CN101611317B - 肝脏炎症的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对来自人的生物样品进行诊断研究的方法，用于诊断研究肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，其中所述样品被研究作为肝脏炎症—尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的标志物的一种或多种蛋白质，其中相对于健康状况，所述蛋白质浓度升高或者降低表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬化。所述蛋白质选自：ER6Q、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP 4、原肌球蛋白、PTGES 2、淀粉样P-组分、transgelin、钙调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H Igg B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、ATP 5 A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶、或者在每一情况下，是其部分序列。

Description

肝脏炎症的生物标志物
本发明涉及一种用于人类肝脏炎症的生物样品的诊断研究的方法，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，样品被研究因为一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，蛋白质的浓度相对于健康状况提高或降低，这表明肝脏存在炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变中。
全世界大约有1.7亿人慢性感染了丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus(HCV))。病人之间疾病的病程显著不同；虽然大约20％的病人在20年内发展为肝硬化，而在其它病人中，在更长的时间期间后，仍然没有观察到这一类型的发展。除了其它因素之外，可确定会增加肝脏纤维化和/或肝硬变概率的一批因素有，雄性、酒精滥用、HIV或曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的共感染、遗传易感性和感染时年龄较大。
最重要的是，肝星状细胞(hepatic stellate cells(HSC))，其在休息状态下在正常肝脏中负责维生素A的储存，尤其是，负责肝脏纤维化和/或肝硬变的发展。相反，在纤维化肝脏中，它们被激活，增生，且发展为肌纤维母细胞。这些肌成纤维细胞产生大量胶原蛋白，下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases(MMP))的产生，且显示出MMP的生理抑制剂(physiological inhibitors of the MMP(TIMP))的增加性表达。随着增加胶原蛋白积聚，肝脏的纤维化进一步发展，这最后可能导致器官功能衰竭。
尤其是，聚乙二醇化干扰素α(peg-interferon alpha)和利巴韦林(ribavirin(三氮唑核苷))被用于慢性肝炎C的抗病毒治疗。尽管这种方式可以成功地治疗许多病人，但该治疗在至少50％病人中是不成功的，这些病人感染了HCV基因型1，这种HCV基因型1在西方国家是最普遍的。这对感染了HCV基因型4的病人是类似真实的，这种HCV基因型4在埃及频繁发生。此外，持久的抗病毒治疗的成本很高，并且这种治疗与显著的副作用有关。在显著晚期的病人中，抗病毒治疗不再产生期望的成功。因此，存在对能更好地诊断肝炎病人的纤维化以及因此而言肝硬化发生的需求，以及能够为治疗医师提供就抗病毒治疗是否可取以及是否有希望做出决断的能力的需求。
过去许多非侵入性标记物已经被用于肝脏纤维化的检测，在这些非侵入性标记物中，有所谓的acti-test或fibro-test、III型前胶原肽(PIIIP)、透明质酸、基质金属蛋白酶(MMP)以及它们的抑制剂(TIMP)(T.Poynard等人，Expert Rev Mol Diagn.2005，5(1)：15-21；V.Leroy等人，J Hep 2001，35(1)：26)。然而，所有这些标记物仅仅表现出有限的敏感性和特异性，由于这个原因，存在对更合适的标记物的进一步需求。
从所描述的现有技术出发，因此它自身提出此种目标，即提供研究肝脏炎症和/或肝脏纤维化和/或肝硬变的生物样品的改进方法，其中使用新颖的标记物。
根据本发明，实现了这样的目标，即通过研究人类生物样品的肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的方法，样品被研究，目标是一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，以及升高水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，所述蛋白质选自：ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样-P-组分、transgelin、钙调节蛋白1、人(Homo sapiens)p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基。
进一步，本发明也涉及一种相应的方法，其中，降低水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，在这种情况下，所述蛋白质选自：亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α-链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
对于上调以及下调蛋白，也根据本发明，通过确定生物标记物(也就是：标志物蛋白)的部分序列，进行了研究。尤其是，这样的部分序列优选包括根据本发明的生物标志物的60％的氨基酸序列，尤其是70％和更多，80％和更多，尤其是90至95％。
在本发明的上下文中，术语肝脏炎症包括任何形式的肝炎，但尤其是肝脏纤维化，直到肝硬变(关于这些术语，例如，请参考相关的Pschyrembel，Klinisches
Figure G2007800297213D00031
[Clinical Dictionary]，260th edition，2004，Berlin)。根据本发明，肝脏纤维化和肝硬变是优选的。
进一步，本发明也涉及肝脏炎症的诊断，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，针对待研究的病人实施测定选自如下的至少一种蛋白的确定：ER60、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES 2、淀粉样-P-组分、transgelin、钙调节蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α-链前蛋白原、果糖二磷酸醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶或其各自的部分序列。
进一步，根据本发明的这些生物标志物和/或标志物蛋白对于根据本发明的诊断是可能的。
与非纤维化组织相比，在纤维化组织的蛋白质组学分析过程中，所引述的蛋白可被鉴定为潜在的生物标志物。为了该目的，从感染了丙型肝炎的病人拿出肝脏活组织检查样品。在手工均质器中用裂解缓冲液均质化样品，DNA和其它细胞材料被除去，得到蛋白质浓缩物。使用染料标记这些蛋白质；使用等电聚焦，使蛋白质在第一个维度经受2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳，在第二个维度经受SDS凝胶电泳。借助适合该目的的软件，比较纤维化和非纤维化细胞的结果，检测且量化在纤维化样品中扩大或降低的斑，这是与非纤维化样品相比而言。例如，来自GE Healthcare的ImageQuantTM软件以及该公司的DeCyder软件可作为执行软件。测量且分析用来标记蛋白质的染料的散发。
借助LC-ESI-MS(液相色谱-电喷雾-质谱)完成进一步的分析。首先，借助凝胶中的胰蛋白酶，将蛋白质分解为单一肽片段；其中，在凝胶中，样品在之前已经被分离。借助反相HPLC，将这些片段彼此分离，并且使用质谱法研究这些片段，以鉴定单一蛋白。当然，其它合适的质谱法也可用于该目的，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。
下述蛋白质能在研究中被鉴定，相对于非纤维化细胞，这些蛋白在纤维化细胞中被上调(倍数变化正值)或下调(倍数变化负值)：
上调蛋白：
    NCBI登记号     鉴定蛋白     倍数变化
    IPI00025252.1     ER60蛋白     26.9
    IPI00418471.5     波形蛋白     5.6
    IPI00448938.1     H链H IgG B12     14.7
    IPI00697648.1     肌动蛋白α1骨骼肌蛋白     6.5
    IPI00022792.3     hMFAP 4     45.1
  IPI00455050.1   肌节原肌球蛋白κ   87.1
  IPI00014581.1   TPM1人原肌球蛋白α链   28.7
  IPI00220709.3   β原肌球蛋白   52.4
  IPI00010779.3   原肌球蛋白4   20.6
  IPI00303568.3   PTGES 2   6.1
  IPI00010796.1   脯氨酰4-羟化酶，β亚基   4.6
  IPI00022391.1   淀粉样P-组分，血清   7.3
  IPI00216138.5   transgelin   15
  IPI00021264.1   钙调节蛋白1   21.1
  IPI00022433.5   Homo sapiens p20蛋白[pirB53814]   16.9
  IPI00718271.2   17kDa肌球蛋白轻链   8.4
下调蛋白：
  NCBI登记号   简单蛋白   倍数变化
  IPI00218342.9   亚甲基四氢叶酸脱氢酶1   -9.37
  IPI00745872.1   PRO2619   -3.2
  IPI00218914.4   醛脱氢酶1   -7.7
  IPI00029717.1   纤维蛋白原α-链前蛋白   -6.4
  IPI00218407.5   果糖二磷酸醛缩酶B   -16.6
  IPI00020632.4   精氨酸琥珀酸合成酶   -11.0
  IPI00014424.1   Eef1a2   -6.4
  IPI00440493.2   ATP5A1   -5.8
  IPI00708487.1   α-2-肌动蛋白；α心脏肌动蛋白   -8.6
  IPI00017551.1   调钙素(衰老标志蛋白30)   -13.3
  IPI00708398.1   ABBOS-血清白蛋白前体   -13.3
  IPI00291006.1   线粒体苹果酸脱氢酶前体   -5.9
  IPI00030363.1   线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶前体   -5.9
NCBI：国家生物技术信息中心
下面详细说明了几个鉴定蛋白的序列信息。肽序列，一方面，导致蛋白质的鉴定，另一方面，允许蛋白质异形体的区别(也对比于本申请所附的序列列表)，有黑色加深。
原肌球蛋白
SEQ ID NO 1    MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEEDIAAKEKLL
SEQ ID NO 2    MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEEDIAAKEKLL
SEQ ID NO 3    MDAIKKKMQMLKLDKENAIDRAEQAEADKKQAEDRCKQLEEEQQALQKKL
SEQ ID NO 4    MDAIKKKMQMLKLDKENALDRAEQAEADKKAAEDRSKQLEDELVSLQKKL
SEQ ID NO 5    ------------------------------------MAGLNSLEAVKRKI
SEQ ID NO 1    RVSEDERDRVLEELHKAEDSLLAAEEAAAKAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 2    RVSEDERDRVLEELHKAEDSLLAAEEAAAKAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 3    KGTEDEVEKYSESVKEAQEKLEQAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 4    KGTEDELDKYSEALKDAQEKLELAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELD
SEQ ID NO 5    QALQQQADEAEDRAQGLQRELDGERERREKAEGDVAALNRRIQLFEEELD
SEQ ID NO 1    RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 2    RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 3    RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMELQEMQLKE
SEQ ID NO 4    RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIESRAQKDEEKMEIQEIQLKE
SEQ ID NO 5    RAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMEIQEMQLKE
SEQ ID NO 1    AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGKCAELEEELKTV
SEQ ID NO 2    AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGKCAELEEELKTV
SEQ ID NO 3    AKHIAEDSDRKYEEVARKLVILEGELERSEERAEVAESRARQLEEELRTM
SEQ ID NO 4    AKHIAEDADRKYEEVARKLVIIESDLERAEERAELSEGQVRQLEEQLRIM
SEQ ID NO 5    AKHIAEEADRKYEEVARKLVILEGELERAEERAEVSELKCGDLEEELKNV
SEQ ID NO 1    TNDLKSLEAQAEKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 2    TNDLKSLEAQAEKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 3    DQALKSLMASEEEYSTKEDKYEEEIKLLEEKLKEAETRAEFAERSVAKLE
SEQ ID NO 4    DQTLKALMAAEDKYSQKEDRYEEEIKVLSDKLKEAETRAEFAERSVTKLE
SEQ ID NO 5    TNNLKSLEAASEKYSEKEDKYEEEIKLLSDKLKEAETRAEFAERTVAKLE
SEQ ID NO 1    KSIDDLEDELYAQKLKYKAISEELDHALNDMTSI
SEQ ID NO 2    KSIDDLEDELYAQKLKYKAISEELDHALNDMTSI
SEQ ID NO 3    KTIDDLEETLASAKEENVEIHQTLDQTLLELNNL
SEQ ID NO 4    KSIDDLEEKVAHAKEENLSMHQMLDQTLLELNNM
SEQ ID NO 5    KTIDDLEEKLAQAKEENVGLHQTLDQTLNELNCI
Transgelin
SEQ ID NO 6    MANKGPSYGMSREVQSKIEKKYDEELEERLVEWIIVQCGPDVGRPDRGRL
SEQ ID NO 7    MANKGPSYGMSREVQSKIEKKYDEELEERLVEWIIVQRGPDVGRPDRGRL
SEQ ID NO 6    GFQVWLKNGVILSKLVNSLYPDGSKPVKVPENPPSMVFKQMEQVAQFLKA
SEQ ID NO 7    GFQVWLKNGVILSKLVNSLYPDGSKPVKVPENPPSMVFKQMEQVAQFLKA
SEQ ID NO 6    AEDYGVIKTDMFQTVDLFEGKDMAAVQRTLMALGSLAVTKNDGHYRGDPN
SEQ ID NO 7    AEDYGVIKTDMFQTVDLFEGKDMAAVQRTLMALGSLAVTKNDGHYRGDPN
SEQ ID NO 6    WFMKKAQEHKREFTESQLQEGKHVIGLQMGSNRGASQAGMTGYGRPRQII
SEQ ID NO 7    WFMKKAQEHKREFTESQLQEGKHVIGLQMGSNRG----------------
SEQ ID NO 6    S
SEQ ID NO 7    -
SEQ ID NO 1：肌节原肌球蛋白κ，TPM1-κ；NCBI登记号：IPI00455050.1
SEQ ID NO 2：肌节原肌球蛋白κ；NCBI登记号：IPI00455050.1
SEQ ID NO 3：β原肌球蛋白；NCBI登记号：IPI00220709.3
SEQ ID NO 4：TPM 1人原肌球蛋白1α-链；NCBI登记号：IPI00014581.1
SEQ ID NO 5：原肌球蛋白4；NCBI登记号：IPI00010779.3
SEQ ID NO 6：transgelin；NCBI登记号：IPI00216138.5
SEQ ID NO 7：transgelin变体；NCBI登记号：IPI00216138.5
图1所示为使用2-D凝胶电泳分离的蛋白质的图片，使用了来自总共7个病人的肝脏硬化肝实质的纤维化和非纤维化细胞，这些病人遭遇了丙型肝炎相关的肝硬化。圆形标记表示原肌球蛋白(β)，椭圆形标记表示hMFAP4。图片的类似性支持了结果的再现性。
尤其是，原肌球蛋白、transgelin、钙调理蛋白(calponin)、hMFAP4和波形蛋白已经显示出是根据本发明的有希望的且优选的生物标志物。进一步，原肌球蛋白可以是肌节原肌球蛋白κ、β原肌球蛋白、TPM1人原肌球蛋白或原肌球蛋白4。
所引述的hMFAP4是人微纤丝结合蛋白4(the humanmicrofibrillar associated protein 4)。然而，除了上面提及的上调蛋白，下调代谢酶也可被用作标志物，尤其是精氨酰琥珀酸合成酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、线粒体苹果酸脱氢酶和线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
下面简单讨论了一些已鉴别蛋白，这些提供于此，仅仅在于尽力澄清，这些解释不应该理解为以任何方式对寻找专利权的客体的限制。
调钙素，也已知为衰老标志蛋白-30(sensescence markerprotein-30(SMP-30))，通过浆细胞膜、微粒体和线粒体中Ca2+酶的激活，在维持胞内Ca2+水平中起着显著的作用。与健康肝细胞相比，调钙素在纤维化肝细胞中被下调13倍。这可能表明，就患病的肝脏组织中的氧化应激而言，调钙素的补偿效应受到降低。
线粒体苹果酸脱氢酶和线粒体乙酰乙酰基转移酶，两者在纤维化肝组织都被下调5.9倍。这可能说明，丙型肝炎病毒核心蛋白和蛋白NS3和NS5与线粒体之间的相互作用导致形成活性氧(reactiveoxygen species(ROS))，这可能是对纤维化细胞中所引述酶的较弱表达的解释。
纤维化肝脏细胞中受扰线粒体酶的进一步迹象是ATP合成酶α亚基(the ATP synthase alpha-subunit(ATP5A1))的降低表达，它在氧化磷酸化作用中催化ATP合成。
丙型肝炎病毒核心蛋白和NS5A蛋白的进一步作用，是通过与载脂蛋白A1(apolipoprotein A1(apoA1))或A2(apoA2)的交互作用，与内质网的膜、高尔基体和胞内脂质蓄积的扩大有关。脂质转移蛋白受到相当地抑制，或者VLDL(very low density lipoproteins(极低密度脂蛋白))的合成受到干扰。在纤维化肝细胞中，能观察到乙酰基-CoA-乙酰基转移酶的显著下调(倍数变化：-5.88)。
纤维化肝脏的代谢紊乱也表明它们本身在糖酵解酶的降低表达上，例如果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(倍数变化：-16.6)、烯醇酶-1(2-磷酸二甘油酸水解酶)或乙二醛酶。
由于这些代谢功能紊乱状态，纤维化肝细胞中的蛋白合成被部分地显著降低：血清白蛋白(倍数变化：-13.2)，其功能相当于脂肪酸、类固醇和甲状腺激素的载体，并且稳定胞外液相体积，它仅仅仍然以降低方式被表达。
纤维化肝细胞中肝脏再生的过程明显被亚甲基四氢叶酸脱氢酶(倍数变化：-9.4)的弱表达削弱，其催化四氢叶酸的C-1衍生物转化中的三个顺序反应。未降低的酶功能对正常细胞功能、生长和去分化是重要的。
总的来说，细胞平衡、糖酵解反应途径、脂质区室化和代谢的紊乱似乎存在于纤维化细胞中，这促进了活性氧(ROS)的产生。这些又依次导致肝细胞和肝星状细胞中的TGF-β1合成，为肝纤维发生的最强大的促进剂。
在扩增的可检测蛋白领域，蛋白质肌动蛋白α(倍数变化：6.5)和肌动蛋白γ(倍数变化：9.1)能被鉴定。这些是肌细胞的细肌丝和非肌细胞的细胞骨架的主要组分。肌动蛋白显然是HSC细胞的产物，在丙型肝炎诱导的纤维化事件中以扩增方式发生。
进一步的鉴定蛋白是波形蛋白(倍数变化：4.6)。这被假定为一种来自间充质的肝星状细胞的产物。
多种原肌球蛋白异构体，这些异构体显然不是由肝细胞产生的，而是由肌成纤维性的肝脏星状细胞产生，尤其具有最高的扩增速率(倍数变化：9.7到83.1)。
34kDa蛋白质钙调理蛋白通常也在平滑肌细胞中被特异地表达，并且结合钙调蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白。考虑到肌成纤维细胞激活的肝星状细胞，根据蛋白质组学分析的结果，钙调理蛋白(calponin)也在纤维化细胞中被上调(倍数变化：18.5)。
Transgelin(倍数变化：15)也被假定是肝星状细胞的产物。Transgelin是22kDa蛋白，该蛋白也被称作SM22-α，且与钙调理蛋白有结构类似性。淀粉样成分P，是一种糖蛋白，其包括一对非共价结合的五聚物，亚单位的尺寸为23至25kDa，在纤维化事件中比健康组织中更强地表达(倍数变化：7.3)。直到此刻，肝纤维增生中的生理学功能仍然是未知的，但过度表达表明了一种反常的细胞过程。
总之可以表明，可用作生物标志物的蛋白质的过度表达或者表达异常减弱，归结于：在纤维化肝细胞中，于细胞凋亡过程中，紊乱的细胞平衡、受损的线粒体和代谢酶、降低的细胞合成、和细胞骨架蛋白的扩大表达。
在用作生物标志物的蛋白质样品的研究中，如上面所描述的，可使用一种过程，其中，借助于2-D凝胶电泳，该过程包括第一维度上的等电聚焦，和第二维度上的凝胶电泳，进行蛋白质的分离，并且通过蛋白质模式与非纤维化对照样品的比较，证明特异蛋白质的过度表达和/或表达不足。凝胶电泳优选是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析凝胶的相应软件是可获得的，例如，从GE Healthcare，以DeCyder软件的形式获得。
为了检测蛋白质，在完成2-D凝胶电泳之前，使用染料，优选标记这些样品。染料优选是荧光染料。尤其优选使用Cy2、Cy3和/或Cy5。这些染料是可得到的，例如，从GE Healthcare，Freiburg，Germany。这些是羧甲基靛青染料，两个吲哚分子通过有共轭双键的碳链结合在一起。可促使相应的官能化染料与半胱氨酸侧链的硫醇基团反应，以便将蛋白质共价连接在染料上。为了二硫桥还原的目的，首先借助合适的还原剂还原样品，例如，借助三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP))。随后，进行与相应的官能化染料的反应，直到最后通过添加DTT终止反应。然而，其它氨基酸残基借助染料的官能化也是可能的，例如，赖氨酸的侧链。
使用Cy3、Cy5染料系统尤其有利，这在于，除了实际样品，在2-D凝胶电泳过程中也可使用内标法，实际样品和内标法用不同染料(分别用Cy3和Cy5)提供。
当然，除了所引述的染料，也可使用其它(荧光)染料，它们在现有领域是已知的，如荧光素或四甲基罗丹明。
用作标志物的蛋白质的测定和量化，也借助进一步的蛋白质诊断方法进行，这些方法对本技术领域的普通技术人员是已知的，尤其是，使用放射性或荧光标记抗体。尤其是，此处引述了适合该目的的生物分析方法，如免疫组织化学技术、抗体阵列、luminex、ELISA、免疫荧光和放射免疫分析法。也使用适合该目的的进一步生物分析方法进行用作标志物的蛋白质的测定和量化，如质谱法，例如，MRM(多反应监测)或AQUA(绝对量化)，借助这些方法，标志物蛋白可被定量地测量。
用于测定蛋白质的样品可以是肝组织样品，这些样品是借助活组织检查拿出的。然而，也可使用(全)血、血清、或者血浆样品，这些样品明显更易于获得。
除了所描述的方法，本发明也涉及使用所引述的蛋白质作为检测肝炎炎症的生物标志物，尤其是肝纤维化的检测。
所引述的根据本发明的标志物蛋白也可用于进一步的实施方案中，用于鉴别诊断，尤其是鉴别诊断早期识别、肝脏疾病的进程预测、严重程度的判断、伴随治疗的进程判断、病因学和体外诊断学。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于完成根据本发明所述方法的试剂盒或诊断设备，所述试剂盒包含至少一个根据本发明的标志物(也可以是：标志物蛋白)，以及检测试剂和进一步的助剂。
下面实施例被用来解释本发明，但没有将本发明限定为这些实施例。
实施例
实施例1样品分析：
从感染了基因型1的丙型肝炎的总共7个病人拿出肝实质，这些病人已经经受了肝移植，拿出的肝实质被立刻冷冻在冰上，且于-86℃储存。在显微镜下，在纤维化组织和健康部分之间分离样品组织。沿着纤维化隔膜拿出纤维化材料。使用苏木素对2-D凝胶电泳的层染色，其储存于-20℃。将来自微分离解剖的分离细胞放置在100μL分解缓冲液(tris HCl 30mM；硫脲2M；尿素7M，CHAPS 4％，pH 8.0)中，随后通过应用超声波破碎(6×10s脉冲)。
通过离心去除DNA和其它细胞残余物(12,000g进行五分钟)。确定裂解物的蛋白质浓度。
为了制备内标，通过在1小时的时间间隔内，在黑暗中，于37℃下，应用2nmol三-(2-羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP)还原3μg的组织裂解物。使用无水DMF p.a.(2nmol/μl)稀释Cy染料(GEHealthcare，Freiburg，Germany)，将4nmol Cy3混合到借助TCEP所还原的样品中。于37℃培养30分钟后，添加4μL DTT(1.08g/mL)终止反应。
将被研究的蛋白质的半胱氨酸氨基酸(3500纤维化细胞，2500非纤维化细胞)，在添加4nmol Cy5之前，也通过用2nmol TCEP于37℃在黑暗中温育1小时，而被还原。在彻底混合后，将样品在黑暗中于37℃反应30分钟。通过添加10μL DTT终止反应。
为了准备等电聚焦，加入10μL两性电解质2-4(GEHealthcare)。在进一步彻底混合后，同时处理Cy3-标记的和Cy5-标记的细胞。
随后，进行2-D凝胶电泳，21.25h电压梯度被用于等电聚焦。125mM tris、40％(w/v)甘油、3％(w/v)SDS、65mM DTT、pH 6.8被用于10分钟，作为平衡缓冲液。随后，在第二个维度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
借助合适的扫描仪(Typhoon 9400，GE Healthcare)，在完成凝胶电泳后记录图像，并且借助ImageQuant软件和DeCyder软件(GEHealthcare)进行分析。用这种方式，能在凝胶(DIA)中进行不同的分析，以检测且量化单一斑点。
借助酶胰蛋白酶，在10mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.8)中，于37℃将蛋白分裂过夜。使用乙腈-甲酸混合物将以该方式产生的片段提取两次，用于进一步分割和质谱研究。这是借助与纳米-ES I-MS(电喷雾质谱质谱法)结合的在线-RP-毛细管HPLC进行的。蛋白斑点的完整检测也借助HPLC-MS来进行，结合且使用了合适的蛋白数据库(NCBI，美国国家生物技术信息中心)。
实施例2：蛋白质原肌球蛋白及其在病人血清中的检测
为了该目的，使用Western斑点分析进行蛋白检测。原肌球蛋白能在不同来源的肝硬化病人的血清中可重复性地被鉴别(图2)。
图2：下述病人血清的原肌球蛋白Western斑点：
1：(病人1)丙型肝炎(HepC)肝硬化CHILD C
2：(病人2)肝硬化CHILD C
3：(病人3)肝硬化CHILD C
4：(病人4)肝硬化CHILD C
5：(病人5)肝硬化CHILD C
6：(病人6)肝硬化CHILD A
7：(病人7)肝硬化CHILD A
8：(病人8)正常对照
9：(病人9)正常对照
10：(病人10)正常对照
11：(病人11)正常对照
12：(病人12)乙基-毒性肝硬化CHILD C
13：(病人13)乙基-毒性肝硬化CHILD C
14：(病人14)HepB纤维化
15：(病人15)HepC纤维化
16：原肌球蛋白0,005μg
这些病人，一方面，是有肝硬化和/或纤维化的感染了丙型肝炎病人，另一方面，是有乙基-毒性肝硬化的病人，和一个有肝纤维化的乙型肝炎病人。有肝硬化的病人被进一步划分为不同的CHILD类别，通过引入不同的血液参数，它们提供了关于肝硬化严重程度的信息。分类是从CHILD A进行的，其第二年的存活率为大约100％；直到CHILD C，其存活率为大约30％。在健康对照组的病人血清中不能检测原肌球蛋白带(图2，带8-11)。有趣的是，在有CHILD C分类的丙型肝炎病人中能检测到原肌球蛋白(图2，带1-5)，而在有CHILD A肝硬化的硬变病人中，不能检测到蛋白带(图2，带6-7)。此外，研究了乙基-毒性肝硬化(CHILD C分类)，也显示了消弱形式的原肌球蛋白的信号，且具有CHILD C分类(图2，带12-13)。进一步，原肌球蛋白带能在乙型肝炎纤维化病人中被检测到，这在丙型肝炎纤维化病人中是不可能的。
序列表
<110>Schmiegel，Prof.Dr.Wolff
Figure K200780029721320090212Z000011
Dr.Christian
Ruhr-Bochum
Sipos.Dr.Bence
Figure K200780029721320090212Z000013
Prof.Dr.Günter
<120>肝脏炎症的生物标志物
<130>RUB/Meyer 32-5WO
<140>10 2006 048 249.2
<141>2006-08-10
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>l
<211>284
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>l
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1               5                   10                  15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ala Ala
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Ser Lys Gln Leu Glu Glu Asp Ile Ala Ala Lys Glu Lys
        35                  40                  45
Leu Leu Arg Val Ser Glu Asp Glu Arg Asp Arg Val Leu Glu Glu Leu
    50                  55                  60
His Lys Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
                85                  90                  95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
            100                 105                 11G
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
        115                 120                 125
Val Ile Glu Ser Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln
    130                 135                 140
Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ala Asp Arg
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Ser Asp Leu
                165                 170                 175
Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Lys Cys Ala Glu
            180                 185                 190
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Thr Val Thr Asn Asp Leu Lys Ser Leu Glu
        195                 200                 205
Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Ile Lys Val Leu Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu
                245                 250                 255
Glu Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Lys Leu Lys Tyr Lys Ala Ile Ser Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Asp His Ala Leu Asn Asp Met Thr Ser Ile
        275                 280
<210>2
<211>284
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>2
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1               5                   10                  15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ala Ala
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Ser Lys Gln Leu Glu Glu Asp Ile Ala Ala Lys Glu Lys
        35                  40                  45
Leu Leu Arg Val Ser Glu Asp Glu Arg Asp Arg Val Leu Glu Glu Leu
    50                  55                  60
His Lys Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
                85                  90                  95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
        115                 120                 125
Val Ile Glu Ser Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln
    130                 135                 140
Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ala Asp Arg
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Ser Asp Leu
                165                 170                 175
Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Lys Cys Ala Glu
            180                 185                 190
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Thr Val Thr Asn Asp Leu Lys Ser Leu Glu
        195                 200                 205
Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Ile Lys Val Leu Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu
                245                 250                 255
Glu Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Lys Leu Lys Tyr Lys Ala Ile Ser Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Asp His Ala Leu Asn Asp Met Thr Ser Ile
        275                 280
<210>3
<211>284
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>3
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1               5                   10                  15
Asn Ala Ile Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Gln Ala
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Cys Lys Gln Leu Glu Glu Glu Gln Gln Ala Leu Gln Lys
        35                  40                  45
Lys Leu Lys Gly Thr Glu Asp Glu Val Glu Lys Tyr Ser Glu Ser Val
    50                  55                  60
Lys Glu Ala Gln Glu Lys Leu Glu Gln Ala Glu Lys Lys Ala Thr Asp
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
                85                  90                  95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
        115                 120                 125
Val Ile Glu Asn Arg Ala Met Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Leu Gln
    130                 135                 140
Glu Met Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ser Asp Arg
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Leu Glu Gly Glu Leu
                165                 170                 175
Glu Arg Ser Glu Glu Arg Ala Glu Val Ala Glu Ser Arg Ala Arg Gln
            180                 185                 190
Leu Glu Glu Glu Leu Arg Thr Met Asp Gln Ala Leu Lys Ser Leu Met
        195                 200                 205
Ala Ser Glu Glu Glu Tyr Ser Thr Lys Glu Asp Lys Tyr Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Ile Lys Leu Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Ala Lys Leu Glu Lys Thr Ile Asp Asp Leu
                245                 250                 255
Glu Glu Thr Leu Ala Ser Ala Lys Glu Glu Asn ValGlu Ile Hi s Gln
            260                 265                 270
Thr Leu Asp Gln Thr Leu Leu Glu Leu Asn Asn Leu
        275                 280
<210>4
<211>284
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>4
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1               5                   10                  15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ala Ala
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Ser Lys Gln Leu Glu Asp Glu Leu Val Ser Leu Gln Lys
        35                  40                  45
Lys Leu Lys Gly Thr Glu Asp Glu Leu Asp Lys Tyr Ser Glu Ala Leu
    50                  55                  60
Lys Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Leu Ala Glu Lys Lys Ala Thr Asp
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
                85                  90                  95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
        115                 120                 125
Val Ile Glu Ser Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln
    130                 135                 140
Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ala Asp Arg
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Ser Asp Leu
                165                 170                 175
Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Gln Val Arg Gln
            180                 185                 190
Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ile Met Asp Gln Thr Leu Lys Ala Leu Met
        195                 200                 205
Ala Ala Glu Asp Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Ile Lys Val Leu Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu
                245                 250                 255
Glu Glu Lys Val Ala His Ala Lys Glu Glu Asn Leu Ser Met His Gln
            260                 265                 270
Met Leu Asp Gln Thr Leu Leu Glu Leu Asn Asn Met
        275                 280
<210>5
<211>248
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>5
Met Ala Gly Leu Asn Ser Leu Glu Ala Val Lys Arg Lys Ile Gln Ala
1               5                   10                  15
Leu Gln Gln Gln Ala Asp Glu Ala Glu Asp Arg Ala Gln Gly Leu Gln
            20                  25                  30
Arg Glu Leu Asp Gly Glu Arg Glu Arg Arg Glu Lys Ala Glu Gly Asp
        35                  40                  45
Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Phe Glu Glu Glu Leu Asp
    50                  55                  60
Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys Leu Glu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys Val Ile Glu Asn
                85                  90                  95
Arg Ala Met Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln Glu Met Gln Leu
            100                 105                 110
Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg Lys Tyr Glu Glu
        115                 120                 125
Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Leu Glu Gly Glu Leu Glu Arg Ala Glu
    130                 135                 140
Glu Arg Ala Glu Val Ser Glu Leu Lys Cys Gly Asp Leu Glu Glu Glu
145                 150                 155                 160
Leu Lys Asn Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Ala Ala Ser Glu
                165                 170                 175
Lys Tyr Ser Glu Lys Glu Asp Lys Tyr Glu Glu Glu Ile Lys Leu Leu
            180                 185                 190
Ser Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg
        195                 200                 205
Thr Val Ala Lys Leu Glu Lys Thr Ile Asp Asp Leu Glu Glu Lys Leu
    210                 215                 220
Ala Gln Ala Lys Glu Glu Asn Val Gly Leu His Gln Thr Leu Asp Gln
225                 230                 235                 240
Thr Leu Asn Glu Leu Asn Cys Ile
                245
<210>6
<211>201
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>6
Met Ala Asn Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Met Ser Arg Glu Val Gln Ser
1               5                   10                  15
Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Glu Arg Leu Val Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ile Val Gln Cys Gly Pro Asp Val Gly Arg Pro Asp Arg Gly
        35                  40                  45
Arg Leu Gly Phe Gln Val Trp Leu Lys Asn Gly Val Ile Leu Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Val Asn Ser Leu Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Pro Val Lys Val Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asn Pro Pro Ser Met Val Phe Lys Gln Met Glu Gln Val Ala Gln
                85                  90                  95
Phe Leu Lys Ala Ala Glu Asp Tyr Gly Val Ile Lys Thr Asp Met Phe
            100                 105                 110
Gln Thr Val Asp Leu Phe Glu Gly Lys Asp Met Ala Ala Val Gln Arg
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser Leu Ala Val Thr Lys Asn Asp Gly His
    130                 135                 140
Tyr Arg Gly Asp Pro Asn Trp Phe Met Lys Lys Ala Gln Glu His Lys
145                 150                 155                 160
Arg Glu Phe Thr Glu Ser Gln Leu Gln Glu Gly Lys His Val Ile Gly
                165                 170                 175
Leu Gln Met Gly Ser Ash Arg Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Gly
            180                 185                 190
Tyr Gly Arg Pro Arg Gln Ile Ile Ser
        195                 200
<210>7
<211>184
<212>PRT
<213>人肝细胞
<400>7
Met Ala Asn Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Met Ser Arg Glu Val Gln Ser
1               5                   10                  15
Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Glu Arg Leu Val Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ile Val Gln Arg Gly Pro Asp Val Gly Arg Pro Asp Arg Gly
        35                  40                  45
Arg Leu Gly Phe Gln Val Trp Leu Lys Asn Gly Val Ile Leu Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Val Asn Ser Leu Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Pro Val Lys Val Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asn Pro Pro Ser Met Val Phe Lys Gln Met Glu Gln Val Ala Gln
                85                  90                  95
Phe Leu Lys Ala Ala Glu Asp Tyr Gly Val Ile Lys Thr Asp Met Phe
            100                 105                 110
Gln Thr Val Asp Leu Phe Glu Gly Lys Asp Met Ala Ala Val Gln Arg
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser Leu Ala Val Thr Lys Asn Asp Gly His
    130                 135                 140
Tyr Arg Gly Asp Pro Asn Trp Phe Met Lys Lys Ala Gln Glu His Lys
145                 150                 155                 160
Arg Glu Phe Thr Glu Ser Gln Leu Gln Glu Gly Lys His Val Ile Gly
                165                 170                 175
Leu Gln Met Gly Ser Asn Arg Gly
            180

Claims (14)

1.检测生物样品中ER60的浓度的检测试剂在制备试剂盒或诊断设备中的用途，所述试剂盒或诊断设备用于肝脏纤维化和/或肝硬变的诊断。
2.如权利要求1的用途，其中所述试剂盒或诊断设备还包含检测生物样品中选自如下所述的至少一种蛋白质的浓度的检测试剂：波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样P-组分、transgelin、钙调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶β亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PR02619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eef1a2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
3.如权利要求2的用途，特征在于：原肌球蛋白是肌节原肌球蛋白κ、β原肌球蛋白、TPM1人原肌球蛋白、或原肌球蛋白4。
4.如权利要求1至3中的任何一项所述的用途，特征在于：所述试剂盒或诊断设备用于生物分析方法。
5.如权利要求4所述的用途，所述生物分析方法为免疫组织化学技术、抗体阵列、luminex、ELISA、免疫荧光或放射免疫分析法。
6.如权利要求1至3中的任何一项所述的用途，特征在于：所述试剂盒或诊断设备用于质谱法以定量确定标志蛋白质。
7.如权利要求6的用途，所述质谱法为多反应监测MRM质谱法或绝对量化AQUA质谱法。
8.如权利要求1至3中的任何一项所述的用途，特征在于：所述试剂盒或诊断设备用于2-D电泳，第一维度为等电聚焦，第二维度为凝胶电泳。
9.如权利要求8的用途，特征在于：凝胶电泳是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
10.如权利要求8的用途，特征在于：所述试剂盒或诊断设备包含在进行2-D电泳之前对样品进行标记的染料。
11.如权利要求10的用途，特征在于：染料是Cy2、Cy3和/或Cy5。
12.如权利要求1至3中的任何一项所述的用途，特征在于：样品是肝脏活组织检查样品。
13.如权利要求1至3中的任何一项所述的用途，特征在于：样品是血清、血浆或全血。
14.根据权利要求1至3任一项的用途，所述试剂盒或诊断设备用于鉴别诊断早期识别、肝脏疾病的进程预测、严重程度的判断、伴随治疗的进程判断、病因学和体外诊断学。
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