JP2007526898A - Ｌｐａを含む化合物 - Google Patents

Ｌｐａを含む化合物 Download PDF

Info

Publication number
JP2007526898A
JP2007526898A JP2006522236A JP2006522236A JP2007526898A JP 2007526898 A JP2007526898 A JP 2007526898A JP 2006522236 A JP2006522236 A JP 2006522236A JP 2006522236 A JP2006522236 A JP 2006522236A JP 2007526898 A JP2007526898 A JP 2007526898A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
swiss
accession number
prot accession
fgl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006522236A
Other languages
English (en)
Inventor
モーテン・アルブレヒトセン
エリザベート・ボック
ウラディミール・ベレジン
アルネ・ホルム
Original Assignee
エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ filed Critical エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ
Publication of JP2007526898A publication Critical patent/JP2007526898A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ)に結合する能力のある新しいペプチド化合物に関して、当該化合物は、二つのアミノ酸配列の少なくとも一つがＦＧＦＲに結合のする能力のある、二つの個別のアミノ酸配列を含む。発明は、化合物のアミノ酸配列を開示して、それらを含む医薬組成物を特徴化する。本発明はまた、ＦＧＦＲが疾患からの病理および／もしくは回復に役割を演じる、異なる病的な状態の処置もしくは予防のために化合物ならびにそれらを含む医薬組成物の使用に関する。本発明の新しいペプチド化合物は、リガンド提示アッセンブリ(ＬＰＡ)方法により取得され得る。

Description

本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ)に結合する能力がある新しいペプチド化合物に関して、当該化合物は、二つのアミノ酸配列の少なくとも一つがＦＧＦＲに結合する能力がある、二つの個別のアミノ酸配列を含む。本発明は化合物のアミノ酸配列を開示して、それらを含む医薬組成物を特徴づける。本発明はまた、ＦＧＦＲが病理および／もしくは疾患からの回復に役割を演じる、異なる病的な状態の処置および／もしくは予防のための化合物ならびに医薬組成物の使用に関する。本発明の新しいペプチド化合物は、リガンド提示アッセンブリ(ＬＰＡ)方法により取得され得る。
脳可塑性および可塑性を制御する機構は、学習および記憶ならびに脳損傷後の機能の回復に中心的である。神経向性の因子は、成体の中枢神経系(ＣＮＳ)における脳可塑性を調節し続ける分子クラスの一つであることが明らかである一方で、あまり認識されていないが、同じく重大であるものは、ニューロンの長期増強作用、保存および再生のような可塑性機構における細胞接着分子(ＣＡＭ類)の役割である。しかしながら、皮肉にも、ＣＡＭ類は、細胞外の空間をまた再編成することができて、アルツハイマー病および多発性硬化症のような状態における脳病理の発症を駆動する障害を引き起こす。候補分子は、古典的なＣＡＭおよびベータ−アミロイドの多くの性質を共有して、偽ＣＡＭとして仮装することができる、アミロイド前駆体タンパク質を含む。ベータ−アミロイドは、アルツハイマー病における老人班の形成のための病巣として働いて、ＣＡＭ類のように、神経向性の因子および他のＣＡＭ類を編成するための環境を提供する。炎症性の応答はこの環境で進化して、小膠細胞、補体および他の因子により治療される永続化されたニューロンの損傷の悪性なサイクルを開始することができる(Cotman et al. (1998) Prog Neurobiol. 55:659-69)。
イムノグロブリンスーパーファミリーの神経細胞接着分子(ＣＡＭ類)は、発育初期の間におよび成体において重要部位で複数群の細胞を核化して維持する。それらの接着性質に加えて、ＣＡＭ類の好同質性のおよび好異質性の相互作用は、細胞内シグナル伝達に影響することができる。それ故に、細胞遊走、増殖、および分化を含む、発症事象に影響するそれらの能力は、それらの接着のおよびシグナル伝達の性質の両方に起因する。
神経細胞接着分子、ＮＣＡＭ、は最初に発見された神経ＣＡＭであった。ＮＣＡＭの発見は集中的に研究されてきていて、今やそれは良く特性化されている(Ronn et al. (2000) Int J Dev Neurosci 18:193-9)。ＮＣＡＭはイムノグロブリン(Ｉｇ)スーパーファミリーに属する。その細胞外部分は、五つのＩｇ様および二つのIII型フィブロネクチン(Ｆ３)モジュールから成る。ＮＣＡＭは、細胞−細胞および細胞−基層相互作用の両方を支援する。ＮＣＡＭは、ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよび異なる型のコラーゲンのような種々の細胞外マトリックス成分に結合する。細胞−細胞相互作用は、ＮＣＡＭの好同質性相互作用により主として支援される。ＮＣＡＭの異なるモジュールは、独特な機能を実施すると示されてきている。かくして、ＮＣＡＭの好同質性結合は、最初の三つのＩｇモジュールに依存すると今や信じられている。ヘパリン結合配列はＩｇ２モジュールに局在化している。ＮＣＡＭはまた、神経細胞接着分子Ｌ１に結合する。この相互作用は、ＮＣＡＭの第四ＩｇモジュールおよびＬ１上で発現されるオリゴマンノシド部分の間で起こると信じられている。ＮＣＡＭの二つの膜−隣接面のＦ３モジュールは、繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ)の結合に関与すると示されてきている。
数多くの研究グループが、ＮＣＡＭ−仲介軸索の成長の基礎をなす細胞内シグナル伝達カスケードが、ＦＧＦＲの刺激により活性化されるシグナル形質導入カスケードに類似することを指し示す大量の証拠を今や蓄積してきている(Povlsen et al. (2003) Neurochem Res 1:127-41)。
繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ類)は、三つのＩｇ様モジュールから細胞外で、そして分裂したチロシン−キナーゼモジュールから細胞内で成る四つの密接に関連する受容体タンパク質チロシンキナーゼのファミリーである(Powers et al. (2000) Endocr Relat Cancer 7:165-97)。受容体は、形態形成、発育、血管新生、および創傷治癒の重要な調節因子として知られている。ＦＧＦＲの活性化およびシグナル伝達は、ＦＧＦＲの天然のリガンド、繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、の高親和性結合により誘発される受容体の二量化に依存して、それはまた、細胞表面のヘパリンもしくはヘパラン硫酸プロテオグリカンの関与を必要とする。繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ類)およびそれらの受容体は、実質的に全ての哺乳動物の組織の多くの発症のおよび修復の過程に関与する綿密なシグナル伝達系を構成して、特に、それらは末梢のおよび中枢の神経系の機能化に顕著な役割を演じている。かくして、ＦＧＦファミリーの２３個のメンバーの中で、１０個が脳中に確認されてきている(Jungnickel et al, (2004) Mol Cell Neurosci. 25:21-9; Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell Tissue Res. 313:139-57)。
ＮＣＡＭは、ＦＧＦＲの推定上の別のリガンド、低親和性結合リガンド、の新しいクラスのメンバーとして最近考えられてきている。ＮＣＡＭおよび受容体の間の直接の相互作用についての証拠が得られてきている(Kiselyov et al. (2003) Structure (Camｂ) 11:691-701)。
ＮＣＡＭおよびＦＧＦＲの間の直接の相互作用に関与する配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(ＦＧＬペプチド)を有する確認されたＮＣＡＭフラグメントは、ＦＧＦＲの活性の調節が重要な役割を演じ得る、種々の病的な障害の処置のための新しい候補薬物として最近提案されてきている(ＷＯ ０３／０１６３５１)。ＷＯ ０３／０１６３５１は、ＦＧＦＲを結合して活性化することによるＦＧＬペプチドの或る生物作用を記述している。ＷＯ ０３／０１６３５１にしたがって、ペプチドの単一コピー(モノマー)のニューロンの細胞へのインビトロでの提示は、細胞の生存および分化を促進するのに十分である。しかしながら、むしろ高濃度のペプチドが作用を達成するために必要とされる。
ペプチド配列、例えば抗原ペプチド、の多重提示は、インビトロでのペプチド配列の生物応答を増幅するための価値ある手段であると示されてきていて(Berezin and Bock (2004) J Mol Neurosci.22:33-39; Ronn et al (1999) Nat Biotechnol 17:1000-5)、それは、インビボでの動物モデルで効果的に使用されてきている(Cambon et al. (2004) J Neurosci. 17:4197-204)。
生物学的に活性なペプチド配列の合成的樹状ポリマーは、研究およびある臨床応用に今や使用されている。樹状ポリマーは、多重部位でコア分子に接着して、それにより枝分かれのポリマーを形成する、モノマー性ペプチド配列の数多くのコピーから成っている。リシンは、それが枝分かれ反応に利用可能な二つの反応性アミノ基を有するので、コアマトリックスの中で最も普通に使用される。リシンコアの上のペプチド配列の多量化は多重抗原ペプチド(ＭＡＰ)提示として知られている。ＭＡＰ(複数を含む)(樹状体ペプチド)の合成方法がＰＣＴ／ＵＳ９０／０２０３９に記述された。
一般的に、二つの経路、即ち直接的なおよび間接的な経路、を樹状体ペプチドの合成に使用することができる。両方の場合において、望ましい程度の枝分かれを得るために、Ｂｏｃ化学の場合には二保護のＢｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)を、Ｆｍｏｃ化学の場合にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｆｍｏｃ)を用いて固体支持体の上で先ずＣ−末端コアが組み立てられる。
直接的な経路では、周知のメリフィールド法によりリシンのコアの上で特定のペプチドの段階的アッセンブリにより、合成が為される。この段階方法は、ＣからＮへの配向を持つペプチドを生産する。ペプチド鎖を縦に並んで合成し得るか、もしくは、それに代えて、それぞれのペプチドを直交する脱離方法を用いてコアの異なるリシン腕の上で合成することができる。
樹状体ペプチドの合成のためのこのアプローチは便利あるけれども、最終生成物の品質が問題視され得て、良く規定された生成物を得る問題が文献に広く議論されてきている。鎖のアッセンブリての間に問題が起こる。ＭＡＰ型の樹状体は巨大分子であり、そこではそれぞれの単一なペプチド鎖はお互いに非制御的に相互作用して、それによりコアへの高効率カップリングを妨害し得て、精製に努力を必要とする不均一な化合物の製造に至る。例えば電気スプレー質量分析法(ＥＳ−ＭＳ)によるこれらの生成物の特徴づけは困難であって、結果として、樹状ペプチド生成物は、完全な特徴づけ無しでしばしば使用される。
間接的な経路では、精製された非保護ペプチドフラグメントのコアマトリックスへのカップリングにより、合成が為される。この型の連結反応のための二つの一般方法を使用し得て、それらは、それぞれ、チオールのおよびカルボニルの化学に基づいている。
リシンマトリックスの上のクロロアセチル基(複数を含む)の組込みおよび精製された、合成のＮ−末端システインペプチドへの引き続くカップリングにより、チオールの化学を行って、明白な構造を持つ樹状体を生成し得る。リシンのコアの上のＳ−アセチル基およびペプチドの上のハロアセチル基を用いることにより、逆の配置をコアマトリックスの上のチオールで達成し得る。カルボニルの化学では、カルボニル基および弱塩基の間に縮合が起こる。この反応に使用され得る、二つの型の弱塩基がある。最初のものはヒドロキシルアミンおよびヒドラジンを含んで、第二のものは１,２−アミノエタンチオールおよび１,２−アミノエタノールのような１,２−二置換部分を含む。最後の二つの基は、Ｎ−末端のＣｙｓおよびＴｈｒもしくはＳｅｒにそれぞれ見出されていて、縮合生成物はチアゾリジンおよびオキサゾリジンである。コアマトリックスの上のカルボニル基は、Ｎ−末端のＳｅｒ、ＴｈｒもしくはＣｙｓの過酸化物酸化により得られ得る。両方の方法は当分野で周知である(例えば、Lu et al., (1991) Mol Immunol 28:623-630; Defoort et al., (1992) Int J Pept Prot Res 40:214-221; Drijfhout et al. (1991) Int J Pept Prot Res 37:27-32を参照)。
ＭＡＰ型の化合物に関連するもう一つの問題はペプチド鎖の配向である。リシンコア上の望ましいペプチドの段階的アッセンブリでの直接的な経路では、ＣからＮへの配向を持つペプチド鎖を有する化合物のみを単に得ることができる。間接的な経路は、両方の配向、ＣからＮへのおよびＮからＣへの、配向を許容するが、方法は他の主要な不利点、例えば、不純な生成物に至る、ジスルフィドの酸化による望ましくない副反応、天然のペプチド鎖の中に存在するシステイン残基との干渉、を有し、そして手順があらゆる合成について最適化を要求する。
ペプチド配列の最適数の複製を見出すことは、解決されるべきもう一つの問題である。ＭＡＰ方法により合成される樹状ペプチドポリマーの大抵の研究は、テトラ−もしくはオクタマーのポリマーを用いて行われてきている。しかしながら、１５個もしくはそれ以上のアミノ酸の４〜８個の配列を含む化合物のインビボでの適用は、もし化合物が脳の処置のためであるならば重要である、化合物が血液−脳関門を浸透する能力の問題の課題がある。ペプチド配列のダイマーは、ダイマーが樹状テトラマー類似体の生物活性を所有する場合には、この問題への解決であり得る。異なるリンカーを含む生物学的に活性なペプチドダイマーの生産および使用は、当分野でまた周知である(例えば、ＷＯ ００／１８７９１、ＷＯ ００／２４７７０を参照)。
(発明の概要)
ＦＧＬの四つの配列から成るＦＧＬペプチドの樹状体変種はラットにおいてインビボで有効であると示されてきている(Cambon et al. (2004) J Neurosci. 17:4197-204)、けれども、本発明の著者等は、ヒト患者の処置に樹状体の薬物候補としての使用を考慮することは予備的であることを見出した。ＦＧＬペプチドの樹状テトラマーの最終精製は、ＭＡＰ合成の生成物は高度に不均質であって、その特徴づけは困難であることを明らかにした。この問題を解決するために、本発明の著者等は、既知の合成手順を用いて、ＦＧＦの異なるダイマーを合成することを試みた。驚くべきことに、ＦＧＬ樹状体に類似する生物活性を有した唯一のＦＧＬダイマーは、ＷＯ ００／１８７９１に開示されるように、リガンド提示アッセンブリ方法(ＬＰＡ)により生産されたダイマーであった。ＦＧＬ配列が、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で開示されるように、Ｃｙｓ残基により、もしくは、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res 45:173-179の中で開示されるように、Ｌｙｓ残基により、連結された、ダイマーのような、ＦＧＬの他のダイマーは同一の活性を有しなかった。
したがって、第一の態様では、本発明は、二つの個別なペプチド配列を含む化合物に関し、そこでは、二つの個別な配列の少なくとも一つは、式
Ｌ１-Ａ-Ｌ２-Ｂ-Ｌ３-Ｃ-Ｌ４-Ｄ-Ｌ５
〔式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは、疎水性アミノ酸残基から選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは、塩基性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは、酸性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは、ＧｌｙもしくはＡｌａであり、そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、化学結合もしくはｎ個のアミノ酸残基(そこでは、ｎは０〜５の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含み、当該二つのペプチド配列は、一般式
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、
Ｘは、ＨＮ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ]ＣＲ(ＣＲ２)ｐＣＲ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐ、もしくは[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ](ＣＲ２)ｐ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数である)であり、ＡおよびＢは独立して、置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕のリンカーを通してお互いに接合される。
本発明にしたがう上の化合物はＬＰＡ方法により取得可能である。
もう一つの態様では、本発明は、上で規定されるように化合物を含む医薬組成物に関する。
さらにもう一つの態様では、本発明は、
ａ)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病に関連する中枢のおよび末梢の神経系の状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置；
ｂ)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置；または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患または状態の処置；
ｃ)創傷治癒の促進；
ｄ)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞死の予防；
ｅ)血管再生の促進；
ｆ)学習能力ならびに／または短期のおよび／もしくは長期の記憶の刺激；
ｇ)虚血による細胞死の予防；
ｈ)アルコール摂取による身体損傷の予防；
ｉ)プリオン病の処置；
ｊ)がんの処置
のための医薬品の製造のために上記の化合物を使用することに関与する。
(図面の説明)
図１は、ＬＰＡ−型ＦＧＬダイマー(ＦＧＬＬ)の合成のフローチャートを示す。
図２は、ＦＧＬＬのＨＰＬＣ精製プロフィールを提示する。
図３は、ＦＧＬＤのＨＰＬＣ精製プロフィールを提示する。
図４は、種々の神経毒性薬剤で処理された一次ニューロンの生存へのＦＧＬペプチドの作用を立証する。
ポリ−Ｄ−リシンで被膜された２４−穴の培養プレート上で種々の濃度のペプチドの有無で六日間細胞１５０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖された１５日目のラットの胚からのドーパミン作動性ニューロン(ＤＮ)(ａおよびｂ)を、１００μＭの６−ＯＨＤＡに二時間露出した。培地を変更して、種々の濃度のＦＧＬｄを加えた。ニューロンを培養の以前にさらに２４時間増殖し、そしてそれらを固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。
１９日目のラットの胚からの海馬ニューロン(ＨＮ)(ｃおよびｄ)を、ポリ−Ｌ−リシンで被膜された８−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で細胞４０,０００個／ｃｍ２の密度で接種して、２０μＭのアミロイド−β２５〜３５ペプチド(Ａβ２５〜３５)を含有する培地の中で種々の濃度のＦＧＬｄの存在下に２４時間増殖した後に、それらを固定して、Hoechst 33258で染色した。
生後７日目のラットからの小脳の顆粒ニューロン(ＣＧＮ)(ｅおよびｆ)を、ポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で４０ｍＭのＫＣｌを含有する培地の中で７日間細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、次いで、種々の濃度のＦＧＬｄで補足された５ｍＭのＫＣｌを含有する培地へ置換した。二日のインキュベーションの後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。
(ａ)６−ＯＨＤＡで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの作用。
(ｂ)６−ＯＨＤＡで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
(ｃ)Ａβ２５〜３５で処理された海馬培養物への５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦの作用。
(ｄ)Ａβ２５〜３５で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
(ｅ)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物への５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１の作用。
(ｆ)アポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物への種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
それぞれの型の培養物について少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ニューロンの総数に比較して、生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として表される。ＦＧＬの処理なしで細胞死を受けるように誘発された対照培養物は、１００％にセットされた。無処理の対照と比較したときには、＋ｐ＜０.０５、＋＋ｐ＜０.０１。細胞死を受けるように誘発された培養物と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図５は、高ＫＣl培地(４０ｍＭ)の中で六日間ニューロンを増殖した後で、低ＫＣl培地(５ｍＭ ＫＣl)へ培地を変えることによりアポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物の中でＤＮＡ−フラグメント化へのＦＧＬペプチドの作用を立証する。フラグメント化ＤＮＡを持つニューロンの数をApoAlertアポトーシス検出キットを用いて測定して、ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンのフラクションを計数により評価した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、低ＫＣlでの対照培養物を１００％にセットして、細胞の全数に比してＤＮＡ−フラグメント化を示す細胞の百分率±平均値の標準誤差として示される。
(ａ)アポトーシスを受ける細胞の数への高ＫＣlのＣＧＮ培養物を奪うことの作用。
(ｂ)アポトーシスで誘発されるＣＧＮ培養物の中でＦＧＬｄの作用。
低ＫＣlで処理されたＣＧＮ培養物と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図６は、Ｅｒｋ１／２のリン酸化へのＦＧＬの作用を示す。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞２９０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、引き続いてＦＧＬdで１０〜９０分間処理し、固定して、ホスホ−ｐ４２／４４に対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５および＊＊ｐ＜０.０１。
図７は、Ａｋｔのリン酸化へのＦＧＬの作用を示す。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞２９０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、種々の濃度において１０〜３０分間それぞれ引き続いてＦＧＬＬで処理して、引き続いて固定して、Ｓｅｒ４７３の上でリン酸化されたＡｋｔに対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として表される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５。
図８は、アポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮのＦＧＬで誘発された生存率へのＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰｌ３Ｋの阻害剤の作用を示す。ＣＧＮを、細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度で七日間ポリ−Ｌ−リシンで被膜された８−穴のパーマノックススライドの上で４０ｍＭのＫＣｌを含有する培地の中で増殖した後で、培地をＦＧＬdと一緒に５ｍＭのＫＣｌを含有する培地に変えた。その後に、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９(●)、Ｐｌ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２(▲)およびＦＧＦＲ阻害剤ＳＵ５４０２(■)を種々の濃度で加えた。阻害剤の添加は、全ての場合で１０μｇ／ｍｌのＦＧＬdの添加により引き継がれた。ペプチドおよび阻害剤とのインキュベーションの二日後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。少なくとも四つの個別の実験からの結果は、ＦＧＬdで処理した対照培養物を１００％にセットして、ニューロンの総数に比べて生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として示される。
図９は、ドーパミン作動性の(●)、海馬の(▲)および小脳顆粒のニューロン(■)からの神経突起成長へのＦＧＬペプチドの作用を示す。細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度でポリ−Ｄ−リシンで被膜された２４−穴の細胞培養プレートの上で種々の濃度のＦＧＬdで、ドーパミン作動性ニューロンを７２時間増殖した。培養物をチロシン水酸化酵素に対して引き続いて免疫染色した。海馬ニューロンおよびＣＧＮを細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で８−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で平板培養して、種々の濃度のＦＧＬdの存在下に２４時間インキュベートした。引き続いて、ニューロンをＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。それぞれのニューロン培養物について少なくとも五つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図１０は、新生のラットからの海馬ニューロンの神経突起成長へのＦＧＬペプチドの三つのダイマー変種の作用を示す。細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で種々の濃度のＦＧＬＬ(■)、ＦＧＬｌｙｓ(▲)もしくはＦＧＬｃｙｓ(●)で、海馬ニューロンの一次培養物を２４時間増殖して、次いで、ＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊＊ｐ＜０.０１。
図１１は、ＣＧＮ培養物におけるＦＧＬで誘発された神経突起成長へのＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰｌ３Ｋの阻害剤の作用を示す。細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で８−穴のパーマノックススライドの上でＦＧＬペプチドおよび阻害剤の存在で、ＣＧＮ培養物を２４時間増殖した。１２.５、２５および５０μＭの濃度で、同時に１０μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＰＤ９８０５９(●)を加えた；３.５、７および１０μＭの濃度で、同時に２７μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＬＹ２９４００２(▲)を加えた。２０、４０および８０μＭの濃度で、同時に２７μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＳＵ５４０２(■)を加えた。処理後に、細胞を固定して、ＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ＦＧＬｄで処理した対照培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。破線は、ＦＧＬdの処理なしの培養物における平均の神経突起長を指し示す。ＦＧＬdで処理した対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１。
図１２は、Ｅ１９ラットからの海馬ニューロンの一次培養物のＦＭ１−４３脱染色の速度へのＦＧＬd、ＦＧＬ対照およびビークルの作用を示す。それぞれの値は、４〜８回の実験の平均を表して、誤差の棒は平均値の標準誤差を指し示す。任意の期間の間で５μｇ／ｍｌのＦＧＬdでの処理、もしくは２４時間で２０μｇ／ｍｌでの処理のいずれも、ＦＭ１−４３の取り除きの速度へ如何なる作用も有しなかった。対照的に、１時間および４８時間で２０μｇ／ｍｌのＦＧＬdで処理された培養物の中のシナプシスは、対照培養物と比較するときに、ＦＭ１−４３の取り除きの著しく増加した速度を示して、これらの培養物における増大されたシナプス前の応答を指し示した。値を不対ｔ検定を用いて比較した。＊ｐ＝０.０４(１時間)および＊＊ｐ＝０.００３２(４８時間)。ＦＧＬ対照は、配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＡＡＧＫＳＫＡ(配列番号：１４７)から成る対照ペプチドである。ＦＧＬ配列のＧｌｎ残基のＡｌａへの変異は、ＦＧＬ活性を廃止すると示されてきている(Kiselyov et al. 2003、上の引用を参照)。
図１３は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントの脳室内(ｉ.ｃ.ｖ)の注射により誘発されたラットの記憶(社会的認識試験)へのＦＧＬＬ、ＦＧＬＤおよびＦＧＬ対照の初期後頭下方投与の作用を立証する。結果は、その中でラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬの後頭下方投与がＡ−βで誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目に為された実験からである。社会的認識試験を(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ投与後の２１日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は４〜２２匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,２７)＝１５.４、ｐ＜０.００１)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な作用が、Ａ−β／Ｖ群と比較して対照およびＶ／Ｖで処理した群の間にまた観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。‘Ｖ／Ｖ'は、Ａ−βおよびＦＧＬの交換としてビークルを受領したラットを意味する。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。
図１４は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬ)のｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷の形成への(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目のＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は３〜１３匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１８)＝５.２、ｐ＝０.０１６)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊ｐ＜０.０５および＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０５)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１５は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬ)のｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの海馬のＣＡ３区域の中のアミロイド負荷の形成への(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目のＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は２〜１２匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１５)＝９.５４、ｐ＝０.００２)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１６は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの海馬でのニューロン死へのＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された毒性後の７、１０、および１３日目に後頭下方に投与された、ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬのラットの海馬のＣＡ３区域の中のニューロン細胞死への作用。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(３,１７)＝１３.７６、ｐ＜０.００１)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１７は、社会的認識試験において(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)の作用を立証する。社会的認識試験をＡ−βフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の４４日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は４〜５匹で変動した。結果を不対ｔ検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。短期間記憶の有意な障害がＡ−βでの処理により誘発された(ｐ＜０.０５、対照およびＡ−β／Ｖの間の不対ｔ検定)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１８は、Ａ−βフラグメントで誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)のラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は３〜１３匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１２)＝１８.６、ｐ＝０.００２)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Bonferroniの多重比較検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１９は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントで誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)のラットの海馬のＣＡ３区域の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は３〜５匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,９)＝１０.６、ｐ＝０.００４)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２０は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントで誘発された毒性後の７、１０、および１３日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。一元配置分散分析法(Ｆ(２,９)＝２６.９；ｐ＜０.００１、Newman-Keuls事後検定：対照群と比較されたＡ−β／Ｖ(＊＊＊ｐ＜０.００１))を用いて、結果を解析して、Ａ−β／ＦＧＬＬで処理した群(＊＊ｐ＜０.０１)と比較した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２１は、社会的認識試験において(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ラット当りビークル、２００μｇのＦＧＬＬ、および４００μｇのＦＧＬＬの三つの鼻腔内投与の作用を示す。社会的認識試験を(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の２１日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は３〜８匹で変動した。結果は平均±平均値の標準誤差として示されて、不対ｔ検定(対照対Ａ−β／Ｖのｐ＜０.０１)および一元配置分散分析法(Ｆ(２,１９)＝５.６；ｐ＝０.０１；Newman-Keuls事後検定、Ａ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、４００のｐ＜０.０５；およびＡ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５；一方ではＡ−β／ＦＧＬＬ、４００対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５)により解析した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖで処理した群と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２２は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)のｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ラット当りビークル、２００μｇのＦＧＬＬ、および４００μｇのＦＧＬＬの三つの鼻腔内投与の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。結果を不対ｔ検定(対照群対Ａ−β／Ｖで処理した群(ｐ＜０.０１)の)ならびに一元配置分散分析法(Ｆ(２,１６)＝８.６；ｐ＝０.０３、Newman-Keuls事後検定：Ａ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、４００の＊＊ｐ＜０.０１およびＡ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５と共に)を用いて解析した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖで処理した群と比較するとき、０.０５(＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２３は、オープンフィールド試験において立ち上がり活性について試験されたラットへの５.９μｇのＦＧＬｄの投与の作用を示す。 (２５〜３５)β−アミロイドフラグメントで誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目に、ペプチドを後頭下方に適用した。数の‘１'、‘２'、および‘３'は、測定の期間を指し示す：‘１'は１〜３分を指して、‘２'は８〜１０分を指して、そして‘３'は１８〜２０分を指す。‘Ｖ／Ｖ'は、ラットが(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびＦＧＬｄの交換としてビークルを受領したことを指し示す。群中の動物の数は９〜１１匹で変動した。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。結果を不対ｔ検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、第一の測定期間(１〜３分)と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。
図２４は、ＰＮＤ１、２、および３での子当り２.６μｇのＦＧＬＬ、ＦＧＬｄもしくはＦＧＬ対照の鼻腔内投与の後に、ＰＮＤ４でのラットの子による平面立ち直り反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(Ｆ＝４.０５、ｐ＝０.０３９)を用いて解析し、そしてNewman-Keuls検定は、対照のおよびＦＧＬ対照の群と比較するとき、ＦＧＬＬ(ｐ＜０.０５)およびＦＧＬｄ(ｐ＜０.０５)の統計的に有意な作用を示した。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。
図２５は、ＰＮＤ１、２、および３での子当り２.６μｇのＦＧＬＬ、ＦＧＬｄもしくはＦＧＬ対照の鼻腔内投与の後で、ＰＮＤ６およびＰＮＤ９でのラットの子による背地走行反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(ＦＰＮＤ６＝５.１４；、ＰＰＮＤ６＝０.００８)を用いて解析した。ＰＮＤ６では、ＦＧＬＬ(＊ｐ＜０.０５)のおよびＦＧＬｄ(＊＊ｐ＜０.０１)の群について、対照のおよびＦＧＬｃ(ＦＧＬ対照)の群と比較するとき、統計的に有意な作用が観察された。ＰＮＤ９では、ＦＧＬの有意な作用は何も観察されなかった(一元配置分散分析法：ＦＰＮＤ９＝０.９４；、ＰＰＮＤ９＝０.４４)。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。
図２６は、インビボ試験の時間経過の図式的提示を示す。
図２７は、低ＫＣｌ濃度でのラットの小脳の顆粒ニューロンの培養物における配列番号２(ＥＦループ)のペプチドの生存作用を示す。対照細胞を、同一の培養条件でインスリン成長因子１(ＩＧＦ−１)で処理した。
図２８は、インビトロでのラット海馬ニューロンへのＥＦＬペプチド(配列番号２)の神経突起生成作用を示す。ＥＦＬで処理した培養物の中の神経突起の長さをビークル(リン酸塩緩衝食塩水)で処理した培養物の中の神経突起の長さと比較する。
(発明の詳細な説明)
１．化合物
繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ)の機能を調整する能力のある化合物は、種々の疾患および病的状態の治療的処置のための有効な薬物の開発の観点で最大の重要性を持つ。かくして、ＦＧＦＲに結合して、ＦＧＦＲ活性を調整する能力がある新規な化合物を提供することが本発明の目的である。本発明にしたがって、化合物は、二つの配列の少なくとも一つは、ＦＧＦＲに低親和性結合をする能力があるアミノ酸配列に共通な構造モチーフを含む、少なくとも二つのペプチド配列を含む。
１．ペプチド配列
かくして、一つの態様では、本発明は、二つの個別なペプチド配列に関し、そこでは、当該二つの個別なペプチド配列の少なくとも一つは、式
Ｌ１-Ａ-Ｌ２-Ｂ-Ｌ３-Ｃ-Ｌ４-Ｄ-Ｌ５
〔式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは塩基性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは酸性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つはＧｌｙもしくはＡｌａであり、そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は化学結合もしくはｎ個のアミノ酸残基(そこでは、ｎは０〜５の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列を含む。
本明細書では、アミノ酸残基について標準的な一字コードならびに標準的な三字コードが適用されている。アミノ酸についての略語は、IUPAC-IUB Joint Commision on Bio-Chemical Nomemclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37の推奨基準にしたがっている。明細書および特許請求の範囲を通して、天然アミノ酸についての三字コードもしくは一字コードのいずれかが使用されている。ＬもしくはＤ型が特定化されてきていない場合には、問題のアミノ酸は天然のＬ型(Pure & Appl. Chem. Vol. (56(5) pp 595-624 (1984)を参照)かもしくはＤ型を有することが理解されるべきであり、それで、形成されるペプチドは、Ｌ型、Ｄ型のアミノ酸、もしくは混合のＬ型およびＤ型の配列から構成され得る。
何も特定化されていない場合には、本発明のペプチドのＣ−末端アミノ酸は遊離のカルボン酸、これは“−ＯＨ”としてまた特定化され得る、として存在することが理解されるべきである。しかしながら、本発明の化合物のＣ−末端アミノ酸は、“−ＮＨ２”として指示される、アミド化誘導体であり得る。他に何も言及されていない場合には、ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸は、遊離のアミノ基、これは“Ｈ−”として特定化され得る、を含んでいる。
他に何も特定化されていない場合には、天然に産出するかしないに関わらず、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、および／もしくはガンマアミノ酸のような、任意のアミノ酸から、アミノ酸を選択することができる。したがって、基としては：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｉｂ、Ｎａｌ、Ｓａｒ、Ｏｒｎ、リシン類似体、ＤＡＰ、ＤＡＰＡおよび４Ｈｙｐが含まれるが、それらに限定されない。
また、本発明にしたがって、例えばアミノ酸のグリコシル化および／もしくはアセチル化のような、化合物／ペプチドの修飾を実施し得る。
塩基性アミノ酸残基は、アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓの残基により、酸性アミノ酸残基は―アミノ酸ＧｌｕおよびＡｓｐの残基により、そして疎水性アミノ酸残基は、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒの残基により、本発明にしたがって表される。好ましい実施態様では、塩基性アミノ酸残基は、ＡｒｇもしくはＬｙｓにより表される。
１．１ ペプチド配列の長さ
本発明の化合物は、共に、６〜１６０個のアミノ酸残基、例えば６〜１５０個のアミノ酸残基、例えば６〜１４０個のアミノ酸残基、例えば６〜１３０個のアミノ酸残基、例えば６〜１２０個のアミノ酸残基、例えば６〜１１０個のアミノ酸残基、例えば６〜１００個のアミノ酸残基、例えば６〜９０個のアミノ酸残基、例えば６〜８０個のアミノ酸残基、例えば６〜７０個のアミノ酸残基、例えば６〜６０個のアミノ酸残基、例えば６〜５０個のアミノ酸残基、例えば６〜４０個のアミノ酸残基、６〜３０個のアミノ酸残基、例えば６〜２０個のアミノ酸残基、例えば６〜１０個のアミノ酸残基を含む二つの個別なペプチドフラグメントを含み得る。かくして、一つの実施態様では、化合物の二つの個別なペプチドフラグメントのいずれかのアミノ酸配列の長さは、変動し得る。もう一つの実施態様では、化合物のそれぞれのペプチドフラグメントのアミノ酸配列の長さは、同一であり得る。
本明細書では、“個別なペプチドフラグメント／配列”なる用語は、ペプチドフラグメント／配列(二つもしくはそれ以上)が、一つのアミノ酸配列の中でペプチド結合により隣接して結合されていないが、それらが、例えば下で考察されるリンカーのような、リンカーを通してお互いに結合され得ることを意味する。
したがって、化合物の個別なペプチド配列のいずれかは、３〜８０個のアミノ酸残基、例えば３〜７０個、例えば３〜６０個、例えば３〜５０個のアミノ酸残基、例えば３〜３０個のアミノ酸残基、例えば３〜２０個のアミノ酸残基、例えば３〜１５個のアミノ酸残基、例えば３〜１０個のアミノ酸残基から独立して成り得る。
もう一つの実施態様では、化合物の配列のいずれかは、４〜８０個のアミノ酸残基、例えば４〜７０個のアミノ酸残基、例えば４〜６０個のアミノ酸残基、例えば４〜５０個のアミノ酸残基、例えば４〜４０個のアミノ酸残基、４〜３０個のアミノ酸残基のような、例えば４〜２０個のアミノ酸残基、例えば４〜１５個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
さらなる実施態様では、配列は、５〜８０個のアミノ酸残基、例えば５〜７０個のアミノ酸残基、例えば５〜６０個のアミノ酸残基、例えば５〜５０個のアミノ酸残基、例えば５〜４０個のアミノ酸残基、例えば５〜３０個のアミノ酸残基、例えば５〜２０個のアミノ酸残基、例えば５〜１５個のアミノ酸残基、例えば５〜１０個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
なおさらなる実施態様では、配列は、６〜８０個のアミノ酸残基、例えば６〜７０個のアミノ酸残基、例えば６〜６０個のアミノ酸残基、例えば６〜５０個のアミノ酸残基、例えば６〜４０個のアミノ酸残基、例えば６〜３０個のアミノ酸残基、例えば６〜２０個のアミノ酸残基、例えば６〜１５個のアミノ酸残基、例えば６〜１０個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る。
本発明はまた、７〜８０個のアミノ酸残基、例えば７〜７０個のアミノ酸残基、例えば７〜６０個のアミノ酸残基、例えば７〜５０個のアミノ酸残基、例えば７〜４０個のアミノ酸残基、例えば７〜３０個のアミノ酸残基、例えば７〜２０個のアミノ酸残基、例えば７〜１５個のアミノ酸残基、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個のアミノ酸残基の長さを独立して有し得る、二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物に関する。
個別な配列の長さは、８〜８０個のアミノ酸残基、例えば８〜７０個のアミノ酸残基、例えば８〜６０個のアミノ酸残基、例えば８〜５０個のアミノ酸残基、例えば８〜４０個のアミノ酸残基、例えば８〜３０個のアミノ酸残基、例えば８〜２０個のアミノ酸残基でまたあり得る。もしくは、それは、９〜８０個のアミノ酸残基、例えば９〜７０個のアミノ酸残基のような、例えば９〜６０個のアミノ酸残基、例えば９〜５０個のアミノ酸残基、例えば９〜４０個のアミノ酸残基、例えば９〜３０個のアミノ酸残基、例えば９〜２０個のアミノ酸残基であり得る。
それらのいずれかが、１０〜７０個のアミノ酸残基のような、１０〜８０個のアミノ酸残基、１０〜５０個のアミノ酸残基のような、例えば１０〜６０個のアミノ酸残基、１０〜３０個のアミノ酸残基のような、例えば１０〜４０個のアミノ酸残基、例えば１０〜２０個のアミノ酸残基の長さを有している、二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物は、本発明の範囲内にまたある。
一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列のいずれかが、１５〜８０個のアミノ酸残基、例えば１５〜７０個のアミノ酸残基、例えば１５〜６０個のアミノ酸残基、例えば１５〜５０個のアミノ酸残基、例えば１５〜４０個のアミノ酸残基、例えば１５〜３０個のアミノ酸残基、例えば１５〜２０個のアミノ酸残基の長さを独立して有する、二つの個別なアミノ酸配列を含む。
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、化合物の二つのアミノ酸配列のいずれかの最小の長さは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個のアミノ酸残基で独立してあり得て、最大のものは、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個のアミノ酸残基である。二つのアミノ酸配列のいずれかの長さが２５〜３６個のアミノ酸残基を持つ場合は、好ましい化合物でまたある。
さらにもう一つの好ましい実施態様では、化合物のペプチドフラグメントの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５個のアミノ酸残基を独立して持ち得る。９〜２０個のアミノ酸残基の範囲における個別なペプチドフラグメントの長さが最も好まれる。
本発明のなおもう一つの好ましい実施態様では、化合物の二つのペプチド配列の少なくとも一つは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子からなる群より選択されるポリペプチドの配列に由来する。
２．２ ペプチド配列の起源
かくして、化合物の二つのペプチド配列の少なくとも一つは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ならびに金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子および成長因子からなる群より選択されるポリペプチドの配列に由来することが好ましい。
本発明の著者等は、１)ＦＧＦＲに結合するそれらの能力が、および２)受容体に対するそれらの結合部位の構造が、ＦＧＦＲの天然の高親和性リガンド、ＦＧＦ類と異なる、新しいクラスのＦＧＦＲリガンドを最近確認してきている。新しいＦＧＦＲリガンドは、受容体の既知のＦＧＦＲ結合部位とまた異なる、ＦＧＦＲの上の結合部位で受容体に低親和性結合をする能力がある。本発明にしたがって、新しい低親和性ＦＧＦＲリガンドのＦＧＦＲ結合部位は、上で考察したモチーフを含む配列を含んでいる。新しいクラスのＦＧＦＲリガンドは、ＦＧＦＲの活性に独立している生物学的機能を有し得るタンパク質を、本発明にしたがって含む。さらに、新しい低親和性ＦＧＦＲリガンドは、１)そのＦＧＦＲを結合して活性化することにより実行される機能、および２)他の機構により実行される機能を有し得る。機能(１)および機能(２)は、異なる生物学的意義を有し得る。受容体への結合の比較的低親和性により、本発明にしたがう新しいリガンドは、ＦＧＦにより既に開始されてきている受容体活性化を調整する能力が無い。本発明にしたがって、新しいグループの低親和性ＦＧＦＲリガンドは、細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子として当分野で公知である分子を含んでいる。
本発明にしたがって、細胞接着分子は、
―神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１３５９１、Ｐ１３５９５−０１、Ｐ１３５９５)、
―神経細胞接着分子Ｌ１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＱ７、Ｑ９ＱＹ３８、Ｐ１１６２７、Ｑ０５６９５、Ｐ３２００４)、
―神経細胞接着分子−２(ＮＣＡＭ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３６３５５)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ｎｇ−ＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０３６９６；Ｑ９０９３３)、
―神経細胞接着分子ＣＡＬＬ(Swiss-Prot受託番号：Ｏ００５３３)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９１７６７、Ｐ２０２４１)、
―Ｎｒ−ＣＡＭ(ＨＢＲＡＶＯ、ＮＲＣＡＭ、ＮＲ−ＣＡＭ１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８２３、Ｏ１５１７９、Ｑ９ＱＶＮ３)、
―アクソニン−１／ＴＡＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０２２４６、Ｐ２２０６３、Ｐ２８６８５)、
―軸索に関連する細胞接着分子(ＡｘＣＡＭ)(NCBI Ass. 番号：ＮＰ＿０３１５４４.１；Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＣ３５)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(ＭＡＧ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２０９１７)、
―神経細胞接着分子ＢＩＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２６８２)、
―神経細胞接着分子ＢＩＧ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２８４５)、
―ファシクリン(ＦＡＳ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２２６４８)、
―神経細胞接着分子ＨＮＢ−３／ＮＢ−３(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＱ５２、Ｐ９７５２８、Ｑ９ＪＭＢ８)、
―神経細胞接着分子ＨＮＢ−２／ＮＢ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９４７７９、Ｐ０７４０９、Ｐ９７５２７)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＶＷ７１)、
―接合部接着分子−１(ＪＡＭ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＫＤ５、Ｏ８８７９２)、
―神経細胞接着Ｆ３／Ｆ１１(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３１９８、Ｐ１２６０、Ｑ１２８６０、Ｑ２８１０６、Ｐ１４７８１、Ｏ９３２５０)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９０９２４、Ｑ９１Ｚ６０；Ｏ４２４１４)、
―Ｂ−リンパ球細胞接着分子ＣＤ２２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｒ０９４、Ｐ２０２７３)、
―ネオゲニン(ＮＥＯ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８５９、Ｐ９７６０３、Ｑ９０６１０、Ｐ９７７９８)、
―細胞内細胞接着分子−５(ＩＣＡＭ−５／テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＡＭ９、Ｑ６０６２５)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−１２(ガレクチン−１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＶＤ１、Ｑ９ＪＫＸ２、Ｑ９ＮＺ０３)、
―ガラクトース結合レクチン−４(ガレクチン−４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｋ４１９；Ｐ３８５５２)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
機能性の細胞の表面受容体は、
―繊維芽細胞成長因子受容体１(ＦＧＦＲ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＺＭ７、Ｑ９９ＡＶＶ７、Ｑ９ＵＤ５０、Ｑ６３８２７)、
―繊維芽細胞成長因子受容体２(ＦＧＦＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＫＭ２、Ｐ２１８０２、Ｑ６３２４１)、
―繊維芽細胞成長因子受容体３(ＦＧＦＲ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５Ｍ１３、ＡＦ４８７５５４、Ｑ９９０５２)、
―繊維芽細胞成長因子受容体４(ＦＧＦＲ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１７４２)、
―２型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(ＮＴＲＫＴ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸＪ５)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (ＬＡＲ−ＰＴＰＲＦ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＥＱ１７、Ｑ６４６０５、Ｑ６４６０４、Ｑ９ＱＷ６７、Ｑ９VIＳ８、Ｐ１０５８６)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２５Ｓ５、Ｑ９ＪＩＸ２、Ｑ９ＥＴ５９、Ｑ９Ｒ０４４、Ｑ９ＱＺＳ７、Ｑ０６５００)、
―タンパク質−Ｓ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＳ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６４６９９、Ｑ１３３３２、Ｏ７５８７０)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(Ｒ−ＰＴＰ−カッパ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５２６２)、
―タンパク質−Ｄ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＤ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸ６５、Ｑ９ＩＡＪ１、Ｐ２３４６８、Ｑ６４４８７)、
―Ａ型エフリン受容体８(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＥＫ)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ０９１２７、Ｐ２９３２２)、
―Ａ型エフリン受容体３(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＴＫ−１／ＣＥＫ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２９３１８)、
―Ａ型エフリン受容体２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｎ３Ｚ２)、
―インスリン受容体(ＩＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＰＷＮ６)、
―インスリン様受容体成長因子−１受容体(ＩＧＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＶＷ４、Ｐ０８０６９、Ｐ２４０６２、Ｑ６０７５１、Ｐ１５１２７、Ｐ１５２０８)、
―インスリン関連受容体(ＩＲＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１４６１６)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ−１(Swiss-Prot受託番号：０６８０５、Ｐ３５５９０、Ｑ０６８０６)、
―ラウンドアバウト受容体−１(ｒｏｂｏ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４４９２４、ＡＦ０４１０８２、Ｑ９Ｙ６Ｎ７)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ３サブユニット(ＣＨＲＮＡ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＶＨＨ６、Ｐ０４７５７、Ｑ８Ｒ４Ｇ９、Ｐ３２２９７)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ６サブユニット(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５８２５、Ｑ９Ｒ０Ｗ９)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲＢ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ４０６、Ｑ０５０３０)、
―インターロイキン−６受容体(ＩＬ−６Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ００５６０)、
―インターロイキン−２３受容体(ＩＬ−２３Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ４６１４２２)、
―ＩＬ−３、ＩＬ５およびＧｍＣｓｆのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３２９２７)、
―サイトカイン受容体様分子３(ＣＲＬＦ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＭ５８)、
―クラスＩサイトカイン受容体(ＺＣＹＴＯＲ５)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＨＨ５)、
―ネトリン−１受容体ＤＣＣ(Swiss-Prot受託番号：Ｐ４３１４６)、
―白血球Ｆｃ受容体様タンパク質(ＩＦＧＰ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＰＪ６、Ｑ９６ＫＭ２)、
―マクロファージ捕捉剤受容体２(ＭＳＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＹＫ７)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９９０６２)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
本発明にしたがうヘパラン硫酸プロテオグリカンはパーレカン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９８１６０)、またはフラグメント、もしくはその変異体である。
金属プロテアーゼは、
―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０５９１０)、
―ＡＤＡＭ−１９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ０１３、Ｏ３５６７４)、
―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｐ７８３２５)、
―ＡＤＡＭ−１２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４３１８４、Ｑ６１８２４)、
―ＡＤＡＭ−２８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＬＮ６、Ｑ６１８２４、Ｑ９ＸＳＬ６、Ｑ９ＵＫＱ２)、
―ＡＤＡＭ−３３前駆体(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３、Ｑ９２３Ｗ９)、
―ＡＤＡＭ−９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１３４３３、Ｑ６１０７２)、
―ＡＤＡＭ−７(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｏ３５２２７、Ｑ６３１８０)、
―ＡＤＡＭ−１Ａフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３)、
―ＡＤＡＭ−１５(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＶ０、Ｏ８８８３９、Ｑ１３４４４)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(ＴＥＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ１６３２９１)、
―金属プロテイナーゼ１(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９５２０４、Ｑ９ＢＳＩ６)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
細胞外マトリックス分子は、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３８７０)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５ＫＶ４、Ｑ９５ＫＶ５、Ｐ０７５８９、Ｑ２８３７７、Ｕ４２５９４、Ｏ９５６０９、Ｐ１１２７６)、もしくは、
―テネイシン−Ｒ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５５６８、Ｏ００５３１、Ｑ９０９９５、Ｐ１００３９)、
またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
を含む群から選択され得る。
本発明にしたがう成長因子は、サイトカイン様因子−１(ＣＬＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ７５４６２)、またはフラグメント、もしくはその変異体である。
本明細書における用語“フラグメント”は、予め決められたタンパク質／ポリペプチドアミノ酸配列の長さの約２５〜９９％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、当該ポリペプチドは、上の群から選択される予め決められたポリペプチドの機能性同属体である。
本明細書における用語“変異体”は、ｉ)予め決められたポリペプチドの配列に５０〜１００％相同である、および／もしくはii)アミノ酸残基の種々の翻訳後修飾、例えばアミノ酸残基のリン酸化、アシル化、グリコシル化のような、他の化学的部分を含む、ならびに／またはiii)もう一つの生物分子(複数を含む)、例えば、ポリペプチド(複数を含む)、脂質(複数を含む)もしくは炭水化物(複数を含む)に物理的に関連するか、または共有的に結合するように、化学的に結合する、アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味して、当該ポリペプチドは上の群から選択される予め決められたポリペプチドの機能性同族体である。用語“物理的に関連する”は、分子が疎水性のもしくは静電的な相互作用を介して関連することを意味する。
予め決められたポリペプチドの“機能性同族体”なる用語により、予め決められたポリペプチドの一つもしくはそれ以上の生物機能、好ましい実施態様ではＦＧＦＲに結合して活性化する機構により実施される生物機能(複数を含む)を有する能力のある分子が本明細書において意味される。
上で考察されてきているように、本発明の好ましい機能性の細胞の表面受容体は、繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ類)のファミリーから選択される受容体である。本発明にしたがう上の分子は、ＦＧＦ類の既知のＦＧＦＲ高親和性結合部位と異なる、ＦＧＦＲに対する別の低親和性結合部位を含む。
上の分子の低親和性ＦＧＦＲ結合部位は、それが、配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)に少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴としている。配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡは、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)に由来して、ＮＣＡＭのＦＧＬペプチドとして先行技術で既知である。一つのアミノ酸配列のもう一つのアミノ酸配列との相同性は、二つの照合配列の中で同一のアミノ酸の百分率として規定される。アミノ酸配列の間の相同性は、ＢＬＯＳＵＭ３０、ＢＬＯＳＵＭ４０、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ５５、ＢＬＯＳＵＭ６０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ６５、ＢＬＯＳＵＭ７０、ＢＬＯＳＵＭ７５、ＢＬＯＳＵＭ８０、ＢＬＯＳＵＭ８５、もしくはＢＬＯＳＵＭ９０のような周知のアルゴリズムを用いて計算され得る。
もう一つの実施態様では、上の分子のＦＧＦＲ結合部位は、配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)に比較して、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。そのような配列は、予め決められた配列、例えば配列番号１、の変異体としての適用により規定される。正のアミノ酸一致は、二つの比較される配列の中で同一の位置を有するアミノ酸の物理的および／もしくは化学的性質により規定される同一性もしくは類似性として規定される。本発明の好ましい正のアミノ酸一致は、Ｋ対Ｒ、Ｅ対Ｄ、Ｌ対Ｍ、Ｑ対Ｅ、Ｉ対Ｖ、Ｉ対Ｌ、Ａ対Ｓ、Ｙ対Ｗ、Ｋ対Ｑ、Ｓ対Ｔ、Ｎ対ＳおよびＱ対Ｒである。
さらにもう一つの実施態様では、ＦＧＦＲの新しい低親和性結合リガンドのＦＧＦＲ結合部位は、
ｉ)配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)に少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、の相同性を有するか、もしくは
ii)配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)に比較して、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、の正のアミノ酸一致を有する
、配列のフラグメントもしくは同族体を含み得る。
さらになおもう一つの実施態様では、本発明の新しい低親和性ＦＧＦＲリガンドのＦＧＦＲ結合部位は、特異的な３Ｄ特徴により特徴づけされ得る、即ち、それは、一つもしくはそれ以上の“鎖−ループ−鎖”構造モチーフから本質的に成り得る。それは、上で考察される配列の好ましい特徴である。本発明にしたがって、鎖−ループ−鎖構造は、式
Ｌ１-Ａ-Ｌ２-Ｂ-Ｌ３-Ｃ-Ｌ４-Ｄ-Ｌ５
〔式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは塩基性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは酸性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つはＧｌｙもしくはＡｌａであり、そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は化学結合もしくはｎ個のアミノ酸残基(そこでは、ｎは０〜５の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕のアミノ酸配列の好ましい３Ｄ構造である。
本発明にしたがって、二つの個別なアミノ酸配列の少なくとも一つは好ましくは、上の確認されるモチーフの少なくとも一つを含んで、上の分子のいずれかに好ましくは由来する。本発明にしたがうそのような配列は、配列番号１〜１４６として確認される配列のいずれかから選択され得る。或る実施態様では、二つの個別な配列の一つは、下で確認されるようにグループ１〜１２の配列の一つのグループから選択され得て、二つの個別な配列のもう一つは、配列のもう一つのグループから選択され得る。他の実施態様では、配列は、同一つのグループの配列から選択され得る。
かくして、一つの実施態様では、配列のいずれかの化合物の一つのアミノ酸配列は、グループ１：
ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)、
ＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)、
ＡＴＮＲＱＧＫＶＫＡＦＡＨＬ(配列番号３)、
ＲＹＶＥＬＹＶＶＡＤＳＱＥＦＱＫ(配列番号４)、
ＶＡＥＮＳＲＧＫＮＶＡＫＧ(配列番号５)、
ＧＥＹＷＣＶＡＥＮＱＹＧＱＲ(配列番号６)、
ＲＬＡＡＬＮＧＫＧＬＧＥＩＳ(配列番号７)、
ＫＹＩＡＥＮＭＫＡＱＮＶＡＫＥＩ(配列番号８)、
ＴＩＭＧＬＫＰＥＴＲＹＡＶＲ(配列番号９)、
の配列から独立して選択され得る。
もう一つの実施態様では、少なくとも二つのペプチド配列の少なくとも一つは、配列、
ＮＭＧＩＷＶＱＡＥＮＡＬＧ(配列番号１１)、
ＩＷＶＱＡＥＮＭＬＧ(配列番号１２)、
ＥＩＷＶＥＡＴＮＲＬＧ(配列番号１３)、
ＶＷＶＱＡＡＮＡＬＧ(配列番号１４)、
ＥＶＷＩＥＫＤＰＡＫＧＲＩ(配列番号１５)、
ＡＴＮＫＧＧＥＶＫＫＮＧＨＬ(配列番号１６)、
からなるグループ２から選択され得る。
さらにもう一つの実施態様では、少なくとも二つのペプチド配列の少なくとも一つは、配列、
ＫＹＶＥＬＹＬＶＡＤＹＬＥＦＱＫ(配列番号１７)、
ＲＹＶＥＬＹＶＶＶＤＮＡＥＦＱ(配列番号１８)、
ＫＹＶＥＬVIＶＡＤＮＲＥＦＱＲ(配列番号１９)、
ＫＹＩＥＹＹＬＶＬＤＮＧＥＦＫＲ(配列番号２０)、
ＲＹＬＥＬＹＩＶＡＤＨＴＬＦ(配列番号２１)、
ＫＹＶＥＬＦＩＶＡＤＤＴＶＹＲＲ(配列番号２４)、
ＫＦＩＥＬＦＶＶＡＤＥＹＶＹＲＲ(配列番号２５)、
ＫＩＶＥＫVIＶＡＤＮＳＥＶＲＫ(配列番号２６)、
ＶＥＬVIＶＡＤＨＳＥＡＱＫ (配列番号２７)、
からなるグループ３から選択され得る。
もう一つの実施態様は、配列、
ＶＡＥＮＳＲＧＫＮＩＡＫＧ(配列番号２８)、
ＩＡＥＮＳＲＧＫＮＶＡＲＧ(配列番号２９)、
ＡＥＮＳＲＧＫＮＳＦＲＧ(配列番号３０)、
ＩＡＳＮＬＲＧＲＮＬＡＫＧ(配列番号３１)、
ＩＰＥＮＳＬＧＫＴＹＡＫＧ(配列番号３２)、
ＩＡＥＮＭＫＡＱＮＥＡＫ(配列番号３３)、
からなるグループ４から選択される配列に関与する。
さらにもう一つの実施態様では、配列は、配列、
ＧＥＹＷＣＶＡＫＮＲＶＧＱ(配列番号３５)、
ＧＳＹＴＣＶＡＥＮＭＶＧＫ(配列番号３６)、
ＧＫＹＶＣＶＧＴＮＭＶＧＥＲ(配列番号３７)、
ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＥＹＧ(配列番号３８)、
ＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧ(配列番号３９)、
ＱＹＹＣＶＡＥＮＧＹＧ(配列番号４０)、
ＧＥＹＹＱＥＡＥＱＮＧＹＧ(配列番号４１)、
ＧＮＹＴＣＬＶＥＮＥＹＧ(配列番号４２)、
ＧＭＹＱＣＬＡＥＮＡＹＧ(配列番号４３)、
ＧＭＹＱＣＡＥＮＴＨＧ(配列番号４４)、
ＧＩＹＹＣＬＡＳＮＮＹＧ(配列番号４５)、
ＧＧＹＹＣＴＡＤＮＳＹＧ(配列番号４６)、
ＧＥＹＱＣＦＡＲＮＤＹＧ(配列番号４７)、
ＧＥＹＦＣＬＡＳＮＫＭＧ(配列番号４８)、
ＧＥＹＱＣＦＡＲＮＫＦＧ(配列番号４９)、
ＧＥＹＦＣＬＡＳＮＫＭＧ(配列番号５０)、
ＧＧＹＹＣＴＡＤＮＮＹＧ(配列番号５１)、
ＧＮＹＳＣＥＡＥＮＡＷＧＴＫ(配列番号５２)、
ＧＥＹＴＣＬＡＥＮＳＬＧ(配列番号５３)、
ＧＥＹＥＣＶＡＥＮＧＲＬＧ(配列番号５４)、
ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＫＦＧＲ(配列番号５５)、
ＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧ(配列番号５６)、
ＧＥＹＦＣＶＡＳＮＰＩＧ(配列番号５７)、
ＥＹＴＣＩＡＮＮＱＡＧＥ(配列番号５８)、
ＧＭＹＱＣＶＡＥＮＫＨＬＧ(配列番号５９)、
ＧＥＹＭＣＴＡＳＮＴＩＧＱ(配列番号６０)、
ＥＹＶＣＩＡＥＮＫＡＧＥＱ(配列番号６１)、
ＧＤＹＴＬＩＡＫＮＥＹＧＫ(配列番号６２)、
ＧＦＹＱＣＶＡＥＮＥＡＧ(配列番号６３)、
ＧＫＹＥＣＶＡＴＮＳＡＧＴＲ(配列番号６４)、
ＧＥＹＦＣＶＹＮＮＳＬＧ(配列番号６５)、
ＧＥＹＥＣＡＡＴＮＡＨＧＲ(配列番号６６)、
ＧＡＹＷＣＱＧＴＮＳＶＧＫ(配列番号６７)、
ＧＴＹＳＣＶＡＥＮＩＬＧ(配列番号６８)、
からなるグループ５から選択され得る。
さらにもう一つの実施態様では、一つもしくは両方の配列は、グループ６：
ＲＶＡＡＶＮＧＫＧＱＧＤＹＳ(配列番号６９)、
ＲＶＡＡＩＮＧＣＧＩＧＰＦＳ(配列番号７０)、
ＡＶＬＮＧＫＧＬＧ(配列番号７１)、
ＲＬＡＡＫＮＲＡＧＬＧＥ(配列番号７３)、
ＲＬＧＶＶＴＧＫＤＬＧＥＩ(配列番号７４)、
から選択される。
さらに、もう一つの実施態様では、配列は、グループ７：
ＴＶＴＧＬＫＰＥＴＳＹＭＶＫ(配列番号７５)、
ＴＬＴＧＬＱＰＳＴＲＹＲＶ(配列番号７７)、
ＴＬＬＧＬＫＰＤＴＴＹＤＩＫ(配列番号７８)、
ＴＬＱＧＬＲＰＥＴＡＹＥＬＲ(配列番号７９)、
ＴＬＲＧＬＲＰＥＴＡＹＥＬＲ(配列番号８０)、
ＴＬＭＮＬＲＰＫＴＧＹＳＶＲ(配列番号８１)、
ＴＩＳＧＬＫＰＤＴＴＹ(配列番号８３)、
ＴＬＱＧＬＫＰＤＴＡＹ(配列番号８４)、
ＬＲＧＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号８５)、
ＩＤＧＬＥＰＤＴＥＹＩＶＲ(配列番号８６)、
ＬＱＧＬＫＰＷＴＱＹＡＩ(配列番号８７)、
ＴＩＴＧＬＥＰＧＴＥＹＴＩＱ(配列番号８８)、
ＧＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号８９)、
ＴＬＡＳＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号９０)、
ＬＭＧＬＱＰＡＴＥＹＩＶ(配列番号９１)、
から選択され得る。
他の実施態様では、本発明は、グループの８、９、１０もしくは１１の配列を含む化合物に関与して、
そこでは、グループ８は、配列、
ＫＧＭＧＰＭＳＥＡＶＱＦＲＴ(配列番号９２)、
ＴＬＴＧＬＫＰＤＴＴＹＤＶＫ(配列番号９３)、
ＩＳＧＬＱＰＥＴＳＹＳＬ(配列番号９４)、
ＴＬＬＧＬＫＰＤＴＴＹＤＩＫ(配列番号９５)、
ＴＩＳＧＬＴＰＥＴＴＹＳＩ(配列番号９６)、
ＧＮＹＳＣＬＡＥＮＲＬＧＲ(配列番号９７)、
ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＲＶＧ(配列番号９８)、
ＮＧＶＬＴＧＹＶＬＲＹ(配列番号１０１)、
ＮＧＶＬＴＧＹＮＬＲＹ(配列番号１０２)、
ＮＧＮＬＴＧＹＬＬＱＹ(配列番号１０３)、
ＶＤＥＮＧＶＬＴＧＹＫＩＹＹ(配列番号１０４)、
ＴＨＮＧＡＬＶＧＹＳＶＲＹ(配列番号１０５)、
ＮＧＩＬＴＥＹＩＬＫＹ(配列番号１０６)、
ＮＧＩＬＩＧＹＴＬＲＹ(配列番号１０７)、
ＴＨＳＧＱＩＴＧＹＫＩＲＹ(配列番号１０８)、
ＮＧＫＩＴＧＹIIＹＹ(配列番号１０９)、
ＮＧＩＬＴＥＹＴＬＫＹ(配列番号１１１)、
ＬＤＰＮＧIIＴＱＹＥＩＳＹ(配列番号１１２)、
ＮＧＫＩＴＧＹIIＹＹ (配列番号１１３)、
の配列からなっていて、
グループ９は、配列、
ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＧＰＡ(配列番号１１４)、
ＨＬＴＶＲＡＹＮＧＡＧＹＧＰ(配列番号１１５)、
ＨＬＳＶＫＡＹＮＳＡＧＴＧＰＳ(配列番号１１６)、
ＨＬＡＶＫＡＹＮＳＡＧＴＧＰＳ(配列番号１１７)、
ＮＬＥＶＲＡＦＮＳＡＧＤＧＰ(配列番号１１８)、
ＨＬＴＶＬＡＹＮＳＫＧＡＧＰ(配列番号１１９)、
ＬＲＶＬＶＦＮＧＲＧＤＧＰ(配列番号１２０)、
ＨＩＤＶＳＡＦＮＳＡＧＹＧＰ(配列番号１２１)、
ＨＬＡＶＥＬＦＮＧＲ(配列番号１２２)、
ＬＥＬＱＳＩＮＦＬＧＧＱＰＡ(配列番号１２３)、
ＨＦＴＶＲＡＹＮＧＡＧＹＧＰ(配列番号１２４)、
ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＱＰＡ(配列番号１２５)、
の配列からなっていて、
グループ１０は、配列、
VIＡＤＱＰＴＦＶＫＹＬＩＫ(配列番号１２６)、
ＴＩＫＧＬＲＰＧＶＶＹＥＧＱ(配列番号１２７)、
ＴＬＤＤＬＡＰＤＴＴＹＬＶＱ(配列番号１２９)、
ＴＶＳＤＶＴＰＨＡＩＹＴＶＲ(配列番号１３０)、
IIＲＧＬＮＡＳＴＲＹＬＦＲ(配列番号１３１)、
ＴＬＭＮＬＲＰＫＴＧＹＳＶＲ(配列番号１３２)、
ＴＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＶＲ(配列番号１３３)、
ＲＶＴＧＬＴＰＫＫＴＹＥＦＲ(配列番号１３５)、
ＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＦＲ(配列番号１３６)、
の配列からなっていて、
グループ１１は、配列、
ＥＶＲＶＱＡＶＮＧＧＧＮＧＰＰ(配列番号１３７)、
ＬＩＫＶＶＡＩＮＤＲＧＥ(配列番号１３８)、
ＶＶＳIIＡＶＮＧＲＥＥ(配列番号１３９)、
ＶＶＳＶＹＡＱＮＱＮＧＥ(配列番号１４０)、
ＴＩＳＬＶＡＥＫＧＲＨＫ(配列番号１４１)、
ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＧＰＡ(配列番号１４２)、
ＨＶＥＶＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰＡ(配列番号１４３)、
ＨＶＥＶＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰＡ(配列番号１４４)、
ＥＦＲＶＲＡＶＮＧＡＧＥＧ(配列番号１４５)、
の配列からなっている。
或る実施態様では、化合物は、グループ１２：
ＫＹＶＥＭＦＶＶＶＮＨＱＲＦＱ(配列番号２２)、
ＲＹＶＥＬＦＩＶＶＤＫＥＲＹ(配列番号２３)、
ＡＬＮＧＱＧＬＧＡＴＳ(配列番号７２)、
ＴＬＴＧＬＫＰＳＴＲＹＲＩ(配列番号７６)、
ＴＶＳＧＬＫＰＧＴＲＹ(配列番号８２)、
ＧＴＹＨＣＶＡＴＮＡＨＧ(配列番号９９)、
ＬＳＨＮＧＶＬＴＧＹＬＬＳＹ(配列番号１００)、
ＬＳＨＮＧＩＦＴＬＹ(配列番号１１０)、
ＴＬＴＥＬＳＰＳＴＱＹＴＶＫ(配列番号１２８)、
ＧＰＥＨＬＭＰＳＳＴＹＶＡＲ(配列番号１３４)、
ＶＡＲＶＲＴＲＬＡＰＧＳＲＬＳ(配列番号１４６)、
もしくは
ＱＦＩＡＥＮＭＫＳＨＮＥＴＫＥＶ(配列番号３４)、
の配列から選択される配列を含み得る。
本発明はまた、配列番号１〜１４６に示される予め決められた配列の長さの少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％を有する上のペプチド配列のフラグメントに関して、そこではフラグメントおよび予め決められた配列の間のアミノ酸配列相同性は１００％である。本明細書における変異体は、配列番号１〜１４６から選択される配列に、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％、の相同性を有するアミノ酸配列、もしくは配列番号１〜１４６から選択される配列に比較して、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％、の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列、として規定される。正のアミノ酸一致は、二つの比較される配列の中で同一の位置を有するアミノ酸の物理的および／もしくは化学的性質により規定される同一性もしくは類似性により規定される。本発明の好ましい正のアミノ酸一致は、Ｋ対Ｒ、Ｅ対Ｄ、Ｌ対Ｍ、Ｑ対Ｅ、Ｉ対Ｖ、Ｉ対Ｌ、Ａ対Ｓ、Ｙ対Ｗ、Ｋ対Ｑ、Ｓ対Ｔ、Ｎ対ＳおよびＱ対Ｒである。一つのアミノ酸配列のもう一つのアミノ酸配列との相同性は、二つの照合配列の中で同一のアミノ酸の百分率として規定される。
本明細書における同族体は、例えば三次元構造のような、予め決められた配列の物理的性質の幾らかもしくは例えばもう一つの分子と、特に受容体分子と、相互作用する能力のような、機能性性質の幾らかを残してきている配列番号１〜１４６に示される配列のいずれかに、６０％以下でかつ１９％以上、例えば５０〜５９％、例えば５５％、例えば４０〜４９％、例えば４５％、例えば３０〜３９％、例えば３５％、例えば２０〜２９％、例えば２５％の相同性を有するアミノ酸配列として規定される。本明細書における同族体の変異体は、配列番号１〜１４６から選択される配列のいずれかの同族体に比較して、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％の正のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列として規定される。正のアミノ酸一致の好ましい実施態様は、上記の通りである。本発明は、予め決められた配列が下で規定される細胞の表面受容体と相互作用する能力を残す、フラグメント、変異体および同族体に関与する。
本発明の一つの実施態様では、選択される配列はＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)である。もう一つの実施態様では、好ましい配列はＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)である。
本発明にしたがって、化合物は、上の配列(配列番号１〜１４６)のいずれかから選択される少なくとも二つの異なる個別なペプチド配列を含み得る。なお、化合物は、上の配列のいずれかから選択される同一のアミノ酸配列を有する二つの個別な配列を含み得る。
一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列がＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)である、二つの同一の個別なペプチド配列を含む。もう一つの好ましい実施態様では、化合物は、配列がＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)である、二つの同一の個別なペプチド配列を含む。さらにもう一つの好ましい実施態様では、化合物は、一つの配列がＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)であって、他のものがＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)である、二つの異なる個別なペプチド配列を含む。他の好ましい実施態様は、配列番号１もしくは２のフラグメント、変異体もしくは同族体を含む二つの個別なアミノ酸配列を含む化合物を包含して、そこでは当該フラグメント、変異体および同族体は、上で規定されるようにである。好ましい実施態様では、配列番号１のフラグメント、変異体もしくは同族体は、上で確認されるグループの１、６、１１および１２の配列番号の３〜９、６９〜７４、１００、１２５および１３７〜１４６の配列から選択され、そして配列番号２のフラグメント、変異体もしくは同族体は、上で確認されるグループの７、９および１０の配列番号の７５〜９１、１１４〜１２３、１００、１２６〜１３２の配列から選択される。
一つの実施態様では、化合物の二つの個別なアミノ酸配列の少なくとも一つは、一つのペプチド鎖の中でペプチド結合により共−接合される配列番号１〜１４６の二つもしくはそれ以上の隣接するペプチド配列を含み、本質的に含み、またはから成る。他の実施態様では、共−接合されるペプチド配列は、例えば一つのペプチド鎖の中で２〜５回反復される配列番号１、もしくは例えばペプチド鎖の中で２〜５回反復される配列番号２、または
例えばペプチド鎖の中で２〜５回反復されて、それにより同一のモノマーから成るオリゴマー(多量体)を形成する配列番号３〜１４６のいずれかのように、同一であり得る。他の実施態様では、オリゴマーを形成するペプチドフラグメントのモノマーは、例えば、それらの一つが配列番号１のそして他のものが配列番号２のアミノ酸配列か、もしくは配列番号３〜１４６で示される配列のいずれかを有している、二つのモノマーから成るオリゴマー(ダイマー)の中でのように、アミノ酸配列の中で異なり得る。本発明にしたがって、オリゴマー(多量体)は、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の反復される配列(モノマー)から成り得る。
当該個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号１〜１４６で確認される配列のいずれかの単一のコピーである、リンカーを通してお互いに接合される二つの個別なペプチド配列から成る化合物は、本発明の好ましい化合物である。いっそうさらに好ましいのは、二つの個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号１の配列である、化合物、もしくは二つの個別なペプチド配列のそれぞれが配列番号２の配列である、化合物である。
化合物の中の個別なペプチド配列の配向は、ＮからＣへの、ＣからＮへのもしくは混合のいずれかであり得る。“ＮからＣへの配向”なる用語は、二つの個別な配列が、構造(ＣＯＯＨ)ペプチド配列(ＮＨ２)−リンカー−(ＮＨ２)ペプチド配列(ＣＯＯＨ)の化合物のような、それらのＮ−末端アミノ酸残基を通してリンカーへ接合されることを意味する。“ＣからＮへの配向”なる用語は、二つの予め決められた配列が、構造(ＮＨ２)ペプチド配列(ＣＯＯＨ)−リンカー−(ＣＯＯＨ)ペプチド配列(ＮＨ２)の化合物のような、それらのＣ−末端アミノ酸残基を通してリンカーへ接合されることを意味する。用語“混合配向”は、二つの予め決められた配列が、例えば、タイプ：(ＮＨ２)ペプチド配列(ＣＯＯＨ)−リンカー−(ＮＨ２)ペプチド配列(ＣＯＯＨ)の化合物として、そのＮ−末端アミノ酸残基を通しての一つのペプチド配列およびそのＣ−末端アミノ酸残基を通してのもう一つのように、それらのＣ−末端アミノ酸残基もしくはＮ−末端のいずれかを通してリンカーへ接合されることを意味する。
１．３ リンカー
本発明にしたがって、化合物の二つの個別なペプチド配列は、リンカーにより共−接合されている。本発明にしたがうリンカー分子は、アキラルなジ−、トリ−もしくはテトラカルボン酸から選択されて、当該酸は、一般式、
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、
Ｘは、ＨＮ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ]ＣＲ(ＣＲ２)ｐＣＲ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐ、もしくは[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ](ＣＲ２)ｐ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数である)であり、ＡおよびＢは独立して、置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるかか、またはＡおよびＢは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
用語のＣ１〜１０アルキルの下では、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、およびｔｅｒｔブチルが意味される。
用語のＣ２〜１０アルケニルの下では、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびｔｅｒｔブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語の芳香族部分の下では、フェニルが意味される。
“ＡおよびＢは、環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
本発明にしたがって、上記のアミノ酸配列の二つもしくはそれ以上を含む二つの個別なペプチド配列は、これらの二つのペプチド配列の一つが、上で規定される分子から選択されるリンカー分子の二つのカルボン酸基の一つに共有的に結合されて、ペプチド配列のもう一つは、当該リンカー分子のもう一つのカルボン酸基に共有的に結合される様に、お互いに接合される。ペプチド配列は、それぞれ、Ｎ−もしくはＣ末端アミノ酸残基のアミノ−またはカルボキシ−基を通してリンカーに共有的に結合される。したがって、本発明の化合物は式、
ＣＯＯＨ／ＣＯＮＨ２−ペプチド配列−ＮＨ−ＣＯ−リンカー−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド
配列−ＣＯＯＨ／ＣＯＮＨ２
もしくはＮＨ２−ペプチド配列−ＮＨ−ＣＯ−リンカー−ＮＨ−ＣＯ−ペプチド
配列−ＮＨ２、
を有する。
２．化合物の製造
２．１ 個別なペプチド配列の製造
本発明のぺプチド配列は、任意の従来の合成的方法、組み換えＤＮＡ技術、それにペプチド配列が由来する完全長タンパク質の酵素的切断もしくは当該方法の組合せにより作製され得る。
組み換え作製
かくして、一つの実施態様では、本発明のぺプチドは、組み換えＤＮＡ技術の使用により製造される。
ペプチドもしくはそのペプチドが起源する対応する完全長タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869により記述されるホスホアミジン方法、もしくはMatthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805により記述される方法、により合成的に作製され得る。ホスホアミジン方法にしたがって、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機の中で合成され、精製され、アニール化され、連結されて、適当なベクターの中にクローン化される。
ペプチドをコード化するＤＮＡ配列は、標準的なプロトコル(Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2nd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)にしたがってＤＮＡアーゼＩを用いて、ペプチド起源の対応する完全長タンパク質をコード化するＤＮＡ配列のフラグメント化によりまた作製され得る。本発明は上で確認されるタンパク質の群から選択される完全長タンパク質に関する。本発明の完全長タンパク質をコード化するＤＮＡは、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いてこれに代えてフラグメント化され得る。ＤＮＡのフラグメントは、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2nd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記述される標準的手順を用いてさらに精製される。
完全長タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムのもしくはｃＤＮＡのライブラリーを作製して、標準的技法(Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2 nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照)にしたがう合成的なオリゴペプチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、完全長タンパク質の全てもしくは部分をコード化するＤＮＡ配列のためにスクリーニングをすることにより得られる、ゲノムのもしくはｃＤＮＡの起源のものでまたあり得る。ＤＮＡ配列は、例えば、ＵＳ４,６８３,２０２もしくはSaiki et al., 1988, Science 239:487-491に記述されるように、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりまた作製され得る。
次いで、ＤＮＡ配列は、任意のベクターであり得る組み換え発現ベクターの中へ挿入され、それは組み換えＤＮＡ手順に便利に付され得る。ベクターの選択は、その中にそれが導入されるべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。かくして、ベクターは自己複製ベクター、即ち、その複製が染色体的な複製とは独立している、染色体外の実体、例えばプラスミド、として存在するベクターであり得る。これに代えて、ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれて、その中にそれが組み込まれてきている染色体(複数を含む)と一緒に複製されるものであり得る。
ベクターの中では、ペプチドもしくは完全長タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、適当なプロモーター配列に作動可能なように接合されるべきである。プロモーターは選択の宿主細胞の中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得て、宿主細胞に相同的なもしくは異種ないずれかのタンパク質をコード化する遺伝子に由来され得る。哺乳動物の細胞の中でコード化ＤＮＡ配列の転写を指揮するための適当なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター(Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854-864)、ＭＴ−１(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814)もしくはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞の中での使用のために適当なプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター(Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11)である。酵母宿主細胞の中での使用のための適当なプロモーターとしては、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber and Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434)もしくはアルコール脱水素酵素遺伝子(Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York)からのプロモーター、またはＴＰ１１(ＵＳ ４,５９９,３１１)もしくはＡＤＨ２−４ｃ(Russell et al., 1983, Nature 304:652-654)プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞の中での使用のために適当なプロモーターは、例えば、ＡＤＨ３プロモーター(McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093-2099)もしくはｔｐｉＡプロモーターである。
コード化ＤＮＡ配列は、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または(真菌宿主に対しては)ＴＰＩ１(Alber and Kawasaki, op. cit)もしくはＡＤＨ３(McKnight et al., op. cit.)プロモーターのような、適当なターミネーターにまた作動可能なように接合され得る。ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えば、ＳＶ４０もしくはアデノウイルス５ Ｅｌｂ領域からの)、転写エンハンサー配列(例えば、ＳＶ４０エンハンサー)および転写エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ類をコード化するもの)のような要素をさらに含み得る。
組み換え発現ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞の中で複製することを可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。そのような配列の例(宿主細胞が哺乳動物の細胞であるとき)は、ＳＶ４０複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコード化する遺伝子または薬物、例えば、ネオマイシン、ヒドロマイシンもしくはメトトレキセートに抵抗性を付与するもののような、その生成物が宿主細胞の中の欠陥を補足する遺伝子、をまた含み得る。
ペプチドもしくは完全長タンパク質をコード化するＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ連結するために、およびそれらを複製に必要な情報を含有する適当なベクターに挿入するために用いられる手順は、当業者には周知である(例えば、Sambrook et al., op.cit.を参照)。
本発明の組み換えペプチドを得るために、コード化ＤＮＡ配列を、第二のペプチドコード化配列およびプロテアーゼ切断部位コード化配列と有益に融合し得て、融合タンパク質をコード化するＤＮＡ構成体を与えるが、そこではプロテアーゼ切断部位コード化配列が、ＨＢＰフラグメントおよび第二のペプチドコード化ＤＮＡの間に位置付けされ、組み換え発現ベクターに挿入されて、組み換え宿主細胞の中で発現される。一つの実施態様では、当該第二ペプチドは、グルタチオン−Ｓ−還元酵素、ウシサイモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然のもしくは合成の変異体、またはそれらのペプチドを含む群から選択されるが、それに限定されるものではない。もう一つの実施態様では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列ＩＥＧＲをを持つ、Ｘａ因子、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫをを持つ、エンテロキナーゼ、アミノ酸配列ＬＶＰＲ／ＧＳを持つ、トロンビンもしくはアミノ酸配列ＸＫＸをを持つ、アクロモバクターリチカスの切断部位であり得る。
その中に発現ベクターが導入される宿主細胞は、ぺプチドもしくは完全長タンパク質の発現の能力がある任意の細胞であり得て、好ましくは、無脊椎動物(昆虫)細胞もしくは脊椎動物細胞のような真核細胞、例えばツメガエル卵母細胞もしくは哺乳動物の細胞、特に昆虫および哺乳動物の細胞、である。適当な哺乳動物の細胞株の例は、ＨＥＫ２９３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３)、ＣＯＳ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０)、ＢＨＫ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０)もしくはＣＨＯ(ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１)の細胞株である。哺乳動物の細胞を形質転換して、細胞の中に導入されるＤＮＡ配列を発現する方法は、例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621；Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341；Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426；Wigler et al., 1978, Cell 14:725；Corsaro and Pearson, 1981, in Somatic Cell Genetics 7, p. 603; Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52:456；and Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845、の中に記述されている。
これに代えて、真菌細胞(酵母細胞を含む)を宿主細胞として用い得る。適当な酵母細胞の例としては、サッカロミセス種もしくはシゾサッカロミセス種、特にサッカロミセス セレビジエの菌株の細胞が含まれる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス種もしくはアカパンカビ種、特にコウジカビもしくはクロカビ、の菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は、例えば、ＥＰ ２３８ ０２３に記述されている。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な補足剤を含有する血清−含有のもしくは無血清の培地のような、哺乳動物の細胞を増殖させるために適当な任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌細胞を育てるために適当な培地であり得る。適当な培地は商業的供給業者から入手可能であるかもしくは公表された処方(例えば、the American Type Culture Collectionのカタログの中で)にしたがって作製され得る。
次いで、遠心分離もしくはろ過により培地から宿主細胞を分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウム、により上澄み液もしくはろ液のタンパク質性成分を析出すること、種々のクロマトグラフ手段、例えば、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、による精製、を含む従来の手段により培養培地から、細胞により組み換え的に製造されるペプチドもしくは完全長タンパク質を回収し得る。
合成的作製
ペプチドの合成的製造のための方法は、当分野において周知である。合成的ペプチドを製造するための詳細な記述ならびに実際的な助言は、Synthetic Peptides： A User's Guidｅ)(Advances in Molecular Biology, Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002の中にもしくはPharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins、Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999：の中に見出され得る。
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いることによりおよびＡｃｍで保護されたシステインで例えば合成され得る。逆相ＨＰＬＣによる精製の後に、ペプチドをさらに加工して、例えば、環状のまたはＣ−もしくはＮ−末端の修飾されたイソ型を取得し得る。環化および末端修飾のための方法は、当分野において周知であって、上で引用されるマニュアルの中で詳細に記述されている。
好ましい実施態様では、本発明のペプチド配列は、合成的に、特に、配列支援ペプチド合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis)(ＳＡＰＳ)方法により、製造される。
配列支援ペプチド合成(ＳＡＰＳ)
ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に、または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)もしくはｔｅｒｔ.−ブチルオキシカルボニル(Ｂｏｃ)をＮ−ａ−アミノ保護基および側鎖官能基のための適当な共通の保護基として用いる全自動化ペプチド合成機上でのポリアミド固相方法(Dryland, A. and Sheppard, R.C., (1986) J.Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137.)の連続的流動形式でのいずれかで、ペプチドを合成し得る。
以下は、本発明のペプチドフラグメントの合成のためにＳＡＰＳを用いるときに役立ち得る化学物質のリストおよび手順の記述である。
化学物質および手順
１．溶媒
ＤＭＦ(Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Riedelde-Haen, Germany)(強陽イオン交換樹脂、例えば、Lewatit S 100 MB／H 強酸、Bayer AG Leverkusen, Germany、を充填したカラムを通過することにより精製されて、もし遊離アミンが存在するならば、黄色(Ｄｈｂｔ−Ｏ−陰イオン)を生じる３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン(Ｄｈｂｔ−Ｏｉｉ)の添加により、使用前に遊離アミンに対して分析され得る)。
ＤＣＭ(ジクロロメタン、分析等級、Riedelde-Haen, Germany)は、精製なしで直接に使用され得る。
２．アミノ酸
Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸および対応するペンタフルオロフェニル(Ｐｆｐ)エステルは、Milligen, UK, NovaBiochem, SwitzerlandおよびBachem, Switzerlandから購入され、そしてＤｈｂｔ−エステルは、適当な側鎖が保護された形で、NovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
Ｂｏｃ−保護されたアミノ酸はBachem, Switzerlandから購入され得る。
３．カップリング試薬
ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ)はRiedelde-Hen, Germanyから購入されて、使用前に蒸留され得る。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)はMerck-Schuchardt, Niinchen, Germanyから購入されて、蒸留により精製され得る。Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ,Ｎ,Ｎ”,Ｎ”−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(ＴＢＴＵ)(PerSeptive Biosystems Gmbtl Hamburg, Germany)。
４．リンカー
ＨＭＰＡ、Novabiochem, Switzerland；
４−ヒドロキシメチル安息香酸、Novabiochem；
４−メトキシマンデル酸、Aldrich, Germany；
ＨＭＰＢ、Novabiochem；ＡＭ、Novabiochem；
ＤＩＣにより発生される予め形成された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯｂｔ)エステルとして樹脂にカップリンされるための、３−(４−ヒドロキシメチルフェノキシ)プロピオン酸、Novabiochem。
ラセミ４−メトキシマンデル酸(９８％純度、Aldrich, Germany)は、リンカーとして直接に使用されるかもしくは(＋)−シンコニン(８５％純度、Aldrich, Germany)での処理により分割され得て、光学活性リンカー(＋)−４−メトキシマンデル酸、Ｉａｘ２０＝＋１４６(水)を９５.８％光学純度で、および(−)−４−メトキシマンデル酸、[ａl２０＝−１２８.６(水)を８８.１％光学純度で与える。
(＋／−)−４−メトキシマンデル酸の分割(A. Mckebzie, D.J.C. Pirie, (1936), Berichte 69, 868; E. Knorr, (1904), Berichte 37, 3172)
(＋／−)−４−メトキシマンデル酸(１０ｇ、５４.８９ｍｍｏｌ、Aldrich、９８％)を熱水(６０〜８０℃)５００ｍｌに溶解して、不溶性不純物を除去するために、溶液をまだ温かい間にデカントする。(＋)−シンコニン(１６.１６ｇ、５４.８９ｍｍｏｌ、Aldrich、８５％、[ａlＤ２０＝＋２１１(文献：＋２２８°))を少しづつ熱い溶液に加える。溶液は６０〜８０℃で１５分攪拌後に澄明になって、氷中で冷却される。１時間後に、沈殿をろ過により収集して、乾燥器中で終夜乾燥して、シンコニン塩９.９ｇを与える。塩を沸騰水(８０ｍｌ)から再結晶する；溶液をまだ温かい間にデカントして、次いで、氷中で冷却する。沈殿を１時間後にろ過により収集し、冷水で三回洗浄して、乾燥器中で終夜乾燥して、７.８４ｇ(１６.４５ｍｍｏｌ)を与える。シンコニン塩(２ｇ、４.２ｍｍｏｌ)を４０ｍｌの２ＮＨＣｌに溶解して、直ちに３×３０ｍｌのジエチルエーテルで抽出する。エーテル相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥して、蒸発乾固して、メトキシマンデル酸０.５５ｇを与えた。遊離された４−メトキシマンデル酸の光学純度は、１８.５％ ([ａ]Ｄ２０＝＋２７０)と評価された。シンコニン塩の二回目の再結晶に引き続いて上で記述されるようにマンデル酸の遊離の後に、光学純度は６９.０％([ａ]Ｄ２０＝＋１００.８°)と評価された。三回目の再結晶は、９５.８％([ａ]Ｄ２０＝＋１４０.０°)の光学純度をもたらした。
５．固体支持体
Ｆｍｏｃの戦略にしたがって製造されるペプチドは、３つの異なる型の固体支持体の上で、ＤＭＦ中の０.０５Ｍもしくはさらに高い濃度のＦｍｏｃで保護された活性化アミノ酸を用いて合成される。
１)ＰＥＧ−ＰＳ(ポリスチレンの上にグラフトされたポリエチレングリコール；Tentagel S ＮＨ２樹脂、０.２７ｍｍｏｌ／ｇ、Rapp Polymere, GermanyもしくはNovaSyn TG 樹脂、０.２９ｍｍｏｌ／ｇ、Novabiochem, Switzerlanｄ)；
２)PepSyn Gel(サクロシンメチルエステルで官能化されたポリジメチルアクリルアミド樹脂、１.０ｍｍｏｌ／ｇ；MilliGen, UK)。
３)PepSyn K(サクロシンメチルエステルで官能化された珪藻土支持化ポリジメチルアクリルアミド樹脂、０.１１ｍｍｏｌ／ｇ；MilliGen, UK)。
Ｂｏｃの戦略にしたがって合成されるペプチドは、付着された最初のアミノ酸(Novabiochem, Switzerlanｄ)でメリフィールド−樹脂(ポリスチレンジビニルベンゼン)の上で合成され得る。
６．触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＥＡ)はAldrich, Germanyから、
エチレンジアミンはFluka, Switzerlandから、
ピペリジンはRiedel-deWhen, Frankfurt, Germanyから購入され得る。
４−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)ピリジン(ＤＭＡＰ)はFluka, Switzerlandから購入されて、対称性無水物を伴うカップリング反応における触媒として使用され得る。
３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾ−トリアジン(Ｄｈｂｔ−ＯＨ)はFluka, Switzerlandから、
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯｂｔ)はNovaBiochem, Switzerlandから購入され得る。
７．カップリング手順
最初のアミノ酸を、適切なＮ−ｃｃ−保護されたアミノ酸およびＤＩＣから発生されたＤＭＦ中の対称性無水物としてカップリングする。Ｐｆｐ−もしくはＤｈｂｔ−エステルとして、または適切なＮ−保護されたアミノ酸およびＨＯｂｔからＤＩＣもしくはＴＢＴＵによりＤＭＦ中で作られる、予め形成されたＨＯｂｔエステルとして、次のアミノ酸をカップリングする。Ｆｍｏｃの場合には全てのアシル化は、試験の間でのＦｍｏｃの脱保護を防止するために８０℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックされる。
８．Ｎ−末端アミノ酸−アミノ(Ｎ−ａ−アミノ)保護基の脱保護
ＤＭＦ中における２０％ピペリジンでの処理(バッチ式に合成されるときは１×３および１×７分)によりもしくは樹脂を通して脱保護溶媒を流して(連続的流動合成を用いて１０分、流速１ｍｌ／分)、引き続いて黄色(Ｄｈｂｔ−Ｏ−)が液抜きされた(drained)ＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの付加の後に何も検出できなくなるまで、ＤＭＦで洗浄することにより、Ｆｍｏｃ基の脱保護を実施する。ＤＣＭ中でＴＦＡでの処理１０×１.５分および１×２０分、に引き続いてＤＣＭで洗浄それぞれ６×９分、ＤＣＭ中の１０％(ｖ／ｖ)トリエチルアミンでの中和それぞれ２×１.５分に引き続いてＤＣＭで洗浄６×９分、により、Ｂｏｃ基の脱保護を実施する。
９．酸で樹脂からぺプチドの切断
９５％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ、Halocarbon Products Corporation, U.S.A.; Biesterfeld & Co. Hamburg, Germany)−水ｖ／ｖでの室温で２時間の処理により、ぺプチドを樹脂から切断する。ろ過された樹脂を９５％ＴＦＡ−水で洗浄して、ろ液および洗浄液を減圧下で蒸発する。残渣をエーテルで洗浄して、酢酸−水から凍結乾燥する。粗製の凍結乾燥製品を高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により分析して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ)によりもしくは電気スプレーイオン化質量分析法(ＥＳ−ＭＳ)により確認する。
１０．塩基で樹脂からぺプチドの切断
乾燥された樹脂(１ｇ)を４℃で１Ｍ水酸化ナトリウム(１０ｍｌ)で処理して、室温で１５分間放置する。樹脂を１０％水性酢酸を含有するフラスコ中へろ過する。ペプチドを凍結乾燥により単離して、ゲルろ過に掛ける。
１１．ＴＦＭＳＡで樹脂からぺプチドの切断
乾燥された樹脂(２５０ｍｇ)を撹拌子と共に丸底フラスコの中に置く。チオアニソール／エタンジチオール(２：１、７５０ＦII)を加え、混合液を氷中で冷却し、ＴＦＡ５ｍｌを加えて、混合液を５〜１０分間撹拌する。ＴＦＭＳＡ(５００ＫII)を滴加して、反応を室温で３０〜６０分間継続する。エーテルの添加の後に、ペプチドを沈殿させる。
１２．側鎖保護基の脱保護
好ましくは、側鎖を樹脂からのペプチドの切断と同時に脱保護する。
１３．予め形成されたＨＯｂｔ−エステル
ａ法
Ｎ−ａ−アミノ保護されたアミノ酸３当量をＨＯｂｔ３当量およびＤＩＣ３当量と一緒にＤＭＦ中に溶かす。溶液を室温で１０分間放置して、次いで、予め活性化されたアミノ酸の添加に先立ってＤＭＦ中のＤｈｂｔ−ＯＨ０.２当量の溶液で洗浄されてきていた樹脂に加えた。
ｂ法
Ｎ−ａ−アミノ保護されたアミノ酸３当量をＨＯｂｔ３当量、ＴＢＴＵ３当量およびＤＩＥＡ４.５当量と一緒にＤＭＦ中に溶かす。溶液を室温で５分間放置して、次いで、樹脂に加える。Ｎ−ａ−アミノ保護されたアミノ酸６当量の予め形成された対称性無水物をＤＣＭ中に溶解して、０℃へ冷却する。ＤＣＣ(３当量)を加えて、反応を１０分間継続する。溶媒を真空で除去して、残りをＤＭＦ中に溶かす。溶液をろ過して、直ちに樹脂に加えて、引き続いてＤＭＡＰ０.１当量を加える。
１４．最初のＮ−ａ−アミノ保護されたアミノ酸のカップリング収率の評価
Ｆｍｏｃで保護された乾燥ペプチド−樹脂３〜５ｍｇを、ＤＭＦの中においてピペリジン５ｍｌで２０回１０分間室温で処理して、ジベンゾフルベンピペリジン付加体に対するＵＶ吸収を３０１ｎｍにて評価する。収率をＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ標準に基づいて算出された伸展係数ｅ３０１を用いて測定する。Ｂｏｃ−保護の場合には、Ｂｏｃ−基の除去の後に、ニンヒドリン−方法にしたがってカップリンングを評価する(Sarin, V.K. et al., (1981), Anal. Biochem, 117, 147-157)。
１５．PepSyn K樹脂上でのペプチド合成
乾燥PepSyn K(約５００ｍｇ)をエチレンジアミンで覆って、室温で終夜放置する。樹脂を液抜きして、ＤＭＦ１０×１５ｍｌで、それぞれ５分洗浄する。液抜き後に、樹脂をＤＭＦ中の１０％ｖ／ｖのＤＩＥＡで洗浄し(２×１５ｍｌ、それぞれ５分)洗浄して、黄色が液抜きされたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの付加により何も検出できなくなるまで、最終的にＤＭＦで洗浄する。ＨＭＰＡ３当量、ＨＯｂｔ３当量およびＤＩＣ３当量をＤＭＦ１０ｍｌ中に溶解して、活性化のために１０分間放置して、その後混合液を樹脂に加えて、カップリングを２４時間継続する。樹脂を液抜きして、ＤＭＦで洗浄して(１０×１５ｍｌ、それぞれ５分)、アシル化をニンヒドリン試験によりチェックした。最初のアミノ酸を、側鎖保護の予め形成された対称性無水物(上を参照)としてカップリンさせて、カップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で７０％より良好であるべきである。次いで、合成を以下に記述するように“連続的流動”としてもしくは“バッチ方式”としてのいずれかで継続する。
１６．連続的流動技法を用いるPepSyn K上での連続したペプチド合成
最初の付着されたアミノ酸を持つ樹脂(約５００ｍｇ)を全自動化ペプチド合成機に接合されたカラムの中に置く。Ｆｍｏｃ基を上で記述されるように脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、Ｆｍｏｃ保護された、必要ならば側鎖保護された、Ｐｆｐエステル(３当量)として、Ｄｈｂｔ−ＯＨ(１当量)の付加でカップリングする。それぞれのカップリングの終点を、Ｄｈｂｔ−ＯＨ陰イオンの黄色の消失を分光光度的にモニターすることにより自動的に測定する。完了された合成の後に、ペプチド−樹脂をＤＭＦ(１０分、流速１ｍｌ／分)、ＤＣＭ(３×５ｍｌ、それぞれ３分)および最終的にジエチルエーテル(３×それぞれ５ｍｌ)で洗浄し、カラムから除去して、真空中で乾燥する。
１７．PepSyn K上での連続したバッチ式ペプチド合成
付着され最初のたアミノ酸を持つ樹脂(約５００ｍｇ)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置いて、上で記述されるようにＦｍｏｃ−基を脱保護する。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように作製されたＤＭＦ(５ｍｌ)中の、予め形成されたＦｍｏｃ保護された、必要ならば側鎖保護された、ＨＯｂｔエステル(３当量)として、カップリングする。別に特定されない限り、カップリングを２時間継続する。次いで、過剰の試薬をＤＭＦ洗浄(１２分、流速、１ｍｌ／分)により除去する。全てのアシル化を８０℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をＤＭＦ(１０分、流速１ｍｌ／分)、ＤＣＭ(５×５ｍｌ、それぞれ１分)および最終的にジエチルエーテル(５×５ｍｌ、それぞれ１分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
１８．ＰＥＧ−ＰＳ上でのバッチ式ペプチド合成
Tentagel S ＮＨ２のもしくはNovaSyn TGの樹脂(２５０ｍｇ、０.２７〜０.２９ｍｍｏｌ／ｇ)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をＤＭＦ(５ｍｌ)の中で膨潤させて、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理して、樹脂上での非プロトン化アミノ基の存在を確保する。樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの付加の後に検出できなくなるまでＤＭＦで洗浄する。ＨＭＰＡ(３当量)を予め形成されたＨＯｂｔ−エステルとして上で記述されるようにカップリンして、カップリングを２４時間継続する。樹脂を液抜きして、ＤＭＦ(５×５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄して、アシル化をニンヒドリン試験でチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように予め形成された対称的無水物としてカップリングする。最初のＦｍｏｃ−保護されたアミノ酸のカップリング収率を、上で記述されるように評価する。それは、全ての場合で６０％よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって以下のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成されたＦｍｏｃ保護された、必要ならば側鎖保護された、ＨＯｂｔエステル(３当量)として、カップリングする。カップリングを２時間継続する。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにＤＭＦ(５×５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄する。全てのアシル化を８０℃で実施されるニンヒドリン試験でチェックする。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をＤＭＦ(３×５ｍｌ、それぞれ５分)、ＤＣＭ(３×５ｍｌ、それぞれ１分)および最終的にジエチルエーテル(３×５ｍｌ、それぞれ１分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
１９．PepSyn Gel上でのバッチ式ペプチド合成
乾燥PepSyn Gel樹脂(５００ｍｇ、１ｍｍｏｌ／ｇ)を、ろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に置く。樹脂をエチレンジアミン(１５ｍｌ)の中で膨潤させて、振盪により２０時間穏やかに攪拌する。樹脂を液抜きして、ＤＭＦ(１０×１５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄する。液抜き後、樹脂をＤＭＦ中の１０％ｖ／ｖのＤＩＥＡ(２×１５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄して、黄色が液抜きされたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの付加の後に検出できなくなるまで、最終的にＤＭＦ(５×１５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄する。ＨＭＰＡ(３当量)を、上で記述されるように(ａ法)予め活性化されたＨＯｂｔ−エステルとしてカップリングして、カップリングを２４時間継続する。樹脂を液抜きして、ＤＭＦ(５×１５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄する。アシル化をニンヒドリン試験によりチェックする。最初のアミノ酸を、上で記述されるように、予め形成された側鎖保護の対称的無水物としてカップリングする。最初のＦｍｏｃ−保護されたアミノ酸のカップリング収率を上で記述されるように評価する。それは、全ての場合７０％よりさらに良好であるべきである。配列にしたがって残りのアミノ酸を、上で記述されるように(ａ法)、予め形成されたＦｍｏｃ保護された、必要ならば側鎖保護された、ＨＯｂｔエステル(３当量)として、カップリングする。カップリングを２時間継続して、もし必要ならば、終夜で二回カップリングする。樹脂を液抜きして、過剰の試薬を除去するためにＤＭＦ(５×５ｍｌ、それぞれ５分)で洗浄する。全てのアシル化を８０℃で実施されるニンヒドリン試験によりチェックする。Ｆｍｏｃ−基を上で記述されるように脱保護する。完了された合成の後で、ペプチド−樹脂をＤＭＦ(３×１５ｍｌ、それぞれ５分)、ＤＣＭ(３×１５ｍｌ、それぞれ２分)および最終的にジエチルエーテル(３×１５ｍｌ、それぞれ２分)で洗浄して、真空中で乾燥する。
１９．ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣは、Waters 996フォトダイオードアレー検出器を備えたWaters 600E機器上で、Waters Radial Pak８×１００ｍｍＣ１８逆相カラムで実施され得る。Ａ緩衝液は水中の０.１容量％ＴＦＡであって、Ｂ緩衝液は９０容量％アセトニトリル、９.９容量％水および０.１容量％ＴＦＡである。緩衝液はカラムを通して１.５ｍｌ／分の流速で以下のグラジエントを用いてポンプで送られる：０％〜７０％Ｂからの線形グラジエント(２０分)、７０〜１００％からの線形グラジエント(１分)、定組成の１００％Ｂ(５分)。２．０％Ｂで定組成(２分)、０〜５０％Ｂからの線形グラジエント(２３分)、５０〜１００％Ｂからの線形グラジエント(５分)、定組成の１００％Ｂ(５分)。
２．２ 化合物のＬＰＡ製造
本発明にしたがって、興味ある化合物は好ましくはＬＰＡ方法により得られる。
ＬＰＡ方法
ＬＰＡ方法はＷＯ ００／１８７９１の中に開示されている。方法は本質的に以下の工程より成る：
(ａ)望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を固相合成もしくはフラグメントカップリングにより提供することで、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されている；
(ｂ)もし必要ならば、ペプチドフラグメント(複数を含む)は固相に付着されたままで、任意のＮ−末端アミノ酸を脱保護すること。
(ｃ)環構造を有する構成体を提供するように、保護されていないＮ−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)をアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸と反応させること、および
(ｄ)遊離のＣ−末端基を有するペプチドフラグメント(複数を含む)を含むＬＰＡを提供するように、構成体を固相から切断すること。
上の方法では、(ｄ)工程に先立って、以下の工程を実施し得る：
(ｃ１)もし存在するならば、(ｃ)工程で用いられたカルボン酸から起源する任意のＮ−保護された基を脱保護すること、
(ｃ２)少なくとも一つのＮ−保護されたＮ−末端アミノ酸基を有する望ましい配列(複数を含む)を含むペプチドフラグメント(複数を含む)を提供するように、固相合成もしくはフラグメントカップリングを継続すること、および／または化学的部分を付着すること、ならびに
(ｃ３)もし存在するならば、任意のＮ−末端アミノ基を脱保護すること((ｄ)工程に先立ってもしくはその以後で)。
方法は、とりわけ、ＮからＣへの配向を持つ本発明の望ましい配列を提示するＬＰＡ類を提供する((ｃ)工程)。そして、また同時にＣからＮへの配向を持つ配列も提供する((ｃ２)工程)。
かくして、本発明の化合物を得るために、固相に付着される二つのペプチド鎖が、アキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸により組み立てられるべきである。本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、Ｘは、ＨＮであり、ＡおよびＢは独立して置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
もう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、Ｘは、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐＣＲ、もしくはＲＨＮ(ＣＲ２)ｐＣＲ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数である)であり、(式中、それぞれのＲは、Ｈ、置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分である)、またはＡおよびＢは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
さらにもう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、Ｘは、ＨＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、もしくは[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ]ＣＲ(ＣＲ２)ｐＣＲ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数であり、それぞれのＲは独立して、Ｈまたは置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕を有する。
なおもう一つの実施態様では、本方法で使用されるべき適当なアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸は、一般式、
Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１〜２０の整数であり、Ｘは、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐ、もしくは[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ](ＣＲ２)ｐ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数であり、それぞれのＲは独立して、Ｈまたは置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは一緒に、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を形成する)〕を有する。
用語のＣ１〜１０アルキルの下では、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、およびｔｅｒｔブチルが意味される。
用語のＣ２〜１０アルケニルの下では、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖のもしくは分枝鎖のアルケニル基、例えば、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、およびｔｅｒｔブテニルが意味される。
用語の環状部分の下では、シクロヘキサン、およびシクロペンタンが意味される。
用語の芳香族部分の下では、フェニルが意味される。
“ＡおよびＢは環状の、複素環式のもしくは芳香族の部分を形成する”なる用語は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを指す。
カルボン酸との反応により、Ｘ(ＣＯ−配列)２−固相の型の構成体(式中、Ｘは上で規定されるようである)が得られる。
用語“配列”により、天然由来のおよび／もしくは非天然由来のアミノ酸を含むペプチド、ＰＮＡ−配列またはペプチド模倣体が、本明細書中で意味される。“天然由来のアミノ酸”により、天然に見出される２０個の酸のＬ−およびＤ−型が意味される。非天然−由来のアミノ酸は、例えば、修飾された天然由来のアミノ酸である。用語の配列は、一つもしくはそれ以上のそのような配列を含むとさらに意図される。適当なペプチド模倣体の例は、Marshall G.R.,(1993) Tetrahedron, 49:3547-3558に記述されている。用語“化学的部分”は、ＬＰＡの溶解度もしくは生物活性を高める実体およびＬＰＡをその標的もしくはマーカーに指向するための実体を指す。配列についての好ましい実施態様は、上に記述されている。
Ｘ基は、同一の配列、または一つもしくはそれ以上の異なる配列および／または部分の直接的にまたは間接的に継続される段階的合成またはフラグメントカップリングを許容する。ＬＰＡにおけるペプチドフラグメントの配向(ＮからＣへもしくはＣからＮへ)は、望ましいように規定される。一つの実施態様では、本発明はＮからＣへの配向を持つＬＰＡを特徴とし、もう一つの実施態様では、それは配列の同時的なＮからＣへのおよびＣからＮへの提示を持つ化合物に関与していて、なおもう一つの実施態様では、配列はＣからＮへの配向を有する。
Ｘが暫定的に保護されたアミノ機能を含む場合には、合成もしくはカップリングを保護の後に直接的に行うことができる。環システムの効果的な形成((ｃ)工程における、上を参照)を提供する全てのカルボキシルを含有する基の適当な活性化は、半当量のカルボン酸を用いて保障され得る。トリ−もしくはテトラ−カルボン酸の場合には、活性化されたカルボキシ基は、エチレンジアミンのようなジアミンもしくはメルカプト−、オキシ−、オキソもしくはカルボキシル基のようにさらなる反応に対して適当に官能化されているアミンでさらに誘導体化され得る。ジアミンの場合には、ペプチド合成もしくはフラグメントカップリングを、望ましい配列もしくは化学的な部分にしたがって直接に継続することができる。好ましい実施態様では、Ｆｍｏｃ−保護戦略が用いられるが、任意のアミノ保護基を、合成もしくはカップリン戦略に依存して用い得る。例はＢｏｃ−保護基戦略である。
連続した段階的な合成もしくはフラグメントカップリングは、一つのもしくはリジンのような二官能性の化学的な部分の場合には二つのアミノ酸基で行われるので、ＭＡＰ合成により得られた従来の四量体的なリジン樹状体と比べて遥かにさらに良好な結果を得ることができることが驚くべきことに見出されている。さらに、最適なペプチド合成手順もしくはカップリング手順を、固相に付着された単一鎖に対して使用できて、それらの同質性をＬＰＡを形成する以前に検証できる。固相からの切断および同時的な側鎖脱保護を、標準的なペプチド合成手順(上に記述される)により実施することができる。かくして、最終生成物が、最適なかつ良く規定された組成を有して得られ得る。ＨＰＬＣもしくはゲルろ過のような標準的なクロマトグラフ法による精製を、望まれるかもしくは必要とされるかにより、容易に実施することができる。
環構造を提供するための好ましいジ−、トリ−およびテトラカルボン酸は、イミノジ酢酸、２−アミノマロン酸、３−アミノグルタル酸、３−メチルアミノグルタル酸、３−クロログルタミン酸、３−メトキシ−カルボニルグルタル酸、３−アセチルグルタル酸、グルタル酸、トリカルバリル酸、３,４−ビス−カルボキシメチルアジピン酸、４−(２−カルボキシエチル)−ピメリン酸、(３,５−ビス−カルボキシメチル−フェニル)−酢酸、３,４−ビス−カルボキシメチル−アジピン酸、ベンゼン−１,２,４,５−テトラカルボン酸、４−(３−カルボキシ−アリルアミノ)−ブタ−２−エン酸、４,４−イミノ−ジ安息香酸、１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボン酸、５−アミノイソフタール酸、２−クロロマロン酸、３−ヒドロキシグルタル酸およびベンゼン−１,３,５−トリカルボン酸から選択され得る。
フラグメントカップリング(フラグメントカップリングもしくはフラグメント縮合)は、例えば、「ペプチド合成計画」(Peptide Synthesis protocols)、Methods in Molecular Biology Vol. 35, Chapter 15, 303-316, Nyfeler R, Pennington MW and Dunne BM Eds.,Humana Press, 1994に記述されるように、標準的な手順したがって実施され得る。したがって、フラグメントは、上で記述されるように、固相上で合成され、保護基の完全な保存をもって固相から切断され、精製されて、特徴づけされ得る。適当なフラグメントを、上で記述される他の技法によりまた取得し得る。
本発明の化合物の製造のために上のＬＰＡ方法を使用することは、本発明の好ましい実施態様である。
３．生物活性
本発明にしたがって、化合物を、化合物のペプチド配列(複数を含む)内に位置する結合部位を通して細胞表面受容体に結合して、活性を調整できて、当該結合部位は式、
Ｌ１-Ａ-Ｌ２-Ｂ-Ｌ３-Ｃ-Ｌ４-Ｄ-Ｌ５
〔式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは塩基性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは酸性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つはＧｌｙもしくはＡｌａであり、そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は化学結合もしくはｎ個のアミノ酸残基(そこでは、ｎは０〜５の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される]の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
それ故に、構造的モチーフに結合する上の受容体を含む４〜８０個のアミノ酸残基の長さを有する全てのペプチド配列は、本発明の範囲の中にある。ペプチド配列の好ましい実施態様は上で考察されている。好ましい実施態様における本発明は、二つの個別な配列を含む化合物に関与して、当該配列のそれぞれは上のモチーフを含んで、ＦＧＦＲに結合する能力がある。
受容体
かくして、本発明の化合物は、受容体、特に機能性細胞の表面受容体、のリガンドである。
細胞の表面受容体は、少なくとも一つのペプチド鎖を含む任意の分子として本発明の明細書の中で規定されて、当該分子が膜の外側でシグナルを受領し、そのシグナルを膜を通して伝達して、特定の作用を細胞内において分子的レベルで誘発することにより、例えば、分子複合体の会合もしくは解離を誘発することにより、または生化学的な反応、例えば受容体の自動的リン酸化、または分子内のシグナル伝達の開始に導く受容体のタンパク分解的切断を開始することにより、当該シグナルをさらに運ぶことを可能にするような方式で、当該分子は細胞の原形質膜と会合される。
本発明は機能性細胞の表面受容体に関する。“機能性細胞の表面受容体”により、本発明の細胞の表面受容体がリガンドの確認可能な群を有し、これらのリガンドの受容体への結合が、細胞の生理学的な応答をもたらす分子内的シグナル伝達を誘発することが意味される。例えば、細胞の分化、増殖、生存、アポトーシスもしくは運動性のような、生理学的応答は、受容体との相互作用に関与するリガンド、および／もしくは親和性もしくは存続時間のような当該相互作用の特性、ならびに／または受容体を発現する細胞の種に依存する。用語“リガンド”により、受容体に結合して、それにより当該受容体を活性化するかもしくは阻害する能力がある化合物が規定される。受容体の“活性化”とは、リガンドの細胞外結合の後で、細胞の上述の生理学的応答の一つをもたらす細胞の内部で、“受容体シグナル伝達”もしくは“シグナル伝達”と集合的に用語付けされた生化学的反応のカスケードの中に、受容体が“リガンド結合”の作用を伝達する能力があるようになった、ことを意味する。受容体の“阻害”とは、リガンドの細胞外結合の後で、受容体が“休止”もしくは“不活性”になって、受容体リガンド結合に応答して通常に開始される生化学的反応のカスケードをもはや開始する能力が無いことを意味する。本発明したがって、上で特徴とされる化合物は、機能性細胞の表面受容体の活性化もしくは阻害の能力がある。
本発明の機能的細胞の表面受容体は、好ましい実施態様では、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４を含む繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ類)のファミリーの受容体である。最も好ましい実施態様では、本発明の受容体は、ＦＧＦＲ１もしくはその機能性同族体である。
用語“受容体の機能性同族体”により、
ｉ)ＦＧＦＲの細胞外結合およびそれにより細胞の中での受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、ならびに／もしくは、
ii)ＦＧＦＲのアダプター分子の細胞内結合およびそれにより細胞の中の受容体依存性シグナル伝達カスケードを活性化すること、
の能力がある分子が意味される。
用語“結合”とは、ＦＧＦＲもしくはＦＧＦＲ同族体およびＦＧＦＲに対する結合部位を有する対分子との間の直接的なまたは間接的な相互作用を指す。本明細書では、対分子は、ＦＧＦＲの細胞外リガンドであるか、もしくは細胞内アダプター分子である。“アダプター分子”とは、本発明の内容では、受容体の“活性な状態”を認識し、そのような受容体に選択的に結合して、シグナル伝達の反応のカスケードを誘発することにより細胞の中で“活性化された受容体”のシグナルを運ぶ能力がある分子として規定される。分子内アダプター分子は、例えば、ＳＴＮ、ＦＲＳ、Ｇｒｂ、ＳＨＰ２、ＰＬＣｙもしくはＰＩＰ３により表され得る。
受容体の活性化は、リガンド結合により誘発される受容体二量化にしばしば依存する。それ故に、化合物が受容体分子の二量化(もしくは多量化)を促進する能力は、有利な特徴として本発明に関与する。かくして、一つの実施態様では、本発明は、ＦＧＦＲを二量化する能力がある化合物を特徴とする。本発明の化合物による受容体の二量化は、例えば、受容体の天然の高親和性リガンド、例えばＦＧＦ、が受容体環境の中に不在であって、受容体が暫定的に“休止”、不活性であるときの状況で、起こり得る。しかしながら、一つのＦＧＦ類の存在下では、受容体がこのＦＧＦにより占有されて、活性化されていて、それ故に、本発明の化合物は、ＦＧＦにより誘発されるＦＧＦＲ受容体シグナル伝達を調整するために低い能力を持つかもしくは能力がが全く無い。それにもかかわらず、本発明の化合物は、もし受容体がＦＧＦ暴露に先立って化合物(複数を含む)に暴露されてきているならば、それに代わる結合部位(複数を含む)を占有することにより、ＦＧＦＲへの天然の高親和性リガンドの結合を減衰し得る。この方式で、本発明の化合物は、ＦＧＦに依存する受容体シグナル伝達を調整し得る。受容体の活性化に対する細胞の応答が、例えば、リガンドの受容体との相互作用に親和性の値により、および／もしくはそのような相互作用の持続時間により特徴化され得る、受容体刺激の強度に依存することは当分野において公知である。かくして、ＦＧＦおよび受容体の相互作用の親和性および持続時間の両方は、本発明の化合物により影響を及ぼされ得る。したがって、高親和性リガンドにより誘発される受容体シグナル伝達を調整する能力がある、化合物を提供することは、本発明のもう一つの実施態様である。さらなる実施態様は、１)上で考察された低親和性リガンドにより誘発されるＦＧＦＲ活性化を、本発明の結合部位においてＦＧＦＲ結合に対して当該リガンドと競合させることにより阻害する能力がある、、化合物(複数を含む)、２)上で考察された低親和性リガンドもしくはもう一つの分子により阻害されるＦＧＦＲを活性化する能力があって、当該もう一つの分子が天然ＦＧＦＲ阻害剤もしくは人工的な物質である、化合物(複数を含む)、に関与する。
相互作用の親和性
用語“相互作用”により、化合物が細胞の表面受容体と一過性または永続性の、直接的なもしくは間接的な接触を有することが意味される。
二つの分子間の相互作用は、相互作用の親和性により特徴化され得る。相互作用の親和性は、モル(Ｍ)で表される解離平衡定数、Ｋｄ、の値により一般的に表される。Ｋｄは、受容体分子からのリガンド分子の解離の速度および当該受容体分子への当該リガンド分子の結合の速度との間の比率を反映して、かくしてこれら二つの分子の間の結合の強度の尺度を表わす。結合が強ければ強いほど、Ｋｄの値はさらに低い。
本発明はＦＧＦＲに対して比較的低親和性結合を有する化合物に関する。本発明の低親和性相互作用は、例えば１０−３〜１０−７Ｍのような、例えば１０−３〜１０−６Ｍのような、例えば１０−３〜１０−５Ｍのような、１０−３〜１０−８Ｍの範囲の値、または約１０−４Ｍもしくは約１０−５Ｍを有するＫｄにより特徴づけされる。
受容体の生物学的機能の調節
細胞の表面受容体がリガンド結合における細胞過程を誘発するおよび／もしくは保持する能力は、本明細書では受容体の“生物学的機能”と称される。
本発明は、受容体シグナル伝達を調整することにより、ＦＧＦＲの生物学的機能を調整する能力がある化合物を特徴とする。“受容体シグナル伝達を調整すること”により、細胞外刺激による受容体の活性化に応答して細胞の中で通常起こる、メッセンジャー分子のカスケードの生産の活性化もしくは阻害が意味される。
受容体シグナル伝達の活性化もしくは阻害は、当該受容体を発現する細胞の生理学的応答により通常反映される。それ故に、受容体シグナル伝達を調整することにより、細胞応答を調整することが可能である。
本発明は好ましくは、ＦＧＦＲ１が関連するシグナル伝達の活性化もしくは阻害に関与して、それは、ｉ)ＦＧＦＲ１のチロシンリン酸化の程度；ii)例えば、ＳＴＡＴ１，ＪＮＫ，ＰＬＣｙ，ＥＲＫ，ＳＴＡＴ５，ＰＩ３Ｋ，ＰＫＣ，ＦＲＳ２および／もしくはＧＲＢ２タンパク質のような、ＦＧＦＲ１が関連するシグナル伝達経路のいずれかに関与する一つもしくはそれ以上の細胞内タンパク質の活性化状態；ならびに／またはiii)細胞応答における変化により例えば反映され得る。
ＦＧＦＲ依存性細胞応答に関与するときには、本発明は、細胞分化もしくは脱分化、アポトーシスもしくは細胞生存、細胞運動性の誘発／阻害から選ばれるが、それに限定されるものではない、細胞の応答に関する。
医薬品
細胞死は、発生しているニューロンの５０％がプログラムされた細胞死を通じて除外される、正常なニューロンの発生において、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性状態の病態生理学において、重要な役割を演じている。ＦＧＦＲおよびそれらのリガンドは発症の間でおよび成人期間の間での両方でニューロンの生存の重要な決定因子であることが示されてきている(Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell tissue Res, 313:139-57)。それ故に、ＦＧＦＲに結合することおよび活性化することによりニューロン細胞の生存を促進する能力がある化合物が、高度に望ましい。かくして、一つの態様では、本発明は、神経細胞の生存を促進して、神経細胞死を伴う状態の処置のための医薬品として用いられ得る化合物を特徴化する。しかしながら、ＦＧＦＲシグナル伝達が筋肉およびがん細胞の両方のための生存因子であると示されてきているので(Ozen et al. (2001) J Nat Cancer Inst. 93:1783-90; Miyamoto et al. (1998) J Cell Physiol. 177:58-67; Detilliux et al. (2003) Cardiovasc Res. 57:8-19)、本発明の化合物は、もう一つの型の細胞、例えば、異なる型の筋肉細胞、の生存の促進のための、もしくは、それに代えて、さらにもう一つの型の細胞、例えば、がん細胞の細胞死の促進のための医薬品としてまた使用され得る。
細胞の表面受容体の活性は、健康な生物では厳密に調節されている。受容体もしくは受容体のリガンドの変異、異常発現またはプロセシングは、受容体の活性での異常に至って、それ故に受容体の機能障害に至る。受容体の機能障害は次に、種々の細胞過程の誘発および／もしくは維持に受容体を使用する細胞の機能障害の原因である。後者が疾患の発現である。ＦＧＦＲシグナル伝達の減弱が多数の異なる病態、例えば糖尿病、の発症に至ることがまた知られてきている(Hart et al., Nature 2000, 408:864-8)。ＦＧＦ受容体の活性化は正常な、ならびに病的な血管新生に関与している(Slavin, Cell Biol Int 1995, 19:431-44)。それは、骨格筋、心筋細胞およびニューロンの発生、増殖、機能化および生存にとって重要である(Merle at al., J Biol Chem 1995, 270:17361-7; Cheng and Mattson, Neuron 1991, 7:1031-41; Zhu et al., Mech Ageing Dev 1999, 108:77-85)。それは正常な腎臓の構造の維持に役割を果たしており(Cancilla et al., Kidney Int 2001, 60:147-55)、そして創傷治癒およびがん疾患に関係している(Powers et al., Endocr Relat Cancer. 2000, 7:165-97)。
本発明は、ＦＧＦＲ類の活性の調整に能力がある化合物を提供する。その結果、当該化合物は、ＦＧＦＲ類の活性の調整が治療のための必須な条件と考えられ得る、疾患の処置のための医薬としての発明に関係する。
かくして、本発明の医薬品は一つの態様では、
１)中枢のおよび末梢の神経系の、または筋肉のもしくは種々の器官の、疾患ならびに状態、ならびに／または
２)術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、のような、中枢のおよび末梢の神経系の疾患または状態、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害；
３)臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置のために；または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患もしくは状態の処置のために、ならびに／または
４)がん疾患、ならびに／または
５)プリオン病
の予防ならびに／または処置のためである。
本発明は、新血管新生を必要とするすべての型の固形腫瘍であるがんに関与する。
本発明は、スクレーピー、クロイツフェルトヤコブ病からなる群より選択されるプリオン病に関与する。ＦＧＦＲ類はプリオン病において明確な役割を果たすことが示されてきている(Castelnau et al. (1994) Exp Neurobiol. 130:407-10; Ye and Carp (2002) J Mol Neurosci. 18:179-88)。
もう一つの実施態様では、本発明の化合物は、
１)創傷治癒の促進、および／または
２)急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞の細胞死の予防、ならびに／または
３)血管再生
のための医薬品の製造のためである。
ＦＧＦＲ類およびそれらのリガンドは中枢神経において重要な役割を果たしていて、特にそれらは、記憶および学習に関係する過程に関与している(Reuss and von Bohlen und Halbach (2003) Cell Tissue Res. 313:139-57)。かくして、さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は学習する能力ならびに／または短期のおよび／もしくは長期の記憶の刺激のためである。この実施態様は本発明の好ましい実施態様の一つである。
さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は、
１)虚血による細胞死の予防；
２)アルコール摂取による身体損傷の予防；
のための医薬品の製造のためである。
なおさらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物は、正常な、変性したもしくは損傷した細胞の処置のための医薬品の製造のためであって、それらは、
―神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１３５９１、Ｐ１３５９５−０１、Ｐ１３５９５)、
―神経細胞接着分子Ｌ１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＱ７、Ｑ９ＱＹ３８、Ｐ１１６２７、Ｑ０５６９５、Ｐ３２００４)、
―神経細胞接着分子−２(ＮＣＡＭ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３６３５５)、
―神経−グリア細胞接着分子(Ｎｇ−ＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０３６９６；Ｑ９０９３３)、
―神経細胞接着分子ＣＡＬＬ(Swiss-Prot受託番号：Ｏ００５３３)、
―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９１７６７、Ｐ２０２４１)、
―Ｎｒ−ＣＡＭ(ＨＢＲＡＶＯ、ＮＲＣＡＭ、ＮＲ−ＣＡＭ１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８２３、Ｏ１５１７９、Ｑ９ＱＶＮ３)、
―アクソニン−１／ＴＡＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０２２４６、Ｐ２２０６３、Ｐ２８６８５)、
―軸索に関連する細胞接着分子(ＡｘＣＡＭ)(NCBI Ass. 番号：ＮＰ＿０３１５４４.１；Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＣ３５)、
―ミエリンに関連する糖タンパク質(ＭＡＧ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２０９１７)、
―神経細胞接着分子ＢＩＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２６８２)、
―神経細胞接着分子ＢＩＧ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２８４５)、
―ファシクリン(ＦＡＳ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２２６４８)、
―神経細胞接着分子ＨＮＢ−３／ＮＢ−３(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＱ５２、Ｐ９７５２８、Ｑ９ＪＭＢ８)、
―神経細胞接着分子ＨＮＢ−２／ＮＢ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９４７７９、Ｐ０７４０９、Ｐ９７５２７)、
―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＶＷ７１)、
―接合部接着分子−１(ＪＡＭ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＫＤ５、Ｏ８８７９２)、
―神経細胞接着Ｆ３／Ｆ１１(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３１９８、Ｐ１２６０、Ｑ１２８６０、Ｑ２８１０６、Ｐ１４７８１、Ｏ９３２５０)、
―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９０９２４、Ｑ９１Ｚ６０；Ｏ４２４１４)、
―Ｂ−リンパ球細胞接着分子ＣＤ２２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｒ０９４、Ｐ２０２７３)、
―ネオゲニン(ＮＥＯ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８５９、Ｐ９７６０３、Ｑ９０６１０、Ｐ９７７９８)、
―細胞内細胞接着分子−５(ＩＣＡＭ−５／テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＡＭ９、Ｑ６０６２５)もしくは
―ガラクトース結合レクチン−１２(ガレクチン−１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＶＤ１、Ｑ９ＪＫＸ２、Ｑ９ＮＺ０３)、
―ガラクトース結合レクチン−４(ガレクチン−４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｋ４１９；Ｐ３８５５２)、
―繊維芽細胞成長因子受容体１(ＦＧＦＲ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＺＭ７、Ｑ９９ＡＶＶ７、Ｑ９ＵＤ５０、Ｑ６３８２７)、
―繊維芽細胞成長因子受容体２(ＦＧＦＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＫＭ２、Ｐ２１８０２、Ｑ６３２４１)、
―繊維芽細胞成長因子受容体３(ＦＧＦＲ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５Ｍ１３、ＡＦ４８７５５４、Ｑ９９０５２)、
―繊維芽細胞成長因子受容体４(ＦＧＦＲ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１７４２)、
―２型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(ＮＴＲＫＴ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸＪ５)、
―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (ＬＡＲ−ＰＴＰＲＦ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＥＱ１７、Ｑ６４６０５、Ｑ６４６０４、Ｑ９ＱＷ６７、Ｑ９VIＳ８、Ｐ１０５８６)、
―ネフリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２５Ｓ５、Ｑ９ＪＩＸ２、Ｑ９ＥＴ５９、Ｑ９Ｒ０４４、Ｑ９ＱＺＳ７、Ｑ０６５００)、
―タンパク質−Ｓ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＳ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６４６９９、Ｑ１３３３２、Ｏ７５８７０)、
―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(Ｒ−ＰＴＰ−カッパ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５２６２)、
―タンパク質−Ｄ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＤ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸ６５、Ｑ９ＩＡＪ１、Ｐ２３４６８、Ｑ６４４８７)、
―Ａ型エフリン受容体８(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＥＫ)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ０９１２７、Ｐ２９３２２)、
―Ａ型エフリン受容体３(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＴＫ−１／ＣＥＫ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２９３１８)、
―Ａ型エフリン受容体２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｎ３Ｚ２)、
―インスリン受容体(ＩＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＰＷＮ６)、
―インスリン様受容体成長因子−１受容体(ＩＧＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＶＷ４、Ｐ０８０６９、Ｐ２４０６２、Ｑ６０７５１、Ｐ１５１２７、Ｐ１５２０８)、
―インスリン関連受容体(ＩＲＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１４６１６)、
―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ−１(Swiss-Prot受託番号：０６８０５、Ｐ３５５９０、Ｑ０６８０６)、
―ラウンドアバウト受容体−１(ｒｏｂｏ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４４９２４、ＡＦ０４１０８２、Ｑ９Ｙ６Ｎ７)、
―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ３サブユニット(ＣＨＲＮＡ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＶＨＨ６、Ｐ０４７５７、Ｑ８Ｒ４Ｇ９、Ｐ３２２９７)、
―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ６サブユニット(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５８２５、Ｑ９Ｒ０Ｗ９)、
―血小版由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲＢ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ４０６、Ｑ０５０３０)、
―インターロイキン−６受容体(ＩＬ−６Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ００５６０)、
―インターロイキン−２３受容体(ＩＬ−２３Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ４６１４２２)、
―ＩＬ−３、ＩＬ５およびＧｍＣｓｆのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３２９２７)、
―サイトカイン受容体様分子３(ＣＲＬＦ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＭ５８)、
―クラスＩサイトカイン受容体(ＺＣＹＴＯＲ５)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＨＨ５)、
―ネトリン−１受容体ＤＣＣ(Swiss-Prot受託番号：Ｐ４３１４６)、
―白血球Ｆｃ受容体様タンパク質(ＩＦＧＰ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＰＪ６、Ｑ９６ＫＭ２)、
―マクロファージ捕捉剤受容体２(ＭＳＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＹＫ７)、もしくは
―顆粒球コロニー刺激因子受容体(Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９９０６２)、
パーレカン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９８１６０)
―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０５９１０)、
―ＡＤＡＭ−１９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ０１３、Ｏ３５６７４)、
―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｐ７８３２５)、
―ＡＤＡＭ−１２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４３１８４、Ｑ６１８２４)、
―ＡＤＡＭ−２８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＬＮ６、Ｑ６１８２４、Ｑ９ＸＳＬ６、Ｑ９ＵＫＱ２)、
―ＡＤＡＭ−３３前駆体(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３、Ｑ９２３Ｗ９)、
―ＡＤＡＭ−９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１３４３３、Ｑ６１０７２)、
―ＡＤＡＭ−７(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｏ３５２２７、Ｑ６３１８０)、
―ＡＤＡＭ−１Ａフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３)、
―ＡＤＡＭ−１５(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＶ０、Ｏ８８８３９、Ｑ１３４４４)、
―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(ＴＥＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ１６３２９１)、
―金属プロテイナーゼ１(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９５２０４、Ｑ９ＢＳＩ６)、
―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３８７０)、
―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５ＫＶ４、Ｑ９５ＫＶ５、Ｐ０７５８９、Ｑ２８３７７、Ｕ４２５９４、Ｏ９５６０９、Ｐ１１２７６)、もしくは
―テネイシン−Ｒ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５５６８、Ｏ００５３１、Ｑ９０９９５、Ｐ１００３９)、
サイトカイン様因子−１(ＣＬＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ７５４６２)、
またはそのフラグメント、もしくは変異体
からなる群より選択される一つまたはそれ以上を通常インビボで発現する。
特に、本発明は正常な、変性した、もしくは損傷したＮＣＡＭを提示する細胞に関与する。
本発明の医薬品は、上で規定されるように一つもしくはそれ以上の化合物、または一つもしくはそれ以上の化合物および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物、の有効量を含む。
かくして、本発明はもう一つの態様においてまた、本発明の少なくとも一つの化合物を含む医薬組成物に関与する。
本発明のさらなる態様は、本発明の一つもしくはそれ以上の化合物または本発明にしたがう医薬組成物の有効量を、一つもしくはそれ以上の薬学的に許容される添加剤または担体と混合することを含む、医薬組成物を製造する方法である。一つの実施態様では、化合物は、用具が補綴神経ガイドである、補綴用具との併用で用いられる。かくして、さらなる態様においては、本発明は、それが上で規定されるように一つもしくはそれ以上の化合物または医薬組成物を含むことを特徴とする、補綴神経ガイドに関する。神経ガイドは本分野において既知である。
本発明は、下で言及される疾患および状態のいずれかの処置もしくは予防のための本発明の化合物を含む医薬品ならびに／または医薬組成物の使用に関する。
そのような医薬品および／もしくは医薬組成物は、経口的な、経皮的な、筋肉内の、静脈内の、頭蓋内の、くも膜下腔内の、側脳室内の、鼻腔内のもしくは肺的な投与のために適当に処方され得る。
本発明の化合物に基づく医薬品および組成物の処方開発における戦略は一般的に、任意の他のタンパク質を基盤とする医薬製品のための処方戦略に相当する。潜在的な問題およびそれらの問題を克服するために必要とされる指針は、幾つかの教科書、例えば、“Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems”, Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995、で扱われている。
注射剤は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前での液体の中での溶液にもしくは懸濁液に適する固体形の、いずれかとして通常調製される。製剤はまた乳化され得る。活性成分は、活性成分と薬学的に許容されて、適合する添加物としばしば混合される。適当な添加物は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびそれらの組合せである。加えて、望まれるならば、製剤は湿潤化剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような、または製剤の有効性もしくは輸送を増強させる、補助的物質の少量を含有し得る。
本発明の化合物の製剤を、当業者には公知の技法により調製することができる。製剤は、マイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子等を含む薬学的に許容される担体および添加物を含有し得る。
製剤は、活性成分が効果を発揮すべきである、部位において任意に、注射により適当に投与され得る。他の投与モードに適するさらに別の製剤としては、坐剤、点鼻の、肺的なおよび、或る場合には、経口的な製剤が含まれる。坐剤については、伝統的な結合剤および担体としては、ポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドが含まれる。そのような坐剤は、活性成分(複数を含む)を０.５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。経口的製剤は、例えば、製剤的な等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常に使用される添加物を含む。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤もしくは粉末剤の形を取って、一般的には活性成分(複数を含む)の１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％を含有する。
他の製剤は、点鼻のおよび経肺的な投与に適するそのようなもの、例えば、吸入剤およびエアロゾルである。
活性化合物は中性のもしくは塩の形として処方され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩(ペプチド化合物の遊離アミノ酸で形成される)が含まれ、そして例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄水酸化物の様な無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基からまた誘導され得る。
製剤は、投与剤型に適合する様式で、および治療的に有効であろうような量で、投与される。投与されるべき量は、例えば、対象の体重および年齢、処置されるべき疾患および疾患の段階を含んで、処置されるべき対象に依存する。適当な投与量範囲は、キログラム体重当り約０.１μｇ〜５０００μｇの好ましい範囲であって、通常キログラム体重当り投与当たり数百μｇの桁の活性成分である。化合物の単量体形を用いると、適当な投与量は、キログラム体重当り約０.１μｇ〜３０００μｇの範囲でのような、特にキログラム体重当り約０.１μｇ〜１０００μｇの範囲でのような、キログラム体重当り０.１μｇから５０００μｇまでの範囲にしばしばある。化合物の多回投与形を用いると、適当な投与量は、キログラム体重当り約０.１μｇ〜７５０μｇの範囲でのような、特に、キログラム体重当り約０.１μｇ〜２５０μｇの範囲でのような、キログラム体重当り約０.１μｇ〜５００μｇの範囲でのように、キログラム体重当り０.１μｇ〜１０００μｇの範囲にしばしばある。特に、点鼻的に投与するときは、他の経路により投与するときよりも、さらに少ない投与量が用いられる。投与は一度で実施され得るか、もしくは後続の投与に引き継がれ得る。投与量は投与経路にまた依存するであろうし、そして処置されるべき対象の年齢および体重で変動するであろう。多量体形の好ましい投与量は、７０ｋｇ体重当り１ｍｇ〜７０ｍｇの間隔にあるであろう。
或る適応症に対しては、局所化されたかもしくは実質的に局所化された適用が好ましい。他の適応症に対しては、鼻腔内適用が好ましい。
本発明の化合物の幾つかは十分に活性であるが、他の幾つかに対しては、もし製剤が薬学的に許容される添加剤および／もしくは担体をさらに含むならば、作用が増強されるであろう。そのような添加剤および担体は、本分野において公知であろう。或る場合には、活性物質のその標的への送達を促進する、化合物を含むことは有利であろう。
多くの例では、製剤を多数回に投与することが必要になるであろう。投与は、心室内注入のような、連続的注入、もしくは一日につき、毎日、より多数回に、一週間につき、毎週、多数回に、等のようなさらに多い投与量での投与であり得る。細胞死に導き得る因子(複数を含む)に個人が供されてしまう以前もしくは直後に、医薬品の投与を開始することが好ましい。好ましくは、因子発症から５時間以内のような、因子発症から８時間以内に、医薬品を投与する。化合物の多くは、それにより化合物の投与が１週間もしくは２週間のような、長い間隔で実施され得る、長期効果を呈示する。
神経ガイドの中での使用に関連して、投与は、活性化合物(複数を含む)の徐放性に基づき連続的でもしくは小分量であり得る。さらに、放出の速度および／もしくは放出の部位を制御するために、前駆体を用い得る。他の種類のインプラントならびに経口投与は、徐放性および／もしくは前駆体の使用に同様に基づき得る。
処置
本発明にしたがう化合物／組成物の使用による処置は、一つの実施態様において、分化を誘発すること、増殖を調整すること、再生、ニューロンの可塑性、および細胞、例えばインプラントされたもしくは移植された細胞の生存を刺激するために有用である。長期作用を有する化合物を使用するときに、これは特に有用である。
さらなる実施態様において、処置は、外傷および損傷、急性疾患、慢性疾患ならびに／または障害、特に通常では細胞死に至る変性疾患、Ｘ線および化学療法のような、フリーラジカルを生成引き起こすかさもなければ細胞毒性作用を有する内科的および／もしくは外科的処置ならびに／または診断法のような、他の外的要因、のような種々の要因による死亡の危険にある細胞の生存の刺激のためであり得る。化学療法との関連において、本発明にしたがうＦＧＦＲ結合化合物はがんの処置に有用である。
かくして、処置は、術後神経損傷、例えば脊髄損傷に起因する、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病に関連する神経変性、神経筋変性、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、もしくはハンチントン病のような、中枢のおよび末梢の神経系の疾患または状態に関連する細胞死の処置ならびに／または予防を含む。
また、遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような、神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態に関連して；または生殖腺の、I型およびII型糖尿病のような、膵臓の、腎症のような、腎臓の、変性異常のような、種々の器官の疾患または状態の処置のために、本発明にしたがう化合物は、分化を誘発すること、増殖を調整すること、再生、ニューロンの可塑性および生存を刺激すること、即ち生存を刺激することのために使用され得る。
さらに、化合物および／もしくは医薬組成物は、血管新生を誘発するために、急性心筋梗塞後のような、心筋細胞の細胞死を予防するためにあり得る。さらに、一つの実施態様では、化合物および／もしくは医薬組成物は、急性心筋梗塞後の生存のような、心筋細胞の生存の刺激のためである。もう一つの態様では、化合物および／もしくは医薬組成物は、傷害後のような、血管再生用のためである。
化合物および／もしくは医薬組成物の創傷治癒の促進のための使用は、また本発明の範囲内である。本化合物は血管新生を刺激する能力があって、それによりそれらは創傷治癒過程を促進することができる。
本発明はさらに、がんの処置における化合物および／もしくは医薬組成物の使用を開示する。ＦＧＦＲの活性化の調節は、腫瘍の血管新生、増殖および拡散に重要である。
なおさらなる実施態様では、ＦＧＦＲ活性が神経細胞の分化にために重要であるので、化合物および／もしくは医薬組成物の使用は学習する能力ならびに／または短期のおよび／もしくは長期の記憶の刺激のためである。
さらにもう一つの実施態様では、本発明の化合物および／もしくは医薬組成物は、アルコール摂取による身体損傷の処置のためにある。胎児の発生奇形、長期の神経行動学的変化、アルコール性肝疾患が特に関係している。
化合物および／もしくは医薬組成物を使用することを含むプリオン病の治療的処置は、本発明のさらにもう一つの実施態様である。
特に、本発明の化合物および／もしくは医薬組成物は、悪性新生物、良性新生物、上皮内がんおよび不特定行動の新生物のような新生物、糖尿病のような、内分泌腺の疾患、老人性のおよび初老性の器質性精神異常状態、アルコール性精神病、薬物性精神病、一過性の器官性精神異常状態、アルツハイマー病のような精神病、脳類脂質沈着症、癲癇、進行麻痺(梅毒)、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、ヤコブ−クロイツフェルト病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合失調性障害、情動障害、神経症性障害、性格神経症を含む人格障害、器官性脳症候群に関連する非精神性人格障害、妄想性人格障害、狂信性人格、偏執性人格(障害)、偏執的素質、性的倒錯および障害、精神発達遅滞、神経系および感覚器官の疾患、認知異常、髄膜炎、全脳炎のような中枢神経系の炎症性疾患、アルツハイマー病、ピック病、老人性脳変性のような脳変性、交通性水頭症、閉塞性水頭症、他の錐体外路系疾患および異常運動障害を含むパーキンソン病、脊髄小脳疾患、小脳性運動失調症、マリー運動失調、サンガー−ブラウン運動失調、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、脊髄性筋萎縮症、家族性の、若年性の、成人性の脊髄性筋萎縮症のような原発性小脳変性症、運動神経疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性球麻痺、仮性球麻痺、原発性側索硬化症、他の前角細胞性疾患、前角細胞性疾患、脊髄の非特異的な、他の疾患、脊髄空洞症および延髄空洞症、血管性脊髄症、急性脊髄梗塞(閉塞性)(非閉塞性)、脊髄の動脈血栓症、脊髄の浮腫、亜急性の壊死性ミエロパシー、その他に分類される疾患における脊髄の亜急性の複合変性、ミエロパシー、薬剤誘発性、放射線誘発性脊髄炎、自律神経系の障害、末梢性自律神経の、交感の、副交感の、もしくは植物の系の障害、家族性自律神経失調症[ライリー−デイ症候群]、
特発性末梢自律神経ニューロパシー、頚動脈洞性失神または症候群、頸部交感神経性ジストロフィーまたは麻痺、その他に分類される障害における末梢性自律神経ニューロパシー、アミロイドーシス、末梢神経系疾患、上腕神経叢の病変、頚肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、新生児においてを含む、腕神経叢炎もしくは上肢神経根炎、急性感染性多発神経炎を含む炎症性および中毒性ニューロパシー、ギラン−バレー症候群、感染後多発性神経炎、膠原血管病における多発神経炎、眼の多重構造に影響を及ぼす疾患、化膿性内眼球炎、耳および乳様突起の疾患、慢性リウマチ性心疾患、虚血性心疾患、不整脈、肺系での疾患、神経系の中を含む、新生児における器官および軟組織の異常、陣痛および出産時における麻酔薬または他の鎮静剤投与の合併症、感染症を含む皮膚疾患、循環不全問題、術後傷害を含む、傷害、挫傷、熱傷、神経断裂を含む、神経および脊髄の傷害、関節の病変(開放創の有無で)、外傷性神経腫(開放創の有無で)、外傷性の一次的麻痺(開放創の有無で)、施療の間の不慮の刺傷または裂傷、視神経および視覚経路への傷害、視神経傷害、第２脳神経、視交叉への傷害、視覚経路への傷害、視皮質への傷害、不特定の盲目、他の脳神経への傷害、他のおよび不特定の神経への傷害、薬物、医薬のおよび生物の物質による中毒、遺伝性のもしくは外傷性の筋萎縮性障害のような臨床的状態の処置に；または生殖腺の、Ｉ型およびII型糖尿病のような、膵臓の、腎症のような、腎臓の変性状態、スクレイピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカ(ＧＳＳ)病のような種々の器官の疾患もしくは状態の処置に使用され得る。
本発明にしたがって、上の状態および症状の処置および／もしくは防止は、必要とする個人に化合物および／もしくは医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。
実施例１：本発明のＦＧＬペプチド(配列番号１)および他のペプチドの異なる製剤の製造
ＦＧＬの個別なペプチド鎖の固相合成
例えば、ＥＦＬペプチドのような、本発明のＦＧＬおよび他のペプチド配列の個別なペプチド鎖は、上で記述されるように標準的なＦｍｏｃの固相方法により合成される。実験に用いられるペプチドの合成は、TentaGel S RAM樹脂(９０ｍｇ、０.２２ｍｍｏｌ／ｍｇ)の上で実施される。樹脂をろ過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器の中に入れた。樹脂をＤＭＦの中で膨潤させて、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理して、樹脂上での非保護アミノ基の存在を確保した。その後に、樹脂を液抜きして、黄色が液抜きされたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの付加の後に何も検出できなくなるまで、ＤＭＦで洗浄した。一度に一つずつＦｍｏｃ−基の除去を交互にして、アミノ酸をカップリングした。成長する樹脂に結合されたペプチド鎖にカップリングする前に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を、ＤＭＦ中でＴＢＴＵ／ＨＯＢＴにより予め活性化した。Ｆｍｏｃ−基の除去のためには、ＤＭＦ中のピペリジン溶液を用いた。
ＦＧＬダイマーのＬＰＡ製造
本出願のＦＧＬのＬＰＡ−型ダイマー(ＦＧＬＬ)は、ＷＯ ００／１８７９１で記述されるようにＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いて、Ｂｏｃ−イミノジ酢酸を樹脂の上でペプチドにカップリングすることにより作成された。副反応を減らすために、多数回カップリングを、限定成分としてＢｏｃ−イミノジ酢酸で実施した。ペプチドを樹脂から切断して、スカベンジャーとしてのＴＥＳおよび水の存在下でＴＦＡの中にて側鎖上で同時に脱保護して、ペプチドアミドを与えた。ＴＦＡの量を蒸発により減少して、ペプチドを沈殿させた。ＦＧＬＬの最終精製を逆相ＨＰＬＣにより為した。ＨＰＬＣの条件は、以下のとおりであった：
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＭＱ、5μｍ、４.６×２５０ｍｍ、２００Ａ
流量：１.０ｍｌ／分
移動層：Ａ：０.１２％ＴＦＡ、９５％Ｈ２Ｏ、５％ＡＣＮ
Ｂ：０.１％ＴＦＡ、９５％ＡＣＮ、５％Ｈ２Ｏ
グラジエント：２０分で１５％Ｂから３５％Ｂへ
１分で３５％Ｂから９５％Ｂへそして５分間保持、
検出：ダイオードアレー検出器１９０〜４００ｎｍ
波長：２２０ｎｍ
注入量：２０μｌ
ＦＧＬＬの濃度： ０.５ｍｇ／ｍｌ
ＨＰＬＣ精製されたＦＧＬＬを凍結乾燥により単離した。ＦＧＬＬ合成のフローチャートを、図１に示す。図２はＦＧＬＬの最終精製のＨＰＬＣ溶出プロフィールを描く。
略語
アミノ酸についての略語は、IUPAC-IUB Joint Commision on Bio-Chemical Nomemclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37の推奨基準にしたがっている。
他の略語
ＡｃＯＨ 酢酸
ＴＢＴＵ Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウム四フッ化ホウ素酸塩
ｉｄａ Ｂｏｃイミノジ酢酸
ＭＴＢＥ ｔ−ブチルメチルエーテル
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＥｔＯＨ エタノール、９９.９％
ＤＩＰＥＡ Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＥＳ トリエチルシラン
Ｂｏｃ Ｎ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
Ｒ アミド−ＴＧ−樹脂
ＡＡ アミノ酸
ＦＧＬＬの物理化学的性質
ＦＧＬＬは構造式：
Figure 2007526898
 を有する。
それは、それらのＮ−末端上でリンカー基、アミド酢酸(Ｎ−(カルボキシメチル)グリシン)、により共−接合される１５個のアミノ酸残基の二つの同一のペプチド配列から成る。ＦＧＬＬの分子量は、３３９４.８ダルトンである。濃縮された水溶液(０.５ｍｇ／ｍｌよりさらに高い)の中でのペプチド化合物の非共有結合性の会合は、酢酸の添加により防止される。
ＦＧＬｃｙｓおよびＦＧＬｌｙｓダイマーの合成
それぞれがＳ−Ｓ結合を通して結合されるＮ−末端においてさらに別のシステイン残基を含有する、二つの個別なＦＬＧ配列から成るＦＧＬｃｙｓダイマーを、Goodwin et al. (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2231-2234の中で記述される固相合成を用いて合成した。
それらのＣ−末端を通してリジンにカップリングされる二つの個別なＦＧＬ単量体配列として構築される、ＦＧＬｌｙｓダイマーを、Rajagopalan et al. (1995) Int J Pept Protein Res.45:173-179の中で記述される固相合成を用いて作成した。
ＦＧＬの樹状体テトラマー(ＦＧＬｄ)の合成
ＦＧＬのＭＡＰ−型樹状体、ＦＧＬｄ、を、例えばＰＣＴ／ＵＳ９０／０２０３９の中で記述されるように標準的な方法にしたがって合成した。
図３はＦＧＬＤの最終精製のＨＰＬＣプロフィールを立証する。斜線をひいた区域は合成された生成物の不均質性のレベルを指し示す。
実施例２：インビトロにおけるニューロンの生存へのＦＧＬの種々の製剤の作用
ＦＧＬペプチドの種々の製剤を当分野で周知の生存アッセイにおける生物活性について比較して、以下に詳細に記述した。
ドーパミン作動性ニューロン(ＤＮ)
ドーパミン作動性ニューロンを、胎日数１５日目のウイスターラットの胚から調製した(Charles River, Sulzfeld, Germany or Mollegaard, Denmark)。妊娠ラットを屠殺して子宮を取り出して、ハンクの平衡塩類溶液(ＨＢＳＳ；Gibco, BRL)の中で氷上で保存した。胚の脳から中脳の腹側部を切り出し、グルコース５ｇ／lで補足されたゲイの平衡塩類溶液(ＧＢＳＳ；Gibco, BRL)(Sigma-Aldricｈ)の中で氷上でホモジナイズして、その後でトリプシン化した。解離した細胞をＤＮア−ゼ１およびダイズトリプシン阻害剤(Sigma-Aldricｈ)の存在下に洗浄した。
生存アッセイのために、単離されたニューロンを細胞１５０,０００個／ｃｍ２の密度で上で記述されるようにポリＤ-リジンで被膜された２４−穴の細胞培養プレートの中に接種した。種々の濃度のＦＧＬペプチドの有無でニューロンを６日間分化させた後で、６−ＯＨＤＡを１００μＭの濃度で２時間添加した。原液を、酸化を防止するために０.１%(Ｗ／ｖ)のメタ重亜硫酸ナトリウムの中で６−ＯＨＤＡを１０ｍＭの濃度に溶解させることにより調製した。６−ＯＨＤＡとの２時間後に、培地を、補足剤とペプチドと共にNeurobasal培地に交換して、細胞培養物をさらに２４時間インキュベートし、固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。それぞれの個別な実験におけるそれぞれの実験条件について９８個の画像を、下でドーパミン作動性神経突起成長アッセイについて記述するように自動的に記録した。
海馬ニューロン(ＨＮ)
実験のために、解離された海馬ニューロンを胎日数１９日目のウイスターラットもしくは新生仔のラットからRonn et al. (1999) Nat Biotechnol. 17:1000-5により記述されるように、単離した。
略述すると、氷冷した修飾クレブスリンガー液の中で脳から海馬を単離し、血管を除去し、みじん切で粗くホモジナイズして、次いで、トリプシン化した。解離した細胞をＤＮア−ゼ１およびダイズトリプシン阻害剤の存在下に洗浄した。
アッセイのために、ニューロンをNeurobasal培地の中の細胞４０,０００個／ｃｍ２の密度で１０μｇ／ｍｌのポリ-Ｌ-リジンで被膜された８−穴のパーマノックススライドの上に接種した。平板培養の１５分後に、Ａβ２５〜３５を２０μＭの最終濃度になるように添加した。Ａβ２５〜３５を無菌の脱イオン水中に平板培養に先立って３ｍＭの濃度に溶解して、Pigino et al. (2001) J Neurosci. 21:834-42にしたがって３７℃で４日間インキュベートした。この処理はＡβフラグメントの繊維化を誘発して、それにより神経毒性活性を増加させる。ＦＧＬペプチドを含有するNeurobasal培地でニューロンを７０時間インキュベートし、４％(ｖ／ｖ)のフォルムアルデヒドで固定して、Kruman et al. (1997)により記述されるようにHoechst 33258で２５分間染色した。海馬の神経突起生長アッセイについて記述されるように、コンピューター支援蛍光顕微鏡撮影を用いてそれぞれの実験においてそれぞれの群について１０００〜１５００個のニューロンの画像を無作為に記録した。コペンハーゲン大学タンパク質研究所で開発されたソフトウエアパッケージPrimaを用いて死亡のおよび生存のニューロンからの核を計測して、ニューロンの総数に比べて生存するニューロンのフラクションを推定した。
小脳の顆粒ニューロン(ＣＧＮ)
小脳の顆粒ニューロン(ＣＧＮ)を、生後七日目のウイスターラットからDrejer and Schousboe (1989) Neurochem Res. 14:751-4により以前に記述されたように大部分調製した。
実験のためには、氷上に保存された修飾クレブスリンガー液の中で小脳の組織を細断して、海馬ニューロンについて上で記述されるように処理した。全ての細胞培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿した大気中で３７℃でインキュベートした。全ての動物を、動物福祉に関する国のガイドラインにしたがって取り扱った。
ＣＧＮの初代培養物を、２％(ｖ／ｖ)のＢ２７、０.５％(ｖ／ｖ)のGlutamax、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび培地の中の最終濃度を４０ｍＭとなるようにするＫＣｌを補足したNeurobasal-A培地(Gibco, BRL)の中で、細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度でポリ-Ｌ-リジンで被膜された８−穴のパーマノックスのスライドの上に平板培養した。平板培養の２４時間後に、グリア細胞の増殖を回避するためにシトシン-β−Ｄ-アラビノフラノシド(Ａｒａ−Ｃ；Sigma-Aldricｈ)を１０μＭの最終濃度になるように添加して、その後で、ニューロンをさらに６日間３７℃で分化させた。二回洗浄して、１％(ｖ／ｖ)のグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｄ-グルコース３.５ｇ／ｌならびに１％(ｖ／ｖ)のピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)を種々の濃度のペプチドと一緒に補足したEagle基礎培地(ＢＭＥ；Gibco BRL)に培地を交換することにより、アポトーシス細胞死を誘発した。これにより培養液中のカリウムの濃度は５ｍＭ ＫＣｌに低下した。アポトーシスの誘発の２日後に、海馬のニューロンを使用する生存アッセイについて記述されるように、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定して、Hoechst 33258で染色した。
アッセイを、D'Mello et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10989-93により記述されるように実施した。
ＣＧＮの培養物を用いる他の生存アッセイ
1．ＰＡＣＥアッセイ
総ＣＧＮ数に比較してリン酸化されたＥｒｋ１／２およびＡｋｔの検出を、Versteeg et al. (2000) FEBS Lett. 465:69-73にしたがって実施する。
実験のために、ＣＧＮを細胞２９０,０００個／ｃｍ２の密度でポリ-Ｌ-リジンで被膜された９６−穴のマイクロタイタープレートの中で平板培養した。ニューロンを０．５％(ｖ／ｖ)のGlutamax、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補足されたNeurobasal-A培地の中で増殖した。平板培養の２４時間後に、Ａｒａ−Ｃを上で記述されるように、培養液に添加した。インキュベーションの７２時間後に、培地の半分を試験されるペプチドを含有するNeurobasal-A培地で交換した。Ｅｒｋ１／２リン酸化アッセイのために、培養物を０〜９０分間さらにインキュベートし、７０ｇで８分間遠心分離し、４％(ｖ／ｖ)のホルムアルデヒドで固定して、一次ホスホ−ｐ４２〜４４ウサギ抗体およびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体を用いて免疫染色した。リン酸化されたＡｋｔの検出のために、培養物を１０〜３０分間さらにインキュベートし、７０ｇで８分間遠心分離し、４％(ｖ／ｖ)のホルムアルデヒドで固定して、Ｓｅｒ４７３においてリン酸化されたＡｋｔに対するポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて免疫染色した。クリスタルバイオレットでの染色により総ニューロンの数を、両方のリン酸化アッセイにおいて推定した。
２．ＴＵＮＥＬアッセイ
ＣＧＮを、細胞６０,０００個／ｃｍ２の密度でポリ-Ｌ-リジンで被膜された８−穴のパーマノックススライドの上で平板培養した。２％(ｖ／ｖ)のＢ２７、０．５％(ｖ／ｖ)のGlutamax、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび４０ｍＭのＫＣｌ(最終濃度)で補足されたNeurobasal-A培地の中で、培養物を六日間増殖して、上のＣＧＮ生存アッセイについて記述されるように、アポトーシスを誘発した。アポトーシス細胞死の誘発の２４時間後に、培養物を固定して、ApoAlertアポトーシス検出キットを用いて、本質的に製造業者により記述されるように、ＤＮＡのフラグメント化の程度を測定した。略述すれば、二重鎖ＤＮＡ分子の平滑末端をフルオレッセン-ｄＵＴＰで酵素的に標識して、全てのニューロンを、７５０ｎｇ／ｍｌの濃度でのヨウ化プロピディウムで染色した。油浸60倍1.4 NA対物レンズを備えたNikon Eclipse TE200共焦点顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)に結合したBioRad Radianceレーザー走査システム２０００を用いて、それぞれの実験の中のそれぞれの群から少なくとも２００個のニューロンの画像を得た。ＴＵＮＥＬ陽性のニューロンのフラクションを計数により測定した。
結果
ＦＧＬは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの生存を促進する
ＦＧＬは、増殖因子様活性を持つＦＧＦ受容体のアゴニストであるので、ＦＧＬが種々の神経毒性条件下で神経保護物質として作用することができたかどうかを検討した。ドーパミン作動性ニューロンにおける細胞死は、６−ＯＨＤＡの添加により誘発された。図４ａにおいて、生存するドーパミン作動性ニューロンの数が、無処置の対照と比較して、６−ＯＨＤＡへの暴露後で著しく減少していたことが見られ得る。１０ｎｇ／ｍｌのグリア由来の神経栄養因子(ＧＤＮＦ)の添加は、このニューロン損失を部分的に防止した(１００％にセットされた６−ＯＨＤＡで処置された対照に比較して１５０％)。培養物を種々の濃度のＦＧＬｄ存在下で増殖したときには(図４ｂ)、６−ＯＨＤＡで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率は、１μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの濃度でおよそ１３５％の最大救済率でもって、統計的に有意に増加して、この作用は釣鐘状の用量-応答関係を呈示した。
かくして、ＦＧＬｄは、６−ＯＨＤＡを神経毒性化合物として使用する生存モデルにおいて、ＧＤＮＦとおよそ同一の程度にドーパミン作動性ニューロンを救済することができる。
ＦＧＬｄがＡβ２５〜３５により誘発される死から海馬ニューロンを保護することできるかどうかをまた試験した。海馬ニューロンの培養物を、予め凝集させたＡβ２５〜３５と共に種々の濃度のＦＧＬｄと一緒にインキュベートした。図４ｃにおいて、２０μＭのＡβ２５〜３５での海馬の細胞培養物の処理が中〜低度の神経細胞損失を誘発したことが見られ得る。この損失は、脳由来の神経栄養因子(ＢＤＮＦ)５０ｎｇ／ｍｌにより部分的に救済されることができた。図４ｄに示されているように、０.１〜５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度におけるＦＧＬｄでの処理はまた、２０μＭのＡβ２５〜３５により誘発される神経変性から海馬ニューロンを部分的に救済した。ＦＧＬｄで誘発される神経保護は、０.３μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの濃度で既に最大レベルに達して(Ａβ２５〜３５で処理された対照と比較して１１０％)、５０μｇ／ｍｌまでのＦＧＬｄ濃度で多少とも一定のままであった。
かくして、ＦＧＬｄは、Ａβ２５〜３５ペプチドの神経毒性作用に対してＢＤＮＦでの処理により達成されたのと同一の程度に海馬ニューロンを保護することができる。
もしＣＧＮの初代培養物を高レベルのＫＣｌで増殖させて、ＫＣｌ濃度を引き続いて減少させるならば、アポトーシスが誘発されることが以前に示されてきている。ＦＧＬｄの神経保護作用を、４０ｍＭのＫＣｌの中で７日間分化するように誘発されたＣＧＮ培養物において検討した。引き続いて、ＫＣｌ濃度を５ｍＭに減少して、２日後に、細胞生存率を推定した。図４ｅに見られるように、低ＫＣｌ濃度がＣＧＮ培養物において細胞死を誘発して、これをインスリン様増殖因子１(ＩＧＦ−１)での処理により救済することができた。図４ｆに示されるように、細胞死をＦＧＬｄでの処理によって部分的にまた防止することができた。低ＫＣｌ濃度で増殖された対照と比較して１３５％の最大神経保護が、１〜１０μｇ／ｍｌの間のペプチド濃度で見られた。
かくして、結果は、ＦＧＬがインビトロでドーパミン作動性の、海馬のおよび小脳顆粒のニューロンの生存を促進する能力があることを指し示している。
ＦＧＬはアポトーシスに対して小脳顆粒のニューロンを保護する
ＦＧＬｄの神経保護作用の機構をさらに特徴づけするために、ＫＣｌ欠乏のＣＧＮにおけるＤＮＡのフラグメント化(通常アポトーシスに関連する)の程度を測定した(Eldadah et al., (2000) J Neurosci. 20:179-86に記述されるように)。高ＫＣｌの培地の中に維持されたＣＧＮは、フラグメント化したＤＮＡを持つ非常に少ないニューロンを表示した。低ＫＣｌ濃度で処理された細胞の大部分はＤＮＡのフラグメント化を表示した。１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度においてＦＧＬｄで処理されたＣＧＮ培養物の中には、ごく僅かなニューロンがＫＣｌ欠乏に際してフラグメント化ＤＮＡを表示した。対照的に、対照ペプチド、ＦＧＬ９、二重のアラニン置換を持つ、１０diAladは、神経保護作用を何も呈示しなかった。ＦＧＬｄの神経保護作用を引き続いて定量化して、ＫＣｌ欠乏が、高ＫＣｌ培地の中に維持されたＣＧＮと比較して、フラグメント化ＤＮＡを含有するＣＧＮ数の明らかな増加をもたらしたことを図５に見ることができる。対照ペプチド、ＦＧＬ９、１０diAladでの処理は、ＣＧＮをアポトーシスから救済しなかった。種々の濃度におけるＦＧＬｄの添加は、アポトーシスＣＧＮの数を、１０〜１５μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの濃度において４０％の最大救済率で減少した。
ＦＧＬで誘発されるシグナル伝達はＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化をもたらす
ＦＧＬペプチドは、ＦＧＦＲに結合し活性化させると示されてきている。ＦＧＦＲにより開始されるシグナル伝達経路は、他の中で、ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の活性化に反映されるように、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路、およびセリン／スレオニンタンパク質キナーゼＡｋｔを活性化するＰＩ３Ｋ経路を含む。両方の経路は神経分化および生存に関与していると知られている。それ故に、ＦＧＬの神経突起成長のおよび生存の促進作用はＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の活性化に依存し得る。それ故に、ＦＧＬペプチドでのＣＧＮ培養物の処理に応答してＥｒｋ１／２およびＡｋｔがリン酸化されたかどうかを検討した。図８から、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を誘発できなかった、５μｇ／ｍｌの濃度と対照的に、１０μｇ／ｍｌの濃度におけるペプチドがＥｒｋ１／２の持続的リン酸化を誘発したように見える。この活性化(対照培養物と比較して、１１５〜１２０％)は、ＦＧＬｄでの刺激の１０分後に見られて、少なくとも９０分間持続された。
ＦＧＬによるＡｋｔのリン酸化を、ＣＧＮ培養物のペプチドへの１０もしくは３０分間の曝露の後で分析した(図７)。０.５μｇ／ｍｌ以上の濃度における１０分間の曝露期間は、無処理の対照と比較して、Ａｋｔのリン酸化の有意な増加に至った。リン酸化レベルは１μｇ／ｍｌのペプチド濃度で最高に達して、２０μｇ／ｍｌまで増加する投与量で比較的一定に留まっていた。３０分の曝露時間では、Ａｋｔのリン酸化は何も検出されず、Ｅｒｋ１／２のリン酸化応答とは対照的に、Ａｋｔの活性化は一過性であって、３０分以内に終了することを指し示していた。
かくして、結果は、ＦＧＬがＭＡＰＫ経路の持続性(少なくとも９０分間)活性化およびＡｋｔの一過性(１０分間)活性化を誘発することを指し示している。
ＦＧＬはＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋを通してニューロンの細胞生存を促進する
ＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰＩ３ＫがまたＦＧＬで誘発される生存にも関与しているかどうかを検討するために、アポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物を、上で記述される阻害剤で処理した。図８に示すように、ＦＧＬｄで処理されたが阻害剤の無いアポトーシスで誘発されるＣＧＮ培養物における細胞の生存率を１００％にセットして、ＦＧＬｄで処理されていないアポトーシスで誘発される対照ニューロン(破線でマークされる)はＦＧＬｄで処理されるニューロンと比較して、さらに低い生存率を有していた。ＦＧＦＲ阻害剤、SU5402(■)、は２０μＭの濃度で既にＦＧＬｄに対する生存応答を有意に阻害して、４０μＭのSU5402の濃度はＦＧＬｄで誘発される生存を無処理のアポトーシスで誘発される対照ニューロンの生存率にまで減少した。ＭＥＫ阻害剤、PD98059(●)、は１２.５μＭの濃度で、ＦＧＬｄにより誘発される細胞生存を対照培養物のレベルにまで阻害した。ＰＩ３Ｋ阻害剤LY294002(▲)はＦＧＬｄで誘発される細胞生存を３.５μＭの濃度で有意に阻害して、LY294002がニューロン生存の非常に強力でかつ一般的な阻害剤であることを指し示した。
かくして、ＣＧＮ培養物のＫＣｌ欠乏後のＦＧＬで誘発される生存は、ＦＧＦＲのならびに細胞内キナーゼＭＥＫおよびＰＩ３Ｋの活性化に依存している。結果は、LY294002がニューロン生存の最も強力な阻害剤であり、引き続いてＭＥＫ阻害剤、PD98059、であって、これは生存アッセイにおけるより神経突起成長アッセイではさらに少なく効果的であるように見えて(以下を参照)、ＦＧＬで誘発されるＭＥＫ活性化の主要な機能が分化よりもむしろ神経保護であることを多分指し示している。
実施例３：ＦＧＬの種々の製剤によるインビトロでの神経突起成長の刺激
ＤＮ、ＨＮおよびＣＧＮの初代培養物を上で記述するように作製した。
ドーパミン作動性ニューロン(ＤＮ)
ＤＮを、５０％(ｖ／ｖ)のOptimen 1(Gibco, BRL)、２５％(ｖ／ｖ)の馬血清(Gibco, BRL)、２５％(ｖ／ｖ)のＨＢＳＳおよびグルコース５ｇ／ｌを含有する培地の中で細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度で２４−穴の培養プレート(１２.５μｇ／ｍｌのポリ-Ｄ-リジンで予め被膜されたもの；Sigma-Aldricｈ)の中で平板培養した。細胞を１〜２時間静置して接着させた後で、２％(ｖ／ｖ)のB27 Neurobasal Supplement、０.５％(ｖ／ｖ)のグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(全てGibco, BRLから)を種々の濃度のペプチドの有無で補足されたNeurobasal培地に培地を交換した。インキュベーションの７２時間後に、ニューロンを４％(ｖ／ｖ)のホルムアルデヒドで固定して、チロシン水酸化酵素に対する一次マウスモノクローナル抗体および二次ビオチン化ヒツジの抗マウス抗体を用いて免疫染色して、引き続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとインキュベーションを行った。Walmod et al. (2002) Toxicol Appl Pharmacol. 181:1-15に記述されているコンピューター化顕微鏡ワークステーションを用いて、それぞれの個別の実験におけるそれぞれの実験条件について９８個の画像を自動的に記録した。略述すれば、ワークステーションは、電動式可動顕微鏡台(LUDL Electronic Production Ltd, Hawthorne, NY, USA)、１０倍対物レンズおよび１１００アナログ式黒白ＣＣＤビデオカメラ(DFA, Denmark)を備えたEclipse TE300倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)から成っていた。Protein Laboratory (Copenhagen University, Denmark)で開発されたソフトウエアパッケージPrimaを用いて、Ronn et al., (2000) J Neurosci Methods. 100:25-32)にしたがって神経突起の長さの立体解析学的に基づく測定を行った。
海馬のニューロン(ＨＮ)および小脳顆粒のニューロン(ＣＧＮ)
新生児のＨＮもしくはＣＧＮを、０．４％(ｗ／ｖ)の牛血清アルブミン(ＢＳＡ; Sigma-Aldricｈ)、２％(ｖ／ｖ)のB27 Neurobasal Supplement、１％(ｖ／ｖ)のglutamax、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２％の１Ｍ ＨＥＰＥＳ(いずれもGibco, BRLから)で補足されたNeurobasal培地の中で細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で被膜されていない８−穴のパーマノックスLab-Tekチャンバースライドの上で平板培養した。種々のシグナル伝達経路の阻害剤の有無でペプチド溶液を添加して総量を３００μｌ／ｃｍ２として、スライドを３７℃でインキュベートした。２４時間後に、ニューロンを４％(ｖ／ｖ)のホルムアルデヒドで２０分間固定して、その後でＧＡＰ−４３に対する一次ウサギ抗体およびAlexa Fluor社の二次ヤギ抗ウサギ抗体を用いて免疫染色した。以前に記述されるように(Ronn et al., 2000 op. cit.)、コンピューター支援蛍光顕微鏡を用いることにより、それぞれの個別の実験においてそれぞれの群につき少なくとも２００個のニューロンの画像を系統的に得た。略述すれば、ビデオカメラ(Grundig Electronics, Germany)に結合したNikon Plan ２０倍の対物レンズを持つNikon Diaphot倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)を記録に使用した。ドーパミン作動性神経突起成長アッセイについて上で記述したのと同一のソフトウエアパッケージを用いて、記録された画像を加工した。
結果
ＦＧＬは、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロンの初代培養物における神経突起成長を誘発する
ＦＧＬのモノマー形は、初代の海馬ニューロンからの神経突起成長を誘発すると立証されてきている。ペプチドリガンドの多量体形はモノマー形よりも受容体活性化に対してさらに高い活性を有することが知られている(上で考察される)。それ故に、ＦＧＬの種々のダイマーのおよびテトラマーの型を製造して、ドーパミン作動性の、海馬の、および小脳顆粒のニューロン(ＣＧＮ)の初代培養物を使用してそれらの神経突起成長の刺激能力について試験した。
テトラマー(樹状体)のＦＧＬペプチド(ＦＧＬｄ)の非存在下もしくは存在下で、培養物を増殖した。全ての三つの型のニューロンにおいてＦＧＬｄにより誘発された神経突起成長を引き続いて定量化して、図９に示した。ＦＧＬｄで処理されたドーパミン作動性ニューロン(●)は、用量依存的様式で神経突起の統計的に有意な長さの増加を示し、１μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの濃度で最大の平均神経突起の長さ(無処理の対照と比較して１２５％)が得られた。ＦＧＬｄで処理された海馬ニューロン(▲)は、０.０４μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの用量で既に神経突起の長さの増加を呈示して、２０μｇ／ｍｌまでのＦＧＬｄの濃度を使用する無処理の対照培養物と比較して、およそ１５０％の刺激を持つプラトー状のレベルに達した。ＦＧＬｄで処理されたＣＧＮ培養物(■)はまた、用量依存的な神経突起成長の応答を呈示した。無処理の対照と比較して、２５５％の最大刺激が、５０μｇ／ｍｌのＦＧＬｄの濃度で見られた。
海馬ニューロンの初代培養物を選択して、ＦＧＬペプチドの三つの異なるダイマー変種、ＦＧＬL、ＦＧＬｌｙｓ、およびＦＧＬｃｙｓ、の神経突起成長に及ぼす作用を試験した。図１０に示されるように、ダイマーのリジン樹状体、ＦＧＬｌｙｓ(▲)およびＦＧＬｃｙｓ(●)、は両方とも試験された濃度のいずれにおいても神経突起成長を刺激することができなかった。対照的に、ＦＧＬＬ(■)は有意な神経突起成長の応答を誘発して、１μｇ／ｍｌ濃度で最大刺激に達する釣鐘状カーブをもって用量依存性の関係を呈示した。最大刺激は無処理の対照と比較して１５５％であったが(図１０)、これはＦＧＬｄにより誘発される応答とほぼ同一であった(図９を参照)。
ＦＧＬにより誘発される神経突起成長はＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋの活性化を伴う
ＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋの活性化の生物学的相関を解明するために、ＣＧＮにおいてＦＧＬｄにより誘発される神経突起成長へのこれらのキナーゼの阻害剤の作用を試験した。ＦＧＦＲの阻害剤、SU5402、は受容体の触媒ドメインと相互作用することにより１亜型ＦＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害すると知られている。図１１において、ＦＧＬｄで処理されたＣＧＮ培養物の中の平均の神経突起の長さを１００％とセットして、ＦＧＬｄで処理されていない対照ニューロンについての平均の神経突起の長さが破線でマークされている。SU5402(●)は、ＦＧＬｄで誘発される神経突起成長を８０μＭの濃度で有意に阻害した(初期値の３５％に)ように見える。２５μＭ以上の濃度でのＭＥＫ阻害剤のPD98059(●)との処理は、ＦＧＬｄにより誘発される神経突起成長を７５％に有意に減少した。また、ＰＩ３Ｋの阻害剤のLY294002(▲)は、３.５μＭの濃度で既にＦＧＬｄで誘発される神経突起成長を９０％に有意に阻害して、１０μＭのLY294002の濃度ではＦＧＬｄに対する神経突起成長の応答は殆ど５０％にまで減少されて、これは無処理の対照のニューロンに対するよりもさらに低い。SU5402およびLY294002は、ＦＧＬｄで処理されていない対照培養物における神経突起成長への有意な作用無しであった(データは示されていない)。PD98059は、ＣＧＮにおける基部の神経突起成長に影響を及ぼさないと以前見出されてきている。かくして、ＣＧＮのＦＧＬｄで誘発される神経突起成長の応答は、ＦＧＦＲの活性化ならびにＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋの細胞内シグナル伝達経路の引き継いた活性化に依存している。
Figure 2007526898
 ａＦＧＬ処理無しで細胞死を受けるように誘発された培養物における生存率を１００％(対照)と指定して、ＦＧＬを添加した、培養物と比較した。
統計値(＋ＦＧＬ処理対対照処理)：＊ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１
Figure 2007526898
結論
１．ＦＧＬペプチドは、神経変性障害の処置に必須である、インビトロで種々のニューロンの細胞型に対する生存を促進する化合物である。
２．ＦＧＬペプチドは、インビトロで種々のニューロンの細胞型において神経突起成長を誘発する能力があって、ＦＧＬは、神経変性障害の治療に必須である、軸索と樹状突起の両方の成長を促進する潜在性を有する。
３．全て、モノマーＦＧＬｍ、ダイマーＦＧＬＬ、および樹状体ＦＧＬＤのＦＧＬペプチドの製剤は、生存および神経突起成長の両方の促進に強力である。
４．ＦＧＬＬおよびＦＧＬＤの両方は、神経突起成長の促進においてＦＧＬｍより２００倍以上にさらに強力である。
５．ＦＧＬＬは、ＦＧＬＤのように、神経突起成長および生存の両方の促進に強力である。
６．ダイマーＦＧＬｌｙｓおよびＦＧＬｃｙｓのようなＦＧＬペプチドの他の製剤は、神経突起成長の促進において不活性である。
実施例４：ラットの海馬ニューロンの初代細胞培養物のシナプス可塑性へのＦＧＬの作用
成人の神経系では、海馬のような構造は、可塑的な変化を持続的に受けて、構造と機能を調整する。特に、記憶の獲得は、既に確立されているニューロンの接合の構造上のおよび機能上の変化を必要とすると信じられている。ＮＣＡＭは、発生の間のニューロンの可塑性においてならびに学習および記憶において重要な役割を果たしていると示されてきている(Welzl and Stork, (2003) News Physiol Sci. 18:147-50)；しかしながら、これらの作用の機構は不明である。本試験において、ＦＧＬペプチドがシナプスの可塑性に影響を及ぼすことができるかどうかを検討した。
小胞のターンオーバーへのＦＧＬｄの作用を、ラット胚(Ｅ１９)からの海馬ニューロンの初代培養物において推定した。培養物を上のように作製した。インビトロで１３〜１６日目に続けて、ＦＧＬｄを培養物に添加して、１、２４、もしくは４８時間インキュベートした。インキュベーションの４８時間後で、ＦＧＦＲ阻害剤(SU 5402)をＦＧＬｄと同時に培養物の幾つかに添加した。
ＦＧＬｄでの処理後に、Kiryushko et al (2003) J Biol Chem. 278:12325-34により記述されるようにニューロンを蛍光膜プローブＦＭ１−４３で標識した。次いで、９０ｍＭのカリウムでの脱分極により誘起されたＦＭ１−４３の放出(細胞の脱染色)の割合をRadiance 2000スキャニングシステムおよびNikon ECLIPSE TE200共焦点顕微鏡を用いる微速度画像収集により評価した。
シナプス形成へのＦＧＬｄの作用を、１３日間の培養で増殖させた初代胚性(Ｅ１９)海馬ニューロンにおける神経突起およびシナプスの二重免疫染色を用いてさらに評価した。固定化および免疫染色の前に、細胞を、ＦＧＬｄで４８もしくは９６時間インキュベートした、した。シナプスをシナプトフィシンに対する抗体により検出して、生長関連タンパク質−４３(ＧＡＰ−４３、またＢ−５０もしくはＦ１と呼ばれる)に対する抗体により、神経突起を標識した。免疫染色を、Ronn et al. (2000) (op. cit.)により記述されるように、共焦点蛍光顕微鏡により視覚化して、定量化した。
結果
２０μｇ／mlのＦＧＬｄでの海馬ニューロンの１時間および４８時間の処理は、対照と比較して、ＦＭ１−４３の脱染色の統計的に有意な増加をもたらした(それぞれ、０.００８／秒から０.０１６／秒へ、および０.０１３／秒から０.０２８／秒へ)；一方で２４時間の処理は有意な作用をもたらさなかった(図１２)。これは、ＦＧＬｄが伝達因子放出の短期促進(１時間)およびシナプス効率の長期(４８時間)の増加の両方を引き起こすことを示唆している。ＦＧＦＲ阻害剤のSU5402はＦＧＬｄの作用を打ち消して、ＦＧＬｄの作用がＦＧＦＲとのその相互作用を通じて仲介されたことを指し示している。
海馬ニューロンのシナプトフィシンおよびＧＡＰ−４３に対する二重免疫染色は、神経突起の長さ１００μｍ当りのシナプトフィシン陽性スポットの数のおよそ２０％の増加により反映される(それぞれ、２.４０から２.９６へ、および２.７３から３.２４へ)ように、海馬の培養物に４８および９６時間投与されたＦＧＬｄ(２０μｇ／ml)がシナプスの数を有意に増加したことを示した。
これらの結果は、ＦＧＬペプチドが前シナプス小胞のターンオーバーの速度およびシナプスの数を増加させることによりシナプスの可塑性に影響することを示唆している。
実施例５：虚血条件に曝露された器官型海馬ニューロンの切片培養物および解離海馬ニューロン初代培養物へのＦＧＬの作用
脳は酸素およびグルコースの高度の消費を有して、エネルギー生産について酸化的リン酸化に殆ど完全に依存している。酸素およびグルコースの供給の欠乏は、ニューロンの細胞損傷および死をもたらす。虚血性障害に対する感受性は、脳の異なる部分および異なるニューロン集団でさえの中で異なる。海馬のＣＡ１領域のニューロンは、高い脆弱性の脳にける領域の一つである。
方法
本試験では、Stoppini et al. (1991) Neurosci Methods. 37:173-82の方法にしたがって7日齢のウイスターラットから器官型海馬ニューロンの切片培養物(ＯＨＳＣ)およびMaar et al.(1997) J Neurosci Res. 47:163-72の方法にしたがって１日齢のラットからの解離海馬ニューロンの初代培養物において、酸素およびグルコースの欠乏(ＯＧＤ)の後のシナプスの可塑性、ニューロンの機能および脆弱性へのＦＧＬペプチドの作用を検討した。ＦＧＬｄを添加する前に初代培養物を１１〜１２日間、ＯＨＳＣを１２〜１４日間維持した。
初代細胞培養物およびＯＨＳＣをＯＧＤに１０および２０分間曝露した。ＯＧＤ後に、培養物を再び酸素およびグルコースで供給して、ＯＧＤ曝露の導入後１、４もしくは２４時間の時点で分析した。ＦＧＬｄ(もしくは対照ペプチドＦＧＬｃ)をＯＧＤの２４時間前、直後、または１時間もしくは２４時間後に添加した。ＯＧＤに先立って添加したときには、ＯＧＤを導入するときに培地からＦＧＬｄを除去した。或る場合には、切片培養物をＯＧＤの４時間後にのみＦＧＬｄで処理した。加えて、幾つかのセットアップではＦＧＦＲ阻害剤、SU5402(２５μＭ)、をＦＧＬｄと一緒に加えた。
海馬ニューロンの培養物においては、ＦＭ１−４３染色を用いて、シナプス前の機能を評価した(上で記述されている)。初代細胞培養物およびＯＨＳＣの両方における細胞生存率を、Malich et al, (1997) Toxicology. 124:179-92にしたがって、ＭＴＳ[臭化３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウム]アッセイを用いて測定した。加えて、Laake et al. (1999) Brain Res Brain Res Protoc. 4:173-84にしたがって、ＯＨＳＣにおける細胞生存率をヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色を用いて測定した。
結果
解離海馬の細胞培養物の代謝活性は、ＭＴＳアッセイで測定されるように、対照培養物と比較して、２０分のＯＧＤに続いて１時間後(３１％)および４時間後(３０％)に有意に減少した。細胞培養物をＦＧＬｄで処理したときには(ＯＧＤ後のの２４時間前もしくは直後)、代謝活性へのＯＧＤの作用は消滅した。ＯＨＳＣにおける代謝活性は、ＯＧＤに対して異なる応答を示した。ＯＧＤ一時間後で、代謝活性は対照と比較して有意に増加(１９％)したが、一方ではさらに長期間の再酸素添加(２４時間)は、代謝活性の減少(２４％)をもたらした。両方の時点において、ＯＧＤに２４時間先立ってＦＧＬｄでの処理は、対照と比較して、海馬切片における代謝活性の正常化を引き起こした。解離細胞培養物およびＯＨＳＣの両方において、ＦＧＬｄの処理単独は代謝活性の増加に至った。加えて、もしＦＧＦＲ阻害剤のSU5402がＦＧＬｄと一緒に存在したならば、ＦＧＬｄでの２４時間の前処理は、代謝活性のＯＧＤで誘発される低下を消滅しないで、ＦＧＬｄがＦＧＦＲの活性化を通して代謝活性に影響するかも知れないことを指し示している。
解離海馬の細胞培養物では、高カリウム刺激での前シナプス小胞放出(ＦＭ１−４３脱染色)の速度は、ＦＧＬｄの処理により統計的に有意に増強されて(０.０４／秒から０.０６／秒に)、ＯＧＤ後には、１時間目および４時間目に分析されたととき、減少した(両方が０.０４／秒から０.０２／秒に)。もし細胞培養物をＯＧＤ後の２４時間前もしくは直後のいずれかにＦＧＬｄで処理したならば、ＦＭ１−４３放出の速度のＯＧＤで誘発される減少は消滅した。さらに、ＦＧＦＲ阻害剤のSU5402は、ＦＭ１−４３放出のＯＧＤで誘発される減少へのＦＧＬｄの作用を打ち消した。
ＯＨＳＣでは、１０分間のＯＧＤは、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色で推定されたように遅延性細胞損傷を誘発した。ＯＧＤ後の４時間(０.３％から５.０％へ)および２４時間(０.６％から２３.１％へ)の両方で、ＯＨＳＣのＰＩ染色(全ＣＡ１領域の％)の有意な増加があった。この作用は、切片をＦＧＬｄで２４時間前処理することにより殆ど完全に打ち消されることができた。細胞損傷は、ＯＧＤ直後に切片をＦＧＬｄで処理することによりまた回避されたが、もしＦＧＬｄの処理がＯＧＤ４時間後まで遅れるならば、回避されなかった。対照ペプチドのＦＧＬｃは、ＯＧＤにより誘発される細胞損傷に影響を及ぼさないで、もし切片をＦＧＦＲ阻害剤のSU5402でＦＧＬｄと一緒に前インキュベートしたならば、ＰＩ染色はＯＧＤ単独のそれと同様であった。
考察
ＦＧＬｄペプチドは、二つの異なるインビトロのモデルシステムにおいて酸素とグルコースの一過性欠乏の２４時間前もしくは直後に適用されたときには、神経保護作用を有する。ＯＧＤは、解離海馬の細胞培養物においておよびＯＨＳＣにおいて代謝活性の低下を引き起こして、両方の場合でＦＧＬｄでの処理が、ＯＧＤ後の代謝活性を部分的にもしくは完全に正常化することができた。
虚血は、使用したモデルおよび虚血チャレンジの苛酷性に依存して、増強されたシナプス伝達もしくは低下されたシナプス伝達のいずれかを引き起こすと報告されてきている。本試験で使用されたモデルにおいては、２０分間のＯＧＤは、カリウム刺激での前シナプス小胞の放出の低下を引き起こして、この低下は、ＯＧＤ後の２４時間前もしくは直後のいずれかでＦＧＬｄペプチドを投与することにより減衰された。
かくして、検討された全て三つのパラメーター(代謝活性、前シナプス小胞の放出および細胞生存率)について、ＦＧＬペプチドは、ＯＧＤの作用を部分的にもしくは完全に阻害することができた。さらに、ＦＧＬのこの神経保護活性は、全て三つの場合において、ＦＧＦＲ阻害剤のSU5402により阻害されることができて、ＦＧＦＲ活性がＦＧＬの作用のために必要であることを指し示している。
実施例６：ラットの社会的行動およびインビボでのβ−アミロイドで誘発される神経毒性へのＦＧＬの作用。
モデルの説明
本試験はラットモデルを使用して、その中で神経毒性および認識機能障害を(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントにより誘発した(Maurice T., et al. (1996) (Brain Res. 706:181-93) and Delobette S., et al. (1997) Eur J Pharmacol.319:1-4を参照)。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントによりラットに誘発される短期記憶障害は、それがアルツハイマー病の臨床症状の一つに類似しているので、試験すべき特別な重要性を持っている。ラットにおける短期記憶障害を三つの異なる行動試験：社会的認識試験(Kogan et al, (2000) Hippocampus 10:47-56)、オープンフィールド試験(Cerbone and Sadile, (1994) Neurosci Biobehav Rev. 18:497-518.; Vianna et al, (2000) Learn Mem. 7:333-40)およびＹ字型迷路試験(Clayton & Williams, (2000) Neurobiol Learn Mem. 74:135-45)を用いて評価した。加えて、屠殺時に収集した脳組織について神経病理学的検討を実施した。ＦＧＬペプチドを後頭下方にもしくは鼻腔内にのいずれかで投与した。
方法
初期の処置での代表的な社会的認識試験の時刻表を図２６(Ａ)に略図的に示す。
５日間の馴化期間の後で、ラットを、脳の右側脳室の中にｉ.ｃ.ｖ.で注射した(０日目)、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)(動物当り２５μｇ)で処置した。
ＦＧＬペプチド(ＦＧＬＬもしくはＦＧＬｄのいづれか)を、７、１０および１３日目にもしくは３０、３３および３６日目に後頭下方に(投与当りの動物当り５μｇ)もしくは鼻腔内に(投与当りの動物当り４００μｇ)投与した。動物の行動を、社会的認識試験、オープンフィールド試験、もしくは明暗識別Ｙ字型迷路試験を用いて評価した。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の２８〜３０日目もしくは５１日目に動物を屠殺し、選択された試験では、脳組織を収集し、組織切片をＡ−β特異的抗体で免疫染色して、アミロイド負荷をＡ−β陽性区域の百分率として計算した。加えて、脳切片の選択された区域におけるニューロンの数を立体解析学的アプローチを用いて計算した。
社会的行動および記憶への(２５〜３５)Ａ−β／ビークルの投与の作用
社会的認識試験では、第二の試行の間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の増加を、ビークル(Ｖ)を受領する対照動物と比較して、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントを受領したラットにおいて検出した。オープンフィールド試験では、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントで処置したラットは、対照動物群で注目された減少と対照的に、２０分間の期間の間に探索活性を減少しなかった。陽性の食物強化での明暗識別Ｙ字型迷路試験では、(２５〜３５)βアミロイドフラグメントで処置されたラットは、エラー(間違ったアームへの進入)の数の増加を立証した。
かくして、全て三つの試験において、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与は、短期記憶障害として表示される認知障害をもたらした。
(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与により認知障害が誘発されたラットの行動および記憶へのＦＧＬ投与の作用
ＦＧＬの作用を、幾つかの独立した試験において以下に記述されるインビボでの異なる試験で推定した。
社会的認識試験および神経組織病理
○試験１：(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ＦＧＬを後頭下方に投与した。ＦＧＬｄの最終投与日の日の１４日目に、社会的認識試験においてＦＧＬｄの作用は何も観察されないで、プラセボで処置されたラットを(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント単独でもしくはＦＧＬｄと共にのいずれかを受領するラットと比較する、海馬のＣＡ３領域の神経組織病理学的評価において有意な作用は何も観察されなかった。
○試験２：(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ＦＧＬを後頭下方に投与した。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントを投与することは、第二の出会いにおいてラットにより幼若動物を探索することに費やされた時間の、ならびに対照動物と比較したときのアミロイド負荷およびニューロンの細胞死の、統計的に有意な増加をもたらした。しかしながら、ＦＧＬＬおよびＦＧＬｄでの処置は、β−アミロイドのペプチドフラグメントでのみの処置された動物と比較したときに、第二の試行の間に処置された動物により幼若ラットを探索することに費やされた増加した時間を有意に低下した。ＦＧＬLおよびＦＧＬｄでの処置はまた、帯状回皮質(それぞれ、１００％から３９％および４２％に)においておよび海馬のＣＡ３領域(それぞれ、１００％から１７％および４４％に)おいてアミロイド負荷を有意に低下した。加えて、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較したときに、ＦＧＬＬおよびＦＧＬｄは、海馬のＣＡ３領域においてニューロンの密度の増加(それぞれ、ニューロン１５個から２１および２２個／ｍｃｍ２×１０４へ)を引き起こした。結果を図１３〜１６にグラフで提示する。
○試験３：(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の３０、３３および３６日目に、ＦＧＬＬを後頭下方に投与した。ＦＧＬＬの最終投与の１週間後の４４日目に、(２５〜３５)Ａ−β／ビークルで処置された対照ラットと比較して、ＦＧＬＬを後頭下方に投与したときに、ラットが第二の曝露時に新規対象物(幼弱ラット)を検討するのに費やされた時間の比率において、統計的に有意な低下が観察された(０.５０から０.４１へ)。加えて、神経病理学的検討は、帯状回皮質 (１００％から２４％)および海馬のＣＡ３区域において(１００％から２９％へ)、アミロイド負荷の統計的に有意な低下を示した。加えて、β−アミロイド (２５〜３５)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較して、損傷されたニューロンの百分率の統計的に有意な減少(ニューロン２７〜２１個／ｍｃｍ２×１０−４)が帯状回皮質において観察された。結果を図１７〜２０にグラフで提示する。
○試験４：(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ＦＧＬＬを後頭下方に投与した。アミロイドベータペプチドでの処置は、ＦＧＬペプチドでの処置で打ち消された、短期記憶障害を誘発した。帯状回皮質において、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群と比較して、ニューロン密度の統計的に有意な増加(１１から１４μｍ２×１０−４)が、ＦＧＬＬの投与に応答して観察された。結果を図２１〜２３にグラフで提示する。
オープンフィールド試験
(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、後頭下方に投与されたＦＧＬｄを受領したラットは、ＦＧＬの最終投与後の日の１４日目における最初の測定期間と比較して、最終の測定期間において穴を探索するのに費やされた時間(３.３秒から０.１秒へ)および立ち上がり(７.０秒から０７秒へ)の統計的に有意な減少を示した。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントでのみで処置されたラット群は、二つの測定期間の間に統計的に有意な差を何も示さなかった。移動運動活性は１４日目に影響を受けなかった。
陽性の食物強化での明暗識別Ｙ字型迷路試験
後頭下方に投与されたＦＧＬｄを受領したラットは、訓練最終日の２５日目においてエラーの数の統計的に有意な減少(３.８から１.７へ)を示したが、一方では、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントで処置された対照ラットと比較して、訓練の２１〜２４日目では有意な相違は何も観察されなかった。
考察
この試験で使用されたモデルにおいて、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントで誘発される神経毒性は、アルツハイマー病患者で見られる神経病理および認知障害の多くの側面を反映している。このモデルでは、(２５〜３５)β−アミロイドのペプチドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与は、(２５〜３５)β−アミロイドのペプチドフラグメント投与後の１４日目に開始する、β−アミロイドの沈着をもたらして、これはニューロンの細胞死および認知障害(短期記憶障害)に至る。
ＦＧＬペプチドの初期投与の実験((２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目での)は、ＦＧＬの後頭下方のおよび鼻腔内の両方の投与が、短期記憶障害の防止、種々の脳区域におけるβ−アミロイド負荷の減少、およびニューロンの細胞死の減少をもたらすことを明らかに立証している。後期での(２５〜３５)β−アミロイドのペプチドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の３０、３３および３６日目での、ＦＧＬペプチドの投与は、脳組織における神経病理学的変化および記憶障害の両方を改善した。
これらの試験の重要な側面は、ＦＧＬ投与の異なる経路の有効性を比較することであった。得られた結果は、後頭下方に投与されたＦＧＬペプチドの効力と比較すると、鼻腔内に投与されたＦＧＬペプチドの効力ははるかに弱いけれども、ＦＧＬペプチドの鼻腔内投与が、(２５〜３５)β−アミロイドのペプチドフラグメントでの処置により誘発された記憶障害を効果的に低下したことを明らかに指し示している。鼻腔内に投与されたＦＧＬの記憶への作用が用量依存性であったことは注目すべきである。
結論として、総合すると、これらの結果は、ＦＧＬペプチドが、神経病理を低下させて、(２５〜３５)β−アミロイドのペプチドフラグメントでの処置により誘発される記憶障害を低下させる潜在性を有することを指し示している。これらの知見はまた、ＦＧＬペプチドが、アルツハイマー病を持つ患者におけるβ−アミロイド沈着と関連する認知障害の処置のために治療上の潜在性を有することを指し示している。
実施例７：ラットの子における感覚運動制御の発達
未成熟げっ歯類の新生児のＣＮＳは、脳機能の成熟に影響する薬剤を試験するための有用なモデルである。姿勢の調節(運動)の成熟は、運動のおよび感覚の系の組込みを必要とする。最初の出生後週の間に姿勢のおよび運動器官の機能の成熟は、生後日(ＰＮＤ)３に胸椎レベル、ＰＮＤ６に腰椎レベルに到達する、脳幹および皮質脊髄路からの下行路の生長と関係がある。かくして、ＰＮＤ３およびＰＮＤ６の間の期間は、感覚運動システムの生後組込みを修飾することができる薬剤の作用に感受性な期間として考えられることができる。ＦＧＬのような神経活性薬物の作用の測定に使用されることができる、多数の運動制御試験が使用可能である。本試験では、ラットの子の平面立ち直り応答能力(Tilney, 1933)、軸足歩行能力(Altman et al, (1975) Anim Behav.;23:896-920)、背地走性能力[Henck et al, (2001) Toxicol Sci. 62:80-91)および前足懸垂能力[Kimler et al, (1998) Brain Res Dev Brain Res. 107:49-55)]を選択して、感覚運動制御の発達へのＦＧＬの作用を評価した。実験の時間経過を図２６(Ｂ)に図式的に提示する。
用量−応答試験。ラットの子による平面立ち直り反射の能力への生後日(ＰＮＤ)１、２および３での一日当り０.０２６、０.２６および２.６μｇのＦＧＬｄの鼻腔内投与の作用を評価した。それぞれが１０匹の子(雄５匹および雌５匹)から成る合計五組の同腹仔をこの試験で使用した。
ＦＧＬｄの投与は、ビークルで処置された対照動物と比較して、投与当りで一匹の子当り２.６μｇの濃度で投与されたＰＤＮ５(３.４秒から１.３秒へ)で平面立ち直り反射の能力を有意に改善した。
感覚運動制御の発達試験。ＰＤＮ１、２および３で２.６μｇのペプチドを毎日鼻腔内投与されたラットの子の感覚運動制御の発達(平面立ち直り反射、背地走性反射、軸足歩行および前足懸垂の能力)へのＦＧＬの作用を評価した。それぞれが１０匹の子(雄５匹および雌５匹)から成る合計六組の同腹仔をこの試験で使用した。
ＦＧＬLの投与は、ビークルで処置された対照ラットと比較して、平面立ち直り反射の能力をＰＮＤ４で(２.１秒から１.６秒へ)(図２４)および背地走性反射の能力をＰＮＤ６で(５６.７％から８０.０％に)(図２５)、統計的に有意に改善したが、軸足歩行活動もしくは前足懸垂能力には影響を及ぼさなかった。これは、ＦＧＬが他の機能を妨害すること無しに、出生後の感覚運動制御の発達を促進することを指し示している。加えて、背地走性能力への有意な作用は何もＰＮＤ９で観察されないで、運動制御の発達はＰＮＤ９までに既に完了していたことを示唆している。
考察
本結果は、出生後の発達の間のＣＮＳ可塑性の初期プロセスのモジュレーションにおけるＦＧＬペプチドの作用を立証して、ＦＧＬペプチドが、ＦＧＦ受容体を刺激することにより、感覚運動機能の発達を加速する潜在性を有し得ることを示唆している。
実施例８：前後関係の恐怖条件付け試験およびモーリス水迷路試験
前後関係の恐怖条件付け(ＣＦＣ)試験(Cordero et al, (2003) Horm Behav. 2003 Nov;44(4):338-45)およびモーリス水迷路(ＭＷＭ)試験[Morris R., (1984) J Neurosci Methods. 11:47-60)は、学習および記憶を評価する課題であって、正常な対照ラットのおよび薬物で処置されるラットの能力を比較するために使用される。
前後関係の恐怖条件付け試験では、ラットは、＊新しい環境に曝されたときに回避不能のショックを経験して、これは同一の環境に引き続いて再び曝されるときに、特徴的な不動性すなわち‘すくみ応答'から成る、条件付け恐怖応答の発達をもたらす。
モーリス水迷路試験では、ラットは、水中で泳ぐことから逃れるために隠されたプラットホームを見つけ出すための空間訓練課題で評価される。
本試験は、ＦＧＬｄペプチドの訓練後投与が、嫌悪的および／もしくは新しい状況における記憶の固定をモジュレートするのに有効であるかどうかを検討した。
前後関係の恐怖条件付け試験
ラットを実験の第一日に先立つ３日間の毎日１２０秒間取り扱った。１日(訓練)目にラットは、二分間の１分毎に１秒間のショック(無条件刺激)を受領した。訓練後の直後に動物を、５μｌのＦＧＬｄ(５μｇ)、対照ペプチド(５μｇ)もしくはビークルで注射した。それぞれの処置群は１１〜１４匹のラットから成っていた。合計で、３９匹の動物を評価した。条件付けのために使用されるチャンバーの中に８分間、しかしショック無しで入れることにより、動物を２、７および３０日目に試験した。それぞれのラットを時間−サンプリング手順を用いて、２秒毎に、“すくみ”もしくは“活動性”のいずれかとして等級付けした。
実験の時間経過を図２６(Ｃ)に図式的に提示する。
ＦＧＬｄの投与後にすくみ時間の百分率の統計的に有意な増加が、動物を条件付け後の２日目(５０.５％から７３.５％へ)および７日目(３０.０％から６０.３％へ)に試験したとき、プラセボもしくは対照を受領したラットと比較して、検出された。これは、成熟雄ウイスターラットに訓練後に投与したときに、ＦＧＬｄが条件付け恐怖応答の長期保持を改善する能力があることを指し示している。
モーリス水迷路試験
モーリス水迷路試験では、ラットを、実験前の五日間(−４〜０日目)に１２０秒間の毎日の訓練により隠されたプラットホームの場所を探し出すように予め訓練した。１および２日目に、そのなかでプラットホームの場所を一定に残した３回連続した試行をラットに与えた。その間にラットがプラットホームの場所を探し出すことができた時間を、１２０秒の最大試験期間以内で記録した。１および２日目にそれぞれの訓練試行後の直後にラットは、ＦＧＬｄペプチド(５μｇ)、対照ペプチド(５μｇ)、もしくはビークル溶液の５μｌの注射を受領した。
訓練後の２４時間(３日目)および７日(１０日目)に、動物を試験した。訓練後の１４日(１７日目)に、プラットホームの位置を変更した。三回の連続した試行でプラットホームの新しい位置を見出すように、ラットを訓練した(“逆転学習”)。合計で、４８匹の動物を評価した。動物を、処置群当り１２〜１８匹のラットから成る三群に分割した。
ＦＧＬｄを投与することは、モーリス水迷路試験で評価されたラットでの長期記憶の固定を改善した。ＦＧＬｄ、ＦＧＬｃもしくはビークルの第１回投与後の日の２日目には、ＦＧＬｄで処置されたラットは、無処置のラット(９３.０秒)よりも統計的に有意にさらに速く(６５.８秒)プラットホームを探し出すことができた。作用は１７日目にまた統計的に有意であって、改善された学習能力を示唆していた。
実験の時間経過を図２６(Ｄ)に図式的に提示する。
オープンフィールド試験における追加的実験は、ＦＧＬｄが、ラットにおいて情緒的なもしくは移動的な行動に影響しなかったことを示した。
考察
ＣＦＣ／ＭＷＭ試験の結果は、正常ラットの学習および記憶へのＦＧＬｄの長期作用を立証した。ＦＧＬは、長期記憶形成に関与するシグナル伝達カスケードを起動することにより作用していることがあり得る。上に示されるように、ＦＧＬは、増加されたシナプス前小胞ターンオーバーをもらたす、ＦＧＦＲを通して作用するシナプスの可塑性をモジュレートすることができる。総合して、これらの結果は、ＦＧＬが、学習のおよび記憶の障害を持つ患者の処置に非常に良好な治療的潜在性を有することを示唆している。
実施例９：ＦＧＬＬのインビボ薬物動態：血漿およびＣＳＦ中のＦＧＬＬの推定
ラットならびにイヌの血漿およびＣＳＦの中において、投与されたＦＧＬＬのレベルをラジオイムノアッセイにより評価した。
アッセイ
ａ)ラットおよびイヌの血漿サンプルは、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含有した。
ｂ)ＦＧＬＬをヨウ素化した。ヨウ素化をヨードゲン法を用いて為した。ヨウ素化ペプチドを、Ｃ１８カラムの上で取り込まれなかったＩ１２５から精製した。
ｃ)測定を繰り返して為した。
１．血漿(もしくはＣＳＦ)のサンプル(２０μｌ)を、ＥＤＴＡを含有する試験管(ｎ＝２)に添加した。非免疫ウサギ血清(もしくは対照動物からのＣＳＦ)を含有する非特異的結合(ＮＳＢ)試験管を対照として使用した。
２．希釈した放射能標識のＦＧＬＬ(１００μｌ；トレーサーのおよそ２０,０００ｃｐｍ／試験管)を添加した。トレーサーのみを含有する対照試験管をまた作製した。
３．希釈した抗血清サンプル(ＰＡｂ２６８について１：２０,０００；１００μｌ)を全ての試験管(対照試験管を除く)に加えた。内容物をボルテックス混合した。
４．試験管を４℃で一夜インキュベートした。
５．抗ウサギＳＡＣ−細胞溶液(０.１ｍｌ)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えた。内容物をボルテックス混合して、次いで、室温で３０分間インキュベートした。
６．洗浄緩衝液(２ｍｌ)を、トレーサーを含有する試験管を除く全ての試験管に加えて、試験管を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
７．上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい１分間液切りした。
８．洗浄緩衝液(１.５ｍｌ)を試験管に再び加えて、試験管を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
９．上清をデカントして、試験管を静置して、せいぜい１分間液切りした。その後に、試験管を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
１０．全ての試験管を二回計測した；初めは３分間、次いで１０分間。
結果
検量線精度プロファイルを、重複して(ｎ＝６)ラット血漿においてＦＧＬＬの０.０８０ｎｇ／ｍｌ〜２０.４８ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に亘って作成した。良好な精度が、許容真度(＜２５％)で０.１６０ｎｇ／ｍｌまでの全濃度域に亘って観察されて、それは、ラット血漿におけるアッセイの潜在的定量化下限(ＬＬＯＱ)の指標を与えるものである。計数時間を増加することはアッセイの精度を改善しなかった。
イヌ血漿において０.０８０ｎｇ／ｍｌ〜２０.４８ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に亘って検量線精度プロファイルを重複して(ｎ＝６)作成した。
薬物動態学的パラメーターを、コンピュータープログラムWinNonlin Pro version 3.3 (Pharsight Corporation, USA)を用いて計算した。定量化限界以下(ＢＬＱ)であった値を、平均値の計算においてゼロとして入力した。
幾つかの毒物動態学的パラメーターがまた規定された。測定された毒物動態学的パラメーターには：ＦＧＬＬの最大血漿濃度(Ｃｍａｘ)、それらの出現時間(Ｔｍａｘ)、および投与後２４時間での血漿濃度(Ｃ２４)が含まれた。２４時間の投与間隔以内で血漿ＦＧＬＬ濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ２４)を線形台形公式により推定した。鼻腔内投与の後のＡＵＣ２４値の計算では、サンプリングの時間は投与開始時に比べてであった(５回の投与手順のそれぞれの間で１０分の中断を想定して)。終末速度定数(ｋ)を、時間に対する対数濃度の直線回帰に当てはめることにより推定した。終末半減期(ｔ１／２)をｌｎ２／ｋとして計算した。
５０ｍｇ／ｋｇでの静脈投与で処置された二匹のラットからのＣＳＦの中のＦＧＬＬレベルは、３２１および２６９ｎｇ／ｍｌであった。１００ｍｇ／ｋｇでの皮下投与で処置された他の動物からのＣＳＦの中のＦＧＬＬレベルは、２４２、９２および８１ｎｇ／ｍｌであった。これらのデータは、注射的に投与されたときに、ＦＧＬＬがＣＮＳに入る証拠を提供している。
第一回の投与後に採取された毒物動態サンプルは：
雄および雌を合わせた曝露量(５０ｍｇ／ｋｇ／日、静注)：
ＡＵＣ＝５１,０２６時間ｎｇ／ｍｌ；Ｃｍａｘ＝２０,９５１ｎｇ／ｍＬ
雄および雌を合わせた曝露量(１００ｍｇ／ｋｇ／日、皮下注)：
ＡＵＣ＝５０,１１９時間ｎｇ／ｍｌ；Ｃｍａｘ＝８,３４６ｎｇ／ｍＬ
を明らかにした。
Figure 2007526898
三匹のイヌ(８日目で最終投与の１時間後にサンプル採取した)からのＣＳＦの中のＦＧＬＬの平均レベルは、動物番号２番での４.１ｎｇ／ｍｌから動物番号３番での８.１ｎｇ／ｍｌまでの範囲であって、皮下投与後に、ＦＧＬＬのＣＮＳの中への浸透を指し示した。
実施例１０：インビトロでの配列番号２および配列番号５のペプチドフラグメントの作用
配列番号２のＥＦＬペプチドの個別のモノマーは、上で記述される実験のセットアップにおいてラット海馬ニューロンの神経突起成長を強力に刺激して、ラット小脳のニューロンの生存を刺激する能力がある(作用を図２７および図２８に対応して示す)。ＥＦＬペプチドは、ＮＣＡＭのＦｎ３,２モジュールに由来して、モジュールのＥ鎖−ループ−Ｇ鎖部分を表す。実験のために、ペプチドを上で記述されるように合成した。ペプチドの神経突起生成活性は、ペプチドによる刺激がＦＧＦＲ1の阻害剤、SU54402、により特異的にブロックされるので、ＦＧＦＲ１依存性である。ペプチドは、受容体を発現する細胞においてＦＧＦＲ１に結合して、それを刺激する能力がまたあって、そこではペプチドは、受容体のリン酸化を誘発する(２０μｇ／ｍｌの濃度で３００％以上だけ)。
ＦＧＦＲ1のリン酸化を以下のアッセイを用いて試験した。ラットのＦＧＦＲ１(IIIＣアイソフォーム)ためのｃＤＮＡを、ラットＰＣ１２細胞株から単離されたＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによりクローン化して、ｐｃＤＮＡ３.１(+)プラスミド(Invitrogen)の中に挿入したが、これはヘキサヒスチジンのＮ末端に融合したＦＧＦＲ１の発現を許容する。約８×１０５個のHEK293細胞を、完全培地(１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５８.４ｇ／ｌのGlutamaxで補足されたDMEM 1965)中で６０ｍｍプレートの中で２４時間培養して、次いで、LipofectAMIN PLUS[登録商標]試薬キットを用いて製造業者の指示書(Gibco BRL)にしたがって、０.２μｇのプラスミド(ＦＧＦＲ含有)でトランスフェクトした。細胞を完全培地の中でさらに２４時間増殖させて、次いで、飢餓培地(DMEM 1965)に一夜シフトした。ＦＧＦＲをトランスフェクトした細胞を、ＥＦＬモノマーで２０分間刺激し、８Ｍ尿度、１ｍＭのオルトバナジウム酸(ＰＢＳ中)の中で溶菌して、ヒスチジンタグを介して溶菌液から以下のように精製した：溶菌液をＮｉ２＋／ＮＴＡ-sepharose (Qiagen)の上に装填し、溶菌緩衝液プラス１０ｍＭのイミダゾールで洗浄して、ＦＧＦＲを溶菌緩衝液プラス２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。精製されたＦＧＦＲを、抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagn)もしくは抗ホスホチロシン抗体(ＰＹ２０、Transduction Laboratories)を用いるイムノブロッティングにより分析した。バンドを化学発光により視覚化させて、バンド密度をGeneGnome装置(SynGene)を用いて測定した。
軸索に関連する細胞接着分子[ＮＣＢＩ: NP_031544.1]の配列に由来するペプチドを、上で記述されるアッセイでまた試験した。選択されたペプチドは、Ｃ末端から切断された二つのアミノ酸を有する配列番号５に示される配列の１１−アミノ酸のフラグメントであった。ＦＧＬおよびＥＦＬペプチドと同様に、ペプチドは、インビトロでラット海馬ニューロンの神経突起成長の有意な刺激の能力があった。神経突起の長さにおいて５００％増加の最大作用が、ペプチドの０.３μｇ／ｍｌの濃度で観察された。
図１は、ＬＰＡ−型ＦＧＬダイマー(ＦＧＬＬ)の合成のフローチャートを示す。 図２は、ＦＧＬＬのＨＰＬＣ精製プロフィールを提示する。 図３は、ＦＧＬＤのＨＰＬＣ精製プロフィールを提示する。 図４は、種々の神経毒性薬剤で処理された一次ニューロンの生存へのＦＧＬペプチドの作用を立証する。 ポリ−Ｄ−リシンで被膜された２４−穴の培養プレート上で種々の濃度のペプチドの有無で六日間細胞１５０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖された１５日目のラットの胚からのドーパミン作動性ニューロン(ＤＮ)(ａおよびｂ)を、１００μＭの６−ＯＨＤＡに二時間露出した。培地を変更して、種々の濃度のＦＧＬｄを加えた。ニューロンを培養の以前にさらに２４時間増殖し、そしてそれらを固定して、チロシン水酸化酵素に対して免疫染色した。
１９日目のラットの胚からの海馬ニューロン(ＨＮ)(ｃおよびｄ)を、ポリ−Ｌ−リシンで被膜された８−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で細胞４０,０００個／ｃｍ２の密度で接種して、２０μＭのアミロイド−β２５〜３５ペプチド(Ａβ２５〜３５)を含有する培地の中で種々の濃度のＦＧＬｄの存在下に２４時間増殖した後に、それらを固定して、Hoechst 33258で染色した。
生後７日目のラットからの小脳の顆粒ニューロン(ＣＧＮ)(ｅおよびｆ)を、ポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で４０ｍＭのＫＣｌを含有する培地の中で７日間細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、次いで、種々の濃度のＦＧＬｄで補足された５ｍＭのＫＣｌを含有する培地へ置換した。二日のインキュベーションの後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。
(ａ)６−ＯＨＤＡで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの作用。
(ｂ)６−ＯＨＤＡで処理されたドーパミン作動性ニューロンの生存率への種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
(ｃ)Ａβ２５〜３５で処理された海馬培養物への５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦの作用。
(ｄ)Ａβ２５〜３５で処理された海馬ニューロンへの種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
(ｅ)高カリウムのニューロンを奪うことによりアポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物への５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１の作用。
(ｆ)アポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物への種々の濃度のＦＧＬｄの作用。
それぞれの型の培養物について少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ニューロンの総数に比較して、生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として表される。ＦＧＬの処理なしで細胞死を受けるように誘発された対照培養物は、１００％にセットされた。無処理の対照と比較したときには、＋ｐ＜０.０５、＋＋ｐ＜０.０１。細胞死を受けるように誘発された培養物と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図５は、高ＫＣl培地(４０ｍＭ)の中で六日間ニューロンを増殖した後で、低ＫＣl培地(５ｍＭ ＫＣl)へ培地を変えることによりアポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮ培養物の中でＤＮＡ−フラグメント化へのＦＧＬペプチドの作用を立証する。フラグメント化ＤＮＡを持つニューロンの数をApoAlertアポトーシス検出キットを用いて測定して、ＴＵＮＥＬ−陽性ニューロンのフラクションを計数により評価した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、低ＫＣlでの対照培養物を１００％にセットして、細胞の全数に比してＤＮＡ−フラグメント化を示す細胞の百分率±平均値の標準誤差として示される。(ａ)アポトーシスを受ける細胞の数への高ＫＣlのＣＧＮ培養物を奪うことの作用。(ｂ)アポトーシスで誘発されるＣＧＮ培養物の中でＦＧＬｄの作用。 低ＫＣlで処理されたＣＧＮ培養物と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図６は、Ｅｒｋ１／２のリン酸化へのＦＧＬの作用を示す。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞２９０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、引き続いてＦＧＬdで１０〜９０分間処理し、固定して、ホスホ−ｐ４２／４４に対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５および＊＊ｐ＜０.０１。
図７は、Ａｋｔのリン酸化へのＦＧＬの作用を示す。ＣＧＮをポリ−Ｌ−リシンで被膜されたマイクロタイタープレートの上で三日間細胞２９０,０００個／ｃｍ２の密度で増殖し、種々の濃度において１０〜３０分間それぞれ引き続いてＦＧＬＬで処理して、引き続いて固定して、Ｓｅｒ４７３の上でリン酸化されたＡｋｔに対する抗体で染色した。ニューロンの全数をクリスタルバイオレット染色を用いて評価した。少なくとも三つの独立した実験からの結果は、無処理の培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として表される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５。
図８は、アポトーシスを受けるように誘発されたＣＧＮのＦＧＬで誘発された生存率へのＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰｌ３Ｋの阻害剤の作用を示す。ＣＧＮを、細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度で七日間ポリ−Ｌ−リシンで被膜された８−穴のパーマノックススライドの上で４０ｍＭのＫＣｌを含有する培地の中で増殖した後で、培地をＦＧＬdと一緒に５ｍＭのＫＣｌを含有する培地に変えた。その後に、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９(●)、Ｐｌ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２(▲)およびＦＧＦＲ阻害剤ＳＵ５４０２(■)を種々の濃度で加えた。阻害剤の添加は、全ての場合で１０μｇ／ｍｌのＦＧＬdの添加により引き継がれた。ペプチドおよび阻害剤とのインキュベーションの二日後に、培養物を固定して、Hoechst 33258で染色した。少なくとも四つの個別の実験からの結果は、ＦＧＬdで処理した対照培養物を１００％にセットして、ニューロンの総数に比べて生存ニューロンの百分率±平均値の標準誤差として示される。
図９は、ドーパミン作動性の(●)、海馬の(▲)および小脳顆粒のニューロン(■)からの神経突起成長へのＦＧＬペプチドの作用を示す。細胞１００,０００個／ｃｍ２の密度でポリ−Ｄ−リシンで被膜された２４−穴の細胞培養プレートの上で種々の濃度のＦＧＬdで、ドーパミン作動性ニューロンを７２時間増殖した。培養物をチロシン水酸化酵素に対して引き続いて免疫染色した。海馬ニューロンおよびＣＧＮを細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で８−穴のパーマノックスチャンバースライドの上で平板培養して、種々の濃度のＦＧＬdの存在下に２４時間インキュベートした。引き続いて、ニューロンをＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。それぞれのニューロン培養物について少なくとも五つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１および＊＊＊ｐ＜０.００１。
図１０は、新生のラットからの海馬ニューロンの神経突起成長へのＦＧＬペプチドの三つのダイマー変種の作用を示す。細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で種々の濃度のＦＧＬＬ(■)、ＦＧＬｌｙｓ(▲)もしくはＦＧＬｃｙｓ(●)で、海馬ニューロンの一次培養物を２４時間増殖して、次いで、ＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、無処理の対照を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。対照と比較したときには、＊＊ｐ＜０.０１。
図１１は、ＣＧＮ培養物におけるＦＧＬで誘発された神経突起成長へのＦＧＦＲ、ＭＥＫおよびＰｌ３Ｋの阻害剤の作用を示す。細胞１０,０００個／ｃｍ２の密度で８−穴のパーマノックススライドの上でＦＧＬペプチドおよび阻害剤の存在で、ＣＧＮ培養物を２４時間増殖した。１２.５、２５および５０μＭの濃度で、同時に１０μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＰＤ９８０５９(●)を加えた；３.５、７および１０μＭの濃度で、同時に２７μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＬＹ２９４００２(▲)を加えた。２０、４０および８０μＭの濃度で、同時に２７μｇ／ｍｌのＦＧＬdと共に、ＳＵ５４０２(■)を加えた。処理後に、細胞を固定して、ＧＡＰ−４３に対して免疫染色した。少なくとも四つの独立した実験からの結果は、ＦＧＬｄで処理した対照培養物を１００％にセットして、百分率±平均値の標準誤差として示される。破線は、ＦＧＬdの処理なしの培養物における平均の神経突起長を指し示す。ＦＧＬdで処理した対照と比較したときには、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１。
図１２は、Ｅ１９ラットからの海馬ニューロンの一次培養物のＦＭ１−４３脱染色の速度へのＦＧＬd、ＦＧＬ対照およびビークルの作用を示す。それぞれの値は、４〜８回の実験の平均を表して、誤差の棒は平均値の標準誤差を指し示す。任意の期間の間で５μｇ／ｍｌのＦＧＬdでの処理、もしくは２４時間で２０μｇ／ｍｌでの処理のいずれも、ＦＭ１−４３の取り除きの速度へ如何なる作用も有しなかった。対照的に、１時間および４８時間で２０μｇ／ｍｌのＦＧＬdで処理された培養物の中のシナプシスは、対照培養物と比較するときに、ＦＭ１−４３の取り除きの著しく増加した速度を示して、これらの培養物における増大されたシナプス前の応答を指し示した。値を不対ｔ検定を用いて比較した。＊ｐ＝０.０４(１時間)および＊＊ｐ＝０.００３２(４８時間)。ＦＧＬ対照は、配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＡＡＧＫＳＫＡ(配列番号：１４７)から成る対照ペプチドである。ＦＧＬ配列のＧｌｎ残基のＡｌａへの変異は、ＦＧＬ活性を廃止すると示されてきている(Kiselyov et al. 2003、上の引用を参照)。
図１３は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントの脳室内(ｉ.ｃ.ｖ)の注射により誘発されたラットの記憶(社会的認識試験)へのＦＧＬＬ、ＦＧＬＤおよびＦＧＬ対照の初期後頭下方投与の作用を立証する。結果は、その中でラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬの後頭下方投与がＡ−βで誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目に為された実験からである。社会的認識試験を(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ投与後の２１日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は４〜２２匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,２７)＝１５.４、ｐ＜０.００１)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な作用が、Ａ−β／Ｖ群と比較して対照およびＶ／Ｖで処理した群の間にまた観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。‘Ｖ／Ｖ'は、Ａ−βおよびＦＧＬの交換としてビークルを受領したラットを意味する。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。
図１４は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬ)のｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷の形成への(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目のＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は３〜１３匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１８)＝５.２、ｐ＝０.０１６)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊ｐ＜０.０５および＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０５)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１５は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬ)のｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの海馬のＣＡ３区域の中のアミロイド負荷の形成への(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目のＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。群中の動物の数は２〜１２匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１５)＝９.５４、ｐ＝０.００２)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１６は、その中で認知障害が(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.の注射により誘発されたラットの海馬でのニューロン死へのＦＧＬＬおよびＦＧＬｄの初期後頭下方投与の作用を示す。(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された毒性後の７、１０、および１３日目に後頭下方に投与された、ラット当りの投与当り５.０μｇのＦＧＬのラットの海馬のＣＡ３区域の中のニューロン細胞死への作用。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(３,１７)＝１３.７６、ｐ＜０.００１)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１７は、社会的認識試験において(２５〜３５)β−アミロイドフラグメント(Ａ−β)で誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)の作用を立証する。社会的認識試験をＡ−βフラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の４４日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は４〜５匹で変動した。結果を不対ｔ検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。短期間記憶の有意な障害がＡ−βでの処理により誘発された(ｐ＜０.０５、対照およびＡ−β／Ｖの間の不対ｔ検定)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１８は、Ａ−βフラグメントで誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)のラットの帯状回皮質の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は３〜１３匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,１２)＝１８.６、ｐ＝０.００２)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Bonferroniの多重比較検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、Ｖ／Ｖで処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図１９は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントで誘発された神経毒性後の３０、３３、および３６日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)のラットの海馬のＣＡ３区域の中のアミロイド負荷への作用を示す。群中の動物の数は３〜５匹で変動した。結果を一元配置分散分析法(Ｆ(２,９)＝１０.６、ｐ＝０.００４)を用いて解析し、そして結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５(＊＊＊ｐ＜０.００１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.０１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２０は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントで誘発された毒性後の７、１０、および１３日目に後頭下方に投与された５.０μｇのＦＧＬＬ(ラット当りの投与当り)の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。一元配置分散分析法(Ｆ(２,９)＝２６.９；ｐ＜０.００１、Newman-Keuls事後検定：対照群と比較されたＡ−β／Ｖ(＊＊＊ｐ＜０.００１))を用いて、結果を解析して、Ａ−β／ＦＧＬＬで処理した群(＊＊ｐ＜０.０１)と比較した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖ群と比較するとき(Newman-Keuls事後検定)、０.０５以下のｐ−値を達成することを条件としていた。統計的に有意な相違が、対照で処理した群およびＡ−β／Ｖで処理した群の間に観察された(ｐ＜０.００１)。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２１は、社会的認識試験において(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ラット当りビークル、２００μｇのＦＧＬＬ、および４００μｇのＦＧＬＬの三つの鼻腔内投与の作用を示す。社会的認識試験を(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)フラグメントのｉ.ｃ.ｖ.投与後の２１日目に実施して、成熟ラットが第一(Ｔ１)のおよび第二(Ｔ２)の出会いの間に幼若ラットを探索することに費やされた時間の間の比率として評価した。群中の動物の数は３〜８匹で変動した。結果は平均±平均値の標準誤差として示されて、不対ｔ検定(対照対Ａ−β／Ｖのｐ＜０.０１)および一元配置分散分析法(Ｆ(２,１９)＝５.６；ｐ＝０.０１；Newman-Keuls事後検定、Ａ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、４００のｐ＜０.０５；およびＡ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５；一方ではＡ−β／ＦＧＬＬ、４００対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５)により解析した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖで処理した群と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２２は、(２５〜３５)β−アミロイド(Ａ−β)のｉ.ｃ.ｖ.投与後の７、１０および１３日目に、ラット当りビークル、２００μｇのＦＧＬＬ、および４００μｇのＦＧＬＬの三つの鼻腔内投与の帯状回皮質の中のニューロン細胞死への作用を示す。群中の動物の数は４〜８匹で変動した。結果を不対ｔ検定(対照群対Ａ−β／Ｖで処理した群(ｐ＜０.０１)の)ならびに一元配置分散分析法(Ｆ(２,１６)＝８.６；ｐ＝０.０３、Newman-Keuls事後検定：Ａ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、４００の＊＊ｐ＜０.０１およびＡ−β／Ｖ対ＦＧＬＬ、２００のｐ＜０.０５と共に)を用いて解析した。結果の有意性は、Ａ−β／Ｖで処理した群と比較するとき、０.０５(＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。
図２３は、オープンフィールド試験において立ち上がり活性について試験されたラットへの５.９μｇのＦＧＬｄの投与の作用を示す。 (２５〜３５)β−アミロイドフラグメントで誘発された神経毒性後の７、１０、および１３日目に、ペプチドを後頭下方に適用した。数の‘１'、‘２'、および‘３'は、測定の期間を指し示す：‘１'は１〜３分を指して、‘２'は８〜１０分を指して、そして‘３'は１８〜２０分を指す。‘Ｖ／Ｖ'は、ラットが(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびＦＧＬｄの交換としてビークルを受領したことを指し示す。群中の動物の数は９〜１１匹で変動した。‘Ａ−β'および‘Ｖ'は、それぞれ、(２５〜３５)β−アミロイドフラグメントおよびビークルの略語である。結果を不対ｔ検定を用いて解析し、そして結果の有意性は、第一の測定期間(１〜３分)と比較するとき、０.０５(＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１)以下のｐ−値を達成することを条件としていた。
図２４は、ＰＮＤ１、２、および３での子当り２.６μｇのＦＧＬＬ、ＦＧＬｄもしくはＦＧＬ対照の鼻腔内投与の後に、ＰＮＤ４でのラットの子による平面立ち直り反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(Ｆ＝４.０５、ｐ＝０.０３９)を用いて解析し、そしてNewman-Keuls検定は、対照のおよびＦＧＬ対照の群と比較するとき、ＦＧＬＬ(ｐ＜０.０５)およびＦＧＬｄ(ｐ＜０.０５)の統計的に有意な作用を示した。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。
図２５は、ＰＮＤ１、２、および３での子当り２.６μｇのＦＧＬＬ、ＦＧＬｄもしくはＦＧＬ対照の鼻腔内投与の後で、ＰＮＤ６およびＰＮＤ９でのラットの子による背地走行反射試験の能力の結果を示す。それぞれの処理群の同腹子の数は六であった。結果を一元配置分散分析法(ＦＰＮＤ６＝５.１４；、ＰＰＮＤ６＝０.００８)を用いて解析した。ＰＮＤ６では、ＦＧＬＬ(＊ｐ＜０.０５)のおよびＦＧＬｄ(＊＊ｐ＜０.０１)の群について、対照のおよびＦＧＬｃ(ＦＧＬ対照)の群と比較するとき、統計的に有意な作用が観察された。ＰＮＤ９では、ＦＧＬの有意な作用は何も観察されなかった(一元配置分散分析法：ＦＰＮＤ９＝０.９４；、ＰＰＮＤ９＝０.４４)。ＦＧＬ対照は上で規定されるようである。 図２６は、インビボ試験の時間経過の図式的提示を示す。
図２７は、低ＫＣｌ濃度でのラットの小脳の顆粒ニューロンの培養物における配列番号２(ＥＦループ)のペプチドの生存作用を示す。対照細胞を、同一の培養条件でインスリン成長因子１(ＩＧＦ−１)で処理した。
図２８は、インビトロでのラット海馬ニューロンへのＥＦＬペプチド(配列番号２)の神経突起生成作用を示す。ＥＦＬで処理した培養物の中の神経突起の長さをビークル(リン酸塩緩衝食塩水)で処理した培養物の中の神経突起の長さと比較する。

Claims (34)

  1. 二つの個別なペプチド配列を含む化合物であって、二つの配列の少なくとも一つが式
    Ｌ１-Ａ-Ｌ２-Ｂ-Ｌ３-Ｃ-Ｌ４-Ｄ-Ｌ５
    〔式中、
    Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは疎水性アミノ酸残基から選択されて、
    Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは塩基性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
    Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つは酸性アミノ酸残基、ＡｓｎもしくはＧｌｎから選択されて、
    Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの一つはＧｌｙもしくはＡｌａであり、そして
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は化学結合もしくはｎ個のアミノ酸残基(そこでは、ｎは０〜５の整数である)を有するアミノ酸配列から選択される〕の配列を含み、
    そこでは、
    当該ペプチド配列は式
    Ｘ[(Ａ)ｎＣＯＯＨ][(Ｂ)ｍＣＯＯＨ]
    〔ｎおよびｍは独立して１〜２０の整数であり、
    ＸはＨＮ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐＣＲ、[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ]ＣＲ(ＣＲ２)ｐＣＲ、Ｈ２Ｎ(ＣＲ２)ｐ、ＲＨＮ(ＣＲ２)ｐ、ＨＯ(ＣＲ２)ｐ、ＨＳ(ＣＲ２)ｐ、ハロゲン−(ＣＲ２)ｐ、ＨＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＲＯＯＣ(ＣＲ２)ｐ、ＨＣＯ(ＣＲ２)ｐ、ＲＣＯ(ＣＲ２)ｐ、もしくは[ＨＯＯＣ(Ａ)ｎ][ＨＯＯＣ(Ｂ)ｍ](ＣＲ２)ｐ、(式中、ｐは０もしくは１〜２０の整数である)であり、
    ＡおよびＢは独立して置換のもしくは未置換のＣ１〜１０アルキル、置換のもしくは未置換のＣ２〜１０アルケニル、置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは置換のもしくは未置換の環状部分、置換のもしくは未置換の複素環式部分、または置換のもしくは未置換の芳香族部分を一緒に形成する)〕のリンカーを通してお互いに接合される、化合物。
  2. 二つのペプチド配列の少なくとも一つが機能性の細胞表面受容体に結合する能力がある、請求項１に記載の化合物。
  3. 請求項２に記載の化合物であって、機能性の細胞表面受容体がＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４、もしくはそれらの機能性の同族体を含む繊維芽細胞成長因子受容体(ＦＧＦＲ類)のファミリーから選択される受容体である、化合物。
  4. 請求項２に記載の化合物であって、二つのペプチド配列の少なくとも一つが細胞接着分子、細胞の表面受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および金属プロテアーゼ、細胞外マトリックス分子もしくは成長因子を含む群から選択されるポリペプチドの配列に由来する、化合物。
  5. 細胞接着分子が、
    ―神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１３５９１、Ｐ１３５９５−０１、Ｐ１３５９５)、
    ―神経細胞接着分子Ｌ１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＱ７、Ｑ９ＱＹ３８、Ｐ１１６２７、Ｑ０５６９５、Ｐ３２００４)、
    ―神経細胞接着分子−２(ＮＣＡＭ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３６３５５)、
    ―神経−グリア細胞接着分子(Ｎｇ−ＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０３６９６；Ｑ９０９３３)、
    ―神経細胞接着分子ＣＡＬＬ(Swiss-Prot受託番号：Ｏ００５３３)、
    ―ニューログリアン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９１７６７、Ｐ２０２４１)、
    ―Ｎｒ−ＣＡＭ(ＨＢＲＡＶＯ、ＮＲＣＡＭ、ＮＲ−ＣＡＭ１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８２３、Ｏ１５１７９、Ｑ９ＱＶＮ３)、
    ―アクソニン−１／ＴＡＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０２２４６、Ｐ２２０６３、Ｐ２８６８５)、
    ―軸索に関連する細胞接着分子(ＡｘＣＡＭ)(NCBI Ass. 番号：ＮＰ＿０３１５４４.１；Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＣ３５)、
    ―ミエリンに関連する糖タンパク質(ＭＡＧ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２０９１７)、
    ―神経細胞接着分子ＢＩＧ−１(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２６８２)、
    ―神経細胞接着分子ＢＩＧ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６２８４５)、
    ―ファシクリン(ＦＡＳ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２２６４８)、
    ―神経細胞接着分子ＨＮＢ−３／ＮＢ−３(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＱ５２、Ｐ９７５２８、Ｑ９ＪＭＢ８)、
    ―神経細胞接着分子ＨＮＢ−２／ＮＢ−２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９４７７９、Ｐ０７４０９、Ｐ９７５２７)、
    ―カドヘリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＶＷ７１)、
    ―接合部接着分子−１(ＪＡＭ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＫＤ５、Ｏ８８７９２)、
    ―神経細胞接着Ｆ３／Ｆ１１(コンタクチン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３１９８、Ｐ１２６０、Ｑ１２８６０、Ｑ２８１０６、Ｐ１４７８１、Ｏ９３２５０)、
    ―ニューロファシン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９０９２４、Ｑ９１Ｚ６０；Ｏ４２４１４)、
    ―Ｂ−リンパ球細胞接着分子ＣＤ２２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｒ０９４、Ｐ２０２７３)、
    ―ネオゲニン(ＮＥＯ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２８５９、Ｐ９７６０３、Ｑ９０６１０、Ｐ９７７９８)、
    ―細胞内細胞接着分子−５(ＩＣＡＭ−５／テレンセファリン)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＴＡＭ９、Ｑ６０６２５)もしくは
    ―ガラクトース結合レクチン−１２(ガレクチン−１２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＶＤ１、Ｑ９ＪＫＸ２、Ｑ９ＮＺ０３)、
    ―ガラクトース結合レクチン−４(ガレクチン−４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｋ４１９；Ｐ３８５５２)、
    またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
    を含む群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  6. 細胞の表面受容体が、
    ―繊維芽細胞成長因子受容体１(ＦＧＦＲ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＺＭ７、Ｑ９９ＡＶＶ７、Ｑ９ＵＤ５０、Ｑ６３８２７)、
    ―繊維芽細胞成長因子受容体２(ＦＧＦＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＫＭ２、Ｐ２１８０２、Ｑ６３２４１)、
    ―繊維芽細胞成長因子受容体３(ＦＧＦＲ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５Ｍ１３、ＡＦ４８７５５４、Ｑ９９０５２)、
    ―繊維芽細胞成長因子受容体４(ＦＧＦＲ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１７４２)、
    ―２型ニューロトロフィンチロシンキナーゼ(ＮＴＲＫＴ−２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸＪ５)、
    ―白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ (ＬＡＲ−ＰＴＰＲＦ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＥＱ１７、Ｑ６４６０５、Ｑ６４６０４、Ｑ９ＱＷ６７、Ｑ９VIＳ８、Ｐ１０５８６)、
    ―ネフリン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９２５Ｓ５、Ｑ９ＪＩＸ２、Ｑ９ＥＴ５９、Ｑ９Ｒ０４４、Ｑ９ＱＺＳ７、Ｑ０６５００)、
    ―タンパク質−Ｓ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＳ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６４６９９、Ｑ１３３３２、Ｏ７５８７０)、
    ―タンパク質−カッパ型チロシンホスファターゼ受容体(Ｒ−ＰＴＰ−カッパ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５２６２)、
    ―タンパク質−Ｄ型チロシンホスファターゼ受容体(ＰＴＰＲＤ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＷＸ６５、Ｑ９ＩＡＪ１、Ｐ２３４６８、Ｑ６４４８７)、
    ―Ａ型エフリン受容体８(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＥＫ)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ０９１２７、Ｐ２９３２２)、
    ―Ａ型エフリン受容体３(ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＴＫ−１／ＣＥＫ４)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ２９３１８)、
    ―Ａ型エフリン受容体２(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｎ３Ｚ２)、
    ―インスリン受容体(ＩＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＰＷＮ６)、
    ―インスリン様受容体成長因子−１受容体(ＩＧＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＶＷ４、Ｐ０８０６９、Ｐ２４０６２、Ｑ６０７５１、Ｐ１５１２７、Ｐ１５２０８)、
    ―インスリン関連受容体(ＩＲＲ)(Swiss-Prot受託番号：Ｐ１４６１６)、
    ―チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ−１(Swiss-Prot受託番号：０６８０５、Ｐ３５５９０、Ｑ０６８０６)、
    ―ラウンドアバウト受容体−１(ｒｏｂｏ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４４９２４、ＡＦ０４１０８２、Ｑ９Ｙ６Ｎ７)、
    ―ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体アルファ３サブユニット(ＣＨＲＮＡ３)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８ＶＨＨ６、Ｐ０４７５７、Ｑ８Ｒ４Ｇ９、Ｐ３２２９７)、
    ―ニューロンアセチルコリン受容体アルファ６サブユニット(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５８２５、Ｑ９Ｒ０Ｗ９)、
    ―血小版由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲＢ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ４０６、Ｑ０５０３０)、
    ―インターロイキン−６受容体(ＩＬ−６Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ００５６０)、
    ―インターロイキン−２３受容体(ＩＬ−２３Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ４６１４２２)、
    ―ＩＬ−３、ＩＬ５およびＧｍＣｓｆのベータ−共通サイトカイン受容体(Swiss-Prot受託番号：Ｐ３２９２７)、
    ―サイトカイン受容体様分子３(ＣＲＬＦ１)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＭ５８)、
    ―クラスＩサイトカイン受容体(ＺＣＹＴＯＲ５)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＵＨＨ５)、
    ―ネトリン−１受容体ＤＣＣ(Swiss-Prot受託番号：Ｐ４３１４６)、
    ―白血球Ｆｃ受容体様タンパク質(ＩＦＧＰ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９６ＰＪ６、Ｑ９６ＫＭ２)、
    ―マクロファージ捕捉剤受容体２(ＭＳＲ２)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９１ＹＫ７)、もしくは
    ―顆粒球コロニー刺激因子受容体(Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ)(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９９０６２)、
    またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
    を含む群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  7. ヘパラン硫酸プロテオグリカンがパーレカン(Swiss-Prot受託番号：Ｐ９８１６０)、またはそのフラグメント、もしくは変異体である、請求項４に記載の化合物。
  8. 金属プロテアーゼが、
    ―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ０５９１０)、
    ―ＡＤＡＭ−１９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ０１３、Ｏ３５６７４)、
    ―ＡＤＡＭ−８(Swiss-Prot受託番号：Ｐ７８３２５)、
    ―ＡＤＡＭ−１２(Swiss-Prot受託番号：Ｏ４３１８４、Ｑ６１８２４)、
    ―ＡＤＡＭ−２８(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＪＬＮ６、Ｑ６１８２４、Ｑ９ＸＳＬ６、Ｑ９ＵＫＱ２)、
    ―ＡＤＡＭ−３３前駆体(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３、Ｑ９２３Ｗ９)、
    ―ＡＤＡＭ−９(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１３４３３、Ｑ６１０７２)、
    ―ＡＤＡＭ−７(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｏ３５２２７、Ｑ６３１８０)、
    ―ＡＤＡＭ−１Ａフェルチリンアルファ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ８Ｒ５３３)、
    ―ＡＤＡＭ−１５(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９ＱＹＶ０、Ｏ８８８３９、Ｑ１３４４４)、
    ―金属プロテイナーゼ−デスインテグリンドメイン含有タンパク質(ＴＥＣＡＭ)(Swiss-Prot受託番号：ＡＦ１６３２９１)、
    ―金属プロテイナーゼ１(Swiss-Prot受託番号：Ｏ９５２０４、Ｑ９ＢＳＩ６)、
    またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
    を含む群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  9. 細胞外マトリックス分子が、
    ―VII型コラーゲン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ６３８７０)、
    ―フィブロネクチン(Swiss-Prot受託番号：Ｑ９５ＫＶ４、Ｑ９５ＫＶ５、Ｐ０７５８９、Ｑ２８３７７、Ｕ４２５９４、Ｏ９５６０９、Ｐ１１２７６)、もしくは、
    ―テネイシン−Ｒ(Swiss-Prot受託番号：Ｑ１５５６８、Ｏ００５３１、Ｑ９０９９５、Ｐ１００３９)、
    またはそれらのフラグメント、もしくは変異体、
    を含む群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  10. 成長因子がサイトカイン様因子−１(ＣＬＦ−１)(Swiss-Prot受託番号：Ｏ７５４６２)、またはそのフラグメント、もしくは変異体である、請求項４に記載の化合物。
  11. 二つのペプチド配列の少なくとも一つが、
    ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)、
    ＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)、
    ＡＴＮＲＱＧＫＶＫＡＦＡＨＬ(配列番号３)、
    ＲＹＶＥＬＹＶＶＡＤＳＱＥＦＱＫ(配列番号４)、
    ＶＡＥＮＳＲＧＫＮＶＡＫＧ(配列番号５)、
    ＧＥＹＷＣＶＡＥＮＱＹＧＱＲ(配列番号６)、
    ＲＬＡＡＬＮＧＫＧＬＧＥＩＳ(配列番号７)、
    ＫＹＩＡＥＮＭＫＡＱＮＶＡＫＥＩ(配列番号８)、
    ＴＩＭＧＬＫＰＥＴＲＹＡＶＲ(配列番号９)、
    ＫＧＬＧＥＩＳＡＡＴＥＦＫＴ(配列番号１０)、
    ＮＭＧＩＷＶＱＡＥＮＡＬＧ(配列番号１１)、
    ＩＷＶＱＡＥＮＭＬＧ(配列番号１２)、
    ＥＩＷＶＥＡＴＮＲＬＧ(配列番号１３)、
    ＶＷＶＱＡＡＮＡＬＧ(配列番号１４)、
    ＥＶＷＩＥＫＤＰＡＫＧＲＩ(配列番号１５)、
    ＡＴＮＫＧＧＥＶＫＫＮＧＨＬ(配列番号１６)、
    ＫＹＶＥＬＹＬＶＡＤＹＬＥＦＱＫ(配列番号１７)、
    ＲＹＶＥＬＹＶＶＶＤＮＡＥＦＱ(配列番号１８)、
    ＫＹＶＥＬVIＶＡＤＮＲＥＦＱＲ(配列番号１９)、
    ＫＹＩＥＹＹＬＶＬＤＮＧＥＦＫＲ(配列番号２０)、
    ＲＹＬＥＬＹＩＶＡＤＨＴＬＦ(配列番号２１)、
    ＫＹＶＥＭＦＶＶＶＮＨＱＲＦＱ(配列番号２２)、
    ＲＹＶＥＬＦＩＶＶＤＫＥＲＹ(配列番号２３)、
    ＫＹＶＥＬＦＩＶＡＤＤＴＶＹＲＲ(配列番号２４)、
    ＫＦＩＥＬＦＶＶＡＤＥＹＶＹＲＲ(配列番号２５)、
    ＫＩＶＥＫVIＶＡＤＮＳＥＶＲＫ(配列番号２６)、
    ＶＥＬVIＶＡＤＨＳＥＡＱＫ (配列番号２７)、
    ＶＡＥＮＳＲＧＫＮＩＡＫＧ(配列番号２８)、
    ＩＡＥＮＳＲＧＫＮＶＡＲＧ(配列番号２９)、
    ＡＥＮＳＲＧＫＮＳＦＲＧ(配列番号３０)、
    ＩＡＳＮＬＲＧＲＮＬＡＫＧ(配列番号３１)、
    ＩＰＥＮＳＬＧＫＴＹＡＫＧ(配列番号３２)、
    ＩＡＥＮＭＫＡＱＮＥＡＫ(配列番号３３)、
    ＱＦＩＡＥＮＭＫＳＨＮＥＴＫＥＶ(配列番号３４)、
    ＧＥＹＷＣＶＡＫＮＲＶＧＱ(配列番号３５)、
    ＧＳＹＴＣＶＡＥＮＭＶＧＫ(配列番号３６)、
    ＧＫＹＶＣＶＧＴＮＭＶＧＥＲ(配列番号３７)、
    ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＥＹＧ(配列番号３８)、
    ＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧ(配列番号３９)、
    ＱＹＹＣＶＡＥＮＧＹＧ(配列番号４０)、
    ＧＥＹＹＱＥＡＥＱＮＧＹＧ(配列番号４１)、
    ＧＮＹＴＣＬＶＥＮＥＹＧ(配列番号４２)、
    ＧＭＹＱＣＬＡＥＮＡＹＧ(配列番号４３)、
    ＧＭＹＱＣＡＥＮＴＨＧ(配列番号４４)、
    ＧＩＹＹＣＬＡＳＮＮＹＧ(配列番号４５)、
    ＧＧＹＹＣＴＡＤＮＳＹＧ(配列番号４６)、
    ＧＥＹＱＣＦＡＲＮＤＹＧ(配列番号４７)、
    ＧＥＹＦＣＬＡＳＮＫＭＧ(配列番号４８)、
    ＧＥＹＱＣＦＡＲＮＫＦＧ(配列番号４９)、
    ＧＥＹＦＣＬＡＳＮＫＭＧ(配列番号５０)、
    ＧＧＹＹＣＴＡＤＮＮＹＧ(配列番号５１)、
    ＧＮＹＳＣＥＡＥＮＡＷＧＴＫ(配列番号５２)、
    ＧＥＹＴＣＬＡＥＮＳＬＧ(配列番号５３)、
    ＧＥＹＥＣＶＡＥＮＧＲＬＧ(配列番号５４)、
    ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＫＦＧＲ(配列番号５５)、
    ＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧ(配列番号５６)、
    ＧＥＹＦＣＶＡＳＮＰＩＧ(配列番号５７)、
    ＥＹＴＣＩＡＮＮＱＡＧＥ(配列番号５８)、
    ＧＭＹＱＣＶＡＥＮＫＨＬＧ(配列番号５９)、
    ＧＥＹＭＣＴＡＳＮＴＩＧＱ(配列番号６０)、
    ＥＹＶＣＩＡＥＮＫＡＧＥＱ(配列番号６１)、
    ＧＤＹＴＬＩＡＫＮＥＹＧＫ(配列番号６２)、
    ＧＦＹＱＣＶＡＥＮＥＡＧ(配列番号６３)、
    ＧＫＹＥＣＶＡＴＮＳＡＧＴＲ(配列番号６４)、
    ＧＥＹＦＣＶＹＮＮＳＬＧ(配列番号６５)、
    ＧＥＹＥＣＡＡＴＮＡＨＧＲ(配列番号６６)、
    ＧＡＹＷＣＱＧＴＮＳＶＧＫ(配列番号６７)、
    ＧＴＹＳＣＶＡＥＮＩＬＧ(配列番号６８)、
    ＲＶＡＡＶＮＧＫＧＱＧＤＹＳ(配列番号６９)、
    ＲＶＡＡＩＮＧＣＧＩＧＰＦＳ(配列番号７０)、
    ＡＶＬＮＧＫＧＬＧ(配列番号７１)、
    ＡＬＮＧＱＧＬＧＡＴＳ(配列番号７２)、
    ＲＬＡＡＫＮＲＡＧＬＧＥ(配列番号７３)、
    ＲＬＧＶＶＴＧＫＤＬＧＥＩ(配列番号７４)、
    ＴＶＴＧＬＫＰＥＴＳＹＭＶＫ(配列番号７５)、
    ＴＬＴＧＬＫＰＳＴＲＹＲＩ(配列番号７６)、
    ＴＬＴＧＬＱＰＳＴＲＹＲＶ(配列番号７７)、
    ＴＬＬＧＬＫＰＤＴＴＹＤＩＫ(配列番号７８)、
    ＴＬＱＧＬＲＰＥＴＡＹＥＬＲ(配列番号７９)、
    ＴＬＲＧＬＲＰＥＴＡＹＥＬＲ(配列番号８０)、
    ＴＬＭＮＬＲＰＫＴＧＹＳＶＲ(配列番号８１)、
    ＴＶＳＧＬＫＰＧＴＲＹ(配列番号８２)、
    ＴＩＳＧＬＫＰＤＴＴＹ(配列番号８３)、
    ＴＬＱＧＬＫＰＤＴＡＹ(配列番号８４)、
    ＬＲＧＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号８５)、
    ＩＤＧＬＥＰＤＴＥＹＩＶＲ(配列番号８６)、
    ＬＱＧＬＫＰＷＴＱＹＡＩ(配列番号８７)、
    ＴＩＴＧＬＥＰＧＴＥＹＴＩＱ(配列番号８８)、
    ＧＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号８９)、
    ＴＬＡＳＬＫＰＷＴＱＹＡＶ(配列番号９０)、
    ＬＭＧＬＱＰＡＴＥＹＩＶ(配列番号９１)、
    ＫＧＭＧＰＭＳＥＡＶＱＦＲＴ(配列番号９２)、
    ＴＬＴＧＬＫＰＤＴＴＹＤＶＫ(配列番号９３)、
    ＩＳＧＬＱＰＥＴＳＹＳＬ(配列番号９４)、
    ＴＬＬＧＬＫＰＤＴＴＹＤＩＫ(配列番号９５)、
    ＴＩＳＧＬＴＰＥＴＴＹＳＩ(配列番号９６)、
    ＧＮＹＳＣＬＡＥＮＲＬＧＲ(配列番号９７)、
    ＧＮＹＴＣＶＶＥＮＲＶＧ(配列番号９８)、
    ＧＴＹＨＣＶＡＴＮＡＨＧ(配列番号９９)、
    ＬＳＨＮＧＶＬＴＧＹＬＬＳＹ(配列番号１００)、
    ＮＧＶＬＴＧＹＶＬＲＹ(配列番号１０１)、
    ＮＧＶＬＴＧＹＮＬＲＹ(配列番号１０２)、
    ＮＧＮＬＴＧＹＬＬＱＹ(配列番号１０３)、
    ＶＤＥＮＧＶＬＴＧＹＫＩＹＹ(配列番号１０４)、
    ＴＨＮＧＡＬＶＧＹＳＶＲＹ(配列番号１０５)、
    ＮＧＩＬＴＥＹＩＬＫＹ(配列番号１０６)、
    ＮＧＩＬＩＧＹＴＬＲＹ(配列番号１０７)、
    ＴＨＳＧＱＩＴＧＹＫＩＲＹ(配列番号１０８)、
    ＮＧＫＩＴＧＹIIＹＹ(配列番号１０９)、
    ＬＳＨＮＧＩＦＴＬＹ(配列番号１１０)、
    ＮＧＩＬＴＥＹＴＬＫＹ(配列番号１１１)、
    ＬＤＰＮＧIIＴＱＹＥＩＳＹ(配列番号１１２)、
    ＮＧＫＩＴＧＹIIＹＹ (配列番号１１３)、
    ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＧＰＡ(配列番号１１４)、
    ＨＬＴＶＲＡＹＮＧＡＧＹＧＰ(配列番号１１５)、
    ＨＬＳＶＫＡＹＮＳＡＧＴＧＰＳ(配列番号１１６)、
    ＨＬＡＶＫＡＹＮＳＡＧＴＧＰＳ(配列番号１１７)、
    ＮＬＥＶＲＡＦＮＳＡＧＤＧＰ(配列番号１１８)、
    ＨＬＴＶＬＡＹＮＳＫＧＡＧＰ(配列番号１１９)、
    ＬＲＶＬＶＦＮＧＲＧＤＧＰ(配列番号１２０)、
    ＨＩＤＶＳＡＦＮＳＡＧＹＧＰ(配列番号１２１)、
    ＨＬＡＶＥＬＦＮＧＲ(配列番号１２２)、
    ＬＥＬＱＳＩＮＦＬＧＧＱＰＡ(配列番号１２３)、
    ＨＦＴＶＲＡＹＮＧＡＧＹＧＰ(配列番号１２４)、
    ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＱＰＡ(配列番号１２５)、
    VIＡＤＱＰＴＦＶＫＹＬＩＫ(配列番号１２６)、
    ＴＩＫＧＬＲＰＧＶＶＹＥＧＱ(配列番号１２７)、
    ＴＬＴＥＬＳＰＳＴＱＹＴＶＫ(配列番号１２８)、
    ＴＬＤＤＬＡＰＤＴＴＹＬＶＱ(配列番号１２９)、
    ＴＶＳＤＶＴＰＨＡＩＹＴＶＲ(配列番号１３０)、
    IIＲＧＬＮＡＳＴＲＹＬＦＲ(配列番号１３１)、
    ＴＬＭＮＬＲＰＫＴＧＹＳＶＲ(配列番号１３２)、
    ＴＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＶＲ(配列番号１３３)、
    ＧＰＥＨＬＭＰＳＳＴＹＶＡＲ(配列番号１３４)、
    ＲＶＴＧＬＴＰＫＫＴＹＥＦＲ(配列番号１３５)、
    ＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＥＦＲ(配列番号１３６)、
    ＥＶＲＶＱＡＶＮＧＧＧＮＧＰＰ(配列番号１３７)、
    ＬＩＫＶＶＡＩＮＤＲＧＥ(配列番号１３８)、
    ＶＶＳIIＡＶＮＧＲＥＥ(配列番号１３９)、
    ＶＶＳＶＹＡＱＮＱＮＧＥ(配列番号１４０)、
    ＴＩＳＬＶＡＥＫＧＲＨＫ(配列番号１４１)、
    ＨＬＥＶＱＡＦＮＧＲＧＳＧＰＡ(配列番号１４２)、
    ＨＶＥＶＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰＡ(配列番号１４３)、
    ＨＶＥＶＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰＡ(配列番号１４４)、
    ＥＦＲＶＲＡＶＮＧＡＧＥＧ(配列番号１４５)、もしくは
    ＶＡＲＶＲＴＲＬＡＰＧＳＲＬＳ(配列番号１４６)、または
    またはそのフラグメント、もしくは変異体、もしくは同族体、
    から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドフラグメントである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
  12. 二つのペプチド配列の少なくとも一つが配列番号１(ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ)、または当該配列のフラグメント、変異体、もしくは同族体である、請求項１〜１０に記載の化合物。
  13. 配列番号１の変異体もしくは同族体が配列番号２〜９、１００もしくは１２５から選択される、請求項１２に記載の化合物。
  14. 二つのペプチド配列の少なくとも一つが配列番号２(ＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ)、または当該配列のフラグメント、変異体、もしくは同族体である、請求項１〜１０に記載の化合物。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物であって、化合物が異なるアミノ酸配列を含む二つの個別なペプチドフラグメントを含んで、当該異なるアミノ酸配列は請求項１１に記載のペプチドフラグメントのいずれかから選択される、化合物。
  16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物であって、化合物が同一のアミノ酸配列を含む二つのペプチドフラグメントを含んで、当該アミノ酸配列は請求項１１に記載のペプチドフラグメントのいずれかから選択される、化合物。
  17. ペプチドフラグメントが配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)を独立して有している、請求項１６に記載の化合物。
  18. ペプチドフラグメントが配列ＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)を独立して有している、請求項１６に記載の化合物。
  19. 二つのペプチドフラグメントの一つが配列ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ(配列番号１)を有していて、他のものが配列ＮＩＥＶＷＶＥＡＥＮＡＬＧＫＫＶ(配列番号２)を有している、請求項１５に記載の化合物。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物であって、当該化合物が、
    (ａ)望ましい配列(複数を含む)を含むリガンドを固相合成もしくはフラグメントカップリングにより提供することで、リガンドは固相に付着されている；
    (ｂ)もし必要ならば、リガンド(複数を含む)は固相に付着されたままで、任意のＮ−末端アミノ酸を脱保護すること、
    (ｃ)環構造を有する構成体を提供するように、保護されていないＮ−末端基を有するリガンド(複数を含む)をアキラルなジ−、トリ−、もしくはテトラカルボン酸と反応させること、および
    (ｄ)遊離のＣ−末端基を有するリガンドを含むＬＰＡを提供するように、構成体を固相から切断すること
    の工程を含む請求項１１に記載の配列(複数を含む)の提示を可能にするＬＰＡを作製するための方法により得られている、化合物。
  21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
  22. 術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病に関連する中枢のおよび末梢の神経系の異常、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置のための；臓器移植後のような、または遺伝性のもしくは外傷性の萎縮性筋障害のような神経筋接合部の機能障害での異常を含む筋肉の疾患または状態の処置のための；または生殖腺の、Ｉ型およびII型糖尿病のような膵臓の、腎症のような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸管の、変性状態のような、種々の器官の疾患または状態の処置のための、医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  23. 術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば脳卒中に起因する虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発脳梗塞性痴呆のような痴呆症、硬化症、糖尿病に関連する神経変性、概日時計もしくは神経筋伝導に影響を及ぼす障害、ならびに統合失調症、躁うつ病のような、気分障害の処置のための医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  24. 創傷治癒の促進のための医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  25. がんの処置のための医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  26. がんが新血管新生を必要とする全ての型の固形腫瘍である、請求項２５に記載の使用。
  27. 急性心筋梗塞後の、もしくは血管新生後のような、心筋細胞死の予防のための医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  28. 血管再生のための医薬品の製造のために請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  29. 学習する能力ならびに／または短期のおよび／もしくは長期の記憶の刺激のための医薬品の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  30. 虚血による細胞死の予防のための医薬品の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  31. アルコール摂取による身体損傷の予防のための医薬品の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  32. プリオン病の処置のための医薬品の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  33. 請求項２２〜３１に規定されるように疾患もしくは状態の処置のための、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の医薬品または請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
  34. 処置を必要とする個体の処置の方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物、および／もしくは請求項２１に記載の医薬組成物、ならびに／または請求項２２〜３１に記載の医薬品を当該個体に投与する工程を含む、方法。
JP2006522236A 2003-08-07 2004-08-06 Ｌｐａを含む化合物 Pending JP2007526898A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200301141 2003-08-07
DKPA200400814 2004-05-25
PCT/DK2004/000527 WO2005014623A2 (en) 2003-08-07 2004-08-06 Compounds comprising lpa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007526898A true JP2007526898A (ja) 2007-09-20

Family

ID=34137357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006522236A Pending JP2007526898A (ja) 2003-08-07 2004-08-06 Ｌｐａを含む化合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20090105149A1 (ja)
EP (1) EP1660539B1 (ja)
JP (1) JP2007526898A (ja)
AT (1) ATE469921T1 (ja)
AU (1) AU2004263203A1 (ja)
BR (1) BRPI0413373A (ja)
CA (1) CA2534355A1 (ja)
DE (1) DE602004027508D1 (ja)
IL (1) IL173532A0 (ja)
MX (1) MXPA06001501A (ja)
WO (1) WO2005014623A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011504888A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ Ｎｃａｍ由来の新規ペプチド（ｆｇｌ）
JP2015520191A (ja) * 2012-06-05 2015-07-16 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｎｃａｍペプチド模倣体を用いた精神障害またはその症状を治療するための方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2457164A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Enkam Pharmaceuticals A/S Compounds capable of affecting differentiation, proliferation, regeneration, plasticity and survival of cells
JP2008501620A (ja) * 2003-09-30 2008-01-24 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ 細胞の生存、分化及び／又はシナプスの可塑性を調整する方法
WO2006002262A2 (en) 2004-06-21 2006-01-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genes and pathways differentially expressed in bipolar disorder and/or major depressive disorder
EP1951908B1 (en) 2005-11-12 2013-08-07 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression
CN101384542B (zh) 2006-02-14 2012-07-04 巴斯夫欧洲公司 由单乙二醇(meg)生产亚乙基胺和乙醇胺的方法
JP2009526785A (ja) 2006-02-14 2009-07-23 ウラディミール，ベレジン メタロチオネイン由来ペプチド断片
US7635790B2 (en) 2006-02-14 2009-12-22 Basf Se Method for producing ethylene amines and ethanol amines by the hydrogenating amination of monoethylene glycol and ammonia in the presence of a catalyst
WO2008082821A1 (en) * 2006-11-28 2008-07-10 University Of Southern California Method for promoting wound healing
WO2009100724A1 (en) * 2008-02-11 2009-08-20 Kobenhavns Universitet Novel peptide derived from ncam (bcl)
CA2774999A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
JP2016523125A (ja) 2013-05-30 2016-08-08 グラハム エイチ． クリーシー 局所神経性刺激
US11229789B2 (en) 2013-05-30 2022-01-25 Neurostim Oab, Inc. Neuro activator with controller
US11077301B2 (en) 2015-02-21 2021-08-03 NeurostimOAB, Inc. Topical nerve stimulator and sensor for bladder control
AU2017273857B2 (en) 2016-06-01 2021-08-19 Athira Pharma, Inc. Compounds
CA3082390C (en) 2017-11-07 2023-01-31 Neurostim Oab, Inc. Non-invasive nerve activator with adaptive circuit
JP2022538419A (ja) 2019-06-26 2022-09-02 ニューロスティム テクノロジーズ エルエルシー 適応回路を備えた非侵襲性神経活性化装置
CA3152451A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Michael Bernard Druke Non-invasive nerve activator with boosted charge delivery

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018791A1 (en) * 1998-09-29 2000-04-06 Statens Serum Institut Ligand presenting assembly (lpa), method of preparation and uses thereof
WO2001016166A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains, and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use
WO2002047719A2 (en) * 2000-12-12 2002-06-20 Enkam Pharmaceuticals A/S Survical promoting ncam binding and ncam ligand biding compounds
WO2003016351A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Enkam Pharmaceuticals A/S N - cam related compounds modulating cell groth
WO2003020749A2 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Enkam Pharmaceuticals A/S Ncam binding compounds
JP2007524566A (ja) * 2002-12-20 2007-08-30 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629291A (en) * 1992-01-31 1997-05-13 La Jolla Cancer Research Foundation Methods of modulating fibronectin extracellular matrix assembly
US5840689A (en) * 1993-10-29 1998-11-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for stimulating the regrowth of neurons
US5693488A (en) * 1994-05-12 1997-12-02 The Rockefeller University Transmembrane tyrosine phosphatase, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
US6576607B1 (en) * 1995-04-19 2003-06-10 Acorda Therapeutics Methods using CNS neurite outgrowth modulators
US6313265B1 (en) * 1995-07-24 2001-11-06 The Scripps Research Institute Neurite outgrowth-promoting polypeptides containing fibronectin type III repeats and methods of use
US7504490B1 (en) * 1998-10-16 2009-03-17 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Apergillus fumigatus for diagnostics and therapeutics
US7167819B1 (en) * 1999-05-26 2007-01-23 Chiron Corporation Method of determining the three-dimensional shape of a macromolecule
US6749850B1 (en) * 1999-08-18 2004-06-15 The General Hospital Corporation Methods, compositions and kits for promoting recovery from damage to the central nervous system

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018791A1 (en) * 1998-09-29 2000-04-06 Statens Serum Institut Ligand presenting assembly (lpa), method of preparation and uses thereof
WO2001016166A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains, and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use
WO2002047719A2 (en) * 2000-12-12 2002-06-20 Enkam Pharmaceuticals A/S Survical promoting ncam binding and ncam ligand biding compounds
WO2003016351A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Enkam Pharmaceuticals A/S N - cam related compounds modulating cell groth
WO2003020749A2 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Enkam Pharmaceuticals A/S Ncam binding compounds
JP2007524566A (ja) * 2002-12-20 2007-08-30 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011504888A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ Ｎｃａｍ由来の新規ペプチド（ｆｇｌ）
JP2015520191A (ja) * 2012-06-05 2015-07-16 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｎｃａｍペプチド模倣体を用いた精神障害またはその症状を治療するための方法
JP2018135387A (ja) * 2012-06-05 2018-08-30 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｎｃａｍペプチド模倣体を用いた精神障害またはその症状を治療するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1660539A2 (en) 2006-05-31
EP1660539B1 (en) 2010-06-02
WO2005014623A3 (en) 2005-09-09
AU2004263203A1 (en) 2005-02-17
US20090105149A1 (en) 2009-04-23
CA2534355A1 (en) 2005-02-17
MXPA06001501A (es) 2006-09-04
DE602004027508D1 (de) 2010-07-15
WO2005014623A2 (en) 2005-02-17
IL173532A0 (en) 2006-07-05
BRPI0413373A (pt) 2006-10-17
ATE469921T1 (de) 2010-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2007526898A (ja) Ｌｐａを含む化合物
JP5759379B2 (ja) ニューロテンシンまたはニューロテンシンアナログおよびその使用
CN101389648B (zh) 肽胃泌酸调节素衍生物
US10100100B2 (en) Metallothionein-derived peptide fragments
AU2005224027B2 (en) Y2/Y4 selective receptor agonists for therapeutic interventions
JP2009508886A (ja) 治療的介入のためのｙ２選択性レセプターアゴニスト
JP2012529272A (ja) Ｇｄｎｆおよびｂｄｎｆを中枢神経系へ送達するための融合タンパク質
JP2011528566A (ja) アンジオポエチン由来ペプチド
WO2005014623A9 (en) Compounds comprising lpa
ZA200607492B (en) Y2/Y4 selective receptor agonists for therapeutic interventions
WO2022117116A1 (zh) 一种α9α10nAChR抑制活性肽及其应用
MXPA06014804A (es) Peptidos de union del receptor del factor de crecimiento fibroblastico.
JP2002525102A (ja) Ｎｃａｍ結合化合物
AU2003288434B2 (en) Peptides, antibodies thereto, and their use in the treatment of central nervous system damage
US8470964B2 (en) Peptides derived from NCAM (FGLs)
US20100040623A1 (en) Neuritogenic and neuronal survival promoting peptides derived from the family of s-100 proteins
Niida et al. Antiobesity and emetic effects of a short-length peptide YY analog and its PEGylated and alkylated derivatives
WO2007110079A2 (en) Targeted delivery of fgfr ligands into the brain
ZA200601908B (en) Compounds comprising LPA
MXPA06014402A (es) Peptido de enlace a heparina.

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070802

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100525

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101019