JP2007526278A

JP2007526278A - 抗炎症剤としてのＦｃαＲＩ受容体の一価のリガンド

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Publication number: JP2007526278A
Application number: JP2007501248A
Authority: JP
Inventors: モンテイロ，レナト; パスキエ，ブノワ; ブランク，ウルリッチ; ベナム，マルク; ローネイ，ピエール; プレトラニ，マリナ
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2025-03-04
Also published as: DE602005025731D1; DK1720572T3; EP1570858A1; WO2005089798A1; EP1720572B1; JP4756029B2; US7892538B2; ES2359316T3; ATE494006T1; US20080085280A1; EP1720572A1

Abstract

本発明は、炎症性疾患の治療のための、FcαRI受容体のEC2ドメインに指向された一価の抗体断片の使用に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、FcαRI IgA受容体の一価のリガンドの、抗炎症剤としての使用に関する。

免疫グロブリンA (IgA)は、ヒトにおける最も異種性のIgアイソタイプであり、単量体、多量体及び分泌型IgAのような多様な分子の形で存在する。これは、2つのサブクラス、IgA1及びIgA2を含む。
血清中では、IgAは主に単量体の形で主に存在し、低いパーセンテージで多量体IgA (pIgA)が存在する。
粘膜分泌物（唾液、涙液、初乳、胃腸液、鼻−気管支分泌物及び尿）には、IgAはJ鎖とよばれるポリペプチドで連結された二量体として産生される。二量体IgAは、膜結合性多量体Ig受容体(pIgR)に結合し、得られる複合体は、粘膜上皮の基底外側から先端／管腔（apical/luminal）側に輸送される。この輸送の間、結合したIgAは、pIgRからのタンパク質分解性切断により解放される。しかし、pIgRの一部分、分泌成分は二量体IgAと結合したままであり、全体で分泌型IgA (SIgA)を形成する。

SIgAは、先天性免疫系において主要な役割を演じ、微生物及び外来タンパク質が粘膜表面を貫通することを防いでいる。また、毒素及び感染性生物を中和もしている。

分泌型IgAの役割が粘膜免疫において確立されているが、血清IgA抗体の機能はほとんど知られていない。IgAは、血清中で2番目に豊富にあるIgアイソタイプであるが、体液性免疫応答には通常関与せず、補体を活性化しない。単量体血清IgAは、抗炎症性活性を有し、IgG誘発性食作用、殺菌活性、酸化的バースト及びサイトカイン放出のようなダウンレギュレート機能を有し得る。これに対して、多量体IgA及びIgA含有免疫複合体(IC)は、IgA Fc受容体を通して血液白血球に対する免疫エフェクタ機能を効率的に引き起こすことができる。

免疫グロブリンのFc領域に対する受容体(FcR)は、体液性及び細胞性の応答の間の連結において主要な部分を担っている。5つのヒト抗体クラスの全てについてのFcRが知られている。

ヒトIgA Fc受容体(FcαR)ファミリーは、いくつかのメンバーを含むが(考察のために、例えばMONTEIRO及びVAN DE WINKEL, Annu. Rev. Immunol. 21：177〜204, 2003を参照)、IgA Fc領域に特異的な受容体であるFcαRI (又はCD89)のみが、血液骨髄細胞について同定されている(MONTEIROら, J. Exp. Med. 171：597〜613, 1990; MALISZEWSKIら, J. Exp. Med. 172：1665〜1672, 1990)。FcαRIは、単球／マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、好中球及び好酸球で発現され、IgA1及びIgA2の両方に(CONLEY及びDELACROIX, Ann. Int. Med. 106：892〜899, 1987；KERR, Annu. Rev. Immunol. 12：63〜84, 1994)、低い親和性で(Ka≒10⁶ M^-1)で結合する(MONTEIRO及びVAN DE WINKEL, 2003,上記)。

FcαRIは、Ig遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。これは、2つの細胞外Ig様ドメイン(EC1及びEC2)と、膜貫通領域と、認識されるシグナルモチーフがない細胞質尾部とを含む。ヒトFcαRIの結晶構造は、2つのIg様ドメインが互いに直角（right angles）に配向され、2つのFcαRI分子が1つのIgA分子の結合に必要であることを明らかにする(HERRら, J. Mol. Biol. 327：645〜657, 2003)。IgA結合部位は、膜近位EC1ドメインに位置する。抗FcαRIマウス及びヒトモノクローナル抗体(mAb)は、作製されており(MONTEIROら, J. Immunol. 148：1764〜1770, 1992；SHENら, J. Immunol. 143, 4117〜4122, 1989；PCT WO 91/05805；PCT WO 02/064634)、FcαRIのEC1ドメインに結合するモノクローナル抗体はIgA結合をブロックするが、EC2に結合するものはブロックしないことが示されている。

FcαRI:IgA結合反応の結合（on）及び解離（off）速度は中程度に速いので、単量体IgA結合は一過性であるが、多量体IgA及びIgA免疫複合体の結合は、解離速度が減少するのでそれぞれ結合力が増加する(HERRら, 2003, 上記；WINES, J. Immunol. 162：2146〜2153, 1999)。

食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)、過酸化物発生、サイトカイン産生、抗原提示及び炎症性メディエイタ放出のような免疫応答を引き起こすIgAの能力におけるFcαRIの関与が報告されている(考察のために、MONTEIRO及びVAN DE WINKEL, 2003, 上記、を参照)。これらのFcαRI-媒介性免疫応答を活性化するために、抗FcαRI抗体、例えばMy 43 (PCT WO 91/05805)、又はPCT WO 02/064634に開示されるヒトモノクローナル抗体を用いることが提案されている。

Fc受容体を発現する細胞に対して、抗FcαRI抗体を含む抗FcR抗体を、細胞障害性化合物のような選択的ターゲティング有効成分のベクターとして用いることも提案されている(PCT WO 99/41285)。

米国特許第6 018 031号は、抗FcαR抗体の結合領域と、標的細胞に指向された抗体の結合領域とを含む二機能性抗体を記載している。これらの二機能性抗体は、一方で、上記の標的細胞に、他方で、FcαRを発現するエフェクタ細胞に結合できる。FcαRへのこれらの結合は、エフェクタ細胞のFcαR媒介性活性を誘導し、同じ二機能性抗体分子に結合した標的細胞の破壊をもたらす。

FcαRIを通してのシグナリングは、三量体のFcαRIα/γγを形成するFcαRIのFcRγ鎖サブユニットとの結合に依存する。FcRγ鎖は、その細胞質尾部に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含み(PFEFFERKORN及びYEAMAN, J. Immunol. 153：3228〜3236, 1994；LAUNAYら, J. Biol. Chem. 274：7216〜7225, 1999)、これは重要なシグナリングエフェクタの補充を許容する(KINET, Annu. Rev. Immunol. 17：931〜972, 1999)。FcαRIは、FcRγサブユニットとの物理的結合を有して又は有さずに発現できる。γなしのFcαRIは、IgAを内在化させ、細胞表面に再循環させるが、FcRγ-結合FcαIは、複合化IgAをリソソームに向ける(LAUNAYら, 1999, 上記；SHENら, Blood 97：205〜213, 2001)。IgA再循環以外の非集合FcαRIの細胞性の機能は、今のところ同定されていない。受容体の集合（aggregation）は、サイトカイン放出及び抗体提示のような標的細胞機能のFcαRI媒介性活性化に必要である(SHENら, 2001, 上記；PATRYら, Immunol. 86：1〜5, 1995；GEISSMANNら, J. Immunol. 166：346〜352, 2001)。

IgA媒介性炎症におけるFcαRIの関与はよく認識されているが、IgA抗炎症性性能の基盤となる分子的な基礎は、今まで明らかにされていない。IgA阻害機能がFcα領域を必要とする事が報告されているが(WILTON, Clin. Exp. Immunol. 34, 423〜8 1978；VAN EPPS及びWILLIAMS, J Exp Med 144, 1227〜42 1976)、IgA Fc受容体が演じる部分はわからないままである。

免疫系での負のシグナリングの共通したモデルは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ITIM)を有する受容体を含む。これらの阻害受容体は、活性化受容体と共に集合して作用する。これらの2つの受容体間でのクロストークが負のシグナルを生み出す(RAVETCH及びLANIER, Science, 290, 84〜89, 2000)。ITIMクラスの阻害受容体の例は、Fcγ受容体、FcγRIIBである。しかし、Fcα領域についてのITIM受容体は知られていない。

本発明者らは、今回、予期せぬことに、FcαRIのEC2ドメインに指向された抗体の一価Fab断片によるFcαRIの単量体の占有（monomeric occupancy）が、IgG誘導食作用及びIgE媒介性エキソサイトーシスをインビトロで強く阻害し、驚くべきことに、これらの効果は、FcαRI-結合FcRγサブユニットのITAMモチーフにより媒介されることを見出した。

さらに、本発明者らは、喘息モデルにおいて、上記の一価Fab断片によるFcαRIのインビボターゲティングが、抗原誘導気管支反応亢進、及び随伴する気道炎症、、特に肺組織への白血球浸潤を廃止したことを示した。また、間質性腎臓線維症及び閉塞性腎症のモデルにおいて、上記の一価のFab断片によるFcαRIのインビボターゲティングが、病理的炎症性反応を減少させたことを見出している。

本発明の目的は、FcαRI受容体のEC2ドメインに指向された一価の抗体断片の、炎症性疾患の治療用の医薬の製造における抗炎症性有効成分としての使用である。
上記の一価の抗体断片の抗炎症性特性は、FcαRI発現骨髄細胞を伴う病理的炎症性反応のダウンレギュレーションに起因する。

本発明に従って治療され得る炎症性疾患の例は、アレルギー性疾患、特に喘息、及び免疫グロブリンとFcRとの相互作用を伴う炎症性疾患、例えば腎炎、リウマチ性関節炎及び自己免疫疾患（狼瘡、糖尿病など）を含む。非免疫性炎症性疾患、例えば腎臓炎症の原因となる片側尿管閉塞により誘発されるもの、腎臓の薬物誘発毒性、クローン病のような腸管炎症性障害も含まれる。

一価の抗体断片は、抗原結合部位を1つしか有さない免疫グロブリン断片であり、これに比べると、全免疫グロブリン分子は少なくとも2つの抗原結合部位を含む。一価の断片の例は、軽鎖と重鎖の最初の半分とからなるFab断片、又は抗体の重鎖及び軽鎖の可変部分が互いにフレキシブルリンカーを介して連結して単一鎖タンパク質を形成しているscFv断片である(CLACKSONら, Nature, 352, 624〜628, 1991)。

本発明を行う際に用いることができる一価の抗体断片を得ることを可能にする方法は、それら自体で公知である。
例えば、Fab断片は、FcαRI受容体のEC2ドメインに指向された抗体から、酵素消化の通常の方法により得ることができる。上記の抗体は、通常のハイブリドーマ技術により得られたマウスモノクローナル抗体であり得る。有利には、該抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体でもあり得る。キメラ抗体は、上記のモノクローナル抗体から、定常領域ドメインをヒトドメインで置き換えることにより得ることができる。ヒト化抗体は、上記のモノクローナル抗体のCDRを、それ自体で公知のCDRグラフティング技術を用いて、ヒト抗体のフレームワーク領域（framework region：FR)に組み込むことにより得ることができる。完全ヒトモノクローナル抗体は、例えばPCT WO 02/064634に記載されるように、免疫にされるマウスがヒト免疫グロブリンレパトアを有するトランスジェニックマウスであること以外は、通常のマウスモノクローナル抗体と同様にして得ることができる。

一価の抗体断片、特にscFv断片は、適切な宿主細胞において、適切なリンカーに結合した、FcαRI受容体のEC2ドメインに指向されたモノクローナル、ヒト化又はヒトの抗体の可変領域をコードするDNA配列を含む組換えDNAを発現させることにより直接得ることができる。該断片は、FcαRI受容体のEC2ドメインで選り分けられた（panned with）抗体ファージディスプレイライブラリからつくることもできる。ヒト化scFv断片は、ARNDTら(Int J Cancer 107, 822〜829, 2003)により記載される方法により得ることもできる。

上記の抗体のFcαRI受容体のEC2ドメイン及び一価の断片に対する特異性は、IgAのFcαRI受容体への結合に対するそれらの影響を試験することにより調べることができる。上記の結合をブロックしない抗体又は断片は、ほとんどの場合、EC2ドメインに指向される。しかし、モノクローナル抗体A3のようなブロックしない抗体が、EC1とEC2ドメイン間のエピトープを認識するとの報告がある(MORTONら, J Exp Med, 189, 1715〜22, 1999)。よって、上記の試験は、上記の抗体又は一価の断片の、FcαRI受容体のEC2ドメインを含みEC1ドメインを含まない組換えタンパク質、例えばMORTONら(1999, 上記)により記載されるようなFcαRI EC2及びウシFcγ2R EC1からなるキメラ受容体への結合アッセイにより完了するか、又は置き換えることが有利である。あるいは、IgAのFcαRI受容体への結合をブロックしない抗FcαRI抗体の一価の断片は、インビトロでその抗炎症性特性について、例えば、以下の実施例に記載するように、ヒト血液単球においてIgG-媒介性食作用を阻害するか、又はFcαRI を発現する肥満細胞系統のIgE-媒介性脱顆粒を阻害する能力について、直接試験することができる。

本発明のために、一価の抗体断片は、種々の様式で、全身又は局所で投与できる。
例えば、該断片は、筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下又は局部注射を含む非経口経路により投与できる。
本発明の一価の抗体断片が気道の粘膜表面への送達に適する形態であれば、呼吸器官での局部投与も用いることができる。例えば、これらを、エアロソル形態又は喘息の治療で現在用いられているものに類似のネブライザ装置により患者に送達するための液体製剤に懸濁できる。

一価の抗体断片は、当業者に知られた適切なキャリア及び／又は賦形剤と任意に混合することができる。

本発明は、本発明による抗FcαRI抗体の一価の抗体断片の製造及び使用の限定しない例に言及する、次のさらなる記載からより明確に理解されるであろう。

実施例1：FcαRIターゲティングは、ヒト血液単球においてインビトロでIgG-媒介性食作用を阻害する
血液単球のIgG-媒介性食作用活性の調節におけるFcαRIの役割を調べた。
ヒト末梢血単核細胞を、健康なボランティアから、フィコール−ハイパック密度勾配遠心法により単離した。濃縮した(70〜80%)単球の集合を、MONTEIROら(1990, 上記)に記載されるようなプラスチックへの接着により得た。

抗FcαRI mAb (IgG1κ, クローンA77, MONTEIROら, J. Immunol. 148：1764〜1770, 1992)及び無関係の（irrelevant）コントロールモノクローナル抗体(IgG1κ, クローン320) (PASTORELLIら, J. Biol. Chem. 276: 20407-20412, 2001)のFab断片を、37℃で8時間のペプシン消化、それに続いて0.01 Mシステインでの還元及び0.15 Mヨードアセタミン、pH 7.5でのアルキル化により作製した。完全消化及び純度は、SDS-PAGEにより制御した。

接着性の血液単核細胞を、10μg/mlのFab A77 (c)、無関係のFab 320又はバッファーを用いて、37℃で30分間プレインキュベートした。洗浄後、細胞を、製造業者の指示に従って、ポリクローナルウサギ抗E. coli IgG抗体(Molecular Probes)とともにオプソニン処理したか又はせずにテキサスレッドコンジュゲートE. coli (50 細菌/細胞) (Molecular Probes, Eugene, Oregan)と37℃で30分間インキュベートした。洗浄後、スライドを載せ、共焦点レーザ顕微鏡(LSM 510 Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて調べた。重ね合わせた透過及び蛍光のイメージ(中間のセクション)を示す。パネル(a〜d)は、6つの独立した実験の代表である。異なる健康なドナーを用いた6つの異なる実験における単球当たりの摂取された細菌の平均数(±SD)を、図1に示す。これは、各実験において少なくとも3つの視野で計数することにより測定した。バーの上の数字は、Fabによる阻害の平均パーセンテージであり、これは次のようにして算出された： 100 − 100 × (Fab A77の存在下でIgG-オプソニン処理された細菌のn − オプソニン処理されていない細菌のn) ／ (IgG-オプソニン処理された細菌のn − オプソニン処理されていない細菌のn)、ここでnは、内在化された細菌の平均数を示す。
結果を、図1に示す。

結果は、IgGのオプソニン処理が、単球によるE. coliの食作用を促進することを示す。抗FcαRI Fab A77断片とのプレインキュベーションは、無関係のFab 320断片に比べて、80%より多くIgG媒介食作用を阻害した。

実施例2：FcαRI阻害機能の特徴づけ
FcαRIの阻害機能を、野生型ヒトFcαRIでトランスフェクションした、高親和性受容体IgE (FcεRI)を構成的に発現するラット肥満細胞系統RBL-2H3の脱顆粒応答を試験することによりさらに研究した。

1) 材料及び方法：
細胞トランスフェクション：
RBL-2H3細胞のトランスフェクションは、LAUNAYら(1999, 上記)に記載されるようにして行った。野生型ヒトFcαRI構築物を、XbaI-BamHI制限部位の間にネオマイシン耐性遺伝子を含有するpSRαNEOベクターにクローニングし、配列はDNA配列決定により制御した。ROAら(J. Immunol. 159: 2815〜2823, 1997)に記載されるようにして維持されるRBL-2H3細胞を、Easyjet⁺装置(Eurogenetec, Seraing, Belgium)を用いて250 V及び1500μFaでのエレクトロポレーションにより、15μgのDNAでトランスフェクションした。

1 mg/ml G418に耐性のクローンを、フローサイトメトリによりFcαRIの発現について選択した。細胞を、100μg ヒトポリクローナルIgG (PharMingen, San Diego, California)とプレインキュベートして、FcγRをブロックし、その後、フィコエリスリン標識抗FcαRI mAb (IgG1κ, A59-PE) (MONTEIROら, 1992, 上記)、又はアイソタイプ適合の無関係のAb (Becton Dickinson, Bedford, Massachussets)とインキュベーションした。洗浄後、細胞をFACScaliburフローサイトメータ及びCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)で分析した。ヒトFcαRIを発現する1つのクローン(クローン15.4)を、次の実験のために選択した。

脱顆粒応答
細胞に含有される顆粒状メディエイタのエキソサイトーシスを、(ROAら, 1997, 上記)に記載されるようにして、異なる試験化合物での感作に対する、FcαRIトランスフェクションされた細胞、又はコントロールとして用いられる非トランスフェクション細胞によるβ−ヘキソサミニダーゼの放出を測定することにより測定した。
細胞を、96ウェルプレート(Becton Dickinson)に、5×10⁴細胞/ウェルで入れた。細胞を、各試薬について、以下に記載されるように、異なる試験化合物で感作した。細胞をあらかじめ温めておいたTyrodeバッファー(135 mM NaCl、5 mM KCl、5.6 mMグルコース、10 mM HEPES、pH 7.3、1.8 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂及び5% BSA)中で洗浄し、0.1μg/ml DNP-HAS (Sigma)で脱顆粒を引き起こした。合計のβ−ヘキソサミニダーゼ放出を、自然発生的な放出を引いた後に合計含量のパーセンテージとして算出した。

2) 抗FcαRI Fab断片によるIgE媒介エキソサイトーシスの阻害
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)及び非トランスフェクション(NT) RBL細胞を、IgE抗DNP (1：200)又はIgE抗DNPと10μg/ml 無関係なFab 320コントロール又は抗FcαRI Fab A77で、1時間、37℃で感作した。細胞を洗浄し、DNP-HASで脱顆粒を引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を図2aに示す。

データは、5つの独立した実験の平均±SDである。バーの上の数字は、脱顆粒の阻害の平均パーセンテージに相当する。
結果は、IgE-感作トランスフェクタント(クローン15.4)の抗原刺激が、強い脱顆粒応答を誘導したことを示す。抗FcαRI Fab A77とのプレインキュベーションは、無関係のFab 320に比べて、FcαRIにより開始された脱顆粒を著しく阻害した(74%)。他の2つのトランスフェクタントを用いて同様の結果が得られた(示さず)が、非トランスフェクション細胞(NT)を用いては得られなかった。A77 Fabの阻害効果は、より長い期間(2〜12時間)プレインキュベーションしたときにより強かった(示さず)。
注目すべきことに、抗FcαRI Fabは、IgE結合を修飾することに失敗した(示さず)。ゲルろ過により精製した抗FcαRI Fabは、同様の阻害作用を有しており、観察された効果での凝集物の役割を除外する(示さず)。

3) 抗FcαRI Fab媒介阻害の用量応答研究
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、異なる濃度の抗FcαRI Fab A77又は無関係のFab 320の存在下に、37℃で1時間、IgEで感作した。細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASで引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を図2bに示す。

データは、4つの独立した実験の平均±SDである。
結果は、抗FcαRI Fabによる阻害が濃度依存的であり、1〜10μg/mlの間で最大であったことを示す。

4) 抗FcαRI Fabにより標的されるエピトープの阻害に対する影響
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、異なる抗FcαRI mAb：A3 (EC1とEC2との間の結合部位を認識する；EC2内の結合部位を認識するA59、A62、A77)又は無関係のFab 320からのFab断片10μg/mlの存在下に、37℃で1時間、IgEで感作した。
細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を図2cに示す。

データは、3つの独立した実験の平均±SDである。
試験した4つの抗FcαRI Fabのうち3つが、FcεRI誘発脱顆粒を＞50%で阻害した。4つ目の抗FcαRI Fab (A3)は、脱顆粒の阻害に失敗したが、3つの対照と同様に、FcαRIでトランスフェクションされた細胞に容易に結合した(示さず)。

5) リガンドの価数の阻害に対する影響
この目的のために、F(ab')₂を、抗FcαRI mAb (A77)又は無関係な抗体320から、SILVAINら(J. Immunol. 155: 1606〜1618, 1995)に記載されるようにして、基質に対する比(w/w)が1/50の酵素を用いて、0.1 M酢酸バッファー、pH.4.4中で、37℃で8時間ペプシン消化することにより作製した。完全消化及び純度は、SDS-PAGEにより制御した。

ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、IgE、又はIgEとA77からの10μg/ml Fab若しくはF(ab')₂断片、又はIgEと320からの無関係のFab若しくはF(ab')₂断片で、37℃で1時間感作した。
細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を、図2dに示す。

データは、4つの独立した実験の平均±SDである。
結果は、一価の抗FcαRI Fabが、二価のF(ab')₂断片よりもより強い阻害効果を有したことを示す。

6) FcαRI凝集の細胞脱顆粒に対する影響
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、IgE、又はA77からの10μg/ml Fab若しくはF(ab')₂断片、又は320からの無関係のFab若しくはF(ab')₂断片で、37℃で1時間感作した。
次いで、細胞をウサギ抗マウスIgG (RAM、40μg/ml)のF(ab')₂断片で刺激した(LAUNAYら, J. Leukoc. Biol. 63: 636〜642, 1998)。
細胞を洗浄し、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を図2eに示す。

データは、4つの独立した実験の平均±SDである。
抗FcαRI F(ab')₂をウサギ抗マウスIg (RAM) F(ab')₂を用いて架橋した後の、FcαRIの高度に多価の凝集が、脱顆粒をもたらしたことを示す。抗FcαRI FabとRAM F(ab')₂とを用いてのより少ない程度に多価の凝集は、より少ない脱顆粒をもたらした。抗FcαRI Fab、F(ab')₂又はRAM F(ab')₂のみでは脱顆粒は観察されなかった(示さず)。

実施例3：血清IgAは、FcαRI阻害機能を誘導する
FcαRI RBL-2H3トランスフェクタント(クローン15.4)に対する生理学的リガンドIgAの影響を、上記の実施例2に記載のようにして、脱顆粒応答を試験することにより試験した。

1) IgAへのFcαRI阻害応答に対するタンパク質分解処理の影響
プロテアーゼを含む多数のメディエイタを含有するIgAが炎症部位で生物学的活性を示すので、FcαRIがトリプシンに耐性であると仮定して、IgA媒介阻害機能に対する細胞のトリプシン処理の影響を試験した(MONTEIROら, 1990, 上記)。
ヒトFcαRIトランスフェクタントを、DMEM中の1 mg/ml トリプシン-TCPK (Sigma)を用いるか又は用いずに、37℃で30分間予備処理し、次いでIgEのみ、又はIgEと0.2 mg/ml血清IgG若しくは精製血清IgA (バッチ番号39328及び02828, ICN Biomedicals Inc, Aurora, Ohio)で一晩感作した。
細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を、図3aに示す。

データは、6つの独立した実験の平均±SDである。
バーの上の数字は、阻害の平均パーセンテージを示す。
結果は、血清IgAとのインキュベーションが、IgE-依存性脱顆粒を著しく阻害した(43%)が、IgGとのインキュベーションは阻害しなかったことを示す。血清IgAの阻害効果は、トリプシン処理した細胞において著しく増大した(〜50%増大)が、IgGの阻害効果は増大せず、IgE媒介脱顆粒応答は影響されなかった。同様の増大が、精製骨髄腫IgAを用いて観察された(示さず)。

2) FcαRI阻害機能に対するIg濃度の影響
ヒトFcαRIトランスフェクタントを、DMEM中の1 mg/mlトリプシン-TCPK (Sigma)で、37℃で30分間予備処理し、IgEのみ、又はIgEと種々の濃度の2つのバッチの精製血清IgA (バッチ番号39328及び番号02828, ICN Biomedicals Inc, Aurora, Ohio)、分泌IgA (SIgA, バッチ番号42K3780, Sigma Aldrich, St-Louis, Missouri)、又はヒトIgGとで感作した。
細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を、図3bに示す。

データは、5つの独立した実験の平均±SDである。
結果は、市販の血清IgAの2つの異なるバッチが、用量依存様式で脱顆粒を阻害し、最大の阻害(66%)が0.5 mg/mlで得られたことを示す。初乳SIgAも、より少ない程度ではあるが、細胞活性化を阻害した。

3) IgA1及びIgA2によるFcαRI阻害応答の調節
FcαRIはIgA1及びIgA2の両方に結合するので、この2つのサブクラスの阻害能力を、分泌粘膜の種類に応じてIgA1及びIgA2の両方を種々の量で含有するSIgAの能力に対して比較した。
ヒトFcαRIトランスフェクタントを、DMEM中の1 mg/mlトリプシン-TCPK (Sigma)で、37℃で30分間処理し、IgEと0.2 mg/ml血清IgG、精製された骨髄腫IgA1及びIgA2又はSIgAとで一晩感作した。細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を図3cに示す。

データは、4つの独立した実験の平均±SDである。
結果は、すべての試験された調製物は、ヒトIgG (＜5%)に比べて、著しい阻害(30〜40%)を発生したことを示す。FcαRI阻害応答は、IgA1及びIgA2の両方により誘導できる。

4) 多量体又は単量体の血清IgA阻害の比較
FcαRIは、単量体IgAよりも多量体IgAにより効率的に結合するので、二次架橋を有さないIgAの種々の分子形(HPLCにより分離)の阻害可能性を試験した。
ヒトFcαRIトランスフェクタントを、DMEM中の1 mg/mlトリプシン-TCPK (Sigma)で、37℃で30分間予備処理し、IgEと0.1 mg/ml血清IgG (IgG)、全血清IgA (IgA)、多量体血清IgA (pIgA)、二量体血清IgA (dIgA)又は単量体IgA (mIgA)とで一晩感作した。血清IgAは、HPLCによりサイズ分画した。
細胞を洗浄し、脱顆粒をDNP-HASを用いて引き起こし、β−ヘキソサミニダーゼ放出を決定した。
結果を、図3dに示す。

データは、3つの独立した試験の平均±SDである。
結果は、多量体血清IgAが、単量体血清IgAよりもより阻害的であることを示す。阻害能力は、IgA種のサイズとともに増加する。多量体IgAは、二量体IgA (38%)及び単量体IgA (20%)のどちらよりも効果的であった(60%)。同様のデータが、HPLCにより分離された血清IgAの別のバッチを用いて得られた(示さず)。

A77 mAbとIgAとの違いは、結合部位及びリガンド結合活性により説明できるだろう。抗FcαRI mAb A77結合部位はEC2に位置するが、IgAはEC1ドメインと相互作用し(MORTONら, J. Exp. Med. 189: 1715〜1722, 1999)、多量体IgAは、単量体IgAよりも強くFcαRIに結合する(HERRら, 2003, 上記; WINESら, 1999, 上記)。種々のIgA調製物のみをトランスフェクションされたRBL-2H3細胞とインキュベーションしたときに、β−ヘキソサミニダーゼの放出は観察されず、IgE媒介脱顆粒は、非トランスフェクション細胞(NT)により阻害されなかった(示さず)。

実施例4：FcαRI阻害シグナルは、FcRγ鎖のITAMモチーフにより媒介される
阻害シグナルについての構造的要件を探索するために、一連のFcαRI変異体及びキメラ構築物を用いた。
- FcαRI膜貫通ドメイン内の位置209の荷電アルギニンがロイシン(R209L)に置換されたFcαRI_R209L；この変異は、FcαRIの、FcRγ鎖との結合を廃止する(LAUNAYら, 1999, 上記; MORTONら, J. Biol. Chem. 270: 29781〜29787, 1995)。
- R209L/γキメラ構築物は、FcαRI_R209Lの細胞外及びR209L膜貫通ドメインの、ヒトFcRγ鎖の細胞質内尾部との融合に起因する。

R209L/γキメラは、次のようにして作製した。R209L変異体の細胞外及び膜貫通ドメインを、
を用いてPCRにより増幅し、同様にしてヒトFcαR γ鎖の細胞内ドメインを、
を用いて増幅した。PCR産物を、オーバーラップエクステンションPCRにより融合した。

野生型FcαRI-γ₂受容体、FcαRI_R209L受容体及びR209L/γキメラ受容体の構造を、図4aに模式的に示す。
すべての構築物は、実施例2に記載のようにして、pSRαNeoベクターにクローニングし、RBL-2H3細胞にトランスフェクションした。
野生型ヒトFcαRI (クローン15.5)、FcαRI-γ₂ (クローン5.26)又はR209L/γキメラ(クローン9.4)構築物でトランスフェクションされた細胞を選択した。

フローサイトメトリによるFcαRI発現の測定の結果を、図4bに示す。これらの結果は、全てのRBL-2H3トランスフェクタントが、細胞表面においてかなりのレベルのFcαRIを発現したことを示す。
脱顆粒応答は、実施例2の2)に記載されたようにして試験した。
結果を図4cに示す。

バーの上の数字は、無関係のコントロールFabと比較した阻害のパーセンテージを示す。
結果は、IgEのみで感作された全てのトランスフェクタントは、50%を超えるFcεRI-媒介脱顆粒を示したことを示す。抗FcαRI Fab A77処理は、R209L変異体でトランスフェクションされたRBL-2H3 (クローン5.26)において阻害的でなく、このことはFcαRIの細胞内尾部は、阻害シグナリングを担うモチーフを含有しないことを示唆した。対照的に、トランスフェクションされた細胞(クローン9.4)での抗FcαRI Fab A77のFcαRI_R209L/γキメラ受容体への結合は、野生型受容体でトランスフェクションされた細胞(クローン15.5)で観察されたものと同様の程度で、脱顆粒に対する阻害効果を回復させた(それぞれ91%及び72%)。トランスフェクタントのそれぞれの種類について、少なくとも3つのさらなるクローンを用いて同様の結果を得た(示さず)。

このFcαRI_R209L/γキメラ受容体の凝集は脱顆粒を誘導し、このことは、野生型FcαRIと同様に、活性化及び阻害の両方を媒介できたことを証明する(示さず)。
FcRγ鎖はいずれの既知の阻害モチーフを有さないので、活性化（activatory）モチーフとして通常は知られるFcRγ ITAMを、これが阻害効果をも媒介できるかを知るために研究した。ヒトFcRγ鎖は、細胞活性化において役割を演じることが知られているITAMモチーフの一部分である2つのカルボキシ末端チロシン(FcαRI_R209L/γキメラ受容体内のY268及びY278)を有する(17,24)。点突然変異(Y268F、Y278F及び二重Y268/278F)を、FcαRI_R209L/γキメラのITAMモチーフに導入した。

ITAMモチーフ内にY268F及び／又はY278F変異を含有するR209L/γキメラでトランスフェクションしたRBL-2H3細胞内で確立した安定なトランスフェクタント(単一又は二重)は、阻害及び活性化の応答を媒介することはもはやできなかった(示さず)。

実施例5：FcαRI阻害シグナルは、チロシンリン酸化を誘導し、Ca²⁺流入に影響する
A) チロシンリン酸化アッセイ
ITAM-媒介シグナリングはチロシンキナーゼの活性化を伴うので、FcαRI/γ複合体の単量体ターゲティングを、これがチロシンリン酸化を伴うかを知るために研究した。
示されたRBLトランスフェクタント(FcαRI-γ2、FcαRI_R209L/γキメラ野生型、FcαRI_R209L/γキメラ Y268F/Y278F)を、15分間、10μg/mlの抗FcαRI Fab A77、無関係のFab 320、40μg/mlのRAM F(ab')₂、又は抗FcαRI A77 F(ab')₂とRAM F(ab')₂との組み合わせで刺激した。
刺激及び氷冷PBS中での2回の洗浄の後に、細胞を溶解バッファー(50 mM HEPES pH 7.4、1% Triton X-100、0.1% SDS、50 mM NaF、50 mM NaCl、1 mM Na₃VO₄、30 mM Na₄P₂O₇、50 U/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン)中に溶解し、核後（post-nuclear）上清を調製した。溶解物を、SDS-10% PAGEにより分離し、PVDFメンブレンに移した。4% BSAでブロッキング後、メンブレンを4G10 抗PY Ab (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)と、室温で1時間インキュベートし、HRP結合ヤギ抗マウスIg (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)とインキュベートした。メンブレンをストリップし、抗ラットリン脂質スクランブラーゼ(PLSCR) mAb (PASTORELLIら, 2001, 上記)で再プローブして等しいローディングを評価した。フィルタをECL (Amersham-Pharmacia Biotech)により現像した。
結果を図5に示す。

図5の凡例：
* は、刺激された細胞内の顕著なチロシンリン酸化されたタンパク質を示す。
結果は、FcαRIトランスフェクタントの、抗FcαRI Fab A77とのインキュベーションは、無関係のコントロールFabに比べて、いくつかのチロシンリン酸化タンパク質の出現を誘導したことを示す。リンタンパク質のパターンは、FcαRIの多量体凝集後に得られるものと、強度は違うものの同じなようである。同様のデータが、FcαRI_R209L/γキメラ受容体を用いて得られたが、ITAM内の変異により、単量体及び多量体のターゲティングの後に、この受容体のチロシンリン酸化を開始する能力が廃止された。

B) サイトソルのカルシウムの測定
活性化工程の調節を、細胞活性化についての鍵となるメッセンジャーであるサイトソルのカルシウム流入([Ca²⁺]_i)に対する抗FcαRI Fab A77の効果に関して調べた。

1) 実験手順
ヒトFcαRIトランスフェクタント又は非トランスフェクションRBL-2H3細胞の一定量(1.5×10⁶細胞)を、異なる試験化合物(各実験について以下に記載する)で、20 mM HEPES pH 7.6を補充した完全DMEM中に、37℃で1時間感作した。細胞に、4μMの蛍光プローブFURA-2-AM (Molecular probes, Leiden, The Netherlands)を37℃で30分間負荷した。

洗浄後、細胞を2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、0.5 mg/mlゼラチンを含有するPBS中に1×10⁶細胞/mlで再懸濁し、攪拌及び調温されたボウルに入れた。細胞を、0.1μg/ml DNP-HAS抗原(Ag)又は50 nM タプシガルジン(Sigma)の添加により活性化した。[Ca²⁺]_iを、分光蛍光計(Hitachi F 2000, Salem, New Hampshire)とともに供給されるコンピュータソフトウェアを、GRYNKIEWICZら(J. Biol. Chem. 260: 3440〜3450, 1985)により与えられる式に従って用いて計算した。著しい細胞自己蛍光（cellular auto-fluorescence）は観察されず、用いた化合物はFURA-2-AMの蛍光を変化させなかった。細胞内貯蔵の貢献は、3.5 mM EGTAの存在下での刺激後に決定した。蛍光消滅（fluorescence quenching）実験のために、Mn²⁺ (200μM)を、Ca²⁺フリー培地でインキュベートした細胞に加えた(BERTHONら, Biochem. Pharmacol. 47: 789〜794, 1994)。

2) 抗FcαRI Fabによる、Ca²⁺プラトー段階の阻害
ヒトFcαRIトランスフェクタント(a、クローン15.4)及び非トランスフェクションRBL-2H3細胞(b)を、IgE単独又はIgEと10μg/ml抗FcαRI Fab A77又は無関係のFab 320とで感作した。
結果を図6a及び6bに示す。

データは、少なくとも3つの別々の実験の代表である。
FcεRI刺激後の細胞内最大カルシウムは影響を受けなかった(図6a、□)が、上昇した[Ca²⁺]_iのプラトー段階は、無関係のコントロールFab (図6a、△)又はトランスフェクションされていない細胞(図6b)に比べて、FcαRIトランスフェクタントの抗FcαRI Fab A77とのプレインキュベーション後に著しく阻害された(図6a、○)。

3) 抗FcαRI Fabの、細胞内Ca²⁺貯蔵からの放出に対する影響
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、IgE単独、又はIgEと10μg/ml 抗FcαRI Fab A77若しくは無関係のFab 320とで感作した。次いで、細胞にFURA-2-AMを記載したようにして負荷し、細胞外カルシウムを3.5 mM EGTAでキレート化し、その直後に[Ca²⁺]_iを決定して、細胞内貯蔵からのカルシウム放出と細胞外媒質からのカルシウム侵入とを識別した。結果を図6cに示す。

データは、少なくとも3つの別々の実験の代表である。
結果は、抗FcαRI Fab A77処理がEGTA処理された細胞に影響を及ぼさないことを示し、細胞内カルシウム貯蔵の放出を阻害しなかったことを示唆する。

4) 抗FcαRI Fabは、Ca²⁺流入を阻害する。
カルシウム流入のみが影響されることを確かめるために、外部のCa²⁺をMn²⁺で置き換えた。これは、貯蔵感受性カルシウムチャネル(SOC)を通って細胞に侵入し、内部の遊離のカルシウムと競合し、それによりFURA-2-AM蛍光を消す(BERTHONら, 1994, 上記)。
ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)を、IgE単独(d)、又はIgEと10μg/ml 抗FcαRI Fab A77 (e)若しくは無関係のFab 320 (f)とで感作した。
結果を図6d〜fに示す。

図6d〜fの凡例：
Ag：DNP-HAS抗原での刺激
Mn：Mn²⁺の添加
d = IgE単独
e = IgE + 抗FcαRI Fab A77
f = IgE + 無関係のFab 320

データは、少なくとも3つの別々の実験の代表である。結果は、Mn²⁺イオンの細胞への自発的な侵入により、Mn²⁺の添加が蛍光を減少させたことを示す。FcεRI刺激は、開放されたSOCを通ってのMn²⁺の流入の結果としての蛍光のさらなる顕著な減少を導いた(図6d)。IgE依存性刺激に先立っての抗FcαRI A77での細胞インキュベーションは、この効果を廃止した(図6e)が、無関係のFab 320は影響がなかった(図6f)。
Agは、Mn²⁺流入によりFURA-2-AM蛍光の消光を誘導した。刺激の前と後のカルシウム侵入に対応するスロープは、それぞれ2.5及び4.1 (d)、1.8及び1.9 (e)、並びに3.5 (f)である。

5) 抗FcαRI Fabは、内部の貯蔵からのカルシウム放出とSOCの開放との間の事象を阻害する
FcαRI媒介阻害が、内部の貯蔵からのカルシウム放出とカルシウム流入との間の事象を標的したかについて調べるために、タプシガルジンを用いた。これは、イノシトール三リン酸感受性貯蔵を枯渇させ、膜貫通受容体の連動状態（engagement）の不在下でSOC開放をもたらす薬理作用剤である(THASTRUPら, Agents Actions 27: 17〜23, 1989)。

ヒトFcαRIトランスフェクタント(クローン15.4)(g)、及びトランスフェクションされていないRBL-2H3細胞(h)を、10μg/mlの抗FcαRI Fab A77、又は無関係なFab 320で感作した。細胞にFURA-2-AMを負荷した後、[Ca²⁺]_iを測定し、その後、50 nMタプシガルジン(Tg)で刺激した。
データは、少なくとも3回の別の実験の代表である。
結果を、図6g及び6hに示す。

これらの結果は、タプシガルジンで誘導される、持続する[Ca²⁺]i上昇は、無関係なFab 320又は非トランスフェクション細胞に比べて、FcαRIでトランスフェクションされた細胞において、抗FcαRI Fab A77とのプレインキュベーションにより著しく低減されたことを示す(図6h)。

実施例6：FcαRIターゲティングは、インビボでのIgE媒介喘息症状発現を妨げる
FcαRIの阻害活性はインビトロで証明されたが、この受容体のインビボターゲティングを、それが炎症性応答を阻害できるかを知るために試験した。
マウスはFcαRIホモログを発現しないので(KABAGAWAら, Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 5261〜5266, 1997; HAYAMIら, J. Biol. Chem. 272: 7320〜7327, 1997)、ヒトにおいて観察されるのに類似の骨髄細胞発現を生じる、CD11bプロモータの制御下にヒトFcαRI(CD89、83系統)を発現するBalb/cトランスジェニックマウス(Tg)を用いた(LAUNAYら, J. Exp. Med. 191: 1999〜2009, 2000)。遺伝子型決定は、PCRにより行った(LAUNAYら, 2000, 上記)。マウスは、IFR 02及びBichat Medical Schoolのマウス施設で飼育し、維持した。全ての実験は、国のガイドラインに従って行った。

抗FcαRI Fab免疫療法を、プロトコルを適合させたZUBERIら(J. Immunol. 164: 2667〜2673, 2000)に従うIgE媒介の喘息の動物モデルにおいて試験した。簡単に、FcαRI-トランスジェニックBalb/cマウス(Tg)及び同腹子のコントロール(Lt)を、腹腔内で2回、第0日及び7日に、体重25 gあたり2 mgの水酸化アルミニウムゲル中の10μg TNP-OVA (Sigma)を用いて免疫した。第14日に開始して、マウスに毎日7日間連続で、5μgの抗FcαRI Fab A77又は無関係なFab 320の存在下に、PBS、又は20μg 抗DNP IgE (IC)と複合化した2μg TNP-OVAを用いて、鼻腔内で攻撃した。第14日に、マウスに50μg抗-FcαRI Fab A77、又はコントロールFabを腹腔内で与えた。最後の鼻腔攻撃の24時間後に、自由な意識のあるマウスを、全身プレチスモグラフチャンバ(BUXCO Electronics, Sharon, CT)に入れた。数分間安定化した後、300 mMメタコリンのエアロソルを60秒間送達した。

気道抵抗における変化を、メタコリンへの曝露の後20分間、毎分、以下のようにして計算した：増強休止（enhanced pause）(Penh) = [(呼気時間/弛緩時間)-1] × (最大呼気流量/最大吸気流量) (ZUANY-AMORIMら, Science 280: 1265〜1267, 1998)。
結果を図7aに示す。

カーブは、気道抵抗を意味する。
対応するPenh値の曲線下累積面積(AUC)は、群あたり少なくとも8匹のマウスを含む3回の別々の実験の平均±SDであり、図示した。
結果を図7bに示す。

結果は、無関係なFabの存在下でのIgE免疫複合体を用いる鼻腔内攻撃の繰り返しの後に、PBS攻撃された対照に比べて、(FcαRI⁺) Tgマウスが吸入されたメタコリンに対して気管支機能亢進を発生したことを示す(図7a、7b)。この現象は、トランスジェニックマウスを抗FcαRI Fabで処置することにより廃止された(図7a、7b)。気管支機能亢進は、(FcαRI^-)同腹子コントロール非トランスジェニックにおいて、抗FcαRI Fabにより低減されなかった(図7a、7b)。

FcαRI-トランスジェニックマウスからの肺組織切片の形態学的分析を行った。動物に麻酔をかけた。肺を、1 mlのOptimum Cutter temperature Compound (BDH, Poole, United Kingdom)の気管注入により膨張させ、4%パラホルムアルデヒドで固定し、段階的アルコールで脱水し、パラフィンに包埋した。炎症の程度の比較の組織病理学的評価を、H&E染色した肺切片全体について行った。
結果を図7c〜kに示す。

図7c〜kの凡例：
c〜e = コントロールのPBS攻撃されたマウス
f〜h = 無関係なFab 320で処置された、抗原で攻撃されたマウス
i〜k = 抗FcαRI Fab A77で処置された、抗原で攻撃されたマウス
倍率：×10 (c、f、i)、×100 (d、e、g、h、j、k)

無関係なFab 320で処置された、抗原で攻撃されたTgマウスの肺の組織構造は、主に顆粒球及び単核細胞からなる気管支周囲(図7f)及び上皮(図7g)の炎症性浸潤、並びにびまん性肺胞毛細管うっ血(図7h)を示した(矢印を参照されたい)。これらの特徴は、正常の生理機能を示したPBS攻撃されたマウス(図7c〜e)からの肺では見られなかった。抗原で攻撃した抗FcαRI Fab A77で処置したマウスは、実質的により少ない炎症及びうっ血を示した(図7i〜k)、抗FcαRI Fabの投与は、抗原により誘導される気道のうっ血及び炎症細胞による浸潤を防いだ。
抗FcαRI Fabで処置した(FcαRI^-)同腹子の肺において、効果は観察されなかった（示さず）。

実施例7：非免疫腎臓炎症に対するFcαRIターゲティングの効果
抗FcαRI免疫療法を、間質性腎臓繊維症及び閉塞性腎症の炎症モデルである、マウスにおける片側尿管閉塞(UUO)の後にも試験した(KLAHR及びMORRISSEY, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 283(5): F861〜875, 2002)。腎臓は、尿細管拡張、マクロファージのような炎症性細胞の浸潤、及び腎臓の上皮−間葉性推移を特徴とする。簡単に、左腎の尿管の片側閉塞を、2箇所での結紮により、麻酔をかけたTg CD89マウスに対して行った。外科的介入の1日前及びその後毎日、マウスをPBS、100μgの無関係なFab 320又は100μgのFab A77のいずれかで処置した。第6日にマウスを犠牲にし、閉塞した腎臓を、組織病理学的評価に供した(過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色及び抗CD11b抗体を用いる免疫組織化学染色)。
結果を図8に示す。

図8の凡例：
Tg CD89 PBS = PBSで処置したTg CD89マウスの閉塞腎臓
Tg CD89 + Fab 320 = 無関係のFab 320で処置したTg CD89マウスの閉塞腎臓
Tg CD89 + Fab A77 = Fab A77で処置したTg CD89マウスの閉塞腎臓

PBSで処置した腎臓は、拡張した尿細管及び細胞浸潤(PAS染色、示さず)、特にマクロファージ(抗CD11b染色)を有するUUOの典型的な病理学的特徴を示した。これらの典型的な病理学的特徴は、Fab A77で処置した腎臓で存在せず、浸潤は著しく低減している。Fab 320で処置したTg CD89マウスの腎臓では、何の影響も観察されなかった。

Claims

FcαRI受容体のEC2ドメインに指向された一価抗体断片の、炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための抗炎症性有効成分としての使用。
前記炎症性疾患が、狼瘡、リウマチ性関節炎、糖尿病、腎炎、間質性腎臓線維症、閉塞性腎症及び腸管炎症性疾患から選択される請求項1に記載の使用。
前記疾患がアレルギー性疾患である請求項1に記載の使用。
前記アレルギー性疾患が喘息である請求項3に記載の使用。