺激するためサブドミナント（subdominant）であると記載されるものも存在する。しかしながら、広範囲のエピトープに対する免疫応答を誘起しようとする場合には、よりドミナントなエピトープが優先されサブドミナントエピトープが見落とされるということがないことが重要である。
ワクチン計画の初回刺激段階において、よりドミナントなエピトープは、より弱いエピトープより大きなCTL応答を誘発する。これは、最初の多数のエピトープに対する初回刺激イベントの後のCTL応答が、必然的に、よりドミナントな種に対してはより大きく、サブドミナントの種に対してはより弱いことを意味する。しかしながら、本発明者らは、追加刺激期に同じ多数のエピトープがポリエピトープ構築物として投与された場合、状況が悪化することを見出した。これは、ポリエピトープが、初回刺激期とは異なるベクター／媒体で提供された場合ですら、当てはまると考えられる。本発明者らは、追加刺激段階においては、サブドミナントエピトープに対するCTL応答の増幅が有意に低下してしまう程に、サブドミナントエピトープに対するCTL応答より大きな速度で、よりドミナントなエピトープに対するCTL応答が増加することを見出した。これは、ドミナントエピトープに対して誘起されたCTLが、サブドミナントエピトープに対して誘起されたCTLを犠牲にして、さらに増幅されることを意味する。結果として、ドミナントエピトープに対して誘起されたCTLの割合は増加し、サブドミナントエピトープに対して誘起されたCTLの割合は極わずかにしか増加しない。これは、追加刺激期が、最初の初回刺激段階において増幅されたCTLの増殖を優先することにより、免疫応答を狭小化することを意味する。
本発明者らは、驚くべきことに、多数のドミナントエピトープ及びサブドミナントエピトープに対する追加刺激期の可能性のある負の効果を克服するのに有益な新規の初回刺激−追加刺激計画を決定した。
注目すべきことに、本発明者らは、初回刺激段階の後、応答を追加刺激するため、エピトープが、単一のポリエピトープ構築物として投与された場合とは対照的に、個々に使用された場合、広いCTL応答が、より均一に、有効なレベルにまで追加刺激され得ることを見出した。本発明者らは、個々のエピトープにより追加刺激することによって、ドミナントエピトープに対して誘起されたCTLが、サブドミナントエピトープに対して誘起されたCTLを犠牲にして追加刺激されることがなくなることを見出した。むしろ、それらは、同等に追加刺激される。
特に、そして後で例証されるように、本発明者らは、初回刺激−追加刺激予防接種が狭いCTLレパートリーの増幅をもたらすことを証明するため、黒色腫エピトープのストリングをコードするDNA及びウイルスベクターを使用した。本発明者らは、追加刺激工程においては、ポリエピトープ構築物を提示している細胞の認識に関するCTLの競合によって、初回刺激時により効率的に増幅されたCTLの方へ応答が偏向することを見出した。対照的に、本発明者らは、追加刺激期に、APCが別々にエピトープを提示している場合には、ドミナント決定基及びサブドミナント決定基に特異的なCTLの同時の増幅が得られることを見出した。これは、例えば、各々別々の抗原をコードしているウイルスの混合物を注射することにより、又はエピトープを別々に提示しているAPCの混合物を注射することにより、達成され得る。
従って、本発明は、予防接種計画の初回刺激期にはポリエピトープ構築物が使用されるが、追加刺激期にはエピトープを個々にコードするか又は含む免疫原が使用される、多数のエピトープに対する特異的であるが広域性のCTL応答を誘導する方法を提供する。
本発明は、追加刺激期において、初回刺激段階とは異なる様式でエピトープが免疫系へと提示される、異種初回刺激−追加刺激予防接種計画も提供する。これは、より詳細に後で説明される。
エピトープが個々に投与された場合、多数のエピトープに対する特異的であるが広域性のCTL応答を誘導する追加刺激期の効果が極めて高くなることが決定されたことから、本発明が生まれた。
従って、個体が多数のエピトープにより既に初回刺激されたことがある場合、本発明は、別々の構築物上にある、又は別々の媒体により保持された多数のエピトープを、個々に、即ち別々に投与することを含む、過去に誘導された（初回刺激された）免疫応答を追加刺激する方法を提供する。
本明細書に記載された本発明の全ての面において、多数のエピトープとは、2より大きい、より好ましくは4より大きい、さらに好ましくは7より大きい、任意の数のエピトープと解釈され得る。多数のエピトープのうち、少なくとも2個、より好ましくは4個、さらに好ましくは7個のエピトープは、異なると思われる、即ち異なるアミノ酸配列を含むか、又は異なる抗体により認識されると思われる。しかしながら、多数のエピトープには、数十個又は数百個という程度の多くのエピトープが含まれることも好ましい。これらのエピトープのうちのいくつかは、極めて類似しており交差反応してもよい。
従って、個体が、病原体（例えば、ウイルス、細菌等）又は腫瘍に感染しているか、又は何らかの様式でそれらと接触したことがある、即ちそれらを被曝したことがある場合には、個体の免疫系は、その病原体又は腫瘍により提示された多数のエピトープに対して自然に初回刺激されていると思われる。しかしながら、この免疫系の最初の初回刺激は、個体が病原体又は腫瘍に対する有効な防御を開始するのにはおそらく不十分であると思われる。しかしながら、本発明に従い、既に初回刺激された免疫応答は、別々の構築物（ペプチドもしくは核酸）又は別々の媒体により保持された多数のエピトープを個々に、即ち別々に投与することにより、追加刺激され得る。従って、この情況において、本発明は、広大な治療的可能性を有する。
個体が特定のエピトープに対して初回刺激されているか否か（即ち、病原体の被曝により、又は腫瘍の結果として）を検出することは可能と思われるが、この工程は、必要ではないと思われる。
時間、経費、及び手間を節約するためには、病原体又は腫瘍の被曝により多数のエピトープに対して初回刺激されていると推測される全ての患者を、初回刺激された患者として治療することが好ましいと思われる。
従って、本発明の第一の面において、過去に多数のエピトープのうちの少なくとも1個、好ましくは多数のエピトープの全部に対して初回刺激されたことがあるか、又はそれらを被曝したことがある個体における免疫応答を追加刺激する方法が提供される。前記の方法は、多数の構築物（各々、前記の多数のエピトープのうちの1個をコードしているか又は含んでいる）をその個体へ投与する工程を含む。その構築物は、問題のエピトープを含むペプチドをコードする能力を有する核酸配列であってもよいし、又は直接投与され得るエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質／ポリペプチドであってもよい。その核酸配列は、問題のエピトープのうちの1個又は複数個を含むペプチドをコードする能力を有するDNA、RNA、又はcDNAであり得る。構築物がペプチドをコードする核酸配列であるか又はペプチド自体であるかに関わらず、個体の免疫系へと効率的に提示され得るよう、構築物を保持する媒体を使用することが好ましい。好ましくは、構築物は、核酸発現ベクター、例えばウイルスベクター、又はAPC 、例えば樹状細胞もしくはリンパ球、例えばB細胞のような別々の媒体により、各々提示されるか又は保持される。媒体は、免疫応答の誘導を補助するアジュバントとして作用してもよい。APCは、ペプチド構築物を発現させるために使用されてもよいし、又は投与前にパルス処理されてもよい。
本発明の第一の面に係る方法は、「第二の」又はさらなる追加刺激組成物を投与することをさらに含み得る。この組成物も、前記の多数のエピトープのうちの1個を各々含む個々の構築物を含むと思われる。ここでも、構築物は、ペプチドであってもよいし、又は前記のペプチドをコードする能力を有する核酸配列であってもよい。
第二の又はさらなる追加刺激組成物の投与は、投与されたエピトープに対する個体の免疫応答を追加刺激するのみならず、個体が未だ病原体又は腫瘍の被曝によって自然に初回刺激されていない薬剤内に存在する任意のエピトープに対する「第一の」追加刺激を提供するという利益を有する。換言すると、第二の／さらなる追加刺激組成物は、個体が過去に被曝したことがない、薬剤（「第一の」追加刺激組成物）内に提示された任意のエピトープが、効率的に初めて追加刺激されることを保証する。
又は、本発明は、病原体又は腫瘍に関連した抗原に対して個体を免疫するため、即ち予防的ワクチンとして使用されてもよい。この状況において、個体の免疫系は、まずその病原体に特徴的な多数のエピトープにより初回刺激され、次いで免疫系がその病原体に対する有効な防御を誘起するのを補助するため、追加刺激されなければならない。これは、初回刺激−追加刺激計画として既知である。しかしながら、前記のように、本発明者らは、あらゆる各エピトープに対する免疫応答を最大にするためには、追加刺激段階において、エピトープが個々に投与されなければならないことを見出した。さらに、本発明者らは、異種初回刺激−追加刺激計画が、当技術分野において既に記載されている同種初回刺激−追加刺激法より好ましいことも決定した。従って、追加刺激段階において、初回刺激段階で使用された媒体とは異なる非交差反応性の別の媒体、例えばウイルスベクターを使用して、多数のエピトープを投与することも好ましい。
従って、本発明の第二の面において、個体における多数のエピトープに対する免疫応答、好ましくはCD8＋T細胞免疫応答を誘導する方法が提供される。前記の方法は、前記の多数のエピトープをコードしているか又は含んでいる構築物を含む初回刺激組成物を個体へ投与し、次いで複数個の個々の構築物（各々、前記の多数のエピトープのうちの1個を含んでいる）を含む追加刺激組成物を投与する工程を含む。
第二の面によると、構築物は、ペプチド（タンパク質／ポリペプチド）であってもよいし、又は前記のペプチドをコードする核酸配列であってもよい。この構築物も、エピトープを個体の免疫系へ効率的に呈示する能力を有する媒体を使用して投与されることが好ましい。従って、構築物が核酸配列である場合、これは、核酸発現ベクター、即ちプラスミドベクター又はウイルスベクターに含まれていてもよい。これらのベクターは、同様に、抗原提示細胞（APC）のような細胞に含まれていてもよい。
構築物がペプチドである場合には、細胞、より好ましくはAPCを、媒体として使用することが好ましいかもしれない。それは、これらの細胞が、ペプチドを免疫系へ効率的に呈示する能力を有するためである。APCの例には、樹状細胞及びリンパ球が含まれる。
媒体を使用した個体への構築物の投与は、より詳細に後で記載される。
初回刺激組成物は、多数のエピトープをコードする核酸を各々含有している核酸ベクター1個又は複数個を含み得る。又は、初回刺激組成物は、多数のエピトープを含有しているペプチド又は抗原を含んでいてもよい。
この第二の面において、初回刺激組成物は、エピトープのストリング、即ちポリエピトープ構築物を含む。しかしながら、本方法は、その代わりに、多数のエピトープのうちの1個又は複数個をコードしているか又は含んでいる構築物1個又は複数個の投与を含んでいてもよい。しかしながら、この状況において、初回刺激−追加刺激計画は、異種初回刺激−追加刺激計画であることが好ましい。換言すると、初回刺激組成物が個々のエピトープを含む場合、追加刺激組成物は、好ましくは、異なる非交差反応性の媒体を使用して、その個々のエピトープを保持するか又は提示する。
例えば、核酸構築物が使用される場合には、初回刺激期と追加刺激期とで異なるウイルスベクターが使用され得る。同様に、ペプチド構築物の場合には、初回刺激期と追加刺激期とで異なるAPC細胞が使用され得る。例えば、初回刺激にはB細胞を使用し、追加刺激には樹状細胞を使用するということが可能である。
これは本発明の好ましい態様であり、同種初回刺激−追加刺激計画も、ペプチド構築物を使用する場合には特に、本発明の範囲内であることが理解されなければならない。
全ての初回刺激核酸構築物が、組換え構築物、例えば組換えウイルス構築物、DNA構築物、RNA構築物のような遺伝子構築物、又はそのような構築物によりトランスフェクトもしくは形質導入された細胞であることも好ましい。さらに、初回刺激組成物には、別々のペプチド又はタンパク質、及びそのようなペプチド又はタンパク質が細胞外又は細胞内に負荷された細胞が含まれ得る。ペプチドは、担体タンパク質又はアジュバントとの融合構築物の一部を形成していてもよい。これらは、融合タンパク質として作製され得る。
追加刺激組成物又は初回刺激組成物が、ペプチド又はタンパク質を含む場合、これらは、（ペプチド又はタンパク質のAPCへの細胞内送達を含む）ペプチド及び／又はタンパク質によるパルス処理を施された抗原提示細胞（APC）、例えば樹状細胞又はリンパ球（B細胞）を使用して送達され得る。APCは、ペプチド又はタンパク質でパルス処理された後、APCの活性化を補助するためウイルスにより感染されてもよい。即ち、この場合、ウイルスはペプチドのためのアジュバントとして作用する。
セファロースビーズ又はキチン（chitine）ビーズのような粒子も、APCを模倣し、免疫系の刺激のためペプチド／MHC複合体及び共刺激分子を呈示するために使用され得る。
APCに由来するエキソソーム（exosome）又はその他の細胞成分体も、ペプチドエピトープの送達のため、（ペプチド又はタンパク質のエキソソームへの細胞内送達を含む）ペプチド及び／又はタンパク質によるパルス処理を施され得る。
ペプチド又はタンパク質を、個体へ直接、好ましくは別々の位置において投与することも可能である。このようにして投与されるペプチド又はタンパク質には、好ましくは、初回刺激期又は追加刺激期のいずれかに、アジュバントが添加される。
媒体として核酸ベクターが提供される場合、エピトープをコードする核酸は、核酸の発現による個体における前記の抗原の産生のため、制御配列と機能的に連結されていることが好ましい。
初回刺激組成物が多数のエピトープを提示するため、広いが特異的なCTL応答が、個体の免疫系により誘導される。
初回刺激組成物とは対照的に、追加刺激組成物は、常に、エピトープを個々に提示する。このことにより、既存の記憶CTL応答が、追加刺激期における同一構築物に含まれている他のエピトープに対するCTL応答を有意に低下させるという、本発明者らにより決定された問題が克服される。
初回刺激組成物（使用される場合）又は追加刺激組成物は、核酸構築物を使用する場合、エピトープをコードする核酸構築物を保持するための任意の媒体、例えばアデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターのようなウイルスベクターをさらに含み得る。ウイルスベクターは、修飾型複製欠損ベクター、例えば修飾型ウイルス・アンカラ（Ankara）（MVA）であってもよいし、又はアビポックス（avipox）ベクター、例えば鶏痘（fowlpox）、カナリアポックス（Canarypox）等であってもよい。好ましいベクターには、複製能のないαウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（SFV）が含まれる。その他の適切なベクターは、当業者には明らかであると思われる。
初回刺激組成物は、抗原をコードするDNAを含み得る。DNAは、哺乳動物細胞における複製能を有しない環状プラスミドの形態であってもよい。抗原の発現は、好ましくは、哺乳動物細胞において活性なプロモーター、例えばサイトメガロウイルス前初期（CMV IE）プロモーターにより駆動されると思われる。
CD8＋T細胞免疫応答は、DNAワクチン、Ty-VLP、又は組換え修飾型ワクシニアウイルス・アンカラ（MVA）を使用して初回刺激され得る。後述の実施例において、本発明者らは、初回刺激期に、組換えMVA、裸プラスミドDNA、ワクシニアウイルス、及びセムリキ森林熱ウイルス（SFV）を使用した本発明の態様を記載する。しかしながら、他のベクター（ウイルスベクター又はその他のベクター）も同様に使用され得ることが、当業者には明らかであると思われる。
前述のように、追加刺激期には、初回刺激期に使用されたものとは異なる非交差反応性の、核酸発現ベクター、例えばウイルスベクターのような媒体を、エピトープを呈示するために使用することが好ましい。後述の実施例において、初回刺激期にはプラスミドDNAが媒体ベクターとして使用され、追加刺激期にはワクシニアベクター、MVAベクター、及び／又はSFVベクターが媒体として使用された。追加刺激期には複数個のベクターが媒体として使用されると思われるが、これらは、同一であってもよいし、又は異なっていてもよい。
従って、本発明の第一及び第二の面により、自己抗原又は腫瘍抗原を含む病原体に対して個体を予防接種する方法として使用され得る新規の予防接種計画が提供される。NY-ESO-1抗原、チロシナーゼ抗原、及びMelan-A抗原の使用が以下に例証される。しかしながら、その他の抗原も既知であるか、又は当業者により決定され得る。
さらに、本発明は、予防接種の戦略又は計画を試験し確立するための予防接種モデルとしての重要な有用性を有する。従って、予防接種モデルによって、多数のエピトープに対する特異的であるが広域性のCTL応答を最大にする予防接種計画が確立され得る。
臨床試験においてヒトで試験する前に、マウスのような実験動物でワクチン計画を試験するのが通常である。トランスジェニックマウスは、従来、特定の抗原又はエピトープに対する応答を試験するために使用されている。ヒト環境と可能な限り等しい生物学的環境を提供することが重要である。従って、ヒトのMHC分子を発現する能力を有するトランスジェニックマウスが作製される。後述の実施例において、本発明者らは、二つの型のトランスジェニックマウスを使用した。
第一に、ヒトβ2mのC末端が、キメラ重鎖（HLA-A2.1α1-α2、H-2Dbα3膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメイン）のN末端に共有結合的に連結されている、トランスジェニック単鎖組織適合性クラスI分子を発現するHHD A2トランスジェニックマウスを使用した。これらのマウスのH-2Db遺伝子及びマウスβ2m遺伝子は、相同的組み換えにより破壊されており、血清学的に検出可能なマウス組織適合性クラスI分子の細胞表面発現は完全に欠如している。
第二に、本発明者らは、マウスβ2mと非共有結合的に会合しているキメラ重鎖（HLA-A2.1α1-α2、H-2Kbα3膜貫ドメイン及び細胞質ドメイン）を発現するA2-Kbマウスを使用した。
従って、これらのトランスジェニックマウスは、いずれも、α1及びα2のドメインがヒトA2 MHCに由来し、α3ドメインがマウスのH-2Kb又はH-2Dbに由来するキメラMHCを発現する。これらのマウスは、A2トランスジェニックマウスと呼ばれる。しかしながら、本発明は、HLA-A1、HLA-A3、又はHLA-A4トランスジェニックマウス、即ちA2トランスジェニックマウスと類似の様式でヒトクラスI分子を発現するその他の任意のマウスモデルにおいても、同様に実施され得る。
従って、本発明は、多数の被験エピトープをコードする核酸を含む一次組成物を試験動物へ投与し、続いて、前記の多数の被験エピトープのうちの1個を各々含有している核酸ベクターを複数個含む追加刺激組成物を投与する工程;及び被験エピトープの各々に対するCTL応答を決定する工程を含む、予防接種計画を試験する方法をさらに提供する。
好ましくは、試験動物は、可能な限りヒトの免疫環境に近似した免疫環境を提供するトランスジェニック動物であると思われる。好ましい試験動物は、本明細書に記載されたようなA2トランスジェニックマウスである。
前述のように、初回刺激ベクターは、好ましくは、DNAプラスミド又はウイルスベクターである。しかしながら、追加刺激ベクターは、好ましくは、初回刺激ベクターとは異なる。好ましい態様において、初回刺激ベクターはDNAであり、追加刺激ベクターはワクシニア、MVA、及び／又はSFVの群より選択される。SFVは、DNA初回刺激ベクターの後又はMVAと共に追加刺激ベクターとして使用された場合、優れた結果が達成されることを本発明者らが決定したように、追加刺激期のための好ましいベクターである。SFVは、MVAと交差反応せず、従って、これらの免疫原ベクターは効率的に併用され得る。本発明者らは、ウイルスベクターの一部であるか否かに関わらず、核酸構築物が、抗原がその表面上に提示されるよう哺乳動物細胞と会合して投与され得ることも見出した。抗原がそれらの表面上に提示される場合、そのような細胞は、抗原提示細胞（APC）として既知である。従って、APCという用語には、腫瘍細胞のような細胞が含まれる。構築物を保持するためのAPCの使用は、追加刺激段階において特に好ましい。従って、可能な追加刺激試薬には、ウイルス性もしくは非ウイルス性の核酸構築物によりトランスフェクトもしくは形質導入された樹状細胞もしくはリンパ球、又は抗原を呈示している腫瘍細胞のようなAPCが含まれる。
本発明の第一の面の特定の態様において、初回刺激組成物の投与の後に追加刺激組成物が投与される。ここで、初回刺激組成物と追加刺激組成物とは、例えば以下に例証されるように相互に異なっている。しかしながら、前記のような本発明の方法において、第二及び第三の追加刺激組成物が投与されてもよい。一つの態様において、三重免疫計画は、多数のエピトープを発現するDNA;続いて、多数の初回刺激エピトープのうちの1個を各々含むSFVベクターが多数使用された第一の追加刺激組成物としてのSFV;続いて、多数の初回刺激エピトープのうちの1個を各々含むMVAベクターが多数使用された第三の追加刺激組成物としてのMVAを使用する。又は、SFV追加刺激組成物が、MVA追加刺激組成物の後に投与されてもよい。
同様に、ペプチドが直接投与される場合には、ペプチドでパルス処理されたAPC、エキソソーム、又はAPC模倣体が、いくつかの連続的な追加刺激工程のために使用され得る。これは、連続的な注射により達成され得る。
いかなる場合にも、良好な送達を保証するため、数回、初回刺激組成物及び追加刺激組成物を（例えば注射により）投与することが好ましい。
多数のエピトープを発現するベクターによる初回刺激の後、多数の初回刺激エピトープのうちの1個又は複数個を含む組換えウイルス（即ち、SFV又はMVAのいずれか）の混合物が使用され、その後、多数の初回刺激エピトープのうちの1個を各々コードするペプチドの注射に基づくさらなる追加刺激が行われてもよい。ペプチドは、好ましくは、5〜15アミノ酸長であり、より好ましくは5〜12アミノ酸長であり、より好ましくは5〜10アミノ酸長である。9アミノ酸長のペプチドが好ましい。ペプチドは、天然に存在するものであってもよいし、又は合成のものであってもよい。
本発明者らは、予防接種の計画又は戦略を試験する方法を増強するためには、誘発されたCTL応答の、正確で、効率的で、かつ高速の試験が必要とされることを認識した。これを考慮して、本発明者らは、予防注射を受けたHLA A2トランスジェニックマウスにおいて増幅されたHLA A2拘束性CTLの頻度を直接モニタリングするための、新規の四量体に基づく技術を開発した。これは、本発明の第一の面と関連して、ヒトCTL応答の迅速かつ正確な分析を可能にすることにより、新たなワクチンの開発を大きく加速すると思われる。
特に、本発明者らは、マウスH2Kbα3ドメインを含有しているキメラA2クラスI分子を設計することにより、A2トランスジェニックマウスの血中のA2拘束性CTL応答を直接モニタリングするための技術を開発した。この技術により、多数の異なるベクター内にコードされたポリエピトープ構築物を使用した初回刺激−追加刺激計画により誘導されたCTLの頻度、及びこれらCTLの頻度とそれらのインビボ細胞障害活性との相関を正確にモニタリングすることが可能となる。これは、CTL応答を解明するためにマウスを屠殺する必要がないため、各研究におけるマウスの数を大きく低下させるという長所を有している。
従って、本発明のさらなる面において、1個又は複数個のエピトープによる個体又は試験動物の予防接種の後に増幅された特異的なCTLを検出する能力を有する多量体MHC構造が提供される。その多量体MHC構造は、ストレプトアビジンのような結合メンバーにより単一構造内に共に維持された2個またはそれ以上のMHC分子、好ましくは4個の分子を含む。ここで使用されるストレプトアビジンは、CTLの四量体との結合の検出のために蛍光標識され得る。多数のMHC分子が近傍に維持されるため、それらは、目的のエピトープに対して誘起されたCTLが検出されるよう、ペプチドの形態でそのエピトープを呈示するために効率的に使用され得る。効率的に初回刺激された場合、CTLは、呈示されたペプチド／エピトープを認識し、その構造に結合すると思われる。この結合は、通常、標識された抗体、例えば抗CD8抗体と組み合わせられる、フローサイトメトリーのような既知の技術により検出され得る。
しかしながら、本発明者らは、MHCがヒト起源であるのに対し、試験動物は非ヒト、通常マウスであり、従ってヒトMHCに効率的に結合しないマウスCD8を有すると考えられるため、前記の予防接種モデルにおけるCTL応答を試験するのための、これらの多量体MHC構造、好ましくは四量体の使用には限界があることを見出した。
この問題を克服するため、本発明者らは、MHCのヒトα3ドメインがマウスα3ドメインに交換されたキメラ多量体MHC構造を考案した。α3ドメインがCD8分子と結合するため、キメラ多量体MHC構造は、非キメラ構造より、被験エピトープに対するCTL応答を検出する効果が高い。
従って、本発明は、各MHC分子が、ヒトα3ドメインの代わりにマウスα3ドメインを表わすよう改変されたα3ドメインを含有している、結合メンバーにより近傍に維持された少なくとも2個のヒトMHC分子を含むキメラ多量体MHC構造をさらに提供する。好ましくは、ヒトα3ドメインはマウスα3ドメインに交換されている。キメラ多量体MHC構造は、被験エピトープを呈示するペプチドと複合体化されてもよい。
マウスα3ドメインは、融合タンパク質の作出により、又はマウスα3ドメインに特徴的なアミノ酸もしくはアミノ酸をコードするヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によるヒトα3ドメインの変異により、ヒトα3ドメインと交換するためにヒトMHCへ挿入され得る。理想的には、キメラMHCは、ヒトα1ドメイン及びヒトα2ドメインをコードする核酸が、マウスα3ドメインをコードする核酸と共に発現される融合タンパク質として作製される。このようにして、キメラMHC融合タンパク質は作製される。
次いで、多量体キメラMHC構造は、被験エピトープを呈示するペプチドと会合させられ得る。キメラMHCにより呈示されるペプチドの数は、多量体構造内のMHC分子の数に依存すると思われる。本発明者らは、4個のペプチド／エピトープが近傍で呈示されることを可能にすると思われる四量体を作製した。従って、この構造は、問題のエピトープに対するCTL応答の存在を検出するために使用され得る。例えば、四量体はペプチド／エピトープを呈示し、そして試験動物より得られた生物学的試料（例えば、血液）に添加された場合、エピトープを認識する任意のCTLが、マウスCD8の補助によってその四量体に結合すると思われる。マウスCD8は、ヒトα3ドメインより良好にマウスα3ドメインに結合するため、本発明に係るキメラMHC四量体とのCTLの結合は、非キメラMHC四量体との結合より安定している。
四量体のCTLとの結合は、例えば、蛍光標識された四量体を使用することにより検出され得る。さらに、標識されたCD8抗体が、検出を補助するために使用されてもよく、標識及び染色の技術は、当業者に既知である。
キメラ多量体MHC構造は、前記の予防接種計画によるCTL応答のモニタリングにおいて極めて有用であるのみならず、特定のタンパク質内のエピトープを迅速かつ効率的に決定するためにも使用され得る。
例えば、DNA及び／又は組換えウイルスによりコードされた明確な腫瘍又はウイルスの（1個又は複数個の）抗原性タンパク質により免疫されたA2トランスジェニックマウスは、その（1個又は複数個の）抗原性タンパク質に由来するペプチドと会合したキメラ多量体MHCクラスI分子を使用することにより、特異的なCTL応答を開始させる能力に関してモニタリングされ得る。このプロトコールにより、抗原性タンパク質内にコードされた新規のペプチドエピトープの迅速な同定が可能となると思われる。
本発明者らの発見は、複数個のエピトープに特異的な多数のCTLを同時に増幅することができる最適化されたワクチンの設計にとって重要である。それらは、迅速で、効率的で、かつ信頼性のあるエピトープの試験を可能にし、そして最も効率的な予防接種計画の設計を可能にする予防接種モデルの提供に関しても重要である。
本発明者らは、試験動物における試験エピトープに対するCTL応答を効率的に検出するために使用され得る新規のキメラMHC多量体も考案した。
以下、添付の図面を参照しつつ、本発明の面及び態様を例として例示する。さらなる面及び態様が、当業者には明らかとなると思われる。この書類において言及された全ての文献が、参照として本明細書に組み込まれる。
詳細な説明
材料及び方法
プラスミドDNA構築物
研究の全体にわたり使用されたDNAベクターpSG2は、SV40複製開始点及びネオマイシン耐性マーカーを含有しているBamHI断片を除去し、CMVプロモーターを、イントロンAを含有している同プロモーターのより長いバージョンに交換することにより、pRc/CMV（Invitrogen、Paisley、UK）から派生した。得られたプラスミドは、マルチクローニングサイト及びウシ成長ホルモンポリA配列の前に、真核細胞における発現のためのイントロンAを含むCMVプロモーターを含有している。このプラスミドは、哺乳動物細胞における複製能を有しない。mel3配列（表1）をコードする遺伝子が、標準的な方法を使用してマルチクローニングサイトへ導入された。注射用のプラスミドDNAは、陰イオン交換クロマトグラフィー（Qiagen、Hilden、Germany）を使用して精製され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1mg DNA/mlに希釈された。
組換えワクシニアウイルス及びMVAの作製
組換え及び非組換えのMVAは、10％ウシ胎仔血清（FCS）が補足された最小必須培地において増殖したニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）において、常法により繁殖させられ滴定された。組換えMVAは、ワクシニアシャトルベクターpSC11へmel3ポリエピトープストリング（表1）をクローニングすることにより、記載されたようにして作成された。1細胞当たり0.05pfuの多重度でMVAにより感染されたCEFが、記載されたようにして23、リポフェクチン（Gibco）及びシャトルプラスミドによりトランスフェクトされた。ワクシニアP7.5プロモーターがポリエピトープの発現を駆動する。組換えMVAは8回プラーク精製された。
mel3、全長NY-ESO-1（Dennis L.Panicali、Therion Biologics Corporation、MA 02149、USAより譲り受けた）、又はチロシナーゼを発現するワクシニアウイルス（WR株）は、以前に記載されたようにして24、ベクターpSC11を使用して、mel3ポリエピトープ構築物、NY-ESO-1及びチロシナーゼの全長cDNAをチミジンキナーゼ遺伝子へクローニングすることにより作成された。
組換えSFVの作製
mel3ポリエピトープストリングが、トランスファーベクターpSFV4.2-mel3へクローニングされた。このベクターから作製されたRNAが、組換えSFVmel3粒子を構築するために使用された。組換えSFVストックは、以前に記載されたようにして16、作成され精製された。
ヒトCTLクローンの作製及びCTLアッセイ法
ヒトCTLクローンは、記載されたようにして25、単離された。簡単に説明すると、5％ヒト血清、100U/ml IL-2が補足されたイスコブ（Iscove）培地中の105個の照射済みB細胞を含有している、PBS中100ng/mlの抗CD3及び抗CD28の両方で予めコーティングされたU底96穴プレートへ、四量体／CD8二重陽性染色CTL培養物が単一細胞として分取された。増殖性クローンを、＞107個にまで増幅し、標準的なCr51放出アッセイ法のためのエフェクターとして使用した。本発明者らは、HLA A2拘束性CTLの標的としてMVA mel3により感染されたJY B細胞を使用し、HLA-A1拘束性エピトープに関してはXY B細胞を使用し、Db拘束性インフルエンザ核タンパク質の標的としてH-2b陽性MC57細胞を使用した。本発明者らは、標的に対して3倍希釈でCTLクローンを滴定した。
四量体合成
蛍光四量体HLA-A2.1／ペプチド複合体は、以前に記載されたようにして1、合成された。A2-Kb／ペプチド複合体は、A2.1分子のα1ドメイン及びα2ドメイン並びにH-2Db分子のα3ドメインのキメラ重鎖をヒトβ2-ミクログロブリンと共に使用して、類似の方式で合成された。
PBLの単離及び四量体染色
赤血球溶解緩衝液（Invitrogen、Paisley、UK）を使用して、尾静脈から採取された血液より、新鮮なPBLが単離された。四量体染色については、3×105個の細胞が、10％FCSが補足されたRPMI1640（Sigma、St Louis、MO）20μlに再懸濁させられた。細胞は、37℃で15分間、四量体と共にインキュベートされた。次いで、PBLは、4℃で15分間、ラット抗マウスCD8α（Pharmingen、San Diego、CA）と共にインキュベートされた。細胞は、PBSで2回洗浄され、FACScan（Becton Dickenson、Mountain View、CA）分析のためPBSに再懸濁させられた。
動物及び免疫プロトコール
HHDマウスは、ヒトβ2mのC末端が、キメラ重鎖（HLA-A2.1 α1-α2、H-2Dbα3膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメイン）のN末端に共有結合的に連結されているトランスジェニック単鎖組織適合性クラスI分子を発現している20。これらのマウスのH-2Db遺伝子及びマウスβ2m遺伝子は、相同的組み換えにより破壊されており、血清学的に検出可能なマウス組織適合性クラスI分子の細胞表面発現は完全に欠如している。A2-Kbマウスは、マウスβ2mと非共有結合的に会合したキメラ重鎖（HLA-A2.1α1α2、H-2Kbα3膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン）を発現している。それらは、さらに、C57BL/6に由来する（H-2b）クラス1a及び1bマウス組織適合性分子のフルセットを発現している26。使用された全てのA2トランスジェニックマウスが、本発明者らの動物施設において交配された。4〜6週齢の雌C57/BL6マウスは、ハーラン・オーラック（Harlan Orlac）（Shaws Farm、Blackthorn、UK）より得られた。プラスミドDNA（25〜50μg／筋肉）がPBSに溶解させられ、全身麻酔下の各頸骨筋へ注射された。DNA注射後10日目に、PBSで106〜107pfuに希釈され、外側尾静脈へ静脈（i.v.）注射された組換えワクシニアウイルスにより、マウスが追加刺激された。又は、新鮮に単離された脾臓細胞が、37℃で0.1％BSAが補足されたRPMI中で、90分間、mel3ワクシニア、全長チロシナーゼワクシニア、及び全長NY-ESO-1ワクシニアにより別々に感染された（感染多重度5）。細胞が3回洗浄され、6×107個/mlの濃度で無菌PBSに再懸濁させられ、合わせられ、外側尾静脈へ注射された。マウスは6×106個の脾臓細胞を受容した。
インフルエンザウイルスA型（PR8）により初回刺激されたマウスは、鼻腔内インフルエンザ注射により感染された（20HAU／匹）。30日後、マウスは、前記のようにして、DNA.mel3、続いてMVA.mel3を注射された。SFV-mel3による初回刺激又は追加刺激については、108個のウイルス粒子が無菌PBSで希釈され、外側尾静脈へ注射された。
インビボ死滅
HHDマウスから新鮮に単離された脾臓細胞が、2時間、10-6Mの濃度の異なるペプチドと共にRPMI培地中で別々にインキュベートされた。次いで、インビボの異なる集団の同時の追跡を可能にするため、異なる濃度のカルボキシフロオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）（CFSE、Molecular Probes、Eugene、Oregon）により各細胞プールが標識された27（Hermans,I.F.、Yang,J.及びRonchese,F.の未発表の結果）。標識された細胞がプールされ、107個／匹で尾静脈へ注射された。5-(及び-6-)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン（CellTracker Orange、Molecular Probes、Eugene、Oregon）により標識されたペプチドを含まない対照集団が、未パルス処理細胞と比較された、ペプチドでパルス処理された標的の死滅を査定するために共注射された。マウスは、異なるエピトープに対するCTL頻度を決定するため、蛍光色素標識標的の注射の時点で採血された。注射後5時間目に新鮮に単離されたPBMCのFACS分析を使用して、ペプチド／蛍光色素標識細胞の消失が追跡された。セルトラッカーオレンジ（Cell Tracker Orange）で標識された未パルス処理集団に対する相対死滅率が計算された。100−（100×（パルス処理％／未パルス処理％））。WinMDI 2.8及びセルクエスト（CellQuest) 3.3ソフトウェアが、facsデータを分析するために使用された。
結果
5個のHLA-A2黒色腫エピトープ及び2個のHLA-A1黒色腫エピトープのストリングが、4個の別個のベクター；a）裸プラスミドDNA（mel3.DNA）;b）ワクシニアウイルス（mel3-ワクシニア）;c）修飾型ワクシニア・アンカラ・ウイルス（mel3.MVA）;d）セムリキ森林熱ウイルス（mel3-SFV）へクローニングされた。ヒト及びマウスのクラスI分子により拘束されたCTL応答のモニタリングを保証するため、本発明者らは、H-2DbクラスI分子により拘束されたインフルエンザ核タンパク質（NP）由来の付加的なエピトープを導入した。アミノ末端NP366-374エピトープの提示は、近隣のアミノ酸残基の影響を受ける場合があることが以前に示されているため24、本発明者らは、ポリエピトープ構築物のカルボキシル末端にインフルエンザNP366-374エピトープを発現させることに決定した。ここで使用されたポリエピトープ構築物の配列は、表1に示されている。
MVAによりコードされたポリエピトープの効率的な提示
最初の実験は、mel.3構築物に含まれる各エピトープのA2結合親和性を比較するために実施された。これらの実験の結果から、mel3ペプチドエピトープが、A2分子に対する広範囲の結合親和性を有することが証明された。異なる濃度におけるインフルエンザマトリックスエピトープ58-66の提示を阻害する能力（データ示さず）により定義されたように、Melan-A 26-35ペプチド類似体28が、最も高い結合親和性を有し、NY-ESO-1 157-165ペプチド及びチロシナーゼ1-9ペプチドは、有意に低い親和性を有していた。最適な隣接残基がクラスI拘束性エピトープの提示を保証するのに重要であることが、本発明者ら及び他の研究者らによって以前に証明されている24、29。mel.3ペプチドエピトープが適切なプロセシングを受けることを確証するため、そしてA2分子との結合に関する競合が、低親和性エピトープのCTL認識を減損させないことを査定するため、mel.3ワクシニアを標的細胞に感染させ、ポリエピトープmel.3カセットに含まれる7個のエピトープの各々が、特異的CTLへと同時に提示されることを証明した（図1）。本発明者らは、プロテアソーム依存性の分解が、MAGE3 A2エピトープ271-279の提示を減損させることを以前に示した30。従って、mel3ワクシニアによる標的細胞の感染が、MAGE3 271-279特異的CTLによる溶解に対してそれらを感作する能力を有していることが観察されたのは、驚くべきことであった。さらなる実験によって、小胞体常在性プロテアーゼによるmel.3構築物のプロセシングと一致して、mel3構築物に含まれるMAGE3 271-279エピトープのプロセシングが、全長MAGE3タンパク質に含まれるもののプロセシングとは異なり、ラクタシステイン（lactacystein）抵抗性であり、非TAP依存性であることが証明された（データ示さず）。
ポリエピトープによりコードされたワクチンで予防接種されたマウスにおけるインフルエンザNP366-374特異的CTL応答
mel3ワクシニア感染細胞によるNP366-374エピトープの効率的な提示のため、本発明者らは、強力なNP366-374特異的CTL応答を誘導する異なる予防接種戦略の能力をC57/B6マウスにおいて査定することにした（図2）。NP特異的CTL応答のエクスビボモニタリングを、Db/インフルエンザNP366-374四量体を使用してPBLにおいて実施した。本発明者らは、同種初回刺激追加刺激予防接種プロトコールを異種のものと比較し（図2）、DNA又はMVAによる初回刺激によるCTL誘導の動力学を分析した（データ示さず）。これらの実験の結果より、異種予防接種戦略が、長期持続性のワクチン駆動CTL応答を誘導する能力を有し、その頻度が、同一抗原送達系の反復注射に基づく戦略により得られた頻度より最大100倍大きいことが確認された（図2）。
A2トランスジェニックマウスにおけるA2拘束性CTLの増幅
インビボのA2拘束性CTL応答を初回刺激するmel.3ポリエピトープ構築物の能力を試験するため、A2トランスジェニックマウスを、DNA-mel.3により初回刺激し、MVA-mel.3、ワクシニアmel.3、又はSFV-mel3により追加刺激した。
最初の実験は、Kbα3ドメインを含有しているキメラA2.1分子並びに内因性のDb分子及びKb分子を発現するA2.1トランスジェニックマウス（A2/Kbマウス）26を使用して実施した。A2拘束性応答を、Db拘束性インフルエンザNP366-374応答と同時にモニタリングすることができるよう、本発明者らは、PBL中の関連CTLを直接検出する能力も有する新規のA2/Kb四量体を使用した。A2/Kb四量体及びDb四量体による同時染色により、DNA.mel3によるA2/Kbマウスの初回刺激、それに続くMVA-mel.3が、melan-A 26-35及びインフルエンザNP 366-374に特異的なCTL応答を誘導することが証明された（図3）。対照的に、その他のmel.3エピトープに特異的な応答は、エクスビボ四量体染色により検出不可であった（データ示さず）。
インフルエンザNPエピトープ366-374及びmelan-Aエピトープ26-35に対するCTL応答を同時にモニタリングすることが可能であることから、本発明者らは、過去のインフルエンザウイルスの被曝が、A2/Kbマウスにおいてmelan-A 26-35特異的CTLを増幅する初回刺激−追加刺激プロトコールの能力を損なうか否かを研究することとした。強力なNP366-374特異的CTL応答を生成させるため、A2トランスジェニックマウスをインフルエンザウイルスにより免疫し、その後、DNA. mel3、続いてMVA- mel3を与えた（図3）。mel3ポリエピトープ構築物による予防接種前のNP366-374特異的CTLの増幅によって、melan-A特異的CTLの増幅が有意に低下することが、これらの実験の結果より証明された（図3）。melan-A特異的CTL応答を誘導するmel3初回刺激−追加刺激の能力に対する既存のflu特異的CTLの阻害効果（図3）より、異種予防接種戦略におけるT細胞の干渉が、広範囲の免疫応答の誘導を損なう可能性が浮上した。内因性マウスクラスI分子の存在により、A2KbマウスにおけるA2拘束性レパートリーは有意に狭小化され、従って、異なるワクチンによりコードされた決定基に特異的なA2拘束性CTL間の相互作用を研究する能力が妨げられる。
この理由のため、本発明者らは、A2トランスジェニックマウスHHD20において、初回刺激追加刺激プロトコールにおけるワクチン駆動CTL応答の階層をモニタリングすることにした。HHDマウスは、A2Kbトランスジェニックマウスとは異なり、Db-/-及びβ-2m-/-の背景でヒトβ-2ミクログロブリンに連結されたA2.1クラスI分子を発現しており、A2/Kbトランスジェニックマウスよりはるかに大きいA2拘束性T細胞レパートリーを有する20。
HHDマウスの初回刺激−追加刺激予防接種は多数の黒色腫特異的CTLを誘導する
DNA.mel3によるHHDマウスの初回刺激によって、予防接種を受けた全てのマウスにおいて、Melan-A特異的CTLが、エクスビボ四量体染色により検出可能な頻度にまで増幅された（データ示さず）。対照的に、NY-ESO-1及びチロシナーゼに特異的なCTLの増幅は、免疫されたマウスのうちの少ない割合においてのみ検出可能であり、チロシナーゼ1-9及びMage3 271-279に対する応答は、血液四量体染色において検出されなかった（データ示さず）。
付加的な実験により、全長NY-ESO-1をコードするワクシニアウイルスにより追加刺激されたDNA.mel3初回刺激マウスにおける有意なNY-ESO-1 CTL応答により示されるように、NY-ESO-1特異的CTL応答が、DNA.mel3注射により初回刺激されることが確認された（データ示さず）。対照的に、DNA.mel3により初回刺激することなくNY-ESO-1ワクシニアウイルスを注射した場合、NY-ESO-1 CTLの頻度は、はるかに低かった。DNA mel3で初回刺激されたマウスにチロシナーゼワクシニアを注射した場合にも、類似の結果が得られた（データ示さず）。
melan-A 26-35特異的CTLが、単一DNA予防接種後のドミナントなワクチン駆動CTL応答であったという観察より、初回刺激−追加刺激予防接種プロトコールにおける異なるワクチンによりコードされた決定基に特異的なCTL間の相互作用を研究する機会が与えられた。本発明者らは、ワクシニア.mel3（図4a）、MVA.mel3（図4b）、又はSFV-mel3（図4c）のいずれかによるDNA.mel3初回刺激HHDマウスの追加刺激によって、melan-A特異的CTLが、全CD8＋T細胞の70〜80％にまで増幅されることを観察した。NY-ESO-1エピトープ及びチロシナーゼエピトープに特異的な応答は、Melan-A特異的応答より有意に低かったが、それらの頻度はCD8＋T細胞の2〜30％の範囲であり、このことから、DNA初回刺激、及びコンピテントウイルス（即ち、Vac.mel3）又はインコンピテントウイルス（MVA.mel3及びSFV-mel3）のいずれかによる追加刺激によって、3個の別個の黒色腫特異的エピトープに特異的なCTLの頻度が有意に増強されることが確認された。本発明者らは、インビボの関連ペプチドでパルス処理された蛍光色素標識脾細胞を死滅させる能力により示されたように、ワクチン駆動CTLが細胞障害性であることを確認した（図4d）。これらの結果より、DNA.mel3により初回刺激され、3個の別個のウイルスベクターにより追加刺激されたHHDマウスにおけるmelan-A、NY-ESO-1、及びチロシナーゼに特異的な累積応答が、CD8＋集団の大多数の特異性を担っていることが証明された。
mel.3発現APCに関するワクチン駆動CTLの競合
melan-A特異的CTLを誘導する能力に対する既存のflu記憶CTL応答の阻害効果（図3）が証明されたため、本発明者らは、DNA初回刺激後の免疫応答を支配している多数のmelan-A特異的CTLが、ウイルス追加刺激中のNY-ESO-1及びチロシナーゼに特異的なCTLの増幅に干渉する能力を有するか否かを研究しようとした。
抗原提示細胞の表面における抗原認識に関する競合によって、頻度がより高いCTL集団の免疫優性（immunodominance）が起こることが知られている31-33。本発明者らは、DNA.mel3初回刺激後のmelan-A CTLのより高い数が、インビボでmel3ワクシニア感染APCの迅速な死滅又は遮蔽をもたらし、同APC集団により発現されたNY-ESO-1エピトープ及びチロシナーゼエピトープに特異的なCTLの刺激が妨げられるのだと推論した。
この推論より、NY-ESO-1タンパク質及びチロシナーゼタンパク質を発現しているAPCを、mel3構築物を発現しているAPCから分離することにより、より高頻度のNY-ESO-1及びチロシナーゼに特異的なCTL応答が入手され得るか否かを査定した。1）DNA.mel3により初回刺激され、全長チロシナーゼタンパク質及び全長NY-ESO-1タンパク質をコードするワクシニアウイルスの混合物により追加刺激されたマウスにおけるNY-ESO-1及びチロシナーゼに特異的なCTLの増幅（図5a）；2）全長NY-ESO-1、チロシナーゼ、及びmel3構築物をコードするワクシニアウイルスによりエクスビボで感染された脾細胞の等分物3個のDNA.mel3初回刺激マウスへの養子移植によるmelan-A、NY-ESO-1、及びチロシナーゼに特異的なCTLの同時の増幅（図5b、パネルa、b、及びc）（一方、mel3ワクシニアにより感染された脾細胞の養子移植は、Melan-A特異的CTLの増幅をもたらした（図5b、パネルd、e、及びf））により示されたように、これらの実験の結果より、この仮説が確認された。
本発明者らは、全長チロシナーゼ、全長NY-ESO-1、及びmel3構築物をコードする組換えウイルスの混合物によるDNA.mel3初回刺激マウスの追加刺激によって、melan-A26-35、NY-ESO-1157-165、及びチロシナーゼ369-377に特異的なCTLが同時に増幅されることを証明した（図6a及びb）。広い特異性を有する多数のCTLを同時に増幅するための良好な予防接種戦略の同定は、この型の最適化された追加刺激戦略により誘導されるT細胞免疫が、ポリエピトープ初回刺激追加刺激戦略に基づく予防接種よりも効率的に標的細胞のインビボ死滅を提供することが示されたため（図6c及びd）、重要な臨床的用途を有する。
Melan-A特異的CTLの免疫優性は、追加刺激の際に抗原を分離することにより破られうる。別々に感染された脾細胞が多価応答を追加刺激するために使用された場合には、関連ペプチドが別々に提示され、Melan-A、チロシナーゼ、及びNY-ESO-1に特異的なCTLが同時に増幅された。このアプローチを単純化するため、本発明者らは、ペプチドでパルス処理された樹状細胞を、MVA.mel3初回刺激応答を追加刺激するために使用した。追加刺激のために使用された細胞は、ペプチドの混合物でパルス処理されたもの（図7a）、又は別々にパルス処理されたもの（図7b）であった。本発明者らは、APCの別々のパルス処理が、ペプチドの混合物によるAPCのパルス処理よりも優れていることを示している。このアプローチは、多価CTL応答が、ワクシニアウイルス内にコードされたポリエピトープ構築物によって効率的に初回刺激され、ペプチドでパルス処理されたAPによって効率的に追加刺激され得ることも証明している。
考察
エクスビボアッセイ法における抗原特異的CTL応答のモニタリングの最近の進歩によって、異なる予防接種プロトコールの比較の性能は急速に改良されつつあるため、ワクチン開発には非常に勢いがある。腫瘍及びウイルスの抗原エスケープバリアントの生成を最小限に抑えるためには、ドミナントエピトープ及びサブドミナントエピトープの両方を含むいくつかのエピトープに特異的なワクチン駆動CTLの増幅を保証することが重要である。いくつかの論文が、ウイルス抗原34-36及び組織適合性抗原33、37、38に特異的なCTLの免疫優性を担う原因を検討している。しかしながら、どのようにすれば、最適なワクチン戦略によって、ドミナントエピトープ及びサブドミナントエピトープに特異的なCTLを同時に増幅し得るかは、未だ確立されていない。
これらの疑問を解明するため、本発明者らは、黒色腫CTLエピトープのストリング（表1）をコードする4個の別個のベクターを設計し、A2トランスジェニックマウス及び野生型B6マウスにおいて、ワクチン特異的なCTL応答を誘発する異なる予防接種戦略の能力を比較した。ドミナント決定基及びサブドミナント決定基に特異的なCTLを増幅する能力を有する戦略を同定するため、A2分子に対する高い結合親和性を有するペプチドエピトープ及び低い結合親和性を有するペプチドエピトープを、同一構築物内に連結した。より具体的には、本発明者らは、インビボでの増強された免疫原性を有することが以前に示されている修飾型melan-A類似体26-3528、及びA2分子に対するはるかに低い結合親和性を有することが示されているNY-ESO-1ペプチド157-16539を含めた（表1）。
mel3予防接種を受けたマウスにおけるワクチン駆動CTLの階層
本発明者らは、初回刺激−追加刺激計画で予防接種を受けたA2トランスジェニックマウスにおいて増幅されたA2拘束性CTLの頻度を直接モニタリングするための新規の四量体に基づく技術を開発した。マウスCD8のA2分子に対する結合親和性を増加させるため、マウスH-2Kbα3ドメインを含有しているA2分子（A2/Kb分子）を設計し、四量体A2Kb分子が、四量体A2分子と比較して、マウスA2拘束性CTLに対する増加した染色効率を有し、A2トランスジェニックマウスの大きな割合においてA2拘束性CTLを同定し得ることを証明した。
A2Kbマウスにおける免疫応答を研究する過程で、本発明者らは、Db分子の発現が、強力なインフルエンザNP366-374特異的応答をもたらし、それが、その他のmel3によりコードされたエピトープに特異的なCTLの増幅を有意に減損させることを証明した。異なるワクチンによりコードされた決定基に特異的なA2拘束性CTL間の相互作用を研究するため、本発明者らは、A2Kbトランスジェニックマウスとは異なりDb-/-背景でA2分子を発現するA2トランスジェニックマウスHHD20を免疫した。
いくつかの論文が、最近、ポリエピトープ構築物による予防接種を受けたA2トランスジェニックマウスにおける免疫応答を研究しているが19、20、40、A2トランスジェニックマウスにおけるポリエピトープワクチン駆動CTLの階層が、エクスビボ四量体染色によりモニタリングされた発表はこれが最初である。
本発明者らは、いくつかの予防接種戦略を比較し、非交差反応性ベクターの注射に基づく免疫（異種初回刺激−追加刺激プロトコール）が、同種ベクターの注射に基づく免疫より高いレベルのワクチン特異的免疫応答を保証することを確認した（図2）。同一ウイルスの反復注射により予防接種されたマウスにおけるCTL応答が、非交差反応性ベクターによる予防接種時のCTL頻度と比較して低いのは、ウイルス構造タンパク質に対する中和抗体の存在、及びウイルスタンパク質に特異的なCTLの存在によるのかもしれない（図2）。プラスミドDNAによりコードされる限定された数のタンパク質は、DNA初回刺激が組換えタンパク質に対する免疫応答に集束することを保証し、一方ウイルスによる追加刺激がこの応答を良好に増幅し、組換えタンパク質に特異的なCTLを高レベルにもたらすことが示唆されている。しかしながら、本発明者らは、MVA.mel3又はSFV.mel3のいずれかによる初回刺激が、それぞれインフルエンザウイルス又はMVA.mel3による追加刺激により、NP366-374特異的CTLの有意な増幅をもたらすことを示した（図2）。このことから、CTLを初回刺激する能力が、DNAベクターに特有のものではないことが証明された。
HHD A2トランスジェニックマウスにおいては、内因性マウスクラスI分子により拘束されるCTLの欠如のため、異種初回刺激追加刺激によって、melan-A特異的CTLが全CD8＋T細胞の最大90％にまで著しく増幅され（図4a）、従って、HHDマウスのA2拘束性レパートリーの大きな割合が、ワクチンによりコードされたCTL決定基へと再指向された。melan-A特異的CTL応答の免疫優性には、いくつかの要因が寄与している可能性がある。増加したA2分子及びTCRに対する結合親和性が、好都合な細胞内プロセシングと組み合わされたために、DNA.mel3初回刺激マウスにおいて、melan-Aエピトープ26-35へとCTL応答が偏向したのかもしれない。
ドミナントエピトープに特異的なT細胞応答による非ドミナントエピトープに特異的なT細胞応答の「抑制」は、両方の型の決定基が同一APC上に提示された場合にのみ観察されることが、以前の研究によって示されている32、33、38。多数のAPCの注射によって、サブドミナントエピトープに特異的なT細胞の増幅が起こった41。本発明者らは、melan-Aエピトープ26-35の免疫優性が、ポリエピトープ構築物ではなく、異なる組換えウイルスの混合物（図5a）又は全長タンパク質をコードする個々のワクシニアウイルスによりインビトロで感染された脾細胞（図5b）の注射に基づく追加刺激戦略により克服されることを証明した。
患者における予防接種戦略のための意義
いくつかの臨床試験が、現在、ポリエピトープ構築物を用いた異種初回刺激追加刺激予防接種プロトコールを使用しているため、これらの結果は重要である。本発明者らは、多数のワクチン特異的CTLを誘発する異種初回刺激追加刺激プロトコールの能力を確認し、異種初回刺激−追加刺激プロトコールにおいて、イムノドミナントCTL応答の頻度が、比較的ドミナントでない決定基に特異的なCTL応答の頻度を超えて有意に増幅されることを証明している。多数のメカニズムがワクチンに応答するCTLレパートリーを狭小化する原因となり得るが、本発明者らの結果は、抗原提示細胞（APC）に関するT細胞の競合に基づく免疫優性のモデルと一致している32、33、38。未感作マウスへのvac.mel3の注射によって、リンパ球増加症が誘導され、CD8＋の頻度が0.5％から30％へとシフトすることは、ワクシニアウイルスに対する強力なCTL応答を示しており、注目に値する。血中で誘導されたCD8＋T細胞のうち、50％もが、Melan-A 26-35に特異的であり（データ示さず）、これは、melan-A 26-35が、ウイルスの構造、転写、及び複製を担う200個を超えるワクシニアタンパク質の中で最もイムノドミナントなウイルス発現エピトープのうちの一つであることを証明している。この観察は、Melan-Aエピトープ26-35をコードするウイルスに基づくワクチンの設計にとって重要な臨床的意義を有する。本発明者らは、SFVが、MVAと組み合わせて初回刺激ベクターとして使用されてもよいし（図2）、DNAと組み合わせて追加刺激に使用されてもよい（図4C）ことを証明したため、初回刺激−追加刺激プロトコールにおける組換えSFVの使用は、極めて魅力的である。これらの結果は、マカークにおける、組換えSFVによる初回刺激及びMVAによる追加刺激により誘導されるサル免疫不全ウイルス特異的免疫応答の増強を証明している最近発表された報告11を支持する。
本発明者らは、既存の記憶CTL応答が、同一構築物に含まれる他のエピトープに特異的なCTL応答を有意に低下させることを証明した（図3b）。いくつかのグループが、予防接種試験において、イムノドミナントなインフルエンザペプチドエピトープを陽性対照として使用しているが、本発明者らの結果は、既存の記憶CTL応答が、他のワクチンによりコードされたCTL決定基に特異的なCTL応答を減損させる可能性があるため、DNA又はウイルスに基づくワクチンは、再発性ウイルスにより発現されるエピトープをコードすべきではないことを示唆している。
本発明者らは、さらに、T細胞競合が、初回刺激−追加刺激予防接種戦略におけるT細胞応答の修飾において役割を果たしている可能性が高いことを示した。本発明者らの研究は、初回刺激されたCTLの偏向したレパートリーへの異なるエピトープの同時の提示が、単一のCTL特異性のドミナントな増幅をもたらすことを強く示唆している。しかしながら、初回刺激された応答を、エピトープを別々に提示するAPCにより追加刺激することにより、複数の特異性のCTLがインビボで有効なレベルにまで比較可能に増幅される。
従って、本発明者らは、とりわけ、異なる予防接種プロトコールの、多価A2拘束性CTL応答を最適に誘導する能力を検討するための新規の系を提供した。本発明によれば、広域性のCTL応答を誘導するための方法は、多価構築物の使用を初回刺激期に制限し、追加刺激期には個々のエピトープをコードする別々のベクター、又は別々のタンパク質／ペプチドを使用すべきである。
参照文献
Figure 2008142086
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（表１）ポリCTLエピトープ構築物
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ポリCTLエピトープ遺伝子（mel3）は、エピトープの単一のストリングとして構築された。mel3カセットは、4個の別個のベクター；裸DNA、ワクシニアウイルスWR、MVA、及びSFVへクローニングされた。
mel3 CTLの効率的なプロセシング及び提示。HLA A2及びHLA A1陽性B細胞に、mel3.MVAを感染させ、mel.3ポリCTL構築物に含まれる各エピトープに特異的なCTLクローンの標的として使用した。各CTLクローンの特異性及び特異的溶解の割合（％）が、各パネルの上に示されている。標的細胞は、関連ペプチドでパルス処理されたか（＋ペプチド）、未パルス処理であるか（−ペプチド）、mel3 MVA（MVA.mel3）又は無関連ワクシニア（irr vac）のいずれかにより感染された。マウスNP366-374特異的CTLを、mel3.MVAにより感染されたマウスMC57繊維芽細胞に対するエフェクター細胞として使用した。各バーは、異なるエフェクター／標的比に対応している（黒いバー10：1、白いバー3：1、点付きバー1：1）。 同種及び異種の初回刺激追加刺激予防接種戦略により免疫されたマウスにおけるエクスビボのNP 366-374特異的CTLの頻度。各パネルは、異なる予防接種手法に対応している。 DNA.mel3及びそれに続くMVA.mel3によるA2/kbマウスの初回刺激−追加刺激。A．A2/kbトランスジェニックマウスにおけるDb及びA2拘束性CTLの同時生成。マウスを、DNA-mel3によりi.m.初回刺激し、10日後、MVA-mel3によりi.v.追加刺激した。DB/NP366-374及びA2/melan-A 26-35のエクスビボ四量体分析を実施した。MVA追加刺激から3日後の予防注射を受けた各マウスにおける四量体陽性細胞の頻度が示されている。B．ポリCTLエピトープ構築物に含まれる単一の決定基に特異的な既存の記憶CTL応答の効果。A2/Kbマウスをインフルエンザウイルスによりi.n.免疫し、その後、DNA.mel3、続いてMVA.mel3を注射した。Db/NP366-374及びA2/melan-A 26-35のエクスビボ四量体分析を実施した。MVA追加刺激から3日後の予防注射を受けた各マウスにおける四量体陽性細胞の頻度が示されている。 初回刺激−追加刺激ワクチン駆動CTLの階層。HHDマウスを、DNA.mel3により初回刺激し、vac.Mel3（A）、MVA.mel3（B）、又はSFV.mel.3（C）のいずれかにより追加刺激した。melan-A、チロシナーゼ、及びNY-ESO-1に特異的な応答の頻度を、エクスビボ四量体染色により同時に測定した。DNA.mel3で初回刺激されSFV.mel3で追加刺激されたマウス（C群）に、melan-Aペプチド、チロシナーゼペプチド、又はNY-ESO-1ペプチドのいずれかでパルス処理された蛍光色素標識脾細胞を注射した。インビボ死滅の割合（％）が示されている（D）。 Melan-A特異的CTL応答の免疫優性は、ポリワクシニアによる追加刺激、又はインビトロ感染脾細胞の養子移植により克服され得る。DNA.mel3初回刺激HHDマウスを、全長チロシナーゼ及び全長NY-ESO-1をコードするワクシニアウイルスの混合物により追加刺激した（A）。又は、DNA mel3初回刺激HHDマウスに、全長チロシナーゼワクシニア、全長NY-ESO-1ワクシニア、及びmel3.ワクシニアにより別々にインビトロで感染された脾細胞の等分物3個（B、パネルa、b、及びc）、又はmel3ワクシニアにより感染された脾細胞（B、パネルd、e、及びf）のいずれかを注射した。melan-A、チロシナーゼ、及びNY-ESO-1に特異的な応答の頻度を、エクスビボ四量体染色により同時に測定した。 ポリウイルスによる追加刺激は、melan-A26-35特異的CTLの免疫優性を克服する。DNA.mel3初回刺激HHDマウスを、全長チロシナーゼ、全長NY-ESO-1をコードするワクシニアウイルス、及びSFV.mel3の混合物（A）、又はSFV.mel3（B）のいずれかにより追加刺激した。melan-A26-35、チロシナーゼ369-377、及びNY-ESO-1157-165に特異的な応答の頻度を、エクスビボ四量体染色により同時に測定した。マウス6匹中1匹の染色が示されている。C及びD；各マウスに、melan-A26-35ペプチド、チロシナーゼ369-377ペプチド、又はNY-ESO-1157-165ペプチドのいずれかでパルス処理された蛍光色素標識脾細胞を注射し、インビボ溶解の％を計算した。パネルCは、全長チロシナーゼ、全長NY-ESO-1をコードするワクシニアウイルス、及びSFV.mel3の混合物により追加刺激されたDNA.mel3初回刺激HHDマウスにおけるインビボ死滅に対応しており、パネルDは、SFV.mel3により追加刺激されたDNA.mel3初回刺激HHDマウスにおけるインビボ死滅に対応している。 実験は、MVA.mel3により初回刺激され、ペプチドパルス処理樹状細胞（DC）により追加刺激されたマウスからのA2Kb四量体染色を示す。二つのマウス群が示されている。A群（3匹）は、3個のペプチド（Melan-A、チロシナーゼ、及びNY-ESO-1）の混合物でパルス処理されたDCを受容し、B群（4匹）は、単一のペプチドでパルス処理されたDCの混合物を受容した。図面の左側には、各群の1匹のマウスからの3個のエピトープに対する個々の1つの応答が示されている。図面の右側には、各群の四量体陽性CTLの平均割合（％）が示されている。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。実験は、ペプチドパルス処理DCが、組換えMVAにより初回刺激された多価CTL応答を効率的に追加刺激し得ることを示している（図4A、B、及びCを比較）。実験は、さらに、ペプチドの混合物でパルス処理されたDCと比較して、追加刺激のための別々にペプチドパルス処理されたDCの混合物が、多価応答を追加刺激する効果がより高いことを証明している。

Claims (38)

  1. 個体における免疫応答を追加刺激するための薬剤の調製における多数のエピトープの使用であって、個体が多数のエピトープのうちの少なくとも1個を過去に被曝したことがあり；薬剤が多数のペプチド（各ペプチドが該多数のエピトープのうちの1個を含む）を含む、使用。
  2. 個体が、自然に、又はエピトープのうちの1個もしくは複数個の投与により、多数のエピトープのうちの少なくとも1個を過去に被曝したことがある、請求項1記載の使用。
  3. 免疫応答がCD8＋T細胞免疫応答である、請求項1又は請求項2に記載の使用。
  4. 各ペプチドが抗原提示細胞と会合している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
  5. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項4記載の使用。
  6. 抗原提示細胞がリンパ球である、請求項4記載の使用。
  7. 薬剤がアジュバントをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用。
  8. 各ペプチドが細胞の表面に呈示されている、請求項1又は請求項2に記載の使用。
  9. 個体における免疫応答を誘導するための第一及び第二の薬剤の調製における多数のエピトープの使用であって、第一の薬剤が、1個又は複数個のペプチド（各ペプチドが多数のエピトープのうちの1個又は複数個を含む）を含む初回刺激組成物であり；第二の薬剤が、多数のペプチド（各ペプチドが該多数のエピトープのうちの1個を含む）を含む追加刺激組成物であり；第二の薬剤が第一の薬剤の後に投与される、使用。
  10. 免疫応答がCD8＋T細胞免疫応答である、請求項9記載の使用。
  11. 各ペプチドが抗原提示細胞と会合している、請求項9又は請求項10に記載の使用。
  12. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項11記載の使用。
  13. 抗原提示細胞がリンパ球である、請求項11記載の使用。
  14. 第一及び／又は第二の薬剤がアジュバントを含む、請求項9〜13のいずれか一項に記載の使用。
  15. 多数のエピトープが1個又は複数個の病原体に由来するものである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
  16. 多数のエピトープが腫瘍細胞に由来するものである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
  17. 個体における多数のエピトープに対する免疫応答を追加刺激する方法（個体が、多数のエピトープのうちの少なくとも1個を過去に被曝したことがある）であって、多数のペプチド（各ペプチドが該多数のエピトープのうちの1個を含む）を含む組成物をその個体に投与する工程を含む、方法。
  18. 個体が、自然に、又はエピトープのうちの1個もしくは複数個を含むペプチド1個もしくは複数個の投与により、多数のエピトープのうちの少なくとも1個を過去に被曝したことがある、請求項17記載の方法。
  19. 個体が試験動物であり、かつエピトープが試験エピトープである、請求項17又は請求項18に記載の方法。
  20. 被験エピトープの各々に対するCTL応答を決定する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
  21. 試験動物が、ヒト免疫環境に近似した免疫環境を提供するトランスジェニック動物である、請求項19又は請求項20に記載の方法。
  22. 試験動物がA2トランスジェニックマウスである、請求項21記載の方法。
  23. 各ペプチドが抗原提示細胞と会合している、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項23記載の使用。
  25. 抗原提示細胞がリンパ球である、請求項23記載の使用。
  26. 個体における多数のエピトープに対する免疫応答を誘導する方法であって、多数のエピトープのうちの1個又は複数個を含むペプチドを1個又は複数個含む初回刺激組成物を個体に投与し、次いで各々該多数のエピトープのうちの1個をコードするペプチドを複数個含む追加刺激組成物を投与する工程を含む、方法。
  27. 個体が試験動物であり、かつエピトープが試験エピトープである、請求項26記載の方法。
  28. 被験エピトープの各々に対するCTL応答を決定する工程をさらに含む、請求項27記載の方法。
  29. 試験動物が、ヒト免疫環境に近似した免疫環境を提供するトランスジェニック動物である、請求項27又は請求項28に記載の方法。
  30. 試験動物がA2トランスジェニックマウスである、請求項29記載の方法。
  31. 各ペプチドが抗原提示細胞と会合している、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項31記載の使用。
  33. 抗原提示細胞がリンパ球である、請求項31記載の使用。
  34. 1個又は複数個のエピトープによる個体又は試験動物の予防接種の後に増幅された特異的なCTLを検出する能力を有するキメラ多量体MHC構造であって、結合メンバーにより単一構造内に共に維持された2個またはそれ以上のヒトMHC分子（MHC分子がマウスα3ドメインを表す改変されたα3ドメインを含有している）を含む、キメラ多量体MHC構造。
  35. 改変されたα3ドメインがマウスα3ドメインである、請求項34記載のキメラ多量体MHC構造。
  36. 予防接種において使用されるエピトープを呈示しているペプチドとさらに複合体化されている、請求項34又は請求項35に記載のキメラ多量体MHC構造。
  37. 4個のヒトMHC分子を有する、請求項34〜36のいずれか一項に記載のキメラ多量体MHC構造。
  38. ヒトα1及びα2ドメイン並びにマウスα3ドメインを含む融合タンパク質である、請求項34〜37のいずれか一項に記載のキメラ多量体MHC構造。
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