JP2007535307A - 腫瘍壊死因子Ｚｔｎｆ１２ - Google Patents

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Abstract

新規腫瘍壊死因子リガンドポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が開示される。前記ポリペプチドは、免疫応答に関連する方法内に使用され得、そしてまた、免疫−調節治療剤の開発にも使用され得る。前記リガンドポリペプチドの抗体、結合タンパク質、アゴニスト及びアンタゴニストがまた供給される。

Description

発明の背景：
免疫応答の間に生じる細胞相互作用は、細胞表面受容体及びそれらのそれぞれのリガンドのいくつかのファミリー、例えば腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーのメンバーにより調節される。このファミリーのいくつかのメンバーは、異なった造血細胞系間の相互作用を調節する（Smith など., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76: 959-62,1994 ; Cosman, Stem Cells 12: 440-55,1994）。
一般的に、TNFファミリーのメンバーは、異なった造血細胞間の相互作用、例えばT細胞/B細胞、T細胞/単球及びT細胞/T細胞相互作用を仲介する。この二元伝達の結果は、標的細胞又は活性化状態に依存して、刺激的であるか又は阻害性であり得る。TNFリガンドは、細胞増殖、活性化及び分化の調節、例えばアポプトシス又は細胞毒性による細胞生存性又は死の調節に関与する。TNF受容体（TNFR）分布、誘発の動力学及び誘発のための必要条件における差異は、T細胞−介在性免疫応答におけるTNFリガンドの個々についての定義された役割の概念を支持する。
TNFリガンドファミリーは、多くのタイプII膜内在性糖タンパク質から構成される。神経成長因子（NGF）及びLT−αを除くこのファミリーのメンバーは、N−末端細胞質領域、単一トランスメンブラン領域、リンカー領域及び150〜170個のアミノ酸残基のC−末端受容体−結合ドメインを含む。前記C−末端受容体−結合ドメインは、β−サンドイッチであることが決定されている。NGFを除くのこのファミリーのメンバーは、この細胞外受容体−結合ドメイン内で約20％配列相同性を共有し、そしてリンカー、トランスメンブラン及び細胞質ドメイン内ではほとんどか又はまったく相同性は存在しない。このファミリー内のリガンドは、トリマー又はマルチマー複合体として生物学的に活性である。
このグループは、TNF, LT-α, LT-β, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, OX40L, FasL (Cosman, 前記; Lotz など. , J. Leukoc. Biol. 60: 1-7,1996), TRAIL 又はapo-2 リガンド (Wileyなど., Immunity 3 : 673-82,1995), 及び TNF γ (WO 96/14328号)を包含する。トランスメンブラン領域の存在は、リガンドが膜関連していることを示す。可溶性リガンド形が、TNFα、LT−α及びFasLのために同定されている。特定のプロテアーゼが個々のリガンドを切断し、それを膜から開放するかどうか、又は１つのプロテアーゼがすべてのTNFリガンドファミリーメンバーに関して同じ機能を提供するかどうかは知られていない。TACE（TNF−α転換酵素）は、TNFを切断することが知られている（Moss など., Nature 385: 733-36,1997 ; Black など., Nature 385: 729-33, 1997）。
TNFRファミリーは、タイプI膜内在性糖タンパク質、例えばp75 NGFR, p55 TNFR-I, p75 TNFR-II, TNFR-RP/TNFR-E, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, FAS/APO-1 (Cosman, 前記; Lotz et al., 前記 ), HVEM (Montgomery など. , Cell 87: 427-36,1996), DR3 (Chinnaiyan など., Science 274: 990-92,1996)としても知れれているWSL-1 (Kitson など. , Nature 384: 372-75, 1996), DR4 (Pan など. , Science 276: 111-13,1997), WO 96/28546号に記載されているTNF 受容体タンパク質（現在オステオプロテゲリン(OPG, Simonet et al. , Cell 89: 309-19,1997)としても知れれている）, CAR1 （ニワトリにおいて見出される (Brojatsch et al., Cell 87: 845-55,1996) ）、及びTNFR-関連分子をコードするいくつかのウィルス性読み取り枠から構成されている。NGFR, TNFR-I, CD30, CD40, 4-1BB, DR3, DR4 及び OX40は主に、リンパ/造血系の細胞に制限される。
TNFリガンドファミリーの１つのメンバー、すなわちTNF及びその受容体の相互作用は、広範囲の生物学的工程及び病理学的に必須であることが示されている。特に、受容体−リガンド対は、免疫調節の仲介、免疫刺激及び移植片拒絶の緩和を包含する種々の免疫調節性質を有する。関与はまた、炎症、腫瘍の壊死（Grayなど., Nature 312:721-24, 1984）, 敗血性ショック（Tracyなど., Science 234: 470-74, 1986）及び細胞毒性においても示されている。TNFは、細胞増殖及び分化を促進し、そして調節する（Tartalgia など. , J. Immunol. 151: 4637-41, 1993）。さらに、TNF及びその受容体はまた、アポプトシスにも関与している。
X−線結晶学的構造は、ヒトTNF（Jones など., Nature 388: 225-28,1989), LT-β (Eck など. , J. Biol. Chem. 267: 2119-22, 1992), 及び LT-β/TNFR 複合体 (Banner など., Cell 73: 431-35,1993)）に関して解決されている。この複合体は、１つのLT−βトリマーに対して対照的に結合される３個の受容体分子を特徴とする。受容体オリゴマー化を通して結合するトリマーリガンドのモデルは、シグナルトランスダクション経路を開始することが提案されている。いくつかのTNFメンバーの生物学的活性の同定は、その対応する受容体に対して特異的なモノクローナル抗体の使用を通して促進されて来た。
それらのモノクローナル抗体は、固定される場合、刺激的であり、そして可溶性で拮抗性である傾向がある。これは、受容体架橋が受容体及びリガンドファミリーの両者においてシグナルトランスダクションのための必要条件であるさらなる証拠である。重要なことには、マルチマーIg 融合タンパク質の形での受容体−特異的モノクローナル抗体又は可溶性受容体の使用は、いくつかのファミリーメンバーに関して、インビトロ及びインビボでの生物学的機能を決定することにおいて有用であった。可溶性受容体−Ig融合タンパク質は、CD40, CD30, CD27, 4-IBB及びFas受容体に対応する細胞表面リガンドのクローニングにおいて都合良く使用されて来た。
TNFリガンドファミリーのメンバーは主に、トリマー又はマルチマー複合体として生物学的活性のタイプII膜糖タンパク質として存在する。ほとんどのリガンドは、膜−結合のタンパク質として合成されるが、可溶性形は制限されたタンパク質加水分解により生成され得る。いくつかの受容体に関しては、溶解が、活性のために必要であり、ところが他に関しては、それらの活性は分解に基づいて阻害される。
増殖誘発性リガンド（APRIL）は、その溶解性形で活性的であることが知られている腫瘍壊死因子リガンドの例である（Medema など., Cell Death and Diff. 10: 1121-25に再考される）。APRILは、膜結合形の分解を通してではなく、細胞分泌路を通して、細胞内分解され、そして生成されることにおいてユニークである。APRILは、インビトロで腫瘍細胞の増殖を刺激するその能力に基づいて単離される。APRILを発現するトランスジェニックマウスを用いる実験はT−細胞を刺激することにおいてこのリガンドの役割を示す。このリガンドは、TNFRファミリーの次の２種のメンバー、すなわちBCMA及びTACIに結合することが知られている。しかしながら、APRILに対する少なくとも１つのさらなる受容体についての実験的証拠が存在する。特に、Jurkatヒト白血病T−細胞系は、APRIL刺激に対して敏感であるが、TACIはノザンブロット分析によりJurkat細胞においては検出できない（Medimaなど., 前記）。
炎症は通常、有害な剤及び損傷された組織を破壊し、希釈し、又は隔てる外傷又は微生物侵入に対する局在化された保護応答である。炎症により特徴づけられる炎症は、ヒトにおける羅病率及び死亡率の有意な原因である。炎症は通常、外来性材料による宿主の侵入に対する防御応答として生じるが、それはまた、機械的外傷、毒素及び新形成に対する応答により誘発される。外来物として宿主組織の異常認識により引き起こされる過剰炎症、又は炎症工程の延長はまた、炎症性疾患、例えば糖尿病、喘息、アテローム性硬化症、白内障、再灌流性損傷、癌、後−感染性症状、例えば感染性髄膜炎及びリウマチ性発熱及びリウマチ性疾患、例えば全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎を導く。従って、多くのそのような疾患において炎症を阻害する剤を生成する必要がある。
それらのTNFリガンドファミリーメンバーの示されるインビボ活性は、他のTNFリガンド、リガンドアゴニスト及びアンタゴニスト、及びTNF受容体の莫大な臨床学的可能性及び必要性を示す。本発明は、新規TNFリガンド、及び関連する組成物及び方法を提供することによって、この必要性と取り組む。
発明の特定の記載：
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされたポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。対立遺伝子変異のために対照アミノ酸配列とは異なる同じ種からの同じタンパク質もまた包含される。対立遺伝子変異は、所定のタンパク質をコードする遺伝子における個人間での天然において発生する差異を言及する。
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０9Ｍ-1の結合親和性を有する。
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“コンチグ(contig)”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列とは、ポリヌクレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さのポリヌクレオチド配列を“オーバーラップ”すると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列5’-ATGGCTTAGCTT-3’ に対する代表的なcontig とは、5’-TAGCTTgagtct-3’及び3’-gtcgacTACCGA-5’である。
用語“縮重”とは、ヌクレオチド配列、例えばプローブ又はプライマーに適用される場合、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を参照のこと)。
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
用語“作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
用語“オルト体（ortholog）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
用語“ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド（“nt”）、又はキロ塩基（“kb”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような不対末端は一般的に20ntの長さを越えない。
用語“ポリペプチド”は、本明細書において使用される場合、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
用語“受容体”とは、本明細書において使用される場合、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する、細胞関連タンパク質、又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一の又は異なった受容体サブユニットの会合）における変化をもたらす。
それらの相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、AMP生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL−３受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体及びIL―6受容体)であり得る。
用語“分泌シグナル配列”とは、本明細書において使用される場合、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
用語“可溶性受容体又はリガンド”とは、本明細書において使用される場合、細胞膜に結合されない受容体又はリガンドポリペプチドである。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性リガンドは、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いている受容体−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体又はリガンドは、追加のアミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで成る。
多くの細胞−表面受容体及びリガンドは、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライシングされたmRNAから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体及びリガンドポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確には±10％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
１つの観点においては、本発明は、配列番号２の残基138〜501のアミノ酸を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの観点においては、前記ポリペプチドは、配列番号２の残基140〜501を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２の残基54〜501を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２の残基１〜501を含んで成る。もう１つの態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号２の残基138〜501、配列番号２の残基140〜501、配列番号２の残基164〜501、配列番号２の残基363〜501、配列番号２の残基54〜501、配列番号２の残基164〜362、配列番号２の残基1〜362、及び配列番号２の残基1〜501から選択されたアミノ酸を含んで成り、ここで前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。
もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列と少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはマルチマーを形成する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、TNF受容体を結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識に共有結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン不変領域に共有結合される。
もう１つの観点においては、本発明は、第２ポリペプチドに複合体化される第１ポリペプチドを含んで成る単離されたタンパク質を提供し、ここで前記第１ポリペプチドは配列番号２の残基１〜501のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であり、そして前記タンパク質が免疫又は炎症応答を調節する。１つの態様においては、前記第１ポリペプチドは配列番号２の残基１〜501のアミノ酸配列に対して少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、タンパク質はトリマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はヘテロトリマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はマルチマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はヘテロマルチマーである。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２の残基138〜501のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。１つの態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号２の残基138〜501、配列番号２の残基140〜501、配列番号２の残基164〜501、配列番号２の残基363〜501、配列番号２の残基54〜501、配列番号２の残基164〜362、配列番号２の残基1〜362、及び配列番号２の残基1〜501から選択されたアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードし、ここで前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。
もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、アミノ酸配列と少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはマルチマーを形成する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、TNF受容体を結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識に共有結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン不変領域に共有結合される。
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；配列番号２の残基１〜501に対して、アミノ酸配列において少なくとも80％同一であるポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識又は免疫グロブリン不変領域を含んで成る。もう１つの態様においては、本発明はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、発現ベクターを導入されている培養細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基138〜501のポリペプチド、及び医薬的に許容できるビークルを含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様においては、発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成るポリペプチドの生成方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基138〜501のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。１つの態様においては、前記抗体はモノクローナル抗体である。１つの態様においては、前記抗体は、配列番号２のアミノ酸138〜501のポリペプチドを含んで成るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
もう１つの観点においては、本発明は、順序良く次の段階：
配列番号２の残基140〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；配列番号２の残基138〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；配列番号２の残基54〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；及び配列番号２の残基１〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドにより哺乳類を接種し、ここで前記ポリペプチドが前記動物において免疫応答を誘発し；
抗体を生成し；そして
前記動物から抗体を単離することを含んで成る抗体の生成方法を提供する。１つの態様においては、前記抗体は、配列番号２の残基１〜501に結合する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量の配列番号２の残基１〜501のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x1ポリペプチドによる哺乳類の処理方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量の配列番号２の残基164〜501のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x1ポリペプチドによる哺乳類の処理方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のアンタゴニストを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x1アンタゴニストによる哺乳類の処理方法を提供する。１つの態様においては、前記アンダゴニストは、Ztnf12抗体である。もう１つの態様においては、前期アンタゴニストは、Ztnfx1モノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２の残基164〜501のアミノ酸配列から成るか又は含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２の残基１〜362のアミノ酸配列から成るか又は含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、Ztnf12x1ポリヌクレオチド又はポリペプチドの検出方法を提供する。
１つの観点においては、本発明は、配列番号17の残基192〜529のアミノ酸を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの観点にいては、前記ポリペプチドは、配列番号17の残基１〜529を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号17の残基48〜529を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号17の残基168〜529を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号17の残基166〜529を含んで成る。もう１つの態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号17の残基166〜529、配列番号17の残基168〜529、配列番号17の残基192〜529、配列番号17の残基48〜529、及び配列番号17の残基１〜529から選択されたアミノ酸を含んで成り、ここで前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。
もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列と少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはマルチマーを形成する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、TNF受容体を結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識に共有結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン不変領域に共有結合される。
もう１つの観点においては、本発明は、第２ポリペプチドに複合体化される第１ポリペプチドを含んで成る単離されたタンパク質を提供し、ここで前記第１ポリペプチドは配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であり、そして前記タンパク質が免疫又は炎症応答を調節する。１つの態様においては、前記第１ポリペプチドは配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列に対して少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、タンパク質はヘテロダイマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はトリマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はヘテロトリマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はムルチマーである。もう１つの態様においては、タンパク質はヘテロマルチマーである。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号17の残基192〜529のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。１つの態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号17の残基48〜529、配列番号17の残基168〜529、配列番号17の残基166〜529、及び配列番号17の残基１〜529から選択されたアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードし、ここで前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、アミノ酸配列と少なくとも85％、90％、 95％、 98％又は99％同一である。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはマルチマーを形成する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、TNF受容体を結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識に共有結合する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン不変領域に共有結合される。
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；配列番号17の残基１〜529に対して、アミノ酸配列において少なくとも80％同一であるポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。１つの態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標識又は免疫グロブリン不変領域を含んで成る。もう１つの態様においては、本発明はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、発現ベクターを導入されている培養細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、配列番号17のアミノ酸残基192〜529のポリペプチド、及び医薬的に許容できるビークルを含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様においては、発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成るポリペプチドの生成方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号17のアミノ酸残基192〜529のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。１つの態様においては、前記抗体はモノクローナル抗体である。１つの態様においては、前記抗体は、配列番号17のアミノ酸192〜529のポリペプチドを含んで成るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
もう１つの観点においては、本発明は、順序良く次の段階：配列番号17の残基168〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；配列番号17の残基192〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；配列番号17の残基48〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；及び配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドにより哺乳類を接種し、ここで前記ポリペプチドが前記動物において免疫応答を誘発し、抗体を生成し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る抗体の生成方法を提供する。１つの態様においては、前記抗体は、配列番号17の残基１〜529に結合する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量の配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x2ポリペプチドによる哺乳類の処理方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量の配列番号17の残基164〜529のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x2ポリペプチドによる哺乳類の処理方法を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のアンタゴニストを、哺乳類に投与することを含んで成る、Ztnf12x2アンタゴニストによる哺乳類の処理方法を提供する。１つの態様においては、前記アンダゴニストは、Ztnf12x2抗体である。もう１つの態様においては、前期アンタゴニストは、Ztnf12x2モノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号17の残基192〜529のアミノ酸配列から成るか又は含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列から成るか又は含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、Ztnf12x2ポリヌクレオチド又はポリペプチドの検出方法を提供する。
本発明は、主要壊死因子リガンドファミリー、Ztnf12の新規メンバーとしてのDNA配列（配列番号１）及び対応するポリペプチド配列（配列番号２）の同定に一部、基づかれている。この新規TNFリガンドは、腫瘍壊死因子リガンドファミリーのメンバーに対して相同性を有する。Shu H. -B. , など. , J. Leukoc. Biol. 65: 680-683 Browning J. L.,など., Cell 72: 847- 856 (1993);及び Goodwin R. G. ,など., Cell 73: (1993)を参照のこと。
この新規腫瘍壊死因子は、免疫応答、造血、炎症、細胞欠損、異常細胞増殖、アポアトシス、癌の調節、又は炎症状態の処理に包含され得る。そのリガンドは、Ztnf12と命名されている。
本発明の新規Ztnf12リガンド−コードのポリヌクレオチド及びポリペプチドは、タンパク質のTNFリガンドファミリーに対して特異的な特性の組合せに基づいて、最初に同定された。それらの特性は、遺伝子構造、トランスメンブランアンカーの同定、タンパク質サイズ、染色体位置及びTNFリガンドに対する配列類似性を包含する。この情報を用いて、ヒトcDNAの２種の変異体が、TNFリガンドのファミリーメンバーとして同定された。それらの２種の変異体は、本明細書においては、Ztnfx1及びZtnfx2として命名された。それらの変異体は、集合的には、Ztnf12として命名された。
Ztnf12x1のcDNA配列（配列番号１）の分析は、501個のアミノ酸Ztnf12x1アミノ酸配列（配列番号２）をコードする読取枠を示した。Ztnf12x1ポリペプチドは、配列番号２の残基26〜53のアミノ末端トランスメンブランドメインを含んで成る。タイプIIタンパク質として、Ztnf12x1タンパク質の細胞内ドメインは、配列番号２の残基１〜25であり、そしてZtnf12x1の細胞外ドメインは、配列番号２の残基54〜501である。Ztnf12x1の細胞外ドメインは、配列番号５で示され、そして２種のTNFドメインを含んで成る。Ztnf12x1の第１のTNFドメインは配列番号２の又は配列番号10で示されるようなアミノ酸の位置164で開始し、そして位置360で終結する。Ztnf12x1の第２TNFドメインは配列番号２、又は配列番号11で示されるようなアミノ酸の位置363で開始し、そして位置501で終結する。当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして＋/−３又はそれよりも多くのアミノ酸差異であり得ることを理解するであろう。
Ztnf12x2のcDNA配列（配列番号16）の分析は、529個のアミノ酸（配列番号17）をコードする読取枠を示した。Ztnf12x2ポリペプチドは、Ztnf12x1（配列番号２）の残基47と48との間への28個の残基の挿入によりZtnf12x1とは異なる。Ztnf12x2ポリペプチドは、配列番号17の残基26〜４７のアミノ末端トランスメンブランドメインを含んで成る。タイプIIタンパク質として、Ztnf12x2タンパク質の細胞内ドメインは、配列番号17の残基１〜25であり、そして細胞外ドメインは、配列番号17の残基48〜529である。Ztnf12x2の細胞外ドメインは、２種のTNFドメインを含んで成る。Ztnf12x2の第１のTNFドメインは配列番号17の位置192で開始し、そして位置391で終結する。Ztnf12x2の第２TNFドメインは配列番号17の位置394で開始し、そして位置529で終結する。当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして＋/−３又はそれよりも多くのアミノ酸差異であり得ることを理解するであろう。
Ztnf12の遺伝子構造体の分析は、それが他のTNFリガンドとの類似性を有することを示す。Ztnf12x1ポリヌクレオチド配列の第１エキソンは、配列番号１のヌクレオチド１〜211に及ぶ。Ztnf12×1ポリヌクレオチド配列の第２エキソンは、配列番号１のヌクレオチド212〜269に及ぶ。Ztnf12x1ポリヌクレオチド配列の第３エキソンは、配列番号１のヌクレオチド270〜1650に及ぶ。Ztnf12x2ポリヌクレオチド配列の第１エキソンは、配列番号16のヌクレオチド１〜295に及ぶ。Ztnf12×2ポリヌクレオチド配列の第２エキソンは、配列番号16のヌクレオチド296〜353に及ぶ。Ztnf12x2ポリヌクレオチド配列の第３エキソンは、配列番号16のヌクレオチド354〜1566に及ぶ。３種のエキソン構造体を共有する、TNFリガンドファミリーの他のメンバーは、TNFβ、OX40L、CD27L、41BBL及びGITRLを包含する。さらに、ファミリーメンバー間の進化関係を包含するそれらのTNFリガンドのイントロン相は保存される。
配列番号１により表されるようなZtnf12遺伝子は、染色体17p13.1上に位置し、そして他のTNFリガンド、Tweak及びAPRILから上流（約150kb）に及びもう１つのTNF、Ztnf11から5kb離れて位置する。同じタンパク質ファミリーからの遺伝子はしばしば、同じ染色体上でお互い接近して位置する。
当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして既知のタンパク質との一列整列、タンパク質折りたたみの予測に基づかれていることを認識するであろう。
TNFファミリーのメンバーであるほとんどのタンパク質は、下記式：
［GPLIVMFY］-X-[TLIPVMFY]-X-X-X-G-[LIVMFY]-[FYWS]-[GSLIVMFY]-[HQLIVMFY]（配列番号12）
により表される保存された中心疎水性TNFコンセンサスモチーフにより認識され得る。Ztnf12においては、このモチーフは２度、表される。
モチーフの１つは、配列番号２のアミノ酸211〜221に位置し、そして配列番号８により表される。第２モチーフは、配列番号２のアミノ酸366〜375に位置し、そして配列番号９により表される。モチーフの１つは、配列番号17のアミノ酸239〜249に位置する。第２モチーフは、配列番号17のアミノ酸394〜404に位置する。これは、Ztnf12x2におけるTNFドメインのタンデム反復体を示す。これは、Ztnf12におけるTNFドメインのタンデム反復体を示す。このタイプのタンデムTNF折りたたみがまた、Zacrp4にも見られる。WO公開番号WO/01/02565号、Holloway, J and Lok, Sを参照のこと。
APOZL及びDR5（PDB：1DU3におけるTNF及びTNF受容体）の結晶構造を用いて、APO2Lのペプチドは、TNF受容体と相互作用することが観察される。RANKLとAPO2Lとの間の相同性が与えられると、RNNKと相互作用するRANKLの3D構造が非常に類似することが推定され得る。Ztnf12の相同ペプチドループは、類似する態様でTNF受容体と相互作用する。
腫瘍壊死因子受容体を結合するリガンドとして、Ztnf12の一部がまた細胞から解離し、そして可溶性リガンドを形成することができる。例えば、プロテアーゼ切断部位は、配列番号２の位置125〜137でのZtnf12ポリペプチド配列に位置する。この位置でのZtnf12x1の切断は、可溶性リガンドをもたらすであろう。そのようなリガンドは例えば、配列番号２のアミノ酸残基138〜501のZtnf12x1ポリペプチド（配列番号６）、又は配列番号２のアミノ酸残基140〜501のZtnf12x1ポリペプチド（配列番号７）を含む。さらに、可溶性TNFドメインを含んで成るZtnf12x1ポリペプチド、すなわち配列番号10及び/又は配列番号11で示されるようなZtnf12x1ポリペプチドは、可溶性TNFリガンドであろう。
同様に、Ztnf12x1として、配列番号10及び配列番号11におけるTNFドメインは、タンデム反復体、すなわち配列番号２のアミノ酸164〜501の可溶性ポリペプチドを含んで成る。可溶性リガンドの追加の例として、Ztnf12は、細胞内分離され、そして膜結合形の分解を通してではなく、細胞分泌経路により生成され得る。TNFリガンド、すなわちAPRILは、そのような態様で発現され、そしてプロセッシングされる。Ztnf12x1細胞外ドメインのそのような可溶性リガンドは、配列番号２のアミノ酸54〜501の細胞外ドメインを包含するであろう。他の分解位置は、配列番号２のアミノ酸残基51と130との間で可能である。
腫瘍壊死因子受容体を結合するリガンドとして、Ztnf12x2の一部がまた細胞から解離し、そして可溶性リガンドを形成することができる。例えば、プロテアーゼ切断部位は、配列番号17の位置153〜165でのZtnf12x2ポリペプチド配列に位置する。この位置でのZtnf12x2の切断は、可溶性リガンドをもたらすであろう。そのようなリガンドは例えば、配列番号17のアミノ酸残基166〜529のZtnf12x2ポリペプチド、又は配列番号17のアミノ酸残基168〜529のZtnf12x2ポリペプチドを含む。
さらに、可溶性TNFドメインを含んで成るポリペプチドは、可溶性TNFリガンドであろう。同様に、配列番号17のアミノ酸192〜529のZtnf12x2ポリペプチドは可溶性ポリペプチドであろう。可溶性リガンドの追加の例として、Ztnf12x2は、細胞内分離され、そして膜結合形の分解を通してではなく、細胞分泌経路により生成され得る。TNFリガンド、すなわちAPRILは、そのような態様で発現され、そしてプロセッシングされる。細胞外ドメインのそのような可溶性リガンドは、配列番号17のアミノ酸81〜529の細胞外ドメインを包含するであろう。他の分解位置は、配列番号17のアミノ酸残基81と166との間で可能である。
TNFリガンド及びTNF受容体は、自己免疫疾患、造血、炎症、細胞欠損、異常細胞増殖、アポプトシス及び癌を調節するために臨床学的に有用である。例えば、TNFリガンド、例えばTNFα、Apo2L/TRAIL及びBAFF、及びTNF受容体、例えばTNF-R1、OPG9、TACI-Fc10及びBAFF-R11は、ヒト臨床実験において調べられ、又はすでに市販されている。
対応するTNFリガンドが知られているTNF受容体の他に、TNFリガンドが結合することが示されているいくつかの“孤児”TNF受容体が存在する。それらは、例えばTROY、 RELT、 DR6及びpMK61を包含する。DR6は、死亡ドメインを含み、そしてアポプトシスを誘発する。その発現プロフィールは、いくつかのリンパ組織を含み、そして前立腺/乳癌において高められる。Pan, G. など. FEBS Letters 431: 351-356 (1998)を参照のこと。DR6及びその対応するリガンドは、T細胞増殖、Tヘルパー分化、及びB細胞増殖及びヒト免疫応答において役割を演じることができる。Liu, J. など. Immunity 15 : 23-34 (2001); Schmidt, C. S. など. Med. 197: 51-62 (2003); 及び Zhao, H. など. J. Exp. Med. 194: 1441-1448 (2001)を参照のこと。
TROY、すなわちEDA−R株受容体の発現パターンは、広く見え、そして胚の後期発生段階及び免疫系における発現を包含する。Kojima, T. など. J. Biol. Chem. 275: 20742-20747 (2000)を参照のこと。RELT（リンパ組織において発現される重要体）は、リンパ−特異的であり、そしてT細胞増殖w/CD3を同時刺激することが示されている。Sica, G. L. など. Blood 97: 2702-2707 (2001)を参照のこと。RELT−Fc−ビオチンはまた、流れによりPHA/イノマイシン活性化されたCD3＋細胞を結合する。TNF受容体、すなわちpMK61は、末梢リンパ器官において発現される。IFN-gは、U937及びJurKatへのpMK61−Fc結合を増強し、そしてpMK61−Fcは一次脾臓細胞におけるIg生成を阻害する。Ztnf12は、対応するリガンドが知られているTNF受容体に結合するリガンドであり得る。Ztnf12はまた、“孤児”TNF受容体のためのリガンドでもあり得る。
Ztnf12の組成分布の分析は、Haman Multiple Tissue及びMaster Dot Blotsを用いてのノザンブロット技法により行われ得る。そのようなブロットは、市販されており（Clontech, Palo Alto, CA）、そして当業者に知られている方法によりプローブされ得る。また、例えばWu W.など., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press LLC, 1997を参照のこと。さらに、本発明のポリヌクレオチドの部分は、配列データベースを調べ、そして配列が由来する組織を同定することによって同定され得る。本発明のポリヌクレオチドの部分は、精巣、胚細胞、及び脳ライブラリーにおいて、並びに肺、精巣及びB-細胞のプールから製造されたライブラリーから同定されている。
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるZtnf12ポリペプチドをコードするDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、配列番号２のZtnf12x1ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号18は、配列番号16のZtnf12x2をコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者はまた、配列番号３及び18の縮重配列がU（ウラシル）とT（チミジン）とを置換することによって、配列番号2及び17をコードするすべてのRNA配列も供給することを理解するであろう。従って、配列番号３のヌクレオチド１又は927を含んで成るZtnf12ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、本発明により包含される。
表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３及び18内に使用される1文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC（シトシン）又はTのいずれかを示し、そしてその相補体RはA（アデニン）又はG（グアニジン）を示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
Figure 2007535307
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号3及び18に使用される縮重コドンが表２に示される。
Figure 2007535307
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980; Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６; Wain−Hobson、など.,Gene 13：355−64，1981；Grosjean and Fiera，Gene 18：199−209、1982；Holm,Nuc．Acids Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97，1982を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(表２を参照のこと)。
例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったThrコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３及び18に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１の類似するサイズの領域に対して、又はそれに対して相補的な配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的な緊縮条件は、塩濃度がpH７で約0.03Mまでであり、そして温度が少なくとも約60℃であるそれらの条件である。前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。
DNA及びRNAを単離するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、RNAは、他の組織からのRNAを用いて調製され、そしてゲノムDNAとして単離されるが、精巣からRNAを単離することが好ましい。全RNAは、グアニジウム HCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979）。ポリ（A）+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(ｃDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ（A）+ RNAから調製される。次に、Ztnf12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより同定され、そして単離される。
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトZtnf12遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。配列番号１に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。Ztnf12ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
本発明はまた、診断用途に使用される試薬を提供する。例えば、Ztnf12遺伝子、すなわちZtnf12 DNA又はRNA又はその副配列を含んで成るプローブは、Ztnf12遺伝子がヒト染色体、例えば染色体５上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。Ztnf12は、染色体５の17p13.1領域に位置する。Ztnf12遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、異種性の損失（LOH）、トランスロケーション、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
それらの異常性は、コード配列内、イントロン内、又は上流のプロモーター及び調節領域を包含するフランキング配列内で発生することができ、そしてコード配列内での物理的変更、又は遺伝子発現レベルでの変化として明らかである。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（RELP）分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体（STR）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Sambrookなど., 前記；Ausubel など., 前記；Marian, Chest 108: 255-65, 1995）。
遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばYAC, BAC又はcDNAクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
当業者は、17p13.1領域が、種々の癌に関連する、全体的なゲノム転位、例えばトランスロケーション、欠失、逆位及び重複に包含され得ることを認識するであろう。例えば、The Database of Chromosomal Aberrations in Cancer, at the Cancer Genome Anatomy Project, National Institutes of Health, Bethesda, Mdを参照のこと。
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−Ztnf12抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、Ztnf12 ポリペプチド、mRNA又は抗−Ztnf12 抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
さらに、Ztnf12 ポリヌクレオチドプローブは、染色体17p13.1欠失、及びヒト疾病に関連するトランスロケーション、又は腫瘍の悪性進行に関与する他のトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転移に関与すると思われる他の17p13.1突然変異に関連する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。同様に、Ztnf12ポリヌクレオチドプローブは、染色体５トリソミーに関連する異常性又は遺伝子型、及びヒト疾病又は自然流産に関連する染色体欠失を検出するために使用され得る。従って、Ztnf12ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠陥に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
当業者は、Ztnf12ポリヌクレオチドが、異種性の欠失（LOH）、染色体獲得（例えば、トリソミー）、トランスロケーション、DNA増幅及び同様のものに関連する全体的な染色体異常性の診断のために特に有用であることを認識する。Ztnf12遺伝子が位置する染色体遺伝子座17p13.1内のトランスロケーションは、ヒト疾病に関連することが知られている。例えば、従って、Ztnf12遺伝子はこの決定的領域に位置するので、本発明のZtnf12ポリヌクレオチドプローブは、上記のような12q24トランスロケーション、欠失及びトリソミーに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
上記で論じられるように、Ztnf12遺伝子自体における欠陥は、遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、Ztnf12遺伝子欠陥に関連する疾病の検出、診断予防及び処理を助ける。さらに、Ztnf12ポリペプチドプローブは、Ztnf12染色体遺伝子座で、疾病又は非疾病の個人間での対立遺伝子差異を検出するために使用され得る。それ自体、Ztnf12配列は、法的なDNAプロフィーリングにおける診断として使用され得る。
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために、遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に少なくとも20ntの長さであるが、但し幾分、短いプローブも使用され得る（例えば、14〜17nt）。PCRプライマーは、少なくとも5ntの長さ、好ましくは15nt又はそれ以上、より好ましくは20〜30ntである。遺伝子又は染色体DNAの全体的な分析のためには、Ztnf12ポリヌクレオチドは完全なエキソン又はそれ以上を含んで成ることができる。エキソンは、当業者により容易に決定される。
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために、遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。ほとんどの診断方法は、
（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；
（ii）Ztnf12ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、RFIP分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なPCR反応条件下でPCR反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；
（iii）前記第１反応生物を、電気泳動及び/又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、Ztnf12ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして
（iv）野生型患者からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、PCR生成物の長さ、Ztnf12遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な野生型対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。
本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムDNA、mRNA及びcDNAを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、RNA又はDNAであり得、そして配列番号１の一部、配列番号１の補体、又はそれらのRNA同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
診断における、PCRに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed), PCR Protocols; Current Methods and Applications (Humana Press, Inc, 1993), Cotter (ed), molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols。(Humana Press, Inc. 1998). Lo (ed), Clinical Application of PCR (Humana Press, Inc. 1998), 及びMeltzer (ed), PCR in Bioanalysis (Humana Press. Inc. 1998))。
Ztnf12遺伝子座に関連する突然変異は、直接的な突然変異分析のための標準方法、例えば制限フラグメント長さ多型現象分析、RCR技法を用いての短いタンデム反復体分析、増幅―無反応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、RNアーゼ分解方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析技法を用いることにより、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、次の文献を参照のこと：Mathew (ed), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991),Marian, Chest 108:255 (1995). Coleman and Tsongalis, molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press. Inc. 1996), Landegren (ed.) Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren など. (eds.) Genome Analysis Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998). Dracopoli など. (eds.) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998). 及びRichards and Ward, “Molecular Diagnostic Testing,” in Preineiples of Molecular Medicine, pages 83-88 (Humana Press , luc. 1998)。
突然変異についてのZtnf12遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムDNAを用いて行われ得る。例えば、末梢血液リンパ球から得られるゲノムDNAを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Dracopoliなど. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, p7.1.6-7.1.6 (John Wiley & Sons 1998) を参照のこと。
本発明はさらに、他の種（“種オルト体”）からの相対リガンド及びポリヌクレオチドを提供する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、ネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのZtnf12リガンドポリペプチドである。ヒトZtnf12の種オルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、リガンドを発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。ｍRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン ブロットをプローブすることによって同定され得る。
次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。次に、Ztnf12−コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃDNAの発現がZtnf12に対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
Ztnf12の他の種ポリペプチドは、治療的に重要である。多くの場合、非生来のタンパク質、すなわち異なった種からのタンパク質の使用はその生来のタンパク質よりもより有能であり得ることが示されている。例えば、サケカルシトニンは、ヒトカルシトニン形よりも、骨再吸収の阻止において相当により効果的であることが示されている。サケカルシトニンがオステオポローシスの処理において、ヒトカルシトニンよりもより有能である理由についてのいくつかの仮説が存在する。それらの仮説は、１）サケカルシトニンが分解に対してより耐性であり；２）サケカルシトニンが遅い代謝クリアランス速度（MCR）を有し；そして３）サケカルシトニンが骨受容体部位のための高い親和性をもたらすわずかに異なったコンホメーションを有することを包含する。
もう1つの例は、β−エンドロフィンファミリーにおいて見出される（Hoなど., Int. J. Peptide Protein Res. 29: 521-4, 1987）。研究は、ラクダ、馬、七面鳥及びダチョウβ−エンドロフィンの末梢オピオイド活性は、単離されたテンジュクネズミ回腸が電気刺激され、そして収縮が測定される場合、ヒトβ−エンドロフィンのその活性よりも高いことを示している。ラット、マウス及びウサギからの精管が同様にアッセイされた。
ラット精管モデルにおいては、ラクダ及び馬β−エンドロフィンが、最高の相対的性能を示した。合成されたラットレラキシンは、マウス恥骨結合においてヒト及びブタレラキシンと同じほど活性的であった（Bullesbach and Schwabe, Eur. J. Biochem. 241: 533-7, 1996）。従って、本発明のマウスZtnf12分子は、ヒト細胞、組織及び受容体においてヒト内因性分子よりも高い能力を有する。マウスZtnf12についてのポリヌクレオチド及びポリペプチドが、それぞれ配列番号13及び４で提供される。
本発明はまた、配列番号２のリガンドポリペプチドに対して実質的に相同である単離されたポリペプチド及びその種オルト体を提供する。好ましい形においては、単離されたタンパク質又はポリペプチドは、他のタンパク質又はポリペプチド、特に動物起源の他のタンパク質又はポリペプチドを実質的に有さない。より高く精製された形、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％以上の純度の形でタンパク質又はポリペプチドを提供することが好ましい。用語“実質的に相同である”とは、配列番号２で示される配列に対して、50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質又はポリペプチド、又はその種オルト体を示すために、本明細書において使用される。
そのようなタンパク質又はポリペプチド、又はその種のオルト体又はパラ体は、より好ましくは、配列番号２に対して少なくとも90％、及び最も好ましくは95％又はそれ以上、同一であろう。％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum 62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
Figure 2007535307
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような比率を用いて、類似する方法により決定される。
Figure 2007535307
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約30個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
従って、本発明は、配列番号２のその対応する領域に対して、少なくとも60％、好ましくは少なくとも80％、及びより好ましくは90％、及びさらにより好ましくは95％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、184〜1000個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、Ztnf12ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Xa因子分解部位を含む。
Figure 2007535307
20個の標準アミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）が、本発明のZtnf12ポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに使用され得る。制限された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ztnf12ポリペプチドアミノ酸の代わりに使用され得る。本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基も包含することができる。
天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
例えば、ナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 1993)。
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ztnf12アミノ酸により置換され得る。
本発明のZtnf12ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989)。生物学的相互作用の部位は、例えばZTNF12ポリペプチド−システインプロテイナーゼインヒビター−酵素相互作用はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関連して、核磁気共鳴、結晶学、電気回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos など., Science 255: 306, 1992, Smithなど., J. Mol. Biol. 224: 899, 1992, 及びWlodaverなど., FEBS Lett. 309: 59, 1992 を参照のこと。必須アミノ酸の同一性はまた、関連するシステインファミリーメンバーとの相同性の分析からも推定され得る。
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。
開示されるZtnf12 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WO97／20078により開示されるように、DNA シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNA分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
上記に開示されるような突然変異誘発方法は、クローン化された突然変異誘発されたリガンドの活性を検出するために高処理量のスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性リガンド又はその一部（例えば受容体−結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
上記に論じられる方法を用いて、当業者は、可溶性リガンド又は対立遺伝子変異体に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質の受容体−結合性質を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。可溶性リガンドの例は上記に列挙される。そのようなポリペプチドは、トランスメンブラン、リンカー及び/又は細胞質ドメインからの追加のアミノ酸；親和性標識；及び同様のものを包含することができる。そのようなポリペプチドはまた、一般的に上記に開示されるように、追加のポリペプチドセグメントも含むことができる。
本発明のリガンドポリペプチド、例えば十分な長さのリガンドポリペプチド、リガンドフラグメント（例えば、受容体−結合フラグメント）及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は次の文献に開示される：Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusubel など., eds., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1987。
変異体及び融合タンパク質を包含するZtnf12ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分に変性したポリヌクレオチドを容易に生成することができる。
一般的に、本発明のZtnf12ポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
Ztnf12ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、もう１つの分泌されたタンパク質（例えばt−PA ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、Ztnf12 DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリペプチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
TNFリガンド及びTNF受容体ファミリーのマルチマー複合体は生物学的に活性であることが知られているので、もう１つのTNFリガンドとZtnf12との融合タンパク質を調製することは有用である。それらの融合体のZtnf12部分は、上記で論じられるような、完全に成熟した可溶性タンパク質（すなわち、細胞外部分）、又は他の可溶性Ztnf12 TNFドメインフラグメントであり得る。例えば、APRIL及びBAFFは、ヘテロトリマーリガンドを形成することができる。従ってZtnf12はもう１つのTNFリガンドと共に、マルチマー、ダイマー、トリマー、ヘテロダイマー及びヘテロトリマー（但し、それらだけには限定されない）を形成することができる。そのようなリガンドは、例えばAPRIL, Tweak, Lt-Beta, Lt-Beta, ztnf4, CD-27リガンド及びRANK-Lを包含することができる。
前記融合タンパク質は、他のTNFリガンドのアミノ末端、続いてそのカルボキシル末端で、Ztnf12ポリヌクレオチド配列又はその一部により調製され得る。同様に、Ztnf12ポリペプチド又はそのフラグメントは、その対応するTNF受容体を結合することによって、APRIL、Tweak、Lt-Beta、ztnf4、CD-27リガンド及び/又はRANK-L活性のアゴニストとして使用され得る。RANK-Lの例に関しては、TNF受容体、すなわちRANKの結合が破骨細胞活性をもたらすであろう。（Li, J. など., P.N.A.S. 1566-1571, 2000を参照のこと）。他方では、それらのポリペプチドは、その対応するTNF受容体を結合することにより、しかし細胞内シグナルをもたらさないことによって、APRIL、Tweak、Lt-Beta、ztnf4、CD-27リガンド及び/又はRANK-L活性のインヒビターとして使用され得る。
上記で論じられるように、Ztnf12ポリペプチドは、受容体結合を促進するためにトリマーを形成するであろう。しかしながら、トリマー複合体を形成するためにTNF受容体ポリペプチドを必要としないことは、注目すべきである。Bazzoni (Bazzoni, F. など., P. N. A. S. 92: 5376-5380, 1995)は、いくつかのTNF受容体に関して、二量体化（三量体化又はそれ以上の高次多量体化よりもむしろ）が十分であることを示している。従って、Ztnf12ポリペプチドは、ダイマー、トリマー、マルチマー又はその組合せとして有用であり得る。例えば、Ztnf12トリマーをいかにして製造するかは、例えばWu, X.など.,Mol. Ther. 3:368-374, 2001を参照のこと。
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973）,エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など., 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 ）を包含する。培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950 号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ特許第 4,656,134 号により開示される。
培養された適切な哺乳類細胞は、COS−1（ATCC No. CRL 165）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293（ATCC No. CRL 1573 ; Graham など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 ）、及びチャイニーズ ハムスター卵巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばCD4, CD8,クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は、Sinkarなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarino など.,アメリカ特許第5,162,222号；及びWIPO公開WO94／06463号により公開される。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Autographa californica ）核多角体病ウィルス（AcNPV）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。
Ztnf12ポリペプチドをコードするDNAは、２種の方法の１つにより、AcNPVポリヘドリン遺伝子コード配列の代わりに、バキュロウィルスゲノム中に挿入される。前記第１の方法は、野生型AcNPVと、AcNPV配列を端に有するZtnf12を含むトランスファーベクターとの間での相同DNA組換えの従来の方法である。適切な昆虫細胞、例えばSF9細胞は、野生型AcNPVにより感染され、そしてAcNPVポリヘドリン遺伝子プロモーター、ターミネーター及びフランキング配列に作用可能に連結されるZtnf12ポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによりトランスフェクトされる。King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Baculovirus Expression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照のこと。
昆虫細胞内での天然の組み換えは、ポリペプチドプロモーターにより駆動されるZtnf12を含む組換えバキュロウィルスをもたらすであろう。組換えウィルスストックは、当業界において通常知られている方法により製造される。
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。このシステムは、Bac−to−BacTMキット（Life Technologies, Rockville, MD）として市販されている。
このシステムは、“bacmid” と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Ztnf12ポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。pFastBaclTM トランスファーベクターは、興味ある遺伝子、この場合、Ztnf12の発現を誘導するためにAcNPVポリヒドリンプロモーターを使用する。しかしながら、pFastBaclTMは相当の程度まで修飾され得る。
前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又はMPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のZtnf12分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67（PharMingem, San Diego, CA)は、生来のZtnf12分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
さらに、トランスファーベクターは発現されたZtnf12ポリペプチドのC−又はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピトープ標識（Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）又はFLAG標識をコードするDNAとのイン−フレーム融合体を含むことができる。当業界において知られている技法を用いて、Ztnf12を含むトランスファーベクターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda ）細胞、例えばSf9 細胞をトランスフェクトするために使用される。Ztnf12を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するHigh FiveOTM細胞系(Invitrogen)である（アメリカ特許第5,300,435号）。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。
適切な培地は、Sf9細胞のためには、SF900IITM (Life Technologies),又はEST 921TM(Expression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405TM（JRH Biosciences, Lenza, KS）又はExpress FiveOTM(Life Technologies )である。細胞は、約２〜５×105個の細胞〜１〜２×106個の細胞の接種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1〜10,より典型的にはほぼ３の感染の多重度（MCI）で添加される。組換えウィルス−感染された細胞は典型的には、12〜72時間の感染後で、組換えZtnf12ポリペプチドを生成し、そしてそれを、種々の効率を伴って培地中に分泌する。
培養物は通常、48時間の感染後、収穫される。遠心分離が、培地（上清液）から細胞を分離するために使用される。Ztnf12ポリペプチドを含む上清液は、通常0.45μmの孔サイズの微小孔フィルターを通して濾過される。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（King, L. A. and Possee, R. D., 前記; O’Reilly, D. R. など., 前記；Richardson, C. D., 前記）。上清液からのZtnf12ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pichia methanolica) を包含する。外因性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照のこと。
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、WIPO公開WO97／17450, WO97／17451、WO98／02536及びWO98／02565に開示される。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ アルコール利用遺伝子（AUG１又はAUG２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。
ピチア メタノリカの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP４及びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。
エレクトロポレーションが、P.メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（Ω）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
原核宿主細胞、例えば細菌E.コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性DNA配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Sambrookなど., 前記を参照のこと）。細菌、例えばE.コリにおいてZTNF12ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。
前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％D−グルコース、２％のBactoTMペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI）, 1%のBactoTM 酵母抽出物（Difco Laboratories）, 0.004%のアデニン及び0.006％のL−ロイシン）である。
発現された組換え体Ztnf12ポリペプチド（又はキメラZtnf12ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましく、そしてDEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia, Piscataway, NJ)が特に、好ましい。
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharmacia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。
本発明のポリペプチドは、それらの物性の開発より単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( E.Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。
他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ( ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529−39）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばGlu-Gku、FLAG、マルトース−結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
タンパク質折りたたみ（及び任意には、再酸化）方法が好都合には使用され得る。タンパク質を80％以上の純度、より好ましくは90％以上の純度、さらにより好ましくは95％以上の純度に精製することが好ましく、そして医薬的に純粋な態様、すなわち汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して、99.9％以上の純度が好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さないことが好ましい。好ましくは、精製されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に有さない。
Ztnf12ポリペプチド、又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。Ztnf12ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペルギレ−ト化されても又はペルギレ−トされなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
本発明はまた、可溶性Ztnf12リガンドも提供する。可溶性リガンドは、配列番号２のアミノ酸残基138〜501（配列番号６）；配列番号２のアミノ酸残基140〜501からのポリペプチド（配列番号７）、配列番号10で示されるようなポリペプチド、配列番号11で示されるようなポリペプチド、配列番号２のアミノ酸残基164〜501のポリペプチド、配列番号17のアミノ酸残基166〜529のポリペプチド、及び/又は配列番号17のアミノ酸残基168〜529のポリペプチド、又は非ヒトリガンドのその対応する領域を含んで成る。そのような可溶性ポリペプチドは、ヒトIgとの融合タンパク質を形成するために、His−標識されたタンパク質として、又はN- 又はC−末端FLAGTM−標識されたタンパク質（Hoppなど., Biotechnology6：1204−10,1988）又はGlu−Glu標識されたタンパク質として使用され得る。
好ましくは、細胞外受容体−結合ドメインポリペプチドは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製される。例えば、受容体−結合ドメインのN−末端は、配列番号２のアミノ酸残基54、138、140、164又は363で、又は対立遺伝子変異体又は非ヒトリガンドのその対応する領域で存在することができる。宿主細胞からの可溶性リガンドの輸送を方向づけるために、切断されたリガンドDNAは、分泌ペプチド、例えばｔ−PA分泌ペプチドをコードする第２DNAセグメントに連結される。分泌された可溶性リガンドの精製を促進するために、C−末端延長、例えばポリ−ヒスチジン標識、物質P、Flagペプチド（Hoppなど., 前記; Eastman Kodak Co. New Haven, CTから入手できる）、又は抗体又は他の特定の結合剤が利用できるもう1つのポリペプチド又はタンパク質が、N又はC末端のいずれかで、可溶性リガンドポリペプチドに融合され得る。
他のアプローチにおいては、細胞外受容体−結合ドメインは、２種の不変領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可溶領域を欠いている、免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的にはFcフラグメントを有する融合体として発現され得る。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでFc部分は、お互いジスルフィド結合され、そして２種のリガンドポリペプチドは、お互い密接に接近して整列される。このタイプの融合体は、インビトロアッセイ手段として、溶液から同起源の受容体を親和性精製するために、そして内因性リガンドを特異的に滴定するか、又は阻止することによってシグナルをインビトロで阻止するために使用され得る。
可溶性受容体を精製するためには、Ztnf12−Ig融合タンパク質（キメラ）が、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理温度に近い温度、pH及びイオン強度）下で、可溶性受容体を含むサンプルに添加される。次に、キメラ−受容体複合体が、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定されているプロテインAを用いて、前記混合物により分離される。次に、受容体が、従来の化学的技法、例えば塩又はpHグラジエントを用いて溶出される。他においては、キメラ自体が、上記のようにして行われる結合及び溶出を伴って、固体支持体に結合され得る。集められた画分は、所望する純度レベルに達するまで、再分別され得る。
アッセイへの使用に関しては、キメラは、Fc領域を通して支持体に結合され、そしてELISAに使用される。逆に言えば、可溶性TNF受容体−Ig融合タンパク質は、リガンドが同定されなかったTNF受容体を用いて製造され得る。次に、可溶性Ztnf12は、受容体融合タンパク質と共に混合され、そして結合が上記のようにしてアッセイされる。キメラは、体液及び細胞免疫性における抗原の阻害のために、及び移植片及び器官移植片における免疫抑制のために、自己免疫工程の阻害において抗−炎症剤としてインビボで使用され得る。キメラはまた、例えば骨髄移植の間、及びいくつかの癌についての治療剤として、リンパ球細胞の成長を刺激するためにも使用され得る。
リガンド−結合受容体(又は抗体、相補体／抗相補体対の１つのメンバー)、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る。そのような受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229−40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mol.Biol. 234: 554−63,1993により開示される。受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。
試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は相補体／抗相補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
Ztnf12ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドは、広範囲の種類のTNF受容体−担持の細胞、例えばT細胞、リンパ球細胞、末梢血液単核細胞、多形核白血球細胞、線維芽細胞、造血細胞及び精巣組織における種々の細胞の増殖及び刺激の調節のために使用され得る。他の腫瘍壊死因子、例えばgp39及びTNFβはまた、B細胞増殖も刺激する。Ztnf12ポリペプチドはまた、代謝又は生理学的工程をインビボで仲介することに使用されるであろう。増殖及び分化は、培養された細胞を用いて、インビトロで測定され得る。バイオアッセイ及びELISAは、Ztnf12に対する細胞応答を測定するために利用でき、特に、細胞応答の測定としてサイトカイン生成の変化を測定するそれらである（例えば、Current Protocols in Immunology ed. John E. Coliganなど., NIH, 1996を参照のこと）。アッセイは、他の細胞応答、例えば抗体イソタイプ、単球活性化、NK細胞形成、抗原提供細胞機能、アポプトシスを測定する。
種々のアッセイがまた、骨形成及び再吸収を測定するために利用できる。それらのアッセイは、例えば血清カルシウムレベル、破骨細胞サイズ及び数、骨芽細胞サイズ及び数、エストロゲン欠損により誘発される骨減少症、遠位大腿骨（マウス）の癌性骨体積、軟骨性成長プレート及び軟骨細胞形成及び分化を測定する。本発明のZtnf12ポリペプチドは、それらのアッセイ、及び本明細書に開示される追加のアッセイ、並びに当業者に容易に知られているアッセイのいずれかにより測定され得る。
もう１つの態様においては、細胞活性化は、3H−チミジン摂取を用いて、増殖を測定することによって決定される（Crowleyなど., J. Immunol. Meth 133:55-66, 1990）。他方では、細胞活性化は、サイトカイン、例えばIL-2の生成により、又は細胞特異的活性化マーカーの存在の決定により測定され得る。サイトカイン生成は、サイトカイン−依存性細胞の増殖を刺激する、Ztnf12及び細胞培養上清液の能力を試験することによってアッセイされる。細胞特異的活性化マーカーは、そのようなマーカーに対して特異的な抗体を用いて、検出され得る。
Ztnf12に対するインビトロ及びインビボ応答はまた、培養された細胞を用いて、又は適切な動物モデルに本発明の分子を投与することによって測定され得る。本発明のタンパク質をアッセイするための１のインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（T. C. Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ i ）アデノウィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ；（ ii ）高い力価に増殖され得；（ iii ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ iv ）異なったプロモーターを含む多数の利用できるベクターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。アデノウィルス遺伝子供給に関連するいくつかの欠点（特に、遺伝子療法に関する）は、(i)宿主ゲノム中への非常に低い効率の組み込み；(ii)主にエピソーム形での存在；及び(iii) アデノウィルスベクターの再投与を除く、投与されたウィルスに対する宿主免疫応答を包含する。
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAのより大きな挿入体（７kbまでの）が適応され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスDNA中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、E１遺伝子が宿主細胞（ヒト293細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがE１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する)。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−293細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。例えば、BHK細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
他方では、アデノウィルスベクター感染された293S細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Garnier など., Cytotechnol. 15: 145−55, 1994 を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液から反復して単離され得る。感染された293S 細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
十分に確立された動物モデルは、一定の疾病状態についてのZtnf12ポリペプチドのインビボ効能を試験するために利用できる。特に、Ztnf12ポリペプチドは、自己免疫疾患の多くの動物モデル、例えばNODマウス、インスリン依存性糖尿病（IDDM）についての自発的モデルシステムにおいて、その動物モデルにおける非応答性の誘発を研究するためにインビボで試験され得る。疾病の開始の前又はその開始の後、Ztnf12ポリペプチドの投与は、NODマウスにおける尿グルコースレベルのアッセイによりモニターされ得る。他方では、自己免疫疾患、例えば実験的なアレルギー性脳炎（EAE）の誘発されたモデルは、Ztnf12ポリペプチドを投与され得る。予防又は介在性態様での投与に続いて、EAEの臨床学的兆候がモニターされ得る。
Ztnf12ポリペプチドはまた、Ztnf12エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, など., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、zFGF12ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。
Ztnf12ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばZtnf12又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばF(ab’)2及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCDRのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（cloaking）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。
多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。Ztnf12ポリペプチドに対して指図されたヒト適合されたモノクローナル抗体は、特に免疫療法剤としての使用のために、タンパク質治療剤として使用され得る。本明細書において有用な抗体を生成し又は選択するための他の技法は、Ztnf12タンパク質又はペプチドへの精巣組織のインビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択（例えば、固定された又はラベルされたZtnf12タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。
抗体は、それらが106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を有するZtnf12ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合するものとして定義される。抗体の結合親和性は、当業者によって容易に決定され得る（例えばScatchard 分析による）。
当業者に知られている種々のアッセイが、Ztnf12タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、ELISA、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のZtnf12タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
Ztnf12に対する抗体は、例えば診断アッセイへの使用のために、ヒトZtnf12を発現する細胞の免疫組織化学的標識のために；アフィニティー精製によりZtnf12を単離するために；発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗-インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでZtnf12を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の相補体／抗−相補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。
可溶性ZTNF9ポリペプチドに対する抗体がまた調製され得る。そのような可溶性Ztnf12ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基138〜501（配列番号６）；配列番号２のアミノ酸残基140〜501からのポリペプチド（配列番号７）、配列番号10で示されるようなポリペプチド、配列番号11で示されるようなポリペプチド、配列番号２のアミノ酸残基164〜501のポリペプチド、及び/又は配列番号17のアミノ酸残基54〜501のポリペプチドを含んで成るそれらを包含する。そのような可溶性ポリペプチドは、His, Glu-Glu又はFLAG標識される。
他方では、そのようなポリペプチドは、ヒトIgと融合タンパク質を形成する。特に、His−、Glu−Glu−又はFLAG−標識された可溶性Ztnf12に対して指図された抗−ポリペプチド抗体を含む抗血清が、ヒト又は霊長類組織に対する免疫組織化学により、Ztnf12を結合する、Ztnf12又は受容体の組織分布の分析に使用され得る。それらの可溶性Ztnf12ポリペプチドはまた、可溶性ヒトZtnf12ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生成するために、マウスを免疫化するためにも使用され得る。可溶性ヒトZtnf12ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、当業界において知られている方法、例えば三色蛍光免疫血球法を用いて、造血細胞分布を分析するために使用され得る。
可溶性ヒトZtnf12ポリペプチドに対するモノクローナル抗体はまた、リガンド/受容体対の活性化又は不活性化をもたらす、リガンド/受容体カップリングを模倣するためにも使用され得る。例えば、架橋性抗−可溶性GP39モノクローナル抗体は、T細胞からB細胞へのシグナルを阻害する（Noelleなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6650, 1992）。Ztnf12に対するモノクローナル抗体は、組織分布研究により同定される特定細胞系、特にT細胞系に対するZtnf12受容体/ Ztnf12リガンド対の分布、調節及び生物学的相互作用を決定するために使用され得る。Ztnf12に対する抗体はまた、生物学的サンプルにおける分泌された可溶性Ztnf12を検出するためにも使用され得る。
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは、配列番号２の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ酸、又は約15〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるようにZtnf12ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997)により記載される。
Ztnf12ポリペプチドはまた、Ztnf12エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。Ztnf12ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するための抗原(免疫原)として作用する。当業者は、抗原性エピトープ−担持のポリペプチドがZtnf12ポリペプチド（例えば、配列番号２）の少なくとも６、少なくとも９及び少なくとも15〜約30個の連続したアミノ酸残基の配列を含むことを認識するであろう。
Ztnf12ポリペプチドの大きな部分、すなわちアミノ酸配列の30〜１０個の残基〜その全体の長さの配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。抗原又は免疫原性エピトープはまた、本明細書に記載されるように、結合された標識、アジュバンド及びキャリヤーを含むことができる。適切な抗原は、配列番号２のアミノ酸番号1〜アミノ酸番号501によりコードされるZtnf12ポリペプチド、又は連続した９〜501個のそのアミノ酸フラグメントを含む。
例示のように、Ztnf12における可能性ある抗原性部位は、LASERGENE（DNASTAR; Madison, WI）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）により実行されるような、Jameson-Wolf Method, Jameson and Wolf, CABIOS4: 181, (1988)を用いて同定された。誤りのパラメーターがこの分析において使用された。
適切な抗原は、配列番号２の残基16〜23、配列番号２の残基65〜84、配列番号２の残基97〜103、配列番号２の残基124〜149、配列番号２の残基160〜168、配列番号２の残基177〜191、配列番号２の残基196〜203、配列番号２の残基252〜265、配列番号２の残基280〜288、配列番号12の残基310〜348、配列番号12の残基233〜239、配列番号２の残基244〜252、配列番号２の残基358〜371、配列番号２の残基375〜384、配列番号２の残基400〜419、配列番号２の残基434〜440、配列番号２の残基449〜456、配列番号２の残基467〜480、配列番号２の残基486〜501、配列番号４の残基16〜24、配列番号４の残基73〜84、配列番号４の残基102〜129、配列番号４の残基138〜146、配列番号４の残基150〜158、配列番号４の残基162〜169、配列番号４の残基184〜192、配列番号４の残基197〜206、配列番号４の残基240〜249、配列番号４の残基275〜280、配列番号４の残基283〜290、配列番号４の残基311〜325、配列番号４の残基333〜353、配列番号４の残基359〜368、配列番号４の残基374〜389、配列番号４の残基394〜401、配列番号４の残基411〜418、配列番号４の残基427〜432、配列番号４の残基437〜444、配列番号４の残基451〜456、配列番号４の残基466〜480、及び配列番号17の残基48〜76を含んで成るアミノ酸を包含する。
それらの抗原による動物の接種により生成される免疫応答からの抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, など., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと。
Ztnf12リガンドポリペプチド及び可溶性Ztnf12リガンドは、TNFRファミリーにおける受容体を同定し、そして特徴付けるために使用され得る。Ztnf12はTNFRファミリーの１つの既知メンバー、例えばTNFを結合し、そしてリンフォトキシン−αはTNF受容体に結合する。本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson など., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp.195-202）。タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Methods in Enzymol., vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737）、又は光親和性ラベルされ（Brunner など., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993及びFedan など., Biochem. Pharnacol. 33: 1176-1180, 1984）、そして特定の細胞−表面タンパク質が同定され得る。
可溶性リガンドは、組織又は特定細胞系上での受容体の分布の研究において、及び受容体/リガンド生物学の研究において有用である。受容体−担持の標的細胞を破壊する機構として、それらの受容体に対するTNFリガンドの特異性がまた利用され得る。例えば、毒性化合物は、Ztnf12リガンド、特に可溶性リガンドにカップリングされ得る（Mesriなど., J. Biol. Chem. 268: 4853-62, 1993)。毒性化合物の例は、標的細胞を不活性化する放射性医薬；化学療法剤、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート及びサイトキサン；トキシン、例えばリシン、ジフテリア、シュドモナス内毒素A及びアブリン；及び細胞毒性T−細胞表面分子に対する抗体を包含する。
TNFリガンドとして、Ztnf12は、造血、炎症、細胞欠損、異常細胞増殖、アポプトシス、癌、及び免疫/又は炎症応答の急性及び慢性障害を処理するために有用であろう。炎症は通常、損傷剤、及び損傷された組織を破壊し、希釈し、又は隔てる、トラウマ又は微生物侵入に対する、局在化された保護応答である。炎症により特徴づけられる疾病は、ヒトにおける罹病率及び死亡率の有意な原因である。炎症は通常、有害な剤及び損傷された組織を破壊し、希釈し、又は隔てる外傷又は微生物侵入に対する局在化された保護応答である。
炎症により特徴づけられる炎症は、ヒトにおける羅病率及び死亡率の有意な原因である。炎症は通常、外来性材料による宿主の侵入に対する防御応答として生じるが、それはまた、機械的外傷、毒素及び新形成に対する応答により誘発される。外来物として宿主組織の異常認識により引き起こされる過剰炎症、又は炎症工程の延長はまた、炎症性疾患、例えば糖尿病、喘息、アテローム性硬化症、白内障、再灌流性損傷、癌、後−感染性症状、例えば感染性髄膜炎及びリウマチ性発熱及びリウマチ性疾患、例えば全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎を導く。Ztnf12が処理のために使用され得る追加の炎症状態は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病及び刺激性腸症候群を包含する。
Ztnf12、その類似体、アゴニスト及び/又はアンタゴニストのLPS−誘発された軽い内毒素血症のマウスモデルにおける効果が、強い炎症応答の間、治療候補体の実質的な抗−炎症効果を測定するために使用され得る。このモデルは、低い、非致死性用量の細胞内毒素（リポ多糖、LPS）によりマウスを攻撃することによる急性内毒性血症/敗血症を模倣する。血清を、腹腔内LPS注入の後、種々の時点（１〜８時間）で集め、そして広範囲の種類の前−及び−抗−炎症性サイトカイン、及び炎症応答を仲介する急性相タンパク質の変更された発現について分析した。例えば、生後6ヶ月のBal/c（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）雌マウスを、無菌PBS中、25μgのLPS（Sigma）により腹腔内（i.p.）注射した。
血清サンプルを、個々の時点で、８匹のマウスのグループから０，１，４，８、16、24、48及び72時間で集める。血清サンプルが炎症性サイトカインレベルについてアッセイされる。炎症メディエーター、例えばIL−１β、IL−６、TNFα及びIL−10レベルが、Biosource International（Camarillo, CA）から購入された市販のELISAキットを用いて測定される。次にC57B1/6マウス（Charles River Laboratories; ５匹のマウス/グループ）が、PBS、又はPBS中、種々の濃度のZtnf12、その類似体、アゴニスト及び/又はアンタゴニストにより、LPS攻撃の１時間前、i.p. 処理され得る。次に、マウスは、25μgのLPSによりi.p. 攻撃され、そしてLPS注射の１及び４時間後、放血される。血清が、ELISAにより炎症性メディエーターレベルについて分析される。
免疫応答を測定するためのもう1つのモデルは、特定の抗原に対するT細胞応答を測定する遅延されたタイプの過敏性（DTH）モデルである。このモデルにおいては、マウスは、アジュバント（例えば、ニワトリオボアルブミン、OVA）中、特定のタンパク質により免疫化され、そして次に、耳において同じ抗原（アジュバントなシ）により攻撃される。前記攻撃の後、耳の厚さの上昇（カリパスにより測定された）は、抗原に対する特定免疫応答の測定である。
DTHは、３種の明確な相、１）T細胞が抗原提供細胞（APC）の表面上に提供される外来性タンパク質抗原を認識する相、２）T細胞がサイトカイン（特に、インターフェロンγ、IFN−γ）を分泌し、そして増殖する活性化/感作化相、及び３）炎症（活性化されたマクロファージ及び好中級の浸潤を包含する）及び感染の究極的な解決の両者を包含するエフェクター相において生じる細胞−介在性免疫性の形である。この応答は、細胞内細菌に対する一時防御機構であり、そして可溶性タンパク質抗原又は化学的反応性ヘプテンにより誘発され得る。
従来のDTH応答は、ヒト結核菌（TB）からの精製されたタンパク質誘導体（PPD）により攻撃された個人において、それらの注射された個人が一次TBから回復されるか、又はTBに対してワクチン接種されている場合に生じる。硬化、すなわちDTHの顕著な特徴が、抗原の注入の約18時間後までに検出され、そして24〜48時間で最大である。触診できる硬化の開始の遅延は、応答“遅延された型”を命名するための理由である。すべての種において、DTH反応は、DTH, IFN−γに関与する主要開始サイトカインを生成する、抗原−感作されたCD4+（及び少ない程度のCD8+）T細胞の存在に臨床学的に依存する。
DTHモデルにおけるZtnf12の抗−炎症効果について試験するために、C57Bl/6マウスを、PBS、及び種々の濃度のZtnf12、その類似体、アゴニスト及び/又はアンタゴニストにより処理する。すべてのそれらの処理は、OVA再攻撃の２時間前、腹腔内に行われた。マウス（グループ当たり８匹）を最初に、200μlの合計体積で、Ribiにおいて乳化された、100μgのニワトリオボアルブミン（OVA）により背部に免疫化した。7日後、マウスを10μlのPBS（対照）により左耳に、又はPBS中、10μgのOVA（アジュバントなし）により右耳に、10μlの体積で皮下的に再攻撃した。すべてのマウスの耳の厚さを、マウスの耳に注入する前に測定した（O測定）。耳の厚さを、攻撃の24時間後、測定した。0測定と24時間測定との間の耳の厚さの差異が、記録される。PBS処理グループにおける対照マウスは、24時間後の攻撃での耳の厚さの上昇により示されるように、強いDTH反応を進行した。PBS対照に比較して、耳の厚さの低下は、Ztnf12、その類似体は、アゴニスト及び/又はアンタゴニストが、炎症応答を低め、制限し、又は改善できることを示すであろう。
本明細書に記載される生活性ポリペプチド又は抗体接合体は、静脈内、動脈内又は管内投与され得るか、又は意図される作用の部位で局部的に導入され得る。
さらに、炎症は、侵入剤を受けとめるための生物による保護応答である。炎症は、多くの細胞及び体液メディエーターを包含する段階的に連続した現象である。他方では、炎症応答の制御は宿主を免疫無防備状態にするが、しかしながら、抑制されなければ、炎症は、慢性炎症性疾患（例えば、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患及び同様のもの）、敗血性ショック及び多発性器官不全を包含する重度の合併症を導くことができる。重要なことには、それらの種々の疾病状態は、共通する炎症性メディエーターを共有する。
炎症により特徴づけられる集合的疾病は、ヒト罹病率及び死亡率に対して大きな衝撃を有する。従って、抗−炎症性抗体及び結合ポリペプチド、例えば本明細書に記載されるような抗−Ztnf12抗体及び結合ポリペプチドは、喘息及びアレルギーから自己免疫性及び敗血性ショックまでの莫大に多くのヒト及び動物疾患のための決定的な治療可能性を有することが明白である。本明細書に記載されるような抗−炎症性抗−Ztnf12抗体及び結合ポリペプチドは、特に関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患、乾癬、関連する疾患及び同様のもののような疾病において治療的に使用され得る。
変形性関節炎、リュウマチ様関節炎、損傷の結果としての関節炎性の関節、及び同様のものを包含する関節炎は、本発明の抗−炎症性抗体及び結合ポリペプチド、例えば抗−Ztnf12抗体及び結合ポリペプチドの治療使用から利益を得る通常の炎症状態である。例えば、リウマチ様関節炎（RA）は、全身体に影響を及ぼす全身性疾患であり、そして最も通常の形の関節炎の１つである。それは、痛み、硬直、発熱、赤み及び膨潤を引き起こす、関節の内側をおおう膜の炎症によって特徴づけられる。炎症細胞は、骨及び軟骨を消化することができる酵素を開放する。リウマチ様関節炎の結果として、炎症の関節内層、すなわち滑液が侵入し、そして骨及び軟骨に損傷を与え、他の生理学的効果の中で、関節変性及び重度の痛みを導く。その関連する関節は、その形状及び整合を失い、痛み及び運動の損傷をもたらす。
リウマチ様関節炎（RA）は、重度の疾病及び高められた死亡率を導く、炎症及び続く組織損傷により特に特徴づけられる免疫介在性疾病である。種々のサイトカインがリウマチ様関節炎において局部的に生成される。多くの研究は、IL−１及びTNF−α（２種のプロトタイプのプロ炎症性サイトカイン）が滑膜炎症及び進行性関節破壊に関与する機構において重要な役割を演じることを実証している。実際、RAを有する患者におけるTNF−α及びIL−１インヒビターの投与は、炎症の臨床学的及び生物学的徴候の劇的な改良、及び骨侵食及び軟骨破壊の放射線学徴候の低下を誘導して来た。
しかしながら、それらの有望な結果にもかかわらず、有用な％の患者がそれらの剤に対して応答せず、このことは、他のメディエイターがまた、関節炎の病理学にも関与することを示唆する（Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002）。それらのメディエーターの１つは、Ztnf12であり、そしてZtnf12を結合するか又は阻害する分子、例えば抗−Ztnf12抗体又は結合パートナーは、リウマチ様関節炎及び他の関節炎患者における炎症を低めるための価値ある治療剤として作用することができる。
当業界において知られているリウマチ様関節炎についてのいくつかの動物モデルが存在する。例えば、コラーゲン−誘発された関節炎（CIA）モデルにおいては、マウスは、ヒトリウマチ様関節炎に密接に類似する慢性炎症性関節炎を進行する。CIAはRAと、類似する免疫学的及び病理学的特徴とを共有するので、これは、可能性あるヒト抗炎症性化合物をスクリーリングのための理想的モデルにする。このCIAモデルは、免疫応答及び炎症性応答の両者に依存する、マウスにおける良く知られているモデルである。免疫応答は、抗原として与えられ、そして抗−コラーゲン抗体の生成を導く、コラーゲンに応答してB−細胞及びCD4＋ T−細胞の相互作用を包含する。
炎症相は、マウスの生来のコラーゲンと交差反応し、そして補体カスケードを活性化するそれらのいくつかの抗体の結果として、炎症のメディエーターからの組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、病因の基本的機構が知られていることである。タイプIIコラーゲン上の適切なT−細胞及びB−細胞エピトープは同定されており、そして免疫介在性関節炎に関係する、種々の免疫学的（例えば、遅延性型過敏症及び抗−コラーゲン抗体）及び炎症性（例えば、サイトカイン、ケモカイン及びマトリックス−分解酵素）パートナーが決定されており、そして従って、CIAモデルにおける試験化合物の効率を評価するために使用され得る。（Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3：407−20、1999；Williameなど., Immunol. 89：9784−788、1992；Myersなど., Life Sci. 61: 1861-78, 1997; 及びWangなど．，Immunol．92：8955−959、1995）。
可溶性Ztnf12含有ポリペプチド、例えばZtnf12−Fc4又は他の可溶性Ztnf12及び融合タンパク質のそれらのCIAモデルマウスへの投与は、症状を改善し、そして疾病の経路を変更するためへのZtnf12の使用を評価するために使用される。免疫及び炎症性応答を調節する分子Ztnf12は、リウマチ様関節炎の病因に関連するSAAの生成を誘発し、そしてZtnf12アゴニストはインビトロ及びインビボでSAA活性を阻害することができることができるので、Ztnf12アンタゴニスト、例えば抗−Ztnf12抗体又は結合パートーナー、Ztnf12含有ポリペプチド、例えばZtnf12−Fc4又は他の可溶性Ztnf12及び融合タンパク質の全身性又は局部投与は、RAにおける炎症性応答を実質的に抑制することができる。他の実質的な治療剤は、Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗Atnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものを包含する。
内毒素血症は、感染剤、例えば細菌及び他の感染性疾病剤、敗血症、毒性ショック症候群に通常起因するか、又は日和見性感染及び同様のものにゆだねられた免疫無防備状態の患者における重症状態である。治療的に有用な抗−炎症抗体及び結合ポリペプチド、例えば本発明の抗−Ztnf12抗体及び結合ポリペプチドは、ヒト及び動物における内毒血症の予防及び処理を助ける。他の可能性ある治療剤は、内毒素血症における炎症及び病理学的効果を低めるために価値ある治療剤として作用することができる。Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗−Ztnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものを包含する。
ポリ多糖類（LPS）誘発された内毒血症は、感染性疾病において病理学的効果を生成する多くのプロ炎症メディエーターと連動し、そして囓歯動物におけるLPS誘発された内毒血症は、可能性あるプロ炎症又は免疫調節剤の薬理学的効果を研究するための広く使用され、そして許容できるモデルである。グラム陰性細菌において生成されるLPSは、敗血性ショックの病因における主要原因剤である（Glausnerなど., Lancet 338: 732, 1991）。ショック様状態は実際、LPSの動物中への１回の注射入により実験的に誘発され得る。
LPSに応答する細胞により生成される分子は、病原体を直接的に又は間接的に標的化することができる。それらの生物学的応答は侵入性病原体に対して宿主を保護するが、それらは損傷を引き起こすことができる。従って、重度のグラム陰性細菌感染の結果として生じる生来の免疫性の強力な刺激が、サイトカイン及び他の分子の過剰の生成、及び致命的症状、発熱により特徴づけられる敗血性ショック症状、低血圧、散在性血管内凝固、及び多発性器官不全の進行を誘導する（Dumitruなど., Cell 103: 1071-1083, 2000）。
LPSのそれらの毒性効果は、複数の炎症性メディエーターの導くマクロファージ活性化に最も関連している。それらのメディエーターの中で、TNFは、中和化抗−TNF抗体の投与によるLPS毒性の予防により示されるように、決定的な役割を演じるように見える（Beutlerなど., Science 229: 869, 1985）。C57B1/6マウス中へのE．コリLPS１μgの注射が、注射の約２時間後、循環性IL−６、TNF−α、IL−１、及び急性相タンパク質（例えば、SAA）の有意な上昇をもたらすであろうことは、十分に確立されている。LPSの毒性は、それらのメディエーターに対する受動性免疫化が低められた致死性をもたらすので、それらのサイトカインにより介在されると思われる（Beutler など., Science 229: 869, 1985）。
敗血性ショックの予防及び/又は処理のための可能性ある免疫介入方法は、抗−TNF mAb, IL-1受動体アンタゴニスト、LIF、IL−10及びG−CSFを包含する。LPSは、内毒血症の病理学にたぶん寄与するプロ−炎症性因子の生成を誘発するので、Ztnf12ポリペプチドを拮抗することによるZtnf12活性、SAA又は他のプロ−炎症因子のその中和は、例えば内毒性ショック及び同様のものに見られるように、内毒血症の症状を減じるために使用され得る。他の実質的な治療剤は、Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗−Atnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものを包含する。
アメリカ合衆国においては、約500,000人の人々が、結腸又は直腸のいずれか（潰瘍性大腸炎）、又は小及び大腸の両者（クローン病）に影響を及ぼすことができる炎症性腸疾患（IBD）を有する。それらの疾病の病因は不明であるが、しかしそれらは影響される組織の慢性炎症を包含する。IBD及び関連する疾病における炎症性及び病理学的効果を低めるための価値ある治療剤として作用する、有力な治療剤は、Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗−Atnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものを包含する。
潰瘍性大腸炎（UC）は、結腸の粘膜又は最も内部の内層の炎症及び潰瘍により特徴づけられた、通常結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は、時折結腸を空にし、下痢をもたらす。症状は、下痢ぎみ及び関連する腸の痙攣、発熱及び体重の低下を包含する。UCの正確な原因は未知であるが、最近の研究は、身体の天然の防御が、身体が外来性と見なすタンパク質に対して作用する（“自己免疫反応”）ことを示唆する。たぶん、それらは腸における細菌タンパク質に類似するので、それらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症工程を生ぜしめるか又は刺激することができる。
結腸の内層が破壊されるにつれて、潰瘍が開放性粘液、膿及び血液を形成する。その疾病は通常、直腸領域で始まり、そして最終的に、全大腸中に拡張する。炎症の反復された症状の発現は、瘢痕組織を伴なって、腸及び直腸の壁の肥厚化を導く。結腸組織の死又は販血症は、重度の疾病を生ぜしめる。潰瘍性大腸炎の症状は重症度において変化し、そしてそれらの開始は徐々であるか又は突然であり得る。攻撃は、多くの要因、例えば呼吸器感染又はストレスにより刺激され得る。
現在、UCについての有益な治療は存在しないが、処理は、結腸内層における異常炎症工程の抑制に集中される。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキセ−ト）及びアミノサリチレートを包含する処理は、その疾病を処理するために入手できる。しかしながら、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド及びアザチオプリンの長期使用は、骨の微細化、白内障、感染、及び腎臓及び骨髄の効果を包含する重度の副作用をもたらすことができる。現在の治療が好都合でない患者においては、手術が任意である。手術は、全結腸及び直腸の除去を包含する。
慢性潰瘍性大腸炎に部分的に類似するいくつかの動物モデルが存在する。最も広く使用されるモデルは、結腸において慢性炎症及び潰瘍を誘発する、２，４，６−トリニトロベンスルホン酸/エタノール（TNBS）誘発された大腸炎モデルである。TNBSが直腸内点滴を通して敏感なマウスの結腸中に導入される場合、それは、結腸粘膜において、T−細胞介在性免疫応答を誘発し、この場合、大腸の全壁じゅうへのT−細胞及びマクロファージの強い浸潤により特徴づけされた大量の粘膜浸潤を導く。さらに、この組織病理学的臨床像は、進行性体重の低下（消耗）、出血性下痢、直腸脱出及び大腸壁の肥厚化の臨床学的像を付随する（Neurathなど., Intern, Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000）。
もう１つの大腸炎モデルは、出血性下痢により明白な急性大腸炎、体重の低下、結腸の短縮、及び好中球浸潤を伴なっての粘膜性潰瘍を誘発する硫酸デキストランナトリウム（DSS）を使用する。DSS誘発された大腸炎は、リンパ過形成、病巣陰窩損傷及び上皮潰瘍を伴なって、粘膜固有層中への炎症細胞の浸潤により組織学的に特徴づけられる。それらの変化は、上皮上へのDSSの毒性効果により、及び粘膜固有層細胞のファゴサイトーシス、及びTNF−α及びIFN−γの生成により進行すると思われる。その通常の使用にもかかわらず、ヒト疾病への関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、それがT細胞欠失動物、例えばSCIDマウスにおいて観察されるので、T細胞−無関係モデルとして見なされる。
抗−Ztnf12抗体又は結合パートナー、可溶性Ztnf12含有ポリペプチド、たとえばZtnf12−Fc4又は他の可溶性Ztnf12及び融合タンパク質のそれらのTNBS又はDSSモデルへの投与は、症状を改善し、そして胃腸病の経路を変更するためにZtnf12アンタゴニストの使用を評価するために使用され得る。Ztnf12は、大腸炎における炎症応答において役割を演じ、そしてZtnf12アンタゴニストの投与によるZtnf12活性の中和は、IBDに関しての可能性ある治療アプローチである。他の実質的な治療剤は、Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗−Ztnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものを包含する。
乾癬は、700万以上のアメリカ人に影響を及ぼす慢性皮膚状態である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖する場合に生じ、古い皮膚がすばやく十分に脱皮しない皮膚の赤く熱をもち、はれ上がった、鱗状の皮膚パッチをもたらす。最も通常の形であるプラーク乾癬は、銀色がかった白色鱗片を上部に有する皮膚の炎症性パッチ（“病変”）により特徴づけられる。乾癬は、少数のプラークに限定されるか、又は頭皮、膝、肘及び体幹上に最も通常には出現する、中位〜強い皮膚領域を包含する。それは高く認識できるが、乾癬は感染性疾病ではない。疾病の病因は、影響された組織の慢性炎症を包含する。Ztnf12ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、又は本発明の抗−Ztnf12抗体又は結合パートナー、及び同様のものは、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚及び粘膜アレルギー及び関連する疾病における炎症及び病理学的効果を低めるために価値ある治療剤として作用することができる。
乾癬は、相当な不快性を引き起こすことができる皮膚のT−細胞介在性炎症障害である。それは、治癒せず、そしてすべての年齢の人々に影響を及ぼす疾病である。乾癬は、ヨーロッパ及び北アメリカの人口の約２％に影響する。軽い乾癬を有する個人はしばしば、局部剤によりそれらの疾病を制御することができるが、世界じゅうの10万人以上の患者は、紫外線又は全身性免疫抑制療法を必要とする。不運なことには、紫外線の不便性及び危険性、及び多くの治療の毒性が、それらの長期使用を制限する。さらに、患者は通常、乾癬の再発、及び多くの場合、免疫抑制療法の停止後すぐに、再発を有する。
Ztnf12、その類似体、アゴニスト及び/又はアンタゴニストのB細胞増殖に対する効果が、B細胞増殖アッセイにおいて測定され得る。例えば、１×108個の凍結されたアフェレーシスされる末梢血液単核細胞（PBMC）を含むバイアルを、37℃の水において融解し、そして50mlの管（Falcon, VWR Seattle, WA）における25mlのB細胞培地（Iscaveの変性ダルベッコ培地、10％の熱不活性化されたウシ胎児血清、5％L−グルタミン、5％Pen/Strep）に再懸濁した。細胞を、トリパンブルー（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）を用いて、生存性について試験した。10mlのFicoll/Hypaque Plus(Pharmacia LKB Biotechnology Inc. , Piscataway, NJ)を、細胞懸濁液下に積層し、そして1800rpmで30分間、回転し、そしてブレーキをかけないで自然に停止する。
次に、界面層を除去し、そして新しい50mlのFalcon管に移し、PBSにより40mlの最終体積にし、そして1200rpmで10分間、回転し、そしてブレーキにより停止する。単離されたB細胞生存性を、トリパンブルーを用いて試験する。B細胞を、B細胞培地に、１×106個の細胞/mlの最終濃度で再懸濁し、そして96ウェルU底プレート（Falcon, VWR）に180μl/ウェルでプレートする。次の刺激体の１つを、細胞に添加し、200ml/ウェルの最終体積にする：0.5％抗IgM（ヤギ抗ヒトIgM−アガロース（μ鎖特異的）（PBSに希釈された；Sigma Chemical CO., st. Louis, MO）又は10ng/mlの組換えヒトIL4（PBS及び0.1％BSAに希釈された；Pharmirgen, San Diego, CA）のいずれかによる1mg〜1ng/mlからの10倍希釈でのZtnf12。対照として、細胞は、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）及びPBS、0.5％抗IgM又は0.5％抗1gM及び10ng/mlのIL4と共にインキュベートされる。
次に、細胞は、保湿されたインキュベーターにおいて37℃で72時間インキュベートされる。収穫の16時間前、１μCiの3Hチミジンを、すべてのウェルに添加する。細胞を、96ウェルフィルタープレート（UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT）中に収穫し、細胞ハーベスター（Packard）を用いて収穫し、そして製造業者の説明書に従って集める。プレートを、55℃で20〜30分間、乾燥し、そしてウェルの底を、不透明なプレートシーラーにより密封する。個々のウェルに、0.25mlのシンチレーション液体（Microscrint-O, Packard）を添加し、そしてプレートを、TopCount Microplate Scintillation Counter (Packard)を用いて読み取る。このアッセイにおいては、バックグラウンド対照に対するB細胞刺激が、B細胞増殖を示す。
免疫抑制、特に対宿主性移植片病及び移植片拒絶に関してのそのような治療使用のために、抗−Ztnf12抗体又は多特異的抗体組成物を用いて、T細胞応答を阻害するか又は中和するための方法がまた提供される。さらに、抗−Ztnf12抗体又は多特異的抗体組成物は、自己免疫疾患、例えばインスリン依存性糖尿病（IDDM）、多発生硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（IBD）及びクローン病の処理のための治療プロトコールにおいて有用である。本発明の方法は、炎症性疾患を処理するために、特に関節痛、腫脹、貧血及び他の関連する症状を緩和するために、及び敗血性ショック並びに腎障害を処理するために追加の治療価値を有する。
B細胞応答は、感染性疾病、例えば細菌、ウィルス、原生動物及び寄生虫感染の攻撃において重要である。感染性微生物に対する抗体は、抗原への結合により、続いて補体介在性溶菌又は細胞介在性攻撃により病原体を固定することができる。拮抗性又はシグナル化抗−Ztnf12抗体は、体液性応答を高めるように作用し、そして感染疾病の危険性での個人のための有用な治療剤であり、又はワクチン接種のためのサプリメントとして有用である。
十分に確立された動物モデルが、一定の疾病状態における本発明の抗−Ztnf12抗体又は多特異的抗体組成物のインビボ効能を試験するために入手できる。例示のように、抗−Ztnf12抗体は、多くの自己免疫疾患の動物モデル、例えばSLE（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用するMRL−lpr/lpr又はNZB×NZW F1コンジェニックマウス株において試験され得る。そのような動物は、当業界において知られている。
New Zealand Black (NZB) マウスとNew Zealand White (NZW) マウスとの間の交雑の子孫が、ヒトにおけるSLEに密接に類似するSLEの自発形を成長せしめる。NZBWとして知られているそれらの子孫マウスは、生後１ヶ月でT−細胞に対してIgM自己抗体を成長し始め、そして生後５〜７ヶ月までに、Ig抗−DNA自己抗体は優性免疫グロブリンである。ポリクローナルB−細胞過活性は、自己抗体の過生成を導く。それらの自己抗体、特に一本鎖のDNAに対して向けられたそれらの抗体の沈着は、タンパク尿、窒素血症及び腎不全からの死亡として臨床学的に明白である糸球体腎炎の進行に関連している。
腎不全は、自発性SLEにより影響されるマウスにおいて死の腫瘍原因であり、そしてNZBW株においては、この工程は慢性及び閉塞性である。前記疾病は雄よりも雌においてより急速且つ重症であり、そして平均生存日は雄の406日に比較して、雌はわずか245日である。雌マウスの多くは、生後７〜９ヶ月まで症候性（タンパク尿性）であるが、それらの何匹かは、それらが徴候を進行する場合、より若いか又は年をとっている。NZBWマウスに見られる致命的な腎炎は、ヒトSLEにおいて見られる糸球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを、可能性あるSLE治療の試験のために非常に魅力的にする。
さらに、T細胞増殖、腫瘍増殖、骨髄前駆体、単球増殖に対するZtnf12の効果を測定するためのアッセイは、当業者に知られている。
本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、核酸及び/又は抗体は、免疫機能及び炎症に関する障害の処理に使用され得る。本発明の分子は、種々の組織、例えば精巣及び肺における病理学的状態の進行を調節するか、処理するか、又は予防するために使用され得る。特に、一定の症状又は疾病は、そのような診断、処理又は予防に敏感に反応することができる。これに関して、疾病の調節は、炎症応答又は免疫状態、疾病又は障害の低下、改善、制限及び予防を包含する。
例えば、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に起因するプローブ又はプライマーを用いての追加の方法はまた、患者サンプル、例えば血液、尿、精液、唾液、汗、生検、組織サンプル、又は同様のものにおけるZtnf12発現を検出するためにも使用され得る。例えば、プローブは、腫瘍組織にハイブリダイズされ得、そしてそのハイブリダイズされた複合体は、現場ハイブリダイゼーションにより検出され得る。Ztnf12配列はまた、鋳型としてサンプルmRNAの逆翻訳により生成されるcDNAを用いてPCR増幅により検出され得る（PCR Primer A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Press, 1995）。正常な対照に比較される場合、対照の発現に対して、患者サンプルにおけるZtnf12発現の上昇又は下降がモニターされ、そして疾病のインジケーター又は診断剤として使用され得る。
さらに、腫瘍進行及び転移に対するZtnf12の活性及び効果が、インビボで測定され得る。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物又は他の処理の影響を研究するために開発されて来た。それらのモデルにおいては、培養継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ株のマウス中に移植される。細胞は、受容体マウスにおいて類似する特徴を有する腫瘍中に増殖し、そして転移がまた、そのモデルのいくつかにおいて生じるであろう。腫瘍モデルは、中でも、Lewis肺癌（ATCC No. CRL-1642）及びB16黒色腫（ATCC No. Crl-6323）を包含する。それらは、インビトロで容易に培養され、そして操作される、C57BL6マウスと同種の通常使用される腫瘍系である。それらの細胞系のいずれかの移植に起因する腫瘍は、C57BL6マウスの肺に転移することができる。
Lewis肺癌モデルが最近、脈管形成のインヒビターを同定するためにマウスに使用されている（O’Reilly MS, など. Cell 79: 315-328, 1994）。C57BL6/Jマウスが、組換えタンパク質、アゴニスト又はアンタゴニストの毎日の注入、又は組換えアデノウィルスの１回の注入を通して、実験剤により処理される。この処理に続いて３日で、105〜106個の細胞が背面の皮膚下に移植される。他方では、細胞自体が、タンパク質が全身的によりもむしろ腫瘍部位で又は細胞内で合成されるよう、移植の前、組換えアデノウィルス、例えばZtnf12を発現するアデノウィルスにより感染され得る。マウスは、通常５日以内に眼に見える腫瘍を進行する。腫瘍が３週間までの間、増殖され、この間、それらは対照の処理グループにおいて1500−1800mm3のサイズに達することができる。
腫瘍サイズ及び体重が、その実験を通して注意してモニターされる。殺害の時点で、腫瘍が、肺及び肝臓と共に除去され、そして計量される。肺の重量が、転移性腫瘍負荷量と相互関係することが示された。さらなる測定として、肺表面転移が計数される。切除された腫瘍、肺及び肝臓が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される方法を用いて、組織学的試験、免疫組織化学及び現場ハイブリダイゼーションのために調製される。従って血管構造を回復し、そして転移を受ける腫瘍の能力に対する、問題の発現されたポリペプチド、例えばZtnf12の影響が評価され得る。
さらに、アデノウィルスとは別に、移植された細胞がZtnf12により一時的にトランスフェクトされ得る。さらに、精製されたZtnf12又はZtnf12−ならし培地が、このマウスモデルに直接的に注入され、そして従って、このシステムに使用される。安定したZtnf12トランスフェクトの使用、及びインビボでのZtnf12発現を活性化する誘発性プロモーターの使用は、当業界において知られており、そして転移のZtnf12誘発を評価するためにこのシステムに使用され得る。一般的な文献については、O’Reilly MS, など. Cell 79: 315-328, 1994, 及びRusciano D, など、Murine Models of Liver Metastasis, Invasion Metastasis 14: 349-361,1995を参照のこと。
本発明はまた、単離され、そして精製されたZtnf12ポリヌクレオチドプローブを提供する。そのようなポリヌクレオチド プローブは、RNA又はDNAである得る。DNAは、cDNA又はゲノムDNAのいずれかであり得る。ポリヌクレオチド プローブは一本鎖又は二本鎖DNAまたはRNA、一般的には合成オリゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたcDNA又はゲノム配列から生成され得、そして一般的には、少なくとも16個のヌクレオチド、しばしば17個〜25個又はそれ以上のヌクレオチド、時々、40〜60個のヌクレオチド、及び多くの場合、実質的な部分、ドメイン又はさらに、完全なZtnf12遺伝子又はcDNAさえも含んで成る。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、代表的なZtnf12 DNA配列（配列番号１）又はその補体に対して少なくとも80％の同一性を有する。
プローブを構成する好ましい領域は、５’ 及び/又は３’ コード配列、受容体結合領域、細胞外、トランスメンブラン及び／又は細胞質ドメイン、シグナル配列及び同様のものを含む。ポリヌクレオチド プローブを開発するための技法及びハイブリダイゼーション技法は、当業界において知られており、たとえばAusubel など., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1991 を参照のこと。プローブとしての使用のためには、分子は、検出できるシグナルを供給するために、たとえば酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光団、化学発光体、常磁性粒子及び多くの源、たとえばMolecular Probes, Inc., Eugene, OR, 及びAmersham Corp., Arlington Heights, IL から市販されている同様のものにより、当業界において良く知られている技法を用いてラベルされ得る。
そのようなプローブはまた、サンプル中のZtnf12遺伝子又はmRNA転写体の存在を検出し、又はその量を定量化するためにハイブリダイゼーションにおいて使用され得る。ZTNF12ポリヌクレオチドプローブは、蛍光現場ハイブリダイゼーション（FISH）又は免疫組織化学のような技法を用いて、診断目的のためにDNA又はRNA標的物にハイブリダイズするために使用され得る。
ポリヌクレオチドプローブは、Ztnf12−様タンパク質をコードする遺伝子を同定するために使用され得る。たとえば、Ztnf12ポリヌクレオチドは、腫瘍壊死因子ファミリーの他の新規メンバーを同定するためにPCR反応においてプライマー及び/又は鋳型として使用され得る。
そのようなプローブはまた、新規腫瘍壊死因子をコードする関連する配列のためのライブラリーをスクリーンするためにも使用され得る。そのようなスクリーニングは、プローブ配列に対して、実質的に相同であるが、しかし完全な相同性を必要としない配列の同定を可能にする低い緊縮条件下で実施される。そのような方法及び条件は、当業界において良く知られており、たとえば、Sambrook など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY,1989 を参照のこと。そのような低い緊縮条件は、42℃以下のハイブリダイゼーション温度、50％以下のホルムアルデヒド濃度、及び中位〜低い濃度の塩を包含する。ライブラリーは、ゲノムDNA又はDNAから製造され得る。
ポリヌクレオチドプローブはまた、サザン、ノザン、又はスロット ブロット、コロニー及びプラーク ハイブリダイゼーション及び現場ハイブリダイゼーションのためにも有用である。スクリーニングシステムにおいては、感度、又は低コピー数の標的物の検出を高める、異なったZtnf12ポリペプチドプローブの混合物が調製され得る。
Ztnf12ポリペプチドは、診断システムに使用され得る。Ztnf12に対して特異的に結合する抗体又は他の剤はまた、循環受容体又はリガンドポリペプチドの存在を検出するために使用され得る。そのような検出方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、酵素結合された免疫吸着アッセイ（ELISA）及びラジオイムノアッセイを包含する。免疫組織科学的にラベルされた抗体が、組織サンプルにおけるZtnf12リガンドを検出するために使用され得る。
Ztnf12レベルはまた、RT−PCRのような方法によりモニターされ得、ここでZtnf12 mRNAが検出され、そして定量化され得る。そのような方法は、受容体又はリガンドポリペプチドレベルをモニターし、そして定量化するための診断手段として使用され得る。そのような検出方法に由来する情報は、種々の疾病におけるZtnf12ポリペプチドの有意性の洞察力提供し、そして変更されたレベルのZtnf12が有意である疾病についての診断方法を提供する。変更されたレベルのZtnf12リガンドポリペプチドは、癌、自己免疫疾患、炎症及び免疫欠損を包含する病理学的状態の表示である得る。
本明細書に開示されるZtnf12ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドは、治療剤として有用であり、ここでZtnf12アゴニスト及びアンタゴニストは、細胞、組織及び/又は生物学的流体における１又は複数の生物学的工程を変調することができる。TNFファミリーの多くのメンバーは、リンパ細胞上に発現され、そして異なった免疫細胞間の相互作用を仲介する。TNFとZtnf12との相同性は、Ztnf12が免疫応答の調節、特にリンパ球の活性化及び調節において役割を演じることを示唆する。Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12アゴニストは、免疫欠損の処理のための治療剤として有用である。Ztnf12ポリペプチド、Ztnf12アゴニスト及びアンタゴニストは、インスリン依存性糖尿病（IDDM）、クローン病、多発性硬化症（MS）、重症筋無力症（MG）及び全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患の処理のための治療プロトコールに使用され得る。
Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12アゴニストは、感染を攻撃し、そしてアレルギー症状の軽減を提供するための処理において、抗−ウィルス応答を調節するために使用され得る。Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12アゴニストはまた、細胞アポプトーシスのメディエイターとして作用することによって癌細胞成長を阻害するためにも使用され得る。Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12アゴニストはまた、一定の癌、例えば肺癌、小細胞癌、鱗状細胞癌、大細胞癌及び腺癌の調節への使用のためにも企画される。
Ztnf12ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、インビトロサイトカインアッセイシステムを検量するための標準として、又はそのようなアッセイシステム内の標準として使用され得る。さらに、Ztnf12ポリペプチドに対する抗体は、生活性の中和のためのアッセイ、ELISA及びELISPOTアッセイ、ウェスターンブロット分析及び免疫組織化学用途において使用され得る。種々の他のサイトカインタンパク質、抗体及びDNAは、そのような方法への使用のために、市販源、例えばR＆D Systems, Minneapolis, MNから入手できる。
本発明はまた、Ztnf12ポリペプチド、又は他方では、Ztnf12ポリペプチドが結合する受容体のいずれかに結合し、それによりZtnf12の機能を阻害するか又は排除するアンタゴニストも提供する。そのようなZtnf12アンタゴニストは、抗体；Ztnf12ポリペプチド又はその受容体のいずれかに結合するオリゴヌクレオチド；受容体を結合する能力を保持するが、しかしリガンド又は受容体シグナル化のいずれももたらさないZtnf12ポリペプチドの天然又は合成類似体を包含する。そのような類似体は、ペプチド又はペプチド様化合物であり得る。Ztnf12ポリペプチドの受容体に結合し、そしてシグナル化を妨げる天然又は合成の小分子がまた、アンタゴニストとして企画される。Ztnf12アンタゴニストは、Ztnf12リガンド又は受容体のいずれかからのブロッキングシグナルが有益である一定の障害を処理するための治療剤として有用である。
アンタゴニストは、慢性炎症性疾患を処理するために、特に関節痛、腫脹、貧血及び他の関連する症状を低減するために、追加の治療価値を有する。アンタゴニストはまた、骨再吸収を妨げることにおいても有用である。それらは、リウマチ様関節炎及び全身性エリトマトーデスについての処理にも使用される。アンタゴニストはまた、敗血性ショックの処理にも使用される。
Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12ポリペプチドアンタゴニストは、Tリンパ球のエフェクター機能、特にTリンパ球活性化及び分化の研究においても使用され得る。また、Tヘルパーは、体液性又は細胞免疫性の仲介において機能する。Ztnf12ポリペプチド及びZtnf12ポリペプチドアンタゴニストはまた、リガンド−受容体相互作用を特徴づけるための有用な研究試薬としても企画される。
本発明はまた、核酸−基材の治療処理も提供する。哺乳類が突然変異誘発されZtnf12遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、Ztnf12遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。1つの態様においては、Ztnf12ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥DNAウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス(HSV)、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス(EBV)、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス(AAV)及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。
欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１(HSV1)ベクター（Kaplitt など., Molc. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991）、弱毒化されたアデノウィルス ベクター、例えばStratford-Perricaudat など. (J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Samulski など., J. Virol. 61: 3096-101, 1987; Samulski など., J. Virol. 63: 3822-28,1989）。
もう1つの態様においては、前記遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Anderson など., アメリカ特許第5,399,346号；Mann など., Cell 33: 153, 1983; Temin など., アメリカ特許第4,650,764号；Temin など., アメリカ特許第4,980,289号；Markowitz など., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin など., アメリカ特許第5,124,263 号；Dougherty など., WIPO Publication WO95/07358 号；及びkuo など., Blood 82: 845-52, 1993。
他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。
特定細胞へのリポソームの分子標的化は、1つの領域の利点を表す。特定細胞へのトランスフェクションの方向づけが1つの領域の利点を表すことは明白である。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
身体から細胞を除去し、そして裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸DNAベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はDNAベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Wu など., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu など., J. Biol. Chem. 263: 14621-24, 1988）。
Ztnf12ポリペプチドはまた、医薬使用のために企画される。医薬的有効量の本発明のZtnf12ポリペプチド、アゴニスト又はZtnf12アンタゴニストは、非経口、経口、鼻腔内、直腸、局所、経皮投与又は同様のもののために、医薬的に許容できるキャリヤーと共に配合され得る。配合物は、さらに、１又は複数の希釈剤、充填剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、腑形剤及び同様のものを含むことができ、そして液体、粉末、エマルジョン、坐剤、リポソーム、経皮用パッチ及び錠剤のような形で供給される。
多くのバイオポリマー（生物学的基材システム）のいずれかを含む遅延又は延長された開放性システム、リポソームを用いるシステム、及びポリマー供給システムがまた、Ztnf12ポリペプチド又はアンタゴニストの連続した又は長期源を提供するために本明細書に記載される組成物と共に使用され得る。そのような遅延システムは、経口、局所及び非経口使用のために、配合物に適用でき得る。用語“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、そして宿主又は患者に対して毒性ではないキャリヤー媒体を言及する。当業者は、本発明の化合物を、適切な態様で、及び許容された実施、たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro (ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990 に開示されるそれらの実施に従って配合することができる。
本明細書において使用される場合、Ztnf12ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストの“医薬的に有効な量”は、所望する生物学的結果を誘導するのに十分な量である。その結果は、疾病の徴候、症状又は原因の解決、又は生物学的システムのいづれか他の所望する変異であり得る。たとえば、有効量のZtnf12ポリペプチド又はアンタゴニストは、臨床医又は他の資格のある観察者により示されるように、徴候の主観的軽減又は客観的に同定できる改良点のいずれかを提供する量のポリペプチドである。それはまた、骨再吸収のための処理に応答しての血清Ca2+レベルの低下又は破骨細胞サイズ及び数の阻害をもたらす量であり得る。
他のそのような例は、アセチルコリン抗体レベルの低下、重症筋無力症についての処理の間、筋肉弱体化の低減、又は他の有益な効果を包含する。筋肉硬化症（MS）の処理への使用のための有効量のZtnf12は、筋力弱体化の低減、及び/又はMS再燃の頻度の低下をもたらすであろう。EAEマウスモデル測定においては、疾病の臨床学的徴候、例えば弱々しい尾又は麻痺の程度のEAE等級が作られる。リウマチ様関節炎に関しては、そのようなインジケーターは、炎症の低下及び苦痛又は硬直の緩和を包含し、動物モデルにおいては、徴候は関節、及び後足の腫脹の変化の肉眼による観察に起因する。Ztnf12ポリペプチドの有効量は、処理されるべき疾病又は病状に依存して広く変化することができる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体、並びにそのフラグメントは、疾病、例えば造血、炎症、細胞欠損、異常細胞増殖、アポプトーシス、及び癌腫の処理において有用であろう。さらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体、並びにそのフラグメントは、免疫及び/又は炎症性障害、例えば糖尿病、喘息、アテローム性硬化症、カタラクタ、再潅流損傷、後−感染性症候群、例えば感染性脳膜炎、リウマチ熱、及びリウマチ性疾患、例えば全身性エリテマトーデス及びリウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び過敏性腸管症候群の処理において有用であろう。
投与されるべきポリペプチドの量、及び配合物におけるその濃度は、選択されるビークル、投与の経路、特定のポリペプチドの能力、患者の臨床学的状態、副作用、及び配合物における化合物の安定性に依存する。従って、臨床医は、問題の患者又は類似する患者による臨床実験に依存して、配合物における適切な濃度、及び投与される配合物の量を包含する適切な調製物を用いるであろう。そのような量は、患者の処理される特定の状態、年齢、体重、及び一般的な健康、及び当業者に明らかな他の要因に一部、依存するであろう。
典型的には、用量は、対象ｋｇ当たり0.1〜100mgの範囲であろう。特定の化合物のための用量は、実験動物に基づく研究と組み合わせて、インビトロ又はエクソビボ研究から決定され得る。インビトロ又はエクソビボで有効であることが見出されている化合物の濃度が動物研究のためのガイドを提供し、ここで用量が、作用の部位での類似する濃度を提供するよう計算される実験動物において効果的であると決定される用量は一般的に、１つの大きさの程度内でのヒトにおける用量の予測である。
本発明を実施するために使用される本発明の化合物の投与量は、所望する効果をもたらすのに効果的な投与量を包含する。個々の患者のために効果的な適切な投与量の評価は、医者又は他の適切なヘルスケア-実施者の範囲内である。ガイドとして、臨床医は、Physician’s Desk Reference, 48th Edition, Medical Economics Data Production Co., Montvale, New Jersey 07645-1742 (1994) からの装置を、便利には、入手して使用することができる。
好ましくは、本発明の組成物は、単位投与量形での投与のために提供される。用語“単位投与形”とは、ヒト対象及び動物のために単位投与されるのに適切な物理学的に別個の単位を言及し、個々の単位は必要とされる医薬的希釈剤、キャリヤー又はビークルと共に、所望する医薬的効果を生成するために計算された、予定された量の活性材料を含む。単位投与形の例は、バイアル、アンプル、錠剤、カプレット、ピル、粉末、顆粒、眼薬、経口又は眼内溶液又は懸濁液、眼内軟膏、及び水中油型エマルジョンを包含する。調製、配合及び投与の手段は、当業者に知られており、一般的には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995 を参照のこと。
本発明は、次の非限定的例により、さらに示される。
例１:可溶性Ztnf12発現ベクターの構成：
１つの発現ベクターを、C−末端Glu−Glu標識に融合された可溶性Ztnf12ポリペプチドを発現するために調製する。
PCR生成されたZtnf12 DNAフラグメントを、可溶性Ztnf12 DNAの5’及び3’末端で適切な制限部位を付加するためにPCRプライマーとして適切なオリゴヌクレオチドを用いて創造したZtnf12 cDNA（配列番号１）を含むプラスミドを、PCR増幅のための鋳型として使用する。反応を、クロロホルム/フェノール抽出及びイソプロパノール沈殿により精製し、そして選択された制限エンドヌクレアーゼにより消化する（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）。適切な長さのバンドを、１％アガロースゲル電気泳動により可視化し、切除し、そしてQiaexIITM 精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、製造業者の説明に従って、DNAを精製する。
約30ngの制限消化されたZtnf12挿入体及び約10ngの適切な消化されたベクターを、室温で２時間、連結する。１μlの連結反応を、DH10Bコンピテント細胞（Gibco BRL, Rockville, MD）中に、製造業者の説明書に従ってエレクトロポーレートし、そして50mg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートする。コロニーを、個々のコロニーの液体培養物2mlから調製されたDNAの制限分析によりスクリーンする。陽性クローンの挿入体配列を、配列分析により確かめる。従って、切除されたZtnf12 DNAを、適切な発現ヴェクター中にサブクローン化する。大規模プラスミド調製を、Qiagen（商標）Mega Prepキット（Qiagen）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
同じ方法を用いて、C−末端Fc4標識を有するZtnf12を調製し、Ztnf12/Fc4を創造する。Ztnf12/Fc4を調製するために、発現ベクターは、Glu-Glu標識の代わりにFc4標識を有する。Fc4は、それがもはやFc受容体を結合しないような突然変異を含む、ヒトIgG由来のFc領域である。Fc4がこの例に使用されるが、当業者は、他のFc構造体（すなわち、他のIg分子に由来するそれら）がこの同じプロトコールを用いて可溶性Ztnf12を調製するために使用され得ることを認識することができる。
例２．Ztnf12可溶性ポリペプチドのトランスフェクション及び発現：
トランスフェクションの前日、BHK570細胞（ATCC NO. CRL−10314；ATCC, Manasas, VA）を、通常のBHK DMEM (Gibco/BRL High Glucose) 培地を含む10cmプレートに、50％集密性でプレートする。トランスフェクションの日、細胞を、血清フリー（SF）DMEMにより１度、洗浄し、続いてZtnfl2/Fc4、 Ztnfl2/N EE又はZtnfl2/CEE発現プラスミドによりトランスフェクトする。16μgの個々のDNA構造体を、640μlの合計最終体積のSF DMEM中に希釈した。希釈されたLipofectAMINETM混合物（605μlの培地中、35μlのLipofectAMINETM）を、DNA混合物に添加し、そして室温で30分間インキュベートした。5mlのSF培地を、DNA/LipofectAMINETM 混合物に添加し、次に、これを、BHK細胞に添加した。細胞を、37℃/5％CO2で５時間インキュベートし、この後、10％FBSと共に6.4mlのBHK培地を添加した。細胞を37℃/5％CO2で一晩インキュベートした。
トランスフェクションの約24時間後、BHK細胞を、１μMのメトトレキセート（MTX）を有する選択培地に分けた。前記細胞を、安定したZtnfl2/NEE、Ztnfl2/CEE又はZtnfl2/Fc4細胞系が同定されるまで、この状態で反復して分離した。Ztnfl2可溶性受容体融合タンパク質の発現レベルを検出するために、トランスフェクトされたBHK細胞を、PBSにより洗浄し、そしてSF培地において72時間インキュベートした。SFならし培地を集め、そして20μlのサンプルを、還元条件下で、10％SDS−PAGEゲル上で展開した。タンパク質バンドを、ウェスターンブロットによりニトロセルロースフィルターにトランスファーし、そして融合タンパク質を、Ztnfl2/Fc4融合体についてヤギ−抗−ヒトIgG/HRP接合体、又はZtnfl2/CEE融合体についてマウス−抗−Glu−Glu標識/HRP接合体のいずれかを用いて検出する。Fc4又はCEE標識に融合される異なった可溶性受容体を含む発現ベクターを、対照として使用した。
トランスフェクトされたBHK細胞を、T−162フラスコ中に移した。BHK細胞が約80％の集密性に達するとすぐに、それらを、PBSにより洗浄し、そして100mlのSF培地において72時間インキュベートし、そして次に、ならし培地を、タンパク質精製のために集める。
例３：Ztnfl2/CEE 及びZtnfl2/NEEの精製及び分析：
組換えカルボキシル末端Glu−Glu標識されたZtnfl2を、上記例２に記載されるように、トランスフェクトされたBHK細胞から生成する。約5Lのならし培地を、約72時間のアンキュベーシヨンの後、60の皿から収穫する。培地の一部を、異なった製造業者からの濾過ユニットを用いて無菌濾過する。Nalgene（0.2μm及び45μm）フィルター及びMillipore Express 0. 22μmフィルターを比較し、そしてタンパク質の最良の回収率及び流速を提供する１つを使用する。タンパク質発現のレベルは、新規培地における約72時間後、最適な濃度に達する。
タンパク質を、前記濾過された培地から、抗-Glu- Glu (抗-EE) ペプチド抗体親和性クロマトグラフィー及びS−100ゲル排除クロマトグラフィーカラムの組合せにより精製する。培養培地を、約４ml/分の流速で、20×185mm（58mlの層体積）の抗−EE抗体親和性カラム上に直接的に負荷する。10カラム体積のPBSによるカラムの洗浄の後、結合されたタンパク質を、２カラム体積の0.4mg/mlのEYMPTD ペプチド(Princeton Biomolecules, NJ)により溶出する。５mlの画分を集める。抗−EE抗体親和性カラムからのサンプルを、Ztnfl2/CEEの存在について銀染色及びウエスターンブロットによるSDS−PAGEにより分析する。
Ztnfl2/NEE又はZtnfl2/CEEタンパク質を含む画分をプールし、そしてBiomax-５濃縮機（Millipore）を用いて、４mlに濃縮し、そして16×1000mmのSephacryl S-100 HRゲル濾過カラム(Amersham Pharmacia Biotech)上に負荷する。精製されたZtnfl2/NEE又はZtnfl2/CEEを含む画分をプールし、0.2μmのフィルターを通して濾過し、それぞれ100μlにアリコートし、そして-80℃で凍結する。最終の精製されたタンパク質の濃度を、BCAアッセイ（Pierce, Rockford, IL）により決定する。
組換えZtnfl2/NEE又はZtnfl2/CEEを、クーマシー及び銀染色方法(Fast Silver, Geno Tech)を用いてのSDS−PAGE（Nupage4-12%, Novex）、及びモノクローナル抗−EE抗体を用いてのウェスターンブロットにより分析する。ならし培地又は精製されたタンパク質のいずれかを、Novex's Xcell cell (San Diego, CA)を用いて電気泳動し、そして装置のマニュアルに提供される指針に従って、Novex's Xcell IIブロットモデルを用いて室温でニトロセルロース（0.2μm；Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に、攪拌しながらトランスファーする。トランスファーを、25mMのトリス塩基、200mMのグリシン及び20％メタノールを含む緩衝液において、500mAで１時間、行なう。次に、フィルターを、PBS中、10％脱脂粉乳により、室温で10分間、ブロックする。ニトロセルロースをすばやくすすぎ、次に一次抗体を、2.5％の脱脂粉乳を含むPBSに添加する。
ブロットを、軽く振盪しながら、室温で２時間、又は４℃で一晩インキュベートする。インキュベーションに続いて、ブロットを、それぞれPBSにより10分間、３度、洗浄する。2.5％の脱脂粉乳を含むPBSにおいて1:2000に希釈された二次抗体（ホースラディシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウスIgG；Rockland Inc., Gilbertsville, PAから得られた）を添加し、そして次に、ブロットをPBSにおいてそれぞれ10分間、3度洗浄し、次に水によりすばやくすすぐ。ブロットを、市販の化学発光基質試薬（SuperSignalQ ULTRA試薬１及び２を1:1に混合された試薬；Pierce Chemical Co.から得られる）を用いて展開し、そしてシグナルを、Lumi-Imager’s Lumi Analyst 3.0ソフトウェア（Boehringer Mannbeim GmbH, Germany）を用いて、10秒〜５分の範囲の暴露時間又は必要な時間、捕獲する。
例４：Ztnfl2/Fc4の精製及び分析：
組換えカルボキシル末端Fc4標識されたZtnfl2を、上記例２に記載されるように、トランスフェクトされたBHK細胞から生成する。約6Lのならし培地を、約72時間のアンキュベーシヨンの後、60の皿から収穫する。培地の一部を、異なった製造業者からの濾過ユニットを用いて無菌濾過する。Nalgene（0.2μm及び45μm）フィルター,Millipore Express 0. 22μmフィルター、及びDurapore0. 45μmフィルターを比較し、そしてタンパク質の最良の収率及び流速を提供する１つを使用する。タンパク質発現のレベルは、新規培地における約72時間後、最適な濃度に達する。
タンパク質を、前記濾過された培地から、Poros50プロテインA親和性クロマトグラフィー（PerSeptive Biosystems, 1-5559-01, Framingham, MA）及びS−200ゲル排除クロマトグラフィーカラム（Amersham Pharmacia Biotech）の組合せにより精製した。培養培地を、約４ml/分の流速で、10×80mm（6.2mlの層体積）のプロテインA親和性カラム上に直接的に負荷した。10カラム体積のPBSによるカラムの洗浄の後、結合されたタンパク質を、５カラム体積の0.1Mのグリシン（pH3.0）により、10ml/分で溶出した。それぞれ1.5mlの画分を、溶出されたタンパク質を中和するために、38μlの2.0Mのトリス（pH8.8）を含む管中に集めた。親和性カラムからのサンプルを、クーマシー染色によるSDS−PAGE、及びウェスターンブロットにより、ヒトIg-HRPを用いて、Ztnfl2/Fc4の存在について分析した。
Ztnfl2/Fc4含有画分をプールし、そしてBiomax-30濃縮機（Millipore）を用いて、４mlに濃縮し、そして16×1000mmのSephacryl S−200ゲル濾過カラム上に負荷した。精製されたZtnfl2/Fc4を含む画分をプールし、0.2μmのフィルターを通して濾過し、それぞれ100、200及び500μlにアリコートし、そして-80℃で凍結した。最終の精製されたタンパク質の濃度を、BCAアッセイ（Pierce）及びHPLC-アミノ酸分析により決定した。
組換えZtnfl2/Fc4を、クーマシー染色方法を用いてのSDS−PAGE（Nupage4-12%, Novex）及びヒトIg−HRPを用いてのウェスターンブロットにより分析した。ならし培地又は精製されたタンパク質のいずれかを、Novex's Xcell cell (San Diego, CA)を用いて電気泳動し、そして装置のマニュアルに提供される指針に従って、Novex's Xcell IIブロットモデルを用いて室温でニトロセルロース（0.2mm；Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に、攪拌しながらトランスファーする。トランスファーを、25mMのトリス塩基、200mMのグリシン及び20％メタノールを含む緩衝液において、500mAで１時間、行なう。次に、フィルターを、PBS中、10％脱脂粉乳により、室温で10分間、ブロックする。
ニトロセルロースをすばやくすすぎ、次にヒトLg−HRP抗体（１：2000）を、2.5％の脱脂粉乳を含むPBSに添加する。ブロットを、軽く振盪しながら、室温で２時間、又は４℃で一晩インキュベートする。インキュベーションに続いて、ブロットを、それぞれPBSにより10分間、３度、洗浄し、次に水によりすばやくすすぐ。ブロットを、市販の化学発光基質試薬（SuperSignalQ ULTRA試薬１及び２を1:1に混合された試薬；Pierce Chemical Co.から得られる）を用いて展開し、そしてシグナルを、Lumi-Imager’s Lumi Analyst 3.0ソフトウェア（Boehringer Mannbeim GmbH, Germany）を用いて、10秒〜５分の範囲の暴露時間又は必要な時間、捕獲する。
例５：現場ハイブリダイゼーションを用いてのZcytor16を発現する細胞の同定：
特にヒト組織を単離し、そして現場ハイブリダイゼーションによりZtnfl2発現についてスクリーンした。正常な胃、正常な子宮、神経芽細胞腫及びメラノーマに関する種々のヒト組織を調製し、断片化し、そして現場ハイブリダイゼーションにゆだねた。組織を、標準方法を用いて、10％の緩衝化されたホルマリンに固定し、そしてパラフィンにおいてブロックした。
組織を、４〜８ミクロンに断片化した。組織を、標準のプロトコール（”Development of non-isotopic in situ hybridization” at http://dir. niehs. nih. gov/dirlep/ish. html）を用いて調製した。手短には、組織断片を、HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) により脱パラフィン化し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらを、37℃で２〜20分間、プロティナーゼK（50mg/ml）（Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN）により消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして脱水した。
PCRにより生成された２種の現場プローブを、ヒトZtnf12配列に対して企画する。２組のオリゴを、Ztnf12 cDNAの別々の領域のためのプローブを生成するために企画する。個々の組からのアンチセンスオリゴはまた、それらのPCR生成物からのアンチセンスRNAプローブの容易な転写を可能にするためにT7 RNAポリメラーゼプロモーターのための作用配列を含む。プローブをPCR増幅により製造する。続いて、プローブを、In vitro転写システム（Promega, Madison, WI）を用いて、その製造業者の説明書に従って、ジゴキシゲニン（Boehringer）又はビオチン（Boehringer）によりラベルする。
現場ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニンによりラベルされたZtnfl2プローブ（上記）により行った。プローブを、60℃で12〜16時間、１〜5pモル/mlの濃度でスライドに付加した。続いて、スライドを、２×SSC及び0.1×SSCにより55℃で洗浄した。シグナルを、チラミドシグナル増幅（TSA）（TSA、現場間接的キット；NEN）を用いて増幅し、そしてVector Red基質キット（Vector Lab）により、その製造業者の説明書に従って可視化した。次に、スライドを、ヘマトキシリン（Vector Laboratories, Burlingame, CA）により対比染色した。
例６：ヒトZtnf12ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体を、２匹の雌New Zealand白色ウサギを、例２からのBHKにおいて発現される、精製された組換えタンパク質Ztnf12−CEEタンパク質により免疫化することにより調製する。ウサギは、それぞれ完全フロイントアジュバント中、200μgの精製されたタンパク質の初期腹腔内（ip）注射、続いて、不完全フロイントアジュバント中、100μgのペプチドの２週間ごとの追加免疫化を与えられる。第２の追加免疫注射（合計３回の注射）の投与の７〜10日後、動物を放血し、そして血清を集める。次に、動物を追加免疫化し、そして３週間ごとに放血する。
Ztnf12−特異的ポリクローナル抗体を、1gのCNBr−SEPHAROSE当たり10mgの精製された組換えZtnf12−Fcタンパク質を用いて調製されるCNBr−SEPHAROSE 4Bタンパク質カラム（Pharmacia LKB）を用いてウサギ血清から親和性精製し、続いてPBS中、一晩の20×透析を行う。Ztnfr11−特異的抗体を、抗体標的物として、1μg/の特定の精製された組換えZtnf12−CEE−BHKタンパク質を用いて、ELISAにより特徴づける。
例７：RTPCRを用いての血液及び細胞系パネルにおけるztnf12×１及びztnf12×2 mRNAの分布：
全RNAを、自家増殖され、そしてQiagen（Valencis, CA）RNeasyキットを用いて、製造業者の説明書に従って、又は酸−フェノール精製プロトコール（Chomezynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-9,1987）により精製された、休眠の及び刺激された細胞系又は末梢血液画分から精製した。RNAの質を、Agilent Bioanalyzer上でアリコートを走行することにより評価した。RNAが有意に分解される場合、それは、第１鎖cDNAの続く創造のためには使用されなかった。汚染性ゲノムDNAの存在を、zc41011（配列番号14）及びzc41012（配列番号15）、すなわち遺伝子間ゲノムDNAの単一部位を増幅するプライマーを有するRNAのアリコートに対するPCRアッセイにより評価した。
汚染性ゲノムにDNAアッセイについてのPCR条件は次の通りであった：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び0.5μlの20μMのzc 41011及びzc41012（最終体積25μl）。サイクリングパラメーターは次の通りであった：94℃で20秒、94℃で20秒、60℃で１分20秒（40サイクル）、及び72℃で7分（１サイクル）。
10μlの個々の反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてゲルを、汚染性ゲノムDNAからのPCR生成物の存在について試験した。汚染性ゲノムDNAが観察される場合、全RNAを、DNA−フリー試薬（Ambion, Inc, Austin, TX）を用いて、その製造業者の説明書に従ってDNA化した。汚染性ゲノムDNAを有さないよう出現したRNAのみが、第２鎖cDNAの続く創造のために使用された。
82のヒト細胞系及び33の末梢血液画分からの全RNA20μgを、H2Oにより98μにし、次に２つの49μlのアリコートに分け、個々は10μgの全RNAを含み、そして２つの96−ウェルPCRプレートにプレートした。個々のアリコートに、第２鎖cDNA合成のための試薬（Invitrogen First Strand Synthesis System, Carlsbad, CA）を添加した：20μlの25mMのMgCl2、10μlの10× RT緩衝液、0.1μlの0.1MのDTT、２μlのオリゴdT、2μlのRNAseOut。次に、個々の細胞系からの１つのアリコートに、２μlのSuperscript II Reverse Transcriptaseを添加し、そしてその対応する細胞系アリコートに、H2Oを添加し、マイナス逆転写酵素の負の対照を創造した。すべてのサンプルを次の通りにインキュベートした：25℃で10分、42℃で50分、70℃で15秒。
サンプルを深いウェルプレートに配置し、そしてH2Oにより1.7mlに希釈した。Multipette（Saigan）ロボットを用いて、16.5μlを、96−ウェルPCRプレートの個々のウェルに複数回、アリコートし、細胞系の多くの１度使用PCRパネルを生成し、次に、密封し、そして−20℃で貯蔵した。それらのパネルにおける個々のウエルは、約100ngの全RNAからの第１鎖cDNAを表す。パネル上の第１鎖cDNAの質を、２種の広く発現されるが、しかし適度に富んだ遺伝子、すなわちCLTC（クラスリン）及びTFRC（トランスフェリン受容体C）に対するプライマーを用いて、１組のパネルに対する多重PCRアッセイにより評価した。10μlの個々のPCR反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてゲルを、個々の細胞系について＋RTウェルに対して特異的な個々の遺伝子について強いPCR生成物の存在について評点を付けた。
ztnf12×1及びztnf12×２についての第１鎖cDNAパネルにおけるmRNAの発現を、サンプル当たりそれらのPCR条件下でセンスオリゴzc47496（配列番号20）及びアンチセンスオリゴzc47497（配列番号21）を用いてPCRによりアッセイした：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び0.5μlの20μMのそれぞれのセンス及びアンチセンスプライマー。サイクリングパラメーターは次の通りであった：94℃で１分、94℃で10秒、66℃で30秒（35サイクル）、及び72℃で５分（１サイクル）。プライマーは、ztnf12×1について230bp及びztnf12×2について314bpのPCR生成物を生成することが予測される。10μlの個々の反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてゲルを、ztnf12×2の正又は負の発現について評点を付けた。
結果は、ztnf12×1の発現が拡大せず、そしてztnf12×2はまれに発現され、ztnf12×1に対してまた陽性である少数のサンプルのみにおいて存在することを示す。ztnf12×1に対して陽性である細胞系は、次のものである：TF1、赤白血病、REH, ALLプレ−B系、HBL−100、乳上皮系、A−172、グリア芽腫、Sk−N−SH、神経芽腫系、HuH7及びHepG2、２種の肝細胞癌系、Y−79、網膜芽腫系、U937、単球系、CaCO2及びHCT116、２種の結腸腺癌系、及びTrBMEC、形質転換された骨髄内皮細胞系。ztnf12×2発現は単に、TrBMEC、Sk−N−SH及びHuH7において観察される。
末梢血液においては、ztnf12×発現は、CD34＋前駆体細胞、CD14＋単球＋gIFN（24時）、NK細胞＋PMA/Ionomycinにおいて観察され、そしてztnf12×2発現はそれらのアッセイ条件下でいずれの末梢血液サンプルにおいても存在しない。興味あることには、４時間のCD14＋単球＋gIFN及び休眠CD14＋単球サンプルは、PMA及びイノマイシンにより刺激されたCD14＋単球のように、ztnf12×1に対して陰性であり、このことは転写体の可能性ある強い一時的な調節を示す。
例８：PCRを用いての血液画分におけるztnf12 mRNAの組織分布：
ヒト細胞末梢血液画分からの第１鎖cDNAのパネルを、PCRを用いてztnf12発現についてスクリーンした。パネルは、BD Bioscience (Palo Alto, CA)から購入され、そして次の種々の血液細胞からの10のcDNAサンプルを含んだ：活性化されたCD4＋、休眠CD4＋、活性化されたCD8＋、休眠CD8＋、休眠CD14＋、活性化されたCD19＋、休眠CD19＋、活性化された単核及び単核細胞。第１鎖cDNAをPCRにより、及びG3PDH対照プライマーを、BD BioScience (Palo Alto, CA)により試験した。パネルを、１つの陽性対照サンプル、200ngのゲノムDNAを含む96−ウェル形で組み立てた。個々のウェルは、2μlの100ng/μlのヒトゲノムDNA及び8.0μlの水、1μlのcDNA及び12.0μlの水、又はcDNAの１：５希釈溶液1μl及び12.0μlの水を含んだ。
PCR反応を、0.5μlの20μMの個々のオリゴZC47496（配列番号20）及びZC47497（配列番号21）、2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、１μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）及び１×Rediload色素（Invitrogen, Carlsbad, CA）（25μlの最終体積）を用いて組み立てた。増幅を次の通りに行った：１サイクル、94℃で１分、35サイクル、94℃で310秒、66℃で30秒、続いて１サイクル、72℃で５分。約10mlのPC反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。このPCRによれば、Ztnf12×1は230bpであり、そしてZtnf12×2は314bpである。ゲノムPCR生成物は533bpである。
Ztnf12×1 mRNAは、それらのサンプル中の２種において、すなわち休眠CD4＋ヘルパーT細胞及び休眠CD8＋細胞毒性T細胞において発現される。Ztnf12×2は、それらの末梢血液画分のいずれにおいても発現されない。
例９：PCRを用いてのcDNAパネルにおける組織分布：
ヒト組織からの第１鎖cDNAの２つのパネルを、PCRを用いてztnf12発現についてスクリーンした。パネルは、自家製造され、そして種々のヒト組織（心臓、脳、膀胱、腎臓、前立腺、前立腺上皮、精巣、乳房、子宮内膜、乳腺、卵巣、胎盤及び子宮の正常、癌及び疾病組織）からの94の第１鎖cDNAを含んだ。第１鎖cDNAプレートのための第１鎖cDNAを、自家RNA preps, Clontech RNA, 又はInvitrogen RNAから生成した。パネルサンプルの質を確認するために、PCRを同時に行った。パネルを、正の対照サンプルとして100ngのヒトゲノムDNA（Clontech, Palo Alto, CA）を含む96−ウェル形で設定した。個々のウェルは、100ngの全RNAから合成された第１鎖cDNAを含んだ。
PCR反応を、0.5μlの20μMの個々のオリゴZC47229（配列番号24）及びZC47230（配列番号25）、2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、１μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）及び１×Rediload色素（Invitrogen, Carlsbad, CA）（25μlの最終体積）を用いて組み立てた。増幅を次の通りに行った：１サイクル、94℃で２分、35サイクル、94℃で30秒、64℃で20秒、及び72℃で45秒、続いて１サイクル、72℃で５分。約10mlのPC反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。オリゴは、両形、すなわちZtnf12×1及びZtnf12×2形を採取するが、しかしそれらの間を区別しない。
この実験の結果は、ztnf12発現が組織のこの採取は非常にまれであることを示す。Ztnf12 mRNA発現は、３種の正常精巣サンプルの２種において、はるかに強かった。興味あることには、２種の精巣癌サンプルは、Ztnf12に対して陰性であった。いくつかの脳サンプルはZtnf12に関して陽性であるが（８種の脳癌サンプルのうち４種及び５種の正常脳サンプルのうち３種）、その発現レベルは、精巣サンプルに比較して、かなり低く出現した。ztnf12についての他の散在される陽性は、膀胱、腎臓、卵巣、子宮及び子宮内膜に存在した。子宮内膜においては、８種のサンプルのうち３種がztnf12に関して陽性であり、そしてそれらのうち２種が、精巣を除いて、他の陽性よりも高い発現レベルで認識できた。
例10：PCRを用いてのcDNAパネルにおける組織分布：
自家製造されたcDNAライブラリー及びマラソンcDNAからのDNAのパネルを、PCRを用いて、ztnf12マウス発現についてスクリーンした。パネルは、種々のマウス組織（正常、癌及び疾病）及び休眠又は刺激された細胞系から製造されたcDNAライブラリー及びマラソンcDNAからの49のDNAサンプルを含んだ。前記cDNAライブラリーを、平均挿入体サイズについてベクターオリゴによるPCR、αチューブリンについてPCR又は十分な長さのcDNAについてG3PDHによりQC試験し、そしてリボソーム又はミトコンドリアDNA汚染について配列決定した。
パネルをまた、ネズミカテプシンzプライマーによるPCRによりQC試験した。パネルを、正の対照サンプルとして1ngのマウスゲノムDNA（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）を含む96−ウェル形で設定した。個々のウェルは、100ngの17.5μlのcDNA及び水を含んだ。PCR反応を、0.5μlの20μMの個々のオリゴZC47826（配列番号26）及びZC47827（配列番号27）、2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、１μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）及び１×Rediload色素（Invitrogen, Carlsbad, CA）（25μlの最終体積）を用いて組み立てた。
増幅を次の通りに行った：１サイクル、94℃で１分、35サイクル、94℃で10秒、62℃で25秒、及び72℃で25秒、続いて１サイクル、72℃で５分。約10mlのPC反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。マウスztnf12 PCR生成物は186bpであり、そしていずれかの汚染性ゲノムDNAが、446bpのサイズのPCR生成物により区別できる。
下記表５に見られるこの発現プロフィールの結果は、マウスztnf12が制限された発現を示すことを示唆する。ztnf12についての強い陽性は、精巣及び皮膚においてのみ存在する。弱い陽性は、平滑筋、脾臓、子宮、胃、膵臓、及びマクロファージ細胞系p388D1、前立腺細胞系Jakotoy及びTuvak、及び骨芽細胞系OC10B及びCCC4において観察された。
表５：
細胞/細胞系 生物学的システム Ztnf12 mRNA
229 骨格 ナシ
7F2 骨格 ナシ
7F2-Fat 骨格 ナシ
脂肪細胞−増幅された 骨格 ナシ
αTC1.9脾臓α細胞系 消化 ナシ
脳 神経 ナシ
脳 神経 ナシ
脳 神経 ナシ
脳−整列されたライブラリー 骨格 ナシ
CCC4骨芽細胞系 骨格 存在
膵臓CD90＋（増幅された）T細胞 リンパ ナシ
膵臓CD90＋（増幅された）T細胞 リンパ ナシ
組合されたOC10B骨芽細胞系 骨格 存在
樹状突起 PBL ナシ
胚（ライブラリー） 全身体 ナシ
心臓 心血管（及び内分泌） ナシ
心臓 心血管（及び内分泌） ナシ
腎臓 尿（及び内分泌） ナシ
腎臓 尿（及び内分泌） ナシ
腎臓 尿（及び内分泌） ナシ
肝臓 消化 ナシ
肝臓 消化 ナシ
肺 呼吸 ナシ
肺 呼吸 ナシ
MEWT#2−増幅された BAF3トランスフェクトされた/骨髄 ナシ
P388D1マクロファージ−様細胞系 リンパ 存在
膵臓 消化（内分泌） 存在
胎盤−増幅された 女性生殖（及び内分泌） ナシ
胎盤−整列されたライブラリー 女性生殖（及び内分泌） ナシ
Jakotay−前立腺細胞系 男性生殖 存在
Nelix−前立腺細胞系 男性生殖 ナシ
Paris−前立腺細胞系 男性生殖 ナシ
Torres−前立腺細胞系 男性生殖 ナシ
Tuvak−前立腺細胞系 男性生殖 存在
唾液−増幅された 消化 ナシ
唾液−整列されたライブラリー 消化 ナシ
骨格筋 筋肉 ナシ
皮膚 外皮 存在
皮膚−増幅された 外皮 ナシ
小腸 消化（及び内分泌） ナシ
平滑筋 種々 ナシ
平滑筋 種々 存在
脾臓 リンパ 存在
脾臓 リンパ 存在
胃 消化（及び内分泌） 存在
精巣 男性生殖（及び内分泌） 存在
精巣−増殖された 男性生殖（及び内分泌） 生存
精巣−整列されたライブラリー 男性生殖（及び内分泌） 生存
胸腺 リンパ（及び内分泌） ナシ
子宮 女性生殖（及び内分泌） 存在
例11：ノザンブロット及び疾病プロフィールアレイ上でのztnf12の発現：
センスプライマーzc47230（配列番号28）及びアンチセンスプライマーzc47231（配列番号29）を、次の通りにノザンブロット及び疾病アレイ上での使用のための384bpのフラグメントを生成するために35μlのPCR反応に使用した：2.5μlの10×Advantage2緩衝液及び0.5μlのAdvantage2ポリメラーゼミックス（BD Biosciences, Clontech, Palo Alto, CA）、2.5μlのRedi-Load (Invitrogen, Carlsbad, CA)、2μlの2.5mMのdNTP（Applied Biosystems, Foster City, CA）、0.5μlの20μMの個々のzc47230及び47231、膵臓からの２μlの第１鎖cDNA（100ngの出発全RNAからの第１鎖cDNAを表す）、及び25μlの水。
サイクリング条件は次の通りであった：１サイクル、94℃で２分、35サイクル、94℃で30秒、64℃で30秒、72℃で45秒、続いて１サイクル、72℃で５分、及び４℃での維持。反応をアガロールゲルにおいて実施し、そしてフラグメントを、Qiagenゲル精製カラム（Qiagen, Velencia, CA）を用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。フラグメントを、分光計読取により定量化した。
25ngのフラグメントを、Prime-It II 試薬 (Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、その製造業者の説明書に従ってラベルし、そしてS−200マイクロスピンカラム（Amersham, Piscataway, NJ）を用いて、その製造業者のプロトコールに従って、組込まれていないヌクレオチドから分離した。ztnf12によりプローブされるべきブロット（自己免疫及び血液疾患プロフィーリングアレイ、 癌プロフィーリングアレイ、胎児複数組織ノザンブロット 、複数組織ノザンブロット I 及び III、複数組織発現アレイ、すべてはBD Biosciences, Clontech, Palo Alto, CAからであり、及び関連する細胞系からのmRNAによる1つの自家ブロット）を、ブロットへの添加の前、煮沸され、そして急冷された、100μg/mlのサケ精子DNA（Stratagene, La Jolla, CA）及び６μg/mlのcot-I DNA（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下で、ExpressHyb (BD Biosciences, Clontech Palo Alto, CA)において55℃で一晩プレハイブリダイズした。
放射性ラベルされたztnf12、サケ精子DNA及びcot-1 DNAを一緒に混合し、そして5’煮沸し、続いて氷上で急冷した。サケ精子DNA及びcot-1 DNAの最終濃度は、プレハイブリダイゼーション段階における通りであり、そして放射性ラベルされたztnf12の最終濃度は1×1O6cpm/mlであった。ブロットを、55℃でローラーオーブンにおいて一晩ハイブリダイズし、次にRTで２×SSC、0.1％SDSにおいて、何回かの緩衝液変化を伴って、次に650℃で十分に洗浄した。最終洗浄は、65℃での0.1×SSC、0.1％SDSによった。次に、ブロットを、強いスクリーンによりフィルムに２週間、暴露する。
免疫細胞系ブロット及び複数組織ノザンブロットを、トランスフェリン受容体フラグメントによりプローブした。PCRフラグメントを、分光計読取により定量化した。トランスフェリン受容体フラグメントをラベルし、そして上記のように、複数組織ノザンブロット及び免疫細胞系ノザンブロットをプローブするために使用した。ブロットを、強いスクリーンによりフィルムに７日間、暴露した。結果は、複数組織ノザンブロット及び免疫細胞系ブロットに関して、図１に、複数組織発現アレイに関して、図２に、及び免疫プロフィールアレイに関して、図３に示される。
ztnf12による複数組織ノザンブロットのプロービングの結果は、ztnf12 mRNAが一般的に、まれであるが、但し精巣において強い発現レベルが存在することを示す。２種の転写サイズは、精巣に見られるようにztnf12の約1kb及び2kbに帰する。約3kbでのもう１つの可能性あるztnf12転写体が、小腸において非常にかすかに見られる。免疫細胞系及び胎児組織のノザンブロットは、検出のこのレベルでztnf12 mRNA発現を示さない。トランスフェリン受容体対照プロービング実験は、ブロットが一定水準の性質のものであり、そして低〜中位に発現された対照遺伝子が１週間の暴露で観察されることを示す。
複数組織発現アレイにおいては、精巣における強い発現が再び明らかであり、そしてリンパ節における注目すべき発現は複数組織のザンブロット上には存在しなかった。さらに、癌プロフィーリングアレイ上では、いくらかの腫瘍型において、ztnf12 mRNAが、通常のztnf12 mRNAレベルに比較して、ダウンレギュレートされるように見える。この差異は、腎臓、肝臓、膵臓及び小腸において観察され得る。血液及び自己免疫疾患プロフィーリングアレイにおいては、ztnf12レベルは一般的に、検出できないほど非常に低く、そして疾病状態への明らかな相互関係は存在しない。
例12：RTPCRによるU937, THP1及びHL-60細胞系におけるztnf12 mRNAの分布：
20mg/mlのPMA及び20ng/mlのPMA＋0.5μg/mlのイノマイシンにより6、11及び24時間、刺激されたU937細胞を、100ng/mlのPMAにより11、24及び48時間、刺激した。HL−60細胞を、ビタミンD3、酪酸、レチン酸、PMA又はDMSOにより種々の時点で刺激した。細胞を収穫し、そして全RNAを、Qiagen (Valencia, CA) RNeasyを用いて、その製造業者の説明書に従って、前記プロトコール中に組込まれる任意のDNAse段階を用いて精製した。RNAを、DNA−フリー試薬（Ambion, Inc, Austin, TX）を用いて、その製造業者の説明書に従ってDNA化した。
RNAの質を、Agilent Bioanalyzer上でアリコートを走行することにより評価した。RNAが有意に分解される場合、それは、第１鎖cDNAの続く創造のためには使用されなかった。汚染性ゲノムDNAの存在を、カテプシンZ遺伝子座でのイントロン内のゲノムDNAにおける単一部位を増幅するプライマーによるRNAのアリコートに対するPCRアッセイにより評価した。汚染性ゲノムにDNAアッセイについてのPCR条件は次の通りであった：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び0.5μlの20μMのzc 37263及びzc37264（最終体積25μl）。
サイクリングパラメーターは次の通りであった：94℃で20秒、94℃で20秒、62℃で20秒、72℃で１分（40サイクル）、及び72℃で7分（１サイクル）。10μlの個々の反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてゲルを、汚染性ゲノムDNAからのPCR生成物の存在について試験した。汚染性ゲノムDNAを有さないよう出現したRNAのみが、第１鎖cDNAの続く創造のために使用された。
第１鎖cDNAを製造するために、個々のサンプルからの1μgの全RNAを、水により8μlにした。個々のアリコートに、第１鎖cDNa合成のための試薬（Invitrogen First Strand Synthesis System, Carlsbad, CA）：0.8μlのオリゴdＴ 、0.8μlのランダムヘキサマー、10μlのdNTPを添加し、そして65℃に５分間、加熱した。サンプルを、氷上で１分間インキュベートし、42℃にし、そして4μlの25mMのMgCl2、2μlの10×RT緩衝液、2μlの0.1MのDTT、１μlのRNAseOut及び１μlのSuperscript II 逆転写酵素を添加した。サンプルを次の通りにインキュベートした：25℃で10分、42℃で50分、70℃で15分。１μlのRNAse Hを個々のサンプルに添加し、そして37℃で20分間インキュベートした。
第１鎖cDNAの質を、２種の広く発現されるが、しかし適度に富んだ遺伝子、すなわちCLTC（クラスリン）及びTFRC（トランスフェリン受容体C）に対するプライマーを用いて、１組のパネルに対する多重PCRアッセイにより評価した。10μlの個々の反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてゲルを、予測されるサイズの強いPCR生成物の存在について評点を付けた。
Ztnf12 mRNAの発現を、サンプル当たり次のPCR条件下でセンスオリゴzc47496（配列番号20）及びアンチセンスオリゴzc47497（配列番号21）を用いてPCRによりアッセイした：0.5μlの20μMの個々のオリゴ、2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage 2 ポリメラーゼミックス (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、１μlの2.5mMのdNTPミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、1X Rediload 色素 (Invitrogen, Carlsbad, CA)及び１μlの第１鎖cDNA鋳型又は1μlの体積における第１鎖鋳型の10倍希釈溶液（次に、合計体積は25μlに調節された）。
100ngの出発全RNAからの同等の第１鎖cDNAを、ztnf12発現について試験した。増幅を次の通りに行った：１サイクル、94℃で２分、35サイクル、94℃で30秒、67℃で30秒、及び72℃で１分、続いて１サイクル、72℃で７分。約10mlのPCR反応生成物を、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてサンプルを、ztnf12の陽性又は陰性発現について評点を付けた。
結果は、それらの条件下で、ztnf12 mRNAの発現がU937, THP1及びHL60細胞において、刺激を伴っても又は伴わないでも、検出できないことを示す。
例13：ヒトztnf12のクローニング：
Ztnf12、zc47236（配列番号38）の推定上の5’未翻訳領域におけるプライマー、及びztnf12, zc47324（配列番号39）の推定上の3’未翻訳領域におけるプライマーを、次の通りに、十分な長さのZtnf12×cDNAを生成するためにPCR反応に使用した：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのUltra Pfu ポリメラーゼ (Stratagene, LaJolla, CA)、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、10％DMSO（Sigma, St. Louis, MO）及び１×Rediload 色素（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び増幅された実験用膵臓cDNAライブラリーからの100ngのDNA（25μlの最終体積）。
サイクリング条件は次の通りであった：１サイクル、94℃で１分、35サイクル、94℃で10秒、62℃で30秒及び72℃で１分20秒、続いて１サイクル、72℃で５分。反応を、アガロールゲル電気泳動にゆだね、そしてPCR生成物をゲルから切除し、そしてQiaquick（Qiagen, Valencia, CA）ゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。フラグメントを、TOPOベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に、その製造業者の説明書に従ってサブクローン化し、そして配列決定し、ztnt12×1の十分な長さのcDNA配列を生成した。
ztnf12×2を、類似する態様でクローン化スルことができる。
例14：マウスztnf12のクローニング：
コード配列に対して内部のプライマーを企画し、そして5’及び3’RACE（CDNA末端の急速な増幅）を、増幅された自家マウス精巣ライブラリーからのDNAに対して行った。5’RACE反応についての条件は次の通りであった：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び0.5μlの20μMのzc 47826（配列番号26）、アンチセンスマウスztnf12プライマー、及びzc15191（配列番号40）、ベクタープライマー、及び54ngのマウス精巣ライブラリーのDNA（最終体積25μl）。
サイクリングパラメーターは次の通りであった：94℃で１分、66℃で３分（５サイクル）、94℃で10秒、64℃で30秒、72℃で２分30秒（15サイクル）、及び72℃で５分（１サイクル）。反応をアガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてPCR生成物をゲルから切除し、そしてQiaquick (Qiagen, Valencia, CA)ゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。3’RACE反応についての条件は次の通りであった：2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのAdvantage2 cDNAポリメラーゼミックス（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）、及び0.5μlの20μMのzc 47827（配列番号27）、アンチセンスマウスztnf12プライマー、及びzc19436（配列番号41）、ベクタープライマー、及び54ngのマウス精巣ライブラリーのDNA（最終体積25μl）。
サイクリングパラメーターは次の通りであった：５サイクル、94℃で１分、64℃で30秒、72℃で２分30秒、15サイクル、94℃で10秒、62℃で30秒、72℃で２分30秒、及び１サイクル、72℃で５分。反応をアガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてPCR生成物をゲルから切除し、そしてQiaquick (Qiagen, Valencia, CA)ゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。次に、5’及び3’ゲル精製されたRACEフラグメントを、上記と同じ条件を用いて、それぞれ64℃及び62℃でさらに15サイクル増幅した。反応を、アガロースゲル電気泳動にゆだね、そしてPCR生成物をげるから切除し、Qiaquick (Qiagen, Valencia, CA)ゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製し、そして分光計読取により定量化した。
オーバーラップPCR反応を、5’及び3’RACフラグメントから十分な長さのマウスztnf12を生成するために、次のものを使用した：1μlの個々の20μMのベクタープライマーzc19436及びzc15191、 2.5μlの10×緩衝液及び0.5μlのUltra Pfu ポリメラーゼ(Stratagene, CA)、２μlの2.5mMのdNTPミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）、10％DMSO（Sigma, St. Louis, MO）及び１× Rediload色素（Invitrogen, Carlsbad, CA）、34ng及び38ngの5’及び3’RACEフラグメント（25μlの最終体積）。
サイクリング条件は次の通りであった：１サイクル、94℃で１分、30サイクル、94℃で10秒、64℃で30秒及び72℃で２分、続いて１サイクル、72℃で５分。反応を、アガロールゲル電気泳動にゆだね、そしてPCR生成物をゲルから切除し、そしてQiaquick（Qiagen, Valencia, CA）ゲル抽出キットを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。フラグメントを、TOPOベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に、その製造業者の説明書に従ってサブクローン化し、そして配列決定し、マウスztnt12の十分な長さのcDNA配列を生成した。
例15：発現プラスミドZtinf12NFpZMP21の構成：
ztnt12をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、相同組換えにより構成することができる。ztnt12 cDNAのフラグメントを、ztnt12挿入点を両端に有するベクター配列に対応する5’及び3’末端でのフランキング領域を有する配列番号19のポリヌクレオチドを用いて、PCRにより単離する。プライマーzc47771及びzc47756は、それぞれ配列番号42及び43で示される。
PCR反応混合物を、２％アガ−ロスゲル上で展開し、そして挿入体のサイズに対応するバンドを、QIAquickTM Gel Extractionn Kit( Qiagenn, Valencia, CA )を用いてゲル抽出する。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン、複数のE．コリ起点を有する発現カセット；SV40プロモーター、エンハンサー及び複製の起点、DHFR遺伝子及びSVターミネーターを含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；及びS.セレビシアエにおける選択及び複製のために必要とされるURA3及びCEN−ARS配列を含む哺乳類発現ベクターである。
それを、pZP9（受託番号98668号として、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）、及びpRS316（受託番号77145号として、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されている）から取られた酵母遺伝子要素、ポリオウィルスから内部リボソーム侵入部位（IRES）要素、並びにトランスメンブラントドメインのC−末端で切断されたCD8の細胞外ドメインから構成した。プラスミドpZMP21を、BglIIにより消化し、そしてPCR挿入体との組換えのために使用した。
組換えを、BD In-FusionTM Dry-Down PCR Cloningキット（BD Biosciences, Palo Alto, CA）を用いて行った。PCRフラグメント及び消化されたベクターの10ml混合物を、凍結乾燥されたクローニング試薬に添加し、そして37℃で15分及び50℃で15分間インキュベートした。反応は、形質転換の用意が整った。2μlの組換え反応を用いて、One Shot TOP10 Chemical Competent Cells (Invitrogen, Carlbad, CA)を形質転換し；形質転換反応物を氷上で10分間インキュベートし、そして42℃で30秒間、熱ショックを与えた。反応物を、氷上で２分間インキュベートした（形質転換された細胞の回収を助ける）。
２分間のインキュベーションの後、300μlのSOC（2% BactoQ Tryptone (Difco, Detroit, MI)、 0.5% 酵母抽出物 (Difco)、10 mMの NaCl、 2.5 mMのKCｌ、10 mMのMgCl2、 10 mMのMｇSO4、 20 mMのグルコース）を添加し、そして形質転換体を、１時間、振盪しながら、37℃でインキュベートした。全形質転換体を、１つのLB AMPプレート（LB ブイヨン (Lennox), 1. 8%のBactoQ Agar (Difco), 100 mg/L のアンピシリン）上にプレートした。
コロニーを、それぞれ配列番号22及び23で示されるプライマーzc47771及びzc47756を用いてPCRによりスクリーンした。陽性コロニーを、配列決定により確めた。正しい構造体を、ztng12NFpZMP21として命名した。
例16：タンパク質生成：
３組の200μgのzTNF12_NF構造体をそれぞれ、200単位のPvuIにより37℃で３時間、消化し、そして次に、IPAにより沈殿し、そして1.5mlの微小遠心分離管において回転沈降した。上清液をペレットからデカントし、そしてペレットを1mlの70％エタノールにより洗浄し、そして室温で５分間インキュベートした。管を14,000RPMで10分間、微小遠心分離機において回転し、そして上清液をペレットからデカントした。次に、ペレットを、無菌環境下で750μlのPF−CHO培地に再懸濁し、60℃で30分間インキュベートし、そして室温に冷却した。
5E6 APFDXB11細胞を、３本の管の個々から回転沈降し、そしてDNA−培地溶液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を、0.4cmのギャップキュベットに配置し、そして次のパラメーターを用いてエレクトロポレートした：950μF、高いキャパシタンス及び300V。次に、キュベットの内容物を除き、プールし、そしてPF-CHO培地により25mlの希釈し、そして125mlの振盪フラスコに配置した。フラスコを、37℃、６％CO2でのシェーカー上でのインキュベーターに配置し、そして120RPMで振盪した。
細胞系を、栄養選択、続いて200nMのメトトレキセート（MTX）及び次の500nMのMTXの段階的増幅にゆだねた。検出できるレベルの分泌されたタンパク質はウェスターンブロットにより見出されないが、しかしながら細胞溶解物中のタンパク質は検出された。
例17：ztnf12-MBP融合発現ベクターpTAP170/ztnf12の構成：
マルトース結合タンパク質（MBP）にN−末端で融合されるヒトztng12の一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、相同組換えにより構成する。ヒトztng12 cDNAのフラグメント（配列番号47）を、PCRを用いて単離する。次の２種のプライマーを、PCR反応におけるヒトztng12フラグメントの生成に使用する：（１）ベクターフランキング配列の34bp及びヒトztng12のアミノ末端に対応する24bpを含むプライマーzc47809（配列番号44）、及び（２）前記フランキングベクター配列に対応する3’末端の25bp及びヒトztng12のカルボキシル末端に応答する24bpを含むプライマーZC47810（配列番号45）。
PCR反応条件は次の通りであった：PCR増幅反応条件は次の通りである：１サイクル、95℃で２分；30サイクル、95℃で30秒、続いて62℃で30秒、続いて72℃で1.5分；１サイクル、72℃で10分。個々の４種の25μlPC反応を、1.2％アガロースゲル上で走行し、そして約1172bpのフラグメントの予測されるバンドを見出した。1172bpのバンドをゲルからの切除し、そしてQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, カタログ番号28704)を用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。DNAを、30mlの溶出緩衝液Bを用いて回転カラムから溶出した。10mlの精製されたPCR生成物を、下記のように、SmaIにより切断された受容体ベクターpTAP170への組換えのために使用し、MBP−ヒトztnf12融合体をコードする構造体を生成した。
プラスミドpTAP170は、プラスミドpRS316及びpMAL-c2に由来する。プラスミドpRS316は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）シャトルベクターである（Hieter P. and Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989）。pMAL-C2 (NEB)は、E.コリ発現プラスミドである。それは、tacプロモーター駆動MalE（MBPコードの遺伝子）、続いて、His標識、トロンビン切断部位、クローニング部位及びrrnBターミネーターを担持する。ベクターpTAP170を、酵母相同組換えを用いて構成する。100ngのEcoRI切断された、pMAL-c2を、１μgのPvuI切断されたpRS316, 1μgのリンカーと共に組合し、そして１μgのScaI/EcoRI切断されたpRS316を、PCR反応において再組合す。
オリゴヌクレオチドzc19,372（配列番号30）（100pモル）、zc19,351（配列番号31）（1pモル）、zc19,352 (配列番号32)（1pモル）及びzc19,371（配列番号33）（100pモル）から成るリンカーを、PCR反応において組合した。条件は次の通りであった：94℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で30秒（10サイクル）；続いて４℃でのソーキング。PCR生成物を、100％エタノール沈殿により濃縮した。
100μlのコンピテント酵母細胞（S.セレビシアエ）を、約１μgのヒトztnf12挿入体及び100ngのSmaI消化されたpTAP170ベクターを含む混合物数10μLと共に組合し、そして0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV（５kV /cm）、無限オーム、25μFで電気パルスした。個々のキュベットに、1.2Mのソルビトール600μlを添加した。次に、酵母を、２つのURA Dプレート上に、２つの300μlのアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベートした。
約48時間後、単一のプレートからのUra＋酵母形質転換体を、1mlの水に再懸濁し、そして短時間、回転せしめ、酵母細胞をペレット化した。その細胞ペレットを、1mlの溶融緩衝液（２％Triton X-100, 1%SDS, 100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0，1mMのEDTA）に再懸濁した。この溶融混合物500μlを、300μlの酸洗浄されたガラスビーズ及び500μlのフェノール−クロロホルムを含むEppendorf管に添加し、１分間、２又は３度、かき混ぜ、続いて５分間、最大速度で、Eppendorf遠心分離機において回転せしめた。300μlの水性相を、新しい管に移し、そしてDNAを600μlの100％エタノール（EtOH）により沈殿せしめ、続いて、４℃で10分間、遠心分離した。DNAペレットを100μlの水に再懸濁した。
エレクトロコンピテントE.コリ細胞（DH10B, Invitrogen）の形質転換を、1mlの酵母DNA調製物及び40mlのDH10B細胞により行った。細胞を、2.5kV, 25mF及び400オームで電気パルスした。エレクトロポレーションの後、1.0mlのSOC（２％BuctoTM Trypton (Difco, Detroit, MI), 0.5％酵母抽出物（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、添加した。37℃での30分間のインキュベーションの後、細胞をLB Kanプレート(LBブイヨン(Lennox), 1.8% Bactoa Agar (Difco), 30 mg/ｌ のカナマイシン)上に１アリコートでプレートした。
ヒトztnf12についての正しい発現構造体を有する個々のクローンを、コロニーPCRにより同定し、そして配列を確めた。コロニーPCR条件は次の通りである：１サイクル、95℃で５分；30サイクル、95℃で15秒、続いて55℃で30秒、続いて68℃で30秒；１サイクル、68℃で２分。48の25μlのPCR反応物のそれぞれ10μlを、1.2％アガロースゲル上で走行し、そして約1172bpのフラグメントの予測されるバンドを見出した。
２種のコロニーPCR陽性クローンの二本鎖配列を、ABI PRISM BigDye Terminator v2.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて決定した。配列決定反応を、EdgeBioSystems Centriflex GelFiltration Cartridges (Gaithersburg,MD)を用いて精製し、そしてABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)上で実施した。得られる配列データをアセンブリーし、そしてSequencher v4.1 software (GeneCodes Corporation, Ann Arbor,MI)を用いて編集した。
エレクトロコンピテントE.コリ細胞（MC1061, Casadaban など. J. Mol. Biol. 138, 179-207）の形質転換を、1mlの配列決定DNA及び40mlのMC1061細胞により行った。細胞を、2.0kV, 25mF及び400オームで電気パルスした。エレクトロポレーションの後、1.0mlのSOC（２％BuctoTM Trypton (Difco, Detroit, MI), 0.5％酵母抽出物（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、添加した。37℃での30分間のインキュベーションの後、細胞をLB Kanプレート(LBブイヨン(Lennox), 1.8% Bactoa Agar (Difco), 30 mg/ｌ のカナマイシン)上に１アリコートでプレートした。
ヒトztnf12について正しい発現構造体を有する個々のクローンを、発現により同定した。細胞を、30mg/mlのカナマイシンと共にSuperbroth (Becton Dickinson)において一晩、増殖した。50mlの前記一晩の培養物を用いて、2mlの新しいSuperbroth II＋30mg/mlのカナマイシンを接種した。培養物を振盪しながら37℃で２時間、増殖した。1mlの培養物を、1mMのIPTGにより誘発した。２〜４時間後、250mlの個々の培養物と、250mlのThorner緩衝液（8Mのウレア、100mMのトリス、pH7.0、10％グリセロール、2mMのEDTA、５％SDS）とを、5％bME及び色素と共に混合した。
サンプルを70℃で10分間、加熱した。その20mlを、４％〜12％のPAGEゲル（Invitrogen）上にレーン当たり負荷した。ゲルを、１×MES緩衝液において走行した。陽性クローンを、ztnf12/pTAP170と命名した。Ztnf12/pTAP170内のMBP-ztnf12融合体のポリヌクレオチド配列は、配列番号34で示されており、そしてその対応するMBP-ztnf12融合体のポリペプチド配列は配列番号35で示されている。
例18：ヒトztnf12の細菌発現：
Ztnf12クローンを用いて、Superbroth II (Becton Dickinson) 及び30mg/mlのカナマイシンの一晩の開始培養物を接種した。開始培養物を用いて、500mlのSuperbroth II＋Kanによりそれぞれ充填された2Lのそらせ板付フラスコを接種した。培養物を、OD600が1.89に達するまで、250rpmで37℃で振盪した。この点で、培養物を、1mMのIPTGにより誘発した。培養物を37℃で４時間以上、増殖し、次に、250rpmでの遠心分離により収穫した。ペレットを、タンパク質精製に移行されるまで、−80℃で貯蔵した。
細胞ペレットを、200rpm、37℃で１時間、プラットフォームシェーカー上で振盪しながら、200mlの均質化緩衝液（50mMのトリス、pH7.4、15mMのNacl）に再懸濁した。細胞を、細胞懸濁液を4℃に維持しながら、8,500〜9,000ポンド/in2でAPV2000（APV Homogenizer Group, Wilmington, MA）に３度、通すことにより溶解した。完全な細胞溶解物のアリコートを、後での分析のために保持した。均質化された細胞懸濁液を、12,000×gで４℃で30分間、遠心分離スルことにより透明化した。上清液を注意してデカントし、そして貯蔵し、そして不溶性ペレットを貯蔵した。完全な細胞溶解物を、透明化された上清液及び不溶性ペレットに対してSDS−PAGEにより分析し、標的分子MBP−ztnf12の分割を評価した。MBP−ztnf12分子は、不溶性画分に分割した。
不溶性画分（ペレット）を、8Mのウレア、50mMのトリス、pＨ7.4、150mMのNaClの存在下でポータブル組織ホモナイザーにより均質化した。得られる均質物を、12,000×g、4℃で１時間、透明化した。組換え標的物を、親和性クロマトグラフィーにより、透明化された溶解物から精製した。アミロース樹脂（New England BioLabs, Beverly, MA）を、均質化緩衝液により平衡化した。平衡化された樹脂（10ml）を、前記透明化された上清液と共に組合し、そして4℃で一晩、当分した。次に、溶解物/樹脂スラリーを、空のガラスカラム中に注ぎ、樹脂を充填し、そして重力介在性精製を進行せしめた。流出物を集めた。カラムを、約20カラム体積（CV）の均質緩衝液により洗浄し、そして集めた。
タンパク質を、10mMのマルトースを含む均質緩衝液（Fluka, Milwaukee, WI）により溶出した。画分を集め、そしてSDS−PAGEにより分析した。画分のプールは、分析された画分におけるMBP−ztnf12の純度/質、及び質に基づかれた。プールされた画分を、4LのPBS（7mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、pH7.3）を３回、変えることにより透析した。最終生成物を、標準の方法を従って、0.2mmのフィルターにより濾過し、SDS−PAGE及びウェスタンブロットにより分析し、その後、等分し、-80℃で貯蔵した。
例19：遺伝子修飾を担持するマウスの生成：
ネズミztnf12を発現するトランスジェニックマウスの生成：
“トランスジェニックマウス”として言及される、ztnf12遺伝子を発現するように構築されたマウス、及び“ノックアウトマウス”として言及される、ztnf12遺伝子機能の完全な不在を示すマウスがまた、生成され得る（Snouwaertなど., Science 257: 1083, 1992; Lowellなど., Nature 366: 740-742, 1993; Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiterなど., Annu. Rev. Genet. 20: 465-499, 1986）。例えば、偏在的に、又は組織−特異的又は組織−制限されたプロモーター下でztnf12を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定するために使用さえ得る。
例えば、野生型ztnf12ポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント又は変異体の過剰発現は、正常な細胞工程を変更することができ、ztnf12発現が機能的に適切であり、そしてztnf12、そのアゴニスト又はアンタゴニストのための治療標的物を示すことができる組織を同定する表現型をもたらす。例えば、構築する好ましいトランスジェニックマウスは、ztnf12 （配列番号36）を過剰−発現するものである。さらに、そのような過剰発現は、ヒト疾病、例えば一定のリンパ球の上昇または一定の組織における炎症応答の上昇との類似性を示す表現型をもたらすことができる。
同様に、ノックアウトztnf12マウスは、ztnf12がインビボで絶対的に必要とされる場所を決定するために使用され得る。ノックアウトマウスの表現型は、ztnf12アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるそれらのもの、例えば一定のリンパ球のミッシング又は低められた集団、又は炎症攻撃に対する応答を有するインビボ効果を予測することができる。本明細書に記載されるヒト又はマウスztnf12 cDNAが、ノックアウトマウスを生成するために使用され得る。
それらのマウスは、ztnf12遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用され得、そしてヒト疾病に対応するインビボモデルとして使用され得る。さらに、Ztnf12アンチセンスポリヌクレオチド、Ztnf12に対して指図されたリボザイム又はsiRNAのトランスジェニックマウス発現が、上記トランスジェニックマウスに類似して使用され得る。研究が、精製されたZtnf12タンパク質の投与により行われる。
トランスジェニックマウス及びKOマウスの両者は、詳細な分析、例えばPhysioScreen（体重、組織重量、CBC,臨床学的化学、全体観察及び組織病理学の収集）、種々の器官における血液細胞及びリンパ球のFACS分析、及びいくつかの刺激剤が免疫又は炎症応答におけるZtnf12の機能を確めるために使用され得る動物モデルにより十分に研究されるであろう。
A. Ztnf12トランスジェニックマウスを生成するための構造体：
１．リンパ−特異的EμLCKプロモーターからネズミZtnf12を発現するための構造体：
コンセンサスKozak配列及びネズミZtnf12（配列番号37及び46）コード領域を含むPCRフラグメントを生成するようオリゴヌクレオチドを企画する。それらのオリゴヌクレオチドを、pKFO51中へのクローニングを促進するために、5’末端でのFseI部位及び3’末端でのAscI部位を有するよう企画する。
PCR反応を、200ngのネズミZtnf12鋳型（配列番号36）、及び十分な長さ又は活性部分のZtnf12を増幅するよう企画されたオリゴヌクレオチドにより行う。PCR反応を、当業界において知られている方法を用いて行う。単離された、正しいサイズのDNAフラグメント（zTNF12について1548bp、及びzTNF13について860bp）を、FseI及びAscI (Boerhinger-Mannheim) により消化し、エタノール沈殿し、そしてFseI及びAscIにより前もって消化されたpKFO51中に連結する。pKFO51トランスジェニックベクターは、p1026×（Iritani, B. M. , など., EMBO J.16: 7019-31, 1997）から誘導され、そしてT細胞−特異的Lck近位プロモーター、B/T細胞−特異的免疫グロブリンμH鎖エンハンサー、所望するクローンの挿入のためのポリリンカー、及び不活性成長ホルモンタンパク質コードする突然変異誘発されたhGH遺伝子（3’イントロン及びポリアデニル化シグナルを提供する）を含んだ。
約１μlの個々の連結反応を、DH10B ElectroMaxTM コンピテント細胞（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）中に、その製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートする。コロニーを採取し、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地において増殖する。ミニプレプDNAを、前記採取されたクローンから調製し、そして組み合わされたFseI及びAscIによる制限消化及び続くアガロースゲル電気泳動によりヒトZtnf12挿入体についてスクリーンする。正しいEμLCネズミZtnf12の最大調製を行う。
LCK 近位プロモーター及び 免疫グロブリンμエンハンサー（EμLCK）、ネズミZtnf12 cDNA、突然変異誘発されたhGH遺伝子を含むNotIフラグメントを、受精されたネズミ卵母細胞中へのマイクロインジェクションのために使用されるよう調製する。トランスジェニックマウスのマイクロインジェクション及び生成は、Hogan, B. など. Manipulationg the Mouse Embryo, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994に記載のようにして行われる。
２．MT−１プロモーターからネズミZtnf12を発現するための構造体：
コンセンサスKozak配列及びネズミZtnf12コード領域を含むPCRフラグメントを生成するようオリゴヌクレオチドを企画する。それらのオリゴヌクレオチドを、（ａ）pMT12-8（本発明者の標準のトランスジェニックベクター）中へのクローニングを促進するために、5’末端でのFseI部位及び3’末端でのAscI部位を有するよう企画する。
PCR反応を、200ngのネズミZtnf12鋳型（配列番号X5及びX6）、及び十分な長さ又は活性部分のZtnf12を増幅するよう企画されたオリゴヌクレオチドにより行う。PCR反応条件を、当業界において知られている方法を用いて決定する。PCR生成物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、そしてQiaQuickTM (Qiagen) ゲル抽出キットを用いて精製する。単離された、正しいサイズのDNAフラグメントを、FseI及びAscI (Boerhinger-Mannheim) により消化し、エタノール沈殿し、そしてFseI及びAscIにより前もって消化されたpMT12-8中に連結する。トランスジェニックマウスにおける肝臓及び他の組織において興味ある遺伝子を発現するために企画されたpMT12-8プラスミドは、10kbのMT-1 5’DNA及び7kbのMT-1 3’DNAを端に有する発現カセットを含む。その発現カセットは、MT-1プロモーター、ラットインスリンIIイントロン、所望するクローンの挿入のためのポリリンカー、及びヒト成長ホルモン（hGH）ポリA配列を含んで成る。
約１μlの個々の連結反応を、DH10B ElectroMaxTM コンピテント細胞（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）中に、その製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートする。コロニーを採取し、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地において増殖する。ミニプレプDNAを、前記採取されたクローンから調製し、そしてEcoRIのみ、又は組み合わされたFseI及びAscIによる制限消化及び続くアガロースゲル電気泳動によりネズミZtnf12挿入体についてスクリーンする。
正しいpMT-ネズミZtnf12の最大調製を行う。5’及び3’フランキング配列、MT-1プロモーター、ラットインスリンIIイントロン、ネズミZtnf12 cDNA及びhGHポリA配列を含むSalIフラグメントを、受精されたネズミ卵母細胞中へのマイクロインジェクションのために使用されるよう調製する。トランスジェニックマウスのマイクロインジェクション及び生成は、Hogan, B. など. Manipulationg the Mouse Embryo, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994に記載のようにして行われる。
B. リンパ−特異的EμLCKポリモーターからのZtnf12トランスジェニックマウス創始体の分析：
トランスジェニックである遺伝子型子孫の20％で創始体が生まれた。これは、創始体生成の通常の範囲内にあり、このことは、トランスジーンに関連する胚死亡率が存在しなかったことを示唆する。それらの創始体は、それらの生存の種々の時点で（５週、７週及び10週で）CBCのために放血され、そしてWBC及びリンパ球数における低下が一定して観察された。
C. トランスジェニックマウスの分析：
18匹の創始体トランスジェニック動物及び４匹の正常な対照を分析した。リンパ球/単球/顆粒球増殖を、脾臓、胸腺、血液及び骨髄のFACS分析により特徴づけた。T細胞及びB細胞応答を、脾臓のミトゲン刺激により評価した。高い発現性の創始体動物の１つは、B細胞増殖における初期ブロックの表示である、骨髄における低められた％を有した。この動物はまた、脾臓及び末梢血液におけるB細胞の低められた％、及び脾臓における周縁領域B細胞の高められた％を示した。
このマウスからの脾臓B細胞は、トリチウム化されたチミジンの組込みにより測定される、IgM及びIL-4によるインビトロ刺激に対する低められた応答を有した。第２の創始体トランスジェニック動物（中位のレベルの発現）は、骨髄及び脾臓におけるB細胞、及び末梢血液における正常B細胞における低い低下、及び脾臓における周縁領域B細胞の高められた％を有した。この動物における増殖応答は、ほぼ正常に見えた。他の創始体動物は、FACS分析及びミトゲン刺激によれば、正常に見えた。
創始体動物の子孫は、対照動物からの末梢血液におけるB細胞に実質的な差異は存在しないことを示した。
前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために本明細書に記載されてきたが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、特許請求の範囲を除いて、限定されるものではない。

Claims (24)

  1. 配列番号２の残基138〜501のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、
    a. 配列番号２の残基140〜501；
    b. 配列番号２の残基164〜501；
    c. 配列番号２の残基363〜501；
    d. 配列番号２の残基54〜501；
    e. 配列番号２の残基164〜362；
    f. 配列番号２の残基1〜362；及び
    g. 配列番号２の残基1〜501
    から選択されたアミノ酸を含んで成り、ここで前記ポリペプチドが、a, b, d, d, e, f, 又はgのアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である請求項１記載の単離されたポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドが、マルチマーを形成する請求項１記載の単離されたポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドが、親和性標識に共有結合される請求項１記載の単離されたポリペプチド。
  5. 請求項１記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  6. 次の作用可能に連結された要素：
    転写プロモーター；
    配列番号２の残基１〜501に対して、アミノ酸配列において少なくとも80％同一であるポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び
    転写ターミネーター；
    を含んで成る発現ベクター。
  7. 前記ポリペプチドが、親和性標識又は免疫グロブリン不変領域を含んで成る請求項６記載の発現ベクター。
  8. DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項６記載の発現ベクターを導入されている培養細胞。
  9. 請求項６記載の発現ベクターが導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成るポリペプチドの生成方法。
  10. 請求項１記載のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体。
  11. 順序良く次の段階：
    （ａ）配列番号２の残基140〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （b）配列番号２の残基138〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （c）配列番号２の残基54〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド；及び
    （d）配列番号２の残基１〜501のアミノ酸配列から成るポリペプチド
    から成る群から選択されたポリペプチドを哺乳類に接種し；ここで前記ポリペプチドが前記動物において免疫応答を誘発し；抗体を生成し；そして
    前記動物から抗体を単離する；
    ことを含んで成る抗体の生成方法。
  12. 配列番号２の残基１〜501に結合する、請求項11記載の方法により生成される抗体。
  13. 配列番号17の残基192〜529のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
  14. 前記ポリペプチドが、
    a. 配列番号17の残基166〜529；
    b. 配列番号17の残基168〜529；及び
    c. 配列番号17の残基1〜529；
    から選択されたアミノ酸を含んで成り、ここで前記ポリペプチドが、前記アミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である請求項13記載の単離されたポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチドが、マルチマーを形成する請求項13記載の単離されたポリペプチド。
  16. 前記ポリペプチドが、親和性標識に共有結合される請求項13記載の単離されたポリペプチド。
  17. 請求項13記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  18. 次の作用可能に連結された要素：
    転写プロモーター；
    配列番号17の残基１〜529に対して、アミノ酸配列において少なくとも80％同一であるポリペプチドをコードするDNAセグメント；及び
    転写ターミネーター；
    を含んで成る発現ベクター。
  19. 前記ポリペプチドが、親和性標識又は免疫グロブリン不変領域を含んで成る請求項18記載の発現ベクター。
  20. DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項18記載の発現ベクターを導入されている培養細胞。
  21. 請求項18記載の発現ベクターが導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成るポリペプチドの生成方法。
  22. 請求項13記載のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体。
  23. 順序良く次の段階：
    （ａ）配列番号17の残基166〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （b）配列番号17の残基168〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （c）配列番号17の残基192〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド；及び
    （d）配列番号17の残基１〜529のアミノ酸配列から成るポリペプチド
    から成る群から選択されたポリペプチドを哺乳類に接種し；ここで前記ポリペプチドが前記動物において免疫応答を誘発し；抗体を生成し；そして
    前記動物から抗体を単離する；
    ことを含んで成る抗体の生成方法。
  24. 配列番号17の残基１〜529に結合する、請求項23記載の方法により生成される抗体。
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