JP2007535320A - 生体活性を有する骨芽細胞刺激表面を製造するための酵素的方法およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
二酸化珪素、珪酸塩およびシリコーンは、産業上広く利用され、経済的に重要な材料である。また、ハイテク製品(光学およびマイクロエレクトロニクス機器、ナノ粒子製造など)の製造に用いられる主要な材料の1つでもある。二酸化珪素(SiO2)は、結晶およびアモルファス形状中に存在する。アモルファスSiO2は、とりわけ、分子篩として、触媒、充てん剤、増白剤として、吸収剤として、担体、安定剤あるいは触媒担体として使用されている。また、アモルファスSiO2(「バイオシリカ」)は、その骨格構造が、珪藻(diatom)の殻および珪質カイメンの針(骨針)など、多くの単細胞および多細胞有機体から成り、バイオミネラリゼーションにより形成された材料でもある。
骨芽細胞は、骨形成細胞である。1型コラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質など、骨基質タンパク質のほとんどを合成し、分泌する。また、石灰化に関与するアルカリホスファターゼを多く含有する。骨芽細胞は、1α25‐ジヒドロキシビタミンD3(1α25-dihydroxyvitamin D3)[1.25(OH)2D3]、グルココルチコイドおよび成長因子に反応する。1.25(OH)2D3は、骨再吸収の刺激因子であり、成熟した骨芽細胞中において、石灰化プロセスに関わるオステオカルシンなどの遺伝子発現を増加させる。
診療所において、骨修復および骨置換に好んで優先的に用いられる自家移植には不都合があるため、代替骨置換材の需要は高い。整形外科においては、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)およびそのコポリマー(PLAGA)などの生分解性ポリマーは、しばしば利用されている。近年、45S5生体活性ガラスなど、表面のリン酸カルシウム層を通して、新骨形成を促し、骨への連結を築く、いわゆる生体活性材料が開発されてきた(Hench et al. (1991) J. Amer. Cerm. Soc. 74:1487)。しかしながら、これにより非生理的表面マトリックス(ガラス表面)が手に入るわけではない。
添付図面および配列番号は、以下の通りである。
配列番号2:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)由来のシリカテインαポリペプチドの核酸配列。
配列番号3:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)(SIA_SUBDO)由来のシリカテインβのアミノ酸配列。
配列番号4:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)由来のシリカテインβの核酸配列。
配列番号5:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)由来のシリカーゼ(silicase)のアミノ酸配列。
配列番号6:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)由来のシリカーゼ(silicase)のcDNAの核酸配列。
配列番号7:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)(SIA_SUBDO)由来のコラーゲン3のアミノ酸配列。
配列番号8:本発明により用いられるSドムンクラ(S. domuncula)由来のコラーゲン3の核酸配列。
以下の試験には、ヒト骨芽細胞(SaOS-2細胞)が用いられた。SaOS-2細胞は、骨原性肉腫から生じる(McQuillan et al. (1995) Bone 16:415-426)。全ての培養物に関して、細胞成長および石灰化が測定された。石灰化に加え、アルカリホスファターゼ発現もまた、更なる分化マーカーとして測定された。
コラーゲン修飾に必要なシリカテインポリペプチドは、組織あるいは細胞の精製あるいは組換えにより製造することができる。
シリカテインαおよびシリカテインβの精製は、単離されたカイメン骨針から行うことができる。
組換えタンパク質(シリカテインα:配列番号1;シリカテインβ:配列番号3)の製造は、大腸菌(E.coli)中にて行うことができる。酵母や哺乳類細胞における製造も可能である。この目的のために、特定のcDNAが、pQE-30などの発現ベクター中にクローン化される。E.coli形質転換の後、IPTG(イソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド(isopropyl-β-thiogalactopyranoside))により、タンパク質の発現が誘導される(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York)。Ni-NTAマトリックス上において、ヒスチジン標識による組換えタンパク質の精製が行われる。
(組換え)シリカテインの酵素活性を測定するために、テトラエトキシシラン(TEOS)を加水分解し、続いて重合した後、重合および沈降したシリカの測定に基づいた検定を用いることができる(図3)。同検定において、酵素は、通常1mmのMOPS緩衝液(pH6.8)に溶解され、1〜4.5mMテトラエトキシシラン溶液1ミリリットルと化合される。通常、室温において、反応時間を変えて酵素反応が行われる。シリカ製造物を実証するために、材料が遠心分離され、エタノールで洗浄され、空気乾燥される。その後、沈殿物は1MのNaOHにより加水分解される。放出された珪酸塩は、モリブデート支援実証法(Merck社の珪素検定)により、製造された溶液中で定量される。
天然資源(組織あるいは細胞など)からのシリカーゼ(silicase)精製および酵素(配列番号5)の組換え製造は、技術水準である(DE 102 46 186.4; PCT/EP03/10983)。
(市販の)炭酸脱水酵素製剤(例えばウシ赤血球由来;Calbiochem company製など)あるいは組換えカイメンシリカーゼ(silicase)のシリカーゼ(silicase)活性を示す方法が開示された(DE 102 46 186.4; PCT/EP03/10983)。
天然コラーゲン(ウシコラーゲンなど脊椎動物由来、および海洋性デモカイメンなど無脊椎動物由来)および組換えコラーゲン(特に海洋性カイメンSドムンクラ(S. domuncula)由来)のいずれも、鋳型として用いることができる。その調整に関して、以下に2、3の方法を記載する。
様々な海洋性カイメンからコラーゲンを単離する簡単な方法が開示された(DE 100 10 113 A 1. Verfahren zur Isolierung von Schwammkollagen sowie Herstellung von nanopartikulaerem Kollagen. 出願人: W Schatton. 発明者: J Kreuter, WEG Mueller, W Schatton, D Swatschek, M Schatton; Swatschek et al. (2002) Eur. J. Pharm. Biopharm. 53:107-113)。高収率(>30%)でカイメンコラーゲンが得られる。
組換えコラーゲン(配列番号7)を製造するために、Sドムンクラ(S. domuncula)由来の非線維性コラーゲン(コラーゲン3)をコードするクローンを用いることができる。
ヒト骨肉腫細胞(SaOS-2;アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)は、15%ウシ胎児血清(FBS)に1%グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを加えたマッコイ培地(Invitrogen製)を用いて、37℃、相対湿度98〜100%、および5%CO2雰囲気下において培養される。培地は2日間ごとに交換される。実験用培養物を製造するために、コンフルエント細胞は、Ca2+およびMg2+を含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Sigma製)により短時間洗浄され、その後トリプシン消化される。すなわち、Ca2+およびMg2+を含まないPBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, pH 7.40)中において、0.1重量%のトリプシン/0/04重量%EDTAにより処理される。細胞懸濁液が形成された後、血球計により細胞数が計測され、1000個(細胞数)/mm2の密度において、24ウエルプレート(190 mm2)に植えつけられた。その後培養物は、成長培地中にて14日間までインキュベーションされる。培地は2日間ごとに交換され、1週間後以降は毎日交換された。7日目に、10mMのβ‐グリセロリン酸塩(Sigma製)1M原液が添加された。β‐グリセロリン酸塩により、石灰化が促進される。
培養皿は、PBSのみ(コントロール)、あるいは以下のタンパク質をPBS中に配合した溶液によりコーティングされる。
a) 1型コラーゲン(Sigma製;10 μg/cm2)+シリカテイン(1 μg/cm2)+TEOS(5 mM)
b) 3型コラーゲン(10 μg/cm2)+シリカテイン(1 μg/cm2)+TEOS(5 mM)
ピコグリーン(PicoGreen)検定などの技術水準である手法により、総DNAをバッチに分けて測定することができる。この目的のために、ピコグリーンdsDNA定量試薬(分子プローブ)は、TE緩衝液(10 mM トリス/HCl pH 7.4, 1 mM EDTA)中に1:200の割合で希釈される。その後、ピコグリーン溶液は、サンプル(TE緩衝液中に懸濁された細胞)と、1:1(100μl:100μl)の割合で混合される。各バッチは、暗所にて5分間静置され、その後、蛍光ELISAプレートリーダー(Fluoroskan バージョン4.0など)を用いて、励起波長485nmおよび発光波長535nmにおいて測定される。仔ウシ胸腺DNAによる校正曲線が比較標準として記録された。
SaOS-2細胞などの骨芽細胞によるリン酸カルシウム形成は、Stanfordらの手法(J. Biol. Chem. 270:9420-9428, 1995)、あるいは技術水準であるその他の手法により測定することができる。細胞は、4℃にて1時間、100%エタノール中に固定され、その後短時間、蒸留H2Oにより洗浄され、40mMアリザリンレッドS溶液(pH 4.2;Sigma製)により、10分間室温にて軽く攪拌しながら染色される。その後細胞は、蒸留H2Oおよび1倍PBS(DULBECCO製)により数回洗浄される。その後、細胞は10重量% 塩化セチルピリジニウム(cetylpyridinium chloride)(CPC)100μl/cm2、10mM リン酸ナトリウム(pH 7.0)中において、15分間室温にて軽く攪拌しながらインキュベーションされる。上清のアリコートが、10% CPC、10mM リン酸ナトリウム(pH 7.0)により10倍に希釈され、562nmにおける吸光度が測定される。結合したアリザリンレッドSのモル数は、校正曲線を用いて測定することができる。得られた値は、並行培養により測定された総DNA量と関連付けられる。
本発明の更なる態様としては、表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾による生体活性表面製造のために、シリカテインα、シリカテインβあるいは関連ポリペプチド、を用いたアモルファス二酸化珪素(シリカ)を利用した後述の方法、および得られたその製造物の利用が挙げられる。
Claims (13)
- アモルファス二酸化珪素(シリカ)および/あるいはシリコーンを有する表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する方法であって、ポリペプチドによる酵素修飾からなり、当該ポリペプチドは、配列番号1あるいは配列番号3に示された配列と25%以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカテイン(silicatein)αあるいはシリカテインβドメイン、あるいは配列番号5に示された配列と25%以上の配列同一性を示す動物、細菌、植物あるいは真菌由来のシリカーゼ(silicase)ドメインからなる方法。
- 珪酸、モノアルコキシシラントリオール(monoalkoxysilanetriol)、ジアルコキシシランジオール(dialkoxysilanediol)、トリアルコキシシラノール(trialkoxysilanol)、あるいはテトラアルコキシシラン(tetraalkoxysilane)が酵素修飾基質として用いられることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- モノアルコキシシランジオール(monoalkoxysilanediol)、モノアルコキシシラノール(monoalkoxysilanol)、ジアルコキシシラノール(dialkoxysilanol)、アルキルシラントリオール(alkylsilanetriol)、アリールシラントリオール(arylsilanetriol)あるいはメタロシラントリオール(metallosilanetriol)、アルキルシランジオール(alkylsilanediol)、アリールシランジオール(arylsilanediol)あるいはメタロシランジオール(metallosilanediol)、アルキルシラノール(alkylsilanol)、アリールシラノール(arylsilanol)あるいはメタロシラノール(metallosilanol)、アルキルモノアルコキシシランジオール(alkylmonoalkoxysilanediol)、アリールモノアルコキシシランジオール(arylmonoalkoxysilanediol)あるいはメタロモノアルコキシシランジオール(metallomonoalkoxysilanediol)、アルキルモノアルコキシシラノール(alkylmonoalkoxysilanol)、アリールモノアルコキシシラノール(arylmonoalkoxysilanol)あるいはメタロモノアルコキシシラノール(metallomonoalkoxysilanol)、アルキルジアルコキシシラノール(alkyldialkoxysilanol)、アリールジアルコキシシラノール(aryldialkoxysilanol)あるいはメタロジアルコキシシラノール(metallodialkoxysilanol)、アルキルトリアルコキシシラン(alkyltrialkoxysilane)、アリールトリアルコキシシラン(aryltrialkoxysilane)あるいはメタロトリアルコキシシラン(metallotrialkoxysilane)が酵素修飾基質として用いられることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法において、当該表面は、ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、バイオポリマーあるいはその他の材料である方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、バイオポリマーである方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、コラーゲンである方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項6に記載の方法において、当該分子あるいは分子集合体は、海洋性カイメン由来のコラーゲンである方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、配列番号1あるいは配列番号3によるスベリテス・ドムンクラ(Suberites domuncula)由来のシリカテインαあるいはシリカテインβのポリペプチド、あるいはシリカテインαあるいはシリカテインβドメインのアミノ酸配列が配列番号1あるいは配列番号3に示された配列と25%以上の配列同一性を示すシリカテインαあるいはシリカテインβに相同性のあるポリペプチドが、in vivo、細胞抽出物あるいは細胞溶解物あるいは精製形状において得られる方法。
- 表面上の分子あるいは分子集合体の酵素修飾により、生体活性表面を製造する請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、配列番号5によるスベリテス・ドムンクラSuberites domuncula由来シリカーゼ(silicase)のポリペプチド、あるいはシリカーゼ(silicase)ドメインのアミノ酸配列が配列番号5に示された配列と25%以上の配列同一性を示すシリカーゼ(silicase)に相同性のあるポリペプチドが、in vivo、細胞抽出物あるいは細胞溶解物あるいは精製形状において得られる方法。
- 請求項1〜9に記載された方法により得られた珪酸含有構造物あるいは表面。
- 細胞および/あるいは細胞培養物の成長、活性および/あるいは石灰化を促す方法であって、a)請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法を実施すること、およびb)得られた生体活性表面に細胞および/あるいは細胞培養物を接触させること、から成る方法。
- 細胞および/あるいは細胞培養物の成長、活性および/あるいは石灰化を促す請求項11に記載の方法において、当該細胞は、骨芽細胞あるいは骨芽細胞類似の細胞から選択される方法。
- 細胞培養、組織工学、あるいは医療用インプラント製造における、請求項1〜9あるいは請求項11あるいは12のいずれか1項に記載の方法の利用。
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