JP2007537743A - T細胞レセプターを改善する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
TCRは、T細胞による特定のpMHCの認識を媒介し、それ自体が免疫系の細胞性因子(arm)の機能化に必須である。天然型(native)TCRは、シグナル伝達を媒介することに関与するCD3複合体の非変形タンパク質と会合する免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。TCRはαβ形態及びγδ形態で存在し、これらの形態は、構造的に類似するが、全く異なる解剖学的所在及びおそらくは機能を有する。MHCクラスI及びクラスIIリガンドもまた、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質であるが、抗原提示細胞(「APC」)表面で多様な数々の短いペプチドフラグメントを提示することを可能にする高度に多形性のペプチド結合部位を有して抗原提示に特化している。
TCRは組換え手段により作製することができる。組換えTCRの作製のために今日までに多くの構築物が考案されている。これら構築物は2つの広義のクラス:単鎖TCR(「scTCR」)及び二量体TCR(「dTCR」)に分けられる。
粒子ディスプレイ法は、主に、所望され得る性質(例えば、亢進した発現収率、結合及び/又は安定性の特性)を有するタンパク質を同定するために使用されてきた。これらの方法は、核タンパク質粒子の表面に発現されるタンパク質又はポリペプチドの多様性プール又は「ライブラリ」を作ることを含む。これら粒子は2つの鍵となる特徴を有する。第一に、各粒子は、単一の変形タンパク質又はポリペプチドを提示する。第二に、発現するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝物質は、該粒子の遺伝物質に結合している。このライブラリは、次いで、1回又はそれ以上の選択に付される。例えば、これは、リガンドを変異レセプターの粒子ディスプレイライブラリーと接触させ、どの変異レセプターが最高の親和性で該リガンドと結合するかを同定することからなってもよい。一旦、選択プロセスが完了すると、所望の性質を有するレセプターを単離することができ、レセプターの配列決定を可能とするために、その遺伝物質を増幅することができる。
第1(方法A)は、ベクター(ファージミド)中に、バクテリオファージのコートタンパク質をコードするDNAと融合した異種ペプチド又はポリペプチドをコードするDNAを挿入することによる。次いで、異種ペプチド又はポリペプチドをディスプレイしているファージ粒子の発現を、そのファージミドで細菌細胞をトランスフェクトした後に形質転換細胞を「ヘルパーファージ」に感染させることにより行なう。ヘルパーファージは、機能的なファージ粒子を作成するために必要であるファージミドによりコードされないファージタンパク質の供給源として作用する。
T細胞は胸腺で成熟し、そこで、一般にはポジティブ選択及びネガティブ選択と呼ばれる少なくとも2つの選択機構を経験する。ほとんどの又は全てのTCRの構造は、可変の相補性決定領域(CDR)によるMHC/ペプチド結合に適切なフレームワークを提供する或る特定の一般的な構造上の特徴を共有すると考えられている(Chothiaら、Embo J (1988) 7: 3745-55)。したがって、ほとんどのTCRは、MHC/ペプチド複合体に関して本来的な親和性を有し得る(Chothiaら、Embo J (1988) 7: 3745-55)。胸腺で、MHC分子(これに対してTCRが提示される)(「自己」MHC分子)の1つに関して或る特定の最小レベルの親和性を有するTCRのみがポジティブ選択される。自己MHC分子の1つに関して高親和性を有するT細胞はネガティブ選択される(Amsen及びKruisbeek(1998) Immunol Rev 165: 209-29;Sebzdaら(1999) Annu Rev Immunol 17: 829-74)。
本発明は、所定のペプチド-MHCに結合するTCRのTCRα鎖CDR2配列及び/又はTCRβ鎖CDR2配列への変異の導入が該pMHCとの相互作用に関して少なくとも10倍大きい親和性及び/又は少なくとも10倍遅い解離速度を生じることができるという知見に基く。α鎖及びβ鎖の各々が3つのCDR配列(CDR1、CDR2、及びCDR3)を含有するので、CDR2配列のみの変異が親和性及び/又は解離速度の上記のような改善を有するTCRを生じ得るとは予測されなかった。特に、pMHCのペプチドとの相互作用において優勢であると考えられているのはCDR3領域であり、したがって親和性を増大させ及び/又は解離速度を減少させるための最も見込みのあるストラテジーであると予測され得るのはCDR3配列の変異であるので、予測されない。
1つの広い観点において、本発明は、所定の標的pMHCに特異的な所定のTCRの親和性を増大させ及び/又は解離速度を減少させる方法を提供し、この方法は、該所定のTCRの対応するCDR2配列とは異なるα鎖CDR2配列及び/又はβ鎖CDR2配列を有する複数のTCRを作り、該標的pMHCに関して該複数のTCRからのメンバーの親和性及び/又は解離速度を決定し、該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍大きい親和性及び/又は該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のメンバーを選択することを含んでなる。
本発明の好ましい実施形態では、標的pMHCに関して所定のTCRより少なくとも50倍大きい親和性及び/又は少なくとも50倍遅い解離速度を有する複数のTCRからの1又はそれ以上のメンバーが選択される。
本発明の更なる好ましい実施形態では、標的pMHCに関して所定のTCRより少なくとも500倍大きい親和性及び/又は少なくとも500倍遅い解離速度を有する複数のTCRからの1又はそれ以上のメンバーが選択される。
本発明の方法の1つの実施形態は、上記のように選択したTCRのCDR2配列を決定し、決定したCDR2配列が組み込まれているTCRのストックを作製する追加の工程を含む。
例えばx=10のとき、標的pMHCに関する所定のTCRのKDが10μMであれば、標的pMHCに関するKDが1μM以下である変異TCRα鎖CDR2配列及び/又は変異TCRβ鎖CDR2配列を含んでなる全ての選択したTCRがこの基準を充足し;x=10のとき、標的pMHCに関する所定のTCRのkoffが1×10-3S-1であれば、標的pMHCに関するkoffが1×10-4S-1以下である変異TCRα鎖CDR2配列及び/又は変異TCRβ鎖CDR2配列を含んでなる全ての選択したTCRがこの基準を充足する。
標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を決定する適切な方法は、表面プラズモン共鳴による測定である。本明細書中の実施例6は、この測定を実施の仕方を詳細に説明している。
複数の変異したTCRを作る多くの方法が存在する。
これら方法は2つのカテゴリーに分けられる:
(i)核タンパク質と会合した複数の変異したTCRを作製して、個々のTCR変異体とそれらをコードする遺伝物質との間に連関が存在するTCRライブラリを形成する。核タンパク質が会合したTCRのライブラリは、該ライブラリのメンバーが特定のTCRリガンド、例えばpMHCに結合する能力についての情報を並列に提供するパニング法での使用に特に適切である。このパニング法により選択したTCRライブラリからの幾つかのメンバーは、次いで、一連の更なる親和性及び/又は解離速度の評価を受けてもよい。
(ii)会合した核タンパク質を欠いている可溶性変異体TCRの作製。このような可溶性TCRはTCRライブラリの作製に適切ではなく、複数のこれら可溶性TCRからの各メンバーは、一般に、個別の親和性及び/又は解離速度の評価を必要とする。
(i)天然型膜貫通ドメインを欠き、
(ii)核タンパク質と会合しておらず、
(iii)同族のpMHCと結合する能力を保持している
任意のTCRをいうと理解される。
当業者に公知であるように、部位特異的変異誘発により、単一点変異又は複数変異を個々の可溶性TCRの一方又は両方のCDR2配列に導入して、親和性及び/又は解離速度の評価用の複数の変異体TCRを作製することができる。
本発明の1つの実施形態では、複数のTCRは可溶形態で作られ、標的pMHCに結合するものの親和性及び/又は解離速度を決定し、所望の親和性及び/又は解離速度を有するものを選択するために、順次、該標的pMHCと接触させる。
本発明の代替の実施形態では、複数のTCRは、多様性が少なくともCDR2配列に存する、リボソームによりディスプレイされるαβ単鎖TCRの多様性ライブラリとして作られる。WO 2004/044004は、リボソーム上に単鎖TCR(scTCR)をディスプレイするために必要な方法の説明を提供する。
以下は、CDR2変異を含んでなるTCRの核タンパク質との会合によるディスプレイに好ましいTCRの設計である。これらTCRの設計は、会合した核タンパク質がない可溶性TCRとしての使用にも等しく適していることに留意すべきである。
本発明の1つの好ましい実施形態では、ディスプレイされるαβ二量体TCRは、TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合した第1のポリペプチドと、TCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合した第2のポリペプチドとを含んでなり、第1及び第2のポリペプチドは天然型αβT細胞レセプター中に等価物がないジスルフィド結合により連結され、第1及び第2のポリペプチドの一方が、C末端で、核タンパク質(通常、ファージ粒子)の表面露出アミノ酸残基にペプチド結合により連結している。
本発明の別の実施形態では、ディスプレイされるαβ scTCRポリペプチドは、例えば、
TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRα可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第1のセグメント、
TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第2のセグメント、
第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するか又はその逆に連結するリンカー配列、及び
第1及び第2の鎖の間のジスルフィド結合
を含んでなり、ジスルフィド結合は天然型αβT細胞レセプター中に等価物を有さないものであり、リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第1及び第2のセグメントの可変ドメイン配列が天然型αβT細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向しているような長さ及び位置である。
TCRα鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第1のセグメント、
TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第2のセグメント、及び
第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列
を有するものであってもよく、又は
TCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第1のセグメント、
TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第2のセグメント、及び
第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列
を有するものであってもよい。
ディスプレイされるscTCR又はdTCRに存在する定常ドメイン細胞外配列は、好ましくは、ヒトTCRのそれらに対応し、可変ドメイン配列も同様である。しかし、このような配列間の対応は、アミノ酸レベルで1:1である必要はない。対応するヒトTCR配列に対する、N末端若しくはC末端の切断並びに/又はアミノ酸の欠失及び/若しくは置換は許容され得る。特に、第1及び第2のセグメントに存在する定常ドメイン細胞外配列は、scTCR又はdTCRが結合するリガンドとの接触に直接関与しないので、天然型TCRの細胞外定常ドメイン配列より短くてもよいし、又はこの配列に対する置換若しくは欠失を含んでいてもよい。
ディスプレイされるscTCRについては、リンカー配列は、単一のポリペプチド鎖を形成するために、第1及び第2のTCRセグメントを連結する。リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-(式中、Pはプロリンであり、AAはアミノ酸がグリシン及びセリンであるアミノ酸配列を表す)を有してもよい。
リンカーは、例えば26〜41アミノ酸、好ましくは29、30、31若しくは32アミノ酸又は33、34、35若しくは36アミノ酸からなってもよい、特定のリンカーは、式-PGGG-(SGGGG)5-P-(配列番号:1)及び-PGGG-(SGGGG)6-P-(配列番号:2)(式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである)を有する。
本発明のdTCR及びscTCRは、dTCRポリペプチド対又はscTCRポリペプチドの第1と第2のセグメントの定常ドメイン細胞外配列間のジスルフィド結合を有してもよい。この結合は、天然型二量体αβTCRに存在する天然型鎖間ジスルフィド結合に対応してもよいし、天然型TCR中に対応物(counterpart)を有さない、dTCRポリペプチド対又はscTCRポリペプチドの第1及び第2のセグメントの定常ドメイン細胞外配列中に特異的に組み込まれたシステイン間のものであってもよい。いくつかの場合では、天然型及び非天然型の両方のジスルフィド結合が、望ましくあり得る。
(i)dTCRポリペプチド対の一方のメンバーのC末端、又はscTCRポリペプチドのC末端、又はいずれかのC末端に付着した短いペプチドリンカーのC末端を、核タンパク質粒子の表面露出残基にペプチド結合により直接連結することができる。例えば、表面露出残基は、好ましくは、バクテリオファージの遺伝子III又は遺伝子VIIIの遺伝子産物のN末端にある;及び
(ii)dTCRポリペプチド対の一方のメンバーのC末端、又はscTCRポリペプチドのC末端、又はいずれかのC末端に付着した短いペプチドリンカーのC末端を、導入システイン残基を介して核タンパク質粒子の表面露出システイン残基にジスルフィド結合により連結する。例えば、表面露出残基は再び、好ましくは、バクテリオファージの遺伝子III又は遺伝子VIIIの遺伝子産物のN末端にある。
本発明の具体的実施形態は、標的pMHCに結合するライブラリメンバーの親和性及び/又は解離速度を決定し、所望の親和性及び/又は解離速度を有するものを選択するための方法を提供する。この方法では、
(i)ライブラリの幾つかのメンバーを並列して標的pMHCと接触させ、該pMHCに結合するメンバーを同定し、
(ii)工程(i)で同定したメンバーを順次、標的pMHCと接触させ、該pMHCに関するそれらの親和性を評価し、
(iii)工程(ii)で決定した所望の親和性を有する1又はそれ以上のメンバーを選択し、ディスプレイされているTCRのCDR2配列を決定し、
(iv)このように決定したCDR2配列が組み込まれている可溶形態TCRを作り、
(vi)該標的pMHCに関するこれらTCRの親和性及び/又は解離速度を再決定し、及び又は場合によっては決定し、
(vii)工程(vi)で決定した所望の親和性及び/又は解離速度を有する1又はそれ以上のTCRを選択する。
本発明の方法により単離されるscTCR又はdTCR(好ましくは、ヒト配列に対応する定常配列及び可変配列により構成される)は、実質的に純粋な形態で、又は精製されたか若しくは単離された調製物として提供され得る。例えば、これは、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。
本発明の各観点の好ましい性状は、その他の観点の各々についての性状と同様である(ただし必要な変更は加える)。本明細書中で言及した先行技術文献は、法が許す最大範囲で本明細書に組み込まれる。
以下で添付の図面に言及する。
図2a及び2bはそれぞれ、図1a及び1bのDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。影付きはこれら導入システイン残基の位置を示す。
図4はpEX922-1G4プラスミドのDNA配列を詳述する。
図5はpEX821プラスミドのDNA配列を詳述する。
図6はpEX954プラスミドのDNA配列を詳述する。
図8a及び8bはそれぞれ、図7a及び7bのDNA配列から産生されるILA TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。
図10a及び10bはそれぞれ、図4a及び4bのDNA配列から産生されるHIV Gag TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。
SLLMWITQC(配列番号:3)-HLA-A*0201複合体に、このpMHCに関して増大した親和性及び/又は減少した解離速度で結合する変形体を含有する2つのTCRライブラリを得るために、多数の変異を1G4 TCR鎖のCDR2α配列及びCDR2β配列に別々に導入した。
38.5μlの水、5μlの10×PCR緩衝液、1.5μlのJon342プライマー(10μMストック)、1.5μlのCDR1bRevプライマー(10μMストック)、1G4 TCRα鎖及びβ鎖を含有する2.5ngの鋳型ベクター(pEX746:NY-ESO)、2μlのdNTP(20mM組合せストック)、1μlのpfu turbo polymerase。PCR反応は、95度にて2分間の最初の変性、続いて95度にて30秒間と53度にて30秒間と72度にて60秒間の30サイクルに付した。72度にて10分間の最終の伸長工程を含ませた。50μlのPCR反応物全体を1.4%のTBEアガロースゲル上で分離し、変異誘発産物を表すバンドを切り出し、製造業者の指示に従ってQiagen MinEluteキットを使用して精製した。
図2a及び2bはそれぞれ、図1a及び1bのDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。影付きはこれら導入システイン残基の位置を示す。
図3はpEX746:NY-ESOプラスミドのDNA配列を詳述する。
プライマーJon344及びYol22に置換して上記のとおり。
PCR3 − CDR2α変異用の重複フラグメントの作製:
プライマーYol13及びCDR2aRevに置換して上記のとおり。
PCR4 − CDR2β変異用の重複フラグメントの作製:
プライマーCDR2aFw及びCDR2bRevに置換して上記のとおり。
PCR1及びPCR3からの精製した鋳型フラグメントを水に1:10に希釈し、各々1μlを、37μlの水と5μlの10×PCR緩衝液と1.5μlのYol13プライマー(10μMストック)と1.5μlのcdr1bRevプライマー(10μMストック)と2μlのdNTP(20mM組合せストック)と1μlのpfu turbo polymeraseとを含んでなる50μlのPCR反応液中で合わせた。スプライシングPCR反応は、95℃にて2分間の最初の変性、続いて95℃にて30秒間と54℃にて40秒間と72℃にて90秒間の27サイクルに付した。72℃にて10分間の最終の伸長工程を含ませた。12の同一PCR反応を実施した。12のPCR反応物をプールし、スプライスした変異誘発産物を、製造業者の指示に従ってQiagen Qiaquickキットを使用して精製した。
PCR2及びPCR4に置換して上記のとおり。
PCR5の変異誘発産物をNco I及びBssH IIで消化し、親の1G4 TCRオープンリーディングフレームを含有しNco I及びBssH IIで消化したpEX922-1G4ファージディスプレイベクター(図4はこのプラスミドのDNA配列を詳述する)中に連結した。このようにして、結果的に、親のCDR2α配列モチーフの、変異体配列の大きな多様性集団での置換を生じた。同じことをPCR6についても実施し、その結果、親の配列をCDR2β変異体配列の大きな多様性集団に置換した。しかし、この場合には、使用したクローニング酵素は、BssH II及びNot Iであった。
連結は、標準的なプロトコルに従いT4 DNAリガーゼを用いて3:1のインサート対ベクター比で行った。
実施例1に記載のように構築した2つのライブラリのプールを含んでなるファージ粒子集団から、変異したCDR2配列を含んでなる高親和性1G4 TCRの単離を行った。最初のパニングを、溶液で、SLLMWITQC-HLA-A*0201複合体に結合し得る変異体1G4 TCRをディスプレイするファージ粒子の選択を利用して、以下のとおり行った:
ファージ粒子上にディスプレイされたジスルフィド連結した天然型1G4 TCRと変異したCDR2配列を含んでなる1G4 TCRとを用いる以下の基本ELISAアッセイを、これら分子のSLLMWITQC-HLA-A*0201複合体に関する親和性を評価するために使用した:
可溶性SLLMWITQC-HLA-A*0201の所定の添加について生じる結合阻害の程度は、TCRのSLLMWITQC-HLA-A*0201複合体に関する親和性に比例する。
以下の表は、本実施例で記載した3回目のパニングから得た基本ELISA陽性の20のヒット(hit)のCDR2配列を詳述する。
実施例3の競合ELISAアッセイにより特徴付けられたCDR2α配列又はCDR2α配列のいずれかに変異を含有する高親和性1G4 TCRをコードする3つのファージミドクローンを、更に変異させた。これは、これらクローンを第2世代ライブラリの構築用の出発鋳型として使用することにより実施した。これらライブラリは、実施例1に記載したPCRアプローチを用い各クローンのWT CDR2配列を変異させて構築した。
実施例3に記載のように、ヒットを同定し、特徴付けた。
* − これらCDR2α配列の5つで変異したグルタミンは、グルタミン残基の発現を生じるアンバーコドンによりコードされていた。
** − これらCDR2α配列の両方で変異したグルタミンは、グルタミン残基の発現を生じるアンバーコドンによりコードされていた。
A − 実施例1〜3に記載の第1世代実験から回収したものの1つに正確に一致する変異体1G4 TCR配列を示す。
実施例3で記載したように同定した高親和性1G4 TCR変異体をコードするファージミドDNAを、Mini-Prepキット(Qiagen,UK)を使用して該当するE.coli細胞から単離した。
ファージミドDNAを鋳型として使用し以下のプライマーを使用してPCR増幅を行い、可溶性のTCRα鎖及びβ鎖のDNA配列を増幅した。
実施例5で作製したTCRα鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、E.coli系統BL21pLysS中に別々に形質転換し、単一のアンピシリン耐性コロニーをTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃にてOD600が0.4となるまで増殖させた後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導の3時間後に、Beckman J-6Bにおける30分間4000rpmでの遠心分離により細胞を採集した。細胞ペレットを、50mM Tris-HCl、25%(w/v)スクロース、1mM NaEDTA、0.1%(w/v)アジ化Na、10mM DTTを含有する緩衝液(pH8.0)に再懸濁した。一晩の凍結-解凍工程後、再懸濁細胞を、Milsonix XL2020ソニケータにおいて標準の直径12mmプローブを用い1分間のバーストで合計約10分間超音波処理した。Beckman J2-21遠心機における13000rpmで30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。次いで、3回の界面活性剤での洗浄を行い、細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl、0.5% Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1%(w/v)アジ化Na、2mM DTT、pH8.0)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21における13000rpmで15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液中での類似の洗浄により界面活性剤及び塩を除去した:50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1%(w/v)アジ化Na、2mM DTT、pH8.0。最後に、封入体を30mgの小分けに分割し、−70℃で凍結した。封入体タンパク質の収率を、6Mグアニジン-HClでの可溶化及びBradford色素結合アッセイ(PerBio)での測定により定量した。
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(Biacore 3000TM)を使用して、sTCRのペプチド-MHCリガンドへの結合を分析した。これは、ストレプトアビジンで被覆した結合表面に半配向様式で固定した単一pMHC複合体(下記で説明)を作製し、同時に4つまでの異なるpMHC(別々のフローセルに固定)に対する可溶性T細胞レセプターの結合の効率的な試験を可能にすることによって促進された。HLA複合体の手動での注入により、固定したクラスI分子を正確なレベルで容易に操作することが可能になる。
WT IG4 sTCRの系列希釈物を調製し、1つは〜1000RUの特異的SLLMWITQC-HLA-A*0201複合体で被覆し、2つめは〜1000RUの非特異的HLA-A2-ペプチド複合体で被覆した2つの異なるフローセル上に5μl/分の一定流速で注入した。コントロールセルからの測定値を使用して各濃度について応答を規格化した。規格化したデータ応答をTCRサンプルの濃度に対してプロットし、平衡結合定数KDを算出するために双曲線にフィットさせた(Price及びDwek,Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists(第2版) 1979,Clarendon Press,Oxford)。
高親和性TCRに関して、解離速度定数kd及び会合速度定数kaを実験的に測定することによりKDを決定した。平衡定数KDはkd/kaとして算出した。
1つは〜300RUの特異的SLLMWITQC-HLA-A*0201複合体で被覆し、2つめは〜300RUの非特異的HLA-A2-ペプチド複合体で被覆した2つの異なるセル上にTCRを注入した。流速を50μl/分に設定した。代表的には、250μlのTCRを〜3μM濃度で注入した。次いで、反応がベースラインに戻るまで緩衝液を流した。Biaevaluationソフトウェアを用いて動力学パラメータを算出した。また、半減期の算出を可能とするために、解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。
可溶性ジスルフィド連結天然型1G4 TCRとSLLMWITQC-HLA-A*0201複合体との間の相互作用を、上記の方法を用いて分析して、KDが15μMでkoffが1.28×10-1S-1であると明らかにした。
以下の表は、変異したCDR2配列を有する高親和性1G4 TCRについて上記の方法を用いて得たBiacore結果を詳述する:
前述の実施例に記載した方法は、変異したCDR2配列を含んでなる他のTCRの高親和性変形体を作製し試験するために改変することができる。簡潔には、変異すべきTCR鎖をコードするDNAを、実施例1に記載のようなCDR2ライブラリを作製するための鋳型として使用する。必要な唯一の変更は、ライブラリ構築に利用するプライマーが、変異すべきTCR鎖のDNA配列の等価部分に相補的であるべきことである。
天然型可変ドメイン及び導入システインコドンを含んでなるILA TCRの可溶性変形体のα及びβのTCR鎖のDNA配列は、それぞれ図7a及び7b(配列番号:35及び36)に提供する。
天然型可変ドメイン及び導入システイン残基を含んでなるILA TCRの可溶性変形体のα及びβのTCR鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図8a及び8b(配列番号:37及び38)に提供する。
38.5μlの水、5μlの10×PCR緩衝液、1.5μlのJon342プライマーのILA TCR等価物(10μMストック)、1.5μlのCDR1bRevプライマーのILA TCR等価物(10μMストック)、ILA TCRα鎖及びβ鎖を含有する2.5ngの鋳型ベクター(pEX746:ILA)、2μlのdNTP(20mM組合せストック)、1μlのpfu turbo polymerase。PCR反応は、95度にて2分間の最初の変性、続いて95度にて30秒間と53度にて30秒間と72度にて60秒間の30サイクルに付した。72度にて10分間の最終の伸長工程を含ませた。50μlのPCR反応物全体を1.4%のTBEアガロースゲル上で分離し、変異誘発産物を表すバンドを切り出し、製造業者の指示に従ってQiagen MinEluteキットを使用して精製した。
プライマーJon344及びYol22のILA TCR等価物に置換して上記のとおり。
PCR3 − CDR2α変異のための重複フラグメントの作製:
プライマーYol13及びCDR2aRevのILA TCR等価物に置換して上記のとおり。
PCR4 − CDR2β変異用の重複フラグメントの作製:
プライマーCDR2aFw及びCDR2bRevのILA TCR等価物に置換して上記のとおり。
PCR1及びPCR3からの精製した鋳型フラグメントを水に1:10に希釈し、各々1μlを、37μlの水と5μlの10×PCR緩衝液と1.5μlのYol13プライマーのILA TCR等価物(10μMストック)と1.5μlのcdr1bRevプライマーのILA TCR等価物(10μMストック)と2μlのdNTP(20mM組合せストック)と1μlのpfu turbo polymeraseとを含んでなる50μlのPCR反応物において合わせた。スプライシングPCR反応は、95℃にて2分間の最初の変性、続いて95℃にて30秒間と54℃にて40秒間と72℃にて90秒間の27サイクルに付した。72℃にて10分間の最終の伸長工程を含ませた。12の同一PCR反応を実施した。12のPCR反応物をプールし、スプライスした変異誘発産物を、製造業者の指示に従ってQiagen Qiaquickキットを使用して精製した。
PCR2及びPCR4に置換して上記のとおり。
PCR5の変異誘発産物をNco I及びBssH IIで消化し、親のILA TCRオープンリーディングフレームを含有しNco I及びBssH IIで消化したpEX922-ILAファージディスプレイベクター中に連結した。このようにして、結果的に、親のCDR2α配列モチーフの、変異体配列の大きな多様性集団での置換を生じた。同じことをPCR6についても実施し、その結果、親の配列をCDR2β変異体配列の大きな多様性集団に置換した。しかし、この場合には、使用したクローニング酵素は、BssH II及びNot Iであった。
連結は、標準的なプロトコルに従いT4 DNAリガーゼを用いて3:1のインサート対ベクター比で行った。
上記のように、前述の実施例に記載した方法は、変異したCDR2配列を含んでなる他のTCRの高親和性変形体を作製し試験するために改変することができる。簡潔には、変異すべきTCR鎖をコードするDNAを、実施例1に記載のようなCDR2ライブラリを作製するための鋳型として使用する。必要な唯一の変更は、ライブラリ構築に利用するプライマーが変異すべきTCR鎖のDNA配列の等価部分に相補的であるべきことである。
天然型可変ドメイン及び導入システインコドンを含んでなるILA TCRの可溶性変形体のα及びβのTCR鎖のDNA配列は、それぞれ図9a及び9b(配列番号:54及び55)に提供される。
天然型可変ドメイン及び導入システイン残基を含んでなるILA TCRの可溶性変形体のα及びβのTCR鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図10a及び10b(配列番号:56及び57)に提供される。
変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅を使用して、各CDR2配列について高度に多様性の変異体集団を得た。
次いで、同定したCDR2変異を含有する可溶性ジスルフィド連結TCRを作製して、SLYNTVATL-HLA-A*0201リガンドに関するそれぞれの親和性のBiacoreに基づく測定を可能にした。
Claims (13)
- 所定のTCRの対応するCDR2配列とは異なるα鎖CDR2配列及び/又はβ鎖CDR2配列を有するが、該所定のTCRと同じα及びβのCDR1配列及びCDR3配列を有する複数のTCRを作り、該複数のTCRからのメンバーの標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を決定し、該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍大きい親和性及び/又は該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のメンバーを選択することを含んでなる、所定の標的pMHCに特異的な所定のTCRの親和性を増大させ及び/又は解離速度を減少させる方法。
- (a)前記所定のTCRに関して前記α鎖CDR2配列で変異し前記β鎖CDR2配列では変異していない第1の複数のTCRを作り、
(b)別に、該所定のTCRに関して該β鎖CDR2配列で変異し該α鎖CDR2配列では変異していない第2の複数のTCRを作り、
(c)該第1及び第2の複数のTCRからのメンバーの前記標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を決定し、該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍大きい親和性及び/又は該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍遅い解離速度を有する該複数の各々からの1又はそれ以上のメンバーを選択し、
(d)該複数の各々からの選択したメンバーのCDR2配列を決定し、
(e)各々が該第1の複数からのα鎖CDR2配列及び該第2の複数からのβ鎖CDR2配列を有する1又はそれ以上のTCRを作り、
(f)工程(e)で作った1又はそれ以上のTCRの該標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を決定し、該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍大きい親和性及び/又は該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のTCRを選択することを含んでなる請求項1に記載の方法。 - (a)前記所定のTCRのα鎖及びβ鎖の両方をコードする核酸を提供し、
(b)該核酸を、前記α鎖CDR2配列の1又はそれ以上のコドン及び前記β鎖CDR2配列の1又はそれ以上のコドンの変異誘発に付し、
(c)工程(b)の該変異した核酸から、該所定のTCRに関して該α鎖CDR2配列の1又はそれ以上のアミノ酸及び該β鎖CDR2配列の1又はそれ以上のアミノ酸で変異した複数のTCRを作り、
(d)該複数のTCRのメンバーの前記標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を決定し、該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍大きい親和性及び/又は該標的pMHCに関して該所定のTCRより少なくとも10倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のメンバーを選択することを含んでなる請求項1に記載の方法。 - 工程(b)において、前記核酸を、前記α鎖CDR2配列の3つまでの連続コドン及び前記β鎖CDR2配列の3つまでの連続コドンの変異誘発に付し、工程(c)において、前記所定のTCRに関して該α鎖CDR2配列の3つまでの連続アミノ酸及び該β鎖CDR2配列の3つまでの連続アミノ酸で変異した複数のTCRを作る請求項3に記載の方法。
- 前記親和性及び/又は解離速度が表面プラズモン共鳴により決定される請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的pMHCに関して前記所定のTCRより少なくとも100倍大きい親和性及び/又は少なくとも100倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のTCRが選択される請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的pMHCに関して前記所定のTCRより少なくとも500倍大きい親和性及び/又は少なくとも500倍遅い解離速度を有する1又はそれ以上のTCRが選択される請求項1又は5に記載の方法。
- 親和性及び/又は結合速度/解離速度の決定用のTCRが可溶形態で作られる請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 親和性及び結合速度/解離速度の決定用のTCRがファージによりディスプレイされているαβ二量体TCRの多様性ライブラリとして作られる請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ファージによりディスプレイされているαβ二量体TCRが、
TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合されている第1のポリペプチドと、
TCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合されている第2のポリペプチド
とを含んでなり、
該第1及び第2のポリペプチドは天然型αβT細胞レセプターに等価物を有しないジスルフィド結合により連結され、
該第1又は第2のポリペプチドの一方がC末端で、ファージ粒子の表面露出アミノ酸残基にペプチド結合により連結されている請求項9に記載の方法。 - 前記ファージによりディスプレイされているαβ二量体TCRが、
TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合されている第1のポリペプチドと、
TCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のN末端に融合されている第2のポリペプチド
とを含んでなり、
該第1及び第2のポリペプチドがTRAC*01のエキソン1のThr48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン1のSer57又はそれらの非ヒト等価物から置換されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、
該第1又は第2のポリペプチドの一方がC末端で、ファージ粒子の表面露出アミノ酸残基にペプチド結合により連結されている請求項9に記載の方法。 - 前記複数のTCRがリボソームによりディスプレイされているαβ単鎖TCRの多様性ライブラリとして作られる請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的pMHCに結合するライブラリメンバーの親和性及び/又は解離速度を決定し、所望の親和性及び/又は解離速度を有するものを選択するために、
(i)該ライブラリの幾つかのメンバーを並列して該標的pMHCと接触させ、該pMHCと結合するメンバーを同定し、
(ii)工程(i)で同定したメンバーを順次、該標的pMHCと接触させ、該pMHCに関するそれらの親和性を評価し、
(iii)工程(ii)で評価した該所望の親和性を有する1又はそれ以上のメンバーを選択し、ディスプレイされているTCRのCDR2配列を決定し、
(v)このように決定したCDR2配列が組み込まれている可溶形態のTCRを作り、
(vi)これらTCRの該標的pMHCに関する親和性及び/又は解離速度を再決定又は場合によっては決定し、
(vii)工程(vi)で決定した該所望の親和性及び/又は解離速度を有する1又はそれ以上のTCRを選択する請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
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