CN111983231B - Rps3a分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用 - Google Patents

Rps3a分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用，本发明通过检测肝细胞癌患者术后肿瘤组织中RPS3A表达水平，在临床实践中可作为分子标志物反映肿瘤内免疫细胞浸润水平和免疫检查点分子表达情况，指导肝癌患者免疫治疗管理，即有助于评估肝细胞癌免疫特征和预后风险，推动肝癌个体化治疗方案制定，具有较高指导意义；同时，本发明基于RPS3A分子构建Nomogram预后预测模型，相比于传统的TNM和BCLC分期，具有更好的预测效能和准确度，能够使肝癌患者获得更多的临床净收益，可应用于临床准确判断肝细胞癌患者术后生存时间。

Description

RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用。
背景技术
最新的全球流行病学调查显示，肝细胞癌是所有癌症中发病率增长最快的恶性肿瘤，每年增长2-3％，其5年生存率只有18％。早期肝细胞癌患者虽然能接受根治性手术治疗，但术后2年复发率仍接近50％，5年复发率更是高达75％。目前临床上对术后复发和生存情况的判断主要依赖TNM和BCLC分期，但不能准确反映肿瘤真实特征和预后风险。临床上尚无足够灵敏和特异的指标和模型来准确预测肝癌患者术后的生存情况，以指导治疗策略的制定，提高根治性术后患者的生存率。
大部分肝细胞癌患者在确诊时已处于晚期阶段，以索拉菲尼为代表的靶向治疗是其一线治疗方法，但肿瘤对靶向药物存在较高的耐受性，在实际治疗中疗效不佳。以免疫检查点抑制剂为代表的新兴免疫治疗是目前肿瘤治疗中重要的方法。PD-1抗体(Nivolumab和Pembrolizumab)已被批准用于晚期肝细胞癌的二线治疗。但相关临床试验表明仅有20-40％的癌症患者能够从免疫治疗中获益，因此，提前预测患者对免疫治疗的反应有助于实施精准治疗，减少不必要的药物毒性暴露和医疗费用负担，提高免疫治疗的有效率。研究表明对肿瘤微环境中免疫细胞浸润程度和免疫检查点分子表达情况进行解析，能够预测肿瘤对免疫治疗反应的可能性，但目前缺少简便、有效的分子标志物来反映肝细胞癌的免疫特征。
已有的研究表明核糖体蛋白家族成员在免疫相关细胞的组织浸润中起作用，其中RPS3A分子可调节翻译起始和蛋白合成，并具有许多核糖体外功能。RPS3A在癌症中的作用也备受关注，有证据显示其能参与细胞的恶性转化，并增强肝炎病毒的致癌通路，促进肝细胞癌的发生。RPS3A分子作为生物标志物反映肝细胞癌肿瘤免疫特征和患者预后情况具有一定的可行性。同时，有文献报道Nomogram模型相比于传统的肿瘤分期系统，在预测癌症患者的生存时间中具有更高的准确性，但目前基于Nomogram模型对肝细胞癌患者术后生存概率的准确评估体系研究甚少。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的在于提供RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润和免疫检查点分子表达水平中的应用，确定了一种能在肿瘤组织中检测，可以反映肝细胞癌免疫特征和判断预后不良风险的分子标志物，因此可用于筛选对免疫治疗有效的患者，提高治疗效果，从而促进个体化精准治疗。
本发明第二个目的是提供了一种基于RPS3A分子的预测模型，能够定量准确预测肝细胞癌患者术后生存概率的Nomogram预测模型，可用于鉴定高风险患者进行重点监测和及时干预，从而改善患者预后。
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
一种RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润和免疫检查点分子表达水平中的应用。
优选地，RPS3A分子的表达检测方法包括如下步骤：
(1)、收集肝细胞癌患者的手术切除标本，采用低聚甲醛固定，并用石蜡包埋构建组织微阵列芯片。
(2)、将组织微阵列芯片切片脱石蜡后，采用抗RPS3A抗体孵育过夜，再用辣根过氧化物酶连接的第二抗体孵育，之后进行免疫组化染色，即使用哈里斯氏苏木精进行细胞核染色。
(3)、根据免疫组化染色结果将肝细胞癌患者最终的组织RPS3A表达水平划分为高RPS3A表达和低RPS3A表达，根据患者的临床随访信息，对高RPS3A表达和低RPS3A表达的患者预后进行分析和统计学比较。
(4)、通过HiSeq系统获取TCGA公共数据库中肝细胞癌组织RNA测序数据，利用单样本基因集富集分析(ssGSEA)评估RPS3A表达水平和肿瘤免疫浸润程度的关系，通过Spearman相关分析检测RPS3A表达水平和肿瘤免疫检查点分子表达水平之间的关联。
优选地，在步骤(3)中，肝细胞癌患者肿瘤组织中RPS3A表达水平的评估方法为半定量组织学评分：最终的RPS3A表达水平为染色强度评分与染色范围(0-100％)的乘积。
其中，RPS3A的染色强度评分为：0：-；0.5：-/+；1：+；1.5：+/++；2：++；2.5：++/+++和3：+++；RPS3A表达水平使用四级量表进行分级：阴性、弱、中度和强度，阴性为0，弱为0-100％，中度为100-150％，强度为150-300％；将阴性和弱RPS3A表达定义为低RPS3A表达，将中度和强度RPS3A表达定义为高RPS3A表达。
在步骤(3)和步骤(4)中，发明人通过研究发现，测定肿瘤组织中RPS3A分子的表达水平将肝细胞癌患者划分为高RPS3A表达和低RPS3A表达，可有效判断患者预后不良风险。同时，通过对公共数据库“癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)”中肝细胞癌患者转录组数据的生物信息学分析，证实了高RPS3A表达的肿瘤具有较低的免疫细胞浸润和较高的免疫检查点分子表达水平。
为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
一种基于RPS3A分子构建的预测模型在预测肝细胞癌患者术后无复发生存(relapse free survival，RFS)、总生存时间(overall survival，OS)中的应用；并对肝癌患者OS和RFS进行单因素和多因素COX回归分析；实际上，RPS3A分子为上述的RPS3A分子。
优选地，预测模型由因素输入模块和预测结果输出模块构成。其中，因素输入模块包括：肝细胞癌患者肿瘤组织RPS3A表达水平、甲胎蛋白(AFP)水平、有无腹水和肿瘤大小的检测结果输入总生存时间的因素输入模块，即OS独立的预测因子，及肿瘤组织RPS3A表达水平、甲胎蛋白(AFP)水平、有无腹水、肿瘤大小和TNM分期的检测结果输入无复发生存的因素输入模块，即RFS独立的预测因子。
预测结果输出模块包括：肝细胞癌患者术后3年和5年无复发生存RFS、总生存时间OS的生存概率。
其中，肝细胞癌患术后3年和5年RFS、OS的生存概率的计算方法分别为：相应预测模型中每个变量point值的总和在Total points轴中所在位置所对应的概率尺度轴数值。
优选地，预测模型的构建方法如下：
通过多因素COX回归分析分别得到OS和RFS独立的预测因子作为模型的输入因素，通过COX回归计算每个变量偏回归系数并将预测模型图形化为Nomogram模型；并使用C指数、校准曲线和决策曲线分析对Nomogram模型的预测效能、准确性以及临床净获益进行评价。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明通过检测肝细胞癌术后肿瘤组织中RPS3A分子的表达水平，能够简便、迅速地反映个体肿瘤中免疫细胞浸润程度和免疫检查点分子表达水平，并初步对患者的预后不良风险进行有效评估，从而在临床实践中能及时对术后的治疗策略提供有价值的参考，尤其是在免疫治疗的选择上具有较高的指导意义，有助于肝癌的个体化治疗。
第二、本发明所提供的基于RPS3A分子的Nomogram预后预测模型能够综合利用各个独立预后因素的互补作用，定量准确地评估肝细胞癌患者术后无复发生存和总生存时间概率，其预测准确性明显优于已有的肿瘤分期系统，能够提高对患者术后生存情况的预测效果，对高风险患者及时给予额外的治疗干预和密切的监测，改善患者的不良预后，因此，其具有更好的预测效能和准确度，能够使肝癌患者获得更多的临床净收益。
附图说明
图1为本发明实施例中肝细胞癌肿瘤组织和癌旁组织中RPS3A分子免疫组化染色各表达水平级别示例；及高RPS3A表达组与低RPS3A表达组患者之间总生存和无复发生存曲线及其差异的统计学比较分析图(A图和B图分别是肿瘤组织和癌旁组织中RPS3A分子染色各表达水平级别(强度、中度、弱、阴性)的示例，C图是对肿瘤组织和癌旁组织中RPS3A分子染色各表达水平所占百分比的汇总，D图和E图分别是高RPS3A表达组与低RPS3A表达组患者的总生存时间曲线和复发生存时间曲线)。
图2为本发明实施例中根据TCGA公共数据库的肝细胞癌RNA测序数据对肿瘤RPS3A表达水平和免疫细胞浸润程度的相关性分析图(A图是肿瘤RPS3A表达水平和14种免疫细胞浸润程度相关性(左侧为负相关，右侧为正相关，圈的大小代表相关系数值，颜色深浅代表P值)的汇总，B图和C图是与肿瘤RPS3A表达水平呈显著负相关的两种免疫细胞浸润，D图、E图、F图和G图分别是与肿瘤RPS3A表达水平呈弱的正相关的四种免疫细胞浸润，图上的散点为每个肿瘤样本对应的免疫细胞浸润程度和RPS3A表达水平，深灰色直线为拟合的相关直线，浅灰色区域为相关直线95％的可信区间)。
图3为本发明实施例中纳入的肝细胞癌患者的OS和RFS单因素和多因素COX比例风险回归分析图(A图和C图分别是对总生存时间和无复发生存时间进行单因素COX比例风险回归分析，把年龄、性别、乙肝表面抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原19-9、腹水、肝硬化、肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤包膜、肿瘤分化、微血管侵犯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、BCLC分期、TNM分期以及RPS3A纳入分析中，风险比值代表各个指标不同水平增加或减少患者总生存时间或无复发生存不良的风险倍数(正值代表增加，负值代表减少)，右侧的森林图是对结果的可视化，灰色菱形代表风险比值，黑色平行线代表风险比值的95％可信区间，黑色平行线与灰色的垂直线相交代表没有统计学意义，B图和D图是把单因素COX比例风险回归分析中具有统计学意义的指标进一步进行总生存时间和无复发生存时间的多因素COX比例风险回归分析)。
图4为本发明实施例中所构建的肝细胞癌患者术后3年和5年OS、RFS的Nomogram预后预测模型；及对本发明构建的Nomogram预后预测模型进行校准曲线分析以评价其预测准确性图(A图和B图分别是将预测模型可视化为能定量预测3年和5年总生存时间和无复发生存时间概率的Nomogram模型，C图和D图是对Nomogram模型预测的3年或5年总生存率(横坐标)与实际观察到的患者真实总生存率(纵坐标)进行校准曲线分析，其中45°对角虚线代表最理想的预测值和真实值的吻合程度，越靠近45°对角虚线则预测准确性越高，E图和F图是对Nomogram模型预测的3年或5年无复发生存率(横坐标)与实际观察到的患者真实无复发生存率(纵坐标)进行校准曲线分析)。
图5为本发明实施例中构建的Nomogram预后预测模型和已有的TNM、BCLC分期系统进行决策曲线分析以评估不同模型的临床净获益图(A图和B图分别是各个模型预测3年和5年总生存时间的决策曲线分析，横坐标表示生存阈值的概率，纵坐标表示临床净获益，C图和D图分别是各个模型预测3年和5年无复发生存时间的决策曲线分析，横坐标表示无复发阈值的概率，纵坐标表示临床净获益)。
具体实施方式
本发明提供了一种RPS3A分子在预测肿瘤内免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达水平及预测模型中的应用。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
1.研究对象：
本实施例的研究对象为154例肝细胞癌患者术后肿瘤组织，纳入及排除标准为：
(1)无其他恶性肿瘤病史；
(2)术前未曾接受过癌症治疗，术前未发现肝外转移；
(3)除病毒性肝炎外没有感染或其他炎症的迹象；
(4)根治性切除；
(5)术后病理明确诊断为肝细胞癌。
2.研究方法：
(1)收集肝细胞癌患者的手术切除肿瘤组织标本，进行低聚甲醛固定，石蜡包埋以构建组织微阵列芯片。
(2)收集肝细胞癌患者的临床病理信息和术后随访数据
常规的临床病理信息包括年龄、性别、有无腹水和肝硬化，术前实验室指标和术后病理报告。其中，术前实验室指标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)水平。术后病理报告包括肿瘤数量、大小、包膜、分级和微血管浸润等内容。
随访第1年每3个月进行1次，随后第2年每3-6个月进行1次，然后每年1次。随访内容包括血常规、肝功能检查、血清肿瘤标志物检测、腹部超声和胸片。对怀疑复发的患者实施了增强CT或磁共振成像。OS和RFS分别定义为从手术日期到死亡或复发日期(或最后一次随访)的时间间隔。
(3)肿瘤组织RPS3A分子免疫组化染色
将脱石蜡的肝细胞癌组织切片浸入3％的H2O2中以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后与抗RPS3A的抗体(抗体稀释比例为1：100)在4℃下孵育过夜。第二天将切片与辣根过氧化物酶第二抗体和二氨基联苯胺溶液一起孵育。用哈里斯氏苏木精染剂进行细胞核染色。随后，由两名病理学医师独立进行半定量组织学评分。最终的RPS3A表达水平为染色强度评分(0：-；0.5：-/+；1：+；1.5：+/++；2：++；2.5：++/+++；3：+++)与染色范围(0-100％)的乘积。最终，RPS3A表达水平使用四级量表进行分级：阴性(0)，弱(0-100％)，中度(100-150％)和强度(150-300％)。将阴性和弱RPS3A表达定义为低RPS3A表达，将中度和强度RPS3A表达定义为高RPS3A表达。
(4)肿瘤RPS3A分子表达水平与肝细胞癌患者预后的关系
根据154例肝细胞癌患者的临床随访信息计算相应的OS值和RFS值，然后对高RPS3A表达和低RPS3A表达的患者的OS和RFS进行Kaplan–Meier生存分析绘制生存曲线，并采用Log-rank检验差异有无统计学意义。
(5)RPS3A分子与肝细胞癌肿瘤免疫浸润和免疫检查点分子表达水平的相关性分析
通过HiSeq系统从TCGA公共数据库中获得356例肝癌患者的RNA测序数据，使用R语言软件的limma包中的scale方法对这些mRNA表达数据进行标准化，删除低丰度表达的基因，计算重复基因的平均mRNA表达值。通过R语言软件的gsva包中的ssGSEA方法根据每个样本的mRNA表达情况鉴定出各个样本中24种免疫细胞类型(Th17细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、调节性T细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞、T细胞、Th1细胞、Th2细胞、滤泡辅助T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤细胞CD56阳性细胞、自然杀伤细胞CD56阴性细胞、活化树突状细胞、B细胞、肥大细胞、CD8+T细胞、细胞毒性细胞、T辅助细胞、效应记忆T细胞和中央记忆T细胞)的肿瘤浸润情况，然后进行Spearman等级相关分析以确定肿瘤样本中RPS3A mRNA表达水平和免疫细胞浸润程度之间的相关性。使用R语言软件中的corrplot包分析肿瘤RPS3A表达水平与免疫检查点分子表达水平之间的相关性。
(6)肝细胞癌术后生存相关Nomogram预后预测模型的构建和评价
通过多因素COX比例风险回归分析鉴定出肝细胞癌患者术后OS和RFS独立的预测因子，并纳入预测模型中进行COX回归以计算每个变量的偏回归系数，使用R语言软件中的rms包建立图形化的Nomogram。相应的生存概率＝相应Nomogram模型中每个变量point值的总和在Total points轴中所在位置所对应的概率尺度轴数值。通过C指数、校准曲线和决策曲线分析对Nomogram模型的预测效能、准确性以及临床净获益进行评价。
3.实验结果：
(1)图1A-1B分别是肿瘤组织和癌旁组织中RPS3A分子免疫组化染色各表达水平级别(强度、中度、弱、阴性)的示例。在154例肝细胞癌患者中，肿瘤组织中RPS3A分子强度和中度染色的组织占了51.3％(22.73％+28.57％)，癌旁组织中RPS3A分子强度和中度染色的组织占了11.04％(1.95％+9.09％)，如图1C所示，说明RPS3A分子的表达水平在肿瘤组织中明显增加。进一步根据肿瘤组织中RPS3A分子的染色水平把154例患者分为高RPS3A表达组(强度和中度染色，共79人)和低RPS3A表达组(弱和阴性染色，共75人)，两组间的生存差异显著具有统计学意义(P＝0.016；P＝0.030)，低RPS3A表达组患者的总生存率更高，累积复发率更低，如图1D-1E所示。
(2)对TCGA公共数据库肝细胞癌患者RNA测序数据的ssGSEA分析发现，肿瘤RPS3A表达水平和14种免疫细胞浸润程度具有相关性，如图2A所示。分析表明肿瘤RPS3A表达水平与Th17(Spearman相关系数r＝-0.42，P＜0.001)和中性粒细胞(Spearman相关系数r＝-0.3，P＜0.001)肿瘤浸润程度呈显著负相关(图2B-2C)。RPS3A的表达水平与其他类型的免疫细胞浸润之间呈弱相关性，例如：NK CD56阳性细胞(Spearman相关系数r＝0.28，P＜0.001)、NK CD56阴性细胞(Spearman相关系数r＝0.27，P＜0.001)、滤泡辅助T细胞(Spearman相关系数r＝0.26，P＜0.001)和Th2细胞(Spearman相关系数r＝0.22，P＜0.001)(图2D-2G)。同时，对TCGA公共数据库的肝细胞癌肿瘤样本的RPS3A基因表达水平和20种免疫检查点分子表达水平进行相关性分析，发现肿瘤RPS3A基因表达水平与大多数免疫检查点分子表达水平呈正相关，如表1所示。因此，根据显示的结果，RPS3A表达与诱导的肿瘤免疫逃逸之间存在直接的致病联系。
表1肿瘤RPS3A基因表达水平与免疫检查点分子表达水平的相关系数
Figure BDA0002581230350000071
(3)对154例肝细胞癌患者术后OS和RFS进行单因素COX比例风险回归分析发现高表达RPS3A分子患者的OS不良是低表达RPS3A患者的1.74倍，高表达RPS3A分子患者的RFS不良是低表达RPS3A患者的1.54倍，具有统计学意义(P＝0.018；P＝0.032)，如图3A和3C所示。进一步的多因素COX比例风险回归分析表明肿瘤组织RPS3A表达水平、AFP水平、有无腹水和肿瘤大小是OS的独立预后因素；肿瘤组织RPS3A表达水平、AFP水平、有无腹水、肿瘤大小和TNM分期是RFS的独立预后因素(图3B、3D)，同样高表达RPS3A分子的患者总生存和无复发生存的风险都大于低表达RPS3A分子的患者，且有统计学意义(P＝0.041；P＝0.044)，说明RPS3A分子表达是肝细胞癌总生存和无复发生存的独立预后因素。将这些变量分别纳入相应的COX回归中构建出预测3年和5年OS和RFS的Nomogram模型，即将总生存时间和无复发生存时间多因素COX比例风险回归分析中具有统计学意义的指标纳入相应的Logistic回归中构建Nomogram模型，如图4A-4B所示。3年或5年OS生存概率＝(RPS3A point值+AFP point值+有无腹水point值+肿瘤大小point值)在Total points轴中所处的位置所对应3年或5年生存概率刻度轴数值；3年或5年RFS生存概率＝(RPS3A point值+AFP point值+有无腹水point值+肿瘤大小point值+TNM分期point值)在Total points轴中所处的位置所对应3年或5年生存概率刻度轴数值。
(4)Nomogram模型以及TNM、BCLC分期的C指数如表2所示，Nomogram模型的C指数明显高于后两者，证明其预测效能更高。
表2 Nomogram模型以及TNM、BCLC分期预测肝细胞癌OS和RFS的C指数
Figure BDA0002581230350000081
(5)利用校准曲线对Nomogram模型预测的OS和RFS值与实际观察到的患者真实OS和RFS值进行吻合分析，结果如图4C-4F所示，图中显示Nomogram模型预测肝癌患者3年或5年总生存时间和无复发生存时间的准确性较好，因此Nomogram模型预测的OS和RFS值与实际观察值具有良好的一致性，说明其预测准确度较高。
(6)决策曲线分析发现，在OS阈值概率在0.2-0.6范围内时，用构建的Nomogram模型预测3年和5年OS要比用TNM分期、BCLC分期系统预测获得更多的临床净获益，如图5A-5B所示。在RFS阈值概率在0.3-0.7范围内时，用构建的Nomogram模型预测3年和5年无复发生存时间要比用TNM分期、BCLC分期系统预测获得更多的临床净获益，如图5C-5D所示。因此，在相同的风险阈值可能性下，应用构建的Nomogram模型预测肝癌3年和5年的OS和RFS相比于已有的分期系统能帮助患者获得更多的临床净收益。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.RPS3A分子在构建用于预测肝细胞癌患者术后无复发生存时间和总生存时间的预测模型中的应用；
所述预测模型由因素输入模块和预测结果输出模块构成，所述预测模型为Nomogram模型；
所述预测模型中的因素输入模块包括总生存时间的因素输入模块和无复发生存时间的因素输入模块；肝细胞癌患者肿瘤组织RPS3A表达水平、甲胎蛋白水平、有无腹水和肿瘤大小的检测结果输入总生存时间的因素输入模块，肿瘤组织RPS3A表达水平、甲胎蛋白水平、有无腹水、肿瘤大小和TNM分期的检测结果输入无复发生存时间的因素输入模块；
所述预测模型中的预测结果输出模块用于输出肝细胞癌患者术后3年和5年无复发生存时间、总生存时间的生存概率。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肝细胞癌患者术后3年和5年无复发生存时间、总生存时间的生存概率的计算方法分别为：相应预测模型中每个变量点值的总和在总积分轴中所在位置对应的概率尺度轴数值，即为相应的生存概率。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：预测模型的构建方法如下：
通过多因素比例风险回归分析分别得到无复发生存时间、总生存时间独立的预测因子作为模型的输入因素，通过COX回归计算每个变量偏回归系数并将预测模型图形化为Nomogram模型。
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