JP2008099689A - 組織再構築関連状態についての非侵襲性酵素スクリーニング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】対象から生体試料を得る段階、生体試料において特にマトリックスメタロプロティナーゼを含む高分子量酵素複合体を検出する段階、および高分子量酵素複合体の有無を、組織再構築関連状態の有無と相関させ、それにより組織再構築関連状態についての対象の診断を容易にする段階からなる。
【選択図】なし
Description
本出願は、2000年10月13日に出願された米国特許仮出願第60/240,489号の優先権を主張し、その内容は参照として本明細書に明白に組み入れられている。本出願はまた、1996年4月26日に出願された第08/639,373号(放棄)、米国特許第6,037,138号、および第09/469,637号(係属中)に関連し、それぞれの全内容は参照として本明細書に明白に組み入れられている。ヤン(Yan), L.ら、(2001)J. Biol. Chem. 276: 37258〜37265の内容は参照として本明細書に明白に組み入れられている。
マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、その活性がZn++およびCa++などの金属イオンに依存する、エンドペプチダーゼのファミリーである。MMPは総じて、転移過程の一部として分解され、腫瘍細胞を正常周囲組織から隔離する障壁である、細胞外マトリクス(ECM)の全分子成分を分解できる(Lochter, A.ら、(1998)Ann N Y Acad Sci 857: 180〜93(非特許文献1))。様々な生物学的過程、および病理学的過程、特に腫瘍細胞の浸潤および転移において、MMPが重要な役割を果たすことが示されている(Kleiner, D. E. およびStetler-Stevenson, W. G.(1999)Cancer Chemother Pharmacol. 43: S42-51(非特許文献2))。腫瘍細胞または周辺間質細胞によるMMPの過剰生成は、転移性表現型と相互に関連している。特に、その内容が参照として本明細書に完全に組み入れられている米国特許第09/469,637号(特許文献1)は、生物学的活性のある無傷のMMPが癌患者の生体試料において検出されうり、かつこれが独立性の疾患状態の予測因子(predictor)であることを開示している。米国特許第09/469,637号(特許文献1)において検出されるMMP活性には、例えばMMP-9(92 kDa、ゼラチナーゼB、IV型コラゲナーゼ、EC 3.4.24.35)およびMMP-2(72 kDa、ゼラチナーゼA、IV型コラゲナーゼ、EC 3.4.24.24)を含む。これらのMMPの両方が、組織再構築関連状態、例えば癌の、独立した予測因子であることが示されている。これら2つの主なゼラチナーゼ種に加えて、150 kDaと同等、またはそれ以上の分子量をもついくつかのMMP活性が観察され、高分子量(hMW)MMPと呼ばれた。実験的腫瘍をもつ動物由来または癌患者由来の、血清、血漿、および尿を含む生物学的液体におけるMMPレベルの上昇は、その他のいくつかの研究においても報告されている(Nakajima, Mら、(1993)Cancer Res. 53: 5802〜7(非特許文献3); Zucker, S.ら、(1994)Ann N Y Acad Sci. 732: 248〜62(非特許文献4); Baker, T.ら、(1994)Br J Cancer. 70: 506〜12(非特許文献5); Garbisa, S.ら、(1992)Cancer Res. 52: 4548〜9、1992(非特許文献6))。
癌治療の進歩に伴い、初期診断および/または予測が、疾患転帰にとってますます重要になってきている。従って本発明は、組織再構築関連疾患、例えば癌と診断された対象の生体試料において見出されるhMW MMPの分子同一性を特徴とし、かつそのような疾患の初期診断/予測を提供する。これらのhMW MMP、例えば高分子量酵素複合体の同定により、本発明は、癌などの組織再構築関連疾患を予想するための非侵襲性診断法および/または予測法の発達を促進する。
本発明は、組織再構築関連状態(TRAC)、特に、癌、閉塞性および変性の状態、ならびに関節炎状態についての、対象の診断を容易にするための非侵襲性方法を特徴とする。対象由来の生体試料中の酵素複合体、例えば高分子量(hMW)酵素複合体のパターンの検出が、TRACの診断および予測を容易にするために用いられる。
尿試料の採集および調製-
尿試料採集は、その内容が参照として完全に本明細書に組み入れられている、モーゼズ(Moses), M. A.ら、(1998)Cancer Res. 58: 1395〜9に記載されているように行われた。試料は、採集後直ちに凍結され、アッセイまで-20℃で凍結保存された。分析の前に、血液または白血球を含む検体は、Multistix 9 Urinalysis Strips(Bayer、Elkhart、IN)を使用して血液および白血球の存在について試験することにより除外された。尿試料のクレアチン濃度は、市販のキット(Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO)を用い、製造会社の使用説明書に従って測定された。
基質ゲル電気泳動は、以前に記載された米国特許第09/469,637号に基づき改変を加えて行われた。最初の尿試料(50 μl)を非還元試料緩衝液[4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.15 M トリス pH 6.8、20%v/v グリセロール、および0.5%v/v ブロモフェノールブルー]と混合し、0.1%ゼラチンを含む10%ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad、Hercules、CA)上で分離した。電気泳動後、ゲルを2.5%Triton X-100で2回洗浄した(各洗浄あたり15分間)。ゲルを5 mM CaCl2、1 μM ZnCl2、1%Triton X-100および0.02%NaN3を含む50 mM トリス-HCl(pH 7.6)中、37℃で24時間インキュベートすることにより、基質消化を行った。ゲルを0.1%クーマシーブリリアントブルーR250(Bio-Rad、Hercules、CA)で染色し、ゼラチン分解活性の位置を均一な青色染色のバックグラウンド上に透明なバンドとして検出した。
分子量カットオフ値(MWCO)50 kDaのUltraFree-4遠心フィルター装置(Millipore、Bedford、MA)を用いて、尿試料を濃縮した。濃縮された尿試料のタンパク質濃度は、MicroBCA法(Pierce、Rockford、IL 61105)を用いて測定された。等量(20 μg)のタンパク質を4%〜15%勾配ゲルにロードし、非還元条件下でSDS-PAGEにより分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜(TransBlot、Bio-Rad、Hercules、CA)へ電気泳動的に移動させた。TBS-T(10 mM トリス、pH 7.2、50 mM NaCl、0.5%Tween20)中で1時間、室温で5%低脂肪粉乳を用いて膜をブロックし、続いて、4℃で18時間、一次抗体とインキュベートした。ブロットをTBS-Tで8回洗浄し(洗浄あたり5分間)、3%BSAを含むTBS-Tで1:5000希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合型二次抗体(Vector Laboratories、Burlingame、CA)と、室温で1時間インキュベートした。標識されたタンパク質は、増幅された化学発光により可視化された(Amersham、Arlington Heights、IL)。ヒトNGALに対する精製ポリクローナル抗体は、1:100希釈で使用された(Kjeldsen, L.ら、(1993))。精製されたヒト好中球MMP-9/NGAL複合体は、陽性対照として使用された(CalBiochem、La Jolla、CA)。
125 kDa MMP活性を含む最初の尿試料を、等量のRIPA緩衝液(150 mM NaCl、1.0%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50 mM トリス pH 8.0、0.02%アジ化ナトリウム)と混合した。希釈された尿試料50 μlをウサギ抗ヒトNGAL抗体または対照抗体の増加量と混合した。氷上で30分間インキュベートした後、試料を5 μl RIPA緩衝ザイソルビン(Zysorbin)(ZyoMed Laboratories、South San Francisco、CA)と混合した。氷上で更に30分間インキュベーションした後、抗体-抗原複合体を、10,000 gで5分間の遠心分離により除去した。上清を基質ゲル電気泳動に供して、残存MMP活性を検出した。
組換えヒトproMMP-9(Oncogene、Cambeidge、MA)をゼラチナーゼ緩衝液[50 mM 酢酸ナトリウム(pH = 5.5)または5 mM CaCl2、1 μM ZnCl2を含む50 mM トリス-HCl(pH = 7.0、7.6、または8.0)]で希釈し、最終濃度を10 μMにした。組換えヒトNGALを前述のように精製し、ゼラチナーゼ緩衝液で70 μMまで希釈した。proMMP-9を1:20のモル比でNGALと混合し、37℃で1時間インキュベートした。MMP-9/NGAL複合体の形成は、基質ゲル電気泳動を用いて分析された。proMMP-9およびNGALをまた、MMP活性をもたない正常な対照尿によって別々に希釈した。尿中でのMMP-9/NGAL複合体形成の可能性は、proMMP-9およびNGALを、2:1、1:5、1:10、および1:20のモル比で混合することにより調査された。MMP-9/NGAL複合体は、基質ゲル電気泳動を用いて検出された。
尿試料中のMMP活性の基質ゲル電気泳動
尿試料に含まれるMMP活性は、基質ゲル電気泳動を用いてアッセイされた。新たに解凍された尿試料50 μlを分析のために使用した。これらの尿試料において少なくとも4つの主なMMP活性が容易に検出され、見かけの分子量は200,000、125,000、92,000、および72,000であった(図1A)。92 kDaおよび72 kDaのMMP活性は、それぞれMMP-9およびMMP-2であることが以前に判定されている。200 kDa MMP活性は、MMP-9二量体の推定分子量と一致している。125 kDa MMPの同一性は不明である。好中球由来の精製されたヒトMMP-9/NGAL複合体と共に分析された場合、125 kDa尿MMP活性は、ヒト好中球MMP-9/NGALのそれと同じ位置に移動した(図2A)。この125 kDa尿MMPは、MMP-9およびNGALの活性複合体である。MMPであるというこれらのゼラチン分解活性の同一性は、最終濃度10 mMで1,10-フェナントロリンを使用する阻害研究により確認された(データは未表示)。
抗NGAL抗体による尿試料のウエスタンブロット分析
MMP-9およびNGALの複合体としての125 kDaの尿MMPの同一性をさらに示すために、濃縮尿試料を、ヒトNGALに対する精製抗体を用いるウエスタンブロット分析に供した(Kjeldsen, L.(1993))。非還元条件下で、125 kDaのタンパク質バンドが、125 kDa MMP活性を含む尿試料中で検出された(図1B)。癌患者由来の尿試料のスクリーニングにより、MMP-9/NGALタンパク質複合体の検出と125 kDa MMP活性の存在との間の相関関係が確立された(図1B)。精製抗NGAL抗体を用いて、125 kDaタンパク質バンドが125 kDa MMP活性を含む尿試料中に一貫して検出された。抗体はまた、分析されたすべての尿試料中で、NGAL単量体型(25 kDa)、二量体型(50 kDa)、および三量体型(75 kDa)の存在を検出した。NGAL抗体の特異性は、精製されたヒト好中球MMP-9/NGAL複合体を用いて確認された。非還元条件下で、抗体は、好中球から精製されたMMP-9/NGAL複合体と同様に、濃縮された尿試料中の125 kDa MMP-9/NGAL複合体を認識した(図2B)。MMP-9/NGAL複合体ならびにNGAL単量体、二量体および三量体の複合体に加えて、見かけの分子量150 kDaのいくつかの微量タンパク質バンドもまた、濃縮された尿試料中に検出された。それらの同一性は現在不明であるが、抗NGAL抗体と非特異的に交差反応したタンパク質である可能性が最も高い。
免疫沈降-ザイモグラフィー
尿中の125 kDa MMP活性の同一性をさらに実証するために、抗NGAL抗体を用いて、尿中にNGALとの複合体の形で存在する任意のMMP活性を免疫沈降させた。図3に示されるように、抗NGAL抗体は、濃度依存的様式で、125 kDa尿MMP活性を特異的に免疫沈降させた。125 kDa尿MMP活性の増加量は、抗NGAL抗体の増加量を用いた処理により除去された。抗NGAL抗体1.0 μlで処理された場合、125 kDa MMP活性は完全に除去された。抗NGAL抗体は、他の任意のMMP活性、例えば200 kDa MMP-9二量体、92 kDa MMP-9、または72 kDa MMP-2に効果がなかった。免疫沈降反応の特異性はまた、最高濃度においてでさえいずれのMMP活性も免疫沈降させない対照抗体を用いて、確認された。対照抗体1.0 μlで処理された試料中のMMP-2活性における増加は、血清に含まれる内因性MMP-2活性から生じた。これらのデータをひとまとめにして考えると、癌患者の尿試料中の125 kDa MMP活性はMMP-9とNGALの複合体であるという本発明者らの発見が裏付けられる。
インビトロでのMMP-9/NGAL複合体の再構成
MMP-9/NGAL複合体の形成はまず、陽イオン性のイオンを含むゼラチナーゼ緩衝液を用いて調べられた。組換えヒトproMMP-9およびヒトNGALを最初、pH値が異なる(5.5、7.0、7.6および8.0)ゼラチナーゼ緩衝液に希釈した。希釈されたproMMP-9およびNGALを、続いて1:10のモル比で混合し、最終濃度をそれぞれ、2.6 μMおよび26 μM にした。37℃での1時間のインキュベーション後、MMP-9/NGAL複合体の形成を基質ゲル電気泳動を用いてモニターした。proMMP-9およびNGALを混合することにより、分子量約115 kDaの優勢なMMP活性が生じた(図4A)。115 kDa MMP-9/NGAL複合体の形成は、5.5から8.0の範囲内のpH値、つまり正常な尿のpH範囲をもつ緩衝液中で起きた。しかしながら、この優勢なMMP活性のサイズは、精製されたヒト好中球MMP-9/NGALのそれと同じではない。pH 7.0、7.6および8.0の緩衝液において観察される、125 kDaの微量なMMP活性がある。尿中でのMMP-9/NGAL複合体形成の可能性は、正常な対照尿中でproMMP-9およびNGALを希釈することにより直接試験された。希釈されたproMMP-9およびNGALを異なるモル比(proMMP-9/NGLA = 2:1、1:5、1:10および1:20)で混合し、37℃で1時間インキュベートした。115 kDa MMP-9/NGAL複合体の形成は、すべての混合比において容易に検出された(図4B)。希釈液として使用された対照尿において、MMP活性は検出されなかった。
インビトロでのNGALによるMMP-9分解の調節
インビトロにおいてNGALがMMP-9分解に与える影響は、インキュベーション前に、MMP-9(0.1 μ)およびNGAL(1/0 μ)を混合することにより試験された。MMP-9分解は、NGALの存在下で阻害され、その結果として単独でインキュベートされたMMP-9と比較した各時点での酵素残存量の増加により証明されるように、酵素的分解速度の減少がもたらされた。免疫的に枯渇したNGALは、明らかなMMP-9の保護を示さなかった。NGALの増加量の存在下で、MMP-9の分解が減少し、残存するMMP-9活性の増加がもたらされた。NGALは用量依存的様式でMMP-9を分解から保護できると考えられ、その結果として、MMP-9活性の保存がもたらされた。これらのデータは、MMP-9活性の調節におけるNGALについての潜在的な調節的役割を、例えばNGALがMMP-9との相互作用により腫瘍進行に関与しうることを示唆している。
細胞培養におけるNGALによるMMP-9分解の調節
MMP-9分解へのNGALの保護的効果は、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞を用いた細胞培養において試験された。NGAL(N-2およびN-5)を過剰発現する細胞において、MMP-9活性が検出された。したがって、NGAL発現の増大が、MMP-9活性における増加をもたらすと考えられた。定常状態のMMP-9 mRNAのレベルは、RT-PCR分析を用いて測定されたが、明らかな違いは検出されなかった。内因性MMP-9阻害剤、TIMP-1およびハウスキーピング遺伝子、GAPGHの発現レベルを測定したが、NGALの過剰発現は、TIMP-1またはGAPDHのmRNAレベルに明らかな影響を及ぼさなかった。ヒト乳癌細胞におけるNGALの過剰発現は、MMP-9遺伝子転写における変化に依存しない、MMP-9活性の増加をもたらした。
癌患者の尿中のhMW酵素複合体、例えばMMP-9およびNGALを含む酵素複合体の同定は、TRACを予測するものであり、以下の知見により裏付けられる:(a)尿中の125 kDa MMP活性は、ヒト好中球MMP-9/NGALが移動するのと同じ位置に移動する;(b)抗NGAL抗体は、125 kDa MMP活性を含む濃縮尿試料のほとんどにおいて125 kDaタンパク質バンドをの検出に成功した;(c)同一の抗体が、他の任意のMMP活性に作用することなく、濃度依存的様式で尿中の125 kDa MMP活性を特異的に免疫沈降させることができた。そのような証拠は、参照として本明細書に完全に組み入れられている米国特許第09/469,637号に記載された知見、MMP-9およびMMP-2と同様、hMW MMPの検出が、転移性または器官限局性の癌それぞれの独立した予測因子として役に立つということと一致する。
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多数の等価物を認識するか、または日常的な実験のみを用いて確かめることができると考えられる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
Claims (80)
- 以下の段階を含む、組織再構築関連状態についての対象の診断を容易にするための非侵襲性方法:
対象から生体試料を得る段階;
生体試料において高分子量酵素複合体を検出する段階;および
高分子量酵素複合体の有無を、組織再構築関連状態の有無と相関させ、それにより組織再構築関連状態についての対象の診断を容易にする段階。 - 組織再構築関連状態が癌である、請求項1記載の方法。
- 組織再構築関連状態が、関節炎状態、閉塞性状態、または変性状態である、請求項1記載の方法。
- 癌が器官限局性前立腺癌である、請求項2記載の方法。
- 癌が転移性前立腺癌である、請求項2記載の方法。
- 癌が上皮起源の細胞内にある、請求項2記載の方法。
- 癌が神経系、乳房、網膜、肺、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、尿生殖器官、および胃腸管の癌からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- 癌が中胚葉起源の細胞に生じる、請求項2記載の方法。
- 癌が内胚葉起源の細胞に生じる、請求項2記載の方法。
- 癌が骨細胞または造血性起源の細胞を冒す、請求項2記載の方法。
- 高分子量酵素複合体がプロテアーゼを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項11記載の方法。
- プロテアーゼがマトリクスメタロプロテイナーゼである、請求項11記載の方法。
- マトリクスメタロプロテイナーゼがMMP-9である、請求項13記載の方法。
- 高分子量酵素複合体がリポカリンを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- リポカリンがNGALである、請求項15記載の方法。
- 酵素複合体がTIMPを含む、請求項15記載の方法。
- TIMPがTIMP-1である、請求項17記載の方法。
- 高分子量酵素複合体が、自身と複合して多量体を形成する酵素を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 多量体が二量体または三量体である、請求項19記載の方法。
- 多量体がさらにリポカリンと複合している、請求項19記載の方法。
- リポカリンがNGALである、請求項21記載の方法。
- 多量体がさらにTIMPと複合している、請求項21記載の方法。
- TIMPがTIMP-1である、請求項23記載の方法。
- 酵素複合体の分子量が約150 kDaである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 酵素複合体の分子量が約115 kDa〜約125 kDaである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、組織再構築関連状態についての対象の診断を容易にするための非侵襲性方法:
対象から生体試料を得る段階;
生体試料においてリポカリンを検出する段階;および
リポカリンの有無を組織再構築関連状態の有無と相関させ、それにより、組織再構築関連状態についての対象の診断を容易にする段階。 - 組織再構築関連状態が癌である、請求項27記載の方法。
- 組織再構築関連状態が、関節炎状態、閉塞性状態、または変性状態である、請求項27記載の方法。
- 癌が器官限局性前立腺癌である、請求項28記載の方法。
- 癌が転移性前立腺癌である、請求項28記載の方法。
- 癌が上皮起源の細胞内にある、請求項28記載の方法。
- 癌が、神経系、乳房、網膜、肺、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、尿生殖器官、および胃腸管の癌からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- 癌が中胚葉起源の細胞に生じる、請求項28記載の方法。
- 癌が内胚葉起源の細胞に生じる、請求項28記載の方法。
- 癌が骨細胞または造血性起源の細胞を冒す、請求項28記載の方法。
- リポカリンがNGALである、請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
- リポカリンが多量体として存在する、請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
- 多量体が二量体または三量体である、請求項38記載の方法。
- 生体試料が尿である、請求項1〜10または請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
- 検出段階の前に尿から低分子量混入物を除去する段階をさらに含む、請求項40記載の方法。
- 尿が透析される、請求項41記載の方法。
- 酵素が電気泳動パターンにより検出される、請求項1〜10または請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
- 電気泳動パターンが基質を含むザイモグラム(zymogram)である、請求項43記載の方法。
- ザイモグラム基質が、ゼラチン、カゼイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プラスミン、プラスミノーゲン、IV型コラーゲン、およびIV型コラーゲンの誘導体からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
- 酵素が免疫化学的に検出される、請求項1〜10または請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
- 酵素が放射線免疫測定法により検出される、請求項46記載の方法。
- 酵素が酵素結合免疫吸着測定法により検出される、請求項46記載の方法。
- 以下を含む、組織再構築関連状態の診断および予測を容易にするためのキット:
生体試料中の高分子量酵素複合体の検出用試薬を有する容器;ならびに
組織再構築関連状態の診断および予測を容易にするための、高分子量酵素複合体の検出用試薬を使用するための使用説明書。 - 組織再構築関連状態が癌である、請求項49記載のキット。
- 組織再構築関連状態が、関節炎状態、閉塞性状態、または変性状態である、請求項49記載のキット。
- 癌が器官限局性前立腺癌である、請求項50記載のキット。
- 癌が転移性前立腺癌である、請求項50記載のキット。
- 癌が上皮起源の細胞内にある、請求項50記載のキット。
- 癌が、神経系、乳房、網膜、肺、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、尿生殖器官、および胃腸管の癌からなる群より選択される、請求項54記載のキット。
- 癌が中胚葉起源の細胞に生じる、請求項50記載のキット。
- 癌が内胚葉起源の細胞に生じる、請求項50記載のキット。
- 癌が骨細胞または造血性起源の細胞を冒す、請求項50記載のキット。
- 高分子量酵素複合体がプロテアーゼを含む、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項59記載のキット。
- プロテアーゼがマトリクスメタロプロテイナーゼである、請求項59記載のキット。
- マトリクスメタロプロテイナーゼがMMP-9である、請求項61記載のキット。
- 高分子量酵素複合体がリポカリンを含む、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- リポカリンがNGALである、請求項63記載のキット。
- 酵素複合体がTIMPを含む、請求項63記載のキット。
- TIMPがTIMP-1である、請求項65記載のキット。
- 高分子量酵素複合体が、自身と複合して多量体を形成する酵素を含む、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- 多量体が二量体または三量体である、請求項67記載のキット。
- 多量体がさらにリポカリンと複合している、請求項67記載のキット。
- リポカリンがNGALである、請求項69記載のキット。
- 多量体がさらにTIMPと複合している、請求項69記載のキット。
- TIMPがTIMP-1である、請求項71記載のキット。
- 酵素複合体の分子量が約150 kDaである、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- 酵素複合体の分子量が約115 kDa〜約125 kDaである、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- 生体試料が尿である、請求項49〜58のいずれか一項記載のキット。
- 低分子量混入物の除去のために尿を成分へ分離するための装置をさらに含む、請求項75記載のキット。
- 高分子量酵素複合体が分子量115 kDaではない、請求項1〜10、請求項27〜36、または請求項49〜58のいずれか一項記載の方法またはキット。
- 高分子量酵素複合体がプロゼラチナーゼB酵素を含まない、請求項1〜10、請求項27〜36、または請求項49〜58のいずれか一項記載の方法またはキット。
- 高分子量酵素複合体がNGALを含まない、請求項1〜10、請求項27〜36、または請求項49〜58のいずれか一項記載の方法またはキット。
- 高分子量酵素複合体が、NGALと会合したプロゼラチナーゼB酵素を含まない、請求項1〜10、請求項27〜36、または請求項49〜58のいずれか一項記載の方法またはキット。
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