JP2007527513A

JP2007527513A - サイトカインを調節する作用物質の同定方法

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Publication number: JP2007527513A
Application number: JP2006518583A
Authority: JP
Inventors: ヴェンデラ・パロフ; ロッタ・モレウス
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-28
Publication date: 2007-09-27
Also published as: WO2005001478A1; AU2004252395A1; EP1639371A1; CA2528281A1

Abstract

本発明は、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を阻害することにより、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物の作用を調節する作用物質の同定方法に関するものである。作用物質は、細胞におけるＩＧＦ−１レベルの低減、および成長ホルモンのようなホルモン調節異常またはプロラクチン調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置に有用である。

Description

発明の詳細な説明

技術分野
本発明は、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物の作用を調節する作用物質の同定方法に関し、該作用物質は、細胞におけるＩＧＦ−１レベルの低減、および成長ホルモンまたはプロラクチン調節異常のようなホルモン調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置に有用である。

背景
成長ホルモン（ＧＨ）は、下垂体前葉（脳下垂体前葉）から分泌され、様々な組織を標的とする。ＧＨは、身体の成長、分化および中間代謝、およびＧＨ誘発性インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）により仲介される作用を含む、共通する範囲の作用を有する（Bichell et al., 1992）。ＩＧＦ−１は、出生後の成長の主要な調節因子であり、異なる組織に対する内分泌作用および傍分泌作用の両方を有する。

ＧＨは、膜結合型受容体である成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）（サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属する）と結合することにより、異なる遺伝子の転写を誘導する（Graichen et al., 2003）。これらの受容体は、固有の触媒活性を欠いているが、細胞基質タンパク質をチロシンキナーゼ活性と関連付ける。受容体は１つの膜貫通ドメインを有し、ダイマーを形成し、リガンド結合に際して活性化されるモノマーとして存在する。いくつかの細胞内２次メッセンジャーは、カルシウムイオン、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、Ｇタンパク質、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、およびシグナルトランデューサー、および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１、３、および５を含むＧＨのシグナル伝達において関与している（Wood, 1996）。

ＧＨのシグナル伝達が、活性化がＪＡＫ２およびＳＴＡＴ５のリン酸化を通じて仲介されるセリンプロテアーゼインヒビター（ＳＰＩ）２．１遺伝子において調べられた（Wood, 1996）。リガンド結合によりＧＨＲが活性化される場合、ＧＨＲ細胞内部分に結合しているチロシンキナーゼＪＡＫ２がリン酸化され、次いでＧＨＲ自体をリン酸化する。これによりＳＴＡＴ５のリン酸化を生じ、そしてそれらはホモダイマーを形成し、核に転位され、ＧＨ応答エレメント（ＧＨＲＥ）と呼ばれるＳＰＩ２．１プロモーターの特異的配列と結合し、それにより、遺伝子の転写を活性化する。

細胞表面上のＧＨＲ数を調節するために、ＧＨＲはエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、消化されるためにリソソーム小胞に輸送される。しかしながら、ＧＨＲはまた、ＧＨ刺激に際して取り込まれ、核に転位されることが報告された（Lobie, Wood 1994）。ＧＨＲ自体が遺伝子調節に関与し得ることが示唆されたのである。興味深いことに、ＧＨおよびＧＨＲの両方の核への転位はＪＡＫ２と無関係であり（Graichen et al., 2003）、このことは、この核への転位がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路と無関係の代替シグナル伝達経路であり得ることを示唆している。

２つのＩＧＦ−１プロモーターを調べることで、ラットの肝臓のＩＧＦ−１がＧＨにより活性化されるとき、ＤＮＡとタンパク質との相互作用に変化はみられないことが明らかにされた（LeStunff et al., 1995, Thomas et al., 1994）。このことは、ＧＨがＩＧＦ−１転写の急激な活性化を誘導するという事実（Bichell et al., 1992）とともに、ＤＮＡと結合した既存の転写因子のＧＨ誘発性修飾を示唆している。プロモーター２におけるタンパク質結合ＤＮＡ部位の１つは、転写因子ＡＰ２の結合部位であり得ることが見出され、転写因子ＯＣＴ１もこのプロモーター流域と結合することも示唆された（LeStunff et al., 1995）。転写因子ＡＰ２は、４個のメンバーを含むファミリーに属し、これらは全て、胚形成において増殖および分化の組織特異的エフェクターとして関与している（Pfisterer et al., 2002; Werling and Schorle 2002）。ＯＣＴ１は、たいていの哺乳類細胞タイプにおいて見出される遍在性転写因子であり、細胞中でそれは種々の遺伝子の転写を活性化する。

図面の簡単な説明
図１Ａは、抗ＧＨＲ抗体およびＯＣＴ１ＤＮＡプローブ（配列番号：３および４）とインキュベーションされた、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）でトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を表す。

図１Ｂは、抗ＧＨＲ抗体およびＡＰ２ＤＮＡプローブ（配列番号：５および６）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。

図１Ｃは、抗ＧＨＲ抗体およびＡＰ２ＤＮＡプローブ（配列番号：５および６）とインキュベーションされたラットの肝細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。

図１Ｄは、抗ＧＨＲ抗体およびＰｒ２ＦＤＮＡプローブ（配列番号：９および１０）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。

図１Ｅは、Ｐｒ２ＦＤＮＡプローブ（配列番号：９および１０）とインキュベーションされた、プロラクチン受容体でトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。

図１Ｆは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。遊離プローブ（Ｐ）が負対照として用いられた。特異的なタンパク質とＤＮＡとの相互作用を確かめるため、４００×（過剰量）の未標識の特異的（＋）または非特異的（−）プローブを反応混合物に添加した。起こりうるスーパーシフトの調査は、標識ＤＮＡプローブの添加に先立ち、抽出物を抗ＧＨＲ抗体（ＭＡｂ２６３）とインキュベーションすることにより行われた。代わりに、抗体のみがＤＮＡプローブとインキュベーションされたもの（Ａｂ）では、非特異的な競合は起こらなかった。Ｓ＝ＢＶＴＡ（Ｎ−［５−（アミノスルホニル）−２−メチルフェニル］−５−ブロモ−２−フルアミド）。

図１Ｇは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。遊離プローブ（Ｐ）が負対照として用いられた。特異的なタンパク質とＤＮＡとの相互作用を確かめるため、４００×（過剰量）の未標識の特異的（＋）または非特異的（−）プローブを反応混合物に添加した。起こりうるスーパーシフトの調査は、標識ＤＮＡプローブの添加に先立ち、抽出物を抗ＧＨＲ抗体（ＭＡｂ２６３）とインキュベーションすることにより行われた。代わりに、抗体のみがＤＮＡプローブと共にインキュベーションされたもの（Ａｂ）では、非特異的な競合は起こらなかった。Ｓ＝ＢＶＴＡ。

図１Ｈは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＨＸラットの肝細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。遊離プローブ（Ｐ）が負対照として用いられた。特異的なタンパク質とＤＮＡとの相互作用を確かめるために、４００×（過剰量）の未標識の特異的（＋）または非特異的（−）プローブを反応混合物に添加した。起こりうるスーパーシフトの調査は、標識ＤＮＡプローブの添加に先立ち、抽出物を抗ＧＨＲ抗体（ＭＡｂ２６３）とインキュベーションすることにより行われた。代わりに、抗体のみがＤＮＡプローブと共にインキュベーションされたもの（Ａｂ）では、非特異的な競合は起こらなかった。

図２Ａは、ポンソー（Ponceau）染色により視覚化されたフィルター上の総タンパク質を表す。
図２Ｂは、抗ＧＨＲ抗体でのウエスタンブロットを表す。
図２Ｃは、ＧＨＲがシフトしたバンド中に存在することを示すＥＭＳＡゲルを表す。

図３Ａは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。

図３Ｂは、ブタ抗ウサギ２次抗体のみを用いた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物の対照ウエスタンブロットを表す。

図３Ｃは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。ＧＨＲは、処理に関わらず、トランスフェクションされた細胞およびトランスフェクションされていない細胞由来の核抽出物両方に存在するが、受容体量はトランスフェクションされた細胞においてより多い。

図３Ｄは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＨＸラットの肝細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。ＨＸラットの肝細胞におけるＧＨＲ量は、トランスフェクションされたＷＲＬ−６８細胞におけるものと同じくらい多い。

発明の開示
全長成長ホルモン（ＧＨ）受容体が、ラットの肝細胞および培養ヒト肝細胞由来の単離核に存在することが、免疫細胞化学およびウエスタンブロッティングにより見出された。電気泳動移動度シフトアッセイは、受容体が他の転写因子と相互作用することを示し、これは、ＧＨ受容体でトランスフェクションされた細胞の存在下で観察される増大した量のスーパーシフトにより示される。この相互作用は、ＧＨ受容体結合化合物であるＢＶＴＡ（Ｎ−［５−（アミノスルホニル）−２−メチルフェニル］−５−ブロモ−２−フルアミド）での処理によりダウンレギュレーションされ、ＧＨ誘発性ｍＲＮＡを低減させる。従って、核のＧＨ受容体は機能的であり、転写レベルを調節するタンパク質複合体の一部であると推定される。

第１の態様において、本発明は、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質の同定方法を提供し、該方法は：（ｉ）細胞を候補作用物質と接触させ；次に（ｉｉ）該候補作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と該受容体と相互作用する核因子との相互作用を調節するか否かを決定する（ただし、核因子はＳＴＡＴ５以外である）、を含む。かかる方法により同定される作用物質は、例えば、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物の調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置または予防のために用いられることができる。

本発明は、次の工程：（ｉ）細胞を候補作用物質と接触させ（該候補作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する）；（ｉｉ）該候補作用物質の存在下で、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体結合化合物の生物学的作用を測定し；次に、（ｉｉｉ）該候補作用物質が細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体結合化合物の生物学的作用を調節するか否かを決定する、を含んでいてもよい。ある種の実施態様において、候補作用物質は成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を阻害する。他の実施態様において、候補作用物質は成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を刺激する。

方法は、ＡＰ２、ＯＣＴ１、およびＰｒ２Ｆからなる群から選択される核因子の応答エレメントを含むプロモーターと結合した受容体遺伝子の発現を決定する工程を含んでいてもよい。

本明細書に記載の方法において用いられ得る候補作用物質は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、抗体または抗体フラグメント、非ペプチド化合物、炭水化物、小分子、脂質、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、１本鎖または２本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸分子、およびリボザイムを含む。

本明細書に記載の同定方法は、インビトロまたはインビボにて実施され得る。インビトロの方法のためには、同定は細胞ベースの系または無細胞系を用いて行われ得る。

別の態様において、本発明は、サイトカインクラスＩ受容体と相互作用する核因子の同定方法を特色とし、該方法は：（ｉ）細胞をサイトカインクラスＩ受容体をコードする核酸でトランスフェクションし；（ｉｉ）核抽出物を該細胞から調製し；（ｉｉｉ）核抽出物を候補核因子と結合する標識オリゴヌクレオチドプローブとインキュベーションし；（ｉｖ）反応混合物をポリアクリルアミドゲルにて分離させ；次に、（ｖ）タンパク質とＤＮＡの複合体に対応するバンドを検出する、を含む。方法は、核抽出物の調製に先立ち、細胞をサイトカインクラスＩ受容体結合化合物で刺激する工程を含んでいてもよい。

核因子の他の同定方法は、細胞を受容体構築物でトランスフェクションすること（該核因子オリゴヌクレオチドは、受容体遺伝子の転写を調節するプロモーターの一部である）を含む。細胞はサイトカインクラスＩ受容体結合化合物で刺激され、受容体遺伝子活性が測定される。
核因子は、ＡＰ２、ＯＣＴ１、またはＰｒ２ＦのようなＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。

本発明による方法は、候補作用物質が細胞における成長ホルモンの作用を調節するか否かの決定を含み得る。本発明の１つの実施態様において、かかる決定は、プロモーター（例えば、ＳＰＩ２．１、ＡＰ２、ＯＣＴ−１、またはＰＲ２Ｆプロモーター）と結合した受容体遺伝子の発現の決定を含む。

ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質、およびサンゴ蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）ファミリーの他のメンバーのようなレポーター遺伝子を用いて、転写活性が本発明によるスクリーニングアッセイにおいて決定され得る（例えば、Goeddel (ed.), Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)を参照）。

細胞における成長ホルモンの作用を調節する、本明細書に記載の方法により同定される作用物質は、例えば、成長ホルモン調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置または予防のために用いられ得る。かかる障害は、例えば、末端肥大症、成長ホルモン調節異常、プラダー・ウィリ症候群およびターナー症候群と関連する発育遅延、成長ホルモン不応症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と関連する消耗病、および骨粗鬆症を含む。さらに、作用物質は、細胞におけるＩＧＦ−１レベルまたはＩＧＦ−１産生を低減または阻害するために用いられ得る。

末端肥大症を処置するためには、同定される作用物質は、ＧＨＲと核因子との相互作用を阻害するか、あるいは低減させることが期待される。プラダー・ウィリ症候群、ターナー症候群、成長ホルモン不応症、および骨粗鬆症のような成長ホルモン調節異常と関連する障害を処置するためには、同定される作用物質は、ＧＨＲと核因子との相互作用を刺激するか、あるいは増大させることが期待される。

細胞におけるプロラクチンの作用を調節する、本明細書に記載の方法により同定される作用物質は、例えば、プロラクチン調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置または予防のために用いられ得る。高プロラクチン血症は、プロラクチンの過剰産生および分泌により引き起こされる疾患であり、生殖機能の抑制およびおよび乳汁漏出のような臨床症状を生じる。高プロラクチン血症の原因として、プロラクチン分泌性下垂体腫瘍（プロラクチノーマ）が頻繁に観察される。さらに、当該技術分野において、肥満、高血糖症、高インスリン血症、高コレステロール血症、高脂血症、およびＩＩ型糖尿病のような代謝障害が、プロラクチンの日常レベルでの異常パターン（および変動）と関連することが知られている。プロラクチンの必要な対象は、例えば、乳汁分泌刺激の必要な人（例えば、母親）；免疫系の刺激の必要な人（例えば、免疫障害のリスクのある人、ＡＩＤＳのリスクのある人または人免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した人、あるいは栄養不足の人）である（例えば、米国特許番号第６，５４５，１９８号参照）。

高プロラクチン血症またはプロラクチノーマを処置するためには、同定される作用物質は、プロラクチンと核因子との相互作用を阻害するか、あるいは低減させることが期待される。プロラクチン不全と関連する障害を処置するためには、同定される作用物質は、プロラクチン受容体と核因子との相互作用を刺激するか、あるいは増大させることが期待される。

別の態様において、本発明は、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物の調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置または予防方法を特色とし、該方法は、それらの必要な対象に、有効量の、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質を投与することを含む。ある種の実施態様において、核因子はＳＴＡＴ５以外である。

方法は、作用物質の投与に先立ち、本明細書に記載の医学上の障害を有するか、またはリスクのある対象を同定する工程を含んでもよい。さらに、あるいは代わりに、方法は、作用物質の投与に続き、対象を医学上の障害の１以上の症状の重症度の存在について評価する工程を含むこともできる。対象に投与される作用物質の量は、かかる評価の結果に基づき選択されてもよい。

ある種の実施態様において、作用物質は、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を阻害する。他の実施態様において、作用物質は、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を刺激する。

別の態様において、本発明は、細胞においてＩＧＦ−１転写を調節する方法を特色とし、該方法は、細胞を、有効量の、成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質と接触させ、それにより、細胞におけるＩＧＦ−１転写を調節する、を含む。ある種の実施態様において、作用物質は成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を阻害し、それにより、細胞におけるＩＧＦ−１転写を低減させる。他の実施態様において、作用物質は成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を刺激し、それにより、細胞におけるＩＧＦ−１転写を増大させる。

別の態様において、本発明は、細胞における転写を調節する方法を特色とし、該方法は、細胞を、有効量の、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質と接触させ、それにより、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を調節する（ただし、核因子はＳＴＡＴ５以外である）、を含む。作用物質は、例えば、サイトカインクラスＩ受容体と結合し、サイトカインクラスＩ受容体の核因子と結合する能力を阻害または低減する化合物であり得る。ある種の実施態様において、作用物質はサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を阻害し、それにより、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を低減させる。他の実施態様において、作用物質はサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を刺激し、それにより、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を増大させる。

本明細書に記載の方法および組成物において、サイトカインクラスＩ受容体は、例えば、成長ホルモン受容体またはプロラクチン受容体であり得る。ある種の実施態様において、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物は成長ホルモンであり、サイトカインクラスＩ受容体は成長ホルモン受容体である。他の実施態様において、サイトカインクラスＩ受容体結合化合物はプロラクチンであり、サイトカインクラスＩ受容体はプロラクチン受容体である。
本明細書に記載の方法および組成物において用いられる核因子は、例えば、ＡＰ２、ＯＣＴ１、またはＰｒ２Ｆであり得る。

本明細書に記載の方法において用いられる作用物質は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、抗体または抗体フラグメント、非ペプチド化合物、炭水化物、小分子、脂質、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、１本鎖または２本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸分子、またはリボザイムであり得る。

別段規定されていない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野における通常の知識を有するものにより一般に理解されるのと同じ意味を有する。適当な方法および材料が以下で記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または均等な方法および材料も、本発明の実施または試験において用いられ得る。本明細書において記載の刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は全て、引用により完全に取り込まれる。対立する場合、定義を含め本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみであって、制限することを意図していない。

本発明をここで、実施例を記載してさらに説明する。実施例は決して本発明の範囲を制限することを意図していない。

実施例
実験方法
細胞培養：ヒト胎児肝細胞株であるＷＲＬ−６８細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸塩、および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡ）（全てＧＩＢＣＯ）を添加した、ＮａＨＣＯ_３（Statens Veterinaurmedicinska Anstalt）を含むＥＭＥＭ培地にて培養した。細胞を、トリプシン処理により１週間に２回継代培養し、細胞週密度約８０％を維持した。

トランスフェクション：細胞を、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Roche）を用いて、製造元の説明に従い、ヒトの全長ＧＨ受容体（ｐＭＢ１２８８、２μｇ／μｌ）でトランスフェクションした。この試薬と共に、カチオン性リポソーム系トランスフェクション法（リポフェクション）を用いた。Ｔ７５フラスコのＷＲＬ−６８細胞を、それぞれのフラスコに対してＤＮＡ１０μｇを用いてトランスフェクションした。ＤＮＡ５μｌ（１０μｇ）を、ＯＰＴＩＭＥＭ１培地（GIBCO）２５０μｌで希釈し、ＯＰＴＩＭＥＭ１培地１７５μｌで希釈したＤＯＴＡＰ試薬７５μｌと軽く混合した。混合物を１０分間インキュベーションし、次に、ＯＰＴＩＭＥＭ１培地１０ｍｌと軽く混合した。細胞を１度洗浄し、４時間、ＤＮＡ／ＤＯＴＡＰトランスフェクションミックスとインキュベーションし、次に、新たな培地に交換した。翌日、細胞を新たな培養ディッシュに播種した。

刺激：細胞を、トランスフェクションの２日後、集密度約８０％にて刺激した。無血清培地にて１時間飢餓状態におき、次に、１０ｎＭｈＧＨ（Genotropin, Pharmacia）で６０分間、１μＭＢＶＴＡ（Ｎ−［５−（アミノスルホニル）−２−メチルフェニル］−５−ブロモ−２−フルアミド）で６０分間、または１μＭＢＶＴＡで６０分間、次に１０ｎＭｈＧＨで６０分間刺激した。無血清培地にて３時間（ＧＨＲでトランスフェクションした細胞）または１６時間（トランスフェクションしていないＷＲＬ−６８細胞）飢餓状態に置き、１００ｎＭｈＧＨで２０分間、１μＭＢＶＴＡで２０分間、または１μＭＢＶＴＡで２０分間、次に、１００ｎＭｈＧＨで２０分間刺激した。

核画分および細胞質画分の調製：核抽出物を、Dignam等（1983）およびAusubel等（1993）に記載の方法に従い、次の修飾を加えて調製した。

ＷＲＬ−６８細胞を氷冷ＰＢＳに加えてバラバラ（scrap）にし、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに集め、３０００ｒｐｍにて５分間遠心した。細胞ペレットを、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含む低張バッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．９、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（共にSigma）、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＫＣｌ、０．１％ノニデットＰ−４０（Amersham）、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｎＭオカダ酸（Calbiochem）、１×コンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche））に再懸濁し、３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、再び低張バッファーに再懸濁した。細胞を、氷上にて１０分間膨潤させ、次に、ＤｏｕｎｃｅホモジェナイザーにてＴｅｆｌｏｎ内筒Ｃタイプを用いてホモジェナイズした。細胞溶解を、トリパンブルー（０．４％、Sigma）を一定量の細胞に添加すること（破壊された細胞において核が青く染まる）により、顕微鏡下で確認した。７０〜８０％の純化核画分を得るために、およそ４０回行う必要があった。４０００ｒｐｍにて１５分間遠心して、核を集め、直ぐに−７０℃にて凍結させた。細胞質画分として上清も−７０℃にて保存した。

核画分および細胞質画分を、下垂体摘出ＳＤ（Sprague Dawley）ラットの肝臓から調製した（倫理学的ライセンスＮ１７６／０２）。ラットは５週齢でｈＧＨを投与するためのミニポンプを移植した。対照動物は刺激しておらず、従って完全にＧＨ不足であり、一方ＧＨ動物をｈＧＨ０．１２ｍｇ／ｋｇ／日にて５日間連続して刺激した。動物を麻酔し、肝臓を切り出し、氷冷ＰＢＳに入れた。次に、肝臓を小片にカットし、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含む氷冷低張バッファー８ｍｌに移し、氷上で１０分間膨潤させた。肝臓の小片をＤｏｕｎｃｅホモジェナイザーにてＴｅｆｌｏｎ内筒Ｃタイプを用いてホモジェナイズし、懸濁液を無菌の圧縮機をとおして濾過し、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をさらに、Ｄｏｕｎｃｅホモジェナイザーにてガラス製内筒を用いてホモジェナイズした。細胞溶解を、トリパンブルー（０．４％、Sigma）を一定量の細胞に添加すること（破壊された細胞において核が青く染まる）により、顕微鏡下で確認した。７０〜８０％の純化核画分を得るために、およそ１０〜２０回行う必要があった。４０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心して、核を集めた。上清を取り出し、細胞質画分として保存した。ペレット化した核および細胞質を直ちに−７０℃にて凍結させた。

核タンパク質の抽出：タンパク質を核から抽出するために、核ペレットを、試料を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に用いるか否かで、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含む２×溶解バッファー（１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．６、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ（GIBCO）、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Sigma）、０．２ｍＭＰＭＳＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｎＭオカダ酸、１×コンプリート）、またはインヒビターを含むＥＭＳＡバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭＥＤＴＡ、２５％グリセロール、０．５ｍＭＰＭＳＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｎＭオカダ酸、１×コンプリートプロテアーゼインヒビター）に再懸濁した。最適なタンパク質抽出のために、３種の異なる方法を評価した。試料を氷上に３０分間置き、３７℃で１５分間ＤＮＡｓｅ１μｌで処理するか、あるいは注射針で処理して、ＤＮＡを剪断した。最適な抽出を、下記のウエスタンブロットおよびタンパク質濃度の決定により評価した。試料を１４０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心し、核タンパク質を含む上清を一定量に分け、−７０℃にて保存するか、あるいはウエスタンブロットまたはＥＭＳＡアッセイに用いた。

タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce）（これはビウレット反応（アルカリ性培地中のタンパク質によるＣｕ^２＋のＣｕ^１＋への還元）およびビシンコニン酸（ＢＣＡ）含有試薬を用いる）を用いて決定した。２分子のＢＣＡが１個のＣｕ^１＋イオンを有する複合体を形成し、それは紫色となり、５６２ｎｍにおいて高い吸光度を有する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いた。

免疫沈降：タンパク質Ｇセファロース（Amersham）を用いて、トータルの核抽出物由来のＧＨＲとリン酸化ＳＴＡＴ５ｂを免疫沈降させた。タンパク質Ｇをセファロースビーズに固定化し、ＩｇＧのＦ_ｃ領域と結合させ、抗原結合に利用可能なＦ_ａｂ領域を残した。
それぞれの試料について、タンパク質Ｇセファローススラリー６０μｌを用いた（純化セファロース約３０μｌ）。セファロースを２ｍｌのエッペンドルフチューブに集め、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３×１ｍｌ中で３０００ｒｐｍにて２分間遠心して洗浄した。次に、５μｌ／試料の抗ＧＨＲ（ＭＡｂ２６３，AGEN）または抗リン酸化ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、Ｙ６９４／Ｙ６９９（Upstate Biotechnology）抗体を添加した。抗体と結合したセファロースをＰＢＳで希釈し、室温にて２時間転倒混和した。その後、セファローススラリーを新しい２ｍｌのエッペンドルフチューブに分け入れ、ＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄した。次に、核溶解物を解凍し、それぞれの試料由来の溶解物１００〜２００μｌをセファロースに添加した。上記のプロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含む２×溶解バッファー５００μｌで希釈し、次に、４℃にて一晩転倒混和した。翌日、それぞれの試料を１×溶解バッファーで２回洗浄し、１×溶解バッファーと１２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ６．８との１：１混合物にて１回洗浄した。次に、４×ＮｕＰＡＧＥサンプルバッファー（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ブロモ・フェノールブルー（ＢＦＢ）、グリセロール）および５０ｍＭ還元作用物質ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Sigma）を試料に添加し、その後、それらを７０℃にて１０分間加熱して、タンパク質をセファロースから解離させた。上清中の免疫沈降したタンパク質を、次にゲル電気泳動で分離させることが可能である。

ゲル電気泳動：抽出した核タンパク質を４×ＮｕＰＡＧＥサンプルバッファーで処理し、次に、７０℃にて１０分間加熱した。還元型で分析した試料も、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質とタンパク質の相互作用を破壊するために、５０ｍＭＤＴＴで処理した。次に、タンパク質をＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）上で分離した。ゲルを２００Ｖ、室温にて１時間、ランニングバッファーＭｏｐｓ（５０ｍＭＭＯＰＳ、５０ｍＭＴｒｉｓ、３．５ｍＭＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ）にて泳動した。分子量マーカーとしてSeeBlue Standard（Invitrogen）を用いた。

ウエスタンブロット：タンパク質をＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Amersham）に、４℃、１００Ｖにて１時間、１×ＮｕＰＡＧＥトランスファーバッファー（２５ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２５ｍＭＢｉｃｉｎｅ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％ＥｔＯＨ）を用いてトランスファーした。次に、抗体のメンブレンとの非特異的な結合を防ぐために、メンブレンをＴｒｉｓ緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）（１３０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Amersham））中の１％ミルクからなるブロッキングバッファーで一晩、４℃にてブロッキングした。メンブレンを、ＴＢＳＴにて５分間２回洗浄し、次に、１次抗体と１時間室温にてインキュベーションした。その後、メンブレンを再び、ＴＢＳＴ中にて１０分間３回洗浄し、２次抗体と室温にて１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴ中にて１０分間４回洗浄した。２次抗体と結合した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓを用いて検出し、ＥＣＬＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（共にAmersham）上で露光した。

ストリッピングおよび再ブロッティング：ストリッピングバッファー（６２．５ｍＭＴｒｉｓｐＨ６．５、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ β−メルカプトエタノール）中、５０℃にて３０分間インキュベーションして、メンブレンを抗体からストリッピングした。それらを多量のＴＢＳＴ中で１０分間２回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＴＢＳＴ中１％ミルク）中、４℃にて一晩ブロッキングした。次に、上記の別の抗体を用いて再ブロッティングを行った。用いた１次抗体：マウスモノクローナル抗ＧＨＲＭＡｂ２６３＃１７４Ａ−０２１１：１０００（AGEN）、ＧＨＲの細胞内部分に対するウサギポリクローナル抗血清抗ＧＨＲ１：５０００（Zhang et al., 2001）、ＧＨＲの細胞外部分に対するウサギポリクローナル抗血清抗ＧＨＲ（Biovitrum）、ウサギポリクローナルＩｇＧ抗ＳＴＡＴ５ｂ（Ｃ−１７）ロット＃２５２１：１０００（Santa Cruz Biotechnology）、ウサギポリクローナルＩｇＧ抗リン酸化ＳＴＡＴ５ａ／ｂ（Ｙ６９４／Ｙ６９９）１：１０００（Upstate Biotechnology）。用いた２次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ１：２０００（Dako A/S）、ヒツジ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ１：２０００（Amersham）、ブタ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ１：３０００（Dako A/S）。

電気泳動移動度シフトアッセイ：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、タンパク質とＤＮＡとの相互作用を調べるために用いた方法である。既知の配列を有するＤＮＡプローブを^３３Ｐ−ＡＴＰで末端標識し、次に、核抽出物とインキュベーションした。ＤＮＡプローブと特異的に結合するタンパク質は、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、シフトしたバンドが観察される場合の複合体の移動度を低減させる。ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を同定するために、抗体を核抽出物に添加し、ＤＮＡプローブとインキュベーションする。抗体がＤＮＡと結合するタンパク質を認識すると、複合体の移動度はさらにもっと低減され、スーパーシフトとなる。

^３３Ｐでのオリゴヌクレオチドの標識：一致オリゴヌクレオチド（１．７５ｐｍｏｌ／μ、PromegaまたはSGS DNA）２μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０×バッファー（Promega）１μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega）１μｌ、［γ−^３３Ｐ］ＡＴＰ（AmershamまたはPerkin Elmer）１μｌ、およびヌクレアーゼフリーウォーター（ＤＥＰＣ培地）を混合することで、オリゴヌクレオチドを［γ−^３３Ｐ］ＡＴＰ（２５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Amershamまたは３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Perkin Elmer）で末端標識した。混合物を３７℃にて１０分間インキュベーションし、０．５ＭＥＤＴＡ１μｌを添加して、反応を止めた。０．０５ＭＥＤＴＡ８９μｌを添加して、容量を１００μｌに調節した。未取込の［γ−^３３Ｐ］を取り除くため、一定量である１００μｌをＮＩＣＫ［登録商標］カラム（Amersham Pharmacia Biotech AB）にロードし、標識ＤＮＡを０．０５ＭＥＤＴＡ４００μｌにて２回溶出させた。^３３Ｐ標識試料２μｌをシンチレーション液２００μｌと混合し、Ｂｅｔａカウンター（Trilux1450）にてカウントすることで、特異的活性を測定した。

オリゴヌクレオチド配列
ＧＨＲＥ：
５’−ＴＡＣＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴ−３’（配列番号：１）
３’−ＡＴＧＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＡＧＴＡ−５’（配列番号：２）
ＯＣＴ１：
５’−ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ−３’（配列番号：３）
３’−ＡＣＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＴＣＴＴ−５’（配列番号：４）
ＡＰ２：
５’−ＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴ−３’（配列番号：５）
３’−ＣＴＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡ−５’（配列番号：６）
ＡＰ１：
５’−ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：７）
３’−ＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴ−５’（配列番号：８）

アニーリングし、ＥＭＳＡに用いた、あるいはレポーターベクターにクローン化したオリゴヌクレオチドの配列
ＥＭＳＡに用いた、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを有するＰｒ２Ｆリンカー：
５’−ＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：９）
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号：１０）
ＬｕｃレポーターベクターおよびＳＥＡＰレポーターベクターにクローニングするためのＫｐｎＩ／ＸｈｏＩオーバーハングを有する、２つの可能性のあるＡＰ２部位を含有するリンカー：
５’−ＣＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：１１）
５’−ＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：１２）
ＬｕｃレポーターベクターおよびＳＥＡＰレポーターベクターにクローニングするためのＫｐｎＩ／ＸｈｏＩオーバーハングを有する、２つの「Promega」ＡＰ２部位を含有するリンカー：
５’−ＣＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１３）
５’−ＴＣＧＡＧＡＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：１４）

ＤＮＡ結合反応物の調製：それぞれの反応について、ＥＭＳＡバッファー中の抽出核タンパク質３〜６μｇを、ゲルシフト５×バインディングバッファー（Promega）２μｌおよびヌクレアーゼフリーウォーター（ＤＥＰＣ培地培地）９μｌと混合し、次に、室温にて１０分間インキュベーションした。スーパーシフト分析のために、核抽出物を、抗ＧＨＲ抗体または抗血清１μｌと室温にて１時間プレインキュベーションした。タンパク質とＤＮＡの結合の特異性を制御するために、４００×（過剰量）特異的または非特異的な未標識オリゴヌクレオチドを添加し、反応を制御した。次に、反応物を^３３Ｐ末端標識ＧＨＲＥ(SGS DNA）、ＡＰ１、ＡＰ２またはＯＣＴ１一致オリゴヌクレオチドと室温にて２０分間インキュベーションした。

タンパク質とＤＮＡの複合体のゲル電気泳動：６×ローディングバッファー（３×ＴＢＥバッファー、３２％グリセロール、０．０６％ＢＦＢ）２μｌを、それぞれの試料に添加し、次に、試料をＮｏｖｅｘ６％ＤＮＡ遅延ゲル（Invitrogen）上で分析した。ランニングバッファーとして０．５×ＴＢＥ（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、４５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭＥＤＴＡ（GIBCO））を用い、ゲルを２５０ボルト、室温にて１９分間泳動した。ゲルを固定液（３０％エタノール、１０％酢酸）中で固定し、ゲルドライヤーにて乾燥させた。次に、それらをホスホイメージャー計測系（STORM 860（Molecular Dynamics）およびImage Quant 5.0）を用いて分析した。

ＥＭＳＡ−ウエスタンブロット：ＥＭＳＡを上記の通り行ったが、ゲルを乾燥させる代わりに、それをホスホイメージャースクリーンに露光し、ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、上記の通常のウエスタンブロットにて抗ＧＨＲ抗体を用いてブロットした。タンパク質がメンブレンにトランスファーされたことを確かめるために、メンブレンを全てのタンパク質を染色するＰｏｎｃｅａｕＳ溶液（Sigma）に浸漬した。

実施例１：ＧＨＲおよびＳＴＡＴ５は核抽出物中に存在する
培養細胞株は通常、少量の内在性産生ＧＨＲを示し（図３Ｃ）、肝臓組織は多量の受容体を含有する（図３Ｄ）。核のＧＨＲを検出するために、核タンパク質をゲル電気泳動にて分離し、ウエスタンブロットにて視覚化した。受容体の細胞内部分に対するポリクローナル抗体でブロッティングすると、ＧＨＲは、調べた細胞タイプ（ＷＲＬ−６８、ＧＨＲでトランスフェクションしたＷＲＬ−６８、およびＨＸラットの肝臓）の全画分にて３本の異なるバンドとして検出できた。バンドのうち、２次抗体の非特異的な結合の結果として出現したものはなかった（ブタ抗ウサギ、図３Ｂ）。

トランスフェクションしていないＷＲＬ−６８トータルの核抽出物を用いたウエスタンブロットメンブレンを、ＳＴＡＴ５に対するポリクローナル抗体で再ブロッティングし、それぞれ６０ｋＤａと１００ｋＤａの２本のバンドを観察することができた。１００ｋＤａのバンドはおそらくインタクト（intact）なＳＴＡＴ５モノマーを表し、６０ｋＤａのバンドはＳＴＡＴ５の開裂型である（データは示していない）。

実施例２：全長ＧＨ受容体でのＷＲＬ−６８細胞のトランスフェクションはＧＨＲＥ、ＡＰ２、ＯＣＴ１とＰｒ２ＦＤＮＡプローブとの相互作用を増大させる
ＧＨ受容体でトランスフェクションしたＷＲＬ−６８およびトランスフェクションしていないＷＲＬ−６８核抽出物を、抗ＧＨＲ抗体および^３３Ｐ−ＧＨＲＥ（配列番号：１および２）、^３３Ｐ−ＡＰ２（配列番号：５および６）または^３３Ｐ−ＯＣＴ１（配列番号：３および４）、または^３３Ｐ−Ｐｒ２Ｆ（配列番号：９および１０）一致オリゴヌクレオチドとインキュベーションし、ＥＭＳＡにて分析して、ＧＨＲのこれらのＤＮＡプローブと結合するタンパク質との任意の可能性のある相互作用を解明した。対照のため、抗ＧＨＲとインキュベーションしていない核抽出物を、ＧＨＲＥプローブ（ＧＨＲでトランスフェクションした細胞およびトランスフェクションしていない細胞の両方でいくつかのシフトしたバンドを示した）でのＥＭＳＡを分析した。４００倍の過剰量の未標識の特異的または非特異的なプローブとインキュベーションにより、バンドの特異性を示した（図１および図２参照）。ｈＧＨ刺激の作用は同定されなかった。興味深いことに、全長ＧＨＲでのトランスフェクションは、最もシフトしたバンドの強度を増大させるようであった。このバンド中のタンパク質とＤＮＡとの相互作用はＢＶＴＡ（Ｎ−［５−（アミノスルホニル］−２−メチルフェニル］−５−ブロモ−２−フルアミド）により破壊された。バンドの強度はＢＶＴＡ刺激細胞由来の抽出物において低減し、より高い移動度を有するより小さな複合体を表す小さなバンドが出現したからである。これらの抽出物を抗ＧＨＲ抗体とインキュベーションした場合、結合差は観察されない。トランスフェクションしていない細胞において、核抽出物の抗ＧＨＲとのインキュベーションは、タンパク質のＧＨＲＥプローブとの結合を増大させるようであった。これらのバンドの増大した強度はまた、弱い小さなバンドのスーパーシフトに関与し得る。トランスフェクションしていない細胞中のＧＨＲＥの最も弱いバンドのスーパーシフトは明確に示されたが、この場合、ＢＶＴＡ由来の作用は観察されなかった。抗体のみおよび標識ＧＨＲＥプローブとのインキュベーションは、抗体がＤＮＡ自体とは反応しないことを示した。

ＡＰ２ＤＮＡプローブおよびトランスフェクションしていないＷＲＬ−６８細胞でのＥＭＳＡは、１本のシフトしたバンドを示し、これは競合しなかった（図１Ｂ参照）。ＡＰ２およびＧＨＲでトランスフェクションしたＷＲＬ−６８でのＥＭＳＡにおいて、さらなるバンドが観察され、それは４００×（過剰量）未標識ＡＰ２プローブにより競合されるので、特異的であった（図１Ｂ矢印参照）。これらの核抽出物を抗ＧＨＲ抗体とインキュベーションした場合、この特異的なバンドは強度が増大した。このことは、タンパク質複合体とＡＰ２ＤＮＡプローブとの増強した相互作用を示唆している。ＧＨＲＥを用いたものと同様に、ＢＶＴＡは最も特異的なバンドにより表されるタンパク質とＤＮＡとの相互作用を破壊した。このバンドがＢＶＲＡ刺激細胞由来の抽出物において出現したからである。上記と同様、対照抽出物と比較してｈＧＨ刺激由来の作用は観察されなかった。抗体自体はＤＮＡプローブとの相互作用を示さなかった。

ＯＣＴ１ＤＮＡプローブおよび２種のＷＲＬ−６８細胞タイプでのＥＭＳＡは、２本のシフトしたバンドを示した（図１Ａ）。最もシフトしたバンドは特異的な結合を表した。それは４００倍の過剰量の非標識ＯＣＴ１プローブと競合したからである。ＧＨＲＥおよびＡＰ２でのものと同様、最もシフトしたバンドの強度は、ＧＨＲでトランスフェクションしたＷＲＬ−６８細胞由来の抽出物にて増大した（図１Ａ矢印参照）が、ＡＰ２と対照的に、抗ＧＨＲ抗体との抽出物のインキュベーションはタンパク質のＯＣＴ１ＤＮＡプローブとの結合に明確には影響しなかった。無刺激対照細胞と比較して、ｈＧＨ刺激細胞由来の核抽出物において作用は観察されなかった。また、この場合において、ＢＶＴＡはいくつかのタンパク質とＤＮＡとの相互作用を破壊した；最も特異的なバンドの強度は、ＢＶＴＡ処理細胞由来の抽出物において増大した。ＧＨＲＥおよびＡＰ２でのものと同様、抗体自体はＤＮＡプローブとの相互作用を示さなかった。

ＡＰ１はＧＨ活性化ＭＡＰキナーゼを介して活性化されるので、トランスフェクションしていないＷＲＬ−６８核抽出物を対照としてＡＰ１ＤＮＡプローブ（配列番号：７および８）を用いて分析した。１本のシフトしたバンドを、活性化ＡＰ１転写因子を示す全ての画分で観察することができ、ｈＧＨまたはＢＶＴＡいずれか由来の作用は観察できなかった。ＧＨＲ抗体とのインキュベーションはかすかなバンドを若干生じた。

ＡＰ２およびＯＣＴ１プローブでのＥＭＳＡを、ＧＨＲでトランスフェクションしたＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物と共に行った。分離させた複合体をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。メンブレンの抗ＧＨＲ抗体でのブロッティングは、ＥＭＳＡゲルと比較して不鮮明なバンド中にＧＨＲの存在を示し、これは、ＯＣＴ１およびＡＰ２オリゴヌクレオチドの特異的なシフトしたバンドに対応するようであった。ＧＨＲバンドおよびＯＣＴ１およびＡＰ２でシフトしたバンドの相関は、ＧＨＲがＯＣＴ１でシフトした複合体に存在すること、およびおそらくＡＰ２でシフト複合体にも存在することを示した。

実施例３：ラットの肝臓核抽出物の抗ＧＨＲ抗体とのインキュベーションは、タンパク質のＡＰ２ＤＮＡプローブとの結合を増強させる
ＨＸラットの肝臓の核抽出物を、抗ＧＨＲおよび^３３Ｐ−ＧＨＲＥ、^３３Ｐ−ＡＰ２または^３３Ｐ−ＯＣＴ１一致オリゴヌクレオチドとインキュベーションし、ＥＭＳＡにて分析した。対照のため、抗ＧＨＲとインキュベーションしなかった核抽出物も分析した。２匹の対照動物および２匹のｈＧＨ刺激動物由来の抽出物をアッセイに用いた。

ＧＨＲＥおよびＯＣＴ１ＤＮＡプローブでのＥＭＳＡは、ｈＧＨ刺激したもの、または核抽出物を抗ＧＨＲ抗体とプレインキュベーションしたものいずれにおいても、タンパク質とＤＮＡの結合差を示さなかった。対照的に、ＡＰ２ＤＮＡプローブでのＥＭＳＡは、核抽出物を抗ＧＨＲ抗体とインキュベーションした場合、増強したタンパク質とＤＮＡとの相互作用を示した（図１Ｃ）。上述したように、この作用は、ＧＨＲでトランスフェクションしたＷＲＬ−６８細胞およびＡＰ２プローブでも観察された（図１Ｂ）。対照動物と比較したタンパク質とＤＮＡの結合差は、ｈＧＨ刺激動物由来の抽出物においてみられなかった。抗ＧＨＲインキュベーションＨＸラットの肝臓核抽出物においてみられる増大したタンパク質とＤＮＡとの相互作用が抗ＧＨＲ抗体に特異的であることを確かめるために、ＧＨＲに対する他の抗体を試験した。２つの異なるウサギポリクローナル抗体（１つは細胞外部分に対するものであり、もう１つはＧＨＲの細胞内部分に対するものである）で実験を繰り返した。これらの抗体の両方が、用いた最初の抗体（ＧＨＲの細胞外部分に対するマウスモノクローナル抗体である）と同じく、タンパク質とＤＮＡとの相互作用を増強することを示した。抗体のうちＤＮＡプローブ自体と相互作用するものはなかった。観察される増強したタンパク質とＤＮＡとの相互作用が抗ＧＨＲ抗体に特異的なものであり、任意の抗体で引き起こされないことを確かめるために、抗ＰＫＣ抗体を用いて同じ実験を行った。抗ＰＫＣはタンパク質とＤＮＡとの相互作用を増強しなかった。

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図１Ａは、抗ＧＨＲ抗体およびＯＣＴ１ＤＮＡプローブ（配列番号：３および４）とインキュベーションされた、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）でトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を表す。図１Ｂは、抗ＧＨＲ抗体およびＡＰ２ＤＮＡプローブ（配列番号：５および６）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｃは、抗ＧＨＲ抗体およびＡＰ２ＤＮＡプローブ（配列番号：５および６）とインキュベーションされたラットの肝細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｄは、抗ＧＨＲ抗体およびＰｒ２ＦＤＮＡプローブ（配列番号：９および１０）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞およびトランスフェクションされていないＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｅは、Ｐｒ２ＦＤＮＡプローブ（配列番号：９および１０）とインキュベーションされた、プロラクチン受容体でトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｆは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｇは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−９８細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図１Ｈは、抗ＧＨＲ抗体および成長ホルモン応答エレメントＤＮＡプローブ（配列番号：１および２）とインキュベーションされた、ＨＸラットの肝細胞由来の核抽出物における、ＥＭＳＡの結果を表す。図２Ａは、ポンソー（Ponceau）染色により視覚化されたフィルター上の総タンパク質を表す。図２Ｂは、抗ＧＨＲ抗体でのウエスタンブロットを表す。図２Ｃは、ＧＨＲがシフトしたバンド中に存在することを示すＥＭＳＡゲルを表す。図３Ａは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。図３Ｂは、ブタ抗ウサギ２次抗体のみを用いた、ＧＨＲでトランスフェクションされたＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物の対照ウエスタンブロットを表す。図３Ｃは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＷＲＬ−６８細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。図３Ｄは、１次抗体としてウサギ抗ＧＨＲ抗体を用い、ＨＲＰと結合したブタ抗ウサギ２次抗体により視覚化された、ＨＸラットの肝細胞由来の核抽出物のウエスタンブロットを表す。

Claims

サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質の同定方法であって、下記工程：
細胞を候補作用物質と接触させ；次に
該候補作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と該受容体と相互作用する核因子との相互作用を調節するか否かを決定する（ただし、核因子はＳＴＡＴ５以外である）、
を含む、方法。
下記工程：
細胞を候補作用物質と接触させ（該候補作用物質はサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する）；
該候補作用物質の存在下で、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体結合化合物の生物学的作用を測定し；次に
該候補作用物質が細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体結合化合物の生物学的作用を調節するか否かを決定する、
を含む、請求項１記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体が成長ホルモン受容体である、請求項１記載の方法。
候補作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を阻害する、請求項３記載の方法。
候補作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を刺激する、請求項３記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体結合化合物が成長ホルモンであり、サイトカインクラスＩ受容体が成長ホルモン受容体である、請求項２記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体がプロラクチン受容体である、請求項１記載の方法。
候補作用物質がプロラクチン受容体と核因子との相互作用を阻害する、請求項７記載の方法。
候補作用物質がプロラクチン受容体と核因子との相互作用を刺激する、請求項７記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体結合化合物がプロラクチンであり、サイトカインクラスＩ受容体がプロラクチン受容体である、請求項２記載の方法。
核因子がＡＰ２、ＯＣＴ１、またはＰｒ２Ｆである、請求項１記載の方法。
ＡＰ２、ＯＣＴ１、およびＰｒ２Ｆからなる群から選択される核因子の応答エレメントを含むプロモーターと結合した受容体遺伝子の発現を測定することを含む、請求項２記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体と相互作用する核因子の同定方法であって、下記工程：
細胞をサイトカインクラスＩ受容体をコードする核酸でトランスフェクションし；
核抽出物を細胞から調製し；
該核抽出物を候補核因子と結合する標識オリゴヌクレオチドプローブとインキュベーションし；
反応混合物をポリアクリルアミドゲルにて分離し；次に
タンパク質とＤＮＡの複合体に対応するバンドを検出する、
を含む、方法。
核抽出物の調製に先立ち、細胞をサイトカインクラスＩ受容体結合化合物で刺激することを含む、請求項１１記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体結合化合物の調節異常により引き起こされる医学上の障害の処置または予防方法であって、それらの必要な対象に有効量の、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質を投与する（ただし、核因子はＳＴＡＴ５以外である）ことを含む、方法。
サイトカインクラスＩ受容体結合化合物が成長ホルモンであり、サイトカインクラスＩ受容体が成長ホルモン受容体である、請求項１５記載の方法。
作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を阻害する、請求項１６記載の方法。
作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を刺激する、請求項１６記載の方法。
医学上の障害が末端肥大症である、請求項１６記載の方法。
サイトカインクラスＩ受容体結合化合物がプロラクチンであり、サイトカインクラスＩ受容体がプロラクチン受容体である、請求項１５記載の方法。
作用物質がプロラクチン受容体と核因子との相互作用を阻害する、請求項２０記載の方法。
作用物質がプロラクチン受容体と核因子との相互作用を刺激する、請求項２０記載の方法。
核因子がＡＰ２、ＯＣＴ１、またはＰｒ２Ｆである、請求項１５記載の方法。
細胞におけるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）転写を調節する方法であって、細胞を有効量の、成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質と接触させ、それにより、細胞におけるＩＧＦ−１転写を調節することを含む方法。
作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を阻害し、それにより細胞におけるＩＧＦ−１転写を低減させる、請求項２４記載の方法。
作用物質が成長ホルモン受容体と核因子との相互作用を刺激し、それにより細胞におけるＩＧＦ−１転写を増大させる、請求項２４記載の方法。
細胞における転写を調節する方法であって、
細胞を有効量の、サイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を調節する作用物質と接触させ、それにより、細胞におけるサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を調節する（ただし、核因子はＳＴＡＴ５以外である）ことを含む方法。
作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と結合する、請求項２７記載の方法。
作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を阻害し、それにより、細胞においてサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を増大させる、請求項２７記載の方法。
作用物質がサイトカインクラスＩ受容体と核因子との相互作用を刺激し、それにより、細胞においてサイトカインクラスＩ受容体により誘導される転写を増大させる、請求項２７記載の方法。