KR101343840B1

KR101343840B1 - 리보좀 단백질 ＲＰＳ３ａ를 유효성분으로 하는 셰프론 조성물 및 간암 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101343840B1
Application number: KR1020120001997A
Authority: KR
Inventors: 김균환; 임거흔; 성백린
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2013-12-20
Also published as: KR20130081044A

Abstract

본 발명은 RPS3a를 유효성분으로 하는 셰프론 조성물 및 간암 진단용 조성물에 관한 발명이다.

Description

리보좀 단백질 ＲＰＳ３ａ를 유효성분으로 하는 셰프론 조성물 및 간암 진단용 조성물{ Chaperoning Composition comprising RPS3a and composition for diagnosing HBV-associated Hepatocellular Carcinoma comprising RPS3a}

인간 HBV(Hepatitis B virus)는 급성간염과 만성간염을 유발시키며 인간 간암위험과 밀접하게 관련이 있다고 알려져 있다. HBV 유전체에 암호화되는 4가지 단백질 중에서 HBx(Hepatitis B virus X) 단백질은 다기능단백질로서 간암과 관련이 있다.

현재 HBV 보균자가 반드시 간암이 되는 것이 아니며, HBV 보균자라도 간암에 걸리지 않고 지나는 경우가 대부분이다. 통상 B형간염 바이러스 보균자라 하더라도 간암발생을 하지 않고 평생 지나가는 경우도 많으며, 보균자의 약 30%정도가 감염 후 약20년 내에 간암으로 진행되는데 어떤 분자 마커를 통하여 간암진행이 되는지 알려져 있지 않다. 또한, 인간 B형간염 바이러스가 간암을 유발시킨다고 알려져 있으나 감염 후 언제 유발시키는지,유발시킨다면 어떤 특이적인 분자 마커를 발현시켜 유발시키는지 알려지지 않았다.

HBV가 인간에게 감염하여 비 활동성의 보균자상태를 유지하다가 언제, 어디서, 어떻게 간암이 되고 타 조직으로 전이를 하는지 해명되지 않아 HBV 보균자관리 등에 많은 문제점이 있다. 뿐만아니라, HBV보균자의 간암가능성 또는 간암생성 특이적인 조기진단기술이 부재한 상태이다.

따라서, B형간염 보균자들의 간암발생 예측과 간암발생조기 진단기술의 필요성이 대두 되고 있으며, HBV성 간암 조기진단 기술이 있다면, HBV성 간암의 관리, 예방 및 치료의 지름길이 되는 실정이다.

한편 RPS3a(ribosomal protein S3a)는 ribosomal small subunit (40S)의 구성요소로(Lutsch G, 등 (1990) Eur J Cell Biol 51: 140-150)로 포유류 세포에서 높은 서열 상동성을 가지고 핵과 원형질 모두에 존재한다(Kashuba E, 등(2005) Exp Cell Res 303: 47-55).

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제10-2010-0039528호는 'ＨＢＶ성 간암 진단'에 관한 것으로, HBV(hepatitis B virus)성 간암 마커인 시알산전이효소 ST3Gal III, 후코스전이효소 FUT III, 후코스전이효소 FUT VII 또는 β1-3 갈락토실트랜스퍼라아제(β1-3 galactosyltransferase) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현, 또는 시알릴 루이스 A를 검출하는 방법을 통해 HBV성 간암을 조기에 진단하는 방법 및 키트에 관한 것으로, 여러 가지 시알릴 루이스 항원중에서 시알릴 루이스 A가 HBV성 간암생성의 원인임을 최초로 규명한 것이며, HBV성 간암을 조기에 정확하면서 간편하게 진단 할 수 있다고 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020090098490호는 '간암 진단용 단백질성 마커'에 관한 것으로, ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353) 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 셰프론 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 리보좀 단백질 RPS3a, RPL27a, RPS24, RPL8, RPL35a, 및 RPS27a로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 단백질을 유효성분으로 포함하는 단백질에 대한 셰프론 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RPS3a는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지고, RPL27a는 서열번호 2, RPS24는 서열번호 3, RPL8는 서열번호 4, RPL35a는 서열번호 5, RPS27a는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질은 HBx(Hepatitis B virus X) 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 1의 1에서 50번째의 아미노산 잔기로 구성된 RPS3a(리보좀 단백질 S3a) 단편을 유효성분으로 포함하는 단백질에 대한 셰프론 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 리보좀 단백질 RPS3a, RPL27a, RPS24, RPL8, RPL35a, 및 RPS27a로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 간암은 HBV 관련 간암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 HCC 발달의 중요한 단계로서 HBx-유도된 NF-κB 신호전달에 대하여 과발현된 ribosomal protein S3a (RPS3a)의 효과를 조사하였다. RPS3a에 의한 HBx-유도된 NF-κB 신호전달의 증가는 핵으로의 NF-κB (p65) 신호전달의 이동 능력 및 RPS3a의 넉다운 분석을 통해 조사하였다. 또 RPS3a에 의한 NF-κB의 증가는 생리적 HBx에 대한 셰프론(chaperone) 활성에 의하여 중재된다는 것을 나타내었다.RPS3a의 과발현은 매우 응집하기 쉬운(aggregation-prone) HBx의 수용성을 현저하게 증가시켰다. 또 RPS3a의 돌연변이를 이용한 연구는 RPS3a의 N-말단 도메인(1-50 아미노산)이 HBx와 상호작용 및 셰프론 기능에서 중요하다는 것을 나타내었다. 그 결과들은 RPS3a는 HBx에 대한 셰프론 기능을 통하여 HBx-유도된 NF-κB 신호전달 경로를 촉진시켜서 바이러스적으로 유도된 종양형성에 기여한다는 것을 시사한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

RPS3a 는 HBx -유도된 NF -κB 신호전달을 촉진함

본 발명자들은 HBV-관련된 HCC 조직에서 과발현된 세포 단백질들이 HBx에 의한 종양 활성에 영향을 주는지를 조사하였다. 이 목적을 위하여, 본 발명자들은 처음에는 HBV-연관된 HCC 조직에서 대부분이 리보좀 단백질인 18 종의 과발현된 유전자를 선택하고 클로닝 하였다. HBx와 클로닝된 유전자를 동시 트랜스펙션 후 HBx-매개된 NF-κB 활성화에 대한 이들의 효과를 luciferase 리포터 시스템을 사용하여 테스트 하였다. 1차 스크리닝(데이터는 도시 안함) 후, 추가적인 연구를 위하여 9 유전자들을 선택하였다. 도 1A에 나타낸 것과 같이 이들 9종 중에서 7종 유전자들이 (RPL27a, RPL8, RPS24, RPS27a, RPL21, RPL35a 및 RPS3a) Huh7 세포에서 HBx-유도된 NF-κB 활성을 현저하게 증진시켰다. 특히, RPS3a는 HBx-유도된 NF-κB 활성을 가장 효과적으로 증가시킨 것을 관찰할 수 있었다. 이 관찰은 HepG2 세포에서 더욱 현저하였다(도 1B).

HBx-유도된 NF-κB 신호전달에 대한 RPS3a의 증가 활성을 직접적으로 증명하기 위하여 본 발명자들은 실시예에 기재된 것과 같이 NF-κB ELISA 방법과 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)을 사용하여 NF-κB의 핵 이동을 조사하였다. 핵질을 이용한 NF-κB ELISA 방법은 RPS3a 발현 그 자체만으로는 NF-κB 활성에 영향을 미치지 않는 반면, HBx의 존재하에서, RPS3a는 NF-κB 활성을 상승적으로 증가시킴을 보여줬다. 그러나 RPS3a의 과발현은 HBx의 전체 발현 수준에는 영향을 주지 않았다(도 1C). p65의 핵 이동은 HBx 및 RPS3a의 코트랜스펙션 후에 웨스턴 블럿 분석을 통해서 추가적으로 확인하였다. HBx 및 RPS3a의 동시발현은 p65의 핵 이동을 현저하게 촉진시킨 반면에, 원형질에서 p65의 전체 양은 p65/tubulin의 비율에 기초하여 약간 감소하였다(도 1D). 마지막으로, 본 발명자들은 RPS3a의 증가 활성을 증명하기 위하여 EMSA를 수행하였다. 이 데이터는 RPS3a가 HBx-유도된 NF-κB 신호전달을 과활성화한다는 것을 명확하게 나타낸다(도 1E). luciferase 리포터 분석 및 EMSA방법을 통한 p65 핵 이동의 확인 결과는 HBV-관련된 HCC 조직에서 과발현된 RPS3a가 간 세포에서 HBx-유도된 NF-κB 신호전달을 촉진한다는 것을 나타낸다.

RPS3a 는 HBV -관련된 HCC 조직에서 과발현됨

본 발명자들은 semi-quantitative 역전사 PCR를 사용하여 세 명의 HBV-관련된 HCC 환자들 (IBR 승인됨)의 조직으로부터 종양 및 비종양 부위 사이의 상대적인 RPS3a 발현 레벨을 비교하였다. RPS3a 발현은 말초 비 종양 부위보다 HBV-관련 HCC 조직의 종양 부위에서 현저하게 더 높았다(도 2A 및 2B). 조직에서 RPS3a 단백질 발현의 수준을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 대장균에서 재조합 RPS3a를 생산하고 토끼에서 anti-RPS3a 항체를 제조하였다. anti-RPS3a의 특이성은 넉 다운 및 과발현 시스템을 사용하여 확인하였다(도 2D). 20 케이스의 HBV-양성 HCC 조직의 비종양 및 종양 조직에서 anti-RPS3a 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. HBV-양성 HCC 조직의 70% (14 케이스)는 해당하는 말초 비종양 부위와 비교하여 종양 부위에서 RPS3a의 과발현을 현저하게 나타내었다(표 1). 그 대표적인 면역조직화학 결과들을 살펴보면 RPS3a 단백질의 내생적인 발현정도가 비종양 부위보다 HBV-관련된 HCC의 종양 부위에서 현저하게 더 높았다(도 2C).

리보좀 단백질의 과발현은 HBx 의 발현 패턴에 영향을 줌

HCC 조직에서 과발현된 리보좀 단백질이 HBx-유도된 NF-κB 활성에 영향을 어떻게 주는지를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 리보좀 단백질들을 HBx-GFP와 코트랜스펙션 후 Huh7 세포에서 HBx-GFP 융합 단백질을 사용하여 HBx의 발현 패턴을 먼저 조사하였다. HBx-GFP 발현의 전형적인 패턴을 도 3A에 나타내었다. 흥미롭게도 리보좀 단백질의 과발현은 HBx-GFP의 전체 발현 레벨에는 영향이 없지만(도 3D), HBx-GFP 단백질의 발현 형태에는 영향을 미친다(도 3B). 리보좀 단백질 중에서, RPS3a는 HBx-GFP 플라즈미드와 코트랜스펙션시에 HBx-GFP의 punctate 발현을 현저하게 감소시킨다. punctate 발현을 보이는 세포의 퍼센트는 RPS3a를 코트랜스펙션 시에 약 28%이지만 대조군 pcDNA3.1 트랜스펙션에서는 약 68%이었다(도 3C). 본 발명자들은 punctate 발현의 감소가 HBx-유도된 NF-κB 신호전달의 증가된 활성과 상관관계가 있다는 것을 발견하였다(도 1A). 이 발견은 RPS3a가 기능적인 형태에서 HBx의 수용성 발현과 관련이 있고 이것은 NF-κB 신호전달과 같은 HBx 활성과 관련이 있다는 것을 시사한다.

RPS3a 는 그것의 셰프론 활성을 통하여 HBx -유도된 NF -κB 신호전달을 촉진함

본 발명자들은 HBx-유도된 신호전달 및 HBx의 수용성 발현 모두에 대한 RPS3a의 효과를 조사하였다. 도 4A 및 4B에 나타낸 것과 같이, NF-κB 활성 및 HBx의 수용성 발현은 RPS3a에 비례하여 현저하게 증가한 반면에, HBx의 전체 발현 레벨에는 영향을 주지 않았다.(도 4A). NF-κB 활성과 일치하게(도 4A), HBx의 punctate 발현은 RPS3a 용량 의존적으로 크게 감소하였다(도 4B 및 4C). RPS3a가 원형질에서 HBx의 수용성 발현을 증가하는지를 보기 위하여 본 발명자들은 RPS3a를 코트랜스펙션 후 웨스턴 블럿 분석 및 면역침전법에 통해 원형질 분획에서 수용성 HBx의 양을 측정하였다. 면역침전 결과는 HBx의 수용성 발현은 RPS3a 용량 의존적으로 증가된(도 4D, 우측) 반면에, HBx-GFP의 전체 발현 레벨은 변하지 않았다(도 4D, 좌측). 또 본 발명자들은 RPS3a 및 HBx-HA로 코트랜스펙션 후 얻어진 전체 세포 파쇄액 및 수용성 분획에 대한 직접적인 웨스턴 블럿 분석을 통해서도 유사한 결과를 관찰하였다(도 4E). 그러나 HBx-유도된 NF-κB 활성화에 영향이 없었던 또 다른 리보좀 단백질(도 1A)인 RPS20의 과발현은 HBx의 수용성 발현을 증가시키지 않았다(데이터 도시 안함). 이 결과들은 RPS3a이 HBx의 안정성보다는 가용성에 영향을 준다는 것을 시사한다.

더 직접적인 증거를 발견하기 위하여, 본 발명자들은 E. coli 발현 시스템을 사용하여 HBx에 대한 RPS3a의 수용성 증가 활성을 조사하였다. RPS3a-His 및 HBx-HA의 발현은 각각 L-arabinose 및 IPTG로 조절되었다. HBx의 발현만으로는 대부분 불용성 산물을 야기하였지만(수용성 분획: 4.9%); RPS3a와 동시 발현시에는, HBx 단백질의 수용성 분획은 39%로 크게 증가하였다(도 4F, 좌측). 본 발명자들이 대조군 실험으로 RPS20 또는 EGFP를 HBx와 동시발현시킨 결과에서는 HBx의 수용성 발현의 증가를 관찰할 수 없었다(도 4F, 우측). 이들 데이터는 이 현상이 포유류 세포에 제한되는 것이 아니고 HBx에 대한 RPS3a의 셰프론 기능은 세포 환경에 관계없이 제공된다는 것을 시사한다. 또한 이들 결과들은 HBx에 대한 RPS3a의 셰프론적 효과는 HBx의 기능적인 활성증가에 관여하는 것 같다는 것을 시사한다.

RPS3a 의 넉다운은 HBx 에 의한 RPS3a - 매개된 NF -κB 증가를 파괴함

HBx-매개된 NF-κB 신호전달에 대한 RPS3a의 효과를 더 조사하기 위하여, 본 발명자들은 RNA 간섭을 사용하여 넉다운 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 RPS3a에 대한 siRNAs를 고안하고 RPS3a 발현이 siRNA 1 및 2에 의하여 크게 감소하였다(도 5A 및 5B, 좌측). RPS3a siRNAs의 처리는 HBx 및 p65의 전체 발현 레벨에 영향을 주지 않았다(도 5B, 우측). RPS3a 및 HBx의 동시발현 하에서 siRNA 1 또는 2 처리는 RPS3a-매개된 NF-κB 증가를 완전하게 사라지게 한 반면 대조군 siRNA는 영향이 없었다(도 5C). 특히 siRNAs에 의한 NF-κB 활성에서 감소의 레벨이 있었다. siRNA의 처리는 HBx에 의한 RPS3a-매개된 NF-κB 증가를 기본 레벨로 감소시켰고(GFP 단독), 이것은 HBx 단독의 것보다 더 적었다. 이들 데이터는 내생적인 RPS3a가 HBx-유도된 NF-κB 활성화와 관련이 있다는 것을 시사한다. HBx-매개된 NF-B 활성화에서 내생적인 RPS3a의 관련성을 확인하기 위하여 본 발명자들은 siRNA에 의한 내생적인 RPS3a의 넉다운 상황 하에서 HBx-유도된 NF-κB 활성을 관찰하였다. 내생적인 RPS3a의 넉다운은 도 2D에서 기재된 것과 같이 확인하였다. 이 조건 하에서, NF-κB 활성은 기본 레벨 아래로 감소하였고(도 5D), 이것은 내생적인 RPS3a가 HBx-induced 유도된 NF-κB 활성화에 대하여 중요한 역할을 가진다는 것을 확인한다.

특히 RPS3a의 발현이 HCC 조직에서 풍부하기 때문에(표 1), HCC 세포주에서 RPS3a의 과발현의 효과는 원형질에서 이미 포화 상태이기에 상대적으로 그 효과가 크게 나타나지 않았던 것으로 예측된다. 따라서 siRNA에 의한 RPS3a의 넉다운의 결과는 과발현 실험 보다는 더 강력한 증거를 제공한다.

HBx 에 대한 셰프론 기능에 필요한 RPS3a 의 도메인의 동정

HBx에 대한 셰프론 기능에 필요한 RPS3a의 도메인을 동정하기 위하여 본 발명자들은 도 6A에 기재된 것과 같은 RPS3a의 몇 가지 결손 돌연변이체를 제조하고, 이들 돌연변이체의 발현을 웨스턴 블럿 분석에 의하여 확인하였다(도 7C). 이들 결손 돌연변이체를 사용하여, 본 발명자들은 HBx-유도된 NF-κB 활성화 분석을 수행하였다. 모든 N-말단 결손 돌연변이체(M1에서 M3)들은 HBx-유도된 NF-κB 과활성화를 현저하게 감소시킨 반면에, C-말단 결손 돌연변이체(M4, M5)는 야생형 RPS3a와 비교하여 NF-κB 과활성화에서 큰 변화가 없었다(도 6B).

또 HBx의 수용성 발현에 대한 RPS3a 돌연변이체의 효과는 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 그 N-말단 결손 돌연변이체는 C-말단 돌연변이체(M4, M5)와 대조적으로 HBx-GFP의 puntate 발현을 가용화하는 활성을 상실하였다(도 6C 및 6D). 이 RPS3a 돌연변이체의 수용성 증진 효과는 그들의 HBx-유도된 NF-κB 과활성화와 상관관계가 있다(도 6B). 이 발견들은 RPS3a의 N말단 도메인(아미노산 1-50)이 HBx에 대한 RPS3a 매개된 셰프론 기능에 관여한다는 것을 나타낸다.

RPS3a 가 N-말단 도메인을 통하여 HBx 와 결합 상호작용을 함

일반적으로 단백질의 셰프론 기능은 분자적 셰프론 및 타겟 단백질 사이에 단백질 단백질 결합 상호작용에 의하여 매개된다. 따라서 본 발명자들은 RPS3a의 셰프론 활성이 RPS3a 및 HBx 사이에 물리적인 결합 상호작용에 의하여 매개되는지를 조사하였다. 본 발명자들은 Huh7 세포에서 RPS3a-flag 및 HBx-GFP의 코트랜스펙션 후에 동시면역침전 분석을 수행하였다. 이들 데이터는 RPS3a가 원형질에서 HBx와 결합 상호작용한다는 것을 명백하게 나타낸다(도 7A). RPS3a 및 HBx 사이의 상호작용을 더 증명하기 위하여, 본 발명자들은 HepG2 세포에서 RPS3a-flag 및 HBx-HA 컨스트럭트를 사용하여 동시면역침전을 수행하였다; 이들 분석들 또한 원형질에서 RPS3a가 HBx와 상호작용을 한다는 것을 확인하였다(도 7B). 또 생리적으로 적절한 환경에서 RPS3a 및 HBx 사이의 관련성을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 내생적인 RPS3a가 HBx와 상호작용을 하는지를 조사하였다. 본 발명자들은 도 5D의 결과를 통해 알 수 있듯이 내생적인 RPS3a가 HBx와 상호작용을 한다는 것을 확인하였다(도 7C).

도 6에서 상기 결과들은 RPS3a의 N 말단 도메인이 HBx에 대한 셰프론 기능에 관련되고 그 도메인이 HBx와 RPS3a 결합에 필요하다는 것을 예측할 수 있게 한다. RPS3a 결손 돌연변이체(도 6A)를 HBx와 코트랜스펙션 후에 동시면역침전을 수행하였다. Huh7 세포에서 결손 돌연변이체의 발현 수준과 유사하였다; 그러나 단지 결손 돌연변이체 M4 및 M5만이 HBx와 결합되었다(도 7D). 이 데이터는 N-말단 50 아미노산이 HBx와 RPS3a 결합에 관련이 있다는 것을 나타낸다. 이 결과들은 HBx에 대한 RPS3a의 셰프론 활성의 기존 데이터(도 6)와 잘 맞는다. RPS3a의 N-말단 50 아미노산은 HBx와 결합하여서 셰프론 활성에 관여한다.

마지막으로, 본 발명자들은 동시-위치화 분석을 사용하여 RPS3a 및 HBx 상호작용을 확인하였다(도 7E). 예상한 것과 같이, RPS3a는 HBx와 같은 위치에 위치하였다. RPS3a의 약한 발현(청색 삼각형)이 HBx의 punctate 발현과 상관관계가 있지만 RPS3a를 과발현하는 세포는 HBx의 수용성 발현을 나타낸다(백색 삼각형).

RPS3a 는 HBx 의 셰프론 기능을 통하여 복제 가능한 전장 HBV 지놈의 콘텍스트에서도 HBx-유도된 NF -κB 신호전달을 증가시킴

HBx에 대한 RPS3a의 효과가 생리적인 조건에서 작동하는지를 조사하기 위하여 본 발명자들은 복제 가능한 전장 wt HBV 지놈 [wt HBV 1.3mer] 및 HBx-deficient HBV 지놈[HBV 1.3mer(X-)]을 사용하였다. 본 발명자들은 RPS3a의 넉다운이나 과발현 어느 것도 바이러스 자체 프로모터에 의하여 발현되는 바이러스 단백질의 전체 레벨(HBx, 표면 및 코어)에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다(도 8C 및 8D). NF-B luciferase 분석은 RPS3a가 HBV 1.3mer(X-)에 대해서는 효과가 없지만;, RPS3a는 wt HBV 1.3mer와 코트랜스펙션 시에 NF-B 활성을 증진 시켰음을 보여준다.(도 8A). 이 결과들은 증가된 NF-κB 신호가 전장 HBV 지놈 시스템에서 HBx-의존적이라는 것을 나타낸다. 도 5C에서와 같이, 지놈 구동된 HBx에 의한 RPS3a-매개된 NF-κB 활성향상은 RPS3a에 대한 siRNA에 의하여 소실되었다. 내생적인 RPS3a는 siRNA에 의하여 결손되었을 때, HBV-매개된 NF-κB 활성화도 기초 레벨로 현저하게 감소하였다(도 8B).

RPS3a의 과발현이 지놈 구동된 HBx의 수용성 발현을 촉진하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HBV1.3mer 및 HBV-stable 세포주, HepG2.2.15 시스템의 트랜지언트 트랜스펙션을 채택하였다. 그 결과도 RPS3a가 HBV 지놈에 의하여 발현되는 HBx의 수용성 발현을 촉진한다는 것을 명백하게 나타내었다. 이 현상은 HepG2.2.15 세포에서 더 현저하였다(도 8E). 이들 데이터들은 HCC에서 과발현된 RPS3a가 HBx의 기능적 활성의 증가를 통하여 자연발생적인 HBV 감염에서 HBx-유도된 NF-κB 신호전달을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다.

최종적으로 본 발명자들은 HBV 또는 HBx가 RPS3a의 발현에 영향을 주는지를 조사하였다. HBV 또는 HBx (도 7C) 어느 것도 그 자체로는 RPS3a의 발현 레벨에 영향을 주지 않고(데이터 도시 안함), 이것은 HBV-관련된 HCC 조직에서 RPS3a 과발현은 HBV와는 관련 없이 독립적이라는 것을 시사한다.

본 발명의 결과는 HBV-관련된 간 질환에서 많은 관련을 가진다. 다기능 바이러스 단백질인 HBx는 세포 성장과 관련된 주요 유전자의 트랜스액티베이션, 원암유전자의 유도, 세포 주기의 조절에 관련된 여러 세포 단백질들과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 결과는 HBx가 그러한 세포적 파트너들과 상호작용에 대한 그것의 기능적 안정성을 얻을 수 있다는 것을 시사한다. 또 HSP90가 이미 항암제 타겟이고 geldanamycin과 같은 HSP90의 소분자 저해제는 이미 복합 치료에 있어서 다른 항암제와 같이 사용되고 있다(Whitesell L, Lindquist SL (2005) Nat Rev Cancer 10: 537-549). 이와 유사하게 본 발명은 HBx에 대한 기능적인 안정성을 부여하는 세포적 파트너의 저해가 HBV-관련 간 질환의 예방에 대한 또 다른 치료 타겟이 될 수 있다는 것을 시사한다.

도 1은 RPS3a가 HBx-유도된 NF-κB 신호를 촉진한다는 것을 나타낸 그림으로, (A-B) pNF-κB-Luc(0.25㎍), pEGFP(0.4㎍) (대조군 플라즈미드) 및 기재된 플라즈미드(0.4㎍)와 pEG-HBx(0.4㎍)를 코트랜스펙션 또는 pEG-HBx(0.4㎍)없이 트랜스펙션 후 Huh7 및 HepG2 세포에서 상대적인 NF-κB 활성을 나타냄. (C) 핵에서 NF-κB 활성화의 ELISA를 나타냄. 핵 추출물(4㎍)을 사용하여, 핵에서 활성화된 NF-κB 소단위체 및 플레이트 결합된 NF-κB 컨센서스 DNA 올리고머 사이의 결합을 chemiluminescence를 사용하여 측정함(좌측). 자유롭게 결합되지 않은 NF-κB 컨센서스 DNA 올리고머를 경쟁자로 사용함. 전체 세포 파쇄액(WCL)에서 HBx 및 RPS3a의 발현 레벨을 기재된 항체로 결정함(우측). (D) Huh7 세포에서 핵으로의 p65 이동을 웨스턴 블럿을 통해 분석. 라민과 알파-tubulin을 각각 핵과 원형질 분획의 로딩 대조군으로 사용함. 원형질 분획에서 로딩 양은 핵 분획의 것에 비하여 5 배 희석함. (E) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). 분리된 핵 추출물(3㎍)을 [P³²]-표지된 NF-κB 컨센서스 DNA 올리고머 프로브로 인 비트로 결합을 수행. pEGFP 벡터를 대조군 벡터로 사용함. cold 경쟁자로 과량의(30배) 비 표지된 NF-κB 컨센서스 올리고머를 사용함. 상대적인 결합 강도를 덴시도메터를 사용하여 측정하였다.
도 2는 HBV-관련된 간 세포암 조직에서 RPS3a 발현을 나타낸 그림으로, (A) HBV-관련된 간 세포암 조직의 종양 및 비종양 부위에서 내생적인 RPS3a mRNA 레벨의 검출을 나타냄. 3명의 HBV-원인 간 세포암 환자의 종양 및 비종양 조직으로부터 전체 RNA를 추출함. 전체 RNA 추출물(2㎍) 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여, cDNA를 합성하였다. N 및 T는 각각 비종양 조직 및 종양 조직을 나타냄. (B) HBV-관련된 간 세포암 조직의 종양 및 비종양 조직 사이에 부위에서 상대적인 RPS3a mRNA 비율. 데이터는 세번의 독립적인 실험에 의하여 계산하였다(* P<0.05 및 ** P<0.001). 데이터는 Bio-1D 이미지 분석 소프트웨어에서 GAPDH로 표준화한 후 RPS3a 밴드의 강도 비율을 나타냄. (C) HBV-관련된 간 세포암 조직에서 내생적인 RPS3a 단백질 발현의 대표적인 면역조직화학 데이터를 나타냄. 비종양 및 종양 조직 사이의 RPS3a 발현의 차이는 현미경(배율 X400) 하에서 육완 관찰에 의하여 결정하였고 패널의 상부에 할당하였다. 전체 정보는 표 1을 참고. (D) 인간 RPS3a 항체의 제조 및 확인을 나타냄. 인간 RPS3a 단백질을 E. coli에서 생산하고 토끼 항체를 제조하였다. 제조된 항체의 특이성을 Huh7 세포에서 RPS3a의 넉다운 및 과발현 실험을 통하여 확인하였다. Huh7 세포를 트랜스펙션 72시간 후에 수집하였다.
도 3은 리보좀 단백질의 발현은 간 세포에서 HBx의 punctate 발현을 감소시킴을 나타낸 그림으로, (A) 간 세포에서 GFP 및 HBx-GFP 발현의 대표적인 패턴을 나타냄. Huh7 세포를 6-웰 플레이트에서 2㎍의 pEGFP 또는 pEG-HBx-GFP 플라즈미드를 트랜스펙션하였다. 36시간 후, 각 단백질의 발현 패턴을 형광 현미경(배율 X400)으로 조사함. (B) 리보좀 단백질에 의한 HBx-GFP의 punctate 발현의 감소를 나타냄. pEG-HBx-GFP (2㎍) 및 기재된 플라즈미드(2㎍)를 Huh7 세포에서 동시발현시켰다. pEGFP 또는 pcDNA3.1 플라즈미드를 대조군으로 사용하였다(배율 X200). (C) punctate 발현을 나타내는 세포의 수를 형광 현미경 하에서 계수하였다. punctate 세포의 비율을 계산하고 막대그래프로 나타내었다. (D) 전체 세포 파쇄액에서 HBx-GFP의 전체 발현 레벨을 기재된 리보좀 소단위체와 pEG-HBx-GFP의 코트랜스펙션 후 anti-GFP 항체로 결정하였다.
도 4는 RPS3a가 그것의 셰프론 활성을 통하여 HBx-유도된 NF-κB 신호를 촉진한다는 것을 나타낸 그림으로, (A) RPS3a에 의한 NF-κB의 용량의존적인 활성화를 나타낸 그림. Huh7 세포에서 pEG-HBx (0.4㎍)를 증가되는 양의 RPS3a 및 pNF-κB-Luc (0.25㎍)로 코트랜스펙션시켰다. 전체 DNA 양(1.5㎍)을 12-웰 플레이트에서 pEGFP를 사용하여 조정하였다. 전체 세포 파쇄액에서 RPS3a 및 HBx의 전체 발현 레벨을 각각 anti-flag 및 anti-HA 항체로 결정하였다(우측). (B-C) RPS3에 의한 용량의존적인 HBx-GFP의 punctate 발현의 감소를 나타냄. Huh7 세포를 pEG-HBx-GFP (2ug) 및 증가되는 양의 RPS3a와 코트랜스펙션시켰다. 전체 트랜스펙션된 DNA의 양을 pcDNA3.1을 사용하여 표준화하였다. 트랜스펙션 36시간 후 HBx-GFP 발현의 대표적인 패턴을 패널 B에 나타냄(배율 X200). HBx-GFP의 punctate 발현을 나타내는 세포의 수를 형광 현미경 하에서 계수하고 punctate 세포의 비율을 패널 C에서 계산함. (D) RPS3a에 의한 원형질에서 HBx-GFP의 수용성 발현을 나타냄. pEG-HBx-GFP (1.5㎍)를 증가되는 양의 pcD-RPS3a-flag로 코트랜스펙션하였다. pEGFP(0.5㎍)를 GFP 항체에 대한 검출 및 트랜스펙션에 대한 대조군으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 96시간 후, 세포를 파쇄하고 원형질 수용성 분획을 anti-GFP 항체로 면역침전하였다(우측). 대조군으로 원심분리 전에 전체 세포 파쇄액을 HBx-GFP의 전체 발현에 대하여 분석하였다(좌측). HBx-GFP/GFP의 발현 비율에 주목. (E) RPS3a에 의한 원형질에서 HBx-GFP의 수용성 발현을 나타냄. pcD-HBx-HA 및 pcD-RPS3a-flag의 코트랜스펙션 후, 전체 세포 파쇄액 및 수용성 분획(원심분리 후 전체 세포 파쇄액의 상등액)을 웨스턴 블럿 분석을 통하여 분석하였다. (F) RPS3a는 E. coli 발현 시스템에서 HBx의 수용성 발현을 촉진한다는 것을 나타낸 그림으로, E. coli 세포를 pT7-HBx-HA 및 pBad-RPS3a-His 플라즈미드로 동시형질전환하였다. 배양 및 IPTG 및 L-arabinose 공동유도 후, 전체 세포 추출물을 초음파파쇄에 의하여 얻어서 12000 rpm에서 원심분리하여 분획으로 나누었다(T, S 및 P는 각각 전체 세포 추출물, 상등액 및 펠렛 분획을 나타냄). HBx의 발현 패턴을 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다. 수용성 발현을 덴시토미터로 계산하였다. 랜덤 단백질 대조군으로 또 다른 리보좀 소단위체인 pBad-RPS20-His 나 pBad-EGFP-His 플라즈미드를 대장균 세포에서 pT7-HBx-HA의 동시형질전환을 위하여 사용하였다. Both RPS20 및 EGFP 모두 anti-penta His 항체(Qiagen)에 의하여 검출되었다.
도 5는 RPS3a의 넉다운이 HBx에 의한 RPS3a-매개된 NF-κB 증가를 파괴한다는 것을 나타낸 그림으로, (A) RPS3a 유전자에 대한 siRNA 고안의 도식적인 묘사를 나타냄. (B) RPS3a, HBx 및 내생적인 p65 발현에 대한 세 siRNA 후보물질의 효과를 나타냄. 세포를 pcD-RPS3a-flag (또는 pcD-HBx-HA) 및 각 RPS3a siRNA 후보물질(siRNA1, 2, 3)로 코트랜스펙션하고 트랜스펙션 72시간 후 수집하였다. lamin, GFP, luciferase (GL3)에 대한 siRNA를 대조군 siRNAs로 사용하였다. 단백질의 발현 레벨을 기재된 항체로 검출하였다. (C) NF-κB 활성에 대한 RPS3a 넉다운 효과를 나타낸 그림. pcD-RPS3a (0.4㎍), pEG-HBx (0.4㎍), 및 pNF-κB -Luc (0.25㎍)의 플라즈미드를 RPS3a siRNA1 또는 siRNA2로 코트랜스펙션하였다. 라민 siRNA를 대조군 siRNA로 사용하였다. (D) HBx-매개된 NF-κB 활성화에 대한 내생적인 RPS3a의 효과를 나타낸 그림. NF-κB 활성을 Huh7 세포에서 pNF-κB-Luc 및 기재된 플라즈미드를 siRNAs와 또는 없이 코트랜스펙션 30시간 후 결정하였다. 내생적인 RPS3a의 넉다운은 배경 수준으로 HBx-유도된 NF-κB 활성을 낮추었다는 것에 주목.
도 6은 RPS3a의 N-말단 도메인이 HBx에 의한 수용성 발현 및 NF-κB 과활성화에 중요하다는 것을 나타낸 그림으로, (A) RPS3a 결손 돌연변이체의 구축을 나타냄. (B) RPS3a의 N-말단 도메인이 HBx-유도된 NF-κB 활성에 관여한다는 것을 나타냄. Huh7 세포에서 RPS3a (0.4㎍) 및 pEG-HBx (0.4㎍)의 결손 돌연변이체 또는 야생형으로 코트랜스펙션 후 상대적인 NF-κB 활성을 측정함. (C) RPS3a의 N-말단 부위가 HBx의 punctate 발현에 관련됨. pEG-HBx-GFP (2㎍) 및 야생형 또는 돌연변이체 RPS3a (2㎍)로 코트랜스펙션 36시간 후, HBx-GFP 단백질의 발현 패턴을 형광 현미경을 사용하여 조사하였다(배율 X200). (D) punctate 발현을 나타내는 세포의 수를 형광 현미경 하에서 계수하였다. punctate 세포의 비율을 계산하고 막대그래프로 나타내었다.
도 7은 RPS3a가 N-말단 도메인을 통하여 HBx와 결합 상호작용을 하고 간세포에서 같이 존재한다는 것을 나타내는 그림으로, (A) RPS3a가 간세포에서 HBx와 물리적으로 결합 상호작용을 한다는 것을 나타냄. pEG-HBx-GFP 및 pcD-RPS3a-flag를 Huh7 세포에서 트랜스펙션시키고, 96 시간 후 세포 파쇄액을 anti-flag 항체(좌측) 및 anti-GFP 항체(우측)으로 면역침전시켰다. 웨스턴 블럿 분석을 기재된 항체로 수행하였다. 스트립핑(stripping) 후, 각 막을 anti-HBx 항체 (좌측) 및 anti-flag 항체(우측)으로 처리하였다. RPS3a-flag 밴드를 동정하기 위한 양성 대조군으로, 면역침전을 anti-flag으로 수행하고 동일한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. (B) GFP-융합체 없이 HepG2 세포에서 RPS3a와 HBx의 결합 상호작용을 나타냄. pcD-HBx-HA 및 pcD-RPS3a-flag를 HepG2 세포에서 코트랜스펙션시키고 기재된 것과 같이 면역침전 및 웨스턴 블럿을 수행하였다. (C) Huh7 세포에서 내생적인 RPS3a와 HBx의 결합 상호작용을 나타냄. pcD-HBx-HA를 Huh7 세포에서 트랜스펜션시키고 기재된 것과 같이 면역침전 및 웨스턴 블럿을 수행하였다. (D) HBx 상호작용에 중요한 RPS3a 결합 도메인의 동정을 나타냄. 야생형 pcD-RPS3a-flag (2㎍) 또는 pcD-돌연변이체 RPS3a-flag (M1~M5) (2㎍)를 Huh7 세포에서 pcD-HBx-HA(2㎍)와 코트랜스펙션시켰다. 미리 남겨 놓은 전체 파쇄액을 웨스턴 블럿 분석에 사용하였다(하단 패널). 잔류 파쇄액을 anti-HA 항체로 면역침전하고 anti-flag 항체로 검출하였다. 스트립핑 후, 그 막을 anti-HA 항체로 재블럿팅하였다. (E) HBx 및 RPS3a은 트랜스펙션된 간 세포에 동시 존재한다는 것을 나타내는 그림. Huh7 세포를 pEG-HBx-GFP (2㎍) 및 pcD-RPS3a-flag (2㎍)로 코트랜스펙션시켰다. 24 시간 후, 면역조직화학 분석을 anti-flag 항체를 사용하여 수행하였다. 흰색 및 청색 삼각형은 각각 RPS3a의 높고 낮은 발명을 가지는 세포를 나타낸다. RPS3a의 낮은 발현은 HBx의 punctate 발현과 관련이 있다는 것에 주목.
도 8은 RPS3a가 복제 가능한 HBV 지놈의 컨텍스트에서 그것의 셰프론 기능을 통해서 HBx-유도된 NF-κB 신호를 촉진한다는 것을 나타내는 그림으로, (A) RPS3a가 HBV 전체 지놈 컨텍스트에서 HBx-유도된 NF-κB 활성을 촉진한다는 것을 나타냄. NF-κB 활성을 Huh7 세포에서 pcD-RPS3a-flag 및 pNF-κB-Luc로 복제 가능한 야생형 HBV 1.3mer 또는 HBx-deficient HBV 1.3mer(X-)의 코트랜스펙션 후에 결정하였다. (B) HBV-매개된 NF-κB 활성화에 대한 내생적인 RPS3a의 효과를 나타냄. NF-κB 활성을 Huh7 세포에서 기재된 siRNAs의 존재 또는 부존재에서 야생형 HBV1.3mer 및 pNF-κB -Luc의 코트랜스펙션 30 시간 후 측정하였다. (C-D) 지놈 구동된 바이러스 단백질들에 대한 RPS3a의 과발현 및 넉다운의 효과를 나타냄. 세포를 도 8A 및 8B에 기재된 것과 같이 코트랜스펙션시키고 48시간 후에 수집하였다. 웨스턴 블럿을 전체 세포 파쇄액을 사용하여 수행하였다. HBx 단백질이 WT HBV1.3mer로 트랜스펙션된 세포에서만 관찰된다는 것에 주목, HBV 단백질(HBs 및 core 단백질)의 발현 레벨은 RPS3a의 넉다운 및 과발현 하에서 일정하였다. L, M 및 S는 각각 라지, 미들 및 스몰 표면 항원을 나타냄. (E) RPS3a가 지놈 구동된 HBx의 수용성 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸 그림. Huh7 세포를 WT HBV 1.3mer 및 pcD-RPS3a-flag로 코트랜스펙션시키고 48시간 후에 수집하였다. 전체 세포 파쇄액(WCL) 및 수용성 분획 (원심분리 후 WCL의 상등액)을 기재된 항체에 의한 웨스턴 블럿으로 분석하였다(좌측). HBx-HA를 anti-HBx 항체의 특이성에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. HepG2.2.15 세포에 pcD-RPS3a-flag를 트랜스펙션시키고 48시간 후에 수집하였다. 전체 세포파쇄액(WCL) 및 수용성 분획을 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다(우측).

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 플라즈미드의 구축

HBx (subtype ayw) 및 HBx-GFP 클론에 대한 상세한 사항은 Kim KH, Seong BL (2003) EMBO J 22: 2104-2116에 기재되었다. 야생형 HBx-HA에 대한 발현 플라즈미드를 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)에서 PCR에 의하여 제조하였다. Hsp70p2, RPL27a, RPS20, RPL8, RPS24, RPS27a, RPL21, RPL35a 및 RPS3a의 cDNA는 Korean UniGene Information (KUGI)으로부터 얻었고 pcDNA3.1에 서브클로닝하였다. 또 RPS3a-flag의 야생형 및 결손 돌연변이체(M1, M2, M3, M4, M5) 및 RPS20-flag는 PCR에 의하여 제조하였다. E. coli에서 발현을 위하여 pGE-RPS3a-His, pBad-RPS3a-His, pBad-RPS20-His, pBad-EGFP-His 및 pT7-HBx-HA를 NdeI 및 HindIII 제한 효소 부위를 사용하여 PCR에 의하여 구축하였다.

실시예 2: 시약 및 세포 트랜스펙션

GFP의 검출용 항체는 Clontech (Palo Alto, CA)으로부터 구입하였다. 알파-tubulin 용 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)으로부터 구입하였고 lamin A/C 및 NF-κBp65 용 항체들은 Cell Signaling (Danvers, MA)으로부터 구입하였다. HBV 표면, 코어 및 HBx 단백질을 검출하기 위하여, anti-HBV 표면 항원(abcam, MA, USA), anti-HBV 코어(Dako, Denmark) 및 다클론 anti-HBx (MYBiosource, CA, USA) 항체를 각각 사용하였다. anti-Flag M2 단클론 항체, 토끼 anti-HA, anti-베타-actin 및 2차 항체를 Sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. Alexa Fluor-568 2차 항체를 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다. 인간 간세포암 세포주(Huh 7, HepG2 및 HepG2.2.15 세포주)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하였고. Huh7, HepG2 및 HepG2.2.15는 10% 열 불활성화된 FBS 및 1% antibiotic-antimicotics (Gibco BRL, Oregon, USA)이 공급된 DMEM (Gibco BRL, Oregon, USA)에서 유지시켰다. 트랜지언트 트랜스펙션(80% ~ 90% 세포 컨푸루언시)는 Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 LT1 (Mirus, Madison, WI)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 수행하였다.

실시예 3: Luciferase 분석

Luciferase 분석을 HBx 또는 HBV 지놈 매개된 NF-κB 활성화의 검출을 위하여 수행하였다. 약 4X10⁴ Huh7 및 HepG2 세포를 12-웰 배양 플레이트에 시딩하고 1.05㎍의 플라즈미드(0.25㎍ pNF-κB -Luc, 0.4㎍ HBx 또는 HBV 1.3mer, 및 0.4㎍의 테스트 플라즈미드)를 포함하는 DNA 혼합물로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 DNA의 전체 양을 표준화하기 위하여, empty 벡터(pCMV)를 필요한 경우에 사용하였다. 세포들을 수집하여 트랜스펙션 36시간 후에 파쇄하고(그러하지 않은 경우에는 도면의 설명에 별도 언급) Steady Glo-Luciferase 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여 루시퍼레이즈 활성을 분석하였다. 데이터들은 적어도 5회 독립적인 실험의 결과로부터 수집하였다. 통계적 유의성은 통계적 t-test 분석에 의하여 확인하였다(P < 0.05).

실시예 4: 웨스턴 블럿 및 면역침전 분석

웨스턴 블럿 및 면역침전 분석은 Kim KH, Seong BL (2003) EMBO J 22: 2104-2116에 기재된 것과 같이 수행하였다. 세포를 라이시스 버퍼[25 mM Tris/HCl, 1% NP-40 (또는 전체 세포 파쇄액을 위해서는 1% Triton X-100), 0.5% protease 저해제 칵테일(Sigma, St.Louis, MO), 150 mM NaCl, 2 mM KCl, pH7.4]을 사용하여 파쇄하였다. 면역침전을 위해서, 세포를 0.3ml 또는 0.4ml의 면역침전 라이시스 버퍼[25 mM Tris/HCl, 1% Triton X-100 (또는 0.5% NP-40), 0.5% protease 저해제 칵테일, 150 mM Nacl, 2 mM KCl, pH7.4]을 사용하여 파쇄하였다. 청정화된 전체 세포 파쇄액을 4℃에서 24시간 동안 1차 항체로 배양한 후 10㎕의 protein-A agarose (Roche, Mannheim, Germany)로 혼합한 후 4℃에서 밤새 배양을 수반하였다. PBS를 이용하여 3회 세척 후, 그 면역 복합체를 5X SDS 샘플 버퍼와 혼합하였다. 블럿팅 후 막을 스트립핑 버퍼(Pierce, Rockford, IL)로 스트립핑하고 재블럿팅하였다.

실시예 5: 형광 분석

HBx의 punctate 발현을 관찰하기 위하여, 형광 분석을 Kim KH, Seong BL (2003) EMBO J 22: 2104-2116에 기재된 것과 같이 수행하였다. Huh7 세포들을 pEGFP 또는 pEG-HBx-GFP 플라즈미드 및 테스트 플라즈미드로 코트랜스펙션시켰다. 36시간 후 그 세포들을 형광 현미경(배율 X200)으로 분석하였다. 같은 위치화 분석을 위하여, RPS3a-flag 및 HBx-GFP 플라즈미드를 50% 정도 커버 글래스에서 성장한 Huh7 세포에서 코트랜스펙션시켰다. 24시간 후 그 세포들을 고정화 용액(methanol/formaldehyde=99:1)으로 고정화하였다. 그 세포들을 얼음에서 30분 동안 0.2% Triton X-100로 침투시켰다. 1% BSA를 포함하는 PBS를 1시간 동안 상온에서 불럭킹하기 위하여 사용하였고 그 세포들을 PBS로 세척하였다. 그 세포들을 anti-flag 항체(1:50)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 세포들을 1:1000 희석된 Alexa Fluor-568 염소 2차 항체로 상온에서 40 분간 배양하였다. PBS로 3회 세척 후, DAPI 용액(1㎍/ml)을 핵을 염색하기 위하여 사용하였다. 세포들을 마운팅하고 형광 현미경(배율 X200) 하에서 조사하였다.

실시예 6: 재조합 단백질을 사용한 RPS3a 항체의 생성

RPS3a 검출을 위한 토끼 다클론 항체를 대장균에서 발현된 전장 재조합 인간 RPS3a 단백질을 사용하여 제조하였다. 먼저 6X His tag를 가진 인간 RPS3a를 T7 프로모터에 의하여 조절되는 대장균 발현 pGE 벡터에서 클로닝하고 단백질을 BL21(DE3)pLysS E. coli (Novagen)에서 과발현하였다. 재조합 RPS3a-His 단백질을 대장균에서 가용성있게 발현되었다. 대장균 추출물로부터 재조합 RPS3a-His 단백질의 정제를 위하여 원 스텝 Ni-affinity 크로마토그래피 방법으로 AKTA Prime FPLC (GE Healthcare)을 사용하여 2회 수행하였다. 토끼에서 그 정제된 재조합 RPS3a-His 단백질로 면역화하고, 1^st 및 2^nd 부스트를 1차 면역화 4 주 및 6 주 후 투여하였다. 그 다클론 anti-RPS3a 항체를 protein A 비드를 사용하여 혈청으로부터 정제하였다. RPS3a 단백질에 대한 항체 친화도를 ELISA 및 웨스턴 블럿 분석을 통해서 테스트하였다. 그 제조된 토끼 다클론 anti-RPS3a 항체들은 내생적인 인간 및 마우스 RPS3a를 검출할 수 있다.

실시예 7: 면역조직화학

비종양 및 종양 부위로 구성된 20 쌍의 HBV-양성 인간 간 조직들을 ISU Abxis (Seoul, Korea)로부터 얻었다. 간 조직에 대한 정보는 표 1에 요약하였다. 간 절편들을 알코올을 사용하여 재수화하였다. 항원 회수(retrieval)를 위하여, 구연산 버퍼(pH 6.0)에서 전처리를 수행하였다. 내생적인 퍼옥시데이즈를 3% H₂O₂를 함유한 메탄올로 불활성화하였다. 블럭킹 후, 조직 슬라이드를 4℃에서 wet 챔버에서 토끼 다클론 anti-RPS3a 항체로 밤새 배양하였다. PBS로 세척 후, 그 조직 슬라이드를 상온에서 염소 anti-토끼 항체(EnVision^TM Kits, DAKO, Denmark)로 불활성화시켰다. 그 슬라이드들을 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride 발색원 용액(DAKO)을 사용하여 현상하였다. 그 다음에 그 슬라이드들을 hematoxylin로 카운터 염색하였다.

실시예 8: RT - PCR 및 RNA 간섭 실험

전체 RNAs를 제조업자의 프로토콜에 따라서 Trizol 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 분리하였다. 2㎍의 전체 RNA 및 oligo dT 프라이머를 사용하여, 첫 번째 가닥 cDNA를 Power cDNA synthesis 키트(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 합성하였다. 1㎕ cDNA 산물, 0.5mM 타겟 특이적인 프라이머(RPS3a, GAPDH), 0.5U exTaq polymerase (Takara, Shiga, Japan) 및 0.25mM dNTP의 혼합물을 PCR(24 cycles)에 사용하였다. 특이적인 프라이머는 다음과 같다: RPS3a sense, 5'GTC ACG CTC GAG ATG AGG ACC CAA GGA ACC-3' 및 antisense, 5'GTC ACG AAG CTT TTA AAC AGA TTC TTG GAC-3' GAPDH sense, 5'CGT CTT CAC CAC CAT GGA GA-3' 및 antisense, 5'CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT-3'. 1.5% 아가로스 젤 상에서 그 산물을 분리한 후, 상대적인 발현 레벨을 Bio-1D 이미지 분석 소프트웨어(Vilber Lourmat)를 사용하여 평가하였다.

RPS3a의 넉다운 연구를 위하여, RPS3a에 대한 siRNAs를 삼천리 제약(Seoul, Korea)에서 합성하였다. 센스 및 앤티센스 RNA 절편들을 5X유니버설 결합 버퍼와 혼합하고 90℃에서 2분간 배양하였다. 어닐링을 위하여, 그 혼합물을 30℃에서 1시간 재배양하였다. siRNA 서열은 다음과 같다: RPS3a siRNA 1 sense, 5'-GUG CUA AAG UUG AAC GAG C -3'(서열번호 7) 및 antisense, 5'-GCU CGU UCA ACU UUA GCA C -3'(서열번호 8); RPS3a siRNA2 sense, 5'-GGA UCU UAC CCG UGA CAA A -3'(서열번호 9) 및 antisense, 5'-UUU GUC ACG GGU AAG AUC C -3'(서열번호 10); RPS3a siRNA3 sense, 5'-AGA UUG GUA UGA UGU GAA A -3'(서열번호 11) 및 antisense, 5'-UUU CAC AUC AUA CCA AUC U -3'(서열번호 12); 대조군 siRNA lamin sense, 5'-CUG GAC UUC CAG AAG AAC AUU-3'(서열번호 13) 및 antisense, 5'-UGU UCU UCU GGA AGU CCA GUU-3'(서열번호 14); GL3 siRNA sense, 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG AUU-3' (서열번호 15) 및 antisense, 5'-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GUU-3'(서열번호 16); GFP siRNA sense, 5'-GUU CAG CGU GUC CGG CGA GUU-3'(서열번호 17) 및 antisense, 5'-CUC GCC GGA CAC GCU GAA CUU-3'(서열번호 18). siRNA의 트랜스펙션을 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 수행하였다. RPS3a siRNAs의 효과는 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다.

실시예 9: Electrophoretic mobility shift assay ( EMSA ) 및 NF -κ BEMSA - ELISA 분 석

트랜스펙션 18 시간 후, 세포들을 모아서 핵 및 원형질 분획을 Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 얻었다. 핵으로 p65 이동하는 정도를 EMSA-ELISA 분석(NF-κBp65 용 EZ-Detect Transcription Factor Kits, Pierce, Rockford, IL) 및 EMSA 분석을 사용하여 측정하였다. EMSA-ELISA 분석을 위하여, 핵 추출물(4㎍)을 제공된 플레이트로 배양하고 p65의 레벨을 ELISA로 결정하였다. EMSA를 위하여, 그 핵 추출물(3㎍)을 2㎍의 poly(dI-dC)로 10분간 전체 20㎕ 반응 버퍼[10mM Tris-Cl(pH7.5), 100mM Nacl, 1mM EDTA, 0.5mM DTT, 10% glycerol]로 미리 배양하였다. 미리 배양한 후, 그 [³²P]-말단-표지된 dsDNA 올리고뉴크레오타이드(NF-κB 컨센서스 올리고뉴크레오타이드: 5'AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' Promega, Madison, WI)를 첨가하고 15분 배양하였다. 결합 반응 후, DNA-단백질 복합체를 10% 글리세롤 및 1X TBE를 함유하는 5% 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 상온에서 전기영동에 의하여 분리하였다. 그 다음 젤을 건조시키고 오토래디오그램을 수행하였다. 경쟁 분석을 위하여, 비 표지된 NF-κB 올리고뉴크레오타이드를 첨가하고 [³²P]-표지된 프로브로 처리 전에 25분간 배양하였다. 각 분석은 적어도 5회 수행하였다.

실시예 10: 대장균 시스템에서 수용성 증가 실험

대장균에서 단백질의 유도를 위하여, 각각 IPTG 및 L-Arabinose로 유도가능한 pT7-HBx-HA (Kan+) 및 pBad-RPS3a-His(Amp+) 클론을 구축하였다. 양 플라즈미드들을 클로람페니콜,가나마이신 및 앰피실린을 함유하는 LB 배지를 가지는 BL21(DE3)pLysS E. coli에서 동시형질전환하였다. 그 RPS3a-His 및 HBx-HA 단백질들을 각각 0.2% L-Arabinose 및 1mM IPTG (Sigma, St.Louis, MO)로 30℃에서 처리하여 유도하였다 유도 후, 세포들을 20℃에서 3시ㅋ간 배양하고 3000rpm에서 원심분리하여 수집하였다. 세포들을 초음파로 파쇄하고 원심분리에 의하여 세 분획[전체 파쇄액 (T), 상등액(S), 및 펠렛(P)]으로 나누었다. 대조군으로 pBad-RPS20-His(Amp+) 또는 pBad-EGFP-His(Amp+)을 T7-HBx-HA (Kan+)와 동시형질전환을 위하여 사용하였다. 상세한 수용성 분석은 [45,46]에 기재한 것에 따라서 수행하였다. HBx-HA의 수용성, 즉 상대적인 (S)/(T)의 비율은 Bio-1D 이미지 분석 소프트웨어(Vilber Lourmat)로 측정하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

리보좀 단백질 RPS3a, RPL27a, RPS24, RPL8, RPL35a, 및 RPS27a로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 단백질을 유효성분으로 포함하는 단백질에 대한 셰프론 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 RPS3a는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지고, RPL27a는 서열번호 2, RPS24는 서열번호 3, RPL8는 서열번호 4, RPL35a는 서열번호 5, RPS27a는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질에 대한 셰프론 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 HBx(Hepatitis B virus X) 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질에 대한 셰프론 조성물.
서열번호 1의 1에서 50번째의 아미노산 잔기로 구성된 리보좀 단백질 RPS3a 단편을 유효성분으로 포함하는 단백질에 대한 셰프론 조성물.
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