JP2007532668A - 血管新生を調節する方法 - Google Patents
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Abstract
哺乳類組織において、組織因子細胞質ドメインのリン酸化(つまり、TFの細胞質尾部のSer258のリン酸化)を調節することによって、PARシグナル伝達経路(例、PAR−1又はPAR−2シグナル伝達経路)を調節することを含む、哺乳類の組織における血管新生を調節する方法。好ましい方法において、哺乳類における病理学的血管新生は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へPARシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによって治療される。好ましくは、哺乳類はヒトである。
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、本明細書に参照により組み込まれる2004年4月16日に出願された特許シリアル番号60/562,821についての米国仮出願の利点を請求する。
本願は、本明細書に参照により組み込まれる2004年4月16日に出願された特許シリアル番号60/562,821についての米国仮出願の利点を請求する。
(政府の権利)
本発明は、the National Institutes of Healthからの助成金第EY11254号及びHL16411号の下での政府の支持でなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
本発明は、the National Institutes of Healthからの助成金第EY11254号及びHL16411号の下での政府の支持でなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
(本発明の分野)
本発明は、血管新生を調節するための方法に関する。特に、本発明は、PAR−2シグナル伝達経路を調節することによって、哺乳類における血管新生を刺激するか又は阻害するために血管新生を調節する方法に関する。
本発明は、血管新生を調節するための方法に関する。特に、本発明は、PAR−2シグナル伝達経路を調節することによって、哺乳類における血管新生を刺激するか又は阻害するために血管新生を調節する方法に関する。
予め存在する血管からの新しい血管の形成である血管形成は、正常な発達中の決定的な役割である、創傷治癒及び虚血後組織修復における組織の再生を担う。腫瘍膨張及び虚血性網膜症における血管新生は、血管新生により駆動された疾病進行(病理学的血管新生)の例である。生理学的血管新生及び病理学的血管新生を制御する基本的なメカニズムに関する理解が深まれば、効率のよい血管新生前療法及び抗血管新生療法の開発を支援するであろう。組織因子(TF)は、血管新生に及ぼす有力な制御効果でタンパク質分解断片を生じる凝固プロテアーゼカスケードの阻害剤である。TFは、Gタンパク質により結合され、プロテアーゼにより活性化される受容体(PAR)を通じてシグナル伝達するための凝固プロテアーゼを活性化し表す細胞外共受容体として作用する。PARは、受容体の細胞外タンパク質分解を包含する独特のメカニズムを通じて活性化される。試験管内で、TF−VIIa複合体は、Xa因子と同様PAR−2を活性化する。Xa因子は、最初に同定されたトロンビン受容体であるPAR−1も開裂できる。Xa因子は、三元のTF−VIIa−Xa複合体において最も効率よくシグナル伝達する。
試験管内データは、TFがPARシグナル伝達における共受容体として作用するが、生体内におけるPARシグナル伝達におけるTF細胞質ドメインの役割はほとんど定義されていないままであることを示唆する。腫瘍細胞による発現されるTFは、腫瘍の進行に関与する。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のTF細胞質ドメイン依存性上方制御は、病理学的血管新生に関与することが示唆されてきたが、広く確立されてはいない。さらに、TFは、悪性乳癌における内皮に局在化し、TFの直接的な阻害剤が腫瘍の成長及び血管新生を抑制することがわかってきた。PAR−1及びPAR−2は血管新生においても包含されるが、TFにより惹起される凝固によるPAR活性化を連結する生体内データは散在するままである。
腫瘍の発達は、血管新生と関連することが周知である。例えば、VEGFシグナル伝達の阻害剤などの血管新生阻害剤は、腫瘍の成長を遅延させるか又は逆転させることが示されてきた。腫瘍血管新生に関与する新たな生理学的経路を発見し、及び公知の血管新生経路を阻害するための新たな標的を発見する尽力は絶え間ない。
加齢関連黄斑変性症(ARMD)及び糖尿病性網膜症(DR)は、先進国における失明の筆頭原因であり、異常な網膜血管新生の結果として起こる。網膜は、ニューロン要素、グリア要素、及び血管要素の明確な層からなるため、血管増殖又は浮腫においてみられるものなどの比較的小さな混乱が視覚機能の有意な低下に至りうる。網膜色素変性症(RP)などの遺伝性網膜変性は、細動脈狭小化及び血管萎縮などの血管異常とも関連する。未熟児網膜症(ROP)は、未熟児と関連した網膜性疾患である。ROPは、網膜における異常な血管の成長であり、生後最初の数日間で開始し、急速に進行して(例、数週間にわたって)盲目に至りうる。赤ん坊が未熟児で産まれるとき、正常な血管成長が停止し、新たな異常血管が成育し始めるかもしれず、それによって経時的に網膜に線維状瘢痕を生じることができ、網膜剥離に至ることができ、盲目に至りうる。有意な進行が血管新生を促進及び阻害する因子を同定する上でなされてきたが、眼の血管新生性疾患を特異的に治療するのに現在入手可能な治療はない。
腫瘍の発達及び虚血性網膜症などの病理学的血管新生を包含する疾病を治療するための必要性がある。本発明はこの要求を満たす。
本発明の要約
本発明は、哺乳類の組織における血管新生を調節する方法を提供する。方法は、組織においてPAR−1シグナル伝達経路又はPAR−2シグナル伝達経路などのPARシグナル伝達経路を調節することを含む。PARシグナル伝達経路は、組織における組織因子細胞質ドメインのリン酸化を調節することによって調節できる。PARシグナル伝達経路は、PARシグナル伝達経路阻害剤の組織への投与によって調節できる。
本発明は、哺乳類の組織における血管新生を調節する方法を提供する。方法は、組織においてPAR−1シグナル伝達経路又はPAR−2シグナル伝達経路などのPARシグナル伝達経路を調節することを含む。PARシグナル伝達経路は、組織における組織因子細胞質ドメインのリン酸化を調節することによって調節できる。PARシグナル伝達経路は、PARシグナル伝達経路阻害剤の組織への投与によって調節できる。
本発明の方法は、特にヒトにおける病理学的血管新生を包含する疾病状態を治療するのに有用である。
好ましい実施態様の詳細な記述
本明細書及び付属の請求項において使用されるように、TF−VIIaシグナル伝達の阻害剤、PDGF受容体βシグナル伝達、及び組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤を含む、PAR−2シグナル伝達経路又はPAR−1シグナル伝達経路などのPARシグナル伝達経路の阻害剤に関する、治療上効果のある量という語は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ投与されるときに望ましくない血管新生を低下させるか又は除去する阻害剤の量を意味する。投与は、一連の時間にわたって又は無限に単回投与又は複数回投与で存在しうる。治療効果のある量は、当業者によって迅速に測定できる。
本明細書及び付属の請求項において使用されるように、TF−VIIaシグナル伝達の阻害剤、PDGF受容体βシグナル伝達、及び組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤を含む、PAR−2シグナル伝達経路又はPAR−1シグナル伝達経路などのPARシグナル伝達経路の阻害剤に関する、治療上効果のある量という語は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ投与されるときに望ましくない血管新生を低下させるか又は除去する阻害剤の量を意味する。投与は、一連の時間にわたって又は無限に単回投与又は複数回投与で存在しうる。治療効果のある量は、当業者によって迅速に測定できる。
PARシグナル伝達は、哺乳類組織における血管新生に衝撃を与えうる。組織因子細胞質ドメインのリン酸化(つまり、TFの細胞質尾部のSer258のリン酸化)は、このようなリン酸化が生じる組織におけるPAR発現を刺激し、それが病理学的血管新生に至る。したがって、例えば、組織因子細胞質ドメインのリン酸化によるPARシグナル伝達の調節は、血管新生を調節する(つまり、血管新生を促進するか又は阻害する)のに利用できる。
PARシグナル伝達経路による血管新生の調節は、多くの因子及び他のシグナル伝達経路との交差を包含し、後者にはTF−VIIa複合体シグナル伝達、Xa因子シグナル伝達、及び血小板由来成長因子(PDGF)受容体βシグナル伝達が含まれる。哺乳類組織における血管新生を調節するための方法は、組織におけるPARシグナル伝達を調節すること、好ましくはPAR−2シグナル伝達経路を調節することを含む。
哺乳類における病理学的血管新生は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へPARシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによって治療される。好ましくは、哺乳類はヒトである。PARシグナル伝達経路の好ましい阻害剤の制限のない例には、TF−VIIaシグナル伝達の阻害剤、PDGF受容体βシグナル伝達経路の阻害剤、及び組織因子細胞質ドメインリン酸化の阻害剤が含まれる。
本発明のある好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ、TF−VIIaシグナル伝達阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。好ましいTF−VIIaシグナル伝達阻害剤の制限のない例には、活性部位により阻害されるVIIa(VIIai)、線虫抗凝固ペプチドc2(NAPc2)、VIIa因子特異的抗体及びTF−VIIa複合体特異的抗体、及びそれらの類似物が含まれる。
本発明の別の好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ、PDGF受容体βシグナル伝達阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。PDGF受容体βシグナル伝達阻害剤の制限のない例には、PDGF−BB特異的抗体、及びその類似物が含まれる。
本発明のさらに別の好ましい方法の態様は、病理学的血管新生に苦しむ哺乳類へ組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤の治療効果のある量を投与することを含む。
本発明の方法によって治療できる病理学的血管新生を包含する疾病状態の制限のない例には、(例、乳癌、肺癌、及びそれらの類似物における)腫瘍の発達及び、糖尿病性網膜症、加齢関連黄斑変性、未熟児網膜症、及びそれらの類似物などの虚血性網膜症疾患が含まれる。
マウスの系及び試薬
TF細胞質ドメインの18カルボキシル末端残基を欠失するTFΔCTマウスの系、及び(P.Andrade−Gordon,Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Developmentによって親切に提供された)PAR−2欠乏性マウスを、C57/BL6の遺伝的背景と90%超の相同性を生じるよう戻し交配させた。TFΔCT/PAR−2欠乏性二重ノックアウトを、戻し交配の5世代後に雑種形成することによって生じた。試薬供給源は次のとおりであった。すなわち、マトリゲル(Beckton & Dickinson)、内皮細胞成長培地(EGM、Clonetics)、DMEM(GIBCO)、成長因子(R&D Systems)、TOPRO及びイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア(griffonia simplicifolia)(Molecular Probes)、CD31(Santa Cruz)並びにSMA及びGFAP(SIGMA)に対する抗体、Ki−67(NOVO Laboratories)である。TF、VIIai、ヒルジン、VIIaに対するヤギ抗体及びモノクローナル抗体は、Riewald,M.及びRuf,W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98, 7742−7747(2001)によってすでに記載された。NAPc2及びNAP5は、G.Vlasuk(Corvas International)によって親切に提供された。ヒトTF(1−263)及びヒトTF(1−243)のアデノウィルスコンストラクトは、Dorfleutner,A.及びRuf,W.,Blood 102, 3998-4005(2003)によって記載された。プロテアーゼにより活性化される受容体2を、ヒト内皮細胞における炎症性仲介物質により誘導し、GFPを同時発現するAd5血清型ベクターを同様に発生させた。
TF細胞質ドメインの18カルボキシル末端残基を欠失するTFΔCTマウスの系、及び(P.Andrade−Gordon,Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Developmentによって親切に提供された)PAR−2欠乏性マウスを、C57/BL6の遺伝的背景と90%超の相同性を生じるよう戻し交配させた。TFΔCT/PAR−2欠乏性二重ノックアウトを、戻し交配の5世代後に雑種形成することによって生じた。試薬供給源は次のとおりであった。すなわち、マトリゲル(Beckton & Dickinson)、内皮細胞成長培地(EGM、Clonetics)、DMEM(GIBCO)、成長因子(R&D Systems)、TOPRO及びイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア(griffonia simplicifolia)(Molecular Probes)、CD31(Santa Cruz)並びにSMA及びGFAP(SIGMA)に対する抗体、Ki−67(NOVO Laboratories)である。TF、VIIai、ヒルジン、VIIaに対するヤギ抗体及びモノクローナル抗体は、Riewald,M.及びRuf,W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98, 7742−7747(2001)によってすでに記載された。NAPc2及びNAP5は、G.Vlasuk(Corvas International)によって親切に提供された。ヒトTF(1−263)及びヒトTF(1−243)のアデノウィルスコンストラクトは、Dorfleutner,A.及びRuf,W.,Blood 102, 3998-4005(2003)によって記載された。プロテアーゼにより活性化される受容体2を、ヒト内皮細胞における炎症性仲介物質により誘導し、GFPを同時発現するAd5血清型ベクターを同様に発生させた。
腫瘍の成長
動物検査はすべて、The Scripps Research Instituteの施設内動物取り扱い及び使用委員会により認可された。4×105個のT241線維肉腫細胞を7週齢ないし9週齢の野生型マウス及びTFΔCTマウスへと皮下注射し、>97%C57BL/6であった。14日目の腫瘍体積及び最終的な重量を測定した後、OCTにおける腫瘍の包埋を実施した。10μmの凍結切片をアセトンで固定し、CD31について染色し、血管密度/顕微鏡視野を蛍光顕微鏡によって、野生型マウス及びTFΔCTマウスから各々2つの腫瘍の6枚ないし8枚の切片から測定した。
動物検査はすべて、The Scripps Research Instituteの施設内動物取り扱い及び使用委員会により認可された。4×105個のT241線維肉腫細胞を7週齢ないし9週齢の野生型マウス及びTFΔCTマウスへと皮下注射し、>97%C57BL/6であった。14日目の腫瘍体積及び最終的な重量を測定した後、OCTにおける腫瘍の包埋を実施した。10μmの凍結切片をアセトンで固定し、CD31について染色し、血管密度/顕微鏡視野を蛍光顕微鏡によって、野生型マウス及びTFΔCTマウスから各々2つの腫瘍の6枚ないし8枚の切片から測定した。
血管新生アッセイ
生体外血管新生アッセイを、Massonほか、Biol.Proced.4, 24−31(2002)及びNicosiaほか、Lab Invest.63, 115−122(1990)によって記載されるラット大動脈出芽モデルから採用した。8週齢ないし11週齢のいずれかの性別の野生型マウス、TFΔCTマウス、PAR−2欠乏マウス、及びTFΔCT/PAR−2欠乏マウス由来の胸部大動脈をマトリゲルに包埋し、5%血清、成長因子、又は次の濃度の阻害剤で補充したEGMと重ねた。すなわち、VEGF、bFGF、及びPDGF:20ng/ml、ヒルジン:500nM、VIIai:100nM、NAPc2:200nM、NAP5:1μM、VIIa:50nMである。たいていの場合、大動脈出芽の数を遺伝子型の知識なしで3日目及び4日目に測定した。大動脈リングRNAを標準的な手段を使用してトリゾール(Invitrogen)抽出によって単離し、DNAaseIで切断した後、β−アクチン及びTFについてRT−PCRを実施した。大動脈切片に、全長ヒトTF(1−263)又は切断したヒトTF(1−243)についてのアデノウィルスコンストラクトを無血清DMEM中で約20時間ないし24時間形質導入した後、出芽アッセイへと包埋した。検査は、高(1.1×1010ウィルス粒子/ml)及び低(5×109粒子/ml)と呼ぶ2つの異別のウィルス投与量を使用した。共焦点蛍光顕微鏡観察について、最低取り囲んでいるマトリゲルを有する大動脈切片を4%パラホルムアルデヒド及びメタノールで固定し、一次抗体及び二次抗体でインキュベートし(各24時間)、及び抗退色液(Vector laboratories)でマウントした。あるいは、OCT包埋した大動脈の凍結切片をアセトンで固定し、前述のように染色した。
生体外血管新生アッセイを、Massonほか、Biol.Proced.4, 24−31(2002)及びNicosiaほか、Lab Invest.63, 115−122(1990)によって記載されるラット大動脈出芽モデルから採用した。8週齢ないし11週齢のいずれかの性別の野生型マウス、TFΔCTマウス、PAR−2欠乏マウス、及びTFΔCT/PAR−2欠乏マウス由来の胸部大動脈をマトリゲルに包埋し、5%血清、成長因子、又は次の濃度の阻害剤で補充したEGMと重ねた。すなわち、VEGF、bFGF、及びPDGF:20ng/ml、ヒルジン:500nM、VIIai:100nM、NAPc2:200nM、NAP5:1μM、VIIa:50nMである。たいていの場合、大動脈出芽の数を遺伝子型の知識なしで3日目及び4日目に測定した。大動脈リングRNAを標準的な手段を使用してトリゾール(Invitrogen)抽出によって単離し、DNAaseIで切断した後、β−アクチン及びTFについてRT−PCRを実施した。大動脈切片に、全長ヒトTF(1−263)又は切断したヒトTF(1−243)についてのアデノウィルスコンストラクトを無血清DMEM中で約20時間ないし24時間形質導入した後、出芽アッセイへと包埋した。検査は、高(1.1×1010ウィルス粒子/ml)及び低(5×109粒子/ml)と呼ぶ2つの異別のウィルス投与量を使用した。共焦点蛍光顕微鏡観察について、最低取り囲んでいるマトリゲルを有する大動脈切片を4%パラホルムアルデヒド及びメタノールで固定し、一次抗体及び二次抗体でインキュベートし(各24時間)、及び抗退色液(Vector laboratories)でマウントした。あるいは、OCT包埋した大動脈の凍結切片をアセトンで固定し、前述のように染色した。
新生児血管新生を査定するため、網膜全体のマウントを準備し、血管新生をDorrelほか、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43, 3500−3510(2002)によって記載されるように定量化した。網膜の数及び個々の遺伝子型について使用される異別の同腹子は、野生型(6同腹子からの20の網膜)、TFΔCT(5同腹子からの24の網膜)、PAR−2欠乏性(3同腹子からの10の網膜)、及びTFΔCT/PAR−2欠乏性(4同腹子からの16の網膜)であった。摘出した網膜を4%パラホルムアルデヒド中で固定した後、メタノール固定し、一次抗体又は蛍光共役したイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア(griffonia simplicifolia)中で一晩インキュベートした後、二次抗体インキュベーションを実施し、マウントした。網膜を同一の倍率、解像度、明暗度因子を使用して画像化した。画像を単一網膜モンタージュとして重合し、血管新生の直径を、LaserPixソフトウェア(BioRad)を使用して定量した(1時、2時、3時、4時、5時、及び6時由来の6個の直径の測定結果+2回の無作為な直径測定結果)。血管関連Ki−67+核の総数を、血管平面内で焦点合わせすることによって決定した。この平面内での焦点合わせは、計数から増殖中のニューロン細胞を除去した。
眼の試料の分析
ヒト組織を試用するすべての検査を、認可されたヒト用プロトコールにしたがって、及び告知した患者からの了解の下で実施した。臨床的な理由で除去されることがすでに計画されていた虹彩の試料を直ちに約4℃の20%ショ糖に浸漬した後、凍結切片を作製した。血管新生網膜の試料をSan Diegoアイバンクから得た。この眼を25年間糖尿病性網膜症と臨床的に診断された患者から得た。摘出後、網膜を4%PFAで一晩約4℃にて固定した後、20%ショ糖中で凍結保護し、凍結切片を作製した。凍結切片を一時抗体について処理し、アレクサ488、アレクサ568、又はアレクサ633(Molecular Probes)のいずれかと共役した二次抗体を使用して共焦点顕微鏡観察のために検出した。CD31(Biocare Medical、1:50)及びインテグリンαvβ3(LM609、1:500)に対するマウス抗体、ローダミンにより共役されたUlex Europaeusアグルチニン1(Vector Laboratories、1:1000)、TF細胞外ドメインに対するウサギ抗体(R4563、25μg/ml)、Ser258によりリン酸化されたTF細胞質ドメインに対するウサギ抗体(R6936、25μg/ml)、及びPAR2に対するウサギ抗体(R6797、25μg/ml)を使用した。R6936及びR6797についての免疫原として使用されるペプチドを約50μg/mlで添加し、特異性を呈示した。
ヒト組織を試用するすべての検査を、認可されたヒト用プロトコールにしたがって、及び告知した患者からの了解の下で実施した。臨床的な理由で除去されることがすでに計画されていた虹彩の試料を直ちに約4℃の20%ショ糖に浸漬した後、凍結切片を作製した。血管新生網膜の試料をSan Diegoアイバンクから得た。この眼を25年間糖尿病性網膜症と臨床的に診断された患者から得た。摘出後、網膜を4%PFAで一晩約4℃にて固定した後、20%ショ糖中で凍結保護し、凍結切片を作製した。凍結切片を一時抗体について処理し、アレクサ488、アレクサ568、又はアレクサ633(Molecular Probes)のいずれかと共役した二次抗体を使用して共焦点顕微鏡観察のために検出した。CD31(Biocare Medical、1:50)及びインテグリンαvβ3(LM609、1:500)に対するマウス抗体、ローダミンにより共役されたUlex Europaeusアグルチニン1(Vector Laboratories、1:1000)、TF細胞外ドメインに対するウサギ抗体(R4563、25μg/ml)、Ser258によりリン酸化されたTF細胞質ドメインに対するウサギ抗体(R6936、25μg/ml)、及びPAR2に対するウサギ抗体(R6797、25μg/ml)を使用した。R6936及びR6797についての免疫原として使用されるペプチドを約50μg/mlで添加し、特異性を呈示した。
TF細胞質ドメインの欠失は血管新生を増強させる。
腫瘍血管新生におけるTF細胞質ドメインの役割を査定するため、我々は、野生型同腹子子孫との比較の上でのTF細胞質ドメインの欠失したマウス(TFΔCT)における先天性腫瘍の成長を研究した(図1、パネルa)。腫瘍の膨張及び最終的な腫瘍の重量は、野生型マウスと比較してTFΔCTにおいて約2倍増強した。しかしながら、野生型マウス及びTFΔCTマウス由来の腫瘍は、同様の終末段階の血管密度を示し(図1、パネルa)、腫瘍の膨張が血液供給の増大の後に続き、腫瘍細胞がこれらのマウスで同様の血管新生を確立するという意見と一致した。しかしながら、これらのデータは、宿主間質細胞によって発現されるTFがTFΔCTマウスにおける血管新生の加速に関与するという可能性を排除しなかった。定義された条件下で血管細胞におけるTF細胞質ドメインの調節の役割を直接分析するため、我々は、血管新生を刺激する自家性のマウス血清の存在下で実施される大動脈リングアッセイを採用した。TFΔCTマウス大動脈からの微小血管の出芽は、野生型の大動脈と比べ2倍増強した(図1、パネルb、c)。大動脈出芽細胞は、CD31についてのポジティブ染色及び平滑筋細胞アクチン(SMA)についてのネガティブ染色によって示されるように、主として内皮であった(図1、パネルb)。我々は、出芽しているTFΔCT及び野生型の大動脈における同様のTF発現レベルを観察し(図1、パネルd)、調節解除したTF発現よりもむしろTF細胞質尾部の損失が、TFΔCTマウスにおける内皮細胞出芽の加速を生じることを示した。
腫瘍血管新生におけるTF細胞質ドメインの役割を査定するため、我々は、野生型同腹子子孫との比較の上でのTF細胞質ドメインの欠失したマウス(TFΔCT)における先天性腫瘍の成長を研究した(図1、パネルa)。腫瘍の膨張及び最終的な腫瘍の重量は、野生型マウスと比較してTFΔCTにおいて約2倍増強した。しかしながら、野生型マウス及びTFΔCTマウス由来の腫瘍は、同様の終末段階の血管密度を示し(図1、パネルa)、腫瘍の膨張が血液供給の増大の後に続き、腫瘍細胞がこれらのマウスで同様の血管新生を確立するという意見と一致した。しかしながら、これらのデータは、宿主間質細胞によって発現されるTFがTFΔCTマウスにおける血管新生の加速に関与するという可能性を排除しなかった。定義された条件下で血管細胞におけるTF細胞質ドメインの調節の役割を直接分析するため、我々は、血管新生を刺激する自家性のマウス血清の存在下で実施される大動脈リングアッセイを採用した。TFΔCTマウス大動脈からの微小血管の出芽は、野生型の大動脈と比べ2倍増強した(図1、パネルb、c)。大動脈出芽細胞は、CD31についてのポジティブ染色及び平滑筋細胞アクチン(SMA)についてのネガティブ染色によって示されるように、主として内皮であった(図1、パネルb)。我々は、出芽しているTFΔCT及び野生型の大動脈における同様のTF発現レベルを観察し(図1、パネルd)、調節解除したTF発現よりもむしろTF細胞質尾部の損失が、TFΔCTマウスにおける内皮細胞出芽の加速を生じることを示した。
TF細胞質ドメインシグナル伝達が腫瘍細胞によるVEGF発現を調節する上で関与するため、我々は、野生型大動脈がVEGFにおける相対的な欠乏性による出芽の低下を呈するかどうかを検査した。血清にVEGFを補充しても、TFΔCT大動脈対野生型大動脈から出芽する上での差異はなくならなかった。しかしながら、血清のない場合でのVEGFにより刺激された大動脈は非常に制限された出芽を示し、血清がTFΔCT大動脈からの血管新生の加速に必要であることを示した(図2、パネルa)。TFΔCTマウス血清(血清交換)の存在下での野生型大動脈からの出芽は増強せず、血清因子又は循環しているTFのレベルの上昇よりもむしろTFΔCT血管細胞により発現されるTFが血管新生前の表現型を付与することを示した(図2、パネルa)。
TF−VIIaシグナル伝達はTFΔCT大動脈における血管新生を加速する。
TFΔCT出芽表現型の血清依存性は、TF細胞質尾部の遺伝的切除が凝固因子血管新生前活性を隠さないかもしれないことを示唆した。大動脈リング出芽モデルにおける凝固プロテアーゼを遮断する阻害効果を研究した(図2、パネルb)。ヒルジンによるトロンビンの阻害は、線虫抗凝固ペプチド(NAP)5によるXaの不活性化と同様、出芽に何ら影響せず、凝固カスケードにおいて下流のプロテアーゼからの関与を排除した。活性部位は、TF−VIIa複合体形成を遮断する高い親和性競合アンタゴニストである、活性部位に阻害されたVIIa(VIIai)は、捕捉されたTF−VIIa−Xa複合体を形成することによってTF−VIIaを阻害する線虫阻害剤NAPc2と同様、TFΔCT出芽表現型を逆転するが、野生型大動脈からの出芽には影響を及ぼさなかった。これらの結果は、TF細胞質ドメインがTF−VIIaプロテアーゼシグナル伝達を負に調節することを示す。
TFΔCT出芽表現型の血清依存性は、TF細胞質尾部の遺伝的切除が凝固因子血管新生前活性を隠さないかもしれないことを示唆した。大動脈リング出芽モデルにおける凝固プロテアーゼを遮断する阻害効果を研究した(図2、パネルb)。ヒルジンによるトロンビンの阻害は、線虫抗凝固ペプチド(NAP)5によるXaの不活性化と同様、出芽に何ら影響せず、凝固カスケードにおいて下流のプロテアーゼからの関与を排除した。活性部位は、TF−VIIa複合体形成を遮断する高い親和性競合アンタゴニストである、活性部位に阻害されたVIIa(VIIai)は、捕捉されたTF−VIIa−Xa複合体を形成することによってTF−VIIaを阻害する線虫阻害剤NAPc2と同様、TFΔCT出芽表現型を逆転するが、野生型大動脈からの出芽には影響を及ぼさなかった。これらの結果は、TF細胞質ドメインがTF−VIIaプロテアーゼシグナル伝達を負に調節することを示す。
血管新生におけるVIIa因子(「VIIa」)の役割を直接分析するため、大動脈リングモデルにおいて血清をVIIaと置換した。TF−VIIaは、野生型大動脈及びTFΔCT大動脈の両者からの出芽を効率的には誘導しなかった。内皮細胞の出芽は、成長因子のシグナル伝達に典型的に依存するため、我々はさらに、定義される血管新生前成長因子、つまりVEGF、血小板由来成長因子(PDGF)AA、PDGF−BB、又は塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下でのTFΔCT大動脈からの出芽をさらに特徴付けた。先行データと一致して、これらの因子のいずれもが実質的な出芽を促進せず、TFΔCTの血管新生前表現型は、成長因子いずれか単独の存在下では明白ではなかった。しかしながら、TF−VIIaをPDGF−BBと組み合わせることは、血清条件下で観察されるTFΔCTの血管新生前表現型を選択的に反復した(図2、パネルc)。野生型大動脈からの出芽に及ぼすPDGF−BB及びVIIaの付加的な効果に関する証拠は、線維芽細胞の移動について記載されるように観察されなかった。PDGF−AAは、PDGF受容体αについての選択的なアゴニストであるが、PDGF受容体βを活性化できない。VIIaは、TF細胞質ドメインによるネガティブな調節が欠失する場合、PDGF受容体βシグナル伝達と協同することが明らかである。
PAR−2とのTF−VIIaのシグナル伝達のクロストークは血管新生を調節する。
TF−VIIa依存性PAR−2活性化は、PDGF−BBと協同してTF細胞質ドメイン欠失マウスにおける血管新生を加速させる。TFΔCT/PAR−2欠乏性二重トランスジェニックマウスにおける大動脈リング出芽は、野生型レベルへと逆転し(図2、パネルd)、TF細胞質ドメインの損失がPAR−2依存性の加速した血管新生に至ることを示した。PAR−2欠乏性大動脈における表現型の欠失はさらに、TF細胞質尾部がPAR−2の血管新生前効果を抑制する上で非常に効率的であることを示し、そのことは、TF指向性阻害剤(VIIai及びNAPc2)が野生型大動脈からの出芽を低下しなかったという知見によっても支持される(図2、パネルb)。
TF−VIIa依存性PAR−2活性化は、PDGF−BBと協同してTF細胞質ドメイン欠失マウスにおける血管新生を加速させる。TFΔCT/PAR−2欠乏性二重トランスジェニックマウスにおける大動脈リング出芽は、野生型レベルへと逆転し(図2、パネルd)、TF細胞質ドメインの損失がPAR−2依存性の加速した血管新生に至ることを示した。PAR−2欠乏性大動脈における表現型の欠失はさらに、TF細胞質尾部がPAR−2の血管新生前効果を抑制する上で非常に効率的であることを示し、そのことは、TF指向性阻害剤(VIIai及びNAPc2)が野生型大動脈からの出芽を低下しなかったという知見によっても支持される(図2、パネルb)。
TFΔCTマウスの表現型がTF細胞質ドメインシグナル伝達に関連しないことを排除するため、全長のヒトTF(1−263)又はコントロールとして細胞質ドメインの欠失したヒトTF(1−243)のいずれかを、野生型又はTFΔCT大動脈におけるアデノウィルス形質導入によって回復した。緑色蛍光タンパク質(GFP)及びヒト特異的抗TF抗体による染色の同時発現は、取り囲んでいるマトリゲルへの内皮出芽細胞の移動がヒトTF(1−263)によっては抑制されるが、ヒトTF(1−243)では抑制されないことを示した(図3、パネルa)。CD31によるヒトTFの同時局在化はさらに、アデノウィルス形質導入のための標的としての内皮細胞を同定した。発現レベルを、ウェスタンブロットにおけるヒトTFを検出することによって大動脈リングアッセイからの抽出物中で測定し、そのことはTFの両形態の等しい発現レベルを確認した(図3、パネルb)。より高いウィルス投与量で、ヒトTF(1−263)は、野生型大動脈及びTFΔCT大動脈の両者からの出芽を抑制する(図3、パネルc、左)のに対し、より少ない量のウィルスを投与すると、TFΔCT出芽は野生型レベルへと選択的に逆転した(図3、パネルc、右)。すべての場合において、切断したヒトTF(1−243)は何ら影響を有さず、抑制はTF細胞質尾部に依存することを示した(図3、パネルc)。これらのデータは、適切なレベルで導入される場合、TF細胞質ドメインが血管新生におけるPAR−2シグナル伝達の負の調節を回復できるという概念を支持する。
TF細胞質止め因果血管新生におけるPAR−2シグナル伝達を以下に抑制するかに関するメカニズムへのさらなる洞察を得るため、TFΔCT大動脈の血管新生前表現型の逆転を検討し、シグナル伝達及び導入されたヒトTFとの細胞外プロテアーゼ重合体を要するかどうかを決定した。ヒト特異的モノクローナル抗体によるTF(1−263)の細胞外ドメインの遮断は、TFΔCTマウスの出芽表現型ノ増加の逆転を防止した(図3、パネルd)。PAR−2の関与については、ヒトTF(1−263)の高レベルの発現が野生型大動脈からの出芽を抑制したという知見に基づいて利用することによって取り組まれた。等価のウィルス投与量は、PAR−2欠乏性大動脈からの出芽を低下せず、TF細胞質ドメインの抑制機能がPAR−2発現を要することを示した(図3d)。集約的に、これらのデータは、TF細胞質ドメインによる血管新生の負の調節がPAR−2シグナル伝達の脈絡において特異的に生じることを示す。
TF細胞質ドメインは生理学的血管新生を調節する。
生体内でのTF細胞質ドメインの役割にさらに取り組むため、常同性の方法で視神経乳頭から生じる血管ネットワークを発達させる新生児の網膜における生理学的血管新生を研究した。新生児マウスにおいて、TFΔCTの表層部の血管神経叢直径は、野生型マウスのそれの2倍であり、TF細胞質尾部が生後の発育中の生体内血管新生を負に調節することを示した(図4、パネルa)。新生児TFΔCT網膜における血管新生の程度は、2日齢(P2)野生型網膜に匹敵した(図4、パネルb)。大動脈リングアッセイにおけるデータと一致して、新生児PAR−2欠乏性マウス由来の網膜は、TFΔCT/PAR−2欠乏性二重トランスジェニックマウスと同様、加齢による適切な血管新生を示した(図4、パネルa)。各遺伝子型の少なくとも3回の異別の妊娠から派生した少なくとも10個の網膜の評価は、TFΔCTマウスの観察された表現型と、PAR−2の同時欠失によるその逆転との一致を確認した(図4、パネルc)。
生体内でのTF細胞質ドメインの役割にさらに取り組むため、常同性の方法で視神経乳頭から生じる血管ネットワークを発達させる新生児の網膜における生理学的血管新生を研究した。新生児マウスにおいて、TFΔCTの表層部の血管神経叢直径は、野生型マウスのそれの2倍であり、TF細胞質尾部が生後の発育中の生体内血管新生を負に調節することを示した(図4、パネルa)。新生児TFΔCT網膜における血管新生の程度は、2日齢(P2)野生型網膜に匹敵した(図4、パネルb)。大動脈リングアッセイにおけるデータと一致して、新生児PAR−2欠乏性マウス由来の網膜は、TFΔCT/PAR−2欠乏性二重トランスジェニックマウスと同様、加齢による適切な血管新生を示した(図4、パネルa)。各遺伝子型の少なくとも3回の異別の妊娠から派生した少なくとも10個の網膜の評価は、TFΔCTマウスの観察された表現型と、PAR−2の同時欠失によるその逆転との一致を確認した(図4、パネルc)。
TFΔCT網膜におけるTFの血管細胞特異的局在化は、星状細胞によるTFの顕著な発現のため、CNSにおける確立されたTFを発現する細胞タイプを、下にある神経線維による有力なTF発現と同様、評価するのが困難であった。星状細胞のためのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)染色は、染色パターンに明白な差異のない野生型新生児マウス及びTFΔCT新生児マウス由来の網膜の周辺部に星状細胞が同様に及ぶことを示した。したがって、血管の発達は、TFΔCT網膜における発達する星状細胞の移動の加速には間接的には追随しなかった。血管のアポトーシスは、発達のこの段階にある野生型マウスにおいてあまり頻繁には観察されず、アポトーシス由来の保護がTFΔCTマウスにおける血管新生の加速の原因ではなさそうである。血管の発達の亢進は、細胞増殖の亢進から生じるかもしれないが、Ki−67染色に基づいた血管細胞の増殖は、新生児のTFΔCT網膜及びP2野生型網膜の両者において匹敵する数で存在する(図5、パネルb、c)。P0 TFΔCT網膜の神経叢は、P2野生型網膜と比較してより伸展するのが明白である(図4、パネルa、b)。このことは、移動する細胞の先端縁にMAPキナーゼ経路を局在化させるPAR−2の足場機能と一致した上皮細胞移動の亢進に反映する。TFは悪性胸部腫瘍と関連した血管新生内皮細胞において発現する。試験管内研究は、生体内で毛細管内皮細胞に関して検出可能なPDGF受容体−βの活性化を介する一次内皮細胞移動及びコード/チューブ形成に及ぼすPDGF−BBの直接的な効果を示した。
PDGF−BBシグナル伝達は、血管アーキテクチャーの再構築を安定化及び調節する壁細胞/周皮細胞の集団の動員及び膨張にも重要である。さらに、TF遺伝子の完全な欠失は、周皮細胞の動員における関連した低下を有する卵黄嚢における胚性血管神経叢の不完全な血管再構築を生じた。血管新生出芽中の内皮細胞と壁細胞との密接な関係によって、内皮細胞に及ぼすPDGF−BBの自己分泌効果と、動員される壁細胞に及ぼす二次的なパラ分泌効果とを区別するよう検証される。SMA染色を周皮細胞特異的マーカーとして使用することで、同様の染色パターンが新生児TFΔCTマウス及びP2野生型マウス由来の網膜血管において観察された(図5、パネルd)。各場合における周皮細胞の染色は、出芽の先まで伸びていた(図5、パネルd、はめ込み)。P2 PAR−2欠乏性又はTFΔCT/PAR−2欠乏性マウスの血管神経叢はP2野生型マウスとは区別できず、PAR−2欠乏性マウスにおける欠陥のある血管の発達が比較的早期には明白ではないという可能性を排除した。周皮細胞は、発達中の網膜血管神経叢を再構築する上で重要な役割を担う。P6TFΔCT網膜及びP8野生型網膜の等価に伸びた表層血管神経叢は、匹敵する毛細血管網密度、動脈又は静脈の分布、及びSMA染色のパターンも示す(図5、パネルe)。網膜の血管新生の比較的後期の段階におけるこれらの類似性は、周皮細胞の機能の変化の反証となる。TFΔCT網膜における血管の発達の加速は、網膜のより深層への成熟前内皮細胞の出芽が観察される日である少なくともP6まで持続した。集約的に、これらのデータは、TFΔCTマウスにおける異常な周皮細胞の動員よりもむしろ、表層部の血管神経叢の発達における内皮細胞の移動の加速の表現型と一致する。
新生血管性眼疾患におけるTF細胞質ドメインリン酸化
TFリン酸化が病理学的血管新生の他の場合に生じるかどうかを検討するため、糖尿病患者から摘出された血管新生した虹彩の試料を分析した。
TFリン酸化が病理学的血管新生の他の場合に生じるかどうかを検討するため、糖尿病患者から摘出された血管新生した虹彩の試料を分析した。
TF細胞質ドメインは、内皮細胞において典型的にはリン酸化されない。リン酸化は、TF細胞質ドメインの負の調節効果を放出するかも知れず、したがって病理学的血管新生を促進するかも知れない。実際、Ser258でリン酸化したTFを特異的に認識する抗体による染色は、6名の異別の患者由来の試料において、血管新生の部位でのみTF細胞質ドメインのリン酸化を同定した(図6、パネルa、b、c)。これらの病理学的血管におけるTFのリン酸化はPAR−2発現と同時局在し(図6、パネルa)、そのことは、病理学的血管新生中の調節されていないPAR−2シグナル伝達についての役割を支持した。重要なことに、リン酸化されたTF及びPAR−2染色は、糖尿病又は病理学的血管新生の病歴を有さない緑内障患者由来のコントロール虹彩試料において観察されなかった(図6、パネルd)。
TFリン酸化及びPAR−2上方制御を、糖尿病性網膜症を有する患者から得られた網膜における新生血管においても特に観察した。TF細胞外ドメインに対する抗体による染色は、グリア細胞タイプ及びニューロン細胞タイプ、成熟血管(図6、パネルe、矢じり)及び血管新生の部位(図6、パネルe、白矢印)でのTFの幅広い発現を示した。しかしながら、TFリン酸化は、膨張した病理学的血管においてのみ観察された(図6、パネルe)。病理学的血管におけるリン酸化されたTFの染色は、抗原性ペプチドとの競合によって完全に排除された(図6、パネルa、f)。免疫原によって不完全に競合された非特異的点状染色は、網膜試料における異別の抗体による非特異的染色について周知の領域である内側及び外側の制限する膜において時々観察された。
TFリン酸化は、正常な成熟した網膜の血管において観察されず、病理学的血管新生中のTFリン酸化に対する特異的な役割を支持した。連続切片において、顕著なPAR−2発現がTFリン酸化の観察された同一血管に特異的に観察された(図6、パネルf)。TFリン酸化が新生血管特異的であることを確認するため、我々は、血管増殖の公知のマーカーであるインテグリンαvβ3について糖尿病性網膜を染色した(図6、パネルg、h)。リン酸化TFGは、αvβ3陽性新生血管と一致して同時局在化したのに対し、正常な網膜微小血管は両者について陰性であった(図6、パネルg、h)。
この例は、組織因子シグナル伝達におけるp53の役割を説明する。TFΔCTマウス及びTFΔCT/p53二重変異体マウス由来の網膜を、生後0日(P0)及び生後6日(P6)で検討した。発達中の網膜の加速した血管新生を呈する組織因子細胞尾部の欠失した(TFΔCT)新生児マウスの網膜表現型は、TFΔCT/p53二重変異体マウスにおいて逆転し、腫瘍抑制因子タンパク質として本来見られるp53がTFシグナル伝達と相互作用することを示した。
この例は、TFΔCTマウス、TFΔCT/PAR−2マウス及びTFΔCT/PAR−1マウスに及ぼす酸素加剰の効果を説明する。病理学的血管新生における組織因子細胞質尾部及びプロテアーゼにより活性化される受容体(PAR)1及び2の役割を、酸素誘発性網膜症(OIR)についてのマウスモデルを使用して研究した。新生児野生型(wt)、TFΔCT、PAR−2欠乏性及びPAR−1欠乏性マウス(Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Developmentのご好意により提供)を、TFΔCT/PAR−2及びTFΔCT/PAR−1欠乏性二重変異体と同様、P7で酸素加剰(75%酸素)へ5日間暴露した。TFΔCTでは網膜血管新生の速度が加速するため、網膜の血管新生がP7の野生型に匹敵するP5でマウスを酸素加剰に置いた。P12及びP17で(それぞれ正常酸素圧へ戻した直後及び5日後)、網膜を摘出し、4%PFA中で固定し、フルオレセインにより共役されたイソレクチングリフォニア・シンプリシフォリア(griffonia simplicifolia)でインキュベートした。網膜を、共焦点顕微鏡を使用して画像化し、閉塞及び新生血管房の領域を定量した。
酸素加剰暴露直後、閉塞の程度はすべてのマウスで同様であった。図7は、TFΔCTマウス及びTFΔCT/PAR−1欠乏性二重変異体を野生型マウスとグラフで比較する。図7の上パネルは、野生型マウスと二重変異体が血管閉塞の同様のレベルを有するのに対し、PAR−1欠乏性マウスにおいて、閉塞領域の再血管新生が野生型マウスと比較して有意に遅延したことを示す。TFΔCT/PAR−1欠乏性二重変異体において、この再血管新生の遅延は、新生血管房形成によって明白なように(図7、下パネル)、部分的に逆戻りした。
図8は、TFΔCTマウス及びTFΔCT/PAR−2欠乏性二重変異体を野生型マウスとグラフで比較する。図8の上パネルは、p17で、TFΔCTマウスが野生型マウスと比べ有意に小さな網膜血管閉塞領域を呈したことを示し、そのことは、TF細胞質尾部の損失が閉塞した領域の再血管新生の亢進を生じることを示した。TFΔCT/PAR−2欠乏性二重変異体はTFΔCT表現型を逆戻りさせ、PAR−2シグナル伝達が病理学的血管新生における組織因子の細胞質尾部によって調節されることを示した。閉塞の程度における有意な変化はPAR−2ノックアウトでは観察されなかった。閉塞領域の再血管新生において観察される差異とは対照的に、新生血管房の形成における有意差は、P17での野生型マウスと比較してトランスジェニックマウスのいずれにおいても観察されなかった(図8、下パネル)。
この例は、OIRモデルにおけるマウスにおけるPARシグナル伝達阻害因子(Dickinson及びRuf、J.Biological Chem.,1997; 272: 19875−19879によって記載される方法によって調製される活性部位により阻害されるVII因子(FVIIai))の注入の効果を説明する。OIRのマウスモデルにおけるTFシグナル伝達の役割をさらに研究するため、自然に発生するVII因子よりもTFに対する高い親和性を有する組換え型の活性部位により変異されるVII因子阻害剤(FVIIai)を、マウスが正常酸素圧に戻された直後に硝子体内に注射した。FVIIaiを注射されたマウスにおける反体側のコントロール眼に、コントロールとしてのPBSを注射した。網膜を注射4日後に分析した。FVIIai注射は、閉塞領域の再血管新生を亢進した(図9、上パネル)のに対し、新生血管房の形成は低下した(図9、下パネル)。
考察
血管新生は、凝固の活性化が顕著である、癌、新生血管眼疾患及び関節炎に観察される病変の重要な要素である。実際、凝固は、フィブリンが豊富な暫定的細胞外マトリックスの生成、活性化された血小板からの親血管新生因子及び抗血管新生因子並びに内皮細胞PAR−Iを通じたトロンビンシグナル伝達など、複数の効果によって間接的に血管新生を支えている可能性がある。本データは、PAR−2シグナルがTF細胞質ドメインによって強固に制御されていることを実証することによって、凝固シグナルが血管新生を制御する方法について、新規且つ予測できない洞察を与える。TF細胞質ドメインの遺伝的欠失は、加速された生理的及び病理的血管新生をもたらす。このため、TF細胞質ドメインによる負の制御的調節の喪失は、PAR−2の血管新生促進シグナル伝達を作動させることができる新規経路である。
血管新生は、凝固の活性化が顕著である、癌、新生血管眼疾患及び関節炎に観察される病変の重要な要素である。実際、凝固は、フィブリンが豊富な暫定的細胞外マトリックスの生成、活性化された血小板からの親血管新生因子及び抗血管新生因子並びに内皮細胞PAR−Iを通じたトロンビンシグナル伝達など、複数の効果によって間接的に血管新生を支えている可能性がある。本データは、PAR−2シグナルがTF細胞質ドメインによって強固に制御されていることを実証することによって、凝固シグナルが血管新生を制御する方法について、新規且つ予測できない洞察を与える。TF細胞質ドメインの遺伝的欠失は、加速された生理的及び病理的血管新生をもたらす。このため、TF細胞質ドメインによる負の制御的調節の喪失は、PAR−2の血管新生促進シグナル伝達を作動させることができる新規経路である。
PAR−1は、内皮細胞中で恒常的に発現されているのに対して、PAR−2は、TFも誘導する炎症性サイトカイン刺激時に特異的に上方制御される。しかしながら、TF発現は、内皮細胞中での付随するVEGFシグナル伝達によって相乗的に増強される。TF及びPAR−2の発現並びにTF−P AR−2シグナル伝達経路の機能性は、このため、血管新生増殖因子及び炎症性サイトカインの両方の利用可能性に依存している。動員された単球/マクロファージによる炎症性サイトカイン産生は、血管新生及び血管の側枝増殖にとって重要であると認識されている。これらの適応過程は、傷害を受けた組織から病原体を除去するために先天性免疫系の活動に典型的に付随する創傷治癒と共通点を有している。付随する炎症が存在する場合の創傷治癒の間の加速された血管新生は、TF−PAR−2シグナル伝達経路の生理的機能であるかもしれず、このため、脊椎動物におけるTF細胞質ドメイン構造及び制御要素の進化的保存を説明する可能性がある。
負の制御調節機序が失われた場合に、生理的応答経路は、しばしば、病変を引き起こす。TF細胞質ドメインは、内皮細胞中のPKCα依存性経路を通じたSerリン酸化による翻訳後修飾に対する標的である。TFは、主として、リン酸化されておらず、パルミトイル化がアゴニストによって誘導されたリン酸化を抑制する。さらに、PAR−2の活性化は、内皮細胞中でTF細胞質ドメインリン酸化を引き起こすが、PAR−1は引き起こさない。このため、パルミトイル化の喪失は、PAR−2の上方制御と相まって、TF細胞質ドメインリン酸化の程度を決定する。この考え方は、糖尿病性癌組織から得られるインビボデータによって裏付けられ、上方制御されたPAR−2の、リン酸化されたTFとの同時存在は、新生血管においてのみ観察される。このため、TFのリン酸化は、病理的なPAR−2−依存性血管新生を促進するための負の制御調節のスイッチを切る機序である可能性がある。
TF−P AR−2シグナル伝達は、TFΔCT大動脈中で、PDGF−BBと選択的に協調するが、VEGF、bFGF又はPDGF−AAとは協調しなかった。PDGF−BBは、局所的凝固に関連する、活性化された血小板からの放出によって、又は発芽している内皮細胞からの合成によって容易に利用可能である。VEGFを標的とした抗血管新生療法は、ある種の疾病において有効であるように見受けられるが、別の協調的経路を標的とする分子との併用療法から、さらなる利点が得られるかもしれない。例えば、PDGF受容体は、VEGFによって誘導されたアプローチと組み合わせて、PDGF受容体を阻害することは相乗的な利点を有する。PDGF−BBシグナル伝達は、周皮細胞の動員と成熟した脈管構造を安定化させる上で極めて重要であるので、全身的なPDGF受容体の遮断は明確な制約を有している。実際、内皮細胞特異的PDGF−BBの結果、血管の周皮細胞密度が減少することによって、マウスに微小血管性の血管症が引き起こされる。
本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施形態の様々な改変及び修飾を行うことが可能である。例えば、このような治療を必要としている患者への、リン酸化された細胞質ドメインを有するTFの治療的有効量の全身的又は局所的投与によって、虚血を治療することが可能である。本明細書に例示されている具体的な実施形態に関して限定を意図するものではなく、又は示唆されるべきではない。
Claims (12)
- 哺乳類組織におけるプロテアーゼ活性化受容体(PAR)シグナル伝達経路を調節することを含む、該組織における血管新生を調節する方法。
- 調節がPAR−2シグナル伝達経路の阻害を含む、請求項1の方法。
- 調節がPAR−1シグナル伝達経路の阻害を含む、請求項1の方法。
- PARシグナル伝達経路が組織における組織因子細胞質ドメインのリン酸化を調節することによって調節される、請求項1の方法。
- 病理学的血管新生疾病状態にある哺乳類へPARシグナル伝達経路阻害剤の治療効果のある量を投与することによってPARシグナル伝達経路が調節される、請求項1の方法。
- PARシグナル伝達経路阻害剤がTF−VIIaシグナル伝達阻害剤である、請求項5の方法。
- TF−VIIaシグナル伝達阻害剤が、活性部位により阻害される因子VIIa(VIIai)、線虫抗凝固ペプチドc2(NAPc2)、VIIa因子に特異的な抗体、組織−VIIa因子複合体(TF−VIIa複合体)に特異的な抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項6の方法。
- PARシグナル伝達経路阻害剤がPDGF受容体βシグナル伝達阻害剤である、請求項5の方法。
- PDGF受容体βシグナル伝達阻害剤がPDGF−BBに特異的な抗体である、請求項8の方法。
- PARシグナル伝達経路阻害剤が組織因子細胞質ドメインリン酸化阻害剤である、請求項3の方法。
- 疾病状態が腫瘍の発達を包含する癌であるか又は虚血性網膜症である、請求項5の方法。
- 哺乳類がヒトである、請求項1の方法。
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