JP2008113662A - 代謝調節型ｇａｂａ［ｂ］レセプター、レセプター特異的リガンドおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質、ならびにそのようなタンパク質をコードする核酸を提供すること。更にＤＮＡクローニング法および本明細書で提供される配列由来のプローブを使用したＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの他のメンバーの単離のための方法ならびにこのような方法で単離したＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの新規メンバーを提供することを課題とする。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの活性を調節する化合物の同定および特徴付けにおける、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質ならびにＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質をコードする遺伝子で形質転換した細胞の使用も課題とする。
【解決手段】ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびそれをコードするＤＮＡと有意な相同性を有する精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質を提供することにより解決する。
【選択図】なし

Description

本発明はＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーのタンパク質をコードする核酸、ならびにそれらによりコードされるタンパク質およびそのようなタンパク質の薬理活性物質の開発のための使用に関する。

γ−アミノ酪酸(ＧＡＢＡ)は脳および末梢神経系に見られる主要な抑制性神経伝達物質である。ＧＡＢＡのレセプターは、ＧＡＢＡ_ＡとＧＡＢＡ_Ｂレセプターの二つのサブファミリーに分割されている。これらの中で、ＧＡＢＡ_Ａレセプターは迅速型抑制シグナル伝達に関与し、一方、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは神経伝達の調節に関与しているように見える。前シナプス性ＧＡＢＡ_Ａレセプターは、ＧＡＢＡ、グルタメート、ノルアドレナリン、ドーパミン、５−ヒドロキシトリプタミン、サブスタンスＰ、コレシストキニンおよびソマトスタチンのような神経伝達物質および神経ペプチドの放出に影響し、一方後シナプス性ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、Ｇタンパク質を介してカリウムチャンネルに結合し、遅延性抑制性後シナプス電位(ＩＰＳＰ)を調整する。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの両方のサブタイプの活性化の効果は、シナプス性伝達の調節である。

ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは中枢および末梢神経系のいたる所に位置し(OngおよびKerr, Life Sciences, (1990) 46, 1489−1501;Bowery et al., Drug. Res. (1992) 42(1), 2a, 215−223参照)、従って、記憶および学習から筋肉収縮までの広範囲の神経制御生理学的応答の調節に関与する。このことにより、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは中枢および末梢神経疾患の処置を意図した薬剤の標的となり、実際種々のＧＡＢＡ_Ｂアゴニストおよびアンタゴニストが既知であり、治療への使用が提案されている(Bittiger et al., ＧＡＢＡ:Receptors, Transporters and Metabolism, Tanaka, C., およびBowery, N. G. (編) Birkhaeuser Verlag Basel/Switzerland (1996), 297−305;Bittiger et al., Trends Pharmacol. Sci., 14, 391−394, 1993;Froestl et al., J. Med. Chem., 38, 3297−3312, 1995;Froestl et al., 同書, 3313−3331)。例えば、アルツハイマー病および老人性痴呆症(Age Associated Memory Ｉmpairment)および脳血管性痴呆において、認識機能の損失は脳内の多くの神経伝達物質のレベルの減少に関連する。特に、Ｌ−グルタミン酸の不足は、Ｌ−グルタミン酸が記憶形成および学習の基礎を成す過程に重大に関与していると考えられるため、認識機能の大きな損失をもたらすと予測される。ＧＡＢＡは、多くのシナプスで直接作用し、ＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターに作用することによりＬ−グルタミン酸の放出を減少させる。従って、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストが痴呆症の処置に処方され、動物実験で認識機能を改善することが示されている。加えて、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストは鬱病、不安および癲癇のような精神医学的および神経学的疾患に作用することが予測されている(Bittiger et al., 1993, 1996, 前掲；Froestl et al., 1995, 前掲)。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアゴニストは抗痙攣剤として既知であり、末梢神経系投与において、アゴニストは気管支の炎症、喘息および咳に有益であることが予期される(Bertrand et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149, A900, 1994)。ＧＡＢＡは更に腸、心臓血管系、胆嚢および膀胱ならびに他の種々の組織での活性に関与する(OngおよびKerr, 前掲)。

上記の各場合に作用するＧＡＢＡはＧＡＢＡ_Ｂレセプターによって媒介されていることが既知であり、多くの疾病を処置するための薬剤の設計にこのレセプターが標的となる。
分子生物学およびタンパク質精製法の進歩、かつ薬理学的実験のために精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターを得る明確な要求にもかかわらず、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターはこれまでには均質物にまでクローン化または精製されていない。その部分的精製に関する先の報告は(Nakayasu et al., J. Biol. Chem., 268, 8658−8664, 1993)、現在我々が小さすぎることを知っている８０Kdaタンパク質に関して不正確であると考えられる。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターをクローンできるようにするために、我々は多くのＧＡＢＡ_Ｂレセプター特異的リガンドを開発している。高度に特異的な放射活性で標識したこのような高度に選択的なＧＡＢＡ_Ｂレセプターリガンドの一つを使用した発現クローニングにより、我々は本発明によりラットおよびヒト源から異なるＧＡＢＡ_Ｂレセプターをクローン化し、それらを配列決定し、哺乳類細胞培養において対応する組換えレセプターを発現させた。

本発明の要約
本発明は、精製ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質ならびにこのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明のタンパク質および核酸は、本明細書に記載のようにＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびそれをコードするＤＮＡと有意な相同性を有する。特に、ラットから単離されたＧＡＢＡ_Ｂの明確な変異体である、ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａおよびＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂと名付けられた二つのＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質を提供する。それぞれのｃＤＮＡおよび由来するアミノ酸配列は、配列番号１、２および５、６にそれぞれ記載する。更に、ヒト源から単離されたＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ／ｂ(部分的レセプタークローンを示す)およびＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂ(完全な長さのレセプタークローンを示す)と名付けた二つのヒトＧＡＢＡ_Ｂを提供する。それぞれのｃＤＮＡおよび由来するアミノ酸配列は、配列番号３、４および７、８にそれぞれ記載する。

本発明のＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は、式Ｉおよび式II：

の選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストの一個またはそれ以上に特異的結合を示す。

本発明は、従って、式Ｉおよび式IIの化合物を提供する。更に、これらの選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストの結合は、式IIIおよび式IV：

のような他の選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアゴニストまたはアンタゴニストと競合し得る。

本発明は、更に、ＤＮＡクローニング法および本明細書で提供される配列由来のプローブを使用したＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの他のメンバ−の単離法ならびにこのような方法で単離されたＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの新規メンバ−を提供する。

更に、本発明は、中枢および末梢神経系に関する疾病の処置のための医薬として有用であり得るＧＡＢＡ_ＢレセプターアゴニストおよびアンタゴニストのようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターの活性を修飾する化合物の同定および特徴付けの方法における、ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質ならびにこのようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞の使用に関する。特に、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストは、例えば、脳疾患、鬱病、不安、小発作型癲癇、精神分裂病および近視のような向知性薬、抗痴呆薬、抗鬱剤および抗不安剤として有用であり得、一方ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアゴニストは、例えば、痙攣、三叉神経痛、喘息、咳、嘔吐、潰瘍、尿失禁およびコカイン中毒のような疾病の処置に有用であり得る。

図面の簡単な説明
図１ａは、ＣＯＳ１細胞での組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａの発現を記載する。ラット皮質膜(レーン１)およびＧＡＢＡ_ＢＲ１ａラットｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞(レーン２および３)由来の膜を光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872で標識する。レーン当たり２５μgタンパク質を充填した６％ＳＤＳゲルのオートラジオグラフィ−を示す。レーン１および２：０.６nＭ[^１２５Ｉ]CGP 71872の特異的結合。レーン３：０.６nＭ[^１２５Ｉ]CGP 71872での特定の結合が、１μＭの非標識CGP 54626A(ＧＡＢＡ_Ｂレセプター特異的アンタゴニスト)と競合する、対照実験。天然および組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準(BioRad)と比較して、ゲル移動性で概算した。図１ｂは更にＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂラットーｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞の結果を示す(レーン３)。

図２はラット大脳皮質由来の膜のＧＡＢＡ_Ｂレセプター(白抜き)およびＣＯＳ１細胞由来の組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプター(黒塗り)に結合する[^１２５Ｉ]CGP 6421３の、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストCGP 54626A(●)、CGP 64213(▲)およびCGP 35348(■)による阻害を示す。

図３はラット大脳皮質由来の膜のＧＡＢＡ_Ｂレセプター(白抜き)およびＣＯＳ１細胞由来の組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプター(黒塗り)に結合する[^１２５Ｉ]CGP 64213の、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアゴニストＧＡＢＡ(●)、Ｌ−バクロフェン(▲)およびＡＰＰＡ３−(アミノプロピル−ホスフィン酸)(■)による阻害を示す。

図４は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質の光親和性架橋を示す。示す組織の細胞膜は、[^１２５Ｉ]CGP 71872で光親和性標識し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ−に付す。ａ、ｂは光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872の選択性。ａは神経系の組織の１３０Ｋおよび１００ＫのＧＡＢＡ_Ｂレセプター変異体の異なる分散。[^１２５Ｉ]CGP 71872結合は選択的ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストであるCGP 54626A １μＭの添加により開始する。ｂは異なるリガンドで標識した[^１２５Ｉ]CGP 71872の競合。膜抽出物の光親和性リガンドとのインキュベーションは、示す濃度での競合物質の存在下で行う。ｃはＧＡＢＡ_ＢレセプターはＮ−グリコシル化である。光親和性標識ラット皮質細胞膜を０.４単位のＮ−グリコシダーゼＦまたは０.６ミリ単位のＯ−グリコシダーゼ(Boehringer Mannheim)とインキュベートする。ｄは異なる種由来のＧＡＢＡ_Ｂレセプターの光標識。示す種由来の脳組織は、下記のように標識する。Drosophila melanogasterおよびHaemonchus concortusの場合、全動物を分析する。

図５は天然および組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの薬理学的特性に関するアッセイの結果を示す。ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａはアデニレートシクラーゼの阻害を介在する。安定にＧＡＢＡ_ＢＲ１ａを発現するHEK293細胞をホルスコリン(Ｆsk)２０μＭで処理し、ｃＡＭＰ形成を刺激する(１００％)。Ｆsk誘導ｃＡＭＰ蓄積は、３００μＭ Ｌ−バクロフェンの同時添加により有意(２Ｐ＜０.００１；デュネットのｔ検定)に減少する。Ｌ−バクロフェンの作用は１０μＭ CGP 54626A存在下で拮抗する。百日咳毒素(PTX)１０ng／mlとの細胞の１５−２０時間の予備インキュベーションは、Ｌ−バクロフェンの作用を完全になくす。Ｌ−バクロフェン反応は、非トランスフェクトHEK293細胞では観察されない(挿入)。棒は、４回行った実験の少なくとも個々の３回の平均値±S.E.M.を示す。

発明の詳細な説明
本発明は精製ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質、それをコードする核酸およびそれらの種々の適用に関する。本発明の前には、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは精製形で入手可能ではなく、粗膜調製物のみであった。本発明は、最初に、組換えＤＮＡ法により、実質的に純粋な形で、種々の相互に関連するＧＡＢＡ_Ｂレセプターの製造を可能にした。一般に、グリコシル化形のこのようなタンパク質は、１００から１３０kDaの間の観察される分子量を有し、一方非グリコシル化形はそれぞれ９０から１１０kDaの間の観察される分子量を有することが予期される。

本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、ＧＡＢＡに反応する、神経伝達物質活性のＧ−タンパク質結合調節物質である。それらは、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに選択的な標識リガンド、特に[^１２５Ｉ]CGP 62413および[^１２５Ｉ]CGP 71872に結合することにより定義し得る。組換えＧＡＢＡ_ＢレセプターをＧ−タンパク質およびＧＡＢＡおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプターアゴニストにより活性化できるイオンチャンネルのようなエフェクタ−を含む細胞系で発現させる、機能実験もまた可能である。

本発明のタンパク質は、トランスジェニックまたはノックアウト動物で電気生理学的に、例えば、遅延ＩＰＳＰ(抑制性シナプス後電位)の測定、電場ＥＰＳＰ(興奮性シナプス後電位)の対パルス阻害または(−)−バクロフェン誘導抑制のような当分野で既知のＧＡＢＡ_Ｂレセプターのアッセイでの反応性によって定義し得る。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは神経のカリウムチャンネルへの間接的結合の結果としてＩＰＳＰの観察に対応し、このように確認されたＧＡＢＡ_Ｂレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストは、ＩＰＳＰに関する効果の検出により、神経性試料中におけるＧＡＢＡ_Ｂレセプターの存在を決定するのに使用し得る。

しかしながら、有利には、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は、電場ＥＰＳＰの対パルス拡大により測定される、CGP 64213およびCGP 71872への感受性により評価する。両方の上記化合物が、それらが有効なＧＡＢＡ_Ｂオートレセプターアンタゴニストであるため、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに通常関連する対パルス拡大をなくす。好ましくは、従って、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は、CGP 64213およびCGP 71872により特異的に阻害される。これらの化合物による特異的阻害の例は下に示す。

本明細書での使用において、“ＧＡＢＡ_Ｂレセプター”なる用語はその配列が実質的に配列番号２および８に記載のものであるタンパク質を意味し、一方“ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質”なる用語は、構造的におよび／または機能的にＧＡＢＡ_Ｂレセプターに関連した、例えば、接合変異体のような、誘導体および変異体を含む。好ましくは、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は、例えば、配列番号４および６に記載のものであり、それぞれ配列番号２および８に記載するアミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Ｂレセプターと少なくとも一つの共通構造決定基を共有する。“共通構造決定基”は、上記誘導体が配列番号２および８に記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターの少なくとも一つの構造的特性を含むことを意味する。構造的特性は、天然に発生するまたは変性ＧＡＢＡ_Ｂレセプターポリペプチドまたはそのフラグメントに対して発生した抗体と交差反応できるエピトープまたは抗原性部位の所有、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターと同一性を有するアミノ酸配列の所有および共通の構造／機能関係を有することを含む。従って、本発明により提供されるＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は、アミノ酸変異体、グリコシレーション変異体および他のＧＡＢＡ_Ｂレセプターの生理学的および／または物理的特性を保持するＧＡＢＡ_Ｂレセプターの共有結合誘導体を含む。

更に、“ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質”なる用語の範囲内には、特定の種、好ましくは哺乳類で見られるＧＡＢＡ_Ｂレセプターの天然に存在する変異体も含まれる。このような変異体は、同じ遺伝子ファミリーの関連遺伝子、特定の遺伝子の対立変異体によりコードされ得、またはＧＡＢＡ_Ｂレセプター遺伝子の別のスプライシング変異体を示す。本発明の変異体は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターと同じ基本的機能を有するが、変異体としてのその性質に一致した異なる特性を有し得る。例えば、ＧＡＢＡ_ＢレセプターはＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質のファミリーのメンバ−であり、その単離および特徴付けは本発明により最初に可能になったことが予期される。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの異なるメンバ−は、恐らくその組織特異的局在性および神経シグナル伝達の調節の役割の差異に従って異なる活性プロフィールを有することが予測され得る。

更に、本発明は、ヒトを含む種由来の、更なるＧＡＢＡ_Ｂレセプター、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質およびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質コード核酸の単離および特徴付けを可能にする。配列デ−タの供給は、既知のようにおよび下記の実施例に記載のように、所望のＧＡＢＡ_Ｂレセプターコード核酸を単離するために、当業者が標準ハイブリダイゼーション法を行うことを可能にする。

本発明は、更に、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの少なくとも一つの共通構造決定基を保持する、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの誘導体を含む。例えば、誘導体は、本発明のタンパク質が、置換、化学的、酵素的または他の適当な手段により、天然に存在するアミノ酸以外の分子と共有結合的に修飾されている分子を含む。このような分子は、酵素または放射性同位体のような検出可能分子であり得る。

共通構造決定基を保持する誘導体は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターのフラグメントであり得る。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターのフラグメントは、その個々のドメインおよびドメイン由来のより小さなポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプター由来の小さいポリペプチドは、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに特徴的な一つの特性を定義する。フラグメントは、理論的に、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの一つの特性を保持する限り、ほとんど任意のサイズであり得る。好ましくは、フラグメントは５から６００アミノ酸長の間である。より長いフラグメントは完全長ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの切断物とみなされ、一般に用語“ＧＡＢＡ_Ｂレセプター”に包含される。好ましくは、上記フラグメントはＧＡＢＡ_Ｂレセプターの機能的活性を保持する。このようなフラグメントは、慣用法を使用して、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質から、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質の特定の機能的態様に必須でないアミノ酸残基を除去することにより、当業者は製造し得る。ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質の機能的態様の決定は、本明細書に記載の薬理学的または電気生理学的アッセイを用いて、および特にＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ模倣物に結合する、またはＧタンパク質に結合するＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質の能力の追跡によりなし得る。

ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの誘導体は、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの少なくとも一つの特性を維持する要求に従う、その変異体もまた含む。従って、保存的アミノ酸置換が、実質的にＧＡＢＡ_Ｂレセプターの性質を変えることなくなし得る。置換および更なる欠失は、本発明に含まれるＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質のフラグメントを製造し得る。ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質変異体は、例えば、アミノ酸をコードするトリプレットを、一組またはそれ以上付加、交換および／または欠失によりもたらされるインビトロ変異に付されたＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質をコードするＤＮＡから製造し得る。例えば、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの置換、欠失または挿入変異体は、組換え法およびＧＡＢＡ_Ｂレセプターの天然形との免疫的−または生理学的交差反応性をスクリーニングすることにより製造できる。

変異は、当業者が既知の方法で行い得る。好ましくは、しかしながら、関心のポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発である。部位特異的変異誘発の多くの方法が、Ｍ１３のような一本鎖ファージを使用する方法から、ＰＣＲ基本法まで当分野で既知である(“PCR Protocols:A guide to methods and applications”, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsly, T. J. White (編), Academic Press, New York, 1990参照)。好ましくは、商品として入手可能なAltered Site II Mutagenesis System(Promega)を、使用説明書に従って用い得る。

ＧＡＢＡ_Ｂレセプターのフラグメント、変異体および他の誘導体は、好ましくはＧＡＢＡ_Ｂレセプターとかなりの相同性を保持する。本明細書での使用において、“相同性”は二つの物が、起源および機能が同じであると当業者が決定するのに十分な特徴を共有することを意味する。好ましくは、相同性は配列同一性を意味するために使用する。従って、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの誘導体は、好ましくはそれぞれ配列番号２および８に記載の配列とかなりの配列同一性を保持する。

“かなりの相同性”は、相同性が配列同一性を意味する場合、３０％以上の配列同一性、好ましくは６５％以上の配列同一性および最も好ましくは８０％またはそれ以上の配列同一性を意味する。

本発明の更なる態様に従い、ＧＡＢＡ_ＢレセプターをおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質をコードする核酸が提供される(それぞれ配列番号１、７および３、５)。組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質の製造に有用であることに加えて、これらの核酸はまたプローブとしても有用であり、従って前記のように、当業者はＧＡＢＡ_Ｂレセプターファミリーの更なるメンバ−をコードする核酸の同定および／または単離が可能となる。

他の態様において、本発明は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸と相補的な、またはこれらとハイブリダイズできる核酸配列を提供する。好ましくは、このような核酸は下記のように、高いまたは中程度のストリンジェンシー下でハイブリダイズできる。

更に、本発明の核酸はＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸の存在を測定する方法に有用であり、この方法はＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする(または相補的な)ＤＮＡ(またはＲＮＡ)を試験サンプル核酸とハイブリダイズさせ、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸の存在を測定することを含む。

本発明は、核酸ポリメラーゼ(連鎖)反応を、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ)またはそれらに相補的な核酸で開始させることを含む、核酸試験サンプルの増幅法も提供する。

単離ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸は、ＤＮＡライブラリーのような、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸の天然源または粗核酸調製物に通常含まれる、少なくとも一つの汚染核酸を含まない核酸を含む。単離核酸は、従って、天然に見られる形または配置以外で存在する。しかしながら、単離ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質をコードする核酸は、本来のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−発現細胞中にＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質−特異的核酸を含み、核酸は天然細胞のものと異なる染色体座であるか、そうでなければ天然で見られるのと異なるＤＮＡ配列に併列している。

本発明に従って、ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質、例えば、ヒトおよびラットＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質のような哺乳類ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質、またはそれらのフラグメントをコードする単離核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡが提供される。特に、本発明はヒトおよびラットＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子を提供する。定義上、このようなＤＮＡはコード一本鎖ＤＮＡ、上記コードＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこの相補的(一本鎖)ＤＮＡ自体を含む。例示として、ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質をコードする核酸は、それぞれ配列番号１、７および３、５により示される。

好ましいＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質をコードする配列は、配列番号１、３、５および７のコード配列と実質的に同じ配列を有するものであり、配列番号１、３、５および７のコード配列と同じ配列を有する核酸が最も好ましい。本明細書で使用する限り、実質的に同じ核酸配列は少なくとも約９０％の同一性を共有する。しかしながら、例えば、付加的エクソン配列相同性を有するスプライス変異体は、低くてもよい。

本発明の核酸は、プローブとしてかまたはそうでない使用でも、好ましくは配列番号１、３、５および７に示すＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする配列と実質的に相同である。“実質的に”および“相同”なる用語は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターポリペプチドに関して前記で定義した通りに使用する。

好ましくは、本発明の核酸は、ポリペプチドに関して前記で定義のようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−コード配列のフラグメント、またはその誘導体である。数ヌクレオチド長、好ましくは５から１５０ヌクレオチド長の核酸のフラグメントは、特にプローブとして有用である。

例示的に、核酸は、別に、前記で定義のようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードし、配列番号１、３、５および／または７に記載のＤＮＡ配列、または上記ＤＮＡ配列の選択したフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付け得る。配列番号１、３、５および／または７に記載の配列と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードするこのような配列が好ましい。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、その条件下でポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。このような条件は、当業者には明白である。当業者に既知のように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点(Ｔ_ｍ)に反映され、それは配列相同性の１％減少に付き、約１から１.５℃減少する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は高ストリンジェンシー条件下で行い、続いて種々のストリンジェンシーで洗浄する。

本明細書で使用する限り、高ストリンジェンシーは１Ｍ Ｎａ^＋中、６５−６８℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件である。高ストリンジェンシー条件は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、０.１ピロリン酸ナトリウムおよび非特異的競合剤としての０.１mg／ml変性サケ精子ＤＮＡを含む水溶液中でのハイブリダイゼーションにより提供できる。ハイブリダイゼーションに続いて、高ストリンジェンシー洗浄が、０.２−０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでハイブリダイゼーション温度での最終洗浄(約３０分)を含んで数段階でなし得る。

中位のストリンジェンシーは、上記の溶液中であるが、約６０−６２℃でのハイブリダイゼーションに対応する。この場合、最終洗浄はハイブリダイゼーション温度で、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで行う。

低ストリンジェンシーは、約５０−５２℃での上記溶液中でのハイブリダイゼーションに対応する。この場合、最終洗浄はハイブリダイゼーション温度で、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで行う。

これらの条件は、種々の緩衝液、例えば、ホルムアミドーベース緩衝液および温度を使用して、適合させ得、反復し得ることは理解される。デンハルト溶液およびＳＳＣは、他の適当なハイブリダイゼーション溶液のように、当業者に既知である(例えば、Sambrook, et al., 編 (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkまたはAusubel, et al., 編 (1990)Current Protocols in Molecular Biology, John & Wiley & Sons, Inc.参照)。特に、当業者はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを多くのパラメ−タ−、主に塩濃度と温度を変えることにより変化し得、得られる条件はこのような全てのパラメ−タ−の複合作用の結果であることを理解する。最適ハイブリダイゼーション条件は、プローブのＧＣ含量がまた役割を担うため、経験的に決定しなければならない。

本発明の核酸は、更に、アミノ酸コードの縮重の活用により、天然源から由来したＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸と幾分異なる配列を有するように設計し得る。ほとんどの場合、多くの核酸トリプレットを使用し、あるアミノ酸をコードさせる。従って、同一のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードするほとんど無限の数の核酸を設計し得る。天然に存在する核酸と最も異なる配列のものは、それとハイブリダイズできない程異なり得る。従って、本発明は特に前記で定義のようなＧＡＢＡ_ＢレセプターまたはＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質をコードする核酸を特に包含する。好ましくは、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質をコードする全ての核酸が、それぞれ配列番号２、８および４、６である。

本明細書に記載のガイダンスに従って、本発明の核酸は当分野で既知の方法に従って得ることができる。例えば、本発明のＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用した化学合成、またはゲノムライブラリーのスクリーニングまたはＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を有すると考えられる源から調製した適当なｃＤＮＡライブラリーにより得、それを検出可能なレベルで発現させることができる。

関心の核酸の合成の化学法は当分野で既知であり、トリエステル、ホスファイト、ホスホロアミデートおよびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他の自己プライマー法ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は、核酸の全核酸配列が既知である場合、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用可能な場合、使用し得る。あるいは、標的アミノ酸配列が既知である場合、各アミノ酸残基に対して既知のおよび好ましいコード残基を使用して、可能性の有る核酸配列を推理し得る。

ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする遺伝子を単離する別の方法は、例えば、Sambrook et al., 1989に記載のようなＰＣＲ法の使用である。この方法は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。

ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸は、プローブ、即ち、配列番号１、３、５および７に記載の配列由来のオリゴヌクレオチドを含む本明細書に記載の核酸との適当なハイブリダイゼーション条件下で、適当なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして単離できる。適当なライブラリーは、商品として入手可能であるか、または、例えば、細胞系、組織サンプルなどから調製できる。ライブラリーは、プローブもしくは関心の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計した分析的ツ−ルでスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーに関して、適当な手段はＧＡＢＡ_ＢレセプターまたはＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質を認識し、特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同じまたは異なる種由来の既知のまたは推定のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的ｃＤＮＡをコードする約２０から８０塩基対長のオリゴヌクレオチド；および／または同じまたはハイブリダイズした遺伝子をコードする相補的または相同ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを含む。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために適当なプローブは、同じまたはハイブリダイズしたＤＮＡをコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはそのフラグメント；および／または相同ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを含むがこれらに限定されない。

特に好ましいスクリーニング法は、ＤＮＡの試験サンプル(ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー)のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的ｃＤＮＡ(配列番号１、３、５、７)との適当なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを含む。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的ｃＤＮＡの完全長またはフラグメントをプローブとして使用できる。このようなスクリーニングは、最初に低ストリンジェンシー条件下で行う。低ストリンジェンシー条件は前記で定義の通りであるが、ハイブリダイゼーション溶液の温度およびイオン強度を調節することにより変え得る。例えば、適当な条件は、４０℃から６０℃の間の温度で、０.５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７.２、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ ＥＤＴＡ中のハイブリダイゼーションおよび２×標準クエン酸食塩水(ＳＳＣ、２０×ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、０.３Ｍクエン酸ナトリウムを含む、ｐＨ７.０)、０.１％ＳＤＳでの５０℃またはそれ以下での洗浄を含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、プローブに関して少なくとも４０％配列相同性を有する核酸配列の同定を可能にするように選択する。更なるｃＤＮＡおよびＧＡＢＡ_Ｂ−レセプター遺伝子ファミリーの遺伝子の同定および単離に有用な同様の相同性スクリーニング法は、米国特許第５,２０２,２５７号に記載され、本明細書に引用して包含させる。

プローブ配列と実質的類似性を有するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを同定するために、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用した後、これらのクローンを次いで中位から高ストリンジェンシー条件下に付し、プローブ配列に関して特に高レベルの相同性を有するこれらのクローンを同定する。高ストリンジェンシー条件下での更なる実験は、上記ハイブリダイゼーション溶液を使用した、約６０℃から６８℃のハイブリダイゼーション温度を含む。洗浄条件は、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳまたはそれ以下で、約６５℃またはそれ以下の温度を含む。

本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質特異的ｃＤＮＡの同定の観点から、集められた配列情報を使用して、遺伝子ファミリーのメンバ−の中で、最も保存的な領域から、変性オリゴヌクレオチドプライマー配列のセットを設計する。このようなオリゴヌクレオチドプライマーの混合物は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)中で、すでに単離されたＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質−特異的ｃＤＮＡに関する遺伝子由来のｃＤＮＡまたはゲノムセグメントを増幅するために使用する。

続いて、これらのセグメントは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を使用して、更なる完全長ｃＤＮＡクローンを同定するプローブとして働き得る。あるいは、本発明により提供されたＧＡＢＡ_ＢレセプターまたはＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質に対して発生した抗体は精製に使用でき、ＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質に関連する配列がまた本抗体により認識される。

本発明の核酸を単離するためのライブラリーのスクリーニングは、更に発現スクリーニングにより行い得る。このような方法は、当業者に既知であり、例えばSambrook et al.(前掲)に記載の通りであるが、本質的に核酸クローンの発現ベクタ−への包含を含み、続いて所望のタンパク質生産物に特異的なリガンドを使用してスクリーニングされる。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的リガンドは、下記のように抗体、または特異的ＧＡＢＡアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。特に好ましいのは、下記のCGP 64213のような化合物である。

本明細書で使用する限り、オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは配列番号１、３、５および７に記載の近接塩基対の同じ数またはより大きい数と同じ(または相補的な)である、１０から５０、好ましくは１５から３０および最も好ましくは約２０近接塩基を含むヌクレオチドの配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブとして選択する核酸配列は、偽陽性の結果を最小とするために、十分な長さであり、十分明白であるべきである。ヌクレオチド配列は、通常ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の保存的または非常に相同的なヌクレオチド配列または領域に基づいている。プローブとして使用する核酸は、１箇所またはそれ以上で変性されている。変性オリゴヌクレオチドの使用は、ライブラリーが、その種での優先的コドン使用が既知でない種からスクリーニングされる点で、特に重要である。

プローブを構築するのに好ましい領域は、５'および／または３'コード配列、リガンド結合部位をコードすることが予測される配列などを含む。例えば、本明細書に記載の完全長ｃＤＮＡクローンまたはそのフラグメントをプローブとして使用できる。好ましくは、本発明の核酸はハイブリダイゼーション後、容易に検出するための適当な標識手段で標識されている。例えば、適当な標識手段は放射性標識である。ＤＮＡフラグメントの標識の好ましい方法は、当分野で既知のような、ランダムプライミング反応におけるα^３２Ｐ ｄＡＴＰの、ＤＮＡポリメラーゼによるクレノウフラグメントと一緒の挿入である。オリゴヌクレオチドは、通常γ^３２Ｐ−標識ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識されている。しかしながら、他の方法(例えば、非放射活性)も、フラグメントまたはオリゴヌクレオチドの標識に使用し得、例えば酵素標識、適当なフルオロフォアでの蛍光標識およびビオチニル化を含む。

例えば、実質的に完全なＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−コード配列または該ＤＮＡの一部に基づいた適当なオリゴヌクレオチドでのライブラリーのスクリーニング後、陽性クローンを、ハイブリダイゼーションシグナルの検出により同定する；同定クローンを制限酵素地図および／またはＤＮＡ配列分析で特徴付けし、続いて、例えば、本明細書に記載の配列との比較により試験し、それらが完全なＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を含むか否か(即ち、それらが翻訳開始および停止コドンを含むかどうか)を確認する。選択クローンが不完全である場合、それらは同じまたは異なるライブラリーの再スクリーニングに使用し得、重複クローンを得る。ライブラリーがゲノムである場合、重複クローンはエクソンおよびイントロンを含み得る。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである場合、重複クローンは読み取り枠を含み得る。両方の場合、完全なクローンをＤＮＡおよび本明細書に記載の推定アミノ酸配列との比較により同定し得る。

内因性ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の異常性の検出のために、遺伝子スクリーニングを、本発明のヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションプローブとして使用して行い得る。また、本明細書に記載の核酸配列を基本にして、アンチセンス型治療剤を設計し得る。それの特定の引用として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、先に定義のようなオリゴヌクレオチドプローブに基づいており、その定義の範囲内であることは特記すべきである。このようなオリゴヌクレオチドは、特にではあるが、唯一でなく、アンチセンス治療剤としての使用を意図する場合、例えば、非天然ヌクレオチドアナログの取りこみおよび天然オリゴヌクレオチドへの修飾により、オリゴヌクレオチドへの修飾を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドが置換骨格を、例えば、ホスホロチオエート、２'−Ｏ−メチル修飾のような修飾の形で含み得、またはペプチド核酸の形であり得る。

本発明の核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド伸長の反転およびこれらの組み合わせにより容易に修飾できることは認識される。このような変異体は、例えば、本明細書に記載のまたは天然で見られるＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質配列と異なるアミノ酸配列を有する、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質変異体の製造に使用できる。変異誘発は、予定される(部位特異的)かまたは無作為である。沈黙変異以外の変異は、読み取り枠の外の配列に位置せず、好ましくはループまたはヘアピンのような２次ｍＲＮＡ構造を製造するためにハイブリダイズする相補的領域を製造しない。

本発明の更に別の態様において、核酸はＤＮＡ分子であり、更にベクターにより形質転換された宿主により認識される制御配列に作動可能に結合したＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコピーする核酸を含む、複製可能ベクターを更に含む。本明細書で使用する限り、ベクター(またはプラスミド)は異種ＤＮＡを細胞内に、発現または複製のために挿入するために使用する不連続エレメントを意味する。このような媒体の選択および使用は、当業者には日常の事であり、例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、ベクターの意図される使用、即ち、ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現のどちらに使用するのか、ベクターに挿入するＤＮＡのサイズおよびベクターで形質転換する宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現)に依存して種々の成分およびそれと適合する宿主を含む。ベクター成分は、一般に、一個またはそれ以上の下記のものを含むが、これらに限定されない：複製起源、一個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写停止配列およびシグナル配列。

有利には、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする真核発現ベクターは遺伝子座調節領域(ＬＣＲ)を含む。ＬＣＲは、宿主細胞染色質に統合された導入遺伝子の高レベルの統合部位非依存的発現の指示が可能であり、これはＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質が、ベクターの染色質的統合が起こった永久トランスフェクト真核細胞系の状況で、遺伝子治療適用に設計されたベクター中で、またはトランスジェニック動物で発現される場合、特に重要である。

酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞を含む真核宿主細胞での発現に適当なベクターは、また転写の停止のためにおよびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含む。このような配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'および３'非翻訳領域から一般に利用可能である。

更に、本発明はこのようなベクターで形質転換した宿主細胞および、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質−特異的核酸を、形質転換宿主細胞の培養中に発現させ、所望により、宿主細胞培養からＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を回収することを含む、このようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を製造するための、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸の使用法を提供する。本発明の他の態様に従って、上記核酸を含む細胞が提供される。原核生物、酵母および高等真核細胞のようなこのような宿主細胞を、ＤＮＡの複製およびＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の製造に使用し得る。適当な原核生物は、エシェリキア・コリ、例えばエシェリキア・コリK-12株DH5a、MC1061/P3およびHB101またはバチルス属のようなグラム陰性またはグラム陽性生物生物のような真正細菌を含む。ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質コードベクターに適当な更なる宿主は、糸状菌または酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシアエを含む。高等真核細胞は、昆虫および脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞を含む。近年、培養(組織培養)における脊椎動物細胞が慣用法になっている。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＣＯＳ細胞、NIH 3T3細胞、HeLa細胞またはHEK293細胞のような上皮または繊維芽細胞系である。宿主細胞は、本明細書で、インビトロ培養の細胞および宿主動物内の細胞を含むことを意味する。

ＤＮＡは、Sambrook et al., 前掲またはAusubel et al., (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.に記載のような、当分野で既知の方法を使用して、安定に細胞内に包含されるか、または一過性に発現され得る。

本発明のポリペプチドは、有利には全昆虫を含む昆虫細胞系中で発現できる。本発明の方法に使用するのに適した昆虫細胞系は、原則として、発現ベクターで形質転換され、それによりコードされる異種タンパク質を発現できる鱗翅目細胞を含む。特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞系IPBL-SF-21(Vaughn, et al., (1997) In Vitro, 13, 213-217)のようなＳｆ細胞系の使用が好ましい。派生細胞系Ｓｆ９が特に好ましい。しかしながら、トリコプルシア・ニ３６８(KurstackおよびMarmorosch, (1976) Invertebrate Tissue Culture Applications in Medicine, Biology and Agriculture. Academic Press, New York, USA)のような他の細胞系も使用し得る。これらの細胞系および本発明での使用に適当な他の昆虫細胞系は、商品として入手可能である(例えば、Stratagene, La Jolla, CA, USAから)。

本発明での使用に適当な発現ベクターは、昆虫細胞系で異種タンパク質の発現ができる全てのベクターを含む。一般に、哺乳類および他の真核細胞で有用なベクターは、昆虫細胞培養にも適用可能である。特に昆虫細胞培養を意図したバキュロウイルスベクターが特に好ましく、広く商品として入手可能である(例えば、InvitrogenおよびClontechから)。シンドビスウイルスのような昆虫細胞に感染できる他のウイルスベクターが既知である(Hahn et al., (1992) PNAS (USA) 89, 2679-2683)。選りすぐりのバキュロウイルス(Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42, 177-199にレビュー)は、オートグラファ・カルボルニカ多重核多核体病ウイルス、AcMNPVである。

本発明の核酸および／またはタンパク質は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの調節剤の可能性のある、従って、医薬の可能性のある化合物の混合物化合物のスクリーニング法に使用し得る。例えば、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする遺伝子で形質転換した細胞を、細胞ベースのスクリーニングアッセイに使用でき、試験する薬剤に対する細胞の応答を追跡する。反応は、レポーター遺伝子の活性化、測定可能な薬理学的または電子生理学的変化などの形であり得る。あるいは、本発明の精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を、インビトロアッセイに使用し、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター活性の調節剤をスクリーニングできる。

同様に、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター遺伝子の発現を調節でき、従ってＧＡＢＡ_Ｂレセプター活性を調節できる化合物が、試験遺伝子(ＧＡＢＡ_Ｂレセプター遺伝子自体の一つであり得る)が通常ＧＡＢＡ_Ｂレセプター遺伝子に関連している制御配列に作動可能に結合している発現系を使用して、スクリーニングできる。

本発明は、更に、このようなスクリーニングアッセイで同定された化合物および、前に例示したように、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター調節により処置できる疾病の処置のためのこのような化合物の使用を含む。

本発明の更に別の態様に従って、本発明のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の一個またはそれ以上を特異的に認識し、結合する抗体が提供される。例えば、このような抗体は、配列番号２および８に記載のアミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Ｂレセプターに対して製造できる。あるいは、配列番号４および６に記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質またはＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質フラグメント(インビトロ法でもまた合成し得る)を、免疫原性ポリペプチドに融合させ(組換え発現またはインビトロペプチジル結合で)、次にこの融合タンパク質を使用して、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質エピトープに対して抗体を発生させる。

抗−ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質抗体は、免疫化動物の血清から回収し得る。モノクローナル抗体を、慣用法で、免疫化動物由来の細胞から調製し得る。

本発明の抗体は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質局在化、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸の同定のための発現ライブラリーのスクリーニングまたは機能的ドメインの構造の研究およびＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の精製などに有用である。

本発明の抗体は、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体のような天然クラスの全ての抗体であり得るが、好ましくはＩｇＧ抗体である。更に、本発明はＦａｂ、Ｆ(ab')_２、ＦｖおよびＳｃＦｖのような抗体フラグメントを含む。ＦｖおよびＳｃＦｖのような小さいフラグメントは、その小さいサイズおよびその結果の優れた組織分散のために、診断および治療適用の目的に有利である。

本発明の抗体は、診断および治療適用に使用し得る。従って、それらは、毒素または標識のようなエフェクタータンパク質を含む変形抗体であり得る。特に好ましいのは、インビボでの抗体の分散の造影が可能な標識である。このような標識は、金属粒子のような放射活性標識またはラジオオパーク標識であり得、それらは生体内で容易に見ることができる。更に、それらは蛍光標識または生物から回収した組織サンプルで可視の他の標識であり得る。

組換えＤＮＡ法を使用して、本発明の抗体を改善し得る。従って、キメラ抗体を、診断または治療適用におけるその免疫原性を減少させるために構築し得る。更に、免疫原性は、ＣＤＲ移植により抗体をヒト化する[欧州特許出願０２３９４００号(Winter)参照]ことにより、および所望によりフレームワーク修飾[欧州特許０２３９４００号およびRiechmann et al., Nature 332, 323-327, 1988参照]により最小にし得る。

本発明の抗体は、動物血清から得、もしくはモノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合、細胞培養で製造し得る。組換えＤＮＡ法を使用して、確立された方法に従って、細菌または好ましくは哺乳類細胞培養で抗体を製造し得る。選択した細胞培養系は、好ましくは抗体生産物を分泌する。

従って、本発明は、タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に適当な枠内で結合した、シグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列に作動可能に結合したプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された、宿主、例えばエシェリキア・コリまたは哺乳類細胞を培養し、該タンパク質を単離することを含む、本発明の抗体の製造法を含む。

本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞系は、遺伝的に安定であり、望ましい特異性の本発明のモノクローナル抗体を分泌し、融解および再クローニングにより急速冷凍した培養物から活性化できる。

本発明はまた、適当な哺乳類、例えば、Balb/cマウスを精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質、精製ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を含む抗原性担体、もしくはＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を有する細胞で免疫化し、免疫化動物の抗体産生細胞を適当な骨髄腫細胞系と融合させ、誘導で得られたハイブリッド細胞系をクローン化し、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を指向するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の製造法にも関する。例えば、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を有する細胞で免疫化したBalb/cマウスの脾臓細胞を、骨髄腫細胞系PAIまたは骨髄腫細胞系Sp2/0-Ag14の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローン化する。

本発明は、前記のようなＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の細胞外ドメインを指向する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤＮＡにも関する。定義に従って、このようなＤＮＡはコード一本鎖ＤＮＡ、上記コードＤＮＡおよびその相補的ＤＮＡから成る二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的(一本鎖)ＤＮＡそれ自体を含む。

本発明はまた、内因性ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質の発現を調節するために修飾されているトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳類はトランスジェニックマウスである。例えば、従って、当分野で既知の方法に従って、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質生産が非常に減少しているか除かれているトランスジェニックマウスを設計し得る(Mansour et al., Nature 336, 348-352, 1988)。あるいは、本発明のトランスジェニックマウスは、増加したレベルのＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を発現し得、または発生上または組織特異的方法で、または外来試薬による制御を介して、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質発現の制御をされ得る。このような動物の実験は、インビボでのＧＡＢＡ_Ｂレセプターおよびレセプタータンパク質の重要性の洞察を提供する。

本発明は、更に、下記に、説明のみの目的で、以下の実施例で記載する。
実施例１
リガンドCGP 64213の合成
ＣＯＳ細胞内で発現したＧＡＢＡ_Ｂレセプターの可視化に使用する放射性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 64213は、スキーム１に従って、以下の試薬および条件を使用して合成する：
(１)ＮａＨ、ＴＨＦ、室温、３時間；５−ブロモバレロニトリル、室温、１６時間；(２)ラネイニッケル、ＥｔＯＨ中４％ＮＨ_３、４５℃、１６時間；(３)Ｎ−エトキシ−カルボニルフタルイミド、Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｈ_２Ｏ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、室温、５時間；(４)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、ＥｔＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２(１：９)、室温、１７時間；(５)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、Ｅｔ_３Ｎ、ＴＨＦ、室温、１７時間；(Ｒ)−エピクロロヒドリン、１０mol％ ＺｎＣｌ_２ ＴＨＦ、８０℃、１７時間；ＨＯＡＣ、ＭｅＯＨ、室温、１７時間(６)ｉ−Ｐｒ_２ＥｔＮ、ＥｔＯＨ、８０℃、７日；(７)ＬｉＯＨ、ＥｔＯＨ、Ｈ_２Ｏ(１：１)、１００℃、１７時間；ＭｅＯＨ、Ｈ_３ＰＯ_４；(８)濃ＨＣｌ、１００℃、１７時間；(９)ｉ−Ｐｒ_２ＥｔＮ、ＤＭＦ、室温、７２時間；(１０)Ｎａ^１２５Ｉ、リン酸緩衝液ｐＨ７.４、Ｈ２Ｏ２、cat.ラクトペルオキシダーゼ、３０分、ＲＰ−ＨＰＬＣ。

Froestl, W., et al. J. Med. Chem. (1995), 38, 3297-3312に従って、ホスフィン酸とトリエチルオルト酢酸から、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物による触媒下製造した(１,１−ジエトキシエチル)ホスフィン酸エチル１を、５−ブロモバレロニトリルと縮合して油状シアノ誘導体２(沸点０.１３mbarで１６４℃)を得、それを４％アンモニア含有エタノール中のラネイニッケルで水素化し、一級アミン３(沸点１０^−４mbarで１５０−１６０℃；クーゲルロー浴温度)を得る。３のアミノ基をフタルイミドとして保護し、４を得、それを次に非常に緩和な条件下でホスフィン酸部分で脱保護し、一置換ホスフィン酸エステル５を得る。トリメチルクロロシランとの反応で、５価ホスフィン酸エステル５を非常に反応性のシリル化ホスホナイトに変換し、それは(Ｒ)−エプクロリヒドリンと塩化亜鉛触媒下容易に反応し、クロロヒドリン７を得る。それ自体ラセミ体(３−シアノ−フェニル)−エチルアミンのＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンによる１−(Ｓ)−(＋)−(３−シアノフェニル)−エチルアミン(Pickard et al., J. Amer. Chem. Soc. (1990) 112, 5741-5747)を分離するための分割を介して製造する、１−(Ｒ)−(＋)−(３−シアノフェニル)−エチルアミン８との縮合および残った母液の(−)−カンファン酸との処置、続く３回の結晶化により、芳香族ニトリル−エステル９を得、それを水酸化リチウムと加水分解してメタ−安息香酸誘導体１０を得る。同時にホスフィン酸エチルエステルの加水分解が起こる。フタルイミド保護基を濃縮塩酸と一晩沸騰させることにより除去し、重要な中間体CGP 57604A([３−[１−(Ｒ)−[[３−(５−アミノペンチル)−ヒドロキシホスフィニル]−２−(Ｓ)−ヒドロキシプロピル]アミノ]−エチル]−安息香酸塩酸塩)を得る。これを商品として入手可能なＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−(４−ヒドロキシフェニル)−プロピオネート１１と、ＤＭＦ中、ヒューニッヒの塩基を使用して反応させ、中間体１２を得、それをヨウ化ナトリウム(１２５異性体)と、ヒドロペルオキシドおよび触媒量のラクトペルオキシダーゼを使用してヨウ素化し、放射標識リガンド[^１２５Ｉ]CGP 64213を得る。

非標識CGP 64213をわずかに異なる方法で製造する：３−(４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニル)プロピオン酸１３を、３−(４−ヒドロキシ−フェニル)プロピオン酸から、Runeberg, J., Acta Chem. Scand. (1958), 12, 188-91に従って製造する。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−３−(４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニル)プロピオネート１４(沸点：１９１−４℃)をスキーム２に従って製造し、収率は７３％である。CGP 57604A(スキーム１)と１４の、スキーム１の反応９のように行う室温で７２時間のＤＭＦ中のヒューニッヒ塩基を使用した縮合により、非放射標識CGP 64213(沸点：１７０−５℃、アセトンから結晶化)を、５３％の収率で得る。

^ａ 試薬および条件：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＣＣ、ジオキサン、室温、１６時間。
放射性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 64213の特徴付け：
ラット大脳皮質からのシナプス膜の調製

約２００ｇの体重の２０匹の雄ラット[Tif:RAIf(SPF)]を使用する。動物を断首し、脳を取りだし、大脳皮質を切除して集め、１０容量の、ＭｇＣｌ_２(１ｍＭ)およびＫ_２ＨＰＯ_４(１ｍＭ)含有氷冷０.３２スクロース中で、ガラス／テフロンホモジナイザーで均質化する。膜を１０００×ｇで１５分遠心し、ペレットを再懸濁して遠心を繰り返す。上清をプールし、２００００×ｇで１５分遠心する。ペレットを１０容量のＨ_２Ｏに再懸濁することにより浸透圧性に衝撃を与え、氷上に３０分置く。この懸濁液を３９０００×ｇで遠心し、クレブス−ヘンゼライト緩衝液(２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、５.６ｍＭグルコース、１.２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１.２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４.７mＭ ＫＣｌ、１.８ｍＭ ＣａＣｌ_２)に再懸濁し、２日間、−２０℃に保つ。膜を室温で融解し、３回クレブス−ヘンゼライト緩衝液で、２００００×ｇ、１５分遠心することにより洗浄し、一晩４℃で放置し、再び３回洗浄する。最終ペレットを、２０mlの同じ緩衝液中にガラス／テフロン均質化で再懸濁する。２mlのアリコートを凍結させ、液体窒素中に貯蔵する。使用直前に膜を３７℃の水浴で急速に融解し、再び同じ緩衝液で３回２００００×ｇ、１５分遠心することにより洗浄する。

結合アッセイおよび放射性リガンドの特徴付け
新しい物質で２０００Ci／mmolの特異的放射活性の[^１２５Ｉ]CGP 64213とのインキュベーションを、０.２mlクレブス−ヘンゼライト−トリス緩衝液、ｐＨ７.４中で、２０℃で９０分、基質としての５０μg皮質膜タンパク質と共に行う。インキュベーションをＧＦ／Ｂワットマングラスファイバー濾紙での濾過により終結させる。非特異的結合を、１０^−６Ｍ CGP 54626Aにより定義し、それは２ｎＭ濃度で全結合の５％である。増加した濃度の[^１２５Ｉ]CGP 64213および非直線最小２乗法フィッティングでの飽和実験により、２.６６ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを測定する。０.１ｎＭ[^１２５Ｉ]CGP 64213の濃度での阻害実験で、Ｌ−バクロフェンは４４２ｎＭの阻害定数Ｋｉを示し、２.５ｎＭのＫｉのアンタゴニストCGP 54626Aは、他のＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニスト放射性リガンドで得られたＫｉと良好に一致する。ＧＡＢＡ_Ａ、ベンゾジアゼピン、カイネート、ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡレセプターのアッセイで、ムスカリンコリン作動性、α_１−およびα_２−アドレナリン作動性、β−アドレナリン作動性、５ＨＴ_１、５ＨＴ_２、５ＨＴ_３、ヒスタミン_１、ヒスタミン_２、アデノシン_１μ−オピエートおよびサブスタンスＰレセプターでのストリキニーネ非依存的結合部位で、非標識CGP 64213は、１μＭで不活性である。本化合物は、従って、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに選択的である。[^１２５Ｉ]CGP 64213の０.１ｎＭの濃度で、結合および解離定数を測定する。結合の半減期は２０℃で２０分、および解離の半減期は４０分である。解離の半減期は、温度を４℃に下げると４時間に延長する。この[^１２５Ｉ]CGP 64213の遅い解離速度および高い特異的放射活性が、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの発現系としてのＣＯＳ細胞で結合しているレセプターのオートラジオグラフィー実験を可能にする。

実施例２
光親和性リガンドの製造
ラット皮質膜由来のタグＧＡＢＡ_ＢレセプターおよびＣＯＳ細胞内で発現した組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターを使用した光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872をスキーム３に従って製造する：商品として入手可能なＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−４−アジド−サリチレート１５をCGP 57604Aと縮合し、中間体１６を得、それを、クロラミンＴを使用してヨウ化ナトリウム１２５アイソトープでヨウ素化し、５−ヨード誘導体[^１２５Ｉ]CGP 71872および３−ヨード−誘導体[^１２５Ｉ]CGP 72565の約１：１の混合物を得る。それらを、Vydac 218TP54カラムの逆相ＨＰＬＣ(保持時間：それぞれ１６.４分および１７.４分)で分離する。試薬および条件は下記の通りである：
(１)CGP 57604A(スキーム１)、ｉ−Ｐｒ_２ＥｔＮ、ＤＭＦ,室温、７０時間；(２)Ｎａ^１２５Ｉ、クロラミンＴ、０.０１Ｎ ＮａＯＨ、室温、１時間；ＲＰ−ＨＰＬＣ。

非標識CGP 71872は異なる方法で製造する：Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−４−アジド−５−ヨード−サリチレート１７を４−アジドサリチル酸のヨウ素化および続くＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドとの縮合を介して製造する(スキーム４)。１７とCGP 57604Aとの縮合(スキーム１、反応９参照)は、５７％の収率で、非放射活性CGP 71872を得る(融点：＞１９０℃分解)。

試薬および条件は下記の通りである：(１)(１)ＮａＩ、２Ｎ ＮａＯＨ、クロラミンＴ、室温、８８時間；(２)Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＣＣ、ジオキサン、室温、１６時間；

光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872の特徴付け
リガンドの結合アッセイおよび特徴付け
[^１２５Ｉ]CGP 64213アッセイで記載したようにラット皮質膜を基質として使用する。新鮮な物質で特異的放射活性２０００Ｃｉ／mmolである[^１２５Ｉ]CGP 71872とのインキュベーションを、０.２mlクレブス−ヘンゼライト緩衝液、ｐＨ７.４中、２０℃で９０分、基質としての５０μg膜タンパク質と共に行う。インキュベーションをＧＦ/Ｃワットマングラスファイバー濾紙での濾過により停止させる。非特異的結合を１０^−６Ｍ CGP 54626Aで測定し、２ｎＭの[^１２５Ｉ]CGP 71872の濃度で、全結合の５％である。増加した濃度の[^１２５Ｉ]CGP 71872および非直線最小２乗法フィッティングでの飽和実験により、３.１ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄと計算される。Ｌ−バクロフェンは阻害実験で、３４０ｎＭのＫｉおよびアンタゴニストCGP 54626Aは３.１ｎＭのＫｉを示す。非標識CGP 64213は、[^１２５Ｉ]CGP 64213で記載したのと同じレセプターアッセイで１μＭの濃度で不活性であり、従って、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターにまた特異的であることが判明する。２ｎＭの濃度および２０℃で、結合の半減期は５分、解離の半減期は１０分である。８℃での解離時間は長い。わずか２５％の放射性リガンドが１２０分後に解離する。

膜の光親和性標識
それぞれＧＡＢＡ_ＢＲ１ａおよびＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂラット−ｃＤＮＡで一過性に形質転換したラット大脳皮質およびＣＯＳ１細胞由来の膜をクレブス−ヘンゼライト−トリス緩衝液、ｐＨ７.３に、４mgタンパク質／mlの濃度で懸濁し、暗中、０.６ｎＭ[^１２５Ｉ]CGP 71872と１時間室温でインキュベーションする。インキュベーションを２００００×ｇ、１０分、４℃の遠心により停止させる。この段階は、遊離非結合光親和性標識を除去する。これらの条件下で、使用した全放射活性の約５０％がレセプターに結合した。ペレットをポリエチレンバイアルに４mgタンパク質／mlの濃度で再懸濁し、ＵＶ光(３６５nm)で３分(２４Ｗ)照射する。懸濁液を２００００×ｇで１０分遠心し、緩衝液中に８mg／mlタンパク質の濃度で再懸濁する。過剰の非標識ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニスト(１０^−６Ｍ CGP 54626A)存在下で標識を行った時、放射活性は膜に結合しない。標識膜は−８０℃で貯蔵できる。結果は図１ａおよび１ｂに示す。

加えて、皮質、小脳および脊髄細胞膜の[^１２５Ｉ]CGP 71872光親和性標識を、上記に概説のように分析し、二つのＧＡＢＡ_Ｂタンパク質変異体Ｒ１ａおよびＲ１ｂが神経系で別々に発現することを確認する。小脳において、１００Ｋタンパク質は１３０Ｋタンパク質より優勢であるが、一方脊髄では１３０Ｋタンパク質がより優勢である。皮質組織において、両方のタンパク質が同等に多い。ＧＡＢＡ_Ｂレセプターを欠くことが予測される肝臓および腎臓のような組織で、タンパク質は標識されず、従って、コントロールとして使用されている(図４ａ参照)。

更に、天然ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、図４ｂに示す種々の競合物質存在下で光親和性標識される。ＧＡＢＡ_Ａ選択的リガンドムシモールおよびビククリンもＧＡＢＡ_Ｃレセプターアゴニストシス−アミノクロトン酸(ＣＡＣＡ)またはＧＡＢＡ取りこみシステム阻害剤SK&F89976A(Zuiderwijk, M., Veenstra, E., Lopes Da Silva, F. H. & Ghijsen, W. E. J. M. Effects of uptake carrier blockers SK&F89976-A and L-trans-PDC on in vivo release of amino acids in rat hippocampus. Eur. J. Pharmacol. 307, 275-282 (1996))も、放射性リガンド結合と明白には競合しない。対照的に、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアゴニストＧＡＢＡ、ＡＰＰＡ(３−アミノプロピル−ホスフィン酸)およびＬ−バクロフェンは結合で[^１２５Ｉ]CGP 71872と競合する。他の既知の基準として、Ｌ−バクロフェンはＤ−バクロフェンよりも強く競合する。ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストCGP 54626A、CGP 35348および非放射活性光親和性リガンドがまた天然レセプターで[^１２５Ｉ]CGP 71872の有効な置換剤である。試験した全リガンドに関して、１３０Ｋおよび１００Ｋタンパク質で[^１２５Ｉ]CGP 71872の置換に関して認識できる差異はなく、二つのレセプターの質的に同じ結合薬理学を示す。

天然ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、Ｎ−グリコシダーゼＦでの開裂後の、分子量のそれぞれ１１０Ｋおよび９０Ｋへの減少により示されるように、Ｎ−グリコシル化されている(図４ｃ)。分子量の明白なシフトはＯ−グリコシダーゼでの酵素処理後に検出されない(図４ｃ)。１３０Ｋおよび１００Ｋの光親和性標識タンパク質は、ゼブラダニオを含む分析した全ての脊椎動物から検出され(図４ｄ)、二つのタンパク質およびそのアンタゴニスト結合部位が非常に保存的であることが示される。鳥類ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質は他の種より有意に大きい分子量を示し、恐らくグリコシル化および／またはＲＮＡスプライシングにおける差異を反映する。光親和性リガンドのタンパク質への結合がショウジョウバエDrosophila melanogasterおよび線虫類Haemonchus concortsで検出できない。

実施例３
ＧＡＢＡ_ＢアンタゴニストリガンドCGP 54626Aの合成：
置換実験で使用するリガンドCGP 54626Aをスキーム５に従って合成する：

^ａ試薬および条件：(１)ＮａＨ、ＴＨＦ、室温、３時間；ブロモメチルシクロヘキサン、環流、２４時間；(２)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、ＥｔＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２(１：９)、室温、２４時間；(３)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、Ｅｔ_３Ｎ、ＴＨＦ、室温、２４時間；(Ｒ)−エピクロロヒドリン、１０mol％ＺｎＣｌ_２ ＴＨＦ、８０℃、１７時間；ＨＯＡｃ、ＭｅＯＨ、室温、１７時間；(４)ｉ−Ｐｒ_２ＥｔＮ、ＥｔＯＨ、８０℃、７日；(５)濃ＨＣｌ、１００℃、２４時間。

Froestl et al., J. Med. Chem. (1995), 38, 3297-3312に従って、ホスフィン酸およびトリエチルオルト酢酸から、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物による触媒下製造した(１,１−ジエトキシエチル)ホスフィン酸エチル１を、ブロモメチルシクロヘキサンと縮合させ、油状誘導体１８(沸点６×１０^−４mbarで８５℃)を得、それを非常に緩和な条件下でホスフィン酸部分を脱保護し、一置換ホスフィン酸エステル１９(沸点３×１０^−４mbarで５０℃)を得る。トリメチルクロロシランとの反応で、５価ホスフィン酸エステル１９を非常に反応性の３価エチルホスホナイトに変換させ、それは(Ｒ)−エピクロロヒドリン６と塩化亜鉛で触媒した時に容易に反応し、クロロヒドリン２０を製造する。欧州特許ＥＰ５４３７８０Ａ２に従ったラセミ体１−(３,４−ジクロロフェニル)−エチルアミンの(＋)−マンデル酸での分割により製造した１−(Ｓ)−(−)−(３,４−ジクロロフェニル)−エチルアミン２１との縮合により、ジアステレオ異性体の１：１混合物としての対応する二級アミン２２を得、それを濃塩酸と沸騰させて加水分解し、CGP 54626Aを得る。

[^３Ｈ]CGP 54626Aは、対応するCGP 54626Aの３,４−デヒドロ誘導体、即ち、CGP 54951Aを(１,１−ジエトキシエチル)ホスフィン酸エチル１を、３,４−デヒドロ−シクロヘキシルメチルブロミド(YadavおよびFallis, (1991) Can. J. Chem. 69, 779-789に従って製造)の縮合により製造し、それを非常に注意深く制御された条件下でトリチウム化し、[^３Ｈ]CGP 54626Aを製造する、同様の方法(スキーム６)で製造した。この化合物は、Bittiger et al., Pharmacol. Commun. (1992), 2, 23により特徴付けされた最初のＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニスト放射性リガンドである。

^ａ試薬および条件：(１)ＮａＨ、ＴＨＦ、室温、３時間；３,４−デヒドロブロモ−メチルシクロヘキサン、還流、２４時間；(２)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、ＥｔＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２(１：９)、室温、２４時間；(３)Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、Ｅｔ_３Ｎ、ＴＨＦ、室温、２４時間；(Ｒ)−エピクロロヒドリン、１０mol％ ＺｎＣｌ_２ ＴＨＦ、８０℃、１７時間；ＨＯＡｃ、ＭｅＯＨ、室温、１７時間；(４)ｉ−Ｐｒ_２ＥｔＮ、ＥｔＯＨ、８０℃、４日；(５)ＬｉＯＨ、ＥｔＯＨ、Ｈ_２Ｏ、１００℃、１７時間；ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、室温、１時間；(６)^３Ｈ_２、５％Ｐｄ／Ｃ、ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、ｐＨ＝１、室温、１５分、分取ＴＬＣ。

実施例４
インビトロ電気生理学的測定による、CGP 64213およびCGP 71872のＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストとしての機能的活性の証明
実験は、雌ウィスターＣＯＢラット(３−４週齢)または雄ラットTif:RAI f(SPF)から、標準法を使用して得た４００μm厚の海馬薄片で行う。簡単に、ラットを断頭前に頸部脱臼させる。小脳を除いた脳をすぐに取りだし、氷冷人工脳脊髄液(ＡＣＳＦ)に入れる。海馬を注意深く単離し、組織チョッパー(Sorvall(登録商標))または振動スライサー(Campden)を使用して、横方向４００μm厚切片を切断する。各切片のＣＡ３領域を外科用メス切断で除去する。この方法を、ＣＡ３領域における癲癇様発作のために起こり得るネットワーク機能の変化を除くために行う。得られるＣＡ３−切除切片を暖めた(３２℃)インターフェースでナイロンメッシュに置き、ＡＣＳＦおよび酸素に富む(９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２)、加湿雰囲気を環流(１−２ml.分^−１)する。標準環流培地は：ＮａＣｌ、１２４；ＫＣｌ、３；ＮａＨＣＯ_３、２６；ＮａＨ_２ＰＯ_４、１.２５；ＣａＣｌ_２、２；ＭｇＳＯ_４、１；Ｄ−グルコース、１０を含み(ｍＭ)、９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２であわ立たせる。アクソプローブまたはアクソクランプ−２増幅器(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)をブリッジモードで使用し、４Ｍ ＮａＣｌ−充電微小電極(２−５ＭΩ)を使用して、放線状層または多形細胞層から細胞外記録をする。細胞内記録は、２Ｍメチル硫酸カリウム微小電極(６０−１００ＭΩ)を使用して行う。デジタル化記録をオフライン分析のためにＩＢＭ−互換性ＰＣのハードディスクに保存する。５５μm直径の絶縁ニッケル−クロムワイヤーからなる２極性刺激電極を、放線状層または多形細胞層に置いた記録電極の近くに置き、ＣＡ１ニューロンの順方向モノシナプス性活性化を提供する(Davies et al., (1990) Journal of Physiology 424:513)。各実験において、刺激は固定強度で相同シナプス的に送達される方形波パルス(２０−２００μs；５−３０Ｖ)を含む。全ての医薬は、環流媒体で投与する。データは平均±平均からの標準誤差(S.E.M.)で示し、統計的有意をスチューデンドのｔ検定を使用して評価する。ｎ価は特定の実験を行った数であり、それぞれ異なるラットから取った異なる切片である。
ＧＡＢＡ_Ｂオートレセプター

電場ＥＰＳＰの対のパルス拡大を、CGP 71872およびCGP 64213のＧＡＢＡ_Ｂオートレセプターへの効果の追跡に使用する。対のパルス拡大は、二つの刺激が５−１０Ｈｚ(刺激間間隔１００−２００ms)で伝達される時；全ての場合、２次電場ＥＰＳＰの促進よりむしろ減少をもたらす、ＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターを活性化するのに十分なＧＡＢＡを遊離しない刺激プロトコールに起こる。これはまたシナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプターと無関係である(Nathan et al. (1991) Exp. Brain Res. 84(3) 529-537)。しかしながら、阻害ＧＡＢＡ_Ａレセプター介在ＩＰＳＰにより妨げられ、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストにより、ＧＡＢＡ_Ｂオートレセプターを阻害するのに必要な濃度で阻害される(Nathan et al. (1990), Brain Research 531, 55-65)。(これらの濃度は、錐体ニューロンおよび阻害介在ニューロンの両方でシナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプターを阻害するのに必要な濃度よりも３−１０倍高く、これらのレセプターの効果を妨げること注意すべきである)。電場ＥＰＳＰ(ｆＥＰＳＰ)の対のパルス拡大はＧＡＢＡ_Ｂオートレセプター活性の感受性測定である。本試験システムで有効である化合物は今までなく、ＧＡＢＡ_Ｂオートレセプター活性のアッセイ、例えば、対のパルスまたは(−)−バクロフェン−誘導ＩＰＳＣの減少でもない。

２００msの刺激間間隔での対のパルス刺激は、第１のＥＰＳＰと比べて第２のＥＰＳＰの一貫した拡大をもたらす。従って、第２のｆＥＰＳＰの曲線下面積は、第１のｆＥＰＳＰの、それぞれ２４７±１７％(CGP 64213シリーズの実験)および２４１±２１％(CGP 71872シリーズの実験)である。CGP 64213(０.３μＭ；ｎ＝５)およびCGP 71872(１μＭ；ｎ＝３)の存在下、このＥＰＳＰの対のパルス拡大はなくなり、これらの化合物のＧＡＢＡ_Ｂオートレセプターのアンタゴニストとしての効力を示す。
ＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプター

CGP 71872の、(−)−バクロフェンの電解槽投与により誘発される電場ＥＰＳＰの減少における効果を、グルタメート求心性末端に位置するＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターへのこの化合物の効果のアッセイとして使用する。しかしながら、これらの条件下で、(−)−バクロフェンは、ＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターに加えて、他のＧＡＢＡ_Ｂレセプターの集団(例えば、ＧＡＢＡ_Ｂオートレセプターおよびシナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプター)を活性化し、これらのレセプターの活性化は、電場ＥＰＳＰのサイズを減少よりもむしろ増加させる傾向にある。それ自体、この方法はＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターでの活性化の妥当な測定である。この方法は、ヘテロレセプターの活性化に生理学的に遊離されたＧＡＢＡに依存していないため、Isaacson et al. (1993) Neuron 332:156-158で使用されるＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターの活性化よりもより信頼でき、定量的により再現性のある方法を提供する。この後者の方法は、ヘテロレセプターが異なる調製物調整物でさらされるシナプス的に遊離されるＧＡＢＡの異なる濃度；ＧＡＢＡのレベルに依存するパラメータ、遊離部位とヘテロレセプターの間の距離、およびＧＡＢＡ取りこみ部位の効果のため、本質的に可変である。しかしながら、今日まで、ＧＡＢＡ_Ｂヘテロレセプターを実験するためのこれらの二つの方法を使用して得られた結果の間で、試験された化合物で矛盾は証明されていないことに注目するのは重要である。

(−)−バクロフェン(１０μＭ)は、放線状層で記録された電場ＥＰＳＰ(コントロールの１００±１％；Ｐ＞０.０５)のシナプス前繊維斉射で明白な効果を有しないが、増幅された電場ＥＰＳＰスロープおよびピークを、それぞれ６５±６％および７６±９％(ｎ＝１０)に減少させる。最大減少は、５−１０分環流後に得られ、このレベルをアゴニスト適用の継続時間中持続する。CGP 71872(１μＭ)の環流媒体への添加は、試験した全ての実験で減少を逆転させる(ｎ＝６；Ｐ＜０.０５)。同様の結果が、多形細胞層(ｎ＝３)で記録された電場ＥＰＳＰで観察される、脳スライスにおいて、CGP 71872は、放線状層(ｎ＝４；Ｐ＞０.０５)または多形細胞層(ｎ＝３)で記録された電場ＥＰＳＰピーク増幅、スロープまたはシナプス前繊維斉射(volley)に有意な作用を及ぼさない。

シナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプター
CGP 71872の薬理学的に単離された遅延ＩＰＳＰへの作用を、ＣＡ１錐体ニューロンに位置するシナプス後ＧＡＢＡ_ＢレセプターへのCGP 71872の作用を評価する試験システムとして使用する。ＩＰＳＰがＧＡＢＡ_Ｂレセプターのシナプス活性化により介在されることを示すかなりの文献がある(Froestl et al. (1995) 前掲;Jarolimek et al. (1993) Neurosci. Lett. 154:31-34;Olpe et al. (1990) Clim. Neuropharmacol. 13 Suppl. 2;396;McCormick, (1990) J. Neurophysiol. 62/5:1018;Lambert et al. (1989) Neurosci. Lett. 107:125-128;Soltesz et al. (1989) Brain Research 479:49-55;MullerおよびMisgeld, (1989) Neurosci. Lett. 102:229-234;DutarおよびNicoll (1988) Nature 322:156-8;Karlsson, PozzaおよびOlpe (1988) Eur. J. Pharmacol. 148:485-486)。加えて、この方法は、過去に何回も使用されており、得られたデータは常に(−)−バクロフェン−誘導過分極の拮抗作用；シナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプターでの活性のアッセイとしてまた採用される実験により得られたものと一致する。

CGP 71872での効果を、向イオン性興奮性アミノ酸アンタゴニストＤ−２−アミノ−５−ホスホノペンタノエート(ＡＰ５；５０μＭ)および６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２,３−ジオン(ＣＮＱＸ；２０μＭ)およびＧＡＢＡ_Ａレセプターアンタゴニストピクロトキシン(５０μＭ)の組み合わせを使用して単離した、単一シナプス活性化ＧＡＢＡ_Ｂレセプター介在遅延ＩＰＳＰで試験する。全ての試験したニューロンで、CGP 71872(１μＭ)は遅延ＩＰＳＰ(ｎ＝６)を除き、この化合物がシナプス後ＧＡＢＡ_Ｂレセプターのアンタゴニストであることを示す。

実施例５
ｃＤＮＡライブラリー構築
ＲＮＡを、Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159に従って、７日齢ラットの皮質および小脳から精製する。ポリＡ(＋)ＲＮＡを、記載(Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982) Molecular cloning:A laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY)に記載のように、オリゴ(ｄＴ)カラム(Boehringer Mannheim)を２回通過させて富化する。オリゴ(ｄＴ)刺激された二本鎖ｃＤＮＡを、商品ｃＤＮＡ合成システム(Amersham)を使用して、５μgのポリＡ(＋)ＲＮＡから合成する。キットに供給されている逆転写酵素は、RNAseH(-)SuperscriptII逆転写酵素(Gibco BRL)と置きかえる。ｃＤＮＡ溶液をｔＲＮＡで予備吸着したCentricon-100装置(Amicon)で濃縮し、最終量１００μlとする。小ｃＤＮＡをChromaspin-1000カラム(Clontech)を通して除去する。BstXIアダプター(Invitrogen)をＴ４ ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)を使用して添加し、ｃＤＮＡをアガロースゲルでサイズ分画する。２kbより大きいサイズのｃＤＮＡを精製(Qiaex, Qiagen)し、発現ベクターpcDNAI(Invitrogen)のBstXI部位にライゲートする。ライゲーション混合物のアリコートで、エレクトロコンピテントMC1061/P3エシェリキア・コリ細胞を形質転換(BioRad Gene Pulser II)する。ライブラリーの複雑さを２×１０^６の個々のクローンで概算する。４８クローンの分析から推測される平均挿入サイズは、２.９kb(２.０kbから６.６kbのサイズの範囲)である。

ＣＯＳ１細胞のトランスフェクションのためのプラスミドは、ｃＤＮＡ形質転換の最初の回の後に得た細菌コロニーから単離する。簡単に、ｃＤＮＡライブラリーのアリコートでエレクトロコンピテントMC1061/P3エシェリキア・コリ細胞を形質転換し、寒天プレートで平板培養することにより力価測定する。ｃＤＮＡライブラリーを約２０００コロニーのプールに分け、９cmの寒天プレートで平板培養し、一晩３７℃で生育させる。細菌をプレートから掻き出し、プラスミドＤＮＡをイオン交換カラム(Qiawell, Qiagen)を使用して製造する。

実施例６
ＣＯＳ細胞のｃＤＮＡでのトランスフェクション
ＣＯＳ１細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から得、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)および１５μg／mlゲンタマイシン(Gibco BRL)を添加したダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)で、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で生育させる。

個々の細菌コロニーのプール由来のプラスミドＤＮＡを、標準ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法の変法を使用して、ＣＯＳ１細胞内に挿入する。簡単に、トランスフェクション１日前に、７.５×１０^５細胞を、９cm皿に撒く。翌日、培地を除き、細胞をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ錠、Gibco BRL)１０ml中で１５分インキュベートする。その後、ＰＢＳを除き、ＰＢＳ中の１mg／ml ＤＥＡＥ−デキストラン(Pharmacia)４mlを皿に添加する。９分、室温でインキュベーション後、細胞を２回それぞれ５mlのＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを吸引し、５４０μl ＰＢＳ中の４μgプラスミドＤＮＡ(２０００の個々の細菌コロニーのプール由来)を更に添加し、ＤＮＡと３０分、３７℃で時々揺らしながらインキュベーションする。続いて、１０％ＮＵ−血清(Collaboratorive Research)および８０μＭクロロキン(Sigma)添加ＤＭＥＭ培地４mlを添加する。４時間、３７℃でインキュベーション後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ中の１０％(ｖ／ｖ)ジメチルスルフオキシド(Merck)中で２分インキュベートする。細胞をＰＢＳですすぎ、細胞培養培地を培養皿に添加し、細胞を更に２から３日生育させる。

実施例７
リガンド結合アッセイによるＧＡＢＡ_Ｂレセプタークローンの同定
ＤＮＡのプール(各２０００の個々のコロニー)を、ＣＯＳ１細胞の一過性形質転換後に、ヨウ素化CGP 64213(特異的活性２０００Ci／mmol)での放射性リガンド結合アッセイを使用して、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター発現に関して分析する。

トランスフェクトしたＣＯＳ１細胞の培養皿を氷上に置き、２回、各５mlのクレブス−ヘンゼライト−トリス緩衝液(２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７.４、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、５.６ｍＭグルコース、１.２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１.２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４.７ｍＭ ＫＣｌ、１.８ＣａＣｌ_２)で洗浄する。その後、細胞を、クレブス−トリス緩衝液中で０.２ｎＭの^１２５Ｉ−CGP 64213と共にインキュベートする(１ml溶液／９cm皿)。８０分、室温でインキュベーション後、皿を氷で冷やし、２回、５分、氷冷クレブス−トリス緩衝液５mlで洗浄する。続いて、皿をファンを使用して空気乾燥し、プレートの壁を除去する。オートラジオグラフィーのために、プレートの皿を、補力するスクリーンと共に、コダックX-OMAT ARフィルムに、２から３週間、−８０℃でさらす。

上記ｃＤＮＡライブラリーからの全６４０,０００の個々のクローン(３２０の別々のプール)をスクリーニングする。一つのプールはリガンド結合アッセイにおいて陽性シグナルを発生する。このプールからのプラスミドＤＮＡでエレクトロコンピテントMC1061/P3細胞を再形質転換する。各５００コロニー由来の１０プラスミドプールを製造し、その二つは結合アッセイの再スクリーニングで陽性である。二つのプールの一つの４回連続細分後(SIB選択;McCormick, M. (1987) Methods Enzymol. 151, 445-449)、４３７６bp挿入を含む一つのｃＤＮＡクローンを同定する。最初の同定したｃＤＮＡクローンは、本来Ｆ４と読んでいたが、ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ(配列番号１)と命名する。このｃＤＮＡクローンは、１０８kDaの計算される分子量の推定される９６０アミノ酸のタンパク質をコードする読み取り枠を包含する(配列番号２)。von Heijne(von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids. Res. 14, 4686-4691)に従って、最初の１６アミノ酸は高い可能性で、成熟タンパク質では欠失するシグナルペプチドをコードする。予測される成熟タンパク質の計算される分子量は１０６kDaである。推定されるタンパク質のKyteおよびDolittle(1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132のアルゴリズムでの、University of Wisconsin Genetics Computer Group (Devereux, et al., (1984) Nucl. Acids. Res. 12, 387-395)の配列分析プログラムを使用した疎水性分析は、Ｇ−タンパク質に結合する細胞表面レセプターで予期されるように、数個の膜スパンニング領域を予測する。推定のＮ−グリコシル化部位は、配列番号２に記載の予測される成熟タンパク質のアミノ酸位置７、６７、３９２、４２３、４６５、４８５、４９７および６１４に見られる。

実施例８
クローン化ＧＡＢＡ_Ｂレセプターのアッセイ
クローン化ＧＡＢＡ_Ｂレセプターを含む膜を単離するために、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター−発現ＣＯＳ細胞を含む培養皿を２回クレブス−ヘンゼライト−トリス緩衝液で洗浄する。その後、細胞を皿から掻き出し、ガラス−ガラスホモジナイザーで均質化し、３０分、４℃で４０,０００ｇで遠心する。均質化および遠心段階をもう一回繰り返す。ペレットを緩衝液に再懸濁し、更に分析するまで液体窒素中に貯蔵する。

ＧＡＢＡ_ＢレセプターｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞由来の膜(脳組織から同様の方法で得た膜を対照として使用する)をクレブス−ヘンゼライト−トリス緩衝液に約１mg／mlの濃度で懸濁する。膜を次いで暗所で、０.６ｎＭ ^１２５Ｉ−CGP 71872と、１時間室温でインキュベーションする。コントロール実験は、１μＭのＧＡＢＡ_Ｂレセプター特異的アンタゴニストである非標識CGP 54626Aを含む。インキュベーションを２０,０００ｇ、１０分、４℃での遠心により停止する。ペレットを一度緩衝液で洗浄し、非結合物を結合光親和性標識から除去する。ペレットを緩衝液に再懸濁し、ＵＶ光(３６５nm、２４Ｗ)で３分照射する。懸濁液を再び遠心(２０分、４０,０００ｇ)する。ペレットを緩衝液で洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解し、６％ＳＤＳゲルで、Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685に従って分離する。ゲルを乾燥させ、補力スクリーンと共に、Dupont Reflection NEF-495Ｘ線フィルムに一晩さらす。４,３７６bp ｃＤＮＡクローンから発現されたタンパク質は、約１２０kDaの見かけの分子量を有する(図１)。組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準(BioRad)に対するゲル移動性から概算する。

ＣＯＳ１細胞で発現されたＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターの結合薬理学は、ラット大脳皮質膜の天然ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの結合薬理学と同等である。この目的のために、放射性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 64213の結合特性ならびにこの結合の選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストおよびアゴニストでの阻害を比較する。ＣＯＳ細胞で発現されたＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターの解離定数Ｋ_Ｄは１.８５ｎＭと決定する。皮質膜で発現されたＧＡＢＡ_ＢレセプターのＫ_Ｄは２.７ｎＭであり、従って組換えレセプターで得られたのと類似の値である。ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストCGP 54626A(Froestl et al., (1992) Pharmacol. Communicaitons 2, 52-56)、CGP 71872、CGP 64213およびCGP 35348(Froestl et al., 1992)のＩＣ_５０値(表１)および阻害曲線の傾斜は、組換えおよび天然レセプターで非常に類似である。アゴニストＧＡＢＡ、Ｌ−バクロフェンおよびCGP 27492(アミノホスホン酸、ＡＰＰＡ)の親和性の順番は、組換えおよび天然レセプターで同じであるが、アゴニスト親和性は組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターで常に有意に低い(図３、表１)。ＧＴＰまたはその安定アナログGpp(NH)pは天然ＧＡＢＡ_Ｂレセプターでのアゴニスト親和性を、そのＧ−タンパク質からのレセプターの解離により減少させる(Hill et al., (1984) J. Neurochem. 42, 652-657)。従って、アゴニストの組換えレセプターでの低い親和性は、ＣＯＳ細胞内で、脳細胞内で通常ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに結合しているＧ−タンパク質が利用できないという事実を反映する。我々は、ラット皮質ＧＡＢＡ_Ｂレセプターに関して、Ｌ−バクロフェンのＩＣ_５０値は、３００μＭ Gpp(NH)p存在下で１７０ｎＭから１０μＭにシフトすることを測定している。従って、天然ＧＡＢＡ_ＢレセプターからのＧ−タンパク質の解離は、ＣＯＳ細胞で発現された組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターで得られた３４μＭと同等のＩＣ_５０値をもたらす。結論として、組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターは、ラット皮質由来の天然ＧＡＢＡ_Ｂレセプターと同様の結合薬理学を示す。

表１. 天然および組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの結合薬理学

実施例９
関連遺伝子をクローンするためのＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプターの使用
単離したラットＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ−レセプター(配列番号１)は、更なるＧＡＢＡ_Ｂ−レセプター遺伝子ファミリーのｃＤＮＡ、遺伝子およびタンパク質の同定および単離のためのプローブとして有用である。例えばヒトのような他の種におけるＧＡＢＡ_Ｂ−レセプター遺伝子ファミリーのｃＤＮＡ、遺伝子およびタンパク質の同定および単離にもまた有用である。

更なるラットクローン(ＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂと呼ぶ)およびヒトＧＡＢＡ_Ｂレセプタークローンを単離するために、上記ラットライブラリーおよびヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー(Clontech, Palo Alto, カタログ番号HL3025s)をＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ ｃＤＮＡと、適当なハイブリダイゼーション条件下で交差ハイブリダイズさせる。ヒトライブラリーは、発現ベクターpcDNAIに挿入された、１.２×１０^６の個々のｃＤＮＡクローンを含む単方向オリゴ(ｄＴ)−刺激ライブラリーである。プラスミドライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法は、Sambrook et al. (1989)に記載されている。使用するハイブリダイゼーションプローブは、ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ ｃＤＮＡ(配列番号１)の塩基１９３１から３２６４に対応する^３２Ｐ−標識１.３kb PvuII／ScaIフラグメントである。ハイブリダイゼーションは、０.５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４(ｐＨ７.２)、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６０℃で一晩であった。続く洗浄段階は、１時間、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５５℃(ラットライブラリー)または２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃(ヒトライブラリー)の最終強度である。コダックＸ ＯＭＡＴ ＡＲフィルムを一晩膜に、補力スクリーンと共に−８０℃でさらす。Ｘ線フィルムを、細菌コロニーを含む寒天プレートに並べ、交差ハイブリダイズｃＤＮＡクローンを含むコロニーを単離する。細菌を寒天皿で再平板培養し、コロニーハイブリダイゼーションスクリーニングを２回繰り返す。得られた個々のコロニーをサザンブロットハイブリダイゼーションで分析する。選択したｃＤＮＡコロニーを配列決定により分析し、ラットＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂの２.９kbｃＤＮＡを特徴付ける(配列番号５参照)。このｃＤＮＡは８４４アミノ酸のタンパク質をコードする(配列番号６参照)。この成熟ＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂはＮ−末端１４７アミノ酸残基が１８の異なる残基に置換されていることにより、前記ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａと異なる。恐らく、これらの二つのＧＡＢＡ_Ｂレセプター変異体は、選択的スプライシングにより同じ遺伝子から由来する。ヒトライブラリースクリーニングで陽性のこれらのクローンをまた配列決定で分析し、７９３アミノ酸残基(配列番号４)のレセプタータンパク質をコードする部分的配列を有するＧＡＢＡ_ＢＲ１ａ／ｂ(配列番号３参照)と名付けた一つのクローンならびに、アミノ酸(配列番号８)を有するヒトＧＡＢＡ_Ｂレセプターをコードする完全長ｃＤＮＡを示すＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂヒト(配列番号７参照)と名付けた他のクローンを明らかにする。

実施例１０
HEK293細胞で安定に発現されるＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、アデニレートシクラーゼに陰性に結合する
ＧＡＢＡ_Ｂレセプターは、アデニレートシクラーゼを阻害し、ホスホリパーゼＡ_２を刺激し、Ｋ^＋−チャンネルを活性化し、ボルト数依存的Ｃａ^２＋−チャンネルを不活性化し、イノシトールリン脂質加水分解を調節すると記載されている。ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａおよび−ｂは細胞内と予期される全てのドメインで同一の配列を有するため、同じエフェクターシステムに結合すると予期される。ラット皮質切片調製物を使用して、Ｌ−バクロフェンはホルスコリン−刺激ｃＡＭＰ蓄積を約４０％まで減少させることが示されている。HEK293細胞で安定に発現されているＧＡＢＡ_ＢＲ１ａがホルスコリン−刺激ｃＡＭＰ蓄積を減少させる能力を分析する(図５)。我々は、最大効果を製造するホルスコリンおよびＬ−バクロフェンの濃度を選択した。ホルスコリンはHEL293細胞内でｃＡＭＰレベルを基底レベルの１０倍以上まで刺激する。組換え発現ＧＡＢＡ_Ｂレセプターの３００μＭ Ｌ−バクロフェンとの共投与による刺激は、ホルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を約３０％まで減少させる。この阻害は、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストであるCGP 54626Aにより拮抗される。アデニレートシクラーゼ活性のＧＡＢＡ_ＢＲ１ａによる調節は、百日咳毒素に感受性であり、Ｇ_ｏを欠失するKEK293細胞で、ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａがＧ_ｉに結合することを示す。コントロールとして、Ｌ−バクロフェンはホルスコリン−刺激ｃＡＭＰ形成を非トランスフェクトHEK293細胞で阻害しない(図５)。

寄託データ
ラット由来のＧＡＢＡ_ＢレセプタークローンＧＡＢＡ_ＢＲ１ａは、ブタペスト条約に基づいて、ドイツ、デー−３８１２４ブラウンシュヴァイク、マシェローダーヴェーク１ベー番のドイッチェ・サムルング・フォン・ミクロオルファニズメン・ウント・ゼルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(ＤＳＭＺ)に、１９９６年５月１７日に、受託番号ＤＳＭ１０６８９で寄託した。
ラット由来のＧＡＢＡ_ＢレセプタークローンＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂおよびヒト源由来のＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂは、ブタペスト条約に基づいて、ドイツ、デー−３８１２４ブラウンシュヴァイク、マシェローダーヴェーク１ベー番のドイッチェ・サムルング・フォン・ミクロオルファニズメン・ウント・ゼルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング(ＤＳＭＺ)に、１９９７年２月２１日に、それぞれ受託番号ＤＳＭ１１４２２および１１４２１でで寄託した。

図１ａは、ＣＯＳ１細胞での組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａの発現を記載する。ラット皮質膜(レーン１)およびＧＡＢＡ_ＢＲ１ａラットｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞(レーン２および３)由来の膜を光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872で標識する。レーン当たり２５μgタンパク質を充填した６％ＳＤＳゲルのオートラジオグラフィ−を示す。レーン１および２：０.６nＭ[^１２５Ｉ]CGP 71872の特異的結合。レーン３：０.６nＭ[^１２５Ｉ]CGP 71872での特定の結合が、１μＭの非標識CGP 54626A(ＧＡＢＡ_Ｂレセプター特異的アンタゴニスト)と競合する、対照実験。天然および組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準(BioRad)と比較して、ゲル移動性で概算した。図１ｂは更にＧＡＢＡ_ＢＲ１ｂラットーｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞の結果を示す(レーン３)。 図２はラット大脳皮質由来の膜のＧＡＢＡ_Ｂレセプター(白抜き)およびＣＯＳ１細胞由来の組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプター(黒塗り)に結合する[^１２５Ｉ]CGP 6421３の、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストCGP 54626A(●)、CGP 64213(▲)およびCGP 35348(■)による阻害を示す。 図３はラット大脳皮質由来の膜のＧＡＢＡ_Ｂレセプター(白抜き)およびＣＯＳ１細胞由来の組換えＧＡＢＡ_ＢＲ１ａレセプター(黒塗り)に結合する[^１２５Ｉ]CGP 64213の、ＧＡＢＡ_ＢレセプターアゴニストＧＡＢＡ(●)、Ｌ−バクロフェン(▲)およびＡＰＰＡ３−(アミノプロピル−ホスフィン酸)(■)による阻害を示す。 図４は、ＧＡＢＡ_Ｂレセプタータンパク質の光親和性架橋を示す。示す組織の細胞膜は、[^１２５Ｉ]CGP 71872で光親和性標識し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ−に付す。ａ、ｂは光親和性リガンド[^１２５Ｉ]CGP 71872の選択性。ａは神経系の組織の１３０Ｋおよび１００ＫのＧＡＢＡ_Ｂレセプター変異体の異なる分散。[^１２５Ｉ]CGP 71872結合は選択的ＧＡＢＡ_ＢレセプターアンタゴニストであるCGP 54626A １μＭの添加により開始する。ｂは異なるリガンドで標識した[^１２５Ｉ]CGP 71872の競合。膜抽出物の光親和性リガンドとのインキュベーションは、示す濃度での競合物質の存在下で行う。ｃはＧＡＢＡ_ＢレセプターはＮ−グリコシル化である。光親和性標識ラット皮質細胞膜を０.４単位のＮ−グリコシダーゼＦまたは０.６ミリ単位のＯ−グリコシダーゼ(Boehringer Mannheim)とインキュベートする。ｄは異なる種由来のＧＡＢＡ_Ｂレセプターの光標識。示す種由来の脳組織は、下記のように標識する。Drosophila melanogasterおよびHaemonchus concortusの場合、全動物を分析する。 図５は天然および組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターの薬理学的特性に関するアッセイの結果を示す。ＧＡＢＡ_ＢＲ１ａはアデニレートシクラーゼの阻害を介在する。安定にＧＡＢＡ_ＢＲ１ａを発現するHEK293細胞をホルスコリン(Ｆsk)２０μＭで処理し、ｃＡＭＰ形成を刺激する(１００％)。Ｆsk誘導ｃＡＭＰ蓄積は、３００μＭ Ｌ−バクロフェンの同時添加により有意(２Ｐ＜０.００１；デュネットのｔ検定)に減少する。Ｌ−バクロフェンの作用は１０μＭ CGP 54626A存在下で拮抗する。百日咳毒素(PTX)１０ng／mlとの細胞の１５−２０時間の予備インキュベーションは、Ｌ−バクロフェンの作用を完全になくす。Ｌ−バクロフェン反応は、非トランスフェクトHEK293細胞では観察されない(挿入)。棒は、４回行った実験の少なくとも個々の３回の平均値±S.E.M.を示す。

Claims (21)

1. (a)配列番号１のヌクレオチド１８２位から３０６１位；配列番号３のヌクレオチド１位から２３７９位；配列番号５のヌクレオチド２２８位から２７５９位；または配列番号７のヌクレオチド１６９位から２７００位に記載の核酸配列を含む核酸配列のいずれかにより；
   (b)受託番号ＤＳＭ１０６８９、ＤＭＳ１１４２１およびＤＳＭ１１４２２でＤＳＭＺに寄託されたクローンから成る群から選択される核酸クローンにより；または
   (c)配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のポリヌクレオチドと中位のストリンジェンシー条件下(ここで、中位のストリンジェンシー条件は、６０−６２℃で、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの洗浄段階で終わる)でハイブリダイズする核酸配列のいずれかにより；
   コードされる、単離されたＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質。
2. 式Ｉまたは式II：
   

   

   の選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニストの少なくとも一つに特異的結合できる、請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質。
3. ヒトＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質である、請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質。
4. アミノ酸配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８と３０％を超える相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質。
5. 配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質。
6. 配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする、単離核酸。
7. 核酸配列が配列番号１のヌクレオチド１８２位から３０６１位；配列番号３のヌクレオチド１位から２３７９位；配列番号５のヌクレオチド２２８位から２７５９位；または配列番号７のヌクレオチド１６９位から２７００位に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６記載の単離核酸。
8. 核酸配列が受託番号ＤＳＭ１０６８９、ＤＭＳ１１４２１およびＤＳＭ１１４２２でＤＳＭＺに寄託されたクローンから成る群から選択される核酸クローンによりコードされる、請求項６記載の単離核酸。
9. 配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７を含む核酸配列のいずれか一つと中位のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下(ここで、中位のストリンジェンシー条件は、６０−６２℃で、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの洗浄で終わり、高ストリンジェンシー条件は６５−６８℃で、０.２−１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの洗浄で終わる)でハイブリダイズできる、核酸プローブ(ただし、ＥＭＢＬ受託番号Ｘ９０５４２の核酸プローブを除く)。
10. 核酸プローブが請求項９に記載の核酸配列に関してアンチセンス核酸配列を有する、請求項９記載の核酸プローブ。
11. 配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に記載のレセプターまたはレセプタータンパク質に対して発生させた、抗体。
12. モノクローナル、ポリクローナルまたはキメラ抗体である、請求項１１記載の抗体。
13. Ｆａｂ、Ｆ(ab')_２、ＦｖまたはＳｃＦｖフラグメントである、請求項１１記載の抗体。
14. 制御配列に作動可能に結合した請求項６記載の核酸から成るコード配列を含む、複製可能核酸ベクター。
15. 請求項１４記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
16. 請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を含む、トランスジェニック非ヒト動物細胞(ただし、該トランスジェニック非ヒト動物細胞は請求項１記載のＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を内因性に発現しない)。
17. ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする可能性のあるｃＤＮＡ分子をコードする発現ライブラリーを製造し；
    ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質と結合できる特異的リガンドで発現ライブラリーをスクリーニングする段階を含み、ここで、該特異的リガンドが式Ｉ
    

    

    の化合物または式II
    

    

    の化合物である、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸の同定法。
18. (a)ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする可能性のあるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ分子をコードする発現ライブラリーの製造；
    (b)請求項１０に記載の核酸プローブとのハイブリダイズによる発現ライブラリーのスクリーニング；および
    (c)プローブとハイブリダイズする核酸分子の同定：
    の段階を含む、ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする核酸の同定法。
19. 組換えＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質を含む試験システムの調製；
    化合物または化合物の混合物への試験システムの暴露；
    試験システムで測定してＧＡＢＡ_Ｂレセプター活性の調節をもたらす化合物または化合物の混合物の同定：
    の段階を含む、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター活性の調節剤の可能性のある化合物または化合物の混合物のスクリーニング法。
20. 通常ＧＡＢＡ_Ｂレセプターまたはレセプタータンパク質をコードする遺伝子と結合している制御配列と作動可能に結合した試験遺伝子を含む発現系の提供；
    試験遺伝子の発現のレベルの変化をもたらす化合物の同定：
    の段階を含む、ＧＡＢＡ_Ｂレセプター発現の調節剤の可能性のある化合物または化合物の混合物のスクリーニング法。
21. 請求項２記載の式Ｉまたは式IIの選択的ＧＡＢＡ_Ｂレセプターアンタゴニスト。

Images