JP2007536212A - レプチンアンタゴニストおよびレプチン定量測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
IgG、IgM、IgE、IgA、GILD、もし適用可能ならば、IgGもしくはこれの混合物のサブクラスのような、上述したクラスのサブクラス
IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、もしくはIgGMのようなIgGおよびそのサブクラスが、好ましい。IgGサブタイプIgG1/kもしくはIgG2b/kが、特に好ましい。
(a)組み換え産生されたレプチン結合蛋白を用いた、動物の免疫
(b)該動物からの、免疫細胞の単離
(c)ミエローマ細胞株との、ハイブリドーマ細胞培養に対しての融合
(d)該レプチン結合蛋白への高い特異性を有するクローンの選別
該免疫は、マウス、ウサギ、ブタ、ウマ等のような、このような目的に適している全動物を用いて実施され得る。レプチン結合蛋白に向かう抗体を産生するこのようなクローンを、本発明のクローンから分離するために(例えば、特に該レプチン結合蛋白のリガンド結合部位に向かう抗体を産生するもの)、適切な培地(例えば、マイクロタイタープレートのウェル、ポリスチロールのビーズ、プラスチックのチューブ)が各々、1種の(選別されていない)抗レプチン捕捉抗体で、方法のステップ(e)においてコーティングされる。もう1つ別の方法たる方法(f)では、該レプチン結合蛋白、そして引き続いてそのリガンド(レプチン)が加えられる。これにより該リガンドは好ましく標識されるべきであり(例えば、ビオチン化、標識(放射能標識、蛍光マーカー、酵素マーカー(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)等)を使用して)、あるいは、それぞれの抗リガンド抗体を使用して検出可能であるべきであり、こうして、捕捉抗体によりコーティングされた受容物(recipient)中で、該レプチン結合蛋白に結合する該リガンドの特性が試験され得る。このように、代わりの方法は例えば、放射能、化学蛍光、色測定による方法、または、酵素反応である。洗浄ステップ後、該リガンド添加後にシグナルを示さない「ウェル」もしくは「ビース」が、同定され得る。この場合、該捕捉抗体は、該リガンド結合部位をブロックする。こうして、該結合部位はもはや、該リガンド結合に使えなくなり、これは、該捕捉抗体が該リガンドに干渉するからである。
抗体Aの産生(レプチン−BPに向けて)
20匹より多いBalb/cマウスが繰り返し、一般的に知られた方法に従って組み換え産生されたレプチン−BPを用いて免疫された(Titermax(登録商標)の説明書参照)。レプチン−BPに対して高い力価が達成されたら、脾臓がこれらの動物から取り出され、KoehlerおよびMilsteinにより記載された方法に従って(”予定された特異性の抗体を分泌している融合細胞の連続培養”、Nature、1975年8月7日、256(5517)、495〜7)、ハイブリドーマ細胞が、マウスミエローマ細胞株との融合により、産生された。やはり一般的に知られた方法に従って(稀釈度を限定、該ハイブリドーマ細胞培養上清の、標識抗原を用いたスクリーニング)、これらのクローンが選択され、レプチン−BPへの高い親和性および特異性を有するモノクローナル抗体を産生した。
本発明による抗体の有効性の証明、ならびに、レプチン結合蛋白への干渉存在下での一般的な定量測定法の向上との関連
レプチン結合蛋白が、レプチン結合部位を自由に接近可能にするように、マイクロタイタープレート上で不動化された。これは、レプチン結合蛋白に向けられた他の抗体を使用して実施され、これらは、このホルモンの受容体の相互作用部位内ではなく外において結合する。引き続き、標識(ビオチン化)レプチンが加えられた。次いで、本発明の抗体ZMC2の濃度が上昇していく緩衝溶液が、インキュベート溶液に加えられる。インキュベート時間2時間後、不動化レプチン結合蛋白に結合した標識レプチン量が、ビオチンに特異的に結合する蛍光色素の添加により測定された。ZMC2濃度を上昇させていくと、ビオチン化レプチン結合が減り、こうして、ZMC2の追い出し効果を与えた。
ZMC2抗体の、ヒトレプチン−Rへの、ELISA上での結合
ZMC2抗体の、ヒトレプチン−Rへの結合を検出していくために、ELISAプレートが、組み換えヒトレプチン−R(200ng/ウェル)でコーティングされ、異なる濃度のZMC2抗体(1000、333、111、37、12.3、4.1、1.3、0.45、0.15、0.05、0.016、0.005、0.0018、0.0006ng/mL)が加えられた。ZMC2抗体の、レプチン−Rへの結合が引き続き、ビオチン化2次抗体を使用して検出され、次いで、SAV−HRPおよびシグナル(結果的に得られた色のOD)が、450nmにおいて測定された。結果として、ZMC2抗体が、ヒトレプチン−Rに用量依存的に結合し、対応しているバーによるプロット(柱状グラフ)から得られるとおりである(図6参照)。
ZMC2抗体の、ヒトレプチン−Rへの結合特異性
ZMC2抗体の、ヒトレプチン−Rへの、(過剰)レプチン存在下での競合結合実験用に、ELISAプレートが、組み換えヒトレプチン−R(200ng/ウェル)でコーティングされた。異なる濃度のレプチン(10000、1000、100、10、1、0.1ng/mL)がウェルに、ZMC2抗体存在下もしくは非存在下に、加えられた。ZMC2がもし加えられる場合、濃度10ng/mLで存在させた。ZMC2抗体の結合が次いで引き続き、ビオチン化2次抗体を使用して検出され、次いで、SAV−HRPおよびシグナル(結果的に得られた色のOD)が、450nmにおいて測定された。図7から得られるように、大過剰のレプチンのみが、ZMC2抗体の、ヒトレプチン−Rへの結合を追い出し得る。従って、ZMC2抗体の、レプチン−Rへの結合は、高度に特異的である。
ルシフェラーゼ活性の、レプチン刺激に対する応答における、用量応答
ルシフェラーゼ活性の、レプチン刺激に対する応答における、用量応答を検出するために、HEK293細胞が一過的に、レプチンRbとSTAT3−ルシフェラーゼ−レポーターとの構築体を用いてトランスフェクションされ、種々の用量のレプチンを用いて2時間刺激された。2時間後、培地が、レプチンを全く含有していない新鮮培地により置き換えられ、培養が更に4時間接種され、その後、細胞が溶かし出された。引き続き、ルシフェラーゼ活性が測定され、β−ガラクトシダーゼに関して較正され、トランスフェクションのコントロールとして使用された。結果が、図8に示される。示された値は、非刺激細胞を何倍上回る誘導かを表現する。該誘導は用量依存的であり、約50〜1000ng/mLのレプチンにおいて、最大に到達する。
ZMC2抗体の、レプチンシグナル伝達への阻害効果に関する用量応答
ZMC2抗体の、レプチンシグナル伝達への阻害効果に関する用量応答を得るために、HEK293細胞が一過的に、レプチンRbとSTAT3−ルシフェラーゼ−レポーターとの構築体を用いてトランスフェクションされ、レプチン(5ng/mL)を用いて2時間刺激された。異なる用量のZMC2抗体(10、5、1、0.5、および0.1μg/mL、レプチンが含有される場合)が培養に加えられ、30分後、レプチン(0ng/mL、ZMC2が全く含有されない場合、12.5ng/mL、ZMC2が含有される場合)が培養に加えられた。ルシフェラーゼ活性が引き続き測定され、β−ガラクトシダーゼに関して較正された。結果が図9に、バーによるプロットとして示され、非刺激細胞を何倍上回る誘導かとして表現されている。結果として、ZMC2抗体は用量応答性で、レプチンシグナル伝達への阻害効果を実証した。
ZMC2抗体の、マウスレプチン−Rへの結合
ELISAプレートが、組み換えマウスレプチン−R(200ng/ウェル)でコーティングされ、異なる濃度のZMC2抗体、レプチン、成長ホルモン、もしくはこれらの組み合わせ(ng/mL)が、加えられた。ZMC2抗体の結合が、ビオチン化2次抗体を使用して検出され、次いで、SAV−HRPおよび結果的に得られた色のODが、450nmにおいて測定された。結果が図10に、バーによるプロットとして示される。該プロットから得られるように、ZMC2抗体は、マウスレプチン−Rに用量依存的に結合し、この結合は、高用量においてのみ、レプチンにより追い出され得る。
TNF−α産生の、レプチン活性化ヒト単球における、ZMC2によるブロック
この実験用に、TNF−α産生が、レプチン活性化ヒト単球により誘導された。TNF−α産生誘導後、ZMC2(10および5ng/mL)が、レプチン存在下(250ng/mL)もしくは非存在下に、該単球に加えられた。結果が、図11に示される。図11において分かるように、ZMC2は、レプチン活性化ヒト単球によるTNF−α産生をブロックできる。Y軸は、TNF−αを発現している単球%を示す(%++(CD−14+およびTNF−α+)単球)。
ヒトPBLの、自家ヒト血清中での、okt3による刺激(抗CD3実験)
ヒトPBLの、自家ヒト血清中での、okt3(最適用量100ng/mL)による刺激を測定するために、細胞が、ZMC2ab存在下に(0、0.1、1、および10μg/mL)、外来レプチン存在下(100ng/mL)もしくは非存在下に、接種された。細胞が60分後に採取され、最大限のDNA合成を行わせた。その増殖が測定され(cpm)、図12Aにおいて見ることができる。PBLの増殖を増加させるZMC2の効果が少しあり、これはレプチンにより抑制される。増殖のこの増加は、レプチンにより反転され得、これは以降の実験において見られるとおりである。ZMC2はこうして、アンタゴニストとして作用する。更に、レプチン存在下でのヒトでの抗CD3刺激に対する応答は、PBL中での内因性/記憶細胞の相対割合に依存していると考えられ、より多くの内因性細胞が存在していれば、レプチンに対する応答における増殖の増加分がより大きくなると考えられ、あるいは、より多くの記憶細胞が存在していれば、レプチンにより誘導される増殖の阻害分がより大きくなると考えられる(IFN−g分泌が、記憶細胞増殖抑制にも関わらず増加しているが)。
延長増殖実験
ZMC2の効果をより良く定めるために、増殖実験がより長期間に亘り実施され、細胞が細胞周期のより後の相にある場合、増殖の増加分がより見えるようになるかどうかを見た。これゆえ、増殖は4日(96時間)に測定され、驚くべきことに、ZMC2abが尚、増殖を刺激し、ここでは−混合T細胞集団における全体での応答を見ると−レプチンの添加が増殖を抑制して以来、ZMC2がアンタゴニストとして作用するようになった(図13参照)。ZMC2の特異性が更に、レプチンの添加が増殖を抑制するとの事実により、測定され得る。
ob/obおよびob/+マウスでの食物取り込み実験:3群のマウス
ob/obおよびob/+マウスでの食物取り込み実験用に、全ての雌が採用された。ob/obの場合、マウスが体重維持のために、つまり、よくありがちなように、体重を減らさないだけでなく、体重を増加させるためにも、低用量レプチンを用いて処理された。通常、体重の1グラムが2日毎に、典型的にこれらマウスに餌付けされる。本実験における処理は、100μg/日ip+Recレプチン0.5μg/グラム体重、5日間であった。図14Aにおいて分かるように、体重変化の%曲線は、レプチン単独を用いた処置の間は平坦であり、該処理が有効であったことを指し示している。abにより妨げられている代わりに、体重が僅かに、体重に変化がないのではなく、増加した。比較実験では、異種接合体マウス(図14B参照)が使用されたが、これは、正常マウスよりも低いレプチンを示すからである。該異種接合体マウスが、同用量のab単独を用いて、平行して処理された。非処理マウスは、体重をずっと増加させる傾向を示した(ob/obマウスに関してよりも、強くなかった)。ab処理マウスは体重に関しては同様であったが、やめた後、体重がコントロールよりも増加した。
正常マウス(B6)からの脾臓細胞の増殖が、抗CD3を用いて、マウス(2C11と呼ばれる)用量応答(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100μg/mL)に関して、FCS2%存在下に刺激された。図14Cにおいて見られるように、明確な阻害が、10〜100μg/mLにおいて得られる。
Claims (42)
- レプチン受容体および/またはレプチン結合蛋白に向かう抗体Aであって、リガンドとのレプチン受容体および/またはレプチン結合蛋白の相互作用を実質的に抑え、好ましくは防ぐことを特徴とする、抗体A。
- レプチン受容体の細胞外ドメイン、特に、レプチン結合蛋白に向かうことを特徴とする、請求項1に記載の抗体A。
- 前記リガンドの、レプチン結合蛋白上の結合部位において結合することを特徴とする、請求項1または2に記載の抗体A。
- 前記リガンドがレプチンであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記レプチン結合蛋白が、液体、好ましくは体液に可溶化もしくは懸濁化された生理的レプチン結合蛋白であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体A。
- モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記抗体Aが、抗体ZMC2であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記抗体がヒト化され、ヒトレプチン受容体もしくはヒトレプチン結合蛋白に向かうことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記抗体が、配列番号(SEQ ID NO):1、2、3、4、6、もしくは8から選択される蛋白配列のいずれかから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記抗体が、配列番号(SEQ ID NO):2、4、5、もしくは7から選択される核酸配列によりコード化される蛋白配列を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体A。
- 前記抗体が、レプチンの中枢作用に影響を与えることなく、レプチンの末梢作用をブロックできることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体A。
- F(ab’)2断片もしくは単鎖抗体(scFv)または抗体断片であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体A断片。
- 医薬品としての、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体A、または、請求項12に記載の抗体A断片。
- 部分Iとして、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体、もしくは、請求項12に記載の抗体A断片を含有し、部分IIとして、抗体、抗体断片、もしくはペプチド、好ましくはレプチンを含有する、融合蛋白。
- 前記融合蛋白が、部分Iと部分IIとの間にリンカーを含有することを特徴とする、請求項14に記載の融合蛋白。
- 前記リンカーが、約5〜40アミノ酸、より好ましくは5〜30アミノ酸、最も好ましくは5〜20アミノ酸長を含むことを特徴とする、請求項15に記載の融合蛋白。
- 前記リンカーが、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%のグリシン残基を含有することを特徴とする、請求項15または16に記載の融合蛋白。
- 前記融合蛋白が2重特異的であることを特徴とする、請求項14〜17のいずれか1項に記載の融合蛋白。
- 前記2重特異的融合蛋白が、第1の特異性としてレプチン受容体および/またはレプチン結合蛋白に向かい、第2の特異性として細胞表面蛋白に向かうことを特徴とする、請求項18に記載の融合蛋白。
- 前記融合蛋白が、核酸配列配列番号(SEQ ID NO):7によりコード化されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項14〜19のいずれか1項に記載の融合蛋白。
- 前記融合蛋白が、アミノ酸配列配列番号(SEQ ID NO):8を含むことを特徴とする、請求項14〜19のいずれか1項に記載の融合蛋白。
- リガンドならびにレプチン受容体および/またはレプチン結合蛋白を、可溶化もしくは懸濁化された形態で含有しているサンプル中の、結合蛋白/受容体の該リガンドの定量的算出方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体A断片、および/または、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白が、算出されるべき該サンプルに加えられることを特徴とする、方法。
- 少なくとも1種の抗体Aが、前記定量的算出前もしくは途中に、好ましくは前に加えられ、および/または、該サンプルと共にインキュベートされることを特徴とする、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルが、液体、好ましくは体液、より好ましくはヒト体液、例えば血液を含有することを特徴とする、請求項22または23に記載の方法。
- 結合蛋白/受容体の前記リガンドが、レプチン結合蛋白および/またはレプチン受容体のリガンドであることを特徴とする、請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レプチン結合蛋白が可溶性であり、好ましくは前記レプチン受容体および/またはホルモン結合蛋白の可溶性部分であり、特に可溶性ホルモン結合蛋白であることを特徴とする、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンドの定量的算出が、抗原としての該リガンドの、抗体B、好ましくはモノクローナル抗体Bへの結合を使用して実施されることを特徴とする、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記定量的算出が、競合結合試験、好ましくはラジオイムノアッセイ(RIA)を使用して実施されることを特徴とする、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記定量的算出が、算出されるべきリガンドの濃度の関数として増加していく読み取り用パラメーターの測定により、好ましくは酵素とリンクした免疫吸着剤アッセイ(ELISA)および/またはサンドウィッチアッセイを使用して実施されることを特徴とする、請求項22〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レプチン結合蛋白が、定量的算出前に、算出されるべきサンプルから分離されないことを特徴とする、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗体Aが前記サンプル中に、前記レプチン結合蛋白よりも高濃度、好ましくは少なくとも50%より高い濃度、より好ましくは少なくとも100%の濃度、更により好ましくは少なくとも200%より高い濃度、最も好ましくは少なくとも400%より高い濃度で存在するよう、少なくとも1種の抗体Aが加えられることを特徴とする、請求項22〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンドがレプチンであることを特徴とする、請求項22〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白、適切な場合更に、活性物質、ならびに更に、添加剤および/またはアジュバントを含有する、医薬品。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白、ならびに適切な場合、アジュバントを含有する、診断薬。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白、ならびに、抗原/抗体反応に基づいた、リガンドの定量的算出のための使用のために準備された1つの操作テストアッセイを、互いに区別できるように含有する、キット。
- 第1の調製品が、抗体ZMC2および/または較正のための調製品および/または抗体Bを、使用のために準備された前記操作テストアッセイ中に含有し、ここで該テストアッセイが、リガンドの定量的算出のための抗原/抗体反応に基づいており、ここで抗体Bが該リガンドに向かうことを特徴とする、請求項35に記載のキット。
- 前記リガンドがレプチンであり、抗体Bが、分子量16kDaを有するレプチン主要アイソフォームに向かうことを特徴とする、請求項36に記載のキット。
- 抗体Bが、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項35〜37のいずれか1項に記載のキット。
- 前記モノクローナル抗体Bが、レプチンに向かうことを特徴とする、請求項38に記載のキット。
- 生理的レプチン結合蛋白も含有する生理的溶液中のリガンドの算出、好ましくは定量的算出のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白の、使用。
- 多発硬化(MS)、リューマチ性関節炎、糖尿、1型糖尿病、全身狼瘡エリテマトーデス(SLE)、慢性多発関節炎、バセドー氏病、自己免疫の形の慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、I型アレルギー疾患、II型アレルギー疾患、III型アレルギー疾患、IV型アレルギー疾患、線維筋炎、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リューマチ性多発筋痛、進行性全身性硬化(PSS)、乾癬、ライター症候群、リューマチ性関節炎、脈管炎、多発硬化、糖尿、1型糖尿病、慢性心不全(CHF)、TNFにより媒介される疾患、自己免疫結腸炎、リューマチ性関節炎、全身狼瘡エリテマトーデス、および移植時の拒絶を包含するTH1により媒介される疾患用、天然起源の制御/抑制T細胞による増加した増殖の制御用、ならびに、これらに関連した疾患、および、MAPK/ERK1−2、AKT、p−27−kip1シグナル伝達経路に関連した疾患の処置用、レプチンの免疫作用のブロック用、あるいは免疫療法用医薬品を調製するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白の、使用。
- 多発硬化(MS)、リューマチ性関節炎、糖尿、1型糖尿病、全身狼瘡エリテマトーデス(SLE)、慢性多発関節炎、バセドー氏病、自己免疫の形の慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、I型アレルギー疾患、II型アレルギー疾患、III型アレルギー疾患、IV型アレルギー疾患、線維筋炎、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リューマチ性多発筋痛、進行性全身性硬化(PSS)、乾癬、ライター症候群、リューマチ性関節炎、脈管炎、多発硬化、糖尿、1型糖尿病、慢性心不全(CHF)、TNFにより媒介される疾患、自己免疫結腸炎、リューマチ性関節炎、全身狼瘡エリテマトーデス、および移植時の拒絶を包含するTH1により媒介される疾患から選択される、過剰レプチン濃度による疾患、変化、もしくは病態生理、エネルギー代謝の変化、特に神経性食欲不振のような摂食疾患、および悪液質、ならびに、免疫系の変化、特に、免疫系の望まれない活性化および自己免疫疾患の処置用、天然起源の制御/抑制T細胞による増加した増殖の制御用、ならびに、これらに関連した疾患、および、MAPK/ERK1−2、AKT、p−27−kip1シグナル伝達経路に関連した疾患の処置用、レプチンの免疫作用のブロック用、あるいは免疫療法用医薬品を調製するための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の少なくとも1種の抗体A、請求項12に記載の抗体断片、もしくは、請求項14〜21のいずれか1項に記載の融合蛋白、または、請求項33に記載の医薬品の、使用。
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