JP2007526898A - Lpaを含む化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)に結合する能力のある新しいペプチド化合物に関して、当該化合物は、二つのアミノ酸配列の少なくとも一つがFGFRに結合のする能力のある、二つの個別のアミノ酸配列を含む。発明は、化合物のアミノ酸配列を開示して、それらを含む医薬組成物を特徴化する。本発明はまた、FGFRが疾患からの病理および/もしくは回復に役割を演じる、異なる病的な状態の処置もしくは予防のために化合物ならびにそれらを含む医薬組成物の使用に関する。本発明の新しいペプチド化合物は、リガンド提示アッセンブリ(LPA)方法により取得され得る。
Description
本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)に結合する能力がある新しいペプチド化合物に関して、当該化合物は、二つのアミノ酸配列の少なくとも一つがFGFRに結合する能力がある、二つの個別のアミノ酸配列を含む。本発明は化合物のアミノ酸配列を開示して、それらを含む医薬組成物を特徴づける。本発明はまた、FGFRが病理および/もしくは疾患からの回復に役割を演じる、異なる病的な状態の処置および/もしくは予防のための化合物ならびに医薬組成物の使用に関する。本発明の新しいペプチド化合物は、リガンド提示アッセンブリ(LPA)方法により取得され得る。
脳可塑性および可塑性を制御する機構は、学習および記憶ならびに脳損傷後の機能の回復に中心的である。神経向性の因子は、成体の中枢神経系(CNS)における脳可塑性を調節し続ける分子クラスの一つであることが明らかである一方で、あまり認識されていないが、同じく重大であるものは、ニューロンの長期増強作用、保存および再生のような可塑性機構における細胞接着分子(CAM類)の役割である。しかしながら、皮肉にも、CAM類は、細胞外の空間をまた再編成することができて、アルツハイマー病および多発性硬化症のような状態における脳病理の発症を駆動する障害を引き起こす。候補分子は、古典的なCAMおよびベータ−アミロイドの多くの性質を共有して、偽CAMとして仮装することができる、アミロイド前駆体タンパク質を含む。ベータ−アミロイドは、アルツハイマー病における老人班の形成のための病巣として働いて、CAM類のように、神経向性の因子および他のCAM類を編成するための環境を提供する。炎症性の応答はこの環境で進化して、小膠細胞、補体および他の因子により治療される永続化されたニューロンの損傷の悪性なサイクルを開始することができる(Cotman et al. (1998) Prog Neurobiol. 55:659-69)。
イムノグロブリンスーパーファミリーの神経細胞接着分子(CAM類)は、発育初期の間におよび成体において重要部位で複数群の細胞を核化して維持する。それらの接着性質に加えて、CAM類の好同質性のおよび好異質性の相互作用は、細胞内シグナル伝達に影響することができる。それ故に、細胞遊走、増殖、および分化を含む、発症事象に影響するそれらの能力は、それらの接着のおよびシグナル伝達の性質の両方に起因する。
神経細胞接着分子、NCAM、は最初に発見された神経CAMであった。NCAMの発見は集中的に研究されてきていて、今やそれは良く特性化されている(Ronn et al. (2000) Int J Dev Neurosci 18:193-9)。NCAMはイムノグロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。その細胞外部分は、五つのIg様および二つのIII型フィブロネクチン(F3)モジュールから成る。NCAMは、細胞−細胞および細胞−基層相互作用の両方を支援する。NCAMは、ヘパリン/ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよび異なる型のコラーゲンのような種々の細胞外マトリックス成分に結合する。細胞−細胞相互作用は、NCAMの好同質性相互作用により主として支援される。NCAMの異なるモジュールは、独特な機能を実施すると示されてきている。かくして、NCAMの好同質性結合は、最初の三つのIgモジュールに依存すると今や信じられている。ヘパリン結合配列はIg2モジュールに局在化している。NCAMはまた、神経細胞接着分子L1に結合する。この相互作用は、NCAMの第四IgモジュールおよびL1上で発現されるオリゴマンノシド部分の間で起こると信じられている。NCAMの二つの膜−隣接面のF3モジュールは、繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)の結合に関与すると示されてきている。
数多くの研究グループが、NCAM−仲介軸索の成長の基礎をなす細胞内シグナル伝達カスケードが、FGFRの刺激により活性化されるシグナル形質導入カスケードに類似することを指し示す大量の証拠を今や蓄積してきている(Povlsen et al. (2003) Neurochem Res 1:127-41)。
繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR類)は、三つのIg様モジュールから細胞外で、そして分裂したチロシン−キナーゼモジュールから細胞内で成る四つの密接に関連する受容体タンパク質チロシンキナーゼのファミリーである(Powers et al. (2000) Endocr Relat Cancer 7:165-97)。受容体は、形態形成、発育、血管新生、および創傷治癒の重要な調節因子として知られている。FGFRの活性化およびシグナル伝達は、FGFRの天然のリガンド、繊維芽細胞成長因子(FGF)、の高親和性結合により誘発される受容体の二量化に依存して、それはまた、細胞表面のヘパリンもしくはヘパラン硫酸プロテオグリカンの関与を必要とする。繊維芽細胞成長因子(FGF類)およびそれらの受容体は、実質的に全ての哺乳動物の組織の多くの発症のおよび修復の過程に関与する綿密なシグナル伝達系を構成して、特に、それらは末梢のおよび中枢の神経系の機能化に顕著な役割を演じている。かくして、FGFファミリーの23個のメンバーの中で、10個が脳中に確認されてきている(Jungnickel et al, (2004) Mol Cell Neurosci. 25:21-9; Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell Tissue Res. 313:139-57)。
NCAMは、FGFRの推定上の別のリガンド、低親和性結合リガンド、の新しいクラスのメンバーとして最近考えられてきている。NCAMおよび受容体の間の直接の相互作用についての証拠が得られてきている(Kiselyov et al. (2003) Structure (Camb) 11:691-701)。
NCAMおよびFGFRの間の直接の相互作用に関与する配列EVYVVAENQQGKSKA(FGLペプチド)を有する確認されたNCAMフラグメントは、FGFRの活性の調節が重要な役割を演じ得る、種々の病的な障害の処置のための新しい候補薬物として最近提案されてきている(WO 03/016351)。WO 03/016351は、FGFRを結合して活性化することによるFGLペプチドの或る生物作用を記述している。WO 03/016351にしたがって、ペプチドの単一コピー(モノマー)のニューロンの細胞へのインビトロでの提示は、細胞の生存および分化を促進するのに十分である。しかしながら、むしろ高濃度のペプチドが作用を達成するために必要とされる。
ペプチド配列、例えば抗原ペプチド、の多重提示は、インビトロでのペプチド配列の生物応答を増幅するための価値ある手段であると示されてきていて(Berezin and Bock (2004) J Mol Neurosci.22:33-39; Ronn et al (1999) Nat Biotechnol 17:1000-5)、それは、インビボでの動物モデルで効果的に使用されてきている(Cambon et al. (2004) J Neurosci. 17:4197-204)。
生物学的に活性なペプチド配列の合成的樹状ポリマーは、研究およびある臨床応用に今や使用されている。樹状ポリマーは、多重部位でコア分子に接着して、それにより枝分かれのポリマーを形成する、モノマー性ペプチド配列の数多くのコピーから成っている。リシンは、それが枝分かれ反応に利用可能な二つの反応性アミノ基を有するので、コアマトリックスの中で最も普通に使用される。リシンコアの上のペプチド配列の多量化は多重抗原ペプチド(MAP)提示として知られている。MAP(複数を含む)(樹状体ペプチド)の合成方法がPCT/US90/02039に記述された。
一般的に、二つの経路、即ち直接的なおよび間接的な経路、を樹状体ペプチドの合成に使用することができる。両方の場合において、望ましい程度の枝分かれを得るために、Boc化学の場合には二保護のBoc−Lys(Boc)を、Fmoc化学の場合にはFmoc−Lys(Fmoc)を用いて固体支持体の上で先ずC−末端コアが組み立てられる。
直接的な経路では、周知のメリフィールド法によりリシンのコアの上で特定のペプチドの段階的アッセンブリにより、合成が為される。この段階方法は、CからNへの配向を持つペプチドを生産する。ペプチド鎖を縦に並んで合成し得るか、もしくは、それに代えて、それぞれのペプチドを直交する脱離方法を用いてコアの異なるリシン腕の上で合成することができる。
樹状体ペプチドの合成のためのこのアプローチは便利あるけれども、最終生成物の品質が問題視され得て、良く規定された生成物を得る問題が文献に広く議論されてきている。鎖のアッセンブリての間に問題が起こる。MAP型の樹状体は巨大分子であり、そこではそれぞれの単一なペプチド鎖はお互いに非制御的に相互作用して、それによりコアへの高効率カップリングを妨害し得て、精製に努力を必要とする不均一な化合物の製造に至る。例えば電気スプレー質量分析法(ES−MS)によるこれらの生成物の特徴づけは困難であって、結果として、樹状ペプチド生成物は、完全な特徴づけ無しでしばしば使用される。
間接的な経路では、精製された非保護ペプチドフラグメントのコアマトリックスへのカップリングにより、合成が為される。この型の連結反応のための二つの一般方法を使用し得て、それらは、それぞれ、チオールのおよびカルボニルの化学に基づいている。
リシンマトリックスの上のクロロアセチル基(複数を含む)の組込みおよび精製された、合成のN−末端システインペプチドへの引き続くカップリングにより、チオールの化学を行って、明白な構造を持つ樹状体を生成し得る。リシンのコアの上のS−アセチル基およびペプチドの上のハロアセチル基を用いることにより、逆の配置をコアマトリックスの上のチオールで達成し得る。カルボニルの化学では、カルボニル基および弱塩基の間に縮合が起こる。この反応に使用され得る、二つの型の弱塩基がある。最初のものはヒドロキシルアミンおよびヒドラジンを含んで、第二のものは1,2−アミノエタンチオールおよび1,2−アミノエタノールのような1,2−二置換部分を含む。最後の二つの基は、N−末端のCysおよびThrもしくはSerにそれぞれ見出されていて、縮合生成物はチアゾリジンおよびオキサゾリジンである。コアマトリックスの上のカルボニル基は、N−末端のSer、ThrもしくはCysの過酸化物酸化により得られ得る。両方の方法は当分野で周知である(例えば、Lu et al., (1991) Mol Immunol 28:623-630; Defoort et al., (1992) Int J Pept Prot Res 40:214-221; Drijfhout et al. (1991) Int J Pept Prot Res 37:27-32を参照)。
MAP型の化合物に関連するもう一つの問題はペプチド鎖の配向である。リシンコア上の望ましいペプチドの段階的アッセンブリでの直接的な経路では、CからNへの配向を持つペプチド鎖を有する化合物のみを単に得ることができる。間接的な経路は、両方の配向、CからNへのおよびNからCへの、配向を許容するが、方法は他の主要な不利点、例えば、不純な生成物に至る、ジスルフィドの酸化による望ましくない副反応、天然のペプチド鎖の中に存在するシステイン残基との干渉、を有し、そして手順があらゆる合成について最適化を要求する。
ペプチド配列の最適数の複製を見出すことは、解決されるべきもう一つの問題である。MAP方法により合成される樹状ペプチドポリマーの大抵の研究は、テトラ−もしくはオクタマーのポリマーを用いて行われてきている。しかしながら、15個もしくはそれ以上のアミノ酸の4〜8個の配列を含む化合物のインビボでの適用は、もし化合物が脳の処置のためであるならば重要である、化合物が血液−脳関門を浸透する能力の問題の課題がある。ペプチド配列のダイマーは、ダイマーが樹状テトラマー類似体の生物活性を所有する場合には、この問題への解決であり得る。異なるリンカーを含む生物学的に活性なペプチドダイマーの生産および使用は、当分野でまた周知である(例えば、WO 00/18791、WO 00/24770を参照)。
(発明の概要)
FGLの四つの配列から成るFGLペプチドの樹状体変種はラットにおいてインビボで有効であると示されてきている(Cambon et al. (2004) J Neurosci. 17:4197-204)、けれども、本発明の著者等は、ヒト患者の処置に樹状体の薬物候補としての使用を考慮することは予備的であることを見出した。FGLペプチドの樹状テトラマーの最終精製は、MAP合成の生成物は高度に不均質であって、その特徴づけは困難であることを明らかにした。この問題を解決するために、本発明の著者等は、既知の合成手順を用いて、FGFの異なるダイマーを合成することを試みた。驚くべきことに、FGL樹状体に類似する生物活性を有した唯一のFGLダイマーは、WO 00/18791に開示されるように、リガンド提示アッセンブリ方法(LPA)により生産されたダイマーであった。FGL配列が、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で開示されるように、Cys残基により、もしくは、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res 45:173-179の中で開示されるように、Lys残基により、連結された、ダイマーのような、FGLの他のダイマーは同一の活性を有しなかった。
FGLの四つの配列から成るFGLペプチドの樹状体変種はラットにおいてインビボで有効であると示されてきている(Cambon et al. (2004) J Neurosci. 17:4197-204)、けれども、本発明の著者等は、ヒト患者の処置に樹状体の薬物候補としての使用を考慮することは予備的であることを見出した。FGLペプチドの樹状テトラマーの最終精製は、MAP合成の生成物は高度に不均質であって、その特徴づけは困難であることを明らかにした。この問題を解決するために、本発明の著者等は、既知の合成手順を用いて、FGFの異なるダイマーを合成することを試みた。驚くべきことに、FGL樹状体に類似する生物活性を有した唯一のFGLダイマーは、WO 00/18791に開示されるように、リガンド提示アッセンブリ方法(LPA)により生産されたダイマーであった。FGL配列が、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で開示されるように、Cys残基により、もしくは、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res 45:173-179の中で開示されるように、Lys残基により、連結された、ダイマーのような、FGLの他のダイマーは同一の活性を有しなかった。
したがって、第一の態様では、本発明は、二つの個別なペプチド配列を含む化合物に関し、そこでは、二つの個別な配列の少なくとも一つは、式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは、疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは、塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは、酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは、GlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は、化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含み、当該二つのペプチド配列は、一般式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、
Xは、HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、AおよびBは独立して、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕のリンカーを通してお互いに接合される。
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは、疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは、塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは、酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは、GlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は、化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含み、当該二つのペプチド配列は、一般式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、
Xは、HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、AおよびBは独立して、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕のリンカーを通してお互いに接合される。
本発明にしたがう上の化合物はLPA方法により取得可能である。
もう一つの態様では、本発明は、上で規定されるように化合物を含む医薬組成物に関する。
もう一つの態様では、本発明は、上で規定されるように化合物を含む医薬組成物に関する。
さらにもう一つの態様では、本発明は、
a)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病に関連する中枢のおよび末梢の神経系の状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置;
b)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患または状態の処置;
c)創傷治癒の促進;
d)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞死の予防;
e)血管再生の促進;
f)学習能力ならびに/または短期のおよび/もしくは長期の記憶の刺激;
g)虚血による細胞死の予防;
h)アルコール摂取による身体損傷の予防;
i)プリオン病の処置;
j)がんの処置
のための医薬品の製造のために上記の化合物を使用することに関与する。
a)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病に関連する中枢のおよび末梢の神経系の状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置;
b)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患または状態の処置;
c)創傷治癒の促進;
d)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞死の予防;
e)血管再生の促進;
f)学習能力ならびに/または短期のおよび/もしくは長期の記憶の刺激;
g)虚血による細胞死の予防;
h)アルコール摂取による身体損傷の予防;
i)プリオン病の処置;
j)がんの処置
のための医薬品の製造のために上記の化合物を使用することに関与する。
(図面の説明)
図1は、LPA−型FGLダイマー(FGLL)の合成のフローチャートを示す。
図2は、FGLLのHPLC精製プロフィールを提示する。
図3は、FGLDのHPLC精製プロフィールを提示する。
図1は、LPA−型FGLダイマー(FGLL)の合成のフローチャートを示す。
図2は、FGLLのHPLC精製プロフィールを提示する。
図3は、FGLDのHPLC精製プロフィールを提示する。
図4は、種々の神経毒性薬剤で処理された一次ニューロンの生存へのFGLペプチドの作用を立証する。
ポリ−D−リシンで被膜された24−穴の培養プレート上で種々の濃度のペプチドの有無で六日間細胞150,000個/cm2の密度で増殖された15日目のラットの胚からのドーパミン作動性ニューロン(DN)(aおよびb)を、100μMの6−OHDAに二時間露出した。培地を変更して、種々の濃度のFGLdを加えた。ニューロンを培養の以前にさらに24時間増殖し、そしてそれらを固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。
ポリ−D−リシンで被膜された24−穴の培養プレート上で種々の濃度のペプチドの有無で六日間細胞150,000個/cm2の密度で増殖された15日目のラットの胚からのドーパミン作動性ニューロン(DN)(aおよびb)を、100μMの6−OHDAに二時間露出した。培地を変更して、種々の濃度のFGLdを加えた。ニューロンを培養の以前にさらに24時間増殖し、そしてそれらを固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。
19日目のラットの胚からの海馬ニューロン(HN)(cおよびd)を、ポリ−L−リシンで被膜された8−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で細胞40,000個/cm2の密度で接種して、20μMのアミロイド−β25〜35ペプチド(Aβ25〜35)を含有する培地の中で種々の濃度のFGLdの存在下に24時間増殖した後に、それらを固定して、Hoechst 33258で染色した。
生後7日目のラットからの小脳の顆粒ニューロン(CGN)(eおよびf)を、ポリ−L−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で40mMのKClを含有する培地の中で7日間細胞100,000個/cm2の密度で増殖し、次いで、種々の濃度のFGLdで補足された5mMのKClを含有する培地へ置換した。二日のインキュベーションの後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。
(a)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への10ng/mlのGDNFの作用。
(b)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のFGLdの作用。
(c)Aβ25〜35で処理された海馬培養物への50ng/mlのBDNFの作用。
(d)Aβ25〜35で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のFGLdの作用。
(e)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への50ng/mlのIGF−1の作用。
(f)アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への種々の濃度のFGLdの作用。
(a)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への10ng/mlのGDNFの作用。
(b)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のFGLdの作用。
(c)Aβ25〜35で処理された海馬培養物への50ng/mlのBDNFの作用。
(d)Aβ25〜35で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のFGLdの作用。
(e)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への50ng/mlのIGF−1の作用。
(f)アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への種々の濃度のFGLdの作用。
それぞれの型の培養物について少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ニューロンの総数に比較して、生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として表される。FGLの処理なしで細胞死を受けるように誘発された対照培養物は、100%にセットされた。無処理の対照と比較したときには、+p<0.05、++p<0.01。細胞死を受けるように誘発された培養物と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001。
図5は、高KCl培地(40mM)の中で六日間ニューロンを増殖した後で、低KCl培地(5mM KCl)へ培地を変えることによりアポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物の中でDNA−フラグメント化へのFGLペプチドの作用を立証する。フラグメント化DNAを持つニューロンの数をApoAlertアポトーシス検出キットを用いて測定して、TUNEL−陽性ニューロンのフラクションを計数により評価した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、低KClでの対照培養物を100%にセットして、細胞の全数に比してDNA−フラグメント化を示す細胞の百分率±平均値の標準誤差として示される。
(a)アポトーシスを受ける細胞の数への高KClのCGN培養物を奪うことの作用。
(b)アポトーシスで誘発されるCGN培養物の中でFGLdの作用。
低KClで処理されたCGN培養物と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001。
(a)アポトーシスを受ける細胞の数への高KClのCGN培養物を奪うことの作用。
(b)アポトーシスで誘発されるCGN培養物の中でFGLdの作用。
低KClで処理されたCGN培養物と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001。
図6は、Erk1/2のリン酸化へのFGLの作用を示す。CGNをポリ−L−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞290,000個/cm2の密度で増殖し、引き続いてFGLdで10〜90分間処理し、固定して、ホスホ−p42/44に対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を100%にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、*p<0.05および**p<0.01。
図7は、Aktのリン酸化へのFGLの作用を示す。CGNをポリ−L−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞290,000個/cm2の密度で増殖し、種々の濃度において10〜30分間それぞれ引き続いてFGLLで処理して、引き続いて固定して、Ser473の上でリン酸化されたAktに対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を100%にセットして、百分率±平均値の標準誤差として表される。対照と比較したときには、*p<0.05。
図8は、アポトーシスを受けるように誘発されたCGNのFGLで誘発された生存率へのFGFR、MEKおよびPl3Kの阻害剤の作用を示す。CGNを、細胞100,000個/cm2の密度で七日間ポリ−L−リシンで被膜された8−穴のパーマノックススライドの上で40mMのKClを含有する培地の中で増殖した後で、培地をFGLdと一緒に5mMのKClを含有する培地に変えた。その後に、MEK阻害剤PD98059(●)、Pl3K阻害剤LY294002(▲)およびFGFR阻害剤SU5402(■)を種々の濃度で加えた。阻害剤の添加は、全ての場合で10μg/mlのFGLdの添加により引き継がれた。ペプチドおよび阻害剤とのインキュベーションの二日後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。少なくとも四つの個別の実験からの結果は、FGLdで処理した対照培養物を100%にセットして、ニューロンの総数に比べて生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として示される。
図9は、ドーパミン作動性の(●)、海馬の(▲)および小脳顆粒のニューロン(■)からの神経突起成長へのFGLペプチドの作用を示す。細胞100,000個/cm2の密度でポリ−D−リシンで被膜された24−穴の細胞培養プレートの上で種々の濃度のFGLdで、ドーパミン作動性ニューロンを72時間増殖した。培養物をチロシン水酸化酵素に対して引き続いて免疫染色した。海馬ニューロンおよびCGNを細胞10,000個/cm2の密度で8−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で平板培養して、種々の濃度のFGLdの存在下に24時間インキュベートした。引き続いて、ニューロンをGAP−43に対して免疫染色した。それぞれのニューロン培養物について少なくとも五つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を100%にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001。
図10は、新生のラットからの海馬ニューロンの神経突起成長へのFGLペプチドの三つのダイマー変種の作用を示す。細胞10,000個/cm2の密度で種々の濃度のFGLL(■)、FGLlys(▲)もしくはFGLcys(●)で、海馬ニューロンの一次培養物を24時間増殖して、次いで、GAP−43に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を100%にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、**p<0.01。
図11は、CGN培養物におけるFGLで誘発された神経突起成長へのFGFR、MEKおよびPl3Kの阻害剤の作用を示す。細胞10,000個/cm2の密度で8−穴のパーマノックススライドの上でFGLペプチドおよび阻害剤の存在で、CGN培養物を24時間増殖した。12.5、25および50μMの濃度で、同時に10μg/mlのFGLdと共に、PD98059(●)を加えた;3.5、7および10μMの濃度で、同時に27μg/mlのFGLdと共に、LY294002(▲)を加えた。20、40および80μMの濃度で、同時に27μg/mlのFGLdと共に、SU5402(■)を加えた。処理後に、細胞を固定して、GAP−43に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、FGLdで処理した対照培養物を100%にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。破線は、FGLdの処理なしの培養物における平均の神経突起長を指し示す。FGLdで処理した対照と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01。
図12は、E19ラットからの海馬ニューロンの一次培養物のFM1−43脱染色の速度へのFGLd、FGL対照およびビークルの作用を示す。それぞれの値は、4〜8回の実験の平均を表して、誤差の棒は平均値の標準誤差を指し示す。任意の期間の間で5μg/mlのFGLdでの処理、もしくは24時間で20μg/mlでの処理のいずれも、FM1−43の取り除きの速度へ如何なる作用も有しなかった。対照的に、1時間および48時間で20μg/mlのFGLdで処理された培養物の中のシナプシスは、対照培養物と比較するときに、FM1−43の取り除きの著しく増加した速度を示して、これらの培養物における増大されたシナプス前の応答を指し示した。値を不対t検定を用いて比較した。*p=0.04(1時間)および**p=0.0032(48時間)。FGL対照は、配列EVYVVAENAAGKSKA(配列番号:147)から成る対照ペプチドである。FGL配列のGln残基のAlaへの変異は、FGL活性を廃止すると示されてきている(Kiselyov et al. 2003、上の引用を参照)。
図13は、その中で認知障害が(25〜35)β−アミロイドフラグメントの脳室内(i.c.v)の注射により誘発されたラットの記憶(社会的認識試験)へのFGLL、FGLDおよびFGL対照の初期後頭下方投与の作用を立証する。結果は、その中でラット当りの投与当り5.0μgのFGLの後頭下方投与がA−βで誘発された神経毒性後の7、10、および13日目に為された実験からである。社会的認識試験を(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v投与後の21日目に実施して、成熟ラットが第一(T1)のおよび第二(T2)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は4〜22匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(2,27)=15.4、p<0.001)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05(**p<0.01)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な作用が、A−β/V群と比較して対照およびV/Vで処理した群の間にまた観察された(p<0.001)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。‘V/V'は、A−βおよびFGLの交換としてビークルを受領したラットを意味する。FGL対照は上で規定されるようである。
図14は、その中で認知障害が(25〜35)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り5.0μgのFGL)のi.c.v.の注射により誘発されたラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷の形成への(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)で誘発された神経毒性後の7、10、および13日目のFGLLおよびFGLdの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は3〜13匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(2,18)=5.2、p=0.016)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05(*p<0.05および**p<0.01)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、V/Vで処理した群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.05)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図15は、その中で認知障害が(25〜35)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り5.0μgのFGL)のi.c.v.の注射により誘発されたラットの海馬のCA3区域の中のアミロイド負荷の形成への(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)で誘発された神経毒性後の7、10、および13日目のFGLLおよびFGLdの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は2〜12匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(2,15)=9.54、p=0.002)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05(***p<0.001)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、V/Vで処理した群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.01)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図16は、その中で認知障害が(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.の注射により誘発されたラットの海馬でのニューロン死へのFGLLおよびFGLdの初期後頭下方投与の作用を示す。(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)で誘発された毒性後の7、10、および13日目に後頭下方に投与された、ラット当りの投与当り5.0μgのFGLのラットの海馬のCA3区域の中のニューロン細胞死への作用。群中の動物の数は4〜8匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(3,17)=13.76、p<0.001)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05(***p<0.001)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.001)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図17は、社会的認識試験において(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)で誘発された神経毒性後の30、33、および36日目に後頭下方に投与された5.0μgのFGLL(ラット当りの投与当り)の作用を立証する。社会的認識試験をA−βフラグメントのi.c.v.投与後の44日目に実施して、成熟ラットが第一(T1)のおよび第二(T2)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は4〜5匹で変動した。結果を不対t検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき、0.05(*p<0.05)以下のp−値を達成することを条件としていた。短期間記憶の有意な障害がA−βでの処理により誘発された(p<0.05、対照およびA−β/Vの間の不対t検定)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図18は、A−βフラグメントで誘発された神経毒性後の30、33、および36日目に後頭下方に投与された5.0μgのFGLL(ラット当りの投与当り)のラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は3〜13匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(2,12)=18.6、p=0.002)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Bonferroniの多重比較検定)、0.05(***p<0.001)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、V/Vで処理した群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.001)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図19は、(25〜35)β−アミロイド(A−β)フラグメントで誘発された神経毒性後の30、33、および36日目に後頭下方に投与された5.0μgのFGLL(ラット当りの投与当り)のラットの海馬のCA3区域の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は3〜5匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(F(2,9)=10.6、p=0.004)を用いて解析し、そして結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05(***p<0.001)以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.01)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図20は、(25〜35)β−アミロイド(A−β)フラグメントで誘発された毒性後の7、10、および13日目に後頭下方に投与された5.0μgのFGLL(ラット当りの投与当り)の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は4〜8匹で変動した。一元配置分散分析法(F(2,9)=26.9;p<0.001、Newman-Keuls事後検定:対照群と比較されたA−β/V(***p<0.001))を用いて、結果を解析して、A−β/FGLLで処理した群(**p<0.01)と比較した。結果の有意性は、A−β/V群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、0.05以下のp−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびA−β/Vで処理した群の間に観察された(p<0.001)。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図21は、社会的認識試験において(25〜35)β−アミロイド(A−β)フラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、ラット当りビークル、200μgのFGLL、および400μgのFGLLの三つの鼻腔内投与の作用を示す。社会的認識試験を(25〜35)β−アミロイド(A−β)フラグメントのi.c.v.投与後の21日目に実施して、成熟ラットが第一(T1)のおよび第二(T2)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は3〜8匹で変動した。結果は平均±平均値の標準誤差として示されて、不対t検定(対照対A−β/Vのp<0.01)および一元配置分散分析法(F(2,19)=5.6;p=0.01;Newman-Keuls事後検定、A−β/V対FGLL、400のp<0.05;およびA−β/V対FGLL、200のp<0.05;一方ではA−β/FGLL、400対FGLL、200のp<0.05)により解析した。結果の有意性は、A−β/Vで処理した群と比較するとき、0.05(*p<0.05)以下のp−値を達成することを条件としていた。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図22は、(25〜35)β−アミロイド(A−β)のi.c.v.投与後の7、10および13日目に、ラット当りビークル、200μgのFGLL、および400μgのFGLLの三つの鼻腔内投与の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は4〜8匹で変動した。結果を不対t検定(対照群対A−β/Vで処理した群(p<0.01)の)ならびに一元配置分散分析法(F(2,16)=8.6;p=0.03、Newman-Keuls事後検定:A−β/V対FGLL、400の**p<0.01およびA−β/V対FGLL、200のp<0.05と共に)を用いて解析した。結果の有意性は、A−β/Vで処理した群と比較するとき、0.05(**p<0.01)以下のp−値を達成することを条件としていた。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図23は、オープンフィールド試験において立ち上がり活性について試験されたラットへの5.9μgのFGLdの投与の作用を示す。 (25〜35)β−アミロイドフラグメントで誘発された神経毒性後の7、10、および13日目に、ペプチドを後頭下方に適用した。数の‘1'、‘2'、および‘3'は、測定の期間を指し示す:‘1'は1〜3分を指して、‘2'は8〜10分を指して、そして‘3'は18〜20分を指す。‘V/V'は、ラットが(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびFGLdの交換としてビークルを受領したことを指し示す。群中の動物の数は9〜11匹で変動した。‘A−β'および‘V'は、それぞれ、(25〜35)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。結果を不対t検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、第一の測定期間(1〜3分)と比較するとき、0.05(*p<0.05、**p<0.01)以下のp−値を達成することを条件としていた。
図24は、PND1、2、および3での子当り2.6μgのFGLL、FGLdもしくはFGL対照の鼻腔内投与の後に、PND4でのラットの子による平面立ち直り反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(F=4.05、p=0.039)を用いて解析し、そしてNewman-Keuls検定は、対照のおよびFGL対照の群と比較するとき、FGLL(p<0.05)およびFGLd(p<0.05)の統計的に有意な作用を示した。FGL対照は上で規定されるようである。
図25は、PND1、2、および3での子当り2.6μgのFGLL、FGLdもしくはFGL対照の鼻腔内投与の後で、PND6およびPND9でのラットの子による背地走行反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(FPND6=5.14;、PPND6=0.008)を用いて解析した。PND6では、FGLL(*p<0.05)のおよびFGLd(**p<0.01)の群について、対照のおよびFGLc(FGL対照)の群と比較するとき、統計的に有意な作用が観察された。PND9では、FGLの有意な作用は何も観察されなかった(一元配置分散分析法:FPND9=0.94;、PPND9=0.44)。FGL対照は上で規定されるようである。
図26は、インビボ試験の時間経過の図式的提示を示す。
図26は、インビボ試験の時間経過の図式的提示を示す。
図27は、低KCl濃度でのラットの小脳の顆粒ニューロンの培養物における配列番号2(EFループ)のペプチドの生存作用を示す。対照細胞を、同一の培養条件でインスリン成長因子1(IGF−1)で処理した。
図28は、インビトロでのラット海馬ニューロンへのEFLペプチド(配列番号2)の神経突起生成作用を示す。EFLで処理した培養物の中の神経突起の長さをビークル(リン酸塩緩衝食塩水)で処理した培養物の中の神経突起の長さと比較する。
(発明の詳細な説明)
1.化合物
繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)の機能を調整する能力のある化合物は、種々の疾患および病的状態の治療的処置のための有効な薬物の開発の観点で最大の重要性を持つ。かくして、FGFRに結合して、FGFR活性を調整する能力がある新規な化合物を提供することが本発明の目的である。本発明にしたがって、化合物は、二つの配列の少なくとも一つは、FGFRに低親和性結合をする能力があるアミノ酸配列に共通な構造モチーフを含む、少なくとも二つのペプチド配列を含む。
1.化合物
繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)の機能を調整する能力のある化合物は、種々の疾患および病的状態の治療的処置のための有効な薬物の開発の観点で最大の重要性を持つ。かくして、FGFRに結合して、FGFR活性を調整する能力がある新規な化合物を提供することが本発明の目的である。本発明にしたがって、化合物は、二つの配列の少なくとも一つは、FGFRに低親和性結合をする能力があるアミノ酸配列に共通な構造モチーフを含む、少なくとも二つのペプチド配列を含む。
1.ペプチド配列
かくして、一つの態様では、本発明は、二つの個別なペプチド配列に関し、そこでは、当該二つの個別なペプチド配列の少なくとも一つは、式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含む。
かくして、一つの態様では、本発明は、二つの個別なペプチド配列に関し、そこでは、当該二つの個別なペプチド配列の少なくとも一つは、式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含む。
本明細書では、アミノ酸残基について標準的な一字コードならびに標準的な三字コードが適用されている。アミノ酸についての略語は、IUPAC-IUB Joint Commision on Bio-Chemical Nomemclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37の推奨基準にしたがっている。明細書および特許請求の範囲を通して、天然アミノ酸についての三字コードもしくは一字コードのいずれかが使用されている。LもしくはD型が特定化されてきていない場合には、問題のアミノ酸は天然のL型(Pure & Appl. Chem. Vol. (56(5) pp 595-624 (1984)を参照)かもしくはD型を有することが理解されるべきであり、それで、形成されるペプチドは、L型、D型のアミノ酸、もしくは混合のL型およびD型の配列から構成され得る。
何も特定化されていない場合には、本発明のペプチドのC−末端アミノ酸は遊離のカルボン酸、これは“−OH”としてまた特定化され得る、として存在することが理解されるべきである。しかしながら、本発明の化合物のC−末端アミノ酸は、“−NH2”として指示される、アミド化誘導体であり得る。他に何も言及されていない場合には、ポリペプチドのN−末端アミノ酸は、遊離のアミノ基、これは“H−”として特定化され得る、を含んでいる。
他に何も特定化されていない場合には、天然に産出するかしないに関わらず、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、および/もしくはガンマアミノ酸のような、任意のアミノ酸から、アミノ酸を選択することができる。したがって、基としては:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、リシン類似体、DAP、DAPAおよび4Hypが含まれるが、それらに限定されない。
また、本発明にしたがって、例えばアミノ酸のグリコシル化および/もしくはアセチル化のような、化合物/ペプチドの修飾を実施し得る。
また、本発明にしたがって、例えばアミノ酸のグリコシル化および/もしくはアセチル化のような、化合物/ペプチドの修飾を実施し得る。
塩基性アミノ酸残基は、アミノ酸Arg、Lys、およびHisの残基により、酸性アミノ酸残基は―アミノ酸GluおよびAspの残基により、そして疎水性アミノ酸残基は、アミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、TrpおよびTyrの残基により、本発明にしたがって表される。好ましい実施態様では、塩基性アミノ酸残基は、ArgもしくはLysにより表される。
1.1 ペプチド配列の長さ
本発明の化合物は、共に、6〜160個のアミノ酸残基、例えば6〜150個のアミノ酸残基、例えば6〜140個のアミノ酸残基、例えば6〜130個のアミノ酸残基、例えば6〜120個のアミノ酸残基、例えば6〜110個のアミノ酸残基、例えば6〜100個のアミノ酸残基、例えば6〜90個のアミノ酸残基、例えば6〜80個のアミノ酸残基、例えば6〜70個のアミノ酸残基、例えば6〜60個のアミノ酸残基、例えば6〜50個のアミノ酸残基、例えば6〜40個のアミノ酸残基、6〜30個のアミノ酸残基、例えば6〜20個のアミノ酸残基、例えば6〜10個のアミノ酸残基を含む二つの個別なペプチドフラグメントを含み得る。かくして、一つの実施態様では、化合物の二つの個別なペプチドフラグメントのいずれかのアミノ酸配列の長さは、変動し得る。もう一つの実施態様では、化合物のそれぞれのペプチドフラグメントのアミノ酸配列の長さは、同一であり得る。
本発明の化合物は、共に、6〜160個のアミノ酸残基、例えば6〜150個のアミノ酸残基、例えば6〜140個のアミノ酸残基、例えば6〜130個のアミノ酸残基、例えば6〜120個のアミノ酸残基、例えば6〜110個のアミノ酸残基、例えば6〜100個のアミノ酸残基、例えば6〜90個のアミノ酸残基、例えば6〜80個のアミノ酸残基、例えば6〜70個のアミノ酸残基、例えば6〜60個のアミノ酸残基、例えば6〜50個のアミノ酸残基、例えば6〜40個のアミノ酸残基、6〜30個のアミノ酸残基、例えば6〜20個のアミノ酸残基、例えば6〜10個のアミノ酸残基を含む二つの個別なペプチドフラグメントを含み得る。かくして、一つの実施態様では、化合物の二つの個別なペプチドフラグメントのいずれかのアミノ酸配列の長さは、変動し得る。もう一つの実施態様では、化合物のそれぞれのペプチドフラグメントのアミノ酸配列の長さは、同一であり得る。
本明細書では、“個別なペプチドフラグメント/配列”なる用語は、ペプチドフラグメント/配列(二つもしくはそれ以上)が、一つのアミノ酸配列の中でペプチド結合により隣接して結合されていないが、それらが、例えば下で考察されるリンカーのような、リンカーを通してお互いに結合され得ることを意味する。
したがって、化合物の個別なペプチド配列のいずれかは、3〜80個のアミノ酸残基、例えば3〜70個、例えば3〜60個、例えば3〜50個のアミノ酸残基、例えば3〜30個のアミノ酸残基、例えば3〜20個のアミノ酸残基、例えば3〜15個のアミノ酸残基、例えば3〜10個のアミノ酸残基から独立して成り得る。
もう一つの実施態様では、化合物の配列のいずれかは、4〜80個のアミノ酸残基、例えば4〜70個のアミノ酸残基、例えば4〜60個のアミノ酸残基、例えば4〜50個のアミノ酸残基、例えば4〜40個のアミノ酸残基、4〜30個のアミノ酸残基のような、例えば4〜20個のアミノ酸残基、例えば4〜15個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
さらなる実施態様では、配列は、5〜80個のアミノ酸残基、例えば5〜70個のアミノ酸残基、例えば5〜60個のアミノ酸残基、例えば5〜50個のアミノ酸残基、例えば5〜40個のアミノ酸残基、例えば5〜30個のアミノ酸残基、例えば5〜20個のアミノ酸残基、例えば5〜15個のアミノ酸残基、例えば5〜10個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
なおさらなる実施態様では、配列は、6〜80個のアミノ酸残基、例えば6〜70個のアミノ酸残基、例えば6〜60個のアミノ酸残基、例えば6〜50個のアミノ酸残基、例えば6〜40個のアミノ酸残基、例えば6〜30個のアミノ酸残基、例えば6〜20個のアミノ酸残基、例えば6〜15個のアミノ酸残基、例えば6〜10個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
本発明はまた、7〜80個のアミノ酸残基、例えば7〜70個のアミノ酸残基、例えば7〜60個のアミノ酸残基、例えば7〜50個のアミノ酸残基、例えば7〜40個のアミノ酸残基、例えば7〜30個のアミノ酸残基、例えば7〜20個のアミノ酸残基、例えば7〜15個のアミノ酸残基、例えば8、9、10、11、12、13、もしくは14個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る、二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物に関する。
個別な配列の長さは、8〜80個のアミノ酸残基、例えば8〜70個のアミノ酸残基、例えば8〜60個のアミノ酸残基、例えば8〜50個のアミノ酸残基、例えば8〜40個のアミノ酸残基、例えば8〜30個のアミノ酸残基、例えば8〜20個のアミノ酸残基でまたあり得る。もしくは、それは、9〜80個のアミノ酸残基、例えば9〜70個のアミノ酸残基のような、例えば9〜60個のアミノ酸残基、例えば9〜50個のアミノ酸残基、例えば9〜40個のアミノ酸残基、例えば9〜30個のアミノ酸残基、例えば9〜20個のアミノ酸残基であり得る。
それらのいずれかが、10〜70個のアミノ酸残基のような、10〜80個のアミノ酸残基、10〜50個のアミノ酸残基のような、例えば10〜60個のアミノ酸残基、10〜30個のアミノ酸残基のような、例えば10〜40個のアミノ酸残基、例えば10〜20個のアミノ酸残基の長さを有している、二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物は、本発明の範囲内にまたある。
一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列のいずれかが、15〜80個のアミノ酸残基、例えば15〜70個のアミノ酸残基、例えば15〜60個のアミノ酸残基、例えば15〜50個のアミノ酸残基、例えば15〜40個のアミノ酸残基、例えば15〜30個のアミノ酸残基、例えば15〜20個のアミノ酸残基の長さを独立して有する、二つの個別なアミノ酸配列を含む。
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、化合物の二つのアミノ酸配列のいずれかの最小の長さは、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25個のアミノ酸残基で独立してあり得て、最大のものは、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個のアミノ酸残基である。二つのアミノ酸配列のいずれかの長さが25〜36個のアミノ酸残基を持つ場合は、好ましい化合物でまたある。
さらにもう一つの好ましい実施態様では、化合物のペプチドフラグメントの長さは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15個のアミノ酸残基を独立して持ち得る。9〜20個のアミノ酸残基の範囲における個別なペプチドフラグメントの長さが最も好まれる。
本発明のなおもう一つの好ましい実施態様では、化合物の二つのペプチド配列の少なくとも一つは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子からなる群より選択されるポリペプチドの配列に由来する。
2.2 ペプチド配列の起源
かくして、化合物の二つのペプチド配列の少なくとも一つは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ならびに金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子および成長因子からなる群より選択されるポリペプチドの配列に由来することが好ましい。
かくして、化合物の二つのペプチド配列の少なくとも一つは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ならびに金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子および成長因子からなる群より選択されるポリペプチドの配列に由来することが好ましい。
本発明の著者等は、1)FGFRに結合するそれらの能力が、および2)受容体に対するそれらの結合部位の構造が、FGFRの天然の高親和性リガンド、FGF類と異なる、新しいクラスのFGFRリガンドを最近確認してきている。新しいFGFRリガンドは、受容体の既知のFGFR結合部位とまた異なる、FGFRの上の結合部位で受容体に低親和性結合をする能力がある。本発明にしたがって、新しい低親和性FGFRリガンドのFGFR結合部位は、上で考察したモチーフを含む配列を含んでいる。新しいクラスのFGFRリガンドは、FGFRの活性に独立している生物学的機能を有し得るタンパク質を、本発明にしたがって含む。さらに、新しい低親和性FGFRリガンドは、1)そのFGFRを結合して活性化することにより実行される機能、および2)他の機構により実行される機能を有し得る。機能(1)および機能(2)は、異なる生物学的意義を有し得る。受容体への結合の比較的低親和性により、本発明にしたがう新しいリガンドは、FGFにより既に開始されてきている受容体活性化を調整する能力が無い。本発明にしたがって、新しいグループの低親和性FGFRリガンドは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子として当分野で公知である分子を含んでいる。
本発明にしたがって、細胞接着分子は、
―神経細胞接着分子(NCAM)(Swiss-Prot受託番号:P13591、P13595−01、P13595)、
―神経細胞接着分子L1(Swiss-Prot受託番号:Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
―神経細胞接着分子−2(NCAM−2)(Swiss-Prot受託番号:P36355)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ng−CAM)(Swiss-Prot受託番号:Q03696;Q90933)、
―神経細胞接着分子CALL(Swiss-Prot受託番号:O00533)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号:P91767、P20241)、
―Nr−CAM(HBRAVO、NRCAM、NR−CAM12)(Swiss-Prot受託番号:Q92823、O15179、Q9QVN3)、
―アクソニン−1/TAG−1(Swiss-Prot受託番号:Q02246、P22063、P28685)、
―軸索に関連する細胞接着分子(AxCAM)(NCBI Ass. 番号:NP_031544.1;Swiss-Prot受託番号:Q8TC35)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(MAG)(Swiss-Prot受託番号:P20917)、
―神経細胞接着分子BIG−1(Swiss-Prot受託番号:Q62682)、
―神経細胞接着分子BIG−2(Swiss-Prot受託番号:Q62845)、
―ファシクリン(FAS−2)(Swiss-Prot受託番号:P22648)、
―神経細胞接着分子HNB−3/NB−3(Swiss-Prot受託番号:Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
―神経細胞接着分子HNB−2/NB−2(Swiss-Prot受託番号:O94779、P07409、P97527)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号:Q9VW71)、
―接合部接着分子−1(JAM−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JKD5、O88792)、
―神経細胞接着F3/F11(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号:Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号:Q90924、Q91Z60;O42414)、
―B−リンパ球細胞接着分子CD22(Swiss-Prot受託番号:Q9R094、P20273)、
―ネオゲニン(NEO1)(Swiss-Prot受託番号:Q92859、P97603、Q90610、P97798)、
―細胞内細胞接着分子−5(ICAM−5/テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号:Q8TAM9、Q60625)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−12(ガレクチン−12)(Swiss-Prot受託番号:Q91VD1、Q9JKX2、Q9NZ03)、
―ガラクトース結合レクチン−4(ガレクチン−4)(Swiss-Prot受託番号:Q8K419;P38552)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
―神経細胞接着分子(NCAM)(Swiss-Prot受託番号:P13591、P13595−01、P13595)、
―神経細胞接着分子L1(Swiss-Prot受託番号:Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
―神経細胞接着分子−2(NCAM−2)(Swiss-Prot受託番号:P36355)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ng−CAM)(Swiss-Prot受託番号:Q03696;Q90933)、
―神経細胞接着分子CALL(Swiss-Prot受託番号:O00533)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号:P91767、P20241)、
―Nr−CAM(HBRAVO、NRCAM、NR−CAM12)(Swiss-Prot受託番号:Q92823、O15179、Q9QVN3)、
―アクソニン−1/TAG−1(Swiss-Prot受託番号:Q02246、P22063、P28685)、
―軸索に関連する細胞接着分子(AxCAM)(NCBI Ass. 番号:NP_031544.1;Swiss-Prot受託番号:Q8TC35)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(MAG)(Swiss-Prot受託番号:P20917)、
―神経細胞接着分子BIG−1(Swiss-Prot受託番号:Q62682)、
―神経細胞接着分子BIG−2(Swiss-Prot受託番号:Q62845)、
―ファシクリン(FAS−2)(Swiss-Prot受託番号:P22648)、
―神経細胞接着分子HNB−3/NB−3(Swiss-Prot受託番号:Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
―神経細胞接着分子HNB−2/NB−2(Swiss-Prot受託番号:O94779、P07409、P97527)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号:Q9VW71)、
―接合部接着分子−1(JAM−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JKD5、O88792)、
―神経細胞接着F3/F11(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号:Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号:Q90924、Q91Z60;O42414)、
―B−リンパ球細胞接着分子CD22(Swiss-Prot受託番号:Q9R094、P20273)、
―ネオゲニン(NEO1)(Swiss-Prot受託番号:Q92859、P97603、Q90610、P97798)、
―細胞内細胞接着分子−5(ICAM−5/テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号:Q8TAM9、Q60625)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−12(ガレクチン−12)(Swiss-Prot受託番号:Q91VD1、Q9JKX2、Q9NZ03)、
―ガラクトース結合レクチン−4(ガレクチン−4)(Swiss-Prot受託番号:Q8K419;P38552)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
機能性の細胞の表面受容体は、
―繊維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QZM7、Q99AVV7、Q9UD50、Q63827)、
―繊維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss-Prot受託番号:Q96KM2、P21802、Q63241)、
―繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)(Swiss-Prot受託番号:Q95M13、AF487554、Q99052)、
―繊維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss-Prot受託番号:Q91742)、
―2型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(NTRKT−2)(Swiss-Prot受託番号:Q8WXJ5)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (LAR−PTPRF)(Swiss-Prot受託番号:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8、P10586)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
―タンパク質−S型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRS)(Swiss-Prot受託番号:Q64699、Q13332、O75870)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(R−PTP−カッパ)(Swiss-Prot受託番号:Q15262)、
―タンパク質−D型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRD)(Swiss-Prot受託番号:Q8WX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、
―A型エフリン受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss-Prot受託番号:O09127、P29322)、
―A型エフリン受容体3(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ETK−1/CEK4)(Swiss-Prot受託番号:P29318)、
―A型エフリン受容体2(Swiss-Prot受託番号:Q8N3Z2)、
―インスリン受容体(IR)(Swiss-Prot受託番号:Q9PWN6)、
―インスリン様受容体成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、
―インスリン関連受容体(IRR)(Swiss-Prot受託番号:P14616)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss-Prot受託番号:06805、P35590、Q06806)、
―ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss-Prot受託番号:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ3サブユニット(CHRNA3)(Swiss-Prot受託番号:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ6サブユニット(Swiss-Prot受託番号:Q15825、Q9R0W9)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(PDGFRB)(Swiss-Prot受託番号:Q8R406、Q05030)、
―インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss-Prot受託番号:Q00560)、
―インターロイキン−23受容体(IL−23R)(Swiss-Prot受託番号:AF461422)、
―IL−3、IL5およびGmCsfのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号:P32927)、
―サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JM58)、
―クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot受託番号:Q9UHH5)、
―ネトリン−1受容体DCC(Swiss-Prot受託番号:P43146)、
―白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss-Prot受託番号:Q96PJ6、Q96KM2)、
―マクロファージ捕捉剤受容体2(MSR2)(Swiss-Prot受託番号:Q91YK7)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss-Prot受託番号:Q99062)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
―繊維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QZM7、Q99AVV7、Q9UD50、Q63827)、
―繊維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss-Prot受託番号:Q96KM2、P21802、Q63241)、
―繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)(Swiss-Prot受託番号:Q95M13、AF487554、Q99052)、
―繊維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss-Prot受託番号:Q91742)、
―2型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(NTRKT−2)(Swiss-Prot受託番号:Q8WXJ5)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (LAR−PTPRF)(Swiss-Prot受託番号:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8、P10586)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
―タンパク質−S型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRS)(Swiss-Prot受託番号:Q64699、Q13332、O75870)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(R−PTP−カッパ)(Swiss-Prot受託番号:Q15262)、
―タンパク質−D型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRD)(Swiss-Prot受託番号:Q8WX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、
―A型エフリン受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss-Prot受託番号:O09127、P29322)、
―A型エフリン受容体3(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ETK−1/CEK4)(Swiss-Prot受託番号:P29318)、
―A型エフリン受容体2(Swiss-Prot受託番号:Q8N3Z2)、
―インスリン受容体(IR)(Swiss-Prot受託番号:Q9PWN6)、
―インスリン様受容体成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、
―インスリン関連受容体(IRR)(Swiss-Prot受託番号:P14616)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss-Prot受託番号:06805、P35590、Q06806)、
―ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss-Prot受託番号:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ3サブユニット(CHRNA3)(Swiss-Prot受託番号:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ6サブユニット(Swiss-Prot受託番号:Q15825、Q9R0W9)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(PDGFRB)(Swiss-Prot受託番号:Q8R406、Q05030)、
―インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss-Prot受託番号:Q00560)、
―インターロイキン−23受容体(IL−23R)(Swiss-Prot受託番号:AF461422)、
―IL−3、IL5およびGmCsfのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号:P32927)、
―サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JM58)、
―クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot受託番号:Q9UHH5)、
―ネトリン−1受容体DCC(Swiss-Prot受託番号:P43146)、
―白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss-Prot受託番号:Q96PJ6、Q96KM2)、
―マクロファージ捕捉剤受容体2(MSR2)(Swiss-Prot受託番号:Q91YK7)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss-Prot受託番号:Q99062)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
本発明にしたがうヘパラン硫酸プロテオグリカンはパーレカン(Swiss-Prot受託番号:P98160)、またはフラグメント、もしくはその変異体である。
金属プロテアーゼは、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:Q05910)、
―ADAM−19(Swiss-Prot受託番号:Q9H013、O35674)、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:P78325)、
―ADAM−12(Swiss-Prot受託番号:O43184、Q61824)、
―ADAM−28(Swiss-Prot受託番号:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、
―ADAM−33前駆体(Swiss-Prot受託番号:Q8R533、Q923W9)、
―ADAM−9(Swiss-Prot受託番号:Q13433、Q61072)、
―ADAM−7(Swiss-Prot受託番号:Q9H2U9、O35227、Q63180)、
―ADAM−1Aフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号:Q8R533)、
―ADAM−15(Swiss-Prot受託番号:Q9QYV0、O88839、Q13444)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss-Prot受託番号:AF163291)、
―金属プロテイナーゼ1(Swiss-Prot受託番号:O95204、Q9BSI6)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:Q05910)、
―ADAM−19(Swiss-Prot受託番号:Q9H013、O35674)、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:P78325)、
―ADAM−12(Swiss-Prot受託番号:O43184、Q61824)、
―ADAM−28(Swiss-Prot受託番号:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、
―ADAM−33前駆体(Swiss-Prot受託番号:Q8R533、Q923W9)、
―ADAM−9(Swiss-Prot受託番号:Q13433、Q61072)、
―ADAM−7(Swiss-Prot受託番号:Q9H2U9、O35227、Q63180)、
―ADAM−1Aフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号:Q8R533)、
―ADAM−15(Swiss-Prot受託番号:Q9QYV0、O88839、Q13444)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss-Prot受託番号:AF163291)、
―金属プロテイナーゼ1(Swiss-Prot受託番号:O95204、Q9BSI6)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
細胞外マトリックス分子は、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号:Q63870)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号:Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、O95609、P11276)、もしくは、
―テネイシン−R(Swiss-Prot受託番号:Q15568、O00531、Q90995、P10039)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号:Q63870)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号:Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、O95609、P11276)、もしくは、
―テネイシン−R(Swiss-Prot受託番号:Q15568、O00531、Q90995、P10039)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
本発明にしたがう成長因子は、サイトカイン様因子−1(CLF−1)(Swiss-Prot受託番号:O75462)、またはフラグメント、もしくはその変異体である。
本明細書における用語“フラグメント”は、予め決められたタンパク質/ポリペプチドアミノ酸配列の長さの約25〜99%であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、当該ポリペプチドは、上の群から選択される予め決められたポリペプチドの機能性同属体である。
本明細書における用語“変異体”は、i)予め決められたポリペプチドの配列に50〜100%相同である、および/もしくはii)アミノ酸残基の種々の翻訳後修飾、例えばアミノ酸残基のリン酸化、アシル化、グリコシル化のような、他の化学的部分を含む、ならびに/またはiii)もう一つの生物分子(複数を含む)、例えば、ポリペプチド(複数を含む)、脂質(複数を含む)もしくは炭水化物(複数を含む)に物理的に関連するか、または共有的に結合するように、化学的に結合する、アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味して、当該ポリペプチドは上の群から選択される予め決められたポリペプチドの機能性同族体である。用語“物理的に関連する”は、分子が疎水性のもしくは静電的な相互作用を介して関連することを意味する。
予め決められたポリペプチドの“機能性同族体”なる用語により、予め決められたポリペプチドの一つもしくはそれ以上の生物機能、好ましい実施態様ではFGFRに結合して活性化する機構により実施される生物機能(複数を含む)を有する能力のある分子が本明細書において意味される。
上で考察されてきているように、本発明の好ましい機能性の細胞の表面受容体は、繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR類)のファミリーから選択される受容体である。本発明にしたがう上の分子は、FGF類の既知のFGFR高親和性結合部位と異なる、FGFRに対する別の低親和性結合部位を含む。
上の分子の低親和性FGFR結合部位は、それが、配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴としている。配列EVYVVAENQQGKSKAは、神経細胞接着分子(NCAM)に由来して、NCAMのFGLペプチドとして先行技術で既知である。一つのアミノ酸配列のもう一つのアミノ酸配列との相同性は、二つの照合配列の中で同一のアミノ酸の百分率として規定される。アミノ酸配列の間の相同性は、BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85、もしくはBLOSUM90のような周知のアルゴリズムを用いて計算され得る。
もう一つの実施態様では、上の分子のFGFR結合部位は、配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に比較して、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。そのような配列は、予め決められた配列、例えば配列番号1、の変異体としての適用により規定される。正のアミノ酸一致は、二つの比較される配列の中で同一の位置を有するアミノ酸の物理的および/もしくは化学的性質により規定される同一性もしくは類似性として規定される。本発明の好ましい正のアミノ酸一致は、K対R、E対D、L対M、Q対E、I対V、I対L、A対S、Y対W、K対Q、S対T、N対SおよびQ対Rである。
さらにもう一つの実施態様では、FGFRの新しい低親和性結合リガンドのFGFR結合部位は、
i)配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の相同性を有するか、もしくは
ii)配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に比較して、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の正のアミノ酸一致を有する
、配列のフラグメントもしくは同族体を含み得る。
i)配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の相同性を有するか、もしくは
ii)配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)に比較して、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、の正のアミノ酸一致を有する
、配列のフラグメントもしくは同族体を含み得る。
さらになおもう一つの実施態様では、本発明の新しい低親和性FGFRリガンドのFGFR結合部位は、特異的な3D特徴により特徴づけされ得る、即ち、それは、一つもしくはそれ以上の“鎖−ループ−鎖”構造モチーフから本質的に成り得る。それは、上で考察される配列の好ましい特徴である。本発明にしたがって、鎖−ループ−鎖構造は、式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列の好ましい3D構造である。
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列の好ましい3D構造である。
本発明にしたがって、二つの個別なアミノ酸配列の少なくとも一つは好ましくは、上の確認されるモチーフの少なくとも一つを含んで、上の分子のいずれかに好ましくは由来する。本発明にしたがうそのような配列は、配列番号1〜146として確認される配列のいずれかから選択され得る。或る実施態様では、二つの個別な配列の一つは、下で確認されるようにグループ1〜12の配列の一つのグループから選択され得て、二つの個別な配列のもう一つは、配列のもう一つのグループから選択され得る。他の実施態様では、配列は、同一つのグループの配列から選択され得る。
かくして、一つの実施態様では、配列のいずれかの化合物の一つのアミノ酸配列は、グループ1:
EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)、
NIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)、
ATNRQGKVKAFAHL(配列番号3)、
RYVELYVVADSQEFQK(配列番号4)、
VAENSRGKNVAKG(配列番号5)、
GEYWCVAENQYGQR(配列番号6)、
RLAALNGKGLGEIS(配列番号7)、
KYIAENMKAQNVAKEI(配列番号8)、
TIMGLKPETRYAVR(配列番号9)、
の配列から独立して選択され得る。
EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)、
NIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)、
ATNRQGKVKAFAHL(配列番号3)、
RYVELYVVADSQEFQK(配列番号4)、
VAENSRGKNVAKG(配列番号5)、
GEYWCVAENQYGQR(配列番号6)、
RLAALNGKGLGEIS(配列番号7)、
KYIAENMKAQNVAKEI(配列番号8)、
TIMGLKPETRYAVR(配列番号9)、
の配列から独立して選択され得る。
もう一つの実施態様では、少なくとも二つのペプチド配列の少なくとも一つは、配列、
NMGIWVQAENALG(配列番号11)、
IWVQAENMLG(配列番号12)、
EIWVEATNRLG(配列番号13)、
VWVQAANALG(配列番号14)、
EVWIEKDPAKGRI(配列番号15)、
ATNKGGEVKKNGHL(配列番号16)、
からなるグループ2から選択され得る。
NMGIWVQAENALG(配列番号11)、
IWVQAENMLG(配列番号12)、
EIWVEATNRLG(配列番号13)、
VWVQAANALG(配列番号14)、
EVWIEKDPAKGRI(配列番号15)、
ATNKGGEVKKNGHL(配列番号16)、
からなるグループ2から選択され得る。
さらにもう一つの実施態様では、少なくとも二つのペプチド配列の少なくとも一つは、配列、
KYVELYLVADYLEFQK(配列番号17)、
RYVELYVVVDNAEFQ(配列番号18)、
KYVELVIVADNREFQR(配列番号19)、
KYIEYYLVLDNGEFKR(配列番号20)、
RYLELYIVADHTLF(配列番号21)、
KYVELFIVADDTVYRR(配列番号24)、
KFIELFVVADEYVYRR(配列番号25)、
KIVEKVIVADNSEVRK(配列番号26)、
VELVIVADHSEAQK (配列番号27)、
からなるグループ3から選択され得る。
KYVELYLVADYLEFQK(配列番号17)、
RYVELYVVVDNAEFQ(配列番号18)、
KYVELVIVADNREFQR(配列番号19)、
KYIEYYLVLDNGEFKR(配列番号20)、
RYLELYIVADHTLF(配列番号21)、
KYVELFIVADDTVYRR(配列番号24)、
KFIELFVVADEYVYRR(配列番号25)、
KIVEKVIVADNSEVRK(配列番号26)、
VELVIVADHSEAQK (配列番号27)、
からなるグループ3から選択され得る。
もう一つの実施態様は、配列、
VAENSRGKNIAKG(配列番号28)、
IAENSRGKNVARG(配列番号29)、
AENSRGKNSFRG(配列番号30)、
IASNLRGRNLAKG(配列番号31)、
IPENSLGKTYAKG(配列番号32)、
IAENMKAQNEAK(配列番号33)、
からなるグループ4から選択される配列に関与する。
VAENSRGKNIAKG(配列番号28)、
IAENSRGKNVARG(配列番号29)、
AENSRGKNSFRG(配列番号30)、
IASNLRGRNLAKG(配列番号31)、
IPENSLGKTYAKG(配列番号32)、
IAENMKAQNEAK(配列番号33)、
からなるグループ4から選択される配列に関与する。
さらにもう一つの実施態様では、配列は、配列、
GEYWCVAKNRVGQ(配列番号35)、
GSYTCVAENMVGK(配列番号36)、
GKYVCVGTNMVGER(配列番号37)、
GNYTCVVENEYG(配列番号38)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号39)、
QYYCVAENGYG(配列番号40)、
GEYYQEAEQNGYG(配列番号41)、
GNYTCLVENEYG(配列番号42)、
GMYQCLAENAYG(配列番号43)、
GMYQCAENTHG(配列番号44)、
GIYYCLASNNYG(配列番号45)、
GGYYCTADNSYG(配列番号46)、
GEYQCFARNDYG(配列番号47)、
GEYFCLASNKMG(配列番号48)、
GEYQCFARNKFG(配列番号49)、
GEYFCLASNKMG(配列番号50)、
GGYYCTADNNYG(配列番号51)、
GNYSCEAENAWGTK(配列番号52)、
GEYTCLAENSLG(配列番号53)、
GEYECVAENGRLG(配列番号54)、
GNYTCVVENKFGR(配列番号55)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号56)、
GEYFCVASNPIG(配列番号57)、
EYTCIANNQAGE(配列番号58)、
GMYQCVAENKHLG(配列番号59)、
GEYMCTASNTIGQ(配列番号60)、
EYVCIAENKAGEQ(配列番号61)、
GDYTLIAKNEYGK(配列番号62)、
GFYQCVAENEAG(配列番号63)、
GKYECVATNSAGTR(配列番号64)、
GEYFCVYNNSLG(配列番号65)、
GEYECAATNAHGR(配列番号66)、
GAYWCQGTNSVGK(配列番号67)、
GTYSCVAENILG(配列番号68)、
からなるグループ5から選択され得る。
GEYWCVAKNRVGQ(配列番号35)、
GSYTCVAENMVGK(配列番号36)、
GKYVCVGTNMVGER(配列番号37)、
GNYTCVVENEYG(配列番号38)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号39)、
QYYCVAENGYG(配列番号40)、
GEYYQEAEQNGYG(配列番号41)、
GNYTCLVENEYG(配列番号42)、
GMYQCLAENAYG(配列番号43)、
GMYQCAENTHG(配列番号44)、
GIYYCLASNNYG(配列番号45)、
GGYYCTADNSYG(配列番号46)、
GEYQCFARNDYG(配列番号47)、
GEYFCLASNKMG(配列番号48)、
GEYQCFARNKFG(配列番号49)、
GEYFCLASNKMG(配列番号50)、
GGYYCTADNNYG(配列番号51)、
GNYSCEAENAWGTK(配列番号52)、
GEYTCLAENSLG(配列番号53)、
GEYECVAENGRLG(配列番号54)、
GNYTCVVENKFGR(配列番号55)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号56)、
GEYFCVASNPIG(配列番号57)、
EYTCIANNQAGE(配列番号58)、
GMYQCVAENKHLG(配列番号59)、
GEYMCTASNTIGQ(配列番号60)、
EYVCIAENKAGEQ(配列番号61)、
GDYTLIAKNEYGK(配列番号62)、
GFYQCVAENEAG(配列番号63)、
GKYECVATNSAGTR(配列番号64)、
GEYFCVYNNSLG(配列番号65)、
GEYECAATNAHGR(配列番号66)、
GAYWCQGTNSVGK(配列番号67)、
GTYSCVAENILG(配列番号68)、
からなるグループ5から選択され得る。
さらにもう一つの実施態様では、一つもしくは両方の配列は、グループ6:
RVAAVNGKGQGDYS(配列番号69)、
RVAAINGCGIGPFS(配列番号70)、
AVLNGKGLG(配列番号71)、
RLAAKNRAGLGE(配列番号73)、
RLGVVTGKDLGEI(配列番号74)、
から選択される。
RVAAVNGKGQGDYS(配列番号69)、
RVAAINGCGIGPFS(配列番号70)、
AVLNGKGLG(配列番号71)、
RLAAKNRAGLGE(配列番号73)、
RLGVVTGKDLGEI(配列番号74)、
から選択される。
さらに、もう一つの実施態様では、配列は、グループ7:
TVTGLKPETSYMVK(配列番号75)、
TLTGLQPSTRYRV(配列番号77)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号78)、
TLQGLRPETAYELR(配列番号79)、
TLRGLRPETAYELR(配列番号80)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号81)、
TISGLKPDTTY(配列番号83)、
TLQGLKPDTAY(配列番号84)、
LRGLKPWTQYAV(配列番号85)、
IDGLEPDTEYIVR(配列番号86)、
LQGLKPWTQYAI(配列番号87)、
TITGLEPGTEYTIQ(配列番号88)、
GLKPWTQYAV(配列番号89)、
TLASLKPWTQYAV(配列番号90)、
LMGLQPATEYIV(配列番号91)、
から選択され得る。
TVTGLKPETSYMVK(配列番号75)、
TLTGLQPSTRYRV(配列番号77)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号78)、
TLQGLRPETAYELR(配列番号79)、
TLRGLRPETAYELR(配列番号80)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号81)、
TISGLKPDTTY(配列番号83)、
TLQGLKPDTAY(配列番号84)、
LRGLKPWTQYAV(配列番号85)、
IDGLEPDTEYIVR(配列番号86)、
LQGLKPWTQYAI(配列番号87)、
TITGLEPGTEYTIQ(配列番号88)、
GLKPWTQYAV(配列番号89)、
TLASLKPWTQYAV(配列番号90)、
LMGLQPATEYIV(配列番号91)、
から選択され得る。
他の実施態様では、本発明は、グループの8、9、10もしくは11の配列を含む化合物に関与して、
そこでは、グループ8は、配列、
KGMGPMSEAVQFRT(配列番号92)、
TLTGLKPDTTYDVK(配列番号93)、
ISGLQPETSYSL(配列番号94)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号95)、
TISGLTPETTYSI(配列番号96)、
GNYSCLAENRLGR(配列番号97)、
GNYTCVVENRVG(配列番号98)、
NGVLTGYVLRY(配列番号101)、
NGVLTGYNLRY(配列番号102)、
NGNLTGYLLQY(配列番号103)、
VDENGVLTGYKIYY(配列番号104)、
THNGALVGYSVRY(配列番号105)、
NGILTEYILKY(配列番号106)、
NGILIGYTLRY(配列番号107)、
THSGQITGYKIRY(配列番号108)、
NGKITGYIIYY(配列番号109)、
NGILTEYTLKY(配列番号111)、
LDPNGIITQYEISY(配列番号112)、
NGKITGYIIYY (配列番号113)、
の配列からなっていて、
そこでは、グループ8は、配列、
KGMGPMSEAVQFRT(配列番号92)、
TLTGLKPDTTYDVK(配列番号93)、
ISGLQPETSYSL(配列番号94)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号95)、
TISGLTPETTYSI(配列番号96)、
GNYSCLAENRLGR(配列番号97)、
GNYTCVVENRVG(配列番号98)、
NGVLTGYVLRY(配列番号101)、
NGVLTGYNLRY(配列番号102)、
NGNLTGYLLQY(配列番号103)、
VDENGVLTGYKIYY(配列番号104)、
THNGALVGYSVRY(配列番号105)、
NGILTEYILKY(配列番号106)、
NGILIGYTLRY(配列番号107)、
THSGQITGYKIRY(配列番号108)、
NGKITGYIIYY(配列番号109)、
NGILTEYTLKY(配列番号111)、
LDPNGIITQYEISY(配列番号112)、
NGKITGYIIYY (配列番号113)、
の配列からなっていて、
グループ9は、配列、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号114)、
HLTVRAYNGAGYGP(配列番号115)、
HLSVKAYNSAGTGPS(配列番号116)、
HLAVKAYNSAGTGPS(配列番号117)、
NLEVRAFNSAGDGP(配列番号118)、
HLTVLAYNSKGAGP(配列番号119)、
LRVLVFNGRGDGP(配列番号120)、
HIDVSAFNSAGYGP(配列番号121)、
HLAVELFNGR(配列番号122)、
LELQSINFLGGQPA(配列番号123)、
HFTVRAYNGAGYGP(配列番号124)、
HLEVQAFNGRGSQPA(配列番号125)、
の配列からなっていて、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号114)、
HLTVRAYNGAGYGP(配列番号115)、
HLSVKAYNSAGTGPS(配列番号116)、
HLAVKAYNSAGTGPS(配列番号117)、
NLEVRAFNSAGDGP(配列番号118)、
HLTVLAYNSKGAGP(配列番号119)、
LRVLVFNGRGDGP(配列番号120)、
HIDVSAFNSAGYGP(配列番号121)、
HLAVELFNGR(配列番号122)、
LELQSINFLGGQPA(配列番号123)、
HFTVRAYNGAGYGP(配列番号124)、
HLEVQAFNGRGSQPA(配列番号125)、
の配列からなっていて、
グループ10は、配列、
VIADQPTFVKYLIK(配列番号126)、
TIKGLRPGVVYEGQ(配列番号127)、
TLDDLAPDTTYLVQ(配列番号129)、
TVSDVTPHAIYTVR(配列番号130)、
IIRGLNASTRYLFR(配列番号131)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号132)、
TLTGLKPGTEYEVR(配列番号133)、
RVTGLTPKKTYEFR(配列番号135)、
LTGLKPGTEYEFR(配列番号136)、
の配列からなっていて、
VIADQPTFVKYLIK(配列番号126)、
TIKGLRPGVVYEGQ(配列番号127)、
TLDDLAPDTTYLVQ(配列番号129)、
TVSDVTPHAIYTVR(配列番号130)、
IIRGLNASTRYLFR(配列番号131)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号132)、
TLTGLKPGTEYEVR(配列番号133)、
RVTGLTPKKTYEFR(配列番号135)、
LTGLKPGTEYEFR(配列番号136)、
の配列からなっていて、
グループ11は、配列、
EVRVQAVNGGGNGPP(配列番号137)、
LIKVVAINDRGE(配列番号138)、
VVSIIAVNGREE(配列番号139)、
VVSVYAQNQNGE(配列番号140)、
TISLVAEKGRHK(配列番号141)、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号142)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号143)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号144)、
EFRVRAVNGAGEG(配列番号145)、
の配列からなっている。
EVRVQAVNGGGNGPP(配列番号137)、
LIKVVAINDRGE(配列番号138)、
VVSIIAVNGREE(配列番号139)、
VVSVYAQNQNGE(配列番号140)、
TISLVAEKGRHK(配列番号141)、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号142)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号143)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号144)、
EFRVRAVNGAGEG(配列番号145)、
の配列からなっている。
或る実施態様では、化合物は、グループ12:
KYVEMFVVVNHQRFQ(配列番号22)、
RYVELFIVVDKERY(配列番号23)、
ALNGQGLGATS(配列番号72)、
TLTGLKPSTRYRI(配列番号76)、
TVSGLKPGTRY(配列番号82)、
GTYHCVATNAHG(配列番号99)、
LSHNGVLTGYLLSY(配列番号100)、
LSHNGIFTLY(配列番号110)、
TLTELSPSTQYTVK(配列番号128)、
GPEHLMPSSTYVAR(配列番号134)、
VARVRTRLAPGSRLS(配列番号146)、
もしくは
QFIAENMKSHNETKEV(配列番号34)、
の配列から選択される配列を含み得る。
KYVEMFVVVNHQRFQ(配列番号22)、
RYVELFIVVDKERY(配列番号23)、
ALNGQGLGATS(配列番号72)、
TLTGLKPSTRYRI(配列番号76)、
TVSGLKPGTRY(配列番号82)、
GTYHCVATNAHG(配列番号99)、
LSHNGVLTGYLLSY(配列番号100)、
LSHNGIFTLY(配列番号110)、
TLTELSPSTQYTVK(配列番号128)、
GPEHLMPSSTYVAR(配列番号134)、
VARVRTRLAPGSRLS(配列番号146)、
もしくは
QFIAENMKSHNETKEV(配列番号34)、
の配列から選択される配列を含み得る。
本発明はまた、配列番号1〜146に示される予め決められた配列の長さの少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%を有する上のペプチド配列のフラグメントに関して、そこではフラグメントおよび予め決められた配列の間のアミノ酸配列相同性は100%である。本明細書における変異体は、配列番号1〜146から選択される配列に、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、の相同性を有するアミノ酸配列、もしくは配列番号1〜146から選択される配列に比較して、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列、として規定される。正のアミノ酸一致は、二つの比較される配列の中で同一の位置を有するアミノ酸の物理的および/もしくは化学的性質により規定される同一性もしくは類似性により規定される。本発明の好ましい正のアミノ酸一致は、K対R、E対D、L対M、Q対E、I対V、I対L、A対S、Y対W、K対Q、S対T、N対SおよびQ対Rである。一つのアミノ酸配列のもう一つのアミノ酸配列との相同性は、二つの照合配列の中で同一のアミノ酸の百分率として規定される。
本明細書における同族体は、例えば三次元構造のような、予め決められた配列の物理的性質の幾らかもしくは例えばもう一つの分子と、特に受容体分子と、相互作用する能力のような、機能性性質の幾らかを残してきている配列番号1〜146に示される配列のいずれかに、60%以下でかつ19%以上、例えば50〜59%、例えば55%、例えば40〜49%、例えば45%、例えば30〜39%、例えば35%、例えば20〜29%、例えば25%の相同性を有するアミノ酸配列として規定される。本明細書における同族体の変異体は、配列番号1〜146から選択される配列のいずれかの同族体に比較して、少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列として規定される。正のアミノ酸一致の好ましい実施態様は、上記の通りである。本発明は、予め決められた配列が下で規定される細胞の表面受容体と相互作用する能力を残す、フラグメント、変異体および同族体に関与する。
本発明の一つの実施態様では、選択される配列はEVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)である。もう一つの実施態様では、好ましい配列はNIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)である。
本発明にしたがって、化合物は、上の配列(配列番号1〜146)のいずれかから選択される少なくとも二つの異なる個別なペプチド配列を含み得る。なお、化合物は、上の配列のいずれかから選択される同一のアミノ酸配列を有する二つの個別な配列を含み得る。
一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列がEVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)である、二つの同一の個別なペプチド配列を含む。もう一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列がNIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)である、二つの同一の個別なペプチド配列を含む。さらにもう一つの好ましい実施態様では、化合物は、一つの配列がEVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)であって、他のものがNIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)である、二つの異なる個別なペプチド配列を含む。他の好ましい実施態様は、配列番号1もしくは2のフラグメント、変異体もしくは同族体を含む二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物を包含して、そこでは当該フラグメント、変異体および同族体は、上で規定されるようにである。好ましい実施態様では、配列番号1のフラグメント、変異体もしくは同族体は、上で確認されるグループの1、6、11および12の配列番号の3〜9、69〜74、100、125および137〜146の配列から選択され、そして配列番号2のフラグメント、変異体もしくは同族体は、上で確認されるグループの7、9および10の配列番号の75〜91、114〜123、100、126〜132の配列から選択される。
一つの実施態様では、化合物の二つの個別なアミノ酸配列の少なくとも一つは、一つのペプチド鎖の中でペプチド結合により共−接合される配列番号1〜146の二つもしくはそれ以上の隣接するペプチド配列を含み、本質的に含み、またはから成る。他の実施態様では、共−接合されるペプチド配列は、例えば一つのペプチド鎖の中で2〜5回反復される配列番号1、もしくは例えばペプチド鎖の中で2〜5回反復される配列番号2、または
例えばペプチド鎖の中で2〜5回反復されて、それにより同一のモノマーから成るオリゴマー(多量体)を形成する配列番号3〜146のいずれかのように、同一であり得る。他の実施態様では、オリゴマーを形成するペプチドフラグメントのモノマーは、例えば、それらの一つが配列番号1のそして他のものが配列番号2のアミノ酸配列か、もしくは配列番号3〜146で示される配列のいずれかを有している、二つのモノマーから成るオリゴマー(ダイマー)の中でのように、アミノ酸配列の中で異なり得る。本発明にしたがって、オリゴマー(多量体)は、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の反復される配列(モノマー)から成り得る。
例えばペプチド鎖の中で2〜5回反復されて、それにより同一のモノマーから成るオリゴマー(多量体)を形成する配列番号3〜146のいずれかのように、同一であり得る。他の実施態様では、オリゴマーを形成するペプチドフラグメントのモノマーは、例えば、それらの一つが配列番号1のそして他のものが配列番号2のアミノ酸配列か、もしくは配列番号3〜146で示される配列のいずれかを有している、二つのモノマーから成るオリゴマー(ダイマー)の中でのように、アミノ酸配列の中で異なり得る。本発明にしたがって、オリゴマー(多量体)は、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の反復される配列(モノマー)から成り得る。
当該個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号1〜146で確認される配列のいずれかの単一のコピーである、リンカーを通してお互いに接合される二つの個別なペプチド配列から成る化合物は、本発明の好ましい化合物である。いっそうさらに好ましいのは、二つの個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号1の配列である、化合物、もしくは二つの個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号2の配列である、化合物である。
化合物の中の個別なペプチド配列の配向は、NからCへの、CからNへのもしくは混合のいずれかであり得る。“NからCへの配向”なる用語は、二つの個別な配列が、構造(COOH)ペプチド配列(NH2)−リンカー−(NH2)ペプチド配列(COOH)の化合物のような、それらのN−末端アミノ酸残基を通してリンカーへ接合されることを意味する。“CからNへの配向”なる用語は、二つの予め決められた配列が、構造(NH2)ペプチド配列(COOH)−リンカー−(COOH)ペプチド配列(NH2)の化合物のような、それらのC−末端アミノ酸残基を通してリンカーへ接合されることを意味する。用語“混合配向”は、二つの予め決められた配列が、例えば、タイプ:(NH2)ペプチド配列(COOH)−リンカー−(NH2)ペプチド配列(COOH)の化合物として、そのN−末端アミノ酸残基を通しての一つのペプチド配列およびそのC−末端アミノ酸残基を通してのもう一つのように、それらのC−末端アミノ酸残基もしくはN−末端のいずれかを通してリンカーへ接合されることを意味する。
1.3 リンカー
本発明にしたがって、化合物の二つの個別なペプチド配列は、リンカーにより共−接合されている。本発明にしたがうリンカー分子は、アキラルなジ−、トリ−もしくはテトラカルボン酸から選択されて、当該酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、
Xは、HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、AおよびBは独立して、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるかか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
本発明にしたがって、化合物の二つの個別なペプチド配列は、リンカーにより共−接合されている。本発明にしたがうリンカー分子は、アキラルなジ−、トリ−もしくはテトラカルボン酸から選択されて、当該酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、
Xは、HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、AおよびBは独立して、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるかか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
用語のC1〜10アルキルの下では、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、およびtertブチルが意味される。
用語のC2〜10アルケニルの下では、2〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびtertブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語のC2〜10アルケニルの下では、2〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびtertブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語の芳香族部分の下では、フェニルが意味される。
“AおよびBは、環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
“AおよびBは、環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
本発明にしたがって、上記のアミノ酸配列の二つもしくはそれ以上を含む二つの個別なペプチド配列は、これらの二つのペプチド配列の一つが、上で規定される分子から選択されるリンカー分子の二つのカルボン酸基の一つに共有的に結合されて、ペプチド配列のもう一つは、当該リンカー分子のもう一つのカルボン酸基に共有的に結合される様に、お互いに接合される。ペプチド配列は、それぞれ、N−もしくはC末端アミノ酸残基のアミノ−またはカルボキシ−基を通してリンカーに共有的に結合される。したがって、本発明の化合物は式、
COOH/CONH2−ペプチド配列−NH−CO−リンカー−CO−NH−ペプチド
配列−COOH/CONH2
もしくはNH2−ペプチド配列−NH−CO−リンカー−NH−CO−ペプチド
配列−NH2、
を有する。
COOH/CONH2−ペプチド配列−NH−CO−リンカー−CO−NH−ペプチド
配列−COOH/CONH2
もしくはNH2−ペプチド配列−NH−CO−リンカー−NH−CO−ペプチド
配列−NH2、
を有する。
2.化合物の製造
2.1 個別なペプチド配列の製造
本発明のぺプチド配列は、任意の従来の合成的方法、組み換えDNA技術、それにペプチド配列が由来する完全長タンパク質の酵素的切断もしくは当該方法の組合せにより作製され得る。
2.1 個別なペプチド配列の製造
本発明のぺプチド配列は、任意の従来の合成的方法、組み換えDNA技術、それにペプチド配列が由来する完全長タンパク質の酵素的切断もしくは当該方法の組合せにより作製され得る。
組み換え作製
かくして、一つの実施態様では、本発明のぺプチドは、組み換えDNA技術の使用により製造される。
ペプチドもしくはそのペプチドが起源する対応する完全長タンパク質をコード化するDNA配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869により記述されるホスホアミジン方法、もしくはMatthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805により記述される方法、により合成的に作製され得る。ホスホアミジン方法にしたがって、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機の中で合成され、精製され、アニール化され、連結されて、適当なベクターの中にクローン化される。
かくして、一つの実施態様では、本発明のぺプチドは、組み換えDNA技術の使用により製造される。
ペプチドもしくはそのペプチドが起源する対応する完全長タンパク質をコード化するDNA配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869により記述されるホスホアミジン方法、もしくはMatthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805により記述される方法、により合成的に作製され得る。ホスホアミジン方法にしたがって、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機の中で合成され、精製され、アニール化され、連結されて、適当なベクターの中にクローン化される。
ペプチドをコード化するDNA配列は、標準的なプロトコル(Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2nd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)にしたがってDNAアーゼIを用いて、ペプチド起源の対応する完全長タンパク質をコード化するDNA配列のフラグメント化によりまた作製され得る。本発明は上で確認されるタンパク質の群から選択される完全長タンパク質に関する。本発明の完全長タンパク質をコード化するDNAは、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いてこれに代えてフラグメント化され得る。DNAのフラグメントは、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2nd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記述される標準的手順を用いてさらに精製される。
完全長タンパク質をコード化するDNA配列は、例えば、ゲノムのもしくはcDNAのライブラリーを作製して、標準的技法(Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2 nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照)にしたがう合成的なオリゴペプチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、完全長タンパク質の全てもしくは部分をコード化するDNA配列のためにスクリーニングをすることにより得られる、ゲノムのもしくはcDNAの起源のものでまたあり得る。DNA配列は、例えば、US4,683,202もしくはSaiki et al., 1988, Science 239:487-491に記述されるように、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりまた作製され得る。
次いで、DNA配列は、任意のベクターであり得る組み換え発現ベクターの中へ挿入され、それは組み換えDNA手順に便利に付され得る。ベクターの選択は、その中にそれが導入されるべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。かくして、ベクターは自己複製ベクター、即ち、その複製が染色体的な複製とは独立している、染色体外の実体、例えばプラスミド、として存在するベクターであり得る。これに代えて、ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれて、その中にそれが組み込まれてきている染色体(複数を含む)と一緒に複製されるものであり得る。
ベクターの中では、ペプチドもしくは完全長タンパク質をコード化するDNA配列は、適当なプロモーター配列に作動可能なように接合されるべきである。プロモーターは選択の宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA配列であり得て、宿主細胞に相同的なもしくは異種ないずれかのタンパク質をコード化する遺伝子に由来され得る。哺乳動物の細胞の中でコード化DNA配列の転写を指揮するための適当なプロモーターの例は、SV40プロモーター(Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854-864)、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814)もしくはアデノウイルス2主要後期プロモーターである。昆虫細胞の中での使用のために適当なプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター(Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11)である。酵母宿主細胞の中での使用のための適当なプロモーターとしては、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber and Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434)もしくはアルコール脱水素酵素遺伝子(Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York)からのプロモーター、またはTP11(US 4,599,311)もしくはADH2−4c(Russell et al., 1983, Nature 304:652-654)プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞の中での使用のために適当なプロモーターは、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093-2099)もしくはtpiAプロモーターである。
コード化DNA配列は、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または(真菌宿主に対しては)TPI1(Alber and Kawasaki, op. cit)もしくはADH3(McKnight et al., op. cit.)プロモーターのような、適当なターミネーターにまた作動可能なように接合され得る。ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えば、SV40もしくはアデノウイルス5 Elb領域からの)、転写エンハンサー配列(例えば、SV40エンハンサー)および転写エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスVA RNA類をコード化するもの)のような要素をさらに含み得る。
組み換え発現ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞の中で複製することを可能にするDNA配列をさらに含み得る。そのような配列の例(宿主細胞が哺乳動物の細胞であるとき)は、SV40複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコード化する遺伝子または薬物、例えば、ネオマイシン、ヒドロマイシンもしくはメトトレキセートに抵抗性を付与するもののような、その生成物が宿主細胞の中の欠陥を補足する遺伝子、をまた含み得る。
ペプチドもしくは完全長タンパク質をコード化するDNA配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ連結するために、およびそれらを複製に必要な情報を含有する適当なベクターに挿入するために用いられる手順は、当業者には周知である(例えば、Sambrook et al., op.cit.を参照)。
本発明の組み換えペプチドを得るために、コード化DNA配列を、第二のペプチドコード化配列およびプロテアーゼ切断部位コード化配列と有益に融合し得て、融合タンパク質をコード化するDNA構成体を与えるが、そこではプロテアーゼ切断部位コード化配列が、HBPフラグメントおよび第二のペプチドコード化DNAの間に位置付けされ、組み換え発現ベクターに挿入されて、組み換え宿主細胞の中で発現される。一つの実施態様では、当該第二ペプチドは、グルタチオン−S−還元酵素、ウシサイモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然のもしくは合成の変異体、またはそれらのペプチドを含む群から選択されるが、それに限定されるものではない。もう一つの実施態様では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列IEGRをを持つ、Xa因子、アミノ酸配列DDDDKをを持つ、エンテロキナーゼ、アミノ酸配列LVPR/GSを持つ、トロンビンもしくはアミノ酸配列XKXをを持つ、アクロモバクターリチカスの切断部位であり得る。
その中に発現ベクターが導入される宿主細胞は、ぺプチドもしくは完全長タンパク質の発現の能力がある任意の細胞であり得て、好ましくは、無脊椎動物(昆虫)細胞もしくは脊椎動物細胞のような真核細胞、例えばツメガエル卵母細胞もしくは哺乳動物の細胞、特に昆虫および哺乳動物の細胞、である。適当な哺乳動物の細胞株の例は、HEK293(ATCC CRL−1573)、COS(ATCC CRL−1650)、BHK(ATCC CRL−1632、ATCC CCL−10)もしくはCHO(ATCC CCL−61)の細胞株である。哺乳動物の細胞を形質転換して、細胞の中に導入されるDNA配列を発現する方法は、例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621;Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341;Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426;Wigler et al., 1978, Cell 14:725;Corsaro and Pearson, 1981, in Somatic Cell Genetics 7, p. 603; Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52:456;and Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845、の中に記述されている。
これに代えて、真菌細胞(酵母細胞を含む)を宿主細胞として用い得る。適当な酵母細胞の例としては、サッカロミセス種もしくはシゾサッカロミセス種、特にサッカロミセス セレビジエの菌株の細胞が含まれる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス種もしくはアカパンカビ種、特にコウジカビもしくはクロカビ、の菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は、例えば、EP 238 023に記述されている。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な補足剤を含有する血清−含有のもしくは無血清の培地のような、哺乳動物の細胞を増殖させるために適当な任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌細胞を育てるために適当な培地であり得る。適当な培地は商業的供給業者から入手可能であるかもしくは公表された処方(例えば、the American Type Culture Collectionのカタログの中で)にしたがって作製され得る。
次いで、遠心分離もしくはろ過により培地から宿主細胞を分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウム、により上澄み液もしくはろ液のタンパク質性成分を析出すること、種々のクロマトグラフ手段、例えば、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、による精製、を含む従来の手段により培養培地から、細胞により組み換え的に製造されるペプチドもしくは完全長タンパク質を回収し得る。
合成的作製
ペプチドの合成的製造のための方法は、当分野において周知である。合成的ペプチドを製造するための詳細な記述ならびに実際的な助言は、Synthetic Peptides: A User's Guide)(Advances in Molecular Biology, Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002の中にもしくはPharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins、Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999:の中に見出され得る。
ペプチドの合成的製造のための方法は、当分野において周知である。合成的ペプチドを製造するための詳細な記述ならびに実際的な助言は、Synthetic Peptides: A User's Guide)(Advances in Molecular Biology, Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002の中にもしくはPharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins、Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999:の中に見出され得る。
ペプチドは、Fmoc化学を用いることによりおよびAcmで保護されたシステインで例えば合成され得る。逆相HPLCによる精製の後に、ペプチドをさらに加工して、例えば、環状のまたはC−もしくはN−末端の修飾されたイソ型を取得し得る。環化および末端修飾のための方法は、当分野において周知であって、上で引用されるマニュアルの中で詳細に記述されている。
好ましい実施態様では、本発明のペプチド配列は、合成的に、特に、配列支援ペプチド合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis)(SAPS)方法により、製造される。
好ましい実施態様では、本発明のペプチド配列は、合成的に、特に、配列支援ペプチド合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis)(SAPS)方法により、製造される。
配列支援ペプチド合成(SAPS)
ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に、または9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)もしくはtert.−ブチルオキシカルボニル(Boc)をN−a−アミノ保護基および側鎖官能基のための適当な共通の保護基として用いる全自動化ペプチド合成機上でのポリアミド固相方法(Dryland, A. and Sheppard, R.C., (1986) J.Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137.)の連続的流動形式でのいずれかで、ペプチドを合成し得る。
以下は、本発明のペプチドフラグメントの合成のためにSAPSを用いるときに役立ち得る化学物質のリストおよび手順の記述である。
ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に、または9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)もしくはtert.−ブチルオキシカルボニル(Boc)をN−a−アミノ保護基および側鎖官能基のための適当な共通の保護基として用いる全自動化ペプチド合成機上でのポリアミド固相方法(Dryland, A. and Sheppard, R.C., (1986) J.Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137.)の連続的流動形式でのいずれかで、ペプチドを合成し得る。
以下は、本発明のペプチドフラグメントの合成のためにSAPSを用いるときに役立ち得る化学物質のリストおよび手順の記述である。
化学物質および手順
1.溶媒
DMF(N,N−ジメチルホルムアミド、Riedelde-Haen, Germany)(強陽イオン交換樹脂、例えば、Lewatit S 100 MB/H 強酸、Bayer AG Leverkusen, Germany、を充填したカラムを通過することにより精製されて、もし遊離アミンが存在するならば、黄色(Dhbt−O−陰イオン)を生じる3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(Dhbt−Oii)の添加により、使用前に遊離アミンに対して分析され得る)。
DCM(ジクロロメタン、分析等級、Riedelde-Haen, Germany)は、精製なしで直接に使用され得る。
1.溶媒
DMF(N,N−ジメチルホルムアミド、Riedelde-Haen, Germany)(強陽イオン交換樹脂、例えば、Lewatit S 100 MB/H 強酸、Bayer AG Leverkusen, Germany、を充填したカラムを通過することにより精製されて、もし遊離アミンが存在するならば、黄色(Dhbt−O−陰イオン)を生じる3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(Dhbt−Oii)の添加により、使用前に遊離アミンに対して分析され得る)。
DCM(ジクロロメタン、分析等級、Riedelde-Haen, Germany)は、精製なしで直接に使用され得る。
2.アミノ酸
Fmocで保護されたアミノ酸および対応するペンタフルオロフェニル(Pfp)エステルは、Milligen, UK, NovaBiochem, SwitzerlandおよびBachem, Switzerlandから購入され、そしてDhbt−エステルは、適当な側鎖が保護された形で、NovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
Boc−保護されたアミノ酸はBachem, Switzerlandから購入され得る。
Fmocで保護されたアミノ酸および対応するペンタフルオロフェニル(Pfp)エステルは、Milligen, UK, NovaBiochem, SwitzerlandおよびBachem, Switzerlandから購入され、そしてDhbt−エステルは、適当な側鎖が保護された形で、NovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
Boc−保護されたアミノ酸はBachem, Switzerlandから購入され得る。
3.カップリング試薬
ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)はRiedelde-Hen, Germanyから購入されて、使用前に蒸留され得る。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)はMerck-Schuchardt, Niinchen, Germanyから購入されて、蒸留により精製され得る。O−ベンゾトリアゾリル−N,N,N”,N”−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(TBTU)(PerSeptive Biosystems Gmbtl Hamburg, Germany)。
ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)はRiedelde-Hen, Germanyから購入されて、使用前に蒸留され得る。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)はMerck-Schuchardt, Niinchen, Germanyから購入されて、蒸留により精製され得る。O−ベンゾトリアゾリル−N,N,N”,N”−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(TBTU)(PerSeptive Biosystems Gmbtl Hamburg, Germany)。
4.リンカー
HMPA、Novabiochem, Switzerland;
4−ヒドロキシメチル安息香酸、Novabiochem;
4−メトキシマンデル酸、Aldrich, Germany;
HMPB、Novabiochem;AM、Novabiochem;
DICにより発生される予め形成された1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)エステルとして樹脂にカップリンされるための、3−(4−ヒドロキシメチルフェノキシ)プロピオン酸、Novabiochem。
HMPA、Novabiochem, Switzerland;
4−ヒドロキシメチル安息香酸、Novabiochem;
4−メトキシマンデル酸、Aldrich, Germany;
HMPB、Novabiochem;AM、Novabiochem;
DICにより発生される予め形成された1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)エステルとして樹脂にカップリンされるための、3−(4−ヒドロキシメチルフェノキシ)プロピオン酸、Novabiochem。
ラセミ4−メトキシマンデル酸(98%純度、Aldrich, Germany)は、リンカーとして直接に使用されるかもしくは(+)−シンコニン(85%純度、Aldrich, Germany)での処理により分割され得て、光学活性リンカー(+)−4−メトキシマンデル酸、Iax20=+146(水)を95.8%光学純度で、および(−)−4−メトキシマンデル酸、[al20=−128.6(水)を88.1%光学純度で与える。
(+/−)−4−メトキシマンデル酸の分割(A. Mckebzie, D.J.C. Pirie, (1936), Berichte 69, 868; E. Knorr, (1904), Berichte 37, 3172)
(+/−)−4−メトキシマンデル酸(10g、54.89mmol、Aldrich、98%)を熱水(60〜80℃)500mlに溶解して、不溶性不純物を除去するために、溶液をまだ温かい間にデカントする。(+)−シンコニン(16.16g、54.89mmol、Aldrich、85%、[alD20=+211(文献:+228°))を少しづつ熱い溶液に加える。溶液は60〜80℃で15分攪拌後に澄明になって、氷中で冷却される。1時間後に、沈殿をろ過により収集して、乾燥器中で終夜乾燥して、シンコニン塩9.9gを与える。塩を沸騰水(80ml)から再結晶する;溶液をまだ温かい間にデカントして、次いで、氷中で冷却する。沈殿を1時間後にろ過により収集し、冷水で三回洗浄して、乾燥器中で終夜乾燥して、7.84g(16.45mmol)を与える。シンコニン塩(2g、4.2mmol)を40mlの2NHClに溶解して、直ちに3×30mlのジエチルエーテルで抽出する。エーテル相をNa2SO4上で乾燥して、蒸発乾固して、メトキシマンデル酸0.55gを与えた。遊離された4−メトキシマンデル酸の光学純度は、18.5% ([a]D20=+270)と評価された。シンコニン塩の二回目の再結晶に引き続いて上で記述されるようにマンデル酸の遊離の後に、光学純度は69.0%([a]D20=+100.8°)と評価された。三回目の再結晶は、95.8%([a]D20=+140.0°)の光学純度をもたらした。
(+/−)−4−メトキシマンデル酸の分割(A. Mckebzie, D.J.C. Pirie, (1936), Berichte 69, 868; E. Knorr, (1904), Berichte 37, 3172)
(+/−)−4−メトキシマンデル酸(10g、54.89mmol、Aldrich、98%)を熱水(60〜80℃)500mlに溶解して、不溶性不純物を除去するために、溶液をまだ温かい間にデカントする。(+)−シンコニン(16.16g、54.89mmol、Aldrich、85%、[alD20=+211(文献:+228°))を少しづつ熱い溶液に加える。溶液は60〜80℃で15分攪拌後に澄明になって、氷中で冷却される。1時間後に、沈殿をろ過により収集して、乾燥器中で終夜乾燥して、シンコニン塩9.9gを与える。塩を沸騰水(80ml)から再結晶する;溶液をまだ温かい間にデカントして、次いで、氷中で冷却する。沈殿を1時間後にろ過により収集し、冷水で三回洗浄して、乾燥器中で終夜乾燥して、7.84g(16.45mmol)を与える。シンコニン塩(2g、4.2mmol)を40mlの2NHClに溶解して、直ちに3×30mlのジエチルエーテルで抽出する。エーテル相をNa2SO4上で乾燥して、蒸発乾固して、メトキシマンデル酸0.55gを与えた。遊離された4−メトキシマンデル酸の光学純度は、18.5% ([a]D20=+270)と評価された。シンコニン塩の二回目の再結晶に引き続いて上で記述されるようにマンデル酸の遊離の後に、光学純度は69.0%([a]D20=+100.8°)と評価された。三回目の再結晶は、95.8%([a]D20=+140.0°)の光学純度をもたらした。
5.固体支持体
Fmocの戦略にしたがって製造されるペプチドは、3つの異なる型の固体支持体の上で、DMF中の0.05Mもしくはさらに高い濃度のFmocで保護された活性化アミノ酸を用いて合成される。
1)PEG−PS(ポリスチレンの上にグラフトされたポリエチレングリコール;Tentagel S NH2樹脂、0.27mmol/g、Rapp Polymere, GermanyもしくはNovaSyn TG 樹脂、0.29mmol/g、Novabiochem, Switzerland);
2)PepSyn Gel(サクロシンメチルエステルで官能化されたポリジメチルアクリルアミド樹脂、1.0mmol/g;MilliGen, UK)。
3)PepSyn K(サクロシンメチルエステルで官能化された珪藻土支持化ポリジメチルアクリルアミド樹脂、0.11mmol/g;MilliGen, UK)。
Bocの戦略にしたがって合成されるペプチドは、付着された最初のアミノ酸(Novabiochem, Switzerland)でメリフィールド−樹脂(ポリスチレンジビニルベンゼン)の上で合成され得る。
Fmocの戦略にしたがって製造されるペプチドは、3つの異なる型の固体支持体の上で、DMF中の0.05Mもしくはさらに高い濃度のFmocで保護された活性化アミノ酸を用いて合成される。
1)PEG−PS(ポリスチレンの上にグラフトされたポリエチレングリコール;Tentagel S NH2樹脂、0.27mmol/g、Rapp Polymere, GermanyもしくはNovaSyn TG 樹脂、0.29mmol/g、Novabiochem, Switzerland);
2)PepSyn Gel(サクロシンメチルエステルで官能化されたポリジメチルアクリルアミド樹脂、1.0mmol/g;MilliGen, UK)。
3)PepSyn K(サクロシンメチルエステルで官能化された珪藻土支持化ポリジメチルアクリルアミド樹脂、0.11mmol/g;MilliGen, UK)。
Bocの戦略にしたがって合成されるペプチドは、付着された最初のアミノ酸(Novabiochem, Switzerland)でメリフィールド−樹脂(ポリスチレンジビニルベンゼン)の上で合成され得る。
6.触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAldrich, Germanyから、
エチレンジアミンはFluka, Switzerlandから、
ピペリジンはRiedel-deWhen, Frankfurt, Germanyから購入され得る。
4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)はFluka, Switzerlandから購入されて、対称性無水物を伴うカップリング反応における触媒として使用され得る。
3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾ−トリアジン(Dhbt−OH)はFluka, Switzerlandから、
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)はNovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAldrich, Germanyから、
エチレンジアミンはFluka, Switzerlandから、
ピペリジンはRiedel-deWhen, Frankfurt, Germanyから購入され得る。
4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)はFluka, Switzerlandから購入されて、対称性無水物を伴うカップリング反応における触媒として使用され得る。
3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾ−トリアジン(Dhbt−OH)はFluka, Switzerlandから、
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)はNovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
7.カップリング手順
最初のアミノ酸を、適切なN−cc−保護されたアミノ酸およびDICから発生されたDMF中の対称性無水物としてカップリングする。Pfp−もしくはDhbt−エステルとして、または適切なN−保護されたアミノ酸およびHObtからDICもしくはTBTUによりDMF中で作られる、予め形成されたHObtエステルとして、次のアミノ酸をカップリングする。Fmocの場合には全てのアシル化は、試験の間でのFmocの脱保護を防止するために80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックされる。
最初のアミノ酸を、適切なN−cc−保護されたアミノ酸およびDICから発生されたDMF中の対称性無水物としてカップリングする。Pfp−もしくはDhbt−エステルとして、または適切なN−保護されたアミノ酸およびHObtからDICもしくはTBTUによりDMF中で作られる、予め形成されたHObtエステルとして、次のアミノ酸をカップリングする。Fmocの場合には全てのアシル化は、試験の間でのFmocの脱保護を防止するために80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックされる。
8.N−末端アミノ酸−アミノ(N−a−アミノ)保護基の脱保護
DMF中における20%ピペリジンでの処理(バッチ式に合成されるときは1×3および1×7分)によりもしくは樹脂を通して脱保護溶媒を流して(連続的流動合成を用いて10分、流速1ml/分)、引き続いて黄色(Dhbt−O−)が液抜きされた(drained)DMFへのDhbt−OHの付加の後に何も検出できなくなるまで、DMFで洗浄することにより、Fmoc基の脱保護を実施する。DCM中でTFAでの処理10×1.5分および1×20分、に引き続いてDCMで洗浄それぞれ6×9分、DCM中の10%(v/v)トリエチルアミンでの中和それぞれ2×1.5分に引き続いてDCMで洗浄6×9分、により、Boc基の脱保護を実施する。
DMF中における20%ピペリジンでの処理(バッチ式に合成されるときは1×3および1×7分)によりもしくは樹脂を通して脱保護溶媒を流して(連続的流動合成を用いて10分、流速1ml/分)、引き続いて黄色(Dhbt−O−)が液抜きされた(drained)DMFへのDhbt−OHの付加の後に何も検出できなくなるまで、DMFで洗浄することにより、Fmoc基の脱保護を実施する。DCM中でTFAでの処理10×1.5分および1×20分、に引き続いてDCMで洗浄それぞれ6×9分、DCM中の10%(v/v)トリエチルアミンでの中和それぞれ2×1.5分に引き続いてDCMで洗浄6×9分、により、Boc基の脱保護を実施する。
9.酸で樹脂からぺプチドの切断
95%トリフルオロ酢酸(TFA、Halocarbon Products Corporation, U.S.A.; Biesterfeld & Co. Hamburg, Germany)−水v/vでの室温で2時間の処理により、ぺプチドを樹脂から切断する。ろ過された樹脂を95%TFA−水で洗浄して、ろ液および洗浄液を減圧下で蒸発する。残渣をエーテルで洗浄して、酢酸−水から凍結乾燥する。粗製の凍結乾燥製品を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI TOF MS)によりもしくは電気スプレーイオン化質量分析法(ES−MS)により確認する。
95%トリフルオロ酢酸(TFA、Halocarbon Products Corporation, U.S.A.; Biesterfeld & Co. Hamburg, Germany)−水v/vでの室温で2時間の処理により、ぺプチドを樹脂から切断する。ろ過された樹脂を95%TFA−水で洗浄して、ろ液および洗浄液を減圧下で蒸発する。残渣をエーテルで洗浄して、酢酸−水から凍結乾燥する。粗製の凍結乾燥製品を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI TOF MS)によりもしくは電気スプレーイオン化質量分析法(ES−MS)により確認する。
10.塩基で樹脂からぺプチドの切断
乾燥された樹脂(1g)を4℃で1M水酸化ナトリウム(10ml)で処理して、室温で15分間放置する。樹脂を10%水性酢酸を含有するフラスコ中へろ過する。ペプチドを凍結乾燥により単離して、ゲルろ過に掛ける。
乾燥された樹脂(1g)を4℃で1M水酸化ナトリウム(10ml)で処理して、室温で15分間放置する。樹脂を10%水性酢酸を含有するフラスコ中へろ過する。ペプチドを凍結乾燥により単離して、ゲルろ過に掛ける。
11.TFMSAで樹脂からぺプチドの切断
乾燥された樹脂(250mg)を撹拌子と共に丸底フラスコの中に置く。チオアニソール/エタンジチオール(2:1、750FII)を加え、混合液を氷中で冷却し、TFA5mlを加えて、混合液を5〜10分間撹拌する。TFMSA(500KII)を滴加して、反応を室温で30〜60分間継続する。エーテルの添加の後に、ペプチドを沈殿させる。
乾燥された樹脂(250mg)を撹拌子と共に丸底フラスコの中に置く。チオアニソール/エタンジチオール(2:1、750FII)を加え、混合液を氷中で冷却し、TFA5mlを加えて、混合液を5〜10分間撹拌する。TFMSA(500KII)を滴加して、反応を室温で30〜60分間継続する。エーテルの添加の後に、ペプチドを沈殿させる。
12.側鎖保護基の脱保護
好ましくは、側鎖を樹脂からのペプチドの切断と同時に脱保護する。
好ましくは、側鎖を樹脂からのペプチドの切断と同時に脱保護する。
13.予め形成されたHObt−エステル
a法
N−a−アミノ保護されたアミノ酸3当量をHObt3当量およびDIC3当量と一緒にDMF中に溶かす。溶液を室温で10分間放置して、次いで、予め活性化されたアミノ酸の添加に先立ってDMF中のDhbt−OH0.2当量の溶液で洗浄されてきていた樹脂に加えた。
a法
N−a−アミノ保護されたアミノ酸3当量をHObt3当量およびDIC3当量と一緒にDMF中に溶かす。溶液を室温で10分間放置して、次いで、予め活性化されたアミノ酸の添加に先立ってDMF中のDhbt−OH0.2当量の溶液で洗浄されてきていた樹脂に加えた。
b法
N−a−アミノ保護されたアミノ酸3当量をHObt3当量、TBTU3当量およびDIEA4.5当量と一緒にDMF中に溶かす。溶液を室温で5分間放置して、次いで、樹脂に加える。N−a−アミノ保護されたアミノ酸6当量の予め形成された対称性無水物をDCM中に溶解して、0℃へ冷却する。DCC(3当量)を加えて、反応を10分間継続する。溶媒を真空で除去して、残りをDMF中に溶かす。溶液をろ過して、直ちに樹脂に加えて、引き続いてDMAP0.1当量を加える。
N−a−アミノ保護されたアミノ酸3当量をHObt3当量、TBTU3当量およびDIEA4.5当量と一緒にDMF中に溶かす。溶液を室温で5分間放置して、次いで、樹脂に加える。N−a−アミノ保護されたアミノ酸6当量の予め形成された対称性無水物をDCM中に溶解して、0℃へ冷却する。DCC(3当量)を加えて、反応を10分間継続する。溶媒を真空で除去して、残りをDMF中に溶かす。溶液をろ過して、直ちに樹脂に加えて、引き続いてDMAP0.1当量を加える。
14.最初のN−a−アミノ保護されたアミノ酸のカップリング収率の評価
Fmocで保護された乾燥ペプチド−樹脂3〜5mgを、DMFの中においてピペリジン5mlで20回10分間室温で処理して、ジベンゾフルベンピペリジン付加体に対するUV吸収を301nmにて評価する。収率をFmoc−Ala−OH標準に基づいて算出された伸展係数e301を用いて測定する。Boc−保護の場合には、Boc−基の除去の後に、ニンヒドリン−方法にしたがってカップリンングを評価する(Sarin, V.K. et al., (1981), Anal. Biochem, 117, 147-157)。
Fmocで保護された乾燥ペプチド−樹脂3〜5mgを、DMFの中においてピペリジン5mlで20回10分間室温で処理して、ジベンゾフルベンピペリジン付加体に対するUV吸収を301nmにて評価する。収率をFmoc−Ala−OH標準に基づいて算出された伸展係数e301を用いて測定する。Boc−保護の場合には、Boc−基の除去の後に、ニンヒドリン−方法にしたがってカップリンングを評価する(Sarin, V.K. et al., (1981), Anal. Biochem, 117, 147-157)。
15.PepSyn K樹脂上でのペプチド合成
乾燥PepSyn K(約500mg)をエチレンジアミンで覆って、室温で終夜放置する。樹脂を液抜きして、DMF10×15mlで、それぞれ5分洗浄する。液抜き後に、樹脂をDMF中の10%v/vのDIEAで洗浄し(2×15ml、それぞれ5分)洗浄して、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加により何も検出できなくなるまで、最終的にDMFで洗浄する。HMPA3当量、HObt3当量およびDIC3当量をDMF10ml中に溶解して、活性化のために10分間放置して、その後混合液を樹脂に加えて、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMFで洗浄して(10×15ml、それぞれ5分)、アシル化をニンヒドリン試験によりチェックした。最初のアミノ酸を、側鎖保護の予め形成された対称性無水物(上を参照)としてカップリンさせて、カップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で70%より良好であるべきである。次いで、合成を以下に記述するように“連続的流動”としてもしくは“バッチ方式”としてのいずれかで継続する。
乾燥PepSyn K(約500mg)をエチレンジアミンで覆って、室温で終夜放置する。樹脂を液抜きして、DMF10×15mlで、それぞれ5分洗浄する。液抜き後に、樹脂をDMF中の10%v/vのDIEAで洗浄し(2×15ml、それぞれ5分)洗浄して、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加により何も検出できなくなるまで、最終的にDMFで洗浄する。HMPA3当量、HObt3当量およびDIC3当量をDMF10ml中に溶解して、活性化のために10分間放置して、その後混合液を樹脂に加えて、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMFで洗浄して(10×15ml、それぞれ5分)、アシル化をニンヒドリン試験によりチェックした。最初のアミノ酸を、側鎖保護の予め形成された対称性無水物(上を参照)としてカップリンさせて、カップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で70%より良好であるべきである。次いで、合成を以下に記述するように“連続的流動”としてもしくは“バッチ方式”としてのいずれかで継続する。
16.連続的流動技法を用いるPepSyn K上での連続したペプチド合成
最初の付着されたアミノ酸を持つ樹脂(約500mg)を全自動化ペプチド合成機に接合されたカラムの中に置く。Fmoc基を上で記述されるように脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、Fmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、Pfpエステル(3当量)として、Dhbt−OH(1当量)の付加でカップリングする。それぞれのカップリングの終点を、Dhbt−OH陰イオンの黄色の消失を分光光度的にモニターすることにより自動的に測定する。完了された合成の後に、ペプチド−樹脂をDMF(10分、流速1ml/分)、DCM(3×5ml、それぞれ3分)および最終的にジエチルエーテル(3×それぞれ5ml)で洗浄し、カラムから除去して、真空中で乾燥する。
最初の付着されたアミノ酸を持つ樹脂(約500mg)を全自動化ペプチド合成機に接合されたカラムの中に置く。Fmoc基を上で記述されるように脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、Fmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、Pfpエステル(3当量)として、Dhbt−OH(1当量)の付加でカップリングする。それぞれのカップリングの終点を、Dhbt−OH陰イオンの黄色の消失を分光光度的にモニターすることにより自動的に測定する。完了された合成の後に、ペプチド−樹脂をDMF(10分、流速1ml/分)、DCM(3×5ml、それぞれ3分)および最終的にジエチルエーテル(3×それぞれ5ml)で洗浄し、カラムから除去して、真空中で乾燥する。
17.PepSyn K上での連続したバッチ式ペプチド合成
付着され最初のたアミノ酸を持つ樹脂(約500mg)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置いて、上で記述されるようにFmoc−基を脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように作製されたDMF(5ml)中の、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。別に特定されない限り、カップリングを2時間継続する。次いで、過剰の試薬をDMF洗浄(12分、流速、1ml/分)により除去する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(10分、流速1ml/分)、DCM(5×5ml、それぞれ1分)および最終的にジエチルエーテル(5×5ml、それぞれ1分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
付着され最初のたアミノ酸を持つ樹脂(約500mg)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置いて、上で記述されるようにFmoc−基を脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように作製されたDMF(5ml)中の、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。別に特定されない限り、カップリングを2時間継続する。次いで、過剰の試薬をDMF洗浄(12分、流速、1ml/分)により除去する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(10分、流速1ml/分)、DCM(5×5ml、それぞれ1分)および最終的にジエチルエーテル(5×5ml、それぞれ1分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
18.PEG−PS上でのバッチ式ペプチド合成
Tentagel S NH2のもしくはNovaSyn TGの樹脂(250mg、0.27〜0.29mmol/g)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をDMF(5ml)の中で膨潤させて、DMF中の20%ピペリジンで処理して、樹脂上での非プロトン化アミノ基の存在を確保する。樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に検出できなくなるまでDMFで洗浄する。HMPA(3当量)を予め形成されたHObt−エステルとして上で記述されるようにカップリンして、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄して、アシル化をニンヒドリン試験でチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように予め形成された対称的無水物としてカップリングする。最初のFmoc−保護されたアミノ酸のカップリング収率を、上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で60%よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって以下のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。カップリングを2時間継続する。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにDMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験でチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(3×5ml、それぞれ5分)、DCM(3×5ml、それぞれ1分)および最終的にジエチルエーテル(3×5ml、それぞれ1分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
Tentagel S NH2のもしくはNovaSyn TGの樹脂(250mg、0.27〜0.29mmol/g)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をDMF(5ml)の中で膨潤させて、DMF中の20%ピペリジンで処理して、樹脂上での非プロトン化アミノ基の存在を確保する。樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に検出できなくなるまでDMFで洗浄する。HMPA(3当量)を予め形成されたHObt−エステルとして上で記述されるようにカップリンして、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄して、アシル化をニンヒドリン試験でチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように予め形成された対称的無水物としてカップリングする。最初のFmoc−保護されたアミノ酸のカップリング収率を、上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で60%よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって以下のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。カップリングを2時間継続する。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにDMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験でチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(3×5ml、それぞれ5分)、DCM(3×5ml、それぞれ1分)および最終的にジエチルエーテル(3×5ml、それぞれ1分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
19.PepSyn Gel上でのバッチ式ペプチド合成
乾燥PepSyn Gel樹脂(500mg、1mmol/g)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をエチレンジアミン(15ml)の中で膨潤させて、振盪により20時間穏やかに攪拌する。樹脂を液抜きして、DMF(10×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。液抜き後、樹脂をDMF中の10%v/vのDIEA(2×15ml、それぞれ5分)で洗浄して、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に検出できなくなるまで、最終的にDMF(5×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。HMPA(3当量)を、上で記述されるように(a法)予め活性化されたHObt−エステルとしてカップリングして、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMF(5×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。アシル化をニンヒドリン試験によりチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成された側鎖保護の対称的無水物としてカップリングする。最初のFmoc−保護されたアミノ酸のカップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合70%よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように(a法)、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。カップリングを2時間継続して、もし必要ならば、終夜で二回カップリングする。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにDMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。Fmoc−基を上で記述されるように脱保護する。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(3×15ml、それぞれ5分)、DCM(3×15ml、それぞれ2分)および最終的にジエチルエーテル(3×15ml、それぞれ2分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
乾燥PepSyn Gel樹脂(500mg、1mmol/g)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をエチレンジアミン(15ml)の中で膨潤させて、振盪により20時間穏やかに攪拌する。樹脂を液抜きして、DMF(10×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。液抜き後、樹脂をDMF中の10%v/vのDIEA(2×15ml、それぞれ5分)で洗浄して、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に検出できなくなるまで、最終的にDMF(5×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。HMPA(3当量)を、上で記述されるように(a法)予め活性化されたHObt−エステルとしてカップリングして、カップリングを24時間継続する。樹脂を液抜きして、DMF(5×15ml、それぞれ5分)で洗浄する。アシル化をニンヒドリン試験によりチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成された側鎖保護の対称的無水物としてカップリングする。最初のFmoc−保護されたアミノ酸のカップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合70%よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように(a法)、予め形成されたFmoc保護された、必要ならば側鎖保護された、HObtエステル(3当量)として、カップリングする。カップリングを2時間継続して、もし必要ならば、終夜で二回カップリングする。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにDMF(5×5ml、それぞれ5分)で洗浄する。全てのアシル化を80℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。Fmoc−基を上で記述されるように脱保護する。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をDMF(3×15ml、それぞれ5分)、DCM(3×15ml、それぞれ2分)および最終的にジエチルエーテル(3×15ml、それぞれ2分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
19.HPLC
HPLCは、Waters 996フォトダイオードアレー検出器を備えたWaters 600E機器上で、Waters Radial Pak8×100mmC18逆相カラムで実施され得る。A緩衝液は水中の0.1容量%TFAであって、B緩衝液は90容量%アセトニトリル、9.9容量%水および0.1容量%TFAである。緩衝液はカラムを通して1.5ml/分の流速で以下のグラジエントを用いてポンプで送られる:0%〜70%Bからの線形グラジエント(20分)、70〜100%からの線形グラジエント(1分)、定組成の100%B(5分)。2.0%Bで定組成(2分)、0〜50%Bからの線形グラジエント(23分)、50〜100%Bからの線形グラジエント(5分)、定組成の100%B(5分)。
HPLCは、Waters 996フォトダイオードアレー検出器を備えたWaters 600E機器上で、Waters Radial Pak8×100mmC18逆相カラムで実施され得る。A緩衝液は水中の0.1容量%TFAであって、B緩衝液は90容量%アセトニトリル、9.9容量%水および0.1容量%TFAである。緩衝液はカラムを通して1.5ml/分の流速で以下のグラジエントを用いてポンプで送られる:0%〜70%Bからの線形グラジエント(20分)、70〜100%からの線形グラジエント(1分)、定組成の100%B(5分)。2.0%Bで定組成(2分)、0〜50%Bからの線形グラジエント(23分)、50〜100%Bからの線形グラジエント(5分)、定組成の100%B(5分)。
2.2 化合物のLPA製造
本発明にしたがって、興味ある化合物は好ましくはLPA方法により得られる。
LPA方法
LPA方法はWO 00/18791の中に開示されている。方法は本質的に以下の工程より成る:
(a)望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を固相合成もしくはフラグメントカップリングにより提供することで、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されている;
(b)もし必要ならば、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されたままで、任意のN−末端アミノ酸を脱保護すること。
(c)環構造を有する構成体を提供するように、保護されていないN−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)をアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸と反応させること、および
(d)遊離のC−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)を含むLPAを提供するように、構成体を固相から切断すること。
本発明にしたがって、興味ある化合物は好ましくはLPA方法により得られる。
LPA方法
LPA方法はWO 00/18791の中に開示されている。方法は本質的に以下の工程より成る:
(a)望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を固相合成もしくはフラグメントカップリングにより提供することで、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されている;
(b)もし必要ならば、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されたままで、任意のN−末端アミノ酸を脱保護すること。
(c)環構造を有する構成体を提供するように、保護されていないN−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)をアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸と反応させること、および
(d)遊離のC−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)を含むLPAを提供するように、構成体を固相から切断すること。
上の方法では、(d)工程に先立って、以下の工程を実施し得る:
(c1)もし存在するならば、(c)工程で用いられたカルボン酸から起源する任意のN−保護された基を脱保護すること、
(c2)少なくとも一つのN−保護されたN−末端アミノ酸基を有する望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を提供するように、固相合成もしくはフラグメントカップリングを継続すること、および/または化学的部分を付着すること、ならびに
(c3)もし存在するならば、任意のN−末端アミノ基を脱保護すること((d)工程に先立ってもしくはその以後で)。
(c1)もし存在するならば、(c)工程で用いられたカルボン酸から起源する任意のN−保護された基を脱保護すること、
(c2)少なくとも一つのN−保護されたN−末端アミノ酸基を有する望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を提供するように、固相合成もしくはフラグメントカップリングを継続すること、および/または化学的部分を付着すること、ならびに
(c3)もし存在するならば、任意のN−末端アミノ基を脱保護すること((d)工程に先立ってもしくはその以後で)。
方法は、とりわけ、NからCへの配向を持つ本発明の望ましい配列を提示するLPA類を提供する((c)工程)。そして、また同時にCからNへの配向を持つ配列も提供する((c2)工程)。
かくして、本発明の化合物を得るために、固相に付着される二つのペプチド鎖が、アキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸により組み立てられるべきである。本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、HNであり、AおよびBは独立して置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、HNであり、AおよびBは独立して置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
もう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、H2N(CR2)pCR、もしくはRHN(CR2)pCR、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、(式中、それぞれのRは、H、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分である)、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、H2N(CR2)pCR、もしくはRHN(CR2)pCR、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、(式中、それぞれのRは、H、置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分である)、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
さらにもう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、(式中、pは0もしくは1〜20の整数であり、それぞれのRは独立して、Hまたは置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕を有する。
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、(式中、pは0もしくは1〜20の整数であり、それぞれのRは独立して、Hまたは置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕を有する。
なおもう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数であり、それぞれのRは独立して、Hまたは置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔式中、nおよびmは、独立して1〜20の整数であり、Xは、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数であり、それぞれのRは独立して、Hまたは置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
用語のC1〜10アルキルの下では、1〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、およびtertブチルが意味される。
用語のC2〜10アルケニルの下では、2〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびtertブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語のC2〜10アルケニルの下では、2〜10個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびtertブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語の芳香族部分の下では、フェニルが意味される。
“AおよびBは環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
“AおよびBは環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
カルボン酸との反応により、X(CO−配列)2−固相の型の構成体(式中、Xは上で規定されるようである)が得られる。
用語“配列”により、天然由来のおよび/もしくは非天然由来のアミノ酸を含むペプチド、PNA−配列またはペプチド模倣体が、本明細書中で意味される。“天然由来のアミノ酸”により、天然に見出される20個の酸のL−およびD−型が意味される。非天然−由来のアミノ酸は、例えば、修飾された天然由来のアミノ酸である。用語の配列は、一つもしくはそれ以上のそのような配列を含むとさらに意図される。適当なペプチド模倣体の例は、Marshall G.R.,(1993) Tetrahedron, 49:3547-3558に記述されている。用語“化学的部分”は、LPAの溶解度もしくは生物活性を高める実体およびLPAをその標的もしくはマーカーに指向するための実体を指す。配列についての好ましい実施態様は、上に記述されている。
X基は、同一の配列、または一つもしくはそれ以上の異なる配列および/または部分の直接的にまたは間接的に継続される段階的合成またはフラグメントカップリングを許容する。LPAにおけるペプチドフラグメントの配向(NからCへもしくはCからNへ)は、望ましいように規定される。一つの実施態様では、本発明はNからCへの配向を持つLPAを特徴とし、もう一つの実施態様では、それは配列の同時的なNからCへのおよびCからNへの提示を持つ化合物に関与していて、なおもう一つの実施態様では、配列はCからNへの配向を有する。
Xが暫定的に保護されたアミノ機能を含む場合には、合成もしくはカップリングを保護の後に直接的に行うことができる。環システムの効果的な形成((c)工程における、上を参照)を提供する全てのカルボキシルを含有する基の適当な活性化は、半当量のカルボン酸を用いて保障され得る。トリ−もしくはテトラ−カルボン酸の場合には、活性化されたカルボキシ基は、エチレンジアミンのようなジアミンもしくはメルカプト−、オキシ−、オキソもしくはカルボキシル基のようにさらなる反応に対して適当に官能化されているアミンでさらに誘導体化され得る。ジアミンの場合には、ペプチド合成もしくはフラグメントカップリングを、望ましい配列もしくは化学的な部分にしたがって直接に継続することができる。好ましい実施態様では、Fmoc−保護戦略が用いられるが、任意のアミノ保護基を、合成もしくはカップリン戦略に依存して用い得る。例はBoc−保護基戦略である。
連続した段階的な合成もしくはフラグメントカップリングは、一つのもしくはリジンのような二官能性の化学的な部分の場合には二つのアミノ酸基で行われるので、MAP合成により得られた従来の四量体的なリジン樹状体と比べて遥かにさらに良好な結果を得ることができることが驚くべきことに見出されている。さらに、最適なペプチド合成手順もしくはカップリング手順を、固相に付着された単一鎖に対して使用できて、それらの同質性をLPAを形成する以前に検証できる。固相からの切断および同時的な側鎖脱保護を、標準的なペプチド合成手順(上に記述される)により実施することができる。かくして、最終生成物が、最適なかつ良く規定された組成を有して得られ得る。HPLCもしくはゲルろ過のような標準的なクロマトグラフ法による精製を、望まれるかもしくは必要とされるかにより、容易に実施することができる。
環構造を提供するための好ましいジ−、トリ−およびテトラカルボン酸は、イミノジ酢酸、2−アミノマロン酸、3−アミノグルタル酸、3−メチルアミノグルタル酸、3−クロログルタミン酸、3−メトキシ−カルボニルグルタル酸、3−アセチルグルタル酸、グルタル酸、トリカルバリル酸、3,4−ビス−カルボキシメチルアジピン酸、4−(2−カルボキシエチル)−ピメリン酸、(3,5−ビス−カルボキシメチル−フェニル)−酢酸、3,4−ビス−カルボキシメチル−アジピン酸、ベンゼン−1,2,4,5−テトラカルボン酸、4−(3−カルボキシ−アリルアミノ)−ブタ−2−エン酸、4,4−イミノ−ジ安息香酸、1,4−ジヒドロピリジン−3,5−ジカルボン酸、5−アミノイソフタール酸、2−クロロマロン酸、3−ヒドロキシグルタル酸およびベンゼン−1,3,5−トリカルボン酸から選択され得る。
フラグメントカップリング(フラグメントカップリングもしくはフラグメント縮合)は、例えば、「ペプチド合成計画」(Peptide Synthesis protocols)、Methods in Molecular Biology Vol. 35, Chapter 15, 303-316, Nyfeler R, Pennington MW and Dunne BM Eds.,Humana Press, 1994に記述されるように、標準的な手順したがって実施され得る。したがって、フラグメントは、上で記述されるように、固相上で合成され、保護基の完全な保存をもって固相から切断され、精製されて、特徴づけされ得る。適当なフラグメントを、上で記述される他の技法によりまた取得し得る。
本発明の化合物の製造のために上のLPA方法を使用することは、本発明の好ましい実施態様である。
本発明の化合物の製造のために上のLPA方法を使用することは、本発明の好ましい実施態様である。
3.生物活性
本発明にしたがって、化合物を、化合物のペプチド配列(複数を含む)内に位置する結合部位を通して細胞表面受容体に結合して、活性を調整できて、当該結合部位は式、
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される]の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
本発明にしたがって、化合物を、化合物のペプチド配列(複数を含む)内に位置する結合部位を通して細胞表面受容体に結合して、活性を調整できて、当該結合部位は式、
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される]の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
それ故に、構造的モチーフに結合する上の受容体を含む4〜80個のアミノ酸残基の長さを有する全てのペプチド配列は、本発明の範囲の中にある。ペプチド配列の好ましい実施態様は上で考察されている。好ましい実施態様における本発明は、二つの個別な配列を含む化合物に関与して、当該配列のそれぞれは上のモチーフを含んで、FGFRに結合する能力がある。
受容体
かくして、本発明の化合物は、受容体、特に機能性細胞の表面受容体、のリガンドである。
細胞の表面受容体は、少なくとも一つのペプチド鎖を含む任意の分子として本発明の明細書の中で規定されて、当該分子が膜の外側でシグナルを受領し、そのシグナルを膜を通して伝達して、特定の作用を細胞内において分子的レベルで誘発することにより、例えば、分子複合体の会合もしくは解離を誘発することにより、または生化学的な反応、例えば受容体の自動的リン酸化、または分子内のシグナル伝達の開始に導く受容体のタンパク分解的切断を開始することにより、当該シグナルをさらに運ぶことを可能にするような方式で、当該分子は細胞の原形質膜と会合される。
かくして、本発明の化合物は、受容体、特に機能性細胞の表面受容体、のリガンドである。
細胞の表面受容体は、少なくとも一つのペプチド鎖を含む任意の分子として本発明の明細書の中で規定されて、当該分子が膜の外側でシグナルを受領し、そのシグナルを膜を通して伝達して、特定の作用を細胞内において分子的レベルで誘発することにより、例えば、分子複合体の会合もしくは解離を誘発することにより、または生化学的な反応、例えば受容体の自動的リン酸化、または分子内のシグナル伝達の開始に導く受容体のタンパク分解的切断を開始することにより、当該シグナルをさらに運ぶことを可能にするような方式で、当該分子は細胞の原形質膜と会合される。
本発明は機能性細胞の表面受容体に関する。“機能性細胞の表面受容体”により、本発明の細胞の表面受容体がリガンドの確認可能な群を有し、これらのリガンドの受容体への結合が、細胞の生理学的な応答をもたらす分子内的シグナル伝達を誘発することが意味される。例えば、細胞の分化、増殖、生存、アポトーシスもしくは運動性のような、生理学的応答は、受容体との相互作用に関与するリガンド、および/もしくは親和性もしくは存続時間のような当該相互作用の特性、ならびに/または受容体を発現する細胞の種に依存する。用語“リガンド”により、受容体に結合して、それにより当該受容体を活性化するかもしくは阻害する能力がある化合物が規定される。受容体の“活性化”とは、リガンドの細胞外結合の後で、細胞の上述の生理学的応答の一つをもたらす細胞の内部で、“受容体シグナル伝達”もしくは“シグナル伝達”と集合的に用語付けされた生化学的反応のカスケードの中に、受容体が“リガンド結合”の作用を伝達する能力があるようになった、ことを意味する。受容体の“阻害”とは、リガンドの細胞外結合の後で、受容体が“休止”もしくは“不活性”になって、受容体リガンド結合に応答して通常に開始される生化学的反応のカスケードをもはや開始する能力が無いことを意味する。本発明したがって、上で特徴とされる化合物は、機能性細胞の表面受容体の活性化もしくは阻害の能力がある。
本発明の機能的細胞の表面受容体は、好ましい実施態様では、FGFR1、FGFR2、FGFR3およびFGFR4を含む繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR類)のファミリーの受容体である。最も好ましい実施態様では、本発明の受容体は、FGFR1もしくはその機能性同族体である。
用語“受容体の機能性同族体”により、
i)FGFRの細胞外結合およびそれにより細胞の中での受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、ならびに/もしくは、
ii)FGFRのアダプター分子の細胞内結合およびそれにより細胞の中の受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、
の能力がある分子が意味される。
i)FGFRの細胞外結合およびそれにより細胞の中での受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、ならびに/もしくは、
ii)FGFRのアダプター分子の細胞内結合およびそれにより細胞の中の受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、
の能力がある分子が意味される。
用語“結合”とは、FGFRもしくはFGFR同族体およびFGFRに対する結合部位を有する対分子との間の直接的なまたは間接的な相互作用を指す。本明細書では、対分子は、FGFRの細胞外リガンドであるか、もしくは細胞内アダプター分子である。“アダプター分子”とは、本発明の内容では、受容体の“活性な状態”を認識し、そのような受容体に選択的に結合して、シグナル伝達の反応のカスケードを誘発することにより細胞の中で“活性化された受容体”のシグナルを運ぶ能力がある分子として規定される。分子内アダプター分子は、例えば、STN、FRS、Grb、SHP2、PLCyもしくはPIP3により表され得る。
受容体の活性化は、リガンド結合により誘発される受容体二量化にしばしば依存する。それ故に、化合物が受容体分子の二量化(もしくは多量化)を促進する能力は、有利な特徴として本発明に関与する。かくして、一つの実施態様では、本発明は、FGFRを二量化する能力がある化合物を特徴とする。本発明の化合物による受容体の二量化は、例えば、受容体の天然の高親和性リガンド、例えばFGF、が受容体環境の中に不在であって、受容体が暫定的に“休止”、不活性であるときの状況で、起こり得る。しかしながら、一つのFGF類の存在下では、受容体がこのFGFにより占有されて、活性化されていて、それ故に、本発明の化合物は、FGFにより誘発されるFGFR受容体シグナル伝達を調整するために低い能力を持つかもしくは能力がが全く無い。それにもかかわらず、本発明の化合物は、もし受容体がFGF暴露に先立って化合物(複数を含む)に暴露されてきているならば、それに代わる結合部位(複数を含む)を占有することにより、FGFRへの天然の高親和性リガンドの結合を減衰し得る。この方式で、本発明の化合物は、FGFに依存する受容体シグナル伝達を調整し得る。受容体の活性化に対する細胞の応答が、例えば、リガンドの受容体との相互作用に親和性の値により、および/もしくはそのような相互作用の持続時間により特徴化され得る、受容体刺激の強度に依存することは当分野において公知である。かくして、FGFおよび受容体の相互作用の親和性および持続時間の両方は、本発明の化合物により影響を及ぼされ得る。したがって、高親和性リガンドにより誘発される受容体シグナル伝達を調整する能力がある、化合物を提供することは、本発明のもう一つの実施態様である。さらなる実施態様は、1)上で考察された低親和性リガンドにより誘発されるFGFR活性化を、本発明の結合部位においてFGFR結合に対して当該リガンドと競合させることにより阻害する能力がある、、化合物(複数を含む)、2)上で考察された低親和性リガンドもしくはもう一つの分子により阻害されるFGFRを活性化する能力があって、当該もう一つの分子が天然FGFR阻害剤もしくは人工的な物質である、化合物(複数を含む)、に関与する。
相互作用の親和性
用語“相互作用”により、化合物が細胞の表面受容体と一過性または永続性の、直接的なもしくは間接的な接触を有することが意味される。
二つの分子間の相互作用は、相互作用の親和性により特徴化され得る。相互作用の親和性は、モル(M)で表される解離平衡定数、Kd、の値により一般的に表される。Kdは、受容体分子からのリガンド分子の解離の速度および当該受容体分子への当該リガンド分子の結合の速度との間の比率を反映して、かくしてこれら二つの分子の間の結合の強度の尺度を表わす。結合が強ければ強いほど、Kdの値はさらに低い。
用語“相互作用”により、化合物が細胞の表面受容体と一過性または永続性の、直接的なもしくは間接的な接触を有することが意味される。
二つの分子間の相互作用は、相互作用の親和性により特徴化され得る。相互作用の親和性は、モル(M)で表される解離平衡定数、Kd、の値により一般的に表される。Kdは、受容体分子からのリガンド分子の解離の速度および当該受容体分子への当該リガンド分子の結合の速度との間の比率を反映して、かくしてこれら二つの分子の間の結合の強度の尺度を表わす。結合が強ければ強いほど、Kdの値はさらに低い。
本発明はFGFRに対して比較的低親和性結合を有する化合物に関する。本発明の低親和性相互作用は、例えば10−3〜10−7Mのような、例えば10−3〜10−6Mのような、例えば10−3〜10−5Mのような、10−3〜10−8Mの範囲の値、または約10−4Mもしくは約10−5Mを有するKdにより特徴づけされる。
受容体の生物学的機能の調節
細胞の表面受容体がリガンド結合における細胞過程を誘発するおよび/もしくは保持する能力は、本明細書では受容体の“生物学的機能”と称される。
本発明は、受容体シグナル伝達を調整することにより、FGFRの生物学的機能を調整する能力がある化合物を特徴とする。“受容体シグナル伝達を調整すること”により、細胞外刺激による受容体の活性化に応答して細胞の中で通常起こる、メッセンジャー分子のカスケードの生産の活性化もしくは阻害が意味される。
細胞の表面受容体がリガンド結合における細胞過程を誘発するおよび/もしくは保持する能力は、本明細書では受容体の“生物学的機能”と称される。
本発明は、受容体シグナル伝達を調整することにより、FGFRの生物学的機能を調整する能力がある化合物を特徴とする。“受容体シグナル伝達を調整すること”により、細胞外刺激による受容体の活性化に応答して細胞の中で通常起こる、メッセンジャー分子のカスケードの生産の活性化もしくは阻害が意味される。
受容体シグナル伝達の活性化もしくは阻害は、当該受容体を発現する細胞の生理学的応答により通常反映される。それ故に、受容体シグナル伝達を調整することにより、細胞応答を調整することが可能である。
本発明は好ましくは、FGFR1が関連するシグナル伝達の活性化もしくは阻害に関与して、それは、i)FGFR1のチロシンリン酸化の程度;ii)例えば、STAT1,JNK,PLCy,ERK,STAT5,PI3K,PKC,FRS2および/もしくはGRB2タンパク質のような、FGFR1が関連するシグナル伝達経路のいずれかに関与する一つもしくはそれ以上の細胞内タンパク質の活性化状態;ならびに/またはiii)細胞応答における変化により例えば反映され得る。
FGFR依存性細胞応答に関与するときには、本発明は、細胞分化もしくは脱分化、アポトーシスもしくは細胞生存、細胞運動性の誘発/阻害から選ばれるが、それに限定されるものではない、細胞の応答に関する。
医薬品
細胞死は、発生しているニューロンの50%がプログラムされた細胞死を通じて除外される、正常なニューロンの発生において、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性状態の病態生理学において、重要な役割を演じている。FGFRおよびそれらのリガンドは発症の間でおよび成人期間の間での両方でニューロンの生存の重要な決定因子であることが示されてきている(Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell tissue Res, 313:139-57)。それ故に、FGFRに結合することおよび活性化することによりニューロン細胞の生存を促進する能力がある化合物が、高度に望ましい。かくして、一つの態様では、本発明は、神経細胞の生存を促進して、神経細胞死を伴う状態の処置のための医薬品として用いられ得る化合物を特徴化する。しかしながら、FGFRシグナル伝達が筋肉およびがん細胞の両方のための生存因子であると示されてきているので(Ozen et al. (2001) J Nat Cancer Inst. 93:1783-90; Miyamoto et al. (1998) J Cell Physiol. 177:58-67; Detilliux et al. (2003) Cardiovasc Res. 57:8-19)、本発明の化合物は、もう一つの型の細胞、例えば、異なる型の筋肉細胞、の生存の促進のための、もしくは、それに代えて、さらにもう一つの型の細胞、例えば、がん細胞の細胞死の促進のための医薬品としてまた使用され得る。
細胞死は、発生しているニューロンの50%がプログラムされた細胞死を通じて除外される、正常なニューロンの発生において、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性状態の病態生理学において、重要な役割を演じている。FGFRおよびそれらのリガンドは発症の間でおよび成人期間の間での両方でニューロンの生存の重要な決定因子であることが示されてきている(Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell tissue Res, 313:139-57)。それ故に、FGFRに結合することおよび活性化することによりニューロン細胞の生存を促進する能力がある化合物が、高度に望ましい。かくして、一つの態様では、本発明は、神経細胞の生存を促進して、神経細胞死を伴う状態の処置のための医薬品として用いられ得る化合物を特徴化する。しかしながら、FGFRシグナル伝達が筋肉およびがん細胞の両方のための生存因子であると示されてきているので(Ozen et al. (2001) J Nat Cancer Inst. 93:1783-90; Miyamoto et al. (1998) J Cell Physiol. 177:58-67; Detilliux et al. (2003) Cardiovasc Res. 57:8-19)、本発明の化合物は、もう一つの型の細胞、例えば、異なる型の筋肉細胞、の生存の促進のための、もしくは、それに代えて、さらにもう一つの型の細胞、例えば、がん細胞の細胞死の促進のための医薬品としてまた使用され得る。
細胞の表面受容体の活性は、健康な生物では厳密に調節されている。受容体もしくは受容体のリガンドの変異、異常発現またはプロセシングは、受容体の活性での異常に至って、それ故に受容体の機能障害に至る。受容体の機能障害は次に、種々の細胞過程の誘発および/もしくは維持に受容体を使用する細胞の機能障害の原因である。後者が疾患の発現である。FGFRシグナル伝達の減弱が多数の異なる病態、例えば糖尿病、の発症に至ることがまた知られてきている(Hart et al., Nature 2000, 408:864-8)。FGF受容体の活性化は正常な、ならびに病的な血管新生に関与している(Slavin, Cell Biol Int 1995, 19:431-44)。それは、骨格筋、心筋細胞およびニューロンの発生、増殖、機能化および生存にとって重要である(Merle at al., J Biol Chem 1995, 270:17361-7; Cheng and Mattson, Neuron 1991, 7:1031-41; Zhu et al., Mech Ageing Dev 1999, 108:77-85)。それは正常な腎臓の構造の維持に役割を果たしており(Cancilla et al., Kidney Int 2001, 60:147-55)、そして創傷治癒およびがん疾患に関係している(Powers et al., Endocr Relat Cancer. 2000, 7:165-97)。
本発明は、FGFR類の活性の調整に能力がある化合物を提供する。その結果、当該化合物は、FGFR類の活性の調整が治療のための必須な条件と考えられ得る、疾患の処置のための医薬としての発明に関係する。
かくして、本発明の医薬品は一つの態様では、
1)中枢のおよび末梢の神経系の、または筋肉のもしくは種々の器官の、疾患ならびに状態、ならびに/または
2)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、のような、中枢のおよび末梢の神経系の疾患または状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害;
3)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置のために;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患もしくは状態の処置のために、ならびに/または
4)がん疾患、ならびに/または
5)プリオン病
の予防ならびに/または処置のためである。
本発明は、新血管新生を必要とするすべての型の固形腫瘍であるがんに関与する。
1)中枢のおよび末梢の神経系の、または筋肉のもしくは種々の器官の、疾患ならびに状態、ならびに/または
2)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、のような、中枢のおよび末梢の神経系の疾患または状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害;
3)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置のために;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患もしくは状態の処置のために、ならびに/または
4)がん疾患、ならびに/または
5)プリオン病
の予防ならびに/または処置のためである。
本発明は、新血管新生を必要とするすべての型の固形腫瘍であるがんに関与する。
本発明は、スクレーピー、クロイツフェルトヤコブ病からなる群より選択されるプリオン病に関与する。FGFR類はプリオン病において明確な役割を果たすことが示されてきている(Castelnau et al. (1994) Exp Neurobiol. 130:407-10; Ye and Carp (2002) J Mol Neurosci. 18:179-88)。
もう一つの実施態様では、本発明の化合物は、
1)創傷治癒の促進、および/または
2)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞の細胞死の予防、ならびに/または
3)血管再生
のための医薬品の製造のためである。
1)創傷治癒の促進、および/または
2)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞の細胞死の予防、ならびに/または
3)血管再生
のための医薬品の製造のためである。
FGFR類およびそれらのリガンドは中枢神経において重要な役割を果たしていて、特にそれらは、記憶および学習に関係する過程に関与している(Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell Tissue Res. 313:139-57)。かくして、さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は学習する能力ならびに/または短期のおよび/もしくは長期の記憶の刺激のためである。この実施態様は本発明の好ましい実施態様の一つである。
さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は、
1)虚血による細胞死の予防;
2)アルコール摂取による身体損傷の予防;
のための医薬品の製造のためである。
1)虚血による細胞死の予防;
2)アルコール摂取による身体損傷の予防;
のための医薬品の製造のためである。
なおさらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は、正常な、変性したもしくは損傷した細胞の処置のための医薬品の製造のためであって、それらは、
―神経細胞接着分子(NCAM)(Swiss-Prot受託番号:P13591、P13595−01、P13595)、
―神経細胞接着分子L1(Swiss-Prot受託番号:Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
―神経細胞接着分子−2(NCAM−2)(Swiss-Prot受託番号:P36355)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ng−CAM)(Swiss-Prot受託番号:Q03696;Q90933)、
―神経細胞接着分子CALL(Swiss-Prot受託番号:O00533)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号:P91767、P20241)、
―Nr−CAM(HBRAVO、NRCAM、NR−CAM12)(Swiss-Prot受託番号:Q92823、O15179、Q9QVN3)、
―アクソニン−1/TAG−1(Swiss-Prot受託番号:Q02246、P22063、P28685)、
―軸索に関連する細胞接着分子(AxCAM)(NCBI Ass. 番号:NP_031544.1;Swiss-Prot受託番号:Q8TC35)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(MAG)(Swiss-Prot受託番号:P20917)、
―神経細胞接着分子BIG−1(Swiss-Prot受託番号:Q62682)、
―神経細胞接着分子BIG−2(Swiss-Prot受託番号:Q62845)、
―ファシクリン(FAS−2)(Swiss-Prot受託番号:P22648)、
―神経細胞接着分子HNB−3/NB−3(Swiss-Prot受託番号:Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
―神経細胞接着分子HNB−2/NB−2(Swiss-Prot受託番号:O94779、P07409、P97527)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号:Q9VW71)、
―接合部接着分子−1(JAM−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JKD5、O88792)、
―神経細胞接着F3/F11(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号:Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号:Q90924、Q91Z60;O42414)、
―B−リンパ球細胞接着分子CD22(Swiss-Prot受託番号:Q9R094、P20273)、
―ネオゲニン(NEO1)(Swiss-Prot受託番号:Q92859、P97603、Q90610、P97798)、
―細胞内細胞接着分子−5(ICAM−5/テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号:Q8TAM9、Q60625)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−12(ガレクチン−12)(Swiss-Prot受託番号:Q91VD1、Q9JKX2、Q9NZ03)、
―ガラクトース結合レクチン−4(ガレクチン−4)(Swiss-Prot受託番号:Q8K419;P38552)、
―繊維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QZM7、Q99AVV7、Q9UD50、Q63827)、
―繊維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss-Prot受託番号:Q96KM2、P21802、Q63241)、
―神経細胞接着分子(NCAM)(Swiss-Prot受託番号:P13591、P13595−01、P13595)、
―神経細胞接着分子L1(Swiss-Prot受託番号:Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
―神経細胞接着分子−2(NCAM−2)(Swiss-Prot受託番号:P36355)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ng−CAM)(Swiss-Prot受託番号:Q03696;Q90933)、
―神経細胞接着分子CALL(Swiss-Prot受託番号:O00533)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号:P91767、P20241)、
―Nr−CAM(HBRAVO、NRCAM、NR−CAM12)(Swiss-Prot受託番号:Q92823、O15179、Q9QVN3)、
―アクソニン−1/TAG−1(Swiss-Prot受託番号:Q02246、P22063、P28685)、
―軸索に関連する細胞接着分子(AxCAM)(NCBI Ass. 番号:NP_031544.1;Swiss-Prot受託番号:Q8TC35)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(MAG)(Swiss-Prot受託番号:P20917)、
―神経細胞接着分子BIG−1(Swiss-Prot受託番号:Q62682)、
―神経細胞接着分子BIG−2(Swiss-Prot受託番号:Q62845)、
―ファシクリン(FAS−2)(Swiss-Prot受託番号:P22648)、
―神経細胞接着分子HNB−3/NB−3(Swiss-Prot受託番号:Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
―神経細胞接着分子HNB−2/NB−2(Swiss-Prot受託番号:O94779、P07409、P97527)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号:Q9VW71)、
―接合部接着分子−1(JAM−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JKD5、O88792)、
―神経細胞接着F3/F11(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号:Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号:Q90924、Q91Z60;O42414)、
―B−リンパ球細胞接着分子CD22(Swiss-Prot受託番号:Q9R094、P20273)、
―ネオゲニン(NEO1)(Swiss-Prot受託番号:Q92859、P97603、Q90610、P97798)、
―細胞内細胞接着分子−5(ICAM−5/テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号:Q8TAM9、Q60625)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−12(ガレクチン−12)(Swiss-Prot受託番号:Q91VD1、Q9JKX2、Q9NZ03)、
―ガラクトース結合レクチン−4(ガレクチン−4)(Swiss-Prot受託番号:Q8K419;P38552)、
―繊維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QZM7、Q99AVV7、Q9UD50、Q63827)、
―繊維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss-Prot受託番号:Q96KM2、P21802、Q63241)、
―繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)(Swiss-Prot受託番号:Q95M13、AF487554、Q99052)、
―繊維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss-Prot受託番号:Q91742)、
―2型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(NTRKT−2)(Swiss-Prot受託番号:Q8WXJ5)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (LAR−PTPRF)(Swiss-Prot受託番号:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8、P10586)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
―タンパク質−S型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRS)(Swiss-Prot受託番号:Q64699、Q13332、O75870)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(R−PTP−カッパ)(Swiss-Prot受託番号:Q15262)、
―タンパク質−D型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRD)(Swiss-Prot受託番号:Q8WX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、
―A型エフリン受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss-Prot受託番号:O09127、P29322)、
―A型エフリン受容体3(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ETK−1/CEK4)(Swiss-Prot受託番号:P29318)、
―A型エフリン受容体2(Swiss-Prot受託番号:Q8N3Z2)、
―インスリン受容体(IR)(Swiss-Prot受託番号:Q9PWN6)、
―インスリン様受容体成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、
―繊維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss-Prot受託番号:Q91742)、
―2型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(NTRKT−2)(Swiss-Prot受託番号:Q8WXJ5)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (LAR−PTPRF)(Swiss-Prot受託番号:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8、P10586)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
―タンパク質−S型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRS)(Swiss-Prot受託番号:Q64699、Q13332、O75870)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(R−PTP−カッパ)(Swiss-Prot受託番号:Q15262)、
―タンパク質−D型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRD)(Swiss-Prot受託番号:Q8WX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、
―A型エフリン受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss-Prot受託番号:O09127、P29322)、
―A型エフリン受容体3(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ETK−1/CEK4)(Swiss-Prot受託番号:P29318)、
―A型エフリン受容体2(Swiss-Prot受託番号:Q8N3Z2)、
―インスリン受容体(IR)(Swiss-Prot受託番号:Q9PWN6)、
―インスリン様受容体成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、
―インスリン関連受容体(IRR)(Swiss-Prot受託番号:P14616)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss-Prot受託番号:06805、P35590、Q06806)、
―ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss-Prot受託番号:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ3サブユニット(CHRNA3)(Swiss-Prot受託番号:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ6サブユニット(Swiss-Prot受託番号:Q15825、Q9R0W9)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(PDGFRB)(Swiss-Prot受託番号:Q8R406、Q05030)、
―インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss-Prot受託番号:Q00560)、
―インターロイキン−23受容体(IL−23R)(Swiss-Prot受託番号:AF461422)、
―IL−3、IL5およびGmCsfのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号:P32927)、
―サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JM58)、
―クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot受託番号:Q9UHH5)、
―ネトリン−1受容体DCC(Swiss-Prot受託番号:P43146)、
―白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss-Prot受託番号:Q96PJ6、Q96KM2)、
―マクロファージ捕捉剤受容体2(MSR2)(Swiss-Prot受託番号:Q91YK7)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss-Prot受託番号:Q99062)、
パーレカン(Swiss-Prot受託番号:P98160)
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:Q05910)、
―ADAM−19(Swiss-Prot受託番号:Q9H013、O35674)、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:P78325)、
―ADAM−12(Swiss-Prot受託番号:O43184、Q61824)、
―ADAM−28(Swiss-Prot受託番号:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、
―ADAM−33前駆体(Swiss-Prot受託番号:Q8R533、Q923W9)、
―ADAM−9(Swiss-Prot受託番号:Q13433、Q61072)、
―ADAM−7(Swiss-Prot受託番号:Q9H2U9、O35227、Q63180)、
―ADAM−1Aフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号:Q8R533)、
―ADAM−15(Swiss-Prot受託番号:Q9QYV0、O88839、Q13444)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss-Prot受託番号:AF163291)、
―金属プロテイナーゼ1(Swiss-Prot受託番号:O95204、Q9BSI6)、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号:Q63870)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号:Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、O95609、P11276)、もしくは
―テネイシン−R(Swiss-Prot受託番号:Q15568、O00531、Q90995、P10039)、
サイトカイン様因子−1(CLF−1)(Swiss-Prot受託番号:O75462)、
またはそのフラグメント、もしくは変異体
からなる群より選択される一つまたはそれ以上を通常インビボで発現する。
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss-Prot受託番号:06805、P35590、Q06806)、
―ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss-Prot受託番号:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ3サブユニット(CHRNA3)(Swiss-Prot受託番号:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ6サブユニット(Swiss-Prot受託番号:Q15825、Q9R0W9)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(PDGFRB)(Swiss-Prot受託番号:Q8R406、Q05030)、
―インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss-Prot受託番号:Q00560)、
―インターロイキン−23受容体(IL−23R)(Swiss-Prot受託番号:AF461422)、
―IL−3、IL5およびGmCsfのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号:P32927)、
―サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JM58)、
―クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot受託番号:Q9UHH5)、
―ネトリン−1受容体DCC(Swiss-Prot受託番号:P43146)、
―白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss-Prot受託番号:Q96PJ6、Q96KM2)、
―マクロファージ捕捉剤受容体2(MSR2)(Swiss-Prot受託番号:Q91YK7)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss-Prot受託番号:Q99062)、
パーレカン(Swiss-Prot受託番号:P98160)
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:Q05910)、
―ADAM−19(Swiss-Prot受託番号:Q9H013、O35674)、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:P78325)、
―ADAM−12(Swiss-Prot受託番号:O43184、Q61824)、
―ADAM−28(Swiss-Prot受託番号:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、
―ADAM−33前駆体(Swiss-Prot受託番号:Q8R533、Q923W9)、
―ADAM−9(Swiss-Prot受託番号:Q13433、Q61072)、
―ADAM−7(Swiss-Prot受託番号:Q9H2U9、O35227、Q63180)、
―ADAM−1Aフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号:Q8R533)、
―ADAM−15(Swiss-Prot受託番号:Q9QYV0、O88839、Q13444)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss-Prot受託番号:AF163291)、
―金属プロテイナーゼ1(Swiss-Prot受託番号:O95204、Q9BSI6)、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号:Q63870)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号:Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、O95609、P11276)、もしくは
―テネイシン−R(Swiss-Prot受託番号:Q15568、O00531、Q90995、P10039)、
サイトカイン様因子−1(CLF−1)(Swiss-Prot受託番号:O75462)、
またはそのフラグメント、もしくは変異体
からなる群より選択される一つまたはそれ以上を通常インビボで発現する。
特に、本発明は正常な、変性した、もしくは損傷したNCAMを提示する細胞に関与する。
本発明の医薬品は、上で規定されるように一つもしくはそれ以上の化合物、または一つもしくはそれ以上の化合物および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物、の有効量を含む。
かくして、本発明はもう一つの態様においてまた、本発明の少なくとも一つの化合物を含む医薬組成物に関与する。
本発明の医薬品は、上で規定されるように一つもしくはそれ以上の化合物、または一つもしくはそれ以上の化合物および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物、の有効量を含む。
かくして、本発明はもう一つの態様においてまた、本発明の少なくとも一つの化合物を含む医薬組成物に関与する。
本発明のさらなる態様は、本発明の一つもしくはそれ以上の化合物または本発明にしたがう医薬組成物の有効量を、一つもしくはそれ以上の薬学的に許容される添加剤または担体と混合することを含む、医薬組成物を製造する方法である。一つの実施態様では、化合物は、用具が補綴神経ガイドである、補綴用具との併用で用いられる。かくして、さらなる態様においては、本発明は、それが上で規定されるように一つもしくはそれ以上の化合物または医薬組成物を含むことを特徴とする、補綴神経ガイドに関する。神経ガイドは本分野において既知である。
本発明は、下で言及される疾患および状態のいずれかの処置もしくは予防のための本発明の化合物を含む医薬品ならびに/または医薬組成物の使用に関する。
そのような医薬品および/もしくは医薬組成物は、経口的な、経皮的な、筋肉内の、静脈内の、頭蓋内の、くも膜下腔内の、側脳室内の、鼻腔内のもしくは肺的な投与のために適当に処方され得る。
本発明の化合物に基づく医薬品および組成物の処方開発における戦略は一般的に、任意の他のタンパク質を基盤とする医薬製品のための処方戦略に相当する。潜在的な問題およびそれらの問題を克服するために必要とされる指針は、幾つかの教科書、例えば、“Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems”, Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995、で扱われている。
注射剤は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前での液体の中での溶液にもしくは懸濁液に適する固体形の、いずれかとして通常調製される。製剤はまた乳化され得る。活性成分は、活性成分と薬学的に許容されて、適合する添加物としばしば混合される。適当な添加物は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびそれらの組合せである。加えて、望まれるならば、製剤は湿潤化剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤のような、または製剤の有効性もしくは輸送を増強させる、補助的物質の少量を含有し得る。
本発明の化合物の製剤を、当業者には公知の技法により調製することができる。製剤は、マイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子等を含む薬学的に許容される担体および添加物を含有し得る。
製剤は、活性成分が効果を発揮すべきである、部位において任意に、注射により適当に投与され得る。他の投与モードに適するさらに別の製剤としては、坐剤、点鼻の、肺的なおよび、或る場合には、経口的な製剤が含まれる。坐剤については、伝統的な結合剤および担体としては、ポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドが含まれる。そのような坐剤は、活性成分(複数を含む)を0.5%〜10%、好ましくは1〜2%の範囲で含有する混合物から形成され得る。経口的製剤は、例えば、製剤的な等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常に使用される添加物を含む。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤もしくは粉末剤の形を取って、一般的には活性成分(複数を含む)の10〜95%、好ましくは25〜70%を含有する。
他の製剤は、点鼻のおよび経肺的な投与に適するそのようなもの、例えば、吸入剤およびエアロゾルである。
他の製剤は、点鼻のおよび経肺的な投与に適するそのようなもの、例えば、吸入剤およびエアロゾルである。
活性化合物は中性のもしくは塩の形として処方され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩(ペプチド化合物の遊離アミノ酸で形成される)が含まれ、そして例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄水酸化物の様な無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基からまた誘導され得る。
製剤は、投与剤型に適合する様式で、および治療的に有効であろうような量で、投与される。投与されるべき量は、例えば、対象の体重および年齢、処置されるべき疾患および疾患の段階を含んで、処置されるべき対象に依存する。適当な投与量範囲は、キログラム体重当り約0.1μg〜5000μgの好ましい範囲であって、通常キログラム体重当り投与当たり数百μgの桁の活性成分である。化合物の単量体形を用いると、適当な投与量は、キログラム体重当り約0.1μg〜3000μgの範囲でのような、特にキログラム体重当り約0.1μg〜1000μgの範囲でのような、キログラム体重当り0.1μgから5000μgまでの範囲にしばしばある。化合物の多回投与形を用いると、適当な投与量は、キログラム体重当り約0.1μg〜750μgの範囲でのような、特に、キログラム体重当り約0.1μg〜250μgの範囲でのような、キログラム体重当り約0.1μg〜500μgの範囲でのように、キログラム体重当り0.1μg〜1000μgの範囲にしばしばある。特に、点鼻的に投与するときは、他の経路により投与するときよりも、さらに少ない投与量が用いられる。投与は一度で実施され得るか、もしくは後続の投与に引き継がれ得る。投与量は投与経路にまた依存するであろうし、そして処置されるべき対象の年齢および体重で変動するであろう。多量体形の好ましい投与量は、70kg体重当り1mg〜70mgの間隔にあるであろう。
或る適応症に対しては、局所化されたかもしくは実質的に局所化された適用が好ましい。他の適応症に対しては、鼻腔内適用が好ましい。
或る適応症に対しては、局所化されたかもしくは実質的に局所化された適用が好ましい。他の適応症に対しては、鼻腔内適用が好ましい。
本発明の化合物の幾つかは十分に活性であるが、他の幾つかに対しては、もし製剤が薬学的に許容される添加剤および/もしくは担体をさらに含むならば、作用が増強されるであろう。そのような添加剤および担体は、本分野において公知であろう。或る場合には、活性物質のその標的への送達を促進する、化合物を含むことは有利であろう。
多くの例では、製剤を多数回に投与することが必要になるであろう。投与は、心室内注入のような、連続的注入、もしくは一日につき、毎日、より多数回に、一週間につき、毎週、多数回に、等のようなさらに多い投与量での投与であり得る。細胞死に導き得る因子(複数を含む)に個人が供されてしまう以前もしくは直後に、医薬品の投与を開始することが好ましい。好ましくは、因子発症から5時間以内のような、因子発症から8時間以内に、医薬品を投与する。化合物の多くは、それにより化合物の投与が1週間もしくは2週間のような、長い間隔で実施され得る、長期効果を呈示する。
神経ガイドの中での使用に関連して、投与は、活性化合物(複数を含む)の徐放性に基づき連続的でもしくは小分量であり得る。さらに、放出の速度および/もしくは放出の部位を制御するために、前駆体を用い得る。他の種類のインプラントならびに経口投与は、徐放性および/もしくは前駆体の使用に同様に基づき得る。
処置
本発明にしたがう化合物/組成物の使用による処置は、一つの実施態様において、分化を誘発すること、増殖を調整すること、再生、ニューロンの可塑性、および細胞、例えばインプラントされたもしくは移植された細胞の生存を刺激するために有用である。長期作用を有する化合物を使用するときに、これは特に有用である。
本発明にしたがう化合物/組成物の使用による処置は、一つの実施態様において、分化を誘発すること、増殖を調整すること、再生、ニューロンの可塑性、および細胞、例えばインプラントされたもしくは移植された細胞の生存を刺激するために有用である。長期作用を有する化合物を使用するときに、これは特に有用である。
さらなる実施態様において、処置は、外傷および損傷、急性疾患、慢性疾患ならびに/または障害、特に通常では細胞死に至る変性疾患、X線および化学療法のような、フリーラジカルを生成引き起こすかさもなければ細胞毒性作用を有する内科的および/もしくは外科的処置ならびに/または診断法のような、他の外的要因、のような種々の要因による死亡の危険にある細胞の生存の刺激のためであり得る。化学療法との関連において、本発明にしたがうFGFR結合化合物はがんの処置に有用である。
かくして、処置は、術後神経損傷、例えば脊髄損傷に起因する、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病に関連する神経変性、神経筋変性、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、もしくはハンチントン病のような、中枢のおよび末梢の神経系の疾患または状態に関連する細胞死の処置ならびに/または予防を含む。
また、遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような、神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態に関連して;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような、膵臓の、腎症のような、腎臓の、変性異常のような、種々の器官の疾患または状態の処置のために、本発明にしたがう化合物は、分化を誘発すること、増殖を調整すること、再生、ニューロンの可塑性および生存を刺激すること、即ち生存を刺激することのために使用され得る。
さらに、化合物および/もしくは医薬組成物は、血管新生を誘発するために、急性心筋梗塞後のような、心筋細胞の細胞死を予防するためにあり得る。さらに、一つの実施態様では、化合物および/もしくは医薬組成物は、急性心筋梗塞後の生存のような、心筋細胞の生存の刺激のためである。もう一つの態様では、化合物および/もしくは医薬組成物は、傷害後のような、血管再生用のためである。
化合物および/もしくは医薬組成物の創傷治癒の促進のための使用は、また本発明の範囲内である。本化合物は血管新生を刺激する能力があって、それによりそれらは創傷治癒過程を促進することができる。
本発明はさらに、がんの処置における化合物および/もしくは医薬組成物の使用を開示する。FGFRの活性化の調節は、腫瘍の血管新生、増殖および拡散に重要である。
なおさらなる実施態様では、FGFR活性が神経細胞の分化にために重要であるので、化合物および/もしくは医薬組成物の使用は学習する能力ならびに/または短期のおよび/もしくは長期の記憶の刺激のためである。
さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物および/もしくは医薬組成物は、アルコール摂取による身体損傷の処置のためにある。胎児の発生奇形、長期の神経行動学的変化、アルコール性肝疾患が特に関係している。
化合物および/もしくは医薬組成物を使用することを含むプリオン病の治療的処置は、本発明のさらにもう一つの実施態様である。
化合物および/もしくは医薬組成物を使用することを含むプリオン病の治療的処置は、本発明のさらにもう一つの実施態様である。
特に、本発明の化合物および/もしくは医薬組成物は、悪性新生物、良性新生物、上皮内がんおよび不特定行動の新生物のような新生物、糖尿病のような、内分泌腺の疾患、老人性のおよび初老性の器質性精神異常状態、アルコール性精神病、薬物性精神病、一過性の器官性精神異常状態、アルツハイマー病のような精神病、脳類脂質沈着症、癲癇、進行麻痺(梅毒)、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、ヤコブ−クロイツフェルト病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合失調性障害、情動障害、神経症性障害、性格神経症を含む人格障害、器官性脳症候群に関連する非精神性人格障害、妄想性人格障害、狂信性人格、偏執性人格(障害)、偏執的素質、性的倒錯および障害、精神発達遅滞、神経系および感覚器官の疾患、認知異常、髄膜炎、全脳炎のような中枢神経系の炎症性疾患、アルツハイマー病、ピック病、老人性脳変性のような脳変性、交通性水頭症、閉塞性水頭症、他の錐体外路系疾患および異常運動障害を含むパーキンソン病、脊髄小脳疾患、小脳性運動失調症、マリー運動失調、サンガー−ブラウン運動失調、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、脊髄性筋萎縮症、家族性の、若年性の、成人性の脊髄性筋萎縮症のような原発性小脳変性症、運動神経疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性球麻痺、仮性球麻痺、原発性側索硬化症、他の前角細胞性疾患、前角細胞性疾患、脊髄の非特異的な、他の疾患、脊髄空洞症および延髄空洞症、血管性脊髄症、急性脊髄梗塞(閉塞性)(非閉塞性)、脊髄の動脈血栓症、脊髄の浮腫、亜急性の壊死性ミエロパシー、その他に分類される疾患における脊髄の亜急性の複合変性、ミエロパシー、薬剤誘発性、放射線誘発性脊髄炎、自律神経系の障害、末梢性自律神経の、交感の、副交感の、もしくは植物の系の障害、家族性自律神経失調症[ライリー−デイ症候群]、
特発性末梢自律神経ニューロパシー、頚動脈洞性失神または症候群、頸部交感神経性ジストロフィーまたは麻痺、その他に分類される障害における末梢性自律神経ニューロパシー、アミロイドーシス、末梢神経系疾患、上腕神経叢の病変、頚肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、新生児においてを含む、腕神経叢炎もしくは上肢神経根炎、急性感染性多発神経炎を含む炎症性および中毒性ニューロパシー、ギラン−バレー症候群、感染後多発性神経炎、膠原血管病における多発神経炎、眼の多重構造に影響を及ぼす疾患、化膿性内眼球炎、耳および乳様突起の疾患、慢性リウマチ性心疾患、虚血性心疾患、不整脈、肺系での疾患、神経系の中を含む、新生児における器官および軟組織の異常、陣痛および出産時における麻酔薬または他の鎮静剤投与の合併症、感染症を含む皮膚疾患、循環不全問題、術後傷害を含む、傷害、挫傷、熱傷、神経断裂を含む、神経および脊髄の傷害、関節の病変(開放創の有無で)、外傷性神経腫(開放創の有無で)、外傷性の一次的麻痺(開放創の有無で)、施療の間の不慮の刺傷または裂傷、視神経および視覚経路への傷害、視神経傷害、第2脳神経、視交叉への傷害、視覚経路への傷害、視皮質への傷害、不特定の盲目、他の脳神経への傷害、他のおよび不特定の神経への傷害、薬物、医薬のおよび生物の物質による中毒、遺伝性のもしくは外傷性の筋萎縮性障害のような臨床的状態の処置に;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような、膵臓の、腎症のような、腎臓の変性状態、スクレイピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカ(GSS)病のような種々の器官の疾患もしくは状態の処置に使用され得る。
本発明にしたがって、上の状態および症状の処置および/もしくは防止は、必要とする個人に化合物および/もしくは医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。
実施例1:本発明のFGLペプチド(配列番号1)および他のペプチドの異なる製剤の製造
FGLの個別なペプチド鎖の固相合成
例えば、EFLペプチドのような、本発明のFGLおよび他のペプチド配列の個別なペプチド鎖は、上で記述されるように標準的なFmocの固相方法により合成される。実験に用いられるペプチドの合成は、TentaGel S RAM樹脂(90mg、0.22mmol/mg)の上で実施される。樹脂をろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に入れた。樹脂をDMFの中で膨潤させて、DMF中の20%ピペリジンで処理して、樹脂上での非保護アミノ基の存在を確保した。その後に、樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に何も検出できなくなるまで、DMFで洗浄した。一度に一つずつFmoc−基の除去を交互にして、アミノ酸をカップリングした。成長する樹脂に結合されたペプチド鎖にカップリングする前に、Fmoc−アミノ酸を、DMF中でTBTU/HOBTにより予め活性化した。Fmoc−基の除去のためには、DMF中のピペリジン溶液を用いた。
FGLの個別なペプチド鎖の固相合成
例えば、EFLペプチドのような、本発明のFGLおよび他のペプチド配列の個別なペプチド鎖は、上で記述されるように標準的なFmocの固相方法により合成される。実験に用いられるペプチドの合成は、TentaGel S RAM樹脂(90mg、0.22mmol/mg)の上で実施される。樹脂をろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に入れた。樹脂をDMFの中で膨潤させて、DMF中の20%ピペリジンで処理して、樹脂上での非保護アミノ基の存在を確保した。その後に、樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたDMFへのDhbt−OHの付加の後に何も検出できなくなるまで、DMFで洗浄した。一度に一つずつFmoc−基の除去を交互にして、アミノ酸をカップリングした。成長する樹脂に結合されたペプチド鎖にカップリングする前に、Fmoc−アミノ酸を、DMF中でTBTU/HOBTにより予め活性化した。Fmoc−基の除去のためには、DMF中のピペリジン溶液を用いた。
FGLダイマーのLPA製造
本出願のFGLのLPA−型ダイマー(FGLL)は、WO 00/18791で記述されるようにTBTU/HOBtを用いて、Boc−イミノジ酢酸を樹脂の上でペプチドにカップリングすることにより作成された。副反応を減らすために、多数回カップリングを、限定成分としてBoc−イミノジ酢酸で実施した。ペプチドを樹脂から切断して、スカベンジャーとしてのTESおよび水の存在下でTFAの中にて側鎖上で同時に脱保護して、ペプチドアミドを与えた。TFAの量を蒸発により減少して、ペプチドを沈殿させた。FGLLの最終精製を逆相HPLCにより為した。HPLCの条件は、以下のとおりであった:
カラム:YMC ODS−AMQ、5μm、4.6×250mm、200A
流量:1.0ml/分
移動層:A:0.12%TFA、95%H2O、5%ACN
B:0.1%TFA、95%ACN、5%H2O
グラジエント:20分で15%Bから35%Bへ
1分で35%Bから95%Bへそして5分間保持、
検出:ダイオードアレー検出器190〜400nm
波長:220nm
注入量:20μl
FGLLの濃度: 0.5mg/ml
本出願のFGLのLPA−型ダイマー(FGLL)は、WO 00/18791で記述されるようにTBTU/HOBtを用いて、Boc−イミノジ酢酸を樹脂の上でペプチドにカップリングすることにより作成された。副反応を減らすために、多数回カップリングを、限定成分としてBoc−イミノジ酢酸で実施した。ペプチドを樹脂から切断して、スカベンジャーとしてのTESおよび水の存在下でTFAの中にて側鎖上で同時に脱保護して、ペプチドアミドを与えた。TFAの量を蒸発により減少して、ペプチドを沈殿させた。FGLLの最終精製を逆相HPLCにより為した。HPLCの条件は、以下のとおりであった:
カラム:YMC ODS−AMQ、5μm、4.6×250mm、200A
流量:1.0ml/分
移動層:A:0.12%TFA、95%H2O、5%ACN
B:0.1%TFA、95%ACN、5%H2O
グラジエント:20分で15%Bから35%Bへ
1分で35%Bから95%Bへそして5分間保持、
検出:ダイオードアレー検出器190〜400nm
波長:220nm
注入量:20μl
FGLLの濃度: 0.5mg/ml
HPLC精製されたFGLLを凍結乾燥により単離した。FGLL合成のフローチャートを、図1に示す。図2はFGLLの最終精製のHPLC溶出プロフィールを描く。
略語
アミノ酸についての略語は、IUPAC-IUB Joint Commision on Bio-Chemical Nomemclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37の推奨基準にしたがっている。
アミノ酸についての略語は、IUPAC-IUB Joint Commision on Bio-Chemical Nomemclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37の推奨基準にしたがっている。
他の略語
AcOH 酢酸
TBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウム四フッ化ホウ素酸塩
ida Bocイミノジ酢酸
MTBE t−ブチルメチルエーテル
DMF ジメチルホルムアミド
EtOH エタノール、99.9%
DIPEA N−エチル−ジイソプロピルアミン
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMP N−メチルピロリドン
TFA トリフルオロ酢酸
TES トリエチルシラン
Boc N−tertブチルオキシカルボニル
Fmoc 9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu tert−ブチル
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
R アミド−TG−樹脂
AA アミノ酸
AcOH 酢酸
TBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウム四フッ化ホウ素酸塩
ida Bocイミノジ酢酸
MTBE t−ブチルメチルエーテル
DMF ジメチルホルムアミド
EtOH エタノール、99.9%
DIPEA N−エチル−ジイソプロピルアミン
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMP N−メチルピロリドン
TFA トリフルオロ酢酸
TES トリエチルシラン
Boc N−tertブチルオキシカルボニル
Fmoc 9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu tert−ブチル
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
R アミド−TG−樹脂
AA アミノ酸
FGLLの物理化学的性質
FGLLは構造式:
を有する。
それは、それらのN−末端上でリンカー基、アミド酢酸(N−(カルボキシメチル)グリシン)、により共−接合される15個のアミノ酸残基の二つの同一のペプチド配列から成る。FGLLの分子量は、3394.8ダルトンである。濃縮された水溶液(0.5mg/mlよりさらに高い)の中でのペプチド化合物の非共有結合性の会合は、酢酸の添加により防止される。
FGLLは構造式:
それは、それらのN−末端上でリンカー基、アミド酢酸(N−(カルボキシメチル)グリシン)、により共−接合される15個のアミノ酸残基の二つの同一のペプチド配列から成る。FGLLの分子量は、3394.8ダルトンである。濃縮された水溶液(0.5mg/mlよりさらに高い)の中でのペプチド化合物の非共有結合性の会合は、酢酸の添加により防止される。
FGLcysおよびFGLlysダイマーの合成
それぞれがS−S結合を通して結合されるN−末端においてさらに別のシステイン残基を含有する、二つの個別なFLG配列から成るFGLcysダイマーを、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で記述される固相合成を用いて合成した。
それらのC−末端を通してリジンにカップリングされる二つの個別なFGL単量体配列として構築される、FGLlysダイマーを、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res.45:173-179の中で記述される固相合成を用いて作成した。
それぞれがS−S結合を通して結合されるN−末端においてさらに別のシステイン残基を含有する、二つの個別なFLG配列から成るFGLcysダイマーを、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で記述される固相合成を用いて合成した。
それらのC−末端を通してリジンにカップリングされる二つの個別なFGL単量体配列として構築される、FGLlysダイマーを、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res.45:173-179の中で記述される固相合成を用いて作成した。
FGLの樹状体テトラマー(FGLd)の合成
FGLのMAP−型樹状体、FGLd、を、例えばPCT/US90/02039の中で記述されるように標準的な方法にしたがって合成した。
図3はFGLDの最終精製のHPLCプロフィールを立証する。斜線をひいた区域は合成された生成物の不均質性のレベルを指し示す。
FGLのMAP−型樹状体、FGLd、を、例えばPCT/US90/02039の中で記述されるように標準的な方法にしたがって合成した。
図3はFGLDの最終精製のHPLCプロフィールを立証する。斜線をひいた区域は合成された生成物の不均質性のレベルを指し示す。
実施例2:インビトロにおけるニューロンの生存へのFGLの種々の製剤の作用
FGLペプチドの種々の製剤を当分野で周知の生存アッセイにおける生物活性について比較して、以下に詳細に記述した。
FGLペプチドの種々の製剤を当分野で周知の生存アッセイにおける生物活性について比較して、以下に詳細に記述した。
ドーパミン作動性ニューロン(DN)
ドーパミン作動性ニューロンを、胎日数15日目のウイスターラットの胚から調製した(Charles River, Sulzfeld, Germany or Mollegaard, Denmark)。妊娠ラットを屠殺して子宮を取り出して、ハンクの平衡塩類溶液(HBSS;Gibco, BRL)の中で氷上で保存した。胚の脳から中脳の腹側部を切り出し、グルコース5g/lで補足されたゲイの平衡塩類溶液(GBSS;Gibco, BRL)(Sigma-Aldrich)の中で氷上でホモジナイズして、その後でトリプシン化した。解離した細胞をDNア−ゼ1およびダイズトリプシン阻害剤(Sigma-Aldrich)の存在下に洗浄した。
ドーパミン作動性ニューロンを、胎日数15日目のウイスターラットの胚から調製した(Charles River, Sulzfeld, Germany or Mollegaard, Denmark)。妊娠ラットを屠殺して子宮を取り出して、ハンクの平衡塩類溶液(HBSS;Gibco, BRL)の中で氷上で保存した。胚の脳から中脳の腹側部を切り出し、グルコース5g/lで補足されたゲイの平衡塩類溶液(GBSS;Gibco, BRL)(Sigma-Aldrich)の中で氷上でホモジナイズして、その後でトリプシン化した。解離した細胞をDNア−ゼ1およびダイズトリプシン阻害剤(Sigma-Aldrich)の存在下に洗浄した。
生存アッセイのために、単離されたニューロンを細胞150,000個/cm2の密度で上で記述されるようにポリD-リジンで被膜された24−穴の細胞培養プレートの中に接種した。種々の濃度のFGLペプチドの有無でニューロンを6日間分化させた後で、6−OHDAを100μMの濃度で2時間添加した。原液を、酸化を防止するために0.1%(W/v)のメタ重亜硫酸ナトリウムの中で6−OHDAを10mMの濃度に溶解させることにより調製した。6−OHDAとの2時間後に、培地を、補足剤とペプチドと共にNeurobasal培地に交換して、細胞培養物をさらに24時間インキュベートし、固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。それぞれの個別な実験におけるそれぞれの実験条件について98個の画像を、下でドーパミン作動性神経突起成長アッセイについて記述するように自動的に記録した。
海馬ニューロン(HN)
実験のために、解離された海馬ニューロンを胎日数19日目のウイスターラットもしくは新生仔のラットからRonn et al. (1999) Nat Biotechnol. 17:1000-5により記述されるように、単離した。
略述すると、氷冷した修飾クレブスリンガー液の中で脳から海馬を単離し、血管を除去し、みじん切で粗くホモジナイズして、次いで、トリプシン化した。解離した細胞をDNア−ゼ1およびダイズトリプシン阻害剤の存在下に洗浄した。
実験のために、解離された海馬ニューロンを胎日数19日目のウイスターラットもしくは新生仔のラットからRonn et al. (1999) Nat Biotechnol. 17:1000-5により記述されるように、単離した。
略述すると、氷冷した修飾クレブスリンガー液の中で脳から海馬を単離し、血管を除去し、みじん切で粗くホモジナイズして、次いで、トリプシン化した。解離した細胞をDNア−ゼ1およびダイズトリプシン阻害剤の存在下に洗浄した。
アッセイのために、ニューロンをNeurobasal培地の中の細胞40,000個/cm2の密度で10μg/mlのポリ-L-リジンで被膜された8−穴のパーマノックススライドの上に接種した。平板培養の15分後に、Aβ25〜35を20μMの最終濃度になるように添加した。Aβ25〜35を無菌の脱イオン水中に平板培養に先立って3mMの濃度に溶解して、Pigino et al. (2001) J Neurosci. 21:834-42にしたがって37℃で4日間インキュベートした。この処理はAβフラグメントの繊維化を誘発して、それにより神経毒性活性を増加させる。FGLペプチドを含有するNeurobasal培地でニューロンを70時間インキュベートし、4%(v/v)のフォルムアルデヒドで固定して、Kruman et al. (1997)により記述されるようにHoechst 33258で25分間染色した。海馬の神経突起生長アッセイについて記述されるように、コンピューター支援蛍光顕微鏡撮影を用いてそれぞれの実験においてそれぞれの群について1000〜1500個のニューロンの画像を無作為に記録した。コペンハーゲン大学タンパク質研究所で開発されたソフトウエアパッケージPrimaを用いて死亡のおよび生存のニューロンからの核を計測して、ニューロンの総数に比べて生存するニューロンのフラクションを推定した。
小脳の顆粒ニューロン(CGN)
小脳の顆粒ニューロン(CGN)を、生後七日目のウイスターラットからDrejer and Schousboe (1989) Neurochem Res. 14:751-4により以前に記述されたように大部分調製した。
実験のためには、氷上に保存された修飾クレブスリンガー液の中で小脳の組織を細断して、海馬ニューロンについて上で記述されるように処理した。全ての細胞培養物を、5%CO2を含有する加湿した大気中で37℃でインキュベートした。全ての動物を、動物福祉に関する国のガイドラインにしたがって取り扱った。
小脳の顆粒ニューロン(CGN)を、生後七日目のウイスターラットからDrejer and Schousboe (1989) Neurochem Res. 14:751-4により以前に記述されたように大部分調製した。
実験のためには、氷上に保存された修飾クレブスリンガー液の中で小脳の組織を細断して、海馬ニューロンについて上で記述されるように処理した。全ての細胞培養物を、5%CO2を含有する加湿した大気中で37℃でインキュベートした。全ての動物を、動物福祉に関する国のガイドラインにしたがって取り扱った。
CGNの初代培養物を、2%(v/v)のB27、0.5%(v/v)のGlutamax、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび培地の中の最終濃度を40mMとなるようにするKClを補足したNeurobasal-A培地(Gibco, BRL)の中で、細胞100,000個/cm2の密度でポリ-L-リジンで被膜された8−穴のパーマノックスのスライドの上に平板培養した。平板培養の24時間後に、グリア細胞の増殖を回避するためにシトシン-β−D-アラビノフラノシド(Ara−C;Sigma-Aldrich)を10μMの最終濃度になるように添加して、その後で、ニューロンをさらに6日間37℃で分化させた。二回洗浄して、1%(v/v)のグルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン、D-グルコース3.5g/lならびに1%(v/v)のピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)を種々の濃度のペプチドと一緒に補足したEagle基礎培地(BME;Gibco BRL)に培地を交換することにより、アポトーシス細胞死を誘発した。これにより培養液中のカリウムの濃度は5mM KClに低下した。アポトーシスの誘発の2日後に、海馬のニューロンを使用する生存アッセイについて記述されるように、細胞を4%ホルムアルデヒドで固定して、Hoechst 33258で染色した。
アッセイを、D'Mello et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10989-93により記述されるように実施した。
アッセイを、D'Mello et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10989-93により記述されるように実施した。
CGNの培養物を用いる他の生存アッセイ
1.PACEアッセイ
総CGN数に比較してリン酸化されたErk1/2およびAktの検出を、Versteeg et al. (2000) FEBS Lett. 465:69-73にしたがって実施する。
実験のために、CGNを細胞290,000個/cm2の密度でポリ-L-リジンで被膜された96−穴のマイクロタイタープレートの中で平板培養した。ニューロンを0.5%(v/v)のGlutamax、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンで補足されたNeurobasal-A培地の中で増殖した。平板培養の24時間後に、Ara−Cを上で記述されるように、培養液に添加した。インキュベーションの72時間後に、培地の半分を試験されるペプチドを含有するNeurobasal-A培地で交換した。Erk1/2リン酸化アッセイのために、培養物を0〜90分間さらにインキュベートし、70gで8分間遠心分離し、4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、一次ホスホ−p42〜44ウサギ抗体およびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体を用いて免疫染色した。リン酸化されたAktの検出のために、培養物を10〜30分間さらにインキュベートし、70gで8分間遠心分離し、4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、Ser473においてリン酸化されたAktに対するポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて免疫染色した。クリスタルバイオレットでの染色により総ニューロンの数を、両方のリン酸化アッセイにおいて推定した。
1.PACEアッセイ
総CGN数に比較してリン酸化されたErk1/2およびAktの検出を、Versteeg et al. (2000) FEBS Lett. 465:69-73にしたがって実施する。
実験のために、CGNを細胞290,000個/cm2の密度でポリ-L-リジンで被膜された96−穴のマイクロタイタープレートの中で平板培養した。ニューロンを0.5%(v/v)のGlutamax、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンで補足されたNeurobasal-A培地の中で増殖した。平板培養の24時間後に、Ara−Cを上で記述されるように、培養液に添加した。インキュベーションの72時間後に、培地の半分を試験されるペプチドを含有するNeurobasal-A培地で交換した。Erk1/2リン酸化アッセイのために、培養物を0〜90分間さらにインキュベートし、70gで8分間遠心分離し、4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、一次ホスホ−p42〜44ウサギ抗体およびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体を用いて免疫染色した。リン酸化されたAktの検出のために、培養物を10〜30分間さらにインキュベートし、70gで8分間遠心分離し、4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、Ser473においてリン酸化されたAktに対するポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて免疫染色した。クリスタルバイオレットでの染色により総ニューロンの数を、両方のリン酸化アッセイにおいて推定した。
2.TUNELアッセイ
CGNを、細胞60,000個/cm2の密度でポリ-L-リジンで被膜された8−穴のパーマノックススライドの上で平板培養した。2%(v/v)のB27、0.5%(v/v)のGlutamax、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび40mMのKCl(最終濃度)で補足されたNeurobasal-A培地の中で、培養物を六日間増殖して、上のCGN生存アッセイについて記述されるように、アポトーシスを誘発した。アポトーシス細胞死の誘発の24時間後に、培養物を固定して、ApoAlertアポトーシス検出キットを用いて、本質的に製造業者により記述されるように、DNAのフラグメント化の程度を測定した。略述すれば、二重鎖DNA分子の平滑末端をフルオレッセン-dUTPで酵素的に標識して、全てのニューロンを、750ng/mlの濃度でのヨウ化プロピディウムで染色した。油浸60倍1.4 NA対物レンズを備えたNikon Eclipse TE200共焦点顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)に結合したBioRad Radianceレーザー走査システム2000を用いて、それぞれの実験の中のそれぞれの群から少なくとも200個のニューロンの画像を得た。TUNEL陽性のニューロンのフラクションを計数により測定した。
CGNを、細胞60,000個/cm2の密度でポリ-L-リジンで被膜された8−穴のパーマノックススライドの上で平板培養した。2%(v/v)のB27、0.5%(v/v)のGlutamax、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび40mMのKCl(最終濃度)で補足されたNeurobasal-A培地の中で、培養物を六日間増殖して、上のCGN生存アッセイについて記述されるように、アポトーシスを誘発した。アポトーシス細胞死の誘発の24時間後に、培養物を固定して、ApoAlertアポトーシス検出キットを用いて、本質的に製造業者により記述されるように、DNAのフラグメント化の程度を測定した。略述すれば、二重鎖DNA分子の平滑末端をフルオレッセン-dUTPで酵素的に標識して、全てのニューロンを、750ng/mlの濃度でのヨウ化プロピディウムで染色した。油浸60倍1.4 NA対物レンズを備えたNikon Eclipse TE200共焦点顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)に結合したBioRad Radianceレーザー走査システム2000を用いて、それぞれの実験の中のそれぞれの群から少なくとも200個のニューロンの画像を得た。TUNEL陽性のニューロンのフラクションを計数により測定した。
結果
FGLは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの生存を促進する
FGLは、増殖因子様活性を持つFGF受容体のアゴニストであるので、FGLが種々の神経毒性条件下で神経保護物質として作用することができたかどうかを検討した。ドーパミン作動性ニューロンにおける細胞死は、6−OHDAの添加により誘発された。図4aにおいて、生存するドーパミン作動性ニューロンの数が、無処置の対照と比較して、6−OHDAへの暴露後で著しく減少していたことが見られ得る。10ng/mlのグリア由来の神経栄養因子(GDNF)の添加は、このニューロン損失を部分的に防止した(100%にセットされた6−OHDAで処置された対照に比較して150%)。培養物を種々の濃度のFGLd存在下で増殖したときには(図4b)、6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率は、1μg/mlのFGLdの濃度でおよそ135%の最大救済率でもって、統計的に有意に増加して、この作用は釣鐘状の用量-応答関係を呈示した。
かくして、FGLdは、6−OHDAを神経毒性化合物として使用する生存モデルにおいて、GDNFとおよそ同一の程度にドーパミン作動性ニューロンを救済することができる。
FGLは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの生存を促進する
FGLは、増殖因子様活性を持つFGF受容体のアゴニストであるので、FGLが種々の神経毒性条件下で神経保護物質として作用することができたかどうかを検討した。ドーパミン作動性ニューロンにおける細胞死は、6−OHDAの添加により誘発された。図4aにおいて、生存するドーパミン作動性ニューロンの数が、無処置の対照と比較して、6−OHDAへの暴露後で著しく減少していたことが見られ得る。10ng/mlのグリア由来の神経栄養因子(GDNF)の添加は、このニューロン損失を部分的に防止した(100%にセットされた6−OHDAで処置された対照に比較して150%)。培養物を種々の濃度のFGLd存在下で増殖したときには(図4b)、6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率は、1μg/mlのFGLdの濃度でおよそ135%の最大救済率でもって、統計的に有意に増加して、この作用は釣鐘状の用量-応答関係を呈示した。
かくして、FGLdは、6−OHDAを神経毒性化合物として使用する生存モデルにおいて、GDNFとおよそ同一の程度にドーパミン作動性ニューロンを救済することができる。
FGLdがAβ25〜35により誘発される死から海馬ニューロンを保護することできるかどうかをまた試験した。海馬ニューロンの培養物を、予め凝集させたAβ25〜35と共に種々の濃度のFGLdと一緒にインキュベートした。図4cにおいて、20μMのAβ25〜35での海馬の細胞培養物の処理が中〜低度の神経細胞損失を誘発したことが見られ得る。この損失は、脳由来の神経栄養因子(BDNF)50ng/mlにより部分的に救済されることができた。図4dに示されているように、0.1〜50μg/mlの範囲の濃度におけるFGLdでの処理はまた、20μMのAβ25〜35により誘発される神経変性から海馬ニューロンを部分的に救済した。FGLdで誘発される神経保護は、0.3μg/mlのFGLdの濃度で既に最大レベルに達して(Aβ25〜35で処理された対照と比較して110%)、50μg/mlまでのFGLd濃度で多少とも一定のままであった。
かくして、FGLdは、Aβ25〜35ペプチドの神経毒性作用に対してBDNFでの処理により達成されたのと同一の程度に海馬ニューロンを保護することができる。
もしCGNの初代培養物を高レベルのKClで増殖させて、KCl濃度を引き続いて減少させるならば、アポトーシスが誘発されることが以前に示されてきている。FGLdの神経保護作用を、40mMのKClの中で7日間分化するように誘発されたCGN培養物において検討した。引き続いて、KCl濃度を5mMに減少して、2日後に、細胞生存率を推定した。図4eに見られるように、低KCl濃度がCGN培養物において細胞死を誘発して、これをインスリン様増殖因子1(IGF−1)での処理により救済することができた。図4fに示されるように、細胞死をFGLdでの処理によって部分的にまた防止することができた。低KCl濃度で増殖された対照と比較して135%の最大神経保護が、1〜10μg/mlの間のペプチド濃度で見られた。
かくして、結果は、FGLがインビトロでドーパミン作動性の、海馬のおよび小脳顆粒のニューロンの生存を促進する能力があることを指し示している。
もしCGNの初代培養物を高レベルのKClで増殖させて、KCl濃度を引き続いて減少させるならば、アポトーシスが誘発されることが以前に示されてきている。FGLdの神経保護作用を、40mMのKClの中で7日間分化するように誘発されたCGN培養物において検討した。引き続いて、KCl濃度を5mMに減少して、2日後に、細胞生存率を推定した。図4eに見られるように、低KCl濃度がCGN培養物において細胞死を誘発して、これをインスリン様増殖因子1(IGF−1)での処理により救済することができた。図4fに示されるように、細胞死をFGLdでの処理によって部分的にまた防止することができた。低KCl濃度で増殖された対照と比較して135%の最大神経保護が、1〜10μg/mlの間のペプチド濃度で見られた。
かくして、結果は、FGLがインビトロでドーパミン作動性の、海馬のおよび小脳顆粒のニューロンの生存を促進する能力があることを指し示している。
FGLはアポトーシスに対して小脳顆粒のニューロンを保護する
FGLdの神経保護作用の機構をさらに特徴づけするために、KCl欠乏のCGNにおけるDNAのフラグメント化(通常アポトーシスに関連する)の程度を測定した(Eldadah et al., (2000) J Neurosci. 20:179-86に記述されるように)。高KClの培地の中に維持されたCGNは、フラグメント化したDNAを持つ非常に少ないニューロンを表示した。低KCl濃度で処理された細胞の大部分はDNAのフラグメント化を表示した。10〜20μg/mlの濃度においてFGLdで処理されたCGN培養物の中には、ごく僅かなニューロンがKCl欠乏に際してフラグメント化DNAを表示した。対照的に、対照ペプチド、FGL9、二重のアラニン置換を持つ、10diAladは、神経保護作用を何も呈示しなかった。FGLdの神経保護作用を引き続いて定量化して、KCl欠乏が、高KCl培地の中に維持されたCGNと比較して、フラグメント化DNAを含有するCGN数の明らかな増加をもたらしたことを図5に見ることができる。対照ペプチド、FGL9、10diAladでの処理は、CGNをアポトーシスから救済しなかった。種々の濃度におけるFGLdの添加は、アポトーシスCGNの数を、10〜15μg/mlのFGLdの濃度において40%の最大救済率で減少した。
FGLdの神経保護作用の機構をさらに特徴づけするために、KCl欠乏のCGNにおけるDNAのフラグメント化(通常アポトーシスに関連する)の程度を測定した(Eldadah et al., (2000) J Neurosci. 20:179-86に記述されるように)。高KClの培地の中に維持されたCGNは、フラグメント化したDNAを持つ非常に少ないニューロンを表示した。低KCl濃度で処理された細胞の大部分はDNAのフラグメント化を表示した。10〜20μg/mlの濃度においてFGLdで処理されたCGN培養物の中には、ごく僅かなニューロンがKCl欠乏に際してフラグメント化DNAを表示した。対照的に、対照ペプチド、FGL9、二重のアラニン置換を持つ、10diAladは、神経保護作用を何も呈示しなかった。FGLdの神経保護作用を引き続いて定量化して、KCl欠乏が、高KCl培地の中に維持されたCGNと比較して、フラグメント化DNAを含有するCGN数の明らかな増加をもたらしたことを図5に見ることができる。対照ペプチド、FGL9、10diAladでの処理は、CGNをアポトーシスから救済しなかった。種々の濃度におけるFGLdの添加は、アポトーシスCGNの数を、10〜15μg/mlのFGLdの濃度において40%の最大救済率で減少した。
FGLで誘発されるシグナル伝達はErkおよびAktのリン酸化をもたらす
FGLペプチドは、FGFRに結合し活性化させると示されてきている。FGFRにより開始されるシグナル伝達経路は、他の中で、MAPK Erk1/2の活性化に反映されるように、Ras−MAPK経路、およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼAktを活性化するPI3K経路を含む。両方の経路は神経分化および生存に関与していると知られている。それ故に、FGLの神経突起成長のおよび生存の促進作用はMAPKおよびPI3K経路の活性化に依存し得る。それ故に、FGLペプチドでのCGN培養物の処理に応答してErk1/2およびAktがリン酸化されたかどうかを検討した。図8から、Erk1/2のリン酸化を誘発できなかった、5μg/mlの濃度と対照的に、10μg/mlの濃度におけるペプチドがErk1/2の持続的リン酸化を誘発したように見える。この活性化(対照培養物と比較して、115〜120%)は、FGLdでの刺激の10分後に見られて、少なくとも90分間持続された。
FGLによるAktのリン酸化を、CGN培養物のペプチドへの10もしくは30分間の曝露の後で分析した(図7)。0.5μg/ml以上の濃度における10分間の曝露期間は、無処理の対照と比較して、Aktのリン酸化の有意な増加に至った。リン酸化レベルは1μg/mlのペプチド濃度で最高に達して、20μg/mlまで増加する投与量で比較的一定に留まっていた。30分の曝露時間では、Aktのリン酸化は何も検出されず、Erk1/2のリン酸化応答とは対照的に、Aktの活性化は一過性であって、30分以内に終了することを指し示していた。
かくして、結果は、FGLがMAPK経路の持続性(少なくとも90分間)活性化およびAktの一過性(10分間)活性化を誘発することを指し示している。
FGLペプチドは、FGFRに結合し活性化させると示されてきている。FGFRにより開始されるシグナル伝達経路は、他の中で、MAPK Erk1/2の活性化に反映されるように、Ras−MAPK経路、およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼAktを活性化するPI3K経路を含む。両方の経路は神経分化および生存に関与していると知られている。それ故に、FGLの神経突起成長のおよび生存の促進作用はMAPKおよびPI3K経路の活性化に依存し得る。それ故に、FGLペプチドでのCGN培養物の処理に応答してErk1/2およびAktがリン酸化されたかどうかを検討した。図8から、Erk1/2のリン酸化を誘発できなかった、5μg/mlの濃度と対照的に、10μg/mlの濃度におけるペプチドがErk1/2の持続的リン酸化を誘発したように見える。この活性化(対照培養物と比較して、115〜120%)は、FGLdでの刺激の10分後に見られて、少なくとも90分間持続された。
FGLによるAktのリン酸化を、CGN培養物のペプチドへの10もしくは30分間の曝露の後で分析した(図7)。0.5μg/ml以上の濃度における10分間の曝露期間は、無処理の対照と比較して、Aktのリン酸化の有意な増加に至った。リン酸化レベルは1μg/mlのペプチド濃度で最高に達して、20μg/mlまで増加する投与量で比較的一定に留まっていた。30分の曝露時間では、Aktのリン酸化は何も検出されず、Erk1/2のリン酸化応答とは対照的に、Aktの活性化は一過性であって、30分以内に終了することを指し示していた。
かくして、結果は、FGLがMAPK経路の持続性(少なくとも90分間)活性化およびAktの一過性(10分間)活性化を誘発することを指し示している。
FGLはFGFR、MEKおよびPI3Kを通してニューロンの細胞生存を促進する
FGFR、MEKおよびPI3KがまたFGLで誘発される生存にも関与しているかどうかを検討するために、アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物を、上で記述される阻害剤で処理した。図8に示すように、FGLdで処理されたが阻害剤の無いアポトーシスで誘発されるCGN培養物における細胞の生存率を100%にセットして、FGLdで処理されていないアポトーシスで誘発される対照ニューロン(破線でマークされる)はFGLdで処理されるニューロンと比較して、さらに低い生存率を有していた。FGFR阻害剤、SU5402(■)、は20μMの濃度で既にFGLdに対する生存応答を有意に阻害して、40μMのSU5402の濃度はFGLdで誘発される生存を無処理のアポトーシスで誘発される対照ニューロンの生存率にまで減少した。MEK阻害剤、PD98059(●)、は12.5μMの濃度で、FGLdにより誘発される細胞生存を対照培養物のレベルにまで阻害した。PI3K阻害剤LY294002(▲)はFGLdで誘発される細胞生存を3.5μMの濃度で有意に阻害して、LY294002がニューロン生存の非常に強力でかつ一般的な阻害剤であることを指し示した。
FGFR、MEKおよびPI3KがまたFGLで誘発される生存にも関与しているかどうかを検討するために、アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物を、上で記述される阻害剤で処理した。図8に示すように、FGLdで処理されたが阻害剤の無いアポトーシスで誘発されるCGN培養物における細胞の生存率を100%にセットして、FGLdで処理されていないアポトーシスで誘発される対照ニューロン(破線でマークされる)はFGLdで処理されるニューロンと比較して、さらに低い生存率を有していた。FGFR阻害剤、SU5402(■)、は20μMの濃度で既にFGLdに対する生存応答を有意に阻害して、40μMのSU5402の濃度はFGLdで誘発される生存を無処理のアポトーシスで誘発される対照ニューロンの生存率にまで減少した。MEK阻害剤、PD98059(●)、は12.5μMの濃度で、FGLdにより誘発される細胞生存を対照培養物のレベルにまで阻害した。PI3K阻害剤LY294002(▲)はFGLdで誘発される細胞生存を3.5μMの濃度で有意に阻害して、LY294002がニューロン生存の非常に強力でかつ一般的な阻害剤であることを指し示した。
かくして、CGN培養物のKCl欠乏後のFGLで誘発される生存は、FGFRのならびに細胞内キナーゼMEKおよびPI3Kの活性化に依存している。結果は、LY294002がニューロン生存の最も強力な阻害剤であり、引き続いてMEK阻害剤、PD98059、であって、これは生存アッセイにおけるより神経突起成長アッセイではさらに少なく効果的であるように見えて(以下を参照)、FGLで誘発されるMEK活性化の主要な機能が分化よりもむしろ神経保護であることを多分指し示している。
実施例3:FGLの種々の製剤によるインビトロでの神経突起成長の刺激
DN、HNおよびCGNの初代培養物を上で記述するように作製した。
ドーパミン作動性ニューロン(DN)
DNを、50%(v/v)のOptimen 1(Gibco, BRL)、25%(v/v)の馬血清(Gibco, BRL)、25%(v/v)のHBSSおよびグルコース5g/lを含有する培地の中で細胞100,000個/cm2の密度で24−穴の培養プレート(12.5μg/mlのポリ-D-リジンで予め被膜されたもの;Sigma-Aldrich)の中で平板培養した。細胞を1〜2時間静置して接着させた後で、2%(v/v)のB27 Neurobasal Supplement、0.5%(v/v)のグルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン(全てGibco, BRLから)を種々の濃度のペプチドの有無で補足されたNeurobasal培地に培地を交換した。インキュベーションの72時間後に、ニューロンを4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、チロシン水酸化酵素に対する一次マウスモノクローナル抗体および二次ビオチン化ヒツジの抗マウス抗体を用いて免疫染色して、引き続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとインキュベーションを行った。Walmod et al. (2002) Toxicol Appl Pharmacol. 181:1-15に記述されているコンピューター化顕微鏡ワークステーションを用いて、それぞれの個別の実験におけるそれぞれの実験条件について98個の画像を自動的に記録した。略述すれば、ワークステーションは、電動式可動顕微鏡台(LUDL Electronic Production Ltd, Hawthorne, NY, USA)、10倍対物レンズおよび1100アナログ式黒白CCDビデオカメラ(DFA, Denmark)を備えたEclipse TE300倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)から成っていた。Protein Laboratory (Copenhagen University, Denmark)で開発されたソフトウエアパッケージPrimaを用いて、Ronn et al., (2000) J Neurosci Methods. 100:25-32)にしたがって神経突起の長さの立体解析学的に基づく測定を行った。
DN、HNおよびCGNの初代培養物を上で記述するように作製した。
ドーパミン作動性ニューロン(DN)
DNを、50%(v/v)のOptimen 1(Gibco, BRL)、25%(v/v)の馬血清(Gibco, BRL)、25%(v/v)のHBSSおよびグルコース5g/lを含有する培地の中で細胞100,000個/cm2の密度で24−穴の培養プレート(12.5μg/mlのポリ-D-リジンで予め被膜されたもの;Sigma-Aldrich)の中で平板培養した。細胞を1〜2時間静置して接着させた後で、2%(v/v)のB27 Neurobasal Supplement、0.5%(v/v)のグルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン(全てGibco, BRLから)を種々の濃度のペプチドの有無で補足されたNeurobasal培地に培地を交換した。インキュベーションの72時間後に、ニューロンを4%(v/v)のホルムアルデヒドで固定して、チロシン水酸化酵素に対する一次マウスモノクローナル抗体および二次ビオチン化ヒツジの抗マウス抗体を用いて免疫染色して、引き続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとインキュベーションを行った。Walmod et al. (2002) Toxicol Appl Pharmacol. 181:1-15に記述されているコンピューター化顕微鏡ワークステーションを用いて、それぞれの個別の実験におけるそれぞれの実験条件について98個の画像を自動的に記録した。略述すれば、ワークステーションは、電動式可動顕微鏡台(LUDL Electronic Production Ltd, Hawthorne, NY, USA)、10倍対物レンズおよび1100アナログ式黒白CCDビデオカメラ(DFA, Denmark)を備えたEclipse TE300倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)から成っていた。Protein Laboratory (Copenhagen University, Denmark)で開発されたソフトウエアパッケージPrimaを用いて、Ronn et al., (2000) J Neurosci Methods. 100:25-32)にしたがって神経突起の長さの立体解析学的に基づく測定を行った。
海馬のニューロン(HN)および小脳顆粒のニューロン(CGN)
新生児のHNもしくはCGNを、0.4%(w/v)の牛血清アルブミン(BSA; Sigma-Aldrich)、2%(v/v)のB27 Neurobasal Supplement、1%(v/v)のglutamax、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび2%の1M HEPES(いずれもGibco, BRLから)で補足されたNeurobasal培地の中で細胞10,000個/cm2の密度で被膜されていない8−穴のパーマノックスLab-Tekチャンバースライドの上で平板培養した。種々のシグナル伝達経路の阻害剤の有無でペプチド溶液を添加して総量を300μl/cm2として、スライドを37℃でインキュベートした。24時間後に、ニューロンを4%(v/v)のホルムアルデヒドで20分間固定して、その後でGAP−43に対する一次ウサギ抗体およびAlexa Fluor社の二次ヤギ抗ウサギ抗体を用いて免疫染色した。以前に記述されるように(Ronn et al., 2000 op. cit.)、コンピューター支援蛍光顕微鏡を用いることにより、それぞれの個別の実験においてそれぞれの群につき少なくとも200個のニューロンの画像を系統的に得た。略述すれば、ビデオカメラ(Grundig Electronics, Germany)に結合したNikon Plan 20倍の対物レンズを持つNikon Diaphot倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)を記録に使用した。ドーパミン作動性神経突起成長アッセイについて上で記述したのと同一のソフトウエアパッケージを用いて、記録された画像を加工した。
新生児のHNもしくはCGNを、0.4%(w/v)の牛血清アルブミン(BSA; Sigma-Aldrich)、2%(v/v)のB27 Neurobasal Supplement、1%(v/v)のglutamax、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび2%の1M HEPES(いずれもGibco, BRLから)で補足されたNeurobasal培地の中で細胞10,000個/cm2の密度で被膜されていない8−穴のパーマノックスLab-Tekチャンバースライドの上で平板培養した。種々のシグナル伝達経路の阻害剤の有無でペプチド溶液を添加して総量を300μl/cm2として、スライドを37℃でインキュベートした。24時間後に、ニューロンを4%(v/v)のホルムアルデヒドで20分間固定して、その後でGAP−43に対する一次ウサギ抗体およびAlexa Fluor社の二次ヤギ抗ウサギ抗体を用いて免疫染色した。以前に記述されるように(Ronn et al., 2000 op. cit.)、コンピューター支援蛍光顕微鏡を用いることにより、それぞれの個別の実験においてそれぞれの群につき少なくとも200個のニューロンの画像を系統的に得た。略述すれば、ビデオカメラ(Grundig Electronics, Germany)に結合したNikon Plan 20倍の対物レンズを持つNikon Diaphot倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)を記録に使用した。ドーパミン作動性神経突起成長アッセイについて上で記述したのと同一のソフトウエアパッケージを用いて、記録された画像を加工した。
結果
FGLは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの初代培養物における神経突起成長を誘発する
FGLのモノマー形は、初代の海馬ニューロンからの神経突起成長を誘発すると立証されてきている。ペプチドリガンドの多量体形はモノマー形よりも受容体活性化に対してさらに高い活性を有することが知られている(上で考察される)。それ故に、FGLの種々のダイマーのおよびテトラマーの型を製造して、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロン(CGN)の初代培養物を使用してそれらの神経突起成長の刺激能力について試験した。
FGLは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの初代培養物における神経突起成長を誘発する
FGLのモノマー形は、初代の海馬ニューロンからの神経突起成長を誘発すると立証されてきている。ペプチドリガンドの多量体形はモノマー形よりも受容体活性化に対してさらに高い活性を有することが知られている(上で考察される)。それ故に、FGLの種々のダイマーのおよびテトラマーの型を製造して、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロン(CGN)の初代培養物を使用してそれらの神経突起成長の刺激能力について試験した。
テトラマー(樹状体)のFGLペプチド(FGLd)の非存在下もしくは存在下で、培養物を増殖した。全ての三つの型のニューロンにおいてFGLdにより誘発された神経突起成長を引き続いて定量化して、図9に示した。FGLdで処理されたドーパミン作動性ニューロン(●)は、用量依存的様式で神経突起の統計的に有意な長さの増加を示し、1μg/mlのFGLdの濃度で最大の平均神経突起の長さ(無処理の対照と比較して125%)が得られた。FGLdで処理された海馬ニューロン(▲)は、0.04μg/mlのFGLdの用量で既に神経突起の長さの増加を呈示して、20μg/mlまでのFGLdの濃度を使用する無処理の対照培養物と比較して、およそ150%の刺激を持つプラトー状のレベルに達した。FGLdで処理されたCGN培養物(■)はまた、用量依存的な神経突起成長の応答を呈示した。無処理の対照と比較して、255%の最大刺激が、50μg/mlのFGLdの濃度で見られた。
海馬ニューロンの初代培養物を選択して、FGLペプチドの三つの異なるダイマー変種、FGLL、FGLlys、およびFGLcys、の神経突起成長に及ぼす作用を試験した。図10に示されるように、ダイマーのリジン樹状体、FGLlys(▲)およびFGLcys(●)、は両方とも試験された濃度のいずれにおいても神経突起成長を刺激することができなかった。対照的に、FGLL(■)は有意な神経突起成長の応答を誘発して、1μg/ml濃度で最大刺激に達する釣鐘状カーブをもって用量依存性の関係を呈示した。最大刺激は無処理の対照と比較して155%であったが(図10)、これはFGLdにより誘発される応答とほぼ同一であった(図9を参照)。
FGLにより誘発される神経突起成長はFGFR、MEKおよびPI3Kの活性化を伴う
FGFR、MEKおよびPI3Kの活性化の生物学的相関を解明するために、CGNにおいてFGLdにより誘発される神経突起成長へのこれらのキナーゼの阻害剤の作用を試験した。FGFRの阻害剤、SU5402、は受容体の触媒ドメインと相互作用することにより1亜型FGFRのチロシンキナーゼ活性を阻害すると知られている。図11において、FGLdで処理されたCGN培養物の中の平均の神経突起の長さを100%とセットして、FGLdで処理されていない対照ニューロンについての平均の神経突起の長さが破線でマークされている。SU5402(●)は、FGLdで誘発される神経突起成長を80μMの濃度で有意に阻害した(初期値の35%に)ように見える。25μM以上の濃度でのMEK阻害剤のPD98059(●)との処理は、FGLdにより誘発される神経突起成長を75%に有意に減少した。また、PI3Kの阻害剤のLY294002(▲)は、3.5μMの濃度で既にFGLdで誘発される神経突起成長を90%に有意に阻害して、10μMのLY294002の濃度ではFGLdに対する神経突起成長の応答は殆ど50%にまで減少されて、これは無処理の対照のニューロンに対するよりもさらに低い。SU5402およびLY294002は、FGLdで処理されていない対照培養物における神経突起成長への有意な作用無しであった(データは示されていない)。PD98059は、CGNにおける基部の神経突起成長に影響を及ぼさないと以前見出されてきている。かくして、CGNのFGLdで誘発される神経突起成長の応答は、FGFRの活性化ならびにMAPKおよびPI3Kの細胞内シグナル伝達経路の引き継いた活性化に依存している。
FGFR、MEKおよびPI3Kの活性化の生物学的相関を解明するために、CGNにおいてFGLdにより誘発される神経突起成長へのこれらのキナーゼの阻害剤の作用を試験した。FGFRの阻害剤、SU5402、は受容体の触媒ドメインと相互作用することにより1亜型FGFRのチロシンキナーゼ活性を阻害すると知られている。図11において、FGLdで処理されたCGN培養物の中の平均の神経突起の長さを100%とセットして、FGLdで処理されていない対照ニューロンについての平均の神経突起の長さが破線でマークされている。SU5402(●)は、FGLdで誘発される神経突起成長を80μMの濃度で有意に阻害した(初期値の35%に)ように見える。25μM以上の濃度でのMEK阻害剤のPD98059(●)との処理は、FGLdにより誘発される神経突起成長を75%に有意に減少した。また、PI3Kの阻害剤のLY294002(▲)は、3.5μMの濃度で既にFGLdで誘発される神経突起成長を90%に有意に阻害して、10μMのLY294002の濃度ではFGLdに対する神経突起成長の応答は殆ど50%にまで減少されて、これは無処理の対照のニューロンに対するよりもさらに低い。SU5402およびLY294002は、FGLdで処理されていない対照培養物における神経突起成長への有意な作用無しであった(データは示されていない)。PD98059は、CGNにおける基部の神経突起成長に影響を及ぼさないと以前見出されてきている。かくして、CGNのFGLdで誘発される神経突起成長の応答は、FGFRの活性化ならびにMAPKおよびPI3Kの細胞内シグナル伝達経路の引き継いた活性化に依存している。
統計値(+FGL処理対対照処理):*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001
結論
1.FGLペプチドは、神経変性障害の処置に必須である、インビトロで種々のニューロンの細胞型に対する生存を促進する化合物である。
2.FGLペプチドは、インビトロで種々のニューロンの細胞型において神経突起成長を誘発する能力があって、FGLは、神経変性障害の治療に必須である、軸索と樹状突起の両方の成長を促進する潜在性を有する。
3.全て、モノマーFGLm、ダイマーFGLL、および樹状体FGLDのFGLペプチドの製剤は、生存および神経突起成長の両方の促進に強力である。
4.FGLLおよびFGLDの両方は、神経突起成長の促進においてFGLmより200倍以上にさらに強力である。
5.FGLLは、FGLDのように、神経突起成長および生存の両方の促進に強力である。
6.ダイマーFGLlysおよびFGLcysのようなFGLペプチドの他の製剤は、神経突起成長の促進において不活性である。
1.FGLペプチドは、神経変性障害の処置に必須である、インビトロで種々のニューロンの細胞型に対する生存を促進する化合物である。
2.FGLペプチドは、インビトロで種々のニューロンの細胞型において神経突起成長を誘発する能力があって、FGLは、神経変性障害の治療に必須である、軸索と樹状突起の両方の成長を促進する潜在性を有する。
3.全て、モノマーFGLm、ダイマーFGLL、および樹状体FGLDのFGLペプチドの製剤は、生存および神経突起成長の両方の促進に強力である。
4.FGLLおよびFGLDの両方は、神経突起成長の促進においてFGLmより200倍以上にさらに強力である。
5.FGLLは、FGLDのように、神経突起成長および生存の両方の促進に強力である。
6.ダイマーFGLlysおよびFGLcysのようなFGLペプチドの他の製剤は、神経突起成長の促進において不活性である。
実施例4:ラットの海馬ニューロンの初代細胞培養物のシナプス可塑性へのFGLの作用
成人の神経系では、海馬のような構造は、可塑的な変化を持続的に受けて、構造と機能を調整する。特に、記憶の獲得は、既に確立されているニューロンの接合の構造上のおよび機能上の変化を必要とすると信じられている。NCAMは、発生の間のニューロンの可塑性においてならびに学習および記憶において重要な役割を果たしていると示されてきている(Welzl and Stork, (2003) News Physiol Sci. 18:147-50);しかしながら、これらの作用の機構は不明である。本試験において、FGLペプチドがシナプスの可塑性に影響を及ぼすことができるかどうかを検討した。
成人の神経系では、海馬のような構造は、可塑的な変化を持続的に受けて、構造と機能を調整する。特に、記憶の獲得は、既に確立されているニューロンの接合の構造上のおよび機能上の変化を必要とすると信じられている。NCAMは、発生の間のニューロンの可塑性においてならびに学習および記憶において重要な役割を果たしていると示されてきている(Welzl and Stork, (2003) News Physiol Sci. 18:147-50);しかしながら、これらの作用の機構は不明である。本試験において、FGLペプチドがシナプスの可塑性に影響を及ぼすことができるかどうかを検討した。
小胞のターンオーバーへのFGLdの作用を、ラット胚(E19)からの海馬ニューロンの初代培養物において推定した。培養物を上のように作製した。インビトロで13〜16日目に続けて、FGLdを培養物に添加して、1、24、もしくは48時間インキュベートした。インキュベーションの48時間後で、FGFR阻害剤(SU 5402)をFGLdと同時に培養物の幾つかに添加した。
FGLdでの処理後に、Kiryushko et al (2003) J Biol Chem. 278:12325-34により記述されるようにニューロンを蛍光膜プローブFM1−43で標識した。次いで、90mMのカリウムでの脱分極により誘起されたFM1−43の放出(細胞の脱染色)の割合をRadiance 2000スキャニングシステムおよびNikon ECLIPSE TE200共焦点顕微鏡を用いる微速度画像収集により評価した。
シナプス形成へのFGLdの作用を、13日間の培養で増殖させた初代胚性(E19)海馬ニューロンにおける神経突起およびシナプスの二重免疫染色を用いてさらに評価した。固定化および免疫染色の前に、細胞を、FGLdで48もしくは96時間インキュベートした、した。シナプスをシナプトフィシンに対する抗体により検出して、生長関連タンパク質−43(GAP−43、またB−50もしくはF1と呼ばれる)に対する抗体により、神経突起を標識した。免疫染色を、Ronn et al. (2000) (op. cit.)により記述されるように、共焦点蛍光顕微鏡により視覚化して、定量化した。
結果
20μg/mlのFGLdでの海馬ニューロンの1時間および48時間の処理は、対照と比較して、FM1−43の脱染色の統計的に有意な増加をもたらした(それぞれ、0.008/秒から0.016/秒へ、および0.013/秒から0.028/秒へ);一方で24時間の処理は有意な作用をもたらさなかった(図12)。これは、FGLdが伝達因子放出の短期促進(1時間)およびシナプス効率の長期(48時間)の増加の両方を引き起こすことを示唆している。FGFR阻害剤のSU5402はFGLdの作用を打ち消して、FGLdの作用がFGFRとのその相互作用を通じて仲介されたことを指し示している。
20μg/mlのFGLdでの海馬ニューロンの1時間および48時間の処理は、対照と比較して、FM1−43の脱染色の統計的に有意な増加をもたらした(それぞれ、0.008/秒から0.016/秒へ、および0.013/秒から0.028/秒へ);一方で24時間の処理は有意な作用をもたらさなかった(図12)。これは、FGLdが伝達因子放出の短期促進(1時間)およびシナプス効率の長期(48時間)の増加の両方を引き起こすことを示唆している。FGFR阻害剤のSU5402はFGLdの作用を打ち消して、FGLdの作用がFGFRとのその相互作用を通じて仲介されたことを指し示している。
海馬ニューロンのシナプトフィシンおよびGAP−43に対する二重免疫染色は、神経突起の長さ100μm当りのシナプトフィシン陽性スポットの数のおよそ20%の増加により反映される(それぞれ、2.40から2.96へ、および2.73から3.24へ)ように、海馬の培養物に48および96時間投与されたFGLd(20μg/ml)がシナプスの数を有意に増加したことを示した。
これらの結果は、FGLペプチドが前シナプス小胞のターンオーバーの速度およびシナプスの数を増加させることによりシナプスの可塑性に影響することを示唆している。
これらの結果は、FGLペプチドが前シナプス小胞のターンオーバーの速度およびシナプスの数を増加させることによりシナプスの可塑性に影響することを示唆している。
実施例5:虚血条件に曝露された器官型海馬ニューロンの切片培養物および解離海馬ニューロン初代培養物へのFGLの作用
脳は酸素およびグルコースの高度の消費を有して、エネルギー生産について酸化的リン酸化に殆ど完全に依存している。酸素およびグルコースの供給の欠乏は、ニューロンの細胞損傷および死をもたらす。虚血性障害に対する感受性は、脳の異なる部分および異なるニューロン集団でさえの中で異なる。海馬のCA1領域のニューロンは、高い脆弱性の脳にける領域の一つである。
脳は酸素およびグルコースの高度の消費を有して、エネルギー生産について酸化的リン酸化に殆ど完全に依存している。酸素およびグルコースの供給の欠乏は、ニューロンの細胞損傷および死をもたらす。虚血性障害に対する感受性は、脳の異なる部分および異なるニューロン集団でさえの中で異なる。海馬のCA1領域のニューロンは、高い脆弱性の脳にける領域の一つである。
方法
本試験では、Stoppini et al. (1991) Neurosci Methods. 37:173-82の方法にしたがって7日齢のウイスターラットから器官型海馬ニューロンの切片培養物(OHSC)およびMaar et al.(1997) J Neurosci Res. 47:163-72の方法にしたがって1日齢のラットからの解離海馬ニューロンの初代培養物において、酸素およびグルコースの欠乏(OGD)の後のシナプスの可塑性、ニューロンの機能および脆弱性へのFGLペプチドの作用を検討した。FGLdを添加する前に初代培養物を11〜12日間、OHSCを12〜14日間維持した。
本試験では、Stoppini et al. (1991) Neurosci Methods. 37:173-82の方法にしたがって7日齢のウイスターラットから器官型海馬ニューロンの切片培養物(OHSC)およびMaar et al.(1997) J Neurosci Res. 47:163-72の方法にしたがって1日齢のラットからの解離海馬ニューロンの初代培養物において、酸素およびグルコースの欠乏(OGD)の後のシナプスの可塑性、ニューロンの機能および脆弱性へのFGLペプチドの作用を検討した。FGLdを添加する前に初代培養物を11〜12日間、OHSCを12〜14日間維持した。
初代細胞培養物およびOHSCをOGDに10および20分間曝露した。OGD後に、培養物を再び酸素およびグルコースで供給して、OGD曝露の導入後1、4もしくは24時間の時点で分析した。FGLd(もしくは対照ペプチドFGLc)をOGDの24時間前、直後、または1時間もしくは24時間後に添加した。OGDに先立って添加したときには、OGDを導入するときに培地からFGLdを除去した。或る場合には、切片培養物をOGDの4時間後にのみFGLdで処理した。加えて、幾つかのセットアップではFGFR阻害剤、SU5402(25μM)、をFGLdと一緒に加えた。
海馬ニューロンの培養物においては、FM1−43染色を用いて、シナプス前の機能を評価した(上で記述されている)。初代細胞培養物およびOHSCの両方における細胞生存率を、Malich et al, (1997) Toxicology. 124:179-92にしたがって、MTS[臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム]アッセイを用いて測定した。加えて、Laake et al. (1999) Brain Res Brain Res Protoc. 4:173-84にしたがって、OHSCにおける細胞生存率をヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて測定した。
結果
解離海馬の細胞培養物の代謝活性は、MTSアッセイで測定されるように、対照培養物と比較して、20分のOGDに続いて1時間後(31%)および4時間後(30%)に有意に減少した。細胞培養物をFGLdで処理したときには(OGD後のの24時間前もしくは直後)、代謝活性へのOGDの作用は消滅した。OHSCにおける代謝活性は、OGDに対して異なる応答を示した。OGD一時間後で、代謝活性は対照と比較して有意に増加(19%)したが、一方ではさらに長期間の再酸素添加(24時間)は、代謝活性の減少(24%)をもたらした。両方の時点において、OGDに24時間先立ってFGLdでの処理は、対照と比較して、海馬切片における代謝活性の正常化を引き起こした。解離細胞培養物およびOHSCの両方において、FGLdの処理単独は代謝活性の増加に至った。加えて、もしFGFR阻害剤のSU5402がFGLdと一緒に存在したならば、FGLdでの24時間の前処理は、代謝活性のOGDで誘発される低下を消滅しないで、FGLdがFGFRの活性化を通して代謝活性に影響するかも知れないことを指し示している。
解離海馬の細胞培養物の代謝活性は、MTSアッセイで測定されるように、対照培養物と比較して、20分のOGDに続いて1時間後(31%)および4時間後(30%)に有意に減少した。細胞培養物をFGLdで処理したときには(OGD後のの24時間前もしくは直後)、代謝活性へのOGDの作用は消滅した。OHSCにおける代謝活性は、OGDに対して異なる応答を示した。OGD一時間後で、代謝活性は対照と比較して有意に増加(19%)したが、一方ではさらに長期間の再酸素添加(24時間)は、代謝活性の減少(24%)をもたらした。両方の時点において、OGDに24時間先立ってFGLdでの処理は、対照と比較して、海馬切片における代謝活性の正常化を引き起こした。解離細胞培養物およびOHSCの両方において、FGLdの処理単独は代謝活性の増加に至った。加えて、もしFGFR阻害剤のSU5402がFGLdと一緒に存在したならば、FGLdでの24時間の前処理は、代謝活性のOGDで誘発される低下を消滅しないで、FGLdがFGFRの活性化を通して代謝活性に影響するかも知れないことを指し示している。
解離海馬の細胞培養物では、高カリウム刺激での前シナプス小胞放出(FM1−43脱染色)の速度は、FGLdの処理により統計的に有意に増強されて(0.04/秒から0.06/秒に)、OGD後には、1時間目および4時間目に分析されたととき、減少した(両方が0.04/秒から0.02/秒に)。もし細胞培養物をOGD後の24時間前もしくは直後のいずれかにFGLdで処理したならば、FM1−43放出の速度のOGDで誘発される減少は消滅した。さらに、FGFR阻害剤のSU5402は、FM1−43放出のOGDで誘発される減少へのFGLdの作用を打ち消した。
OHSCでは、10分間のOGDは、ヨウ化プロピジウム(PI)染色で推定されたように遅延性細胞損傷を誘発した。OGD後の4時間(0.3%から5.0%へ)および24時間(0.6%から23.1%へ)の両方で、OHSCのPI染色(全CA1領域の%)の有意な増加があった。この作用は、切片をFGLdで24時間前処理することにより殆ど完全に打ち消されることができた。細胞損傷は、OGD直後に切片をFGLdで処理することによりまた回避されたが、もしFGLdの処理がOGD4時間後まで遅れるならば、回避されなかった。対照ペプチドのFGLcは、OGDにより誘発される細胞損傷に影響を及ぼさないで、もし切片をFGFR阻害剤のSU5402でFGLdと一緒に前インキュベートしたならば、PI染色はOGD単独のそれと同様であった。
考察
FGLdペプチドは、二つの異なるインビトロのモデルシステムにおいて酸素とグルコースの一過性欠乏の24時間前もしくは直後に適用されたときには、神経保護作用を有する。OGDは、解離海馬の細胞培養物においておよびOHSCにおいて代謝活性の低下を引き起こして、両方の場合でFGLdでの処理が、OGD後の代謝活性を部分的にもしくは完全に正常化することができた。
FGLdペプチドは、二つの異なるインビトロのモデルシステムにおいて酸素とグルコースの一過性欠乏の24時間前もしくは直後に適用されたときには、神経保護作用を有する。OGDは、解離海馬の細胞培養物においておよびOHSCにおいて代謝活性の低下を引き起こして、両方の場合でFGLdでの処理が、OGD後の代謝活性を部分的にもしくは完全に正常化することができた。
虚血は、使用したモデルおよび虚血チャレンジの苛酷性に依存して、増強されたシナプス伝達もしくは低下されたシナプス伝達のいずれかを引き起こすと報告されてきている。本試験で使用されたモデルにおいては、20分間のOGDは、カリウム刺激での前シナプス小胞の放出の低下を引き起こして、この低下は、OGD後の24時間前もしくは直後のいずれかでFGLdペプチドを投与することにより減衰された。
かくして、検討された全て三つのパラメーター(代謝活性、前シナプス小胞の放出および細胞生存率)について、FGLペプチドは、OGDの作用を部分的にもしくは完全に阻害することができた。さらに、FGLのこの神経保護活性は、全て三つの場合において、FGFR阻害剤のSU5402により阻害されることができて、FGFR活性がFGLの作用のために必要であることを指し示している。
実施例6:ラットの社会的行動およびインビボでのβ−アミロイドで誘発される神経毒性へのFGLの作用。
モデルの説明
本試験はラットモデルを使用して、その中で神経毒性および認識機能障害を(25〜35)β−アミロイドフラグメントにより誘発した(Maurice T., et al. (1996) (Brain Res. 706:181-93) and Delobette S., et al. (1997) Eur J Pharmacol.319:1-4を参照)。(25〜35)β−アミロイドフラグメントによりラットに誘発される短期記憶障害は、それがアルツハイマー病の臨床症状の一つに類似しているので、試験すべき特別な重要性を持っている。ラットにおける短期記憶障害を三つの異なる行動試験:社会的認識試験(Kogan et al, (2000) Hippocampus 10:47-56)、オープンフィールド試験(Cerbone and Sadile, (1994) Neurosci Biobehav Rev. 18:497-518.; Vianna et al, (2000) Learn Mem. 7:333-40)およびY字型迷路試験(Clayton & Williams, (2000) Neurobiol Learn Mem. 74:135-45)を用いて評価した。加えて、屠殺時に収集した脳組織について神経病理学的検討を実施した。FGLペプチドを後頭下方にもしくは鼻腔内にのいずれかで投与した。
モデルの説明
本試験はラットモデルを使用して、その中で神経毒性および認識機能障害を(25〜35)β−アミロイドフラグメントにより誘発した(Maurice T., et al. (1996) (Brain Res. 706:181-93) and Delobette S., et al. (1997) Eur J Pharmacol.319:1-4を参照)。(25〜35)β−アミロイドフラグメントによりラットに誘発される短期記憶障害は、それがアルツハイマー病の臨床症状の一つに類似しているので、試験すべき特別な重要性を持っている。ラットにおける短期記憶障害を三つの異なる行動試験:社会的認識試験(Kogan et al, (2000) Hippocampus 10:47-56)、オープンフィールド試験(Cerbone and Sadile, (1994) Neurosci Biobehav Rev. 18:497-518.; Vianna et al, (2000) Learn Mem. 7:333-40)およびY字型迷路試験(Clayton & Williams, (2000) Neurobiol Learn Mem. 74:135-45)を用いて評価した。加えて、屠殺時に収集した脳組織について神経病理学的検討を実施した。FGLペプチドを後頭下方にもしくは鼻腔内にのいずれかで投与した。
方法
初期の処置での代表的な社会的認識試験の時刻表を図26(A)に略図的に示す。
5日間の馴化期間の後で、ラットを、脳の右側脳室の中にi.c.v.で注射した(0日目)、(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)(動物当り25μg)で処置した。
FGLペプチド(FGLLもしくはFGLdのいづれか)を、7、10および13日目にもしくは30、33および36日目に後頭下方に(投与当りの動物当り5μg)もしくは鼻腔内に(投与当りの動物当り400μg)投与した。動物の行動を、社会的認識試験、オープンフィールド試験、もしくは明暗識別Y字型迷路試験を用いて評価した。(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の28〜30日目もしくは51日目に動物を屠殺し、選択された試験では、脳組織を収集し、組織切片をA−β特異的抗体で免疫染色して、アミロイド負荷をA−β陽性区域の百分率として計算した。加えて、脳切片の選択された区域におけるニューロンの数を立体解析学的アプローチを用いて計算した。
初期の処置での代表的な社会的認識試験の時刻表を図26(A)に略図的に示す。
5日間の馴化期間の後で、ラットを、脳の右側脳室の中にi.c.v.で注射した(0日目)、(25〜35)β−アミロイドフラグメント(A−β)(動物当り25μg)で処置した。
FGLペプチド(FGLLもしくはFGLdのいづれか)を、7、10および13日目にもしくは30、33および36日目に後頭下方に(投与当りの動物当り5μg)もしくは鼻腔内に(投与当りの動物当り400μg)投与した。動物の行動を、社会的認識試験、オープンフィールド試験、もしくは明暗識別Y字型迷路試験を用いて評価した。(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の28〜30日目もしくは51日目に動物を屠殺し、選択された試験では、脳組織を収集し、組織切片をA−β特異的抗体で免疫染色して、アミロイド負荷をA−β陽性区域の百分率として計算した。加えて、脳切片の選択された区域におけるニューロンの数を立体解析学的アプローチを用いて計算した。
社会的行動および記憶への(25〜35)A−β/ビークルの投与の作用
社会的認識試験では、第二の試行の間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の増加を、ビークル(V)を受領する対照動物と比較して、(25〜35)β−アミロイドフラグメントを受領したラットにおいて検出した。オープンフィールド試験では、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで処置したラットは、対照動物群で注目された減少と対照的に、20分間の期間の間に探索活性を減少しなかった。陽性の食物強化での明暗識別Y字型迷路試験では、(25〜35)βアミロイドフラグメントで処置されたラットは、エラー(間違ったアームへの進入)の数の増加を立証した。
かくして、全て三つの試験において、(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与は、短期記憶障害として表示される認知障害をもたらした。
社会的認識試験では、第二の試行の間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の増加を、ビークル(V)を受領する対照動物と比較して、(25〜35)β−アミロイドフラグメントを受領したラットにおいて検出した。オープンフィールド試験では、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで処置したラットは、対照動物群で注目された減少と対照的に、20分間の期間の間に探索活性を減少しなかった。陽性の食物強化での明暗識別Y字型迷路試験では、(25〜35)βアミロイドフラグメントで処置されたラットは、エラー(間違ったアームへの進入)の数の増加を立証した。
かくして、全て三つの試験において、(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与は、短期記憶障害として表示される認知障害をもたらした。
(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与により認知障害が誘発されたラットの行動および記憶へのFGL投与の作用
FGLの作用を、幾つかの独立した試験において以下に記述されるインビボでの異なる試験で推定した。
FGLの作用を、幾つかの独立した試験において以下に記述されるインビボでの異なる試験で推定した。
社会的認識試験および神経組織病理
○試験1:(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、FGLを後頭下方に投与した。FGLdの最終投与日の日の14日目に、社会的認識試験においてFGLdの作用は何も観察されないで、プラセボで処置されたラットを(25〜35)β−アミロイドフラグメント単独でもしくはFGLdと共にのいずれかを受領するラットと比較する、海馬のCA3領域の神経組織病理学的評価において有意な作用は何も観察されなかった。
○試験1:(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、FGLを後頭下方に投与した。FGLdの最終投与日の日の14日目に、社会的認識試験においてFGLdの作用は何も観察されないで、プラセボで処置されたラットを(25〜35)β−アミロイドフラグメント単独でもしくはFGLdと共にのいずれかを受領するラットと比較する、海馬のCA3領域の神経組織病理学的評価において有意な作用は何も観察されなかった。
○試験2:(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、FGLを後頭下方に投与した。(25〜35)β−アミロイドフラグメントを投与することは、第二の出会いにおいてラットにより幼若動物を探索することに費やされた時間の、ならびに対照動物と比較したときのアミロイド負荷およびニューロンの細胞死の、統計的に有意な増加をもたらした。しかしながら、FGLLおよびFGLdでの処置は、β−アミロイドのペプチドフラグメントでのみの処置された動物と比較したときに、第二の試行の間に処置された動物により幼若ラットを探索することに費やされた増加した時間を有意に低下した。FGLLおよびFGLdでの処置はまた、帯状回皮質(それぞれ、100%から39%および42%に)においておよび海馬のCA3領域(それぞれ、100%から17%および44%に)おいてアミロイド負荷を有意に低下した。加えて、(25〜35)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較したときに、FGLLおよびFGLdは、海馬のCA3領域においてニューロンの密度の増加(それぞれ、ニューロン15個から21および22個/mcm2×104へ)を引き起こした。結果を図13〜16にグラフで提示する。
○試験3:(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の30、33および36日目に、FGLLを後頭下方に投与した。FGLLの最終投与の1週間後の44日目に、(25〜35)A−β/ビークルで処置された対照ラットと比較して、FGLLを後頭下方に投与したときに、ラットが第二の曝露時に新規対象物(幼弱ラット)を検討するのに費やされた時間の比率において、統計的に有意な低下が観察された(0.50から0.41へ)。加えて、神経病理学的検討は、帯状回皮質 (100%から24%)および海馬のCA3区域において(100%から29%へ)、アミロイド負荷の統計的に有意な低下を示した。加えて、β−アミロイド (25〜35)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較して、損傷されたニューロンの百分率の統計的に有意な減少(ニューロン27〜21個/mcm2×10−4)が帯状回皮質において観察された。結果を図17〜20にグラフで提示する。
○試験4:(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、FGLLを後頭下方に投与した。アミロイドベータペプチドでの処置は、FGLペプチドでの処置で打ち消された、短期記憶障害を誘発した。帯状回皮質において、(25〜35)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較して、ニューロン密度の統計的に有意な増加(11から14μm2×10−4)が、FGLLの投与に応答して観察された。結果を図21〜23にグラフで提示する。
オープンフィールド試験
(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、後頭下方に投与されたFGLdを受領したラットは、FGLの最終投与後の日の14日目における最初の測定期間と比較して、最終の測定期間において穴を探索するのに費やされた時間(3.3秒から0.1秒へ)および立ち上がり(7.0秒から07秒へ)の統計的に有意な減少を示した。(25〜35)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群は、二つの測定期間の間に統計的に有意な差を何も示さなかった。移動運動活性は14日目に影響を受けなかった。
(25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目に、後頭下方に投与されたFGLdを受領したラットは、FGLの最終投与後の日の14日目における最初の測定期間と比較して、最終の測定期間において穴を探索するのに費やされた時間(3.3秒から0.1秒へ)および立ち上がり(7.0秒から07秒へ)の統計的に有意な減少を示した。(25〜35)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群は、二つの測定期間の間に統計的に有意な差を何も示さなかった。移動運動活性は14日目に影響を受けなかった。
陽性の食物強化での明暗識別Y字型迷路試験
後頭下方に投与されたFGLdを受領したラットは、訓練最終日の25日目においてエラーの数の統計的に有意な減少(3.8から1.7へ)を示したが、一方では、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで処置された対照ラットと比較して、訓練の21〜24日目では有意な相違は何も観察されなかった。
後頭下方に投与されたFGLdを受領したラットは、訓練最終日の25日目においてエラーの数の統計的に有意な減少(3.8から1.7へ)を示したが、一方では、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで処置された対照ラットと比較して、訓練の21〜24日目では有意な相違は何も観察されなかった。
考察
この試験で使用されたモデルにおいて、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで誘発される神経毒性は、アルツハイマー病患者で見られる神経病理および認知障害の多くの側面を反映している。このモデルでは、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメントのi.c.v.投与は、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメント投与後の14日目に開始する、β−アミロイドの沈着をもたらして、これはニューロンの細胞死および認知障害(短期記憶障害)に至る。
この試験で使用されたモデルにおいて、(25〜35)β−アミロイドフラグメントで誘発される神経毒性は、アルツハイマー病患者で見られる神経病理および認知障害の多くの側面を反映している。このモデルでは、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメントのi.c.v.投与は、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメント投与後の14日目に開始する、β−アミロイドの沈着をもたらして、これはニューロンの細胞死および認知障害(短期記憶障害)に至る。
FGLペプチドの初期投与の実験((25〜35)β−アミロイドフラグメントのi.c.v.投与後の7、10および13日目での)は、FGLの後頭下方のおよび鼻腔内の両方の投与が、短期記憶障害の防止、種々の脳区域におけるβ−アミロイド負荷の減少、およびニューロンの細胞死の減少をもたらすことを明らかに立証している。後期での(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメントのi.c.v.投与後の30、33および36日目での、FGLペプチドの投与は、脳組織における神経病理学的変化および記憶障害の両方を改善した。
これらの試験の重要な側面は、FGL投与の異なる経路の有効性を比較することであった。得られた結果は、後頭下方に投与されたFGLペプチドの効力と比較すると、鼻腔内に投与されたFGLペプチドの効力ははるかに弱いけれども、FGLペプチドの鼻腔内投与が、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメントでの処置により誘発された記憶障害を効果的に低下したことを明らかに指し示している。鼻腔内に投与されたFGLの記憶への作用が用量依存性であったことは注目すべきである。
結論として、総合すると、これらの結果は、FGLペプチドが、神経病理を低下させて、(25〜35)β−アミロイドのペプチドフラグメントでの処置により誘発される記憶障害を低下させる潜在性を有することを指し示している。これらの知見はまた、FGLペプチドが、アルツハイマー病を持つ患者におけるβ−アミロイド沈着と関連する認知障害の処置のために治療上の潜在性を有することを指し示している。
実施例7:ラットの子における感覚運動制御の発達
未成熟げっ歯類の新生児のCNSは、脳機能の成熟に影響する薬剤を試験するための有用なモデルである。姿勢の調節(運動)の成熟は、運動のおよび感覚の系の組込みを必要とする。最初の出生後週の間に姿勢のおよび運動器官の機能の成熟は、生後日(PND)3に胸椎レベル、PND6に腰椎レベルに到達する、脳幹および皮質脊髄路からの下行路の生長と関係がある。かくして、PND3およびPND6の間の期間は、感覚運動システムの生後組込みを修飾することができる薬剤の作用に感受性な期間として考えられることができる。FGLのような神経活性薬物の作用の測定に使用されることができる、多数の運動制御試験が使用可能である。本試験では、ラットの子の平面立ち直り応答能力(Tilney, 1933)、軸足歩行能力(Altman et al, (1975) Anim Behav.;23:896-920)、背地走性能力[Henck et al, (2001) Toxicol Sci. 62:80-91)および前足懸垂能力[Kimler et al, (1998) Brain Res Dev Brain Res. 107:49-55)]を選択して、感覚運動制御の発達へのFGLの作用を評価した。実験の時間経過を図26(B)に図式的に提示する。
未成熟げっ歯類の新生児のCNSは、脳機能の成熟に影響する薬剤を試験するための有用なモデルである。姿勢の調節(運動)の成熟は、運動のおよび感覚の系の組込みを必要とする。最初の出生後週の間に姿勢のおよび運動器官の機能の成熟は、生後日(PND)3に胸椎レベル、PND6に腰椎レベルに到達する、脳幹および皮質脊髄路からの下行路の生長と関係がある。かくして、PND3およびPND6の間の期間は、感覚運動システムの生後組込みを修飾することができる薬剤の作用に感受性な期間として考えられることができる。FGLのような神経活性薬物の作用の測定に使用されることができる、多数の運動制御試験が使用可能である。本試験では、ラットの子の平面立ち直り応答能力(Tilney, 1933)、軸足歩行能力(Altman et al, (1975) Anim Behav.;23:896-920)、背地走性能力[Henck et al, (2001) Toxicol Sci. 62:80-91)および前足懸垂能力[Kimler et al, (1998) Brain Res Dev Brain Res. 107:49-55)]を選択して、感覚運動制御の発達へのFGLの作用を評価した。実験の時間経過を図26(B)に図式的に提示する。
用量−応答試験。ラットの子による平面立ち直り反射の能力への生後日(PND)1、2および3での一日当り0.026、0.26および2.6μgのFGLdの鼻腔内投与の作用を評価した。それぞれが10匹の子(雄5匹および雌5匹)から成る合計五組の同腹仔をこの試験で使用した。
FGLdの投与は、ビークルで処置された対照動物と比較して、投与当りで一匹の子当り2.6μgの濃度で投与されたPDN5(3.4秒から1.3秒へ)で平面立ち直り反射の能力を有意に改善した。
感覚運動制御の発達試験。PDN1、2および3で2.6μgのペプチドを毎日鼻腔内投与されたラットの子の感覚運動制御の発達(平面立ち直り反射、背地走性反射、軸足歩行および前足懸垂の能力)へのFGLの作用を評価した。それぞれが10匹の子(雄5匹および雌5匹)から成る合計六組の同腹仔をこの試験で使用した。
FGLLの投与は、ビークルで処置された対照ラットと比較して、平面立ち直り反射の能力をPND4で(2.1秒から1.6秒へ)(図24)および背地走性反射の能力をPND6で(56.7%から80.0%に)(図25)、統計的に有意に改善したが、軸足歩行活動もしくは前足懸垂能力には影響を及ぼさなかった。これは、FGLが他の機能を妨害すること無しに、出生後の感覚運動制御の発達を促進することを指し示している。加えて、背地走性能力への有意な作用は何もPND9で観察されないで、運動制御の発達はPND9までに既に完了していたことを示唆している。
考察
本結果は、出生後の発達の間のCNS可塑性の初期プロセスのモジュレーションにおけるFGLペプチドの作用を立証して、FGLペプチドが、FGF受容体を刺激することにより、感覚運動機能の発達を加速する潜在性を有し得ることを示唆している。
本結果は、出生後の発達の間のCNS可塑性の初期プロセスのモジュレーションにおけるFGLペプチドの作用を立証して、FGLペプチドが、FGF受容体を刺激することにより、感覚運動機能の発達を加速する潜在性を有し得ることを示唆している。
実施例8:前後関係の恐怖条件付け試験およびモーリス水迷路試験
前後関係の恐怖条件付け(CFC)試験(Cordero et al, (2003) Horm Behav. 2003 Nov;44(4):338-45)およびモーリス水迷路(MWM)試験[Morris R., (1984) J Neurosci Methods. 11:47-60)は、学習および記憶を評価する課題であって、正常な対照ラットのおよび薬物で処置されるラットの能力を比較するために使用される。
前後関係の恐怖条件付け(CFC)試験(Cordero et al, (2003) Horm Behav. 2003 Nov;44(4):338-45)およびモーリス水迷路(MWM)試験[Morris R., (1984) J Neurosci Methods. 11:47-60)は、学習および記憶を評価する課題であって、正常な対照ラットのおよび薬物で処置されるラットの能力を比較するために使用される。
前後関係の恐怖条件付け試験では、ラットは、*新しい環境に曝されたときに回避不能のショックを経験して、これは同一の環境に引き続いて再び曝されるときに、特徴的な不動性すなわち‘すくみ応答'から成る、条件付け恐怖応答の発達をもたらす。
モーリス水迷路試験では、ラットは、水中で泳ぐことから逃れるために隠されたプラットホームを見つけ出すための空間訓練課題で評価される。
モーリス水迷路試験では、ラットは、水中で泳ぐことから逃れるために隠されたプラットホームを見つけ出すための空間訓練課題で評価される。
本試験は、FGLdペプチドの訓練後投与が、嫌悪的および/もしくは新しい状況における記憶の固定をモジュレートするのに有効であるかどうかを検討した。
前後関係の恐怖条件付け試験
ラットを実験の第一日に先立つ3日間の毎日120秒間取り扱った。1日(訓練)目にラットは、二分間の1分毎に1秒間のショック(無条件刺激)を受領した。訓練後の直後に動物を、5μlのFGLd(5μg)、対照ペプチド(5μg)もしくはビークルで注射した。それぞれの処置群は11〜14匹のラットから成っていた。合計で、39匹の動物を評価した。条件付けのために使用されるチャンバーの中に8分間、しかしショック無しで入れることにより、動物を2、7および30日目に試験した。それぞれのラットを時間−サンプリング手順を用いて、2秒毎に、“すくみ”もしくは“活動性”のいずれかとして等級付けした。
実験の時間経過を図26(C)に図式的に提示する。
ラットを実験の第一日に先立つ3日間の毎日120秒間取り扱った。1日(訓練)目にラットは、二分間の1分毎に1秒間のショック(無条件刺激)を受領した。訓練後の直後に動物を、5μlのFGLd(5μg)、対照ペプチド(5μg)もしくはビークルで注射した。それぞれの処置群は11〜14匹のラットから成っていた。合計で、39匹の動物を評価した。条件付けのために使用されるチャンバーの中に8分間、しかしショック無しで入れることにより、動物を2、7および30日目に試験した。それぞれのラットを時間−サンプリング手順を用いて、2秒毎に、“すくみ”もしくは“活動性”のいずれかとして等級付けした。
実験の時間経過を図26(C)に図式的に提示する。
FGLdの投与後にすくみ時間の百分率の統計的に有意な増加が、動物を条件付け後の2日目(50.5%から73.5%へ)および7日目(30.0%から60.3%へ)に試験したとき、プラセボもしくは対照を受領したラットと比較して、検出された。これは、成熟雄ウイスターラットに訓練後に投与したときに、FGLdが条件付け恐怖応答の長期保持を改善する能力があることを指し示している。
モーリス水迷路試験
モーリス水迷路試験では、ラットを、実験前の五日間(−4〜0日目)に120秒間の毎日の訓練により隠されたプラットホームの場所を探し出すように予め訓練した。1および2日目に、そのなかでプラットホームの場所を一定に残した3回連続した試行をラットに与えた。その間にラットがプラットホームの場所を探し出すことができた時間を、120秒の最大試験期間以内で記録した。1および2日目にそれぞれの訓練試行後の直後にラットは、FGLdペプチド(5μg)、対照ペプチド(5μg)、もしくはビークル溶液の5μlの注射を受領した。
モーリス水迷路試験では、ラットを、実験前の五日間(−4〜0日目)に120秒間の毎日の訓練により隠されたプラットホームの場所を探し出すように予め訓練した。1および2日目に、そのなかでプラットホームの場所を一定に残した3回連続した試行をラットに与えた。その間にラットがプラットホームの場所を探し出すことができた時間を、120秒の最大試験期間以内で記録した。1および2日目にそれぞれの訓練試行後の直後にラットは、FGLdペプチド(5μg)、対照ペプチド(5μg)、もしくはビークル溶液の5μlの注射を受領した。
訓練後の24時間(3日目)および7日(10日目)に、動物を試験した。訓練後の14日(17日目)に、プラットホームの位置を変更した。三回の連続した試行でプラットホームの新しい位置を見出すように、ラットを訓練した(“逆転学習”)。合計で、48匹の動物を評価した。動物を、処置群当り12〜18匹のラットから成る三群に分割した。
FGLdを投与することは、モーリス水迷路試験で評価されたラットでの長期記憶の固定を改善した。FGLd、FGLcもしくはビークルの第1回投与後の日の2日目には、FGLdで処置されたラットは、無処置のラット(93.0秒)よりも統計的に有意にさらに速く(65.8秒)プラットホームを探し出すことができた。作用は17日目にまた統計的に有意であって、改善された学習能力を示唆していた。
実験の時間経過を図26(D)に図式的に提示する。
オープンフィールド試験における追加的実験は、FGLdが、ラットにおいて情緒的なもしくは移動的な行動に影響しなかったことを示した。
実験の時間経過を図26(D)に図式的に提示する。
オープンフィールド試験における追加的実験は、FGLdが、ラットにおいて情緒的なもしくは移動的な行動に影響しなかったことを示した。
考察
CFC/MWM試験の結果は、正常ラットの学習および記憶へのFGLdの長期作用を立証した。FGLは、長期記憶形成に関与するシグナル伝達カスケードを起動することにより作用していることがあり得る。上に示されるように、FGLは、増加されたシナプス前小胞ターンオーバーをもらたす、FGFRを通して作用するシナプスの可塑性をモジュレートすることができる。総合して、これらの結果は、FGLが、学習のおよび記憶の障害を持つ患者の処置に非常に良好な治療的潜在性を有することを示唆している。
CFC/MWM試験の結果は、正常ラットの学習および記憶へのFGLdの長期作用を立証した。FGLは、長期記憶形成に関与するシグナル伝達カスケードを起動することにより作用していることがあり得る。上に示されるように、FGLは、増加されたシナプス前小胞ターンオーバーをもらたす、FGFRを通して作用するシナプスの可塑性をモジュレートすることができる。総合して、これらの結果は、FGLが、学習のおよび記憶の障害を持つ患者の処置に非常に良好な治療的潜在性を有することを示唆している。
実施例9:FGLLのインビボ薬物動態:血漿およびCSF中のFGLLの推定
ラットならびにイヌの血漿およびCSFの中において、投与されたFGLLのレベルをラジオイムノアッセイにより評価した。
ラットならびにイヌの血漿およびCSFの中において、投与されたFGLLのレベルをラジオイムノアッセイにより評価した。
アッセイ
a)ラットおよびイヌの血漿サンプルは、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含有した。
b)FGLLをヨウ素化した。ヨウ素化をヨードゲン法を用いて為した。ヨウ素化ペプチドを、C18カラムの上で取り込まれなかったI125から精製した。
c)測定を繰り返して為した。
1.血漿(もしくはCSF)のサンプル(20μl)を、EDTAを含有する試験管(n=2)に添加した。非免疫ウサギ血清(もしくは対照動物からのCSF)を含有する非特異的結合(NSB)試験管を対照として使用した。
2.希釈した放射能標識のFGLL(100μl;トレーサーのおよそ20,000cpm/試験管)を添加した。トレーサーのみを含有する対照試験管をまた作製した。
3.希釈した抗血清サンプル(PAb268について1:20,000;100μl)を全ての試験管(対照試験管を除く)に加えた。内容物をボルテックス混合した。
4.試験管を4℃で一夜インキュベートした。
5.抗ウサギSAC−細胞溶液(0.1ml)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えた。内容物をボルテックス混合して、次いで、室温で30分間インキュベートした。
6.洗浄緩衝液(2ml)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えて、試験管を3000rpmで5分間遠心分離した。
7.上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい1分間液切りした。
8.洗浄緩衝液(1.5ml)を試験管に再び加えて、試験管を3000rpmで5分間遠心分離した。
9.上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい1分間液切りした。その後に、試験管を3000rpmで1分間遠心分離した。
10.全ての試験管を二回計測した;初めは3分間、次いで10分間。
a)ラットおよびイヌの血漿サンプルは、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含有した。
b)FGLLをヨウ素化した。ヨウ素化をヨードゲン法を用いて為した。ヨウ素化ペプチドを、C18カラムの上で取り込まれなかったI125から精製した。
c)測定を繰り返して為した。
1.血漿(もしくはCSF)のサンプル(20μl)を、EDTAを含有する試験管(n=2)に添加した。非免疫ウサギ血清(もしくは対照動物からのCSF)を含有する非特異的結合(NSB)試験管を対照として使用した。
2.希釈した放射能標識のFGLL(100μl;トレーサーのおよそ20,000cpm/試験管)を添加した。トレーサーのみを含有する対照試験管をまた作製した。
3.希釈した抗血清サンプル(PAb268について1:20,000;100μl)を全ての試験管(対照試験管を除く)に加えた。内容物をボルテックス混合した。
4.試験管を4℃で一夜インキュベートした。
5.抗ウサギSAC−細胞溶液(0.1ml)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えた。内容物をボルテックス混合して、次いで、室温で30分間インキュベートした。
6.洗浄緩衝液(2ml)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えて、試験管を3000rpmで5分間遠心分離した。
7.上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい1分間液切りした。
8.洗浄緩衝液(1.5ml)を試験管に再び加えて、試験管を3000rpmで5分間遠心分離した。
9.上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい1分間液切りした。その後に、試験管を3000rpmで1分間遠心分離した。
10.全ての試験管を二回計測した;初めは3分間、次いで10分間。
結果
検量線精度プロファイルを、重複して(n=6)ラット血漿においてFGLLの0.080ng/ml〜20.48ng/mlの濃度範囲に亘って作成した。良好な精度が、許容真度(<25%)で0.160ng/mlまでの全濃度域に亘って観察されて、それは、ラット血漿におけるアッセイの潜在的定量化下限(LLOQ)の指標を与えるものである。計数時間を増加することはアッセイの精度を改善しなかった。
イヌ血漿において0.080ng/ml〜20.48ng/mlの濃度範囲に亘って検量線精度プロファイルを重複して(n=6)作成した。
検量線精度プロファイルを、重複して(n=6)ラット血漿においてFGLLの0.080ng/ml〜20.48ng/mlの濃度範囲に亘って作成した。良好な精度が、許容真度(<25%)で0.160ng/mlまでの全濃度域に亘って観察されて、それは、ラット血漿におけるアッセイの潜在的定量化下限(LLOQ)の指標を与えるものである。計数時間を増加することはアッセイの精度を改善しなかった。
イヌ血漿において0.080ng/ml〜20.48ng/mlの濃度範囲に亘って検量線精度プロファイルを重複して(n=6)作成した。
薬物動態学的パラメーターを、コンピュータープログラムWinNonlin Pro version 3.3 (Pharsight Corporation, USA)を用いて計算した。定量化限界以下(BLQ)であった値を、平均値の計算においてゼロとして入力した。
幾つかの毒物動態学的パラメーターがまた規定された。測定された毒物動態学的パラメーターには:FGLLの最大血漿濃度(Cmax)、それらの出現時間(Tmax)、および投与後24時間での血漿濃度(C24)が含まれた。24時間の投与間隔以内で血漿FGLL濃度−時間曲線下面積(AUC24)を線形台形公式により推定した。鼻腔内投与の後のAUC24値の計算では、サンプリングの時間は投与開始時に比べてであった(5回の投与手順のそれぞれの間で10分の中断を想定して)。終末速度定数(k)を、時間に対する対数濃度の直線回帰に当てはめることにより推定した。終末半減期(t1/2)をln2/kとして計算した。
50mg/kgでの静脈投与で処置された二匹のラットからのCSFの中のFGLLレベルは、321および269ng/mlであった。100mg/kgでの皮下投与で処置された他の動物からのCSFの中のFGLLレベルは、242、92および81ng/mlであった。これらのデータは、注射的に投与されたときに、FGLLがCNSに入る証拠を提供している。
第一回の投与後に採取された毒物動態サンプルは:
雄および雌を合わせた曝露量(50mg/kg/日、静注):
AUC=51,026時間ng/ml;Cmax=20,951ng/mL
雄および雌を合わせた曝露量(100mg/kg/日、皮下注):
AUC=50,119時間ng/ml;Cmax=8,346ng/mL
を明らかにした。
雄および雌を合わせた曝露量(50mg/kg/日、静注):
AUC=51,026時間ng/ml;Cmax=20,951ng/mL
雄および雌を合わせた曝露量(100mg/kg/日、皮下注):
AUC=50,119時間ng/ml;Cmax=8,346ng/mL
を明らかにした。
三匹のイヌ(8日目で最終投与の1時間後にサンプル採取した)からのCSFの中のFGLLの平均レベルは、動物番号2番での4.1ng/mlから動物番号3番での8.1ng/mlまでの範囲であって、皮下投与後に、FGLLのCNSの中への浸透を指し示した。
実施例10:インビトロでの配列番号2および配列番号5のペプチドフラグメントの作用
配列番号2のEFLペプチドの個別のモノマーは、上で記述される実験のセットアップにおいてラット海馬ニューロンの神経突起成長を強力に刺激して、ラット小脳のニューロンの生存を刺激する能力がある(作用を図27および図28に対応して示す)。EFLペプチドは、NCAMのFn3,2モジュールに由来して、モジュールのE鎖−ループ−G鎖部分を表す。実験のために、ペプチドを上で記述されるように合成した。ペプチドの神経突起生成活性は、ペプチドによる刺激がFGFR1の阻害剤、SU54402、により特異的にブロックされるので、FGFR1依存性である。ペプチドは、受容体を発現する細胞においてFGFR1に結合して、それを刺激する能力がまたあって、そこではペプチドは、受容体のリン酸化を誘発する(20μg/mlの濃度で300%以上だけ)。
配列番号2のEFLペプチドの個別のモノマーは、上で記述される実験のセットアップにおいてラット海馬ニューロンの神経突起成長を強力に刺激して、ラット小脳のニューロンの生存を刺激する能力がある(作用を図27および図28に対応して示す)。EFLペプチドは、NCAMのFn3,2モジュールに由来して、モジュールのE鎖−ループ−G鎖部分を表す。実験のために、ペプチドを上で記述されるように合成した。ペプチドの神経突起生成活性は、ペプチドによる刺激がFGFR1の阻害剤、SU54402、により特異的にブロックされるので、FGFR1依存性である。ペプチドは、受容体を発現する細胞においてFGFR1に結合して、それを刺激する能力がまたあって、そこではペプチドは、受容体のリン酸化を誘発する(20μg/mlの濃度で300%以上だけ)。
FGFR1のリン酸化を以下のアッセイを用いて試験した。ラットのFGFR1(IIICアイソフォーム)ためのcDNAを、ラットPC12細胞株から単離されたRNAを用いるRT−PCRによりクローン化して、pcDNA3.1(+)プラスミド(Invitrogen)の中に挿入したが、これはヘキサヒスチジンのN末端に融合したFGFR1の発現を許容する。約8×105個のHEK293細胞を、完全培地(10%のFCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび58.4g/lのGlutamaxで補足されたDMEM 1965)中で60mmプレートの中で24時間培養して、次いで、LipofectAMIN PLUS[登録商標]試薬キットを用いて製造業者の指示書(Gibco BRL)にしたがって、0.2μgのプラスミド(FGFR含有)でトランスフェクトした。細胞を完全培地の中でさらに24時間増殖させて、次いで、飢餓培地(DMEM 1965)に一夜シフトした。FGFRをトランスフェクトした細胞を、EFLモノマーで20分間刺激し、8M尿度、1mMのオルトバナジウム酸(PBS中)の中で溶菌して、ヒスチジンタグを介して溶菌液から以下のように精製した:溶菌液をNi2+/NTA-sepharose (Qiagen)の上に装填し、溶菌緩衝液プラス10mMのイミダゾールで洗浄して、FGFRを溶菌緩衝液プラス250mMのイミダゾールで溶出した。精製されたFGFRを、抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagn)もしくは抗ホスホチロシン抗体(PY20、Transduction Laboratories)を用いるイムノブロッティングにより分析した。バンドを化学発光により視覚化させて、バンド密度をGeneGnome装置(SynGene)を用いて測定した。
軸索に関連する細胞接着分子[NCBI: NP_031544.1]の配列に由来するペプチドを、上で記述されるアッセイでまた試験した。選択されたペプチドは、C末端から切断された二つのアミノ酸を有する配列番号5に示される配列の11−アミノ酸のフラグメントであった。FGLおよびEFLペプチドと同様に、ペプチドは、インビトロでラット海馬ニューロンの神経突起成長の有意な刺激の能力があった。神経突起の長さにおいて500%増加の最大作用が、ペプチドの0.3μg/mlの濃度で観察された。
19日目のラットの胚からの海馬ニューロン(HN)(cおよびd)を、ポリ−L−リシンで被膜された8−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で細胞40,000個/cm2の密度で接種して、20μMのアミロイド−β25〜35ペプチド(Aβ25〜35)を含有する培地の中で種々の濃度のFGLdの存在下に24時間増殖した後に、それらを固定して、Hoechst 33258で染色した。
生後7日目のラットからの小脳の顆粒ニューロン(CGN)(eおよびf)を、ポリ−L−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で40mMのKClを含有する培地の中で7日間細胞100,000個/cm2の密度で増殖し、次いで、種々の濃度のFGLdで補足された5mMのKClを含有する培地へ置換した。二日のインキュベーションの後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。
(a)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への10ng/mlのGDNFの作用。
(b)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のFGLdの作用。
(c)Aβ25〜35で処理された海馬培養物への50ng/mlのBDNFの作用。
(d)Aβ25〜35で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のFGLdの作用。
(e)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への50ng/mlのIGF−1の作用。
(f)アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への種々の濃度のFGLdの作用。
(a)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への10ng/mlのGDNFの作用。
(b)6−OHDAで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のFGLdの作用。
(c)Aβ25〜35で処理された海馬培養物への50ng/mlのBDNFの作用。
(d)Aβ25〜35で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のFGLdの作用。
(e)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への50ng/mlのIGF−1の作用。
(f)アポトーシスを受けるように誘発されたCGN培養物への種々の濃度のFGLdの作用。
それぞれの型の培養物について少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ニューロンの総数に比較して、生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として表される。FGLの処理なしで細胞死を受けるように誘発された対照培養物は、100%にセットされた。無処理の対照と比較したときには、+p<0.05、++p<0.01。細胞死を受けるように誘発された培養物と比較したときには、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001。
Claims (34)
- 二つの個別なペプチド配列を含む化合物であって、二つの配列の少なくとも一つが式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
〔式中、
A、B、C、Dの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
A、B、C、Dの一つは塩基性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つは酸性アミノ酸残基、AsnもしくはGlnから選択されて、
A、B、C、Dの一つはGlyもしくはAlaであり、そして
L1、L2、L3、L4およびL5は化学結合もしくはn個のアミノ酸残基(そこでは、nは0〜5の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕の配列を含み、
そこでは、
当該ペプチド配列は式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
〔nおよびmは独立して1〜20の整数であり、
XはHN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、ハロゲン−(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、ハロゲン−(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、もしくは[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、(式中、pは0もしくは1〜20の整数である)であり、
AおよびBは独立して置換のもしくは未置換のC1〜10アルキル、置換のもしくは未置換のC2〜10アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはAおよびBは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕のリンカーを通してお互いに接合される、化合物。 - 二つのペプチド配列の少なくとも一つが機能性の細胞表面受容体に結合する能力がある、請求項1に記載の化合物。
- 請求項2に記載の化合物であって、機能性の細胞表面受容体がFGFR1、FGFR2、FGFR3およびFGFR4、もしくはそれらの機能性の同族体を含む繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR類)のファミリーから選択される受容体である、化合物。
- 請求項2に記載の化合物であって、二つのペプチド配列の少なくとも一つが細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子を含む群から選択されるポリペプチドの配列に由来する、化合物。
- 細胞接着分子が、
―神経細胞接着分子(NCAM)(Swiss-Prot受託番号:P13591、P13595−01、P13595)、
―神経細胞接着分子L1(Swiss-Prot受託番号:Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
―神経細胞接着分子−2(NCAM−2)(Swiss-Prot受託番号:P36355)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ng−CAM)(Swiss-Prot受託番号:Q03696;Q90933)、
―神経細胞接着分子CALL(Swiss-Prot受託番号:O00533)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号:P91767、P20241)、
―Nr−CAM(HBRAVO、NRCAM、NR−CAM12)(Swiss-Prot受託番号:Q92823、O15179、Q9QVN3)、
―アクソニン−1/TAG−1(Swiss-Prot受託番号:Q02246、P22063、P28685)、
―軸索に関連する細胞接着分子(AxCAM)(NCBI Ass. 番号:NP_031544.1;Swiss-Prot受託番号:Q8TC35)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(MAG)(Swiss-Prot受託番号:P20917)、
―神経細胞接着分子BIG−1(Swiss-Prot受託番号:Q62682)、
―神経細胞接着分子BIG−2(Swiss-Prot受託番号:Q62845)、
―ファシクリン(FAS−2)(Swiss-Prot受託番号:P22648)、
―神経細胞接着分子HNB−3/NB−3(Swiss-Prot受託番号:Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
―神経細胞接着分子HNB−2/NB−2(Swiss-Prot受託番号:O94779、P07409、P97527)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号:Q9VW71)、
―接合部接着分子−1(JAM−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JKD5、O88792)、
―神経細胞接着F3/F11(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号:Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号:Q90924、Q91Z60;O42414)、
―B−リンパ球細胞接着分子CD22(Swiss-Prot受託番号:Q9R094、P20273)、
―ネオゲニン(NEO1)(Swiss-Prot受託番号:Q92859、P97603、Q90610、P97798)、
―細胞内細胞接着分子−5(ICAM−5/テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号:Q8TAM9、Q60625)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−12(ガレクチン−12)(Swiss-Prot受託番号:Q91VD1、Q9JKX2、Q9NZ03)、
―ガラクトース結合レクチン−4(ガレクチン−4)(Swiss-Prot受託番号:Q8K419;P38552)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択される、請求項4に記載の化合物。 - 細胞の表面受容体が、
―繊維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QZM7、Q99AVV7、Q9UD50、Q63827)、
―繊維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss-Prot受託番号:Q96KM2、P21802、Q63241)、
―繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)(Swiss-Prot受託番号:Q95M13、AF487554、Q99052)、
―繊維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss-Prot受託番号:Q91742)、
―2型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(NTRKT−2)(Swiss-Prot受託番号:Q8WXJ5)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (LAR−PTPRF)(Swiss-Prot受託番号:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8、P10586)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
―タンパク質−S型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRS)(Swiss-Prot受託番号:Q64699、Q13332、O75870)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(R−PTP−カッパ)(Swiss-Prot受託番号:Q15262)、
―タンパク質−D型チロシンホスファターゼ受容体(PTPRD)(Swiss-Prot受託番号:Q8WX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、
―A型エフリン受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss-Prot受託番号:O09127、P29322)、
―A型エフリン受容体3(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ETK−1/CEK4)(Swiss-Prot受託番号:P29318)、
―A型エフリン受容体2(Swiss-Prot受託番号:Q8N3Z2)、
―インスリン受容体(IR)(Swiss-Prot受託番号:Q9PWN6)、
―インスリン様受容体成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss-Prot受託番号:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、
―インスリン関連受容体(IRR)(Swiss-Prot受託番号:P14616)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss-Prot受託番号:06805、P35590、Q06806)、
―ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss-Prot受託番号:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ3サブユニット(CHRNA3)(Swiss-Prot受託番号:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ6サブユニット(Swiss-Prot受託番号:Q15825、Q9R0W9)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(PDGFRB)(Swiss-Prot受託番号:Q8R406、Q05030)、
―インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss-Prot受託番号:Q00560)、
―インターロイキン−23受容体(IL−23R)(Swiss-Prot受託番号:AF461422)、
―IL−3、IL5およびGmCsfのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号:P32927)、
―サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss-Prot受託番号:Q9JM58)、
―クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot受託番号:Q9UHH5)、
―ネトリン−1受容体DCC(Swiss-Prot受託番号:P43146)、
―白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss-Prot受託番号:Q96PJ6、Q96KM2)、
―マクロファージ捕捉剤受容体2(MSR2)(Swiss-Prot受託番号:Q91YK7)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss-Prot受託番号:Q99062)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択される、請求項4に記載の化合物。 - ヘパラン硫酸プロテオグリカンがパーレカン(Swiss-Prot受託番号:P98160)、またはそのフラグメント、もしくは変異体である、請求項4に記載の化合物。
- 金属プロテアーゼが、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:Q05910)、
―ADAM−19(Swiss-Prot受託番号:Q9H013、O35674)、
―ADAM−8(Swiss-Prot受託番号:P78325)、
―ADAM−12(Swiss-Prot受託番号:O43184、Q61824)、
―ADAM−28(Swiss-Prot受託番号:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、
―ADAM−33前駆体(Swiss-Prot受託番号:Q8R533、Q923W9)、
―ADAM−9(Swiss-Prot受託番号:Q13433、Q61072)、
―ADAM−7(Swiss-Prot受託番号:Q9H2U9、O35227、Q63180)、
―ADAM−1Aフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号:Q8R533)、
―ADAM−15(Swiss-Prot受託番号:Q9QYV0、O88839、Q13444)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss-Prot受託番号:AF163291)、
―金属プロテイナーゼ1(Swiss-Prot受託番号:O95204、Q9BSI6)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択される、請求項4に記載の化合物。 - 細胞外マトリックス分子が、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号:Q63870)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号:Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、O95609、P11276)、もしくは、
―テネイシン−R(Swiss-Prot受託番号:Q15568、O00531、Q90995、P10039)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択される、請求項4に記載の化合物。 - 成長因子がサイトカイン様因子−1(CLF−1)(Swiss-Prot受託番号:O75462)、またはそのフラグメント、もしくは変異体である、請求項4に記載の化合物。
- 二つのペプチド配列の少なくとも一つが、
EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)、
NIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)、
ATNRQGKVKAFAHL(配列番号3)、
RYVELYVVADSQEFQK(配列番号4)、
VAENSRGKNVAKG(配列番号5)、
GEYWCVAENQYGQR(配列番号6)、
RLAALNGKGLGEIS(配列番号7)、
KYIAENMKAQNVAKEI(配列番号8)、
TIMGLKPETRYAVR(配列番号9)、
KGLGEISAATEFKT(配列番号10)、
NMGIWVQAENALG(配列番号11)、
IWVQAENMLG(配列番号12)、
EIWVEATNRLG(配列番号13)、
VWVQAANALG(配列番号14)、
EVWIEKDPAKGRI(配列番号15)、
ATNKGGEVKKNGHL(配列番号16)、
KYVELYLVADYLEFQK(配列番号17)、
RYVELYVVVDNAEFQ(配列番号18)、
KYVELVIVADNREFQR(配列番号19)、
KYIEYYLVLDNGEFKR(配列番号20)、
RYLELYIVADHTLF(配列番号21)、
KYVEMFVVVNHQRFQ(配列番号22)、
RYVELFIVVDKERY(配列番号23)、
KYVELFIVADDTVYRR(配列番号24)、
KFIELFVVADEYVYRR(配列番号25)、
KIVEKVIVADNSEVRK(配列番号26)、
VELVIVADHSEAQK (配列番号27)、
VAENSRGKNIAKG(配列番号28)、
IAENSRGKNVARG(配列番号29)、
AENSRGKNSFRG(配列番号30)、
IASNLRGRNLAKG(配列番号31)、
IPENSLGKTYAKG(配列番号32)、
IAENMKAQNEAK(配列番号33)、
QFIAENMKSHNETKEV(配列番号34)、
GEYWCVAKNRVGQ(配列番号35)、
GSYTCVAENMVGK(配列番号36)、
GKYVCVGTNMVGER(配列番号37)、
GNYTCVVENEYG(配列番号38)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号39)、
QYYCVAENGYG(配列番号40)、
GEYYQEAEQNGYG(配列番号41)、
GNYTCLVENEYG(配列番号42)、
GMYQCLAENAYG(配列番号43)、
GMYQCAENTHG(配列番号44)、
GIYYCLASNNYG(配列番号45)、
GGYYCTADNSYG(配列番号46)、
GEYQCFARNDYG(配列番号47)、
GEYFCLASNKMG(配列番号48)、
GEYQCFARNKFG(配列番号49)、
GEYFCLASNKMG(配列番号50)、
GGYYCTADNNYG(配列番号51)、
GNYSCEAENAWGTK(配列番号52)、
GEYTCLAENSLG(配列番号53)、
GEYECVAENGRLG(配列番号54)、
GNYTCVVENKFGR(配列番号55)、
GEYTCLAGNSIG(配列番号56)、
GEYFCVASNPIG(配列番号57)、
EYTCIANNQAGE(配列番号58)、
GMYQCVAENKHLG(配列番号59)、
GEYMCTASNTIGQ(配列番号60)、
EYVCIAENKAGEQ(配列番号61)、
GDYTLIAKNEYGK(配列番号62)、
GFYQCVAENEAG(配列番号63)、
GKYECVATNSAGTR(配列番号64)、
GEYFCVYNNSLG(配列番号65)、
GEYECAATNAHGR(配列番号66)、
GAYWCQGTNSVGK(配列番号67)、
GTYSCVAENILG(配列番号68)、
RVAAVNGKGQGDYS(配列番号69)、
RVAAINGCGIGPFS(配列番号70)、
AVLNGKGLG(配列番号71)、
ALNGQGLGATS(配列番号72)、
RLAAKNRAGLGE(配列番号73)、
RLGVVTGKDLGEI(配列番号74)、
TVTGLKPETSYMVK(配列番号75)、
TLTGLKPSTRYRI(配列番号76)、
TLTGLQPSTRYRV(配列番号77)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号78)、
TLQGLRPETAYELR(配列番号79)、
TLRGLRPETAYELR(配列番号80)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号81)、
TVSGLKPGTRY(配列番号82)、
TISGLKPDTTY(配列番号83)、
TLQGLKPDTAY(配列番号84)、
LRGLKPWTQYAV(配列番号85)、
IDGLEPDTEYIVR(配列番号86)、
LQGLKPWTQYAI(配列番号87)、
TITGLEPGTEYTIQ(配列番号88)、
GLKPWTQYAV(配列番号89)、
TLASLKPWTQYAV(配列番号90)、
LMGLQPATEYIV(配列番号91)、
KGMGPMSEAVQFRT(配列番号92)、
TLTGLKPDTTYDVK(配列番号93)、
ISGLQPETSYSL(配列番号94)、
TLLGLKPDTTYDIK(配列番号95)、
TISGLTPETTYSI(配列番号96)、
GNYSCLAENRLGR(配列番号97)、
GNYTCVVENRVG(配列番号98)、
GTYHCVATNAHG(配列番号99)、
LSHNGVLTGYLLSY(配列番号100)、
NGVLTGYVLRY(配列番号101)、
NGVLTGYNLRY(配列番号102)、
NGNLTGYLLQY(配列番号103)、
VDENGVLTGYKIYY(配列番号104)、
THNGALVGYSVRY(配列番号105)、
NGILTEYILKY(配列番号106)、
NGILIGYTLRY(配列番号107)、
THSGQITGYKIRY(配列番号108)、
NGKITGYIIYY(配列番号109)、
LSHNGIFTLY(配列番号110)、
NGILTEYTLKY(配列番号111)、
LDPNGIITQYEISY(配列番号112)、
NGKITGYIIYY (配列番号113)、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号114)、
HLTVRAYNGAGYGP(配列番号115)、
HLSVKAYNSAGTGPS(配列番号116)、
HLAVKAYNSAGTGPS(配列番号117)、
NLEVRAFNSAGDGP(配列番号118)、
HLTVLAYNSKGAGP(配列番号119)、
LRVLVFNGRGDGP(配列番号120)、
HIDVSAFNSAGYGP(配列番号121)、
HLAVELFNGR(配列番号122)、
LELQSINFLGGQPA(配列番号123)、
HFTVRAYNGAGYGP(配列番号124)、
HLEVQAFNGRGSQPA(配列番号125)、
VIADQPTFVKYLIK(配列番号126)、
TIKGLRPGVVYEGQ(配列番号127)、
TLTELSPSTQYTVK(配列番号128)、
TLDDLAPDTTYLVQ(配列番号129)、
TVSDVTPHAIYTVR(配列番号130)、
IIRGLNASTRYLFR(配列番号131)、
TLMNLRPKTGYSVR(配列番号132)、
TLTGLKPGTEYEVR(配列番号133)、
GPEHLMPSSTYVAR(配列番号134)、
RVTGLTPKKTYEFR(配列番号135)、
LTGLKPGTEYEFR(配列番号136)、
EVRVQAVNGGGNGPP(配列番号137)、
LIKVVAINDRGE(配列番号138)、
VVSIIAVNGREE(配列番号139)、
VVSVYAQNQNGE(配列番号140)、
TISLVAEKGRHK(配列番号141)、
HLEVQAFNGRGSGPA(配列番号142)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号143)、
HVEVQAFNGRGLGPA(配列番号144)、
EFRVRAVNGAGEG(配列番号145)、もしくは
VARVRTRLAPGSRLS(配列番号146)、または
またはそのフラグメント、もしくは変異体、もしくは同族体、
から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドフラグメントである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。 - 二つのペプチド配列の少なくとも一つが配列番号1(EVYVVAENQQGKSKA)、または当該配列のフラグメント、変異体、もしくは同族体である、請求項1〜10に記載の化合物。
- 配列番号1の変異体もしくは同族体が配列番号2〜9、100もしくは125から選択される、請求項12に記載の化合物。
- 二つのペプチド配列の少なくとも一つが配列番号2(NIEVWVEAENALGKKV)、または当該配列のフラグメント、変異体、もしくは同族体である、請求項1〜10に記載の化合物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の化合物であって、化合物が異なるアミノ酸配列を含む二つの個別なペプチドフラグメントを含んで、当該異なるアミノ酸配列は請求項11に記載のペプチドフラグメントのいずれかから選択される、化合物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の化合物であって、化合物が同一のアミノ酸配列を含む二つのペプチドフラグメントを含んで、当該アミノ酸配列は請求項11に記載のペプチドフラグメントのいずれかから選択される、化合物。
- ペプチドフラグメントが配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)を独立して有している、請求項16に記載の化合物。
- ペプチドフラグメントが配列NIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)を独立して有している、請求項16に記載の化合物。
- 二つのペプチドフラグメントの一つが配列EVYVVAENQQGKSKA(配列番号1)を有していて、他のものが配列NIEVWVEAENALGKKV(配列番号2)を有している、請求項15に記載の化合物。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の化合物であって、当該化合物が、
(a)望ましい配列(複数を含む)を含むリガンドを固相合成もしくはフラグメントカップリングにより提供することで、リガンドは固相に付着されている;
(b)もし必要ならば、リガンド(複数を含む)は固相に付着されたままで、任意のN−末端アミノ酸を脱保護すること、
(c)環構造を有する構成体を提供するように、保護されていないN−末端基を有するリガンド(複数を含む)をアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸と反応させること、および
(d)遊離のC−末端基を有するリガンドを含むLPAを提供するように、構成体を固相から切断すること
の工程を含む請求項11に記載の配列(複数を含む)の提示を可能にするLPAを作製するための方法により得られている、化合物。 - 請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- 術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病に関連する中枢のおよび末梢の神経系の異常、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置のための;臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置のための;または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患または状態の処置のための、医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置のための医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 創傷治癒の促進のための医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- がんの処置のための医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- がんが新血管新生を必要とする全ての型の固形腫瘍である、請求項25に記載の使用。
- 急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞死の予防のための医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 血管再生のための医薬品の製造のために請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 学習する能力ならびに/または短期のおよび/もしくは長期の記憶の刺激のための医薬品の製造のための、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 虚血による細胞死の予防のための医薬品の製造のための、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- アルコール摂取による身体損傷の予防のための医薬品の製造のための、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- プリオン病の処置のための医薬品の製造のための、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 請求項22〜31に規定されるように疾患もしくは状態の処置のための、請求項22〜31のいずれか1項に記載の医薬品または請求項21に記載の医薬組成物の使用。
- 処置を必要とする個体の処置の方法であって、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物、および/もしくは請求項21に記載の医薬組成物、ならびに/または請求項22〜31に記載の医薬品を当該個体に投与する工程を含む、方法。
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