JP2008020383A - リポソームをリガンドとして用いた体液タンパク質の解析方法及び体液タンパク質の調製方法 - Google Patents
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- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【解決手段】体液とリポソームとをカルシウムイオン等の金属イオンの存在下に混合しタンパク質−リポソーム結合体を形成させ、該結合体以外の体液成分から分離した後、該結合体からタンパク質を遊離させ、分画し分画したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する、リポソーム結合性体液タンパク質の解析方法。前記と同様の方法で、タンパク質を遊離した後、遊離したタンパク質を回収するリポソーム結合性体液タンパク質の調製方法。前記と同様の方法で、タンパク質を分画した後、分画した結果を、同様の段階を経て得られた健常者から採取した体液についての分画結果と対比し、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められるタンパク質を識別し、識別したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する、リポソーム結合性体液タンパク質を解析する。
【選択図】なし
Description
[Ning Tang et al., Mass Spectrometry Reviews, 2004, 23, 34-44, "CURRENNT DEVELOPMENTS IN SELDI AFFINITY TECHNOLOGY"(非特許文献1)及びANALYTICL CHEMISTRY, 2003, 149A-155A, "SELDI-TOF MS for Diagnostic Proteomics" (非特許文献2)]
[Byrne AM et al., J. Cell Mol. Med. 2005, 777-94, "Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF)" (非特許文献3)及びEdlich F et al., Handb. Exp. Pharmacol., 2006, 359-404, "Pharmacological targeting of catalyzed protein folding the example of peptide bond cis/trans isomerases" (非特許文献4)]
Ning Tang et al., Mass Spectrometry Reviews, 2004, 23, 34-44, "CURRENNT DEVELOPMENTS IN SELDI AFFINITY TECHNOLOGY" ANALYTICL CHEMISTRY, 2003, 149A-155A, "SELDI-TOF MS for Diagnostic Proteomics" Byrne AM et al., J. Cell Mol. Med. 2005, 777-94, "Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF)" Edlich F et al., Handb. Exp. Pharmacol., 2006, 359-404, "Pharmacological targeting of catalyzed protein folding the example of peptide bond cis/trans isomerases"
[1]体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、及び
分画したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の解析方法。
[2]体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、及び
遊離したタンパク質を回収する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の調製方法。
[3]被検体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、
分画した結果を、同様の段階を経て得られた健常者から採取した体液についての分画結果と対比し、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められる少なくとも一部のタンパク質を識別する段階、及び
識別したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の解析方法。
[4]タンパク質−リポソーム結合体を分離する段階では、タンパク質−リポソーム結合体を沈殿物として分離する、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]リポソームとして、担体に固相化したリポソーム(担体固相化リポソーム)を用い、
タンパク質とリポソームとを結合させる段階では、担体固相化リポソームにタンパク質を結合させ、
タンパク質−リポソーム結合体を分離する段階では、担体固相化ポソームとタンパク質との結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[6]タンパク質を遊離する段階では、分離したタンパク質−リポソーム結合体と金属キレート剤、界面活性剤及び有機溶媒から成る群から選ばれる少なくとも1種を混合し、前記タンパク質−リポソーム結合体からタンパク質を遊離する、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]リポソームを構成する脂質がリン脂質、糖脂質及びコレステロールから成る群から選ばれる少なくとも1種の脂質である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]リポソームを構成する脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジン酸、コレステロール、セラミド、及びガングリオシドから成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]分画処理の方法が、電気泳動法及び液体クロマトグラフィから成る群から選ばれる少なくとも1種である[1]、[3]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]タンパク質−リポソーム結合体画分またはタンパク質画分の分析は、電気泳動、液体クロマトグラフィ、質量分析(MS)、MS/MS及びアミノ酸配列分析から成る群から選ばれる少なくとも1種で行う[1]、[3]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]体液が、血漿、血清、髄液、尿、唾液、涙液、または汗である[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
本発明の第1の態様は、リポソーム結合性体液タンパク質の解析方法に関する。この方法(方法A)は、
(A1)体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質とリポソームとを結合させる段階、
(A2)得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
(A3)分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
(A4)遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、及び
(A5)分画したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含む。
本発明の第2の態様は、リポソーム結合性体液タンパク質の調製方法に関する。この方法(方法B)は、
(B1)体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質とリポソームとを結合させる段階、
(B2)得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
(B3)分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、及び
(B4)遊離したタンパク質を回収する段階
を含む。
本発明の第3の態様は、リポソーム結合性体液タンパク質の解析方法に関する。この方法(方法C)は、
(C1)被検体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質とリポソームとを結合させる段階、
(C2)得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
(C3)分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
(C4)遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、
(C5)分画した結果を、同様の段階を経て得られた健常者から採取した体液についての分画結果と対比し、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められる少なくとも一部のタンパク質を識別する段階、及び
(C6)識別したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含む。
タンパク質とリポソームとを結合させる段階は、本発明の方法A〜Cの全てで共通する。即ち、段階(A1)、(B1)、(C1)は共通する段階である。
この段階は、体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質とリポソームとを結合させる段階である。
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階は、本発明の方法A〜Cの全てで共通する。即ち、段階(A2)、(B2)、(C2)は共通する段階である。
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階は、本発明の方法A〜Cの全てで共通する。即ち、段階(A3)、(B3)、(C3)は共通する段階である。
EGTA: エチレングリコール-ビス(-アミノエチルエーテル) -N,N,N',N'-四酢酸
EDTA: エチレンジアミン4酢酸
BAPTA: 1,2-ビス(o-アミノ-5-ブロモフェノキシ)エタン-N,N,N′,N′-四酢酸
TPEN: N,N,N',N'-テトラキス-(2-ピリジルメチル) エチレンジアミン
これらは、ナトリウム等の塩であることもできる。
方法Bにおいては、タンパク質遊離段階で遊離したタンパク質を回収する(段階(B4))。遊離したタンパク質の回収は、既存のタンパク質の回収方法をそのまま利用することができる。例えば、遠心分離法等で行うことができる。具体的には、遊離したタンパク質を含有する試料を遠心(15,000rpm 15分)して上清を回収することで、遊離したタンパク質を回収することができる。
方法A及びCにおいては、(A3)または(C3)で得られた遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、試料に含まれるタンパク質を分画する。
方法Cにおいては、段階(C4)で分画した結果を、同様の段階を経て得られた健常者から採取した体液についての分画結果と対比して、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められる少なくとも一部のタンパク質を識別する(段階(C5))。方法Cにおいては、例えば、ある疾患を有することが疑われる人、またはある疾患を有する人から採取した体液を被検体液とし、これとは別に、健常者から体液を採取し、これら2つの体液について、段階(C1)〜(C4)を経て分画結果を得、得られた被検体液及び健常者体液についての分画結果を対比して、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められる少なくとも一部のタンパク質を識別する。量の変化の認められるタンパク質とは、例えば、被検体液に含まれるが健常者由来の体液には含まれない、または健常者由来の体液には含まれるが被検体液に含まれないタンパク質であることができる。さらに、被検体液及び健常者由来の体液の両方に含まれるが、存在量が、被検体液と健常者由来の体液とで相違する場合も含む。
方法A及びCにおいては、(A4)または(C5)で得られた、分画したタンパク質の少なくとも1つの画分について分析を行う。
実施例1
材料および方法
1.材料 試薬は特記されたもの以外はSIGMA社特級を用いた。
2.血漿 血漿は、札幌医科大学倫理規定にのっとりインフォームドコンセント後附属病院第1内科患者より得た。得られた血液は、血漿分離し、血漿はー80℃に凍結保存した。
リン脂質(egg PC;phosphatidyl Choline, PS;phosphatidyl Serine)はクロロホルム/メタノール(CHCl3:CH3OH=2:1)に溶解し(10mg/ml)、必要量のPCとPS(PC:PS=9:1)を混ぜ、N2(gas)で乾固させた。その後、バッファー(50mM Hepes(pH7.5), 150mM NaCl)加えて、48℃で30分間インキュベートし、2分間vortexで激しく攪拌し調製した。リン脂質の終濃度は5mg/mlとした。
1.健常人を用いた血漿総タンパク質とリポソーム結合性タンパク質
図1に、2次元電気泳動像を示す。図Aは健常人血漿、Bはリポソーム結合タンパク質の2次元電気泳動像である。ともにタンパク質量50μgを泳動している。図Bの丸い円内は全血漿では認められないタンパク質スポットを示す。またA,B中央矢印のアルブミンは、全血漿でみられる量に類似したスポットがリポソーム結合タンパク質に認められる。これは、リポソームがアルブミンに結合性が弱いことを反映している。結果として血漿アルブミンを除去している。
図2に、健常人血漿と2種類の異なる炎症性疾患患者血漿より得られたリポソーム結合タンパク質の2次元電気泳動像を示す。それぞれの電気泳動パターンで異なるスポットが多数認められる。
図3に2次元電気泳動像を示す。図A,BおよびC,Dはそれぞれ同一患者血漿から別々の実験で得られたリポソーム結合タンパク質の2次元電気泳動像である。同一患者での再現性が確認できる。
図4に、キレート剤にてリポソームより遊離しなかったタンパク質をSDS-PAGEにて1次元電気泳動した結果を示す。図4に示すSDS-PAGE1次元電気泳動においても、大量のタンパク質の結合が見られ、これらのタンパク質の解析も重要であることが示唆された。
血漿0.5μLおよび血漿100μLからのリポソーム結合タンパク質の2次元電気泳動像の比較
健常人血漿0.5μLおよびリポソーム法によって得られたタンパク質を50μgづつ2次元電気泳動にて展開し、銀染色にて可視化した。結果を図5に示す。
リン脂質(卵白フォスファチジュルコリン(PC)、フォスファチジルセリン(PS))はクロロホルム/メタノール(CHCl3:CH3OH=2:1)に溶解し(10mg/ml)、必要量のPCとPS(PC:PS=9:1)を混ぜ、N2(gas)で乾固させた。その後、バッファー(50mM Hepes(pH7.5), 150mM NaCl)加えて、48℃で30分間インキュベートし、2分間vortexで激しく攪拌し調製した。リン脂質の終濃度は5mg/mlとした。
100μLの血漿に終濃度4mMとなるようにEGTAを添加し20kGにて遠心後、上清を回収した。その上清にリポソーム500mg、CaCl2 15mM加えPBSにて全量を1mLとし、4℃にて15分間静置した。20Kgにて遠心後、20mM Hepes(pH7.5),100mM NaCl, 2mM CaCl2のバッファーにて洗浄し、10mM EGTAにてリポソーム結合タンパク質を回収した。
タンパク質をIsoelectric focusing buffer(7M Urea, 2M Thiourea, 2% ampholine, 3% CHAPS, 1% TritonX-100)に溶解し、pH4-7 11cmのDrystrip(Pharmacia bioscience)に添加し1次元目の等電点電気泳動を行った。泳動条件は500V4時間, 1000V1時間,6000V4時間で行った。1次元目の電気泳動終了後、ゲルを平行化バッファーにてSDSに平衡かした。同時にゲル内タンパク質を還元アルキル化した。すなわち平衡化バッファー(2%SDS, 50mM Tris pH8.8, 6M Urea, 30% Glycerol)10mLにDTT100mg入れたもので15分間続いて平衡化バッファー10mLにiodoacetamide 250mg入れたもので15分間処理した。処理後2次元目のSDS-PAGE電気泳動を行った。ゲルは8-12%のグラディエントゲルを用いた。電気泳動終了後銀染色にてタンパク質を可視化した。結果を図5に示す。染色したタンパク質についてゲル間のスポットの比較を行った。
健常者(HC)および疾患患者(AD)血漿のリポソーム法による比較
実施例2と同等の方法を用いて、健常者(HC)および疾患患者(AD)血漿のリポソーム法による比較を行った。結果を図6に示す。尚、患者さんの血漿は、インフォームドコンセントの後に採血した血液を3000回転30分遠心し、上清を血漿として回収したものを使用まで-30℃で保存した。
認知症患者血漿中のアネキシン5の濃度測定
インフォームドコンセントを得た患者から実施例3に示した方法にて血漿を得た。得られた血漿を抗ヒトアネキシン5特異的単クローン抗体を用いたサンドイッチELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)にて血漿中のアネキシン5濃度を定量した。結果を図7に示す。HDS-Rとは長谷川式dementia scoreの略である。長谷川式ではスコアの数字が低いほど認知症のレベルが高い傾向が認められる。左図では、ADの患者においてアネキシン5の濃度が血管性痴呆(VD)や健常人(C)より濃度が高いことが示されている。右図では長谷川式スコアが低い患者ほどアネキシン5の血漿濃度が高いことが示されている。左上の図はアネキシン5の構造の模式図である。アネキシン5はカルシウム存在下で酸性リン脂質(フォスファチジルセリン等)と結合するEndonexin foldを有していることを示す。これは酸性燐脂質よりなるリポソームに結合するドメインである。
Claims (11)
- 体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、及び
分画したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の解析方法。 - 体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、及び
遊離したタンパク質を回収する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の調製方法。 - 被検体液とリポソームとをカルシウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン及びテルビウムイオンから成る群から選ばれる少なくとも1種の金属イオンの存在下に混合し、前記体液に含まれる少なくとも一部のタンパク質と前記リポソームとを結合させる段階、
得られたタンパク質−リポソーム結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する段階、
分離したタンパク質−リポソーム結合体から少なくとも一部のタンパク質を遊離する段階、
遊離したタンパク質を含有する試料を分画処理に供し、前記試料に含まれるタンパク質を分画する段階、
分画した結果を、同様の段階を経て得られた健常者から採取した体液についての分画結果と対比し、被検体液と健常者由来の体液において量の変化の認められる少なくとも一部のタンパク質を識別する段階、及び
識別したタンパク質の少なくとも一つの画分を分析する段階
を含むリポソーム結合性体液タンパク質の解析方法。 - タンパク質−リポソーム結合体を分離する段階では、タンパク質−リポソーム結合体を沈殿物として分離する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- リポソームとして、担体に固相化したリポソーム(以下、担体固相化リポソームという)を用い、
タンパク質とリポソームとを結合させる段階では、担体固相化リポソームにタンパク質を結合させ、
タンパク質−リポソーム結合体を分離する段階では、担体固相化ポソームとタンパク質との結合体を、前記結合体を形成したタンパク質以外の体液成分の少なくとも一部から分離する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - タンパク質を遊離する段階では、分離したタンパク質−リポソーム結合体と金属キレート剤、界面活性剤及び有機溶媒から成る群から選ばれる少なくとも1種を混合し、前記タンパク質−リポソーム結合体からタンパク質を遊離する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- リポソームを構成する脂質がリン脂質、糖脂質及びコレステロールから成る群から選ばれる少なくとも1種の脂質である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- リポソームを構成する脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジン酸、コレステロール、セラミド、及びガングリオシドから成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 分画処理の方法が、電気泳動法及び液体クロマトグラフィから成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項1、3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質−リポソーム結合体画分またはタンパク質画分の分析は、電気泳動、液体クロマトグラフィ、質量分析(MS)、MS/MS及びアミノ酸配列分析から成る群から選ばれる少なくとも1種で行う請求項1、3〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 体液が、血漿、血清、髄液、尿、唾液、涙液、または汗である請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
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