JP6370349B2 - 抗p−セレクチン抗体ならびにそれらの使用および同定方法 - Google Patents
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Description
鎌状赤血球症(SCD)は、主としてアメリカ合衆国においてアフリカ系アメリカ人が罹患する、慢性貧血および血管閉塞症を引き起こすまれな遺伝的血液障害である。鎌状赤血球症は、アフリカ系アメリカ人において最もよく見られる単一遺伝子障害であり、アフリカ人を祖先に持つ人々375〜600人におおよそ1人が罹患する(18、19)。鎌状赤血球障害はまた、地中海諸国、アフリカ・カリブ海ならびに南アメリカおよび中央アメリカの一部の人々の間でも一般にみられる(18、19)。
SCDは、β-グロビン遺伝子における単一のミスセンス変異(Val6Ala)によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患であり、この変異によって、変異体ヘモグロビンは低溶解性になり、脱酸素により重合しやすくなる。ヘモグロビンの重合は赤血球の変形を引き起こし、細胞は鎌状になる。
米国においては、全50州およびコロンビア特別区において、出生時に鎌状細胞スクリーニングが義務付けられており(28)、早期介入の機会が提供されている。診断検査方法は、通例、ヘモグロビン電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィーおよびDNA検査の1以上と組み合わせた全血球数を含む(22)。
鎌状赤血球は、正常な赤血球よりも短い半減期を有し、HbSの不安定性および循環血液中におけるヘモグロビン重合/脱重合の反復性エピソードの効果の結果として生じる。鎌状赤血球は膜イオン透過性、細胞の粘性および変形能に影響し(20)、酸化的膜損傷を促進する(29)。鎌状赤血球症患者は、2〜3か月齢までには貧血を生じ、慢性貧血および溶血と関連する症状および合併症(22、30)、例えば腎臓病、眼疾患、下肢潰瘍、持続勃起および肺高血圧症を発症する(26、31〜37)。SCD患者のヘモグロビン値は6〜10g/dLの範囲であり、ヘモグロビンS分子は酸素に対する親和性が低い。患者における輸血トリガー値は、5以下のヘモグロビン値または、2g/dLもしくはそれ以下のヘモグロビンの急落である。過度なヘマトクリットは鎌状赤血球化を促進する恐れがあるので、一般的には、輸血は、各患者に関して明らかにされたベースライン値にヘモグロビン値を復帰させるように行われる(38)。SCD患者は、赤血球生成を阻止し、再生不良性貧血発症をもたらす恐れのあるパルボウイルスB19感染に罹患しやすい(39)。
血管閉塞は、SCDの臨床経過の核心であり、微小循環および大循環の両方が関与すると思われる。微小血管において生じる閉塞は、急性の疼痛エピソードまたは血管閉塞性クリーゼを起こしうる。血管閉塞性クリーゼは、微小血管閉塞の臨床上の特徴であり、成人SCD患者の入院の90%以上がこれが原因である。脱酸素中にヘモグロビンSが重合し、細胞の鎌状赤血球化が微小血管の閉塞をもたらすことは公知である(40)。しかしながら、ヘモグロビンSの重合は、単に血管閉塞症に関与するだけではないことが最近明らかとなった。現在では、鎌状赤血球の溶解、細胞膜損傷および酸化ストレス、反復性虚血傷害ならびに、鎌状赤血球と内皮との間の、炎症促進性環境をもたらす接着相互作用による微小血管損傷などの事象が明らかにされている(41〜43)。慢性血管炎症のこの環境においては、白血球、血小板および鎌状赤血球と活性化血管内皮との接着ならびに相互との接着は、微小血管閉塞および血管閉塞性クリーゼの主要な原因であると考えられている(43〜47)。さらなる要因、例えば鎌状細胞の剛性、血液粘度の増加および局所血管収縮もまた、血管閉塞症プロセスに潜在的に寄与することが明らかにされている。
SCD患者における血管閉塞は、血管閉塞性クリーゼ、急性胸部症候群、脳血管事象および多発型の器官障害を含む様々な形で現れ得る。従って、血管閉塞の治療法は、疾患の臨床経過および重症度に依存し、一般に、性質が対症療法的であるかまたは姑息的である。血管閉塞性クリーゼを促進する開始因子の回避における患者教育は予防上の利益を示した。2つの最も一般的な対症療法は輸血および鎮痛剤である。大部分のSCD患者は、一般に6〜10g/dLのヘモグロビン値を有し、血管閉塞性クリーゼの間は、ヘモグロビン値は一般的には少なくとも1g/dLに下がる。血管閉塞性クリーゼによって生じる激痛は、麻薬によって治療できるが、麻薬の使用は、麻薬常用および耐性の懸念によって議論の的となる。麻薬の使用による他の合併症は、薬物探索行動、鎮静作用および呼吸抑制である。その有効性を支持する有力な根拠を欠くにもかかわらず、血管閉塞性クリーゼを治療するために、酸素制御が用いられている。血管閉塞性クリーゼ中に補水が用いられる場合もあり、成果を上げている(22、38)。
骨髄移植を考慮することができ、有効である可能性があるが、その使用は限られた数の患者に限定され、ハイリスクの罹患率・死亡率を示す(22)。
SCDにおいては、上で述べたように、鎌状赤血球、血小板、白血球および微小血管間の相互作用はP-セレクチン依存的プロセスであり、血管閉塞症および疼痛クリーゼをもたらす。ヒトβヘモグロビンS(βS)を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおける研究によって、P-セレクチン機能の抗体による抑制は、血管閉塞症を予防および/または軽減することができ、この標的に対する治療の可能性を示唆しているが示された。さらに、βSヘモグロビンを発現しP-セレクチンを欠く(遺伝子欠失により)マウスは血管閉塞症を患わないため、この病的状態におけるこの分子の重要な役割がさらに裏付けられた。
SCD患者における過剰炎症状態は、活性化単球および活性化血管内皮を特徴とする(61〜63)。同様な炎症促進性表現型は静止状態βSマウスにおいて明らかにされた。このマウスは、末梢白血球および好中球レベルの上昇、ローリングおよび接着白血球数の増加ならびに血流量および赤血球速度の減少を示す(64)。βSマウスは酸素欠乏症/再酸素化に過敏性であり、接着および移動白血球数の有意な増加によって示される炎症反応を生じた。この炎症反応は、抗マウスP-セレクチン抗体を機能的に遮断することによって完全に遮断されたが、抗マウスE-セレクチン抗体を機能的に遮断することによっては遮断されなかった。このことは、このプロセスにおけるP-セレクチンの重要な役割を明らかにしている。
これらのセレクチンは、レクチンドメイン(すなわち炭水化物認識ドメイン)、上皮増殖因子様ドメイン(EGF)、コンセンサスリピートの様々なシリーズ、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む共通の構造モチーフを共有する(70)。前述のように、白血球の最初のテターリングおよびローリングはP-セレクチンとPSGL-1との相互作用によって媒介される。従って、(1)P-セレクチンに対する抗体、(2)PSGL-1に対する抗体、(3)PSGL-1の断片またはPSGL-1の組換え体、(4)PSGL-1の結合ドメインを模倣する小分子および(5)PSGL-1に対するP-セレクチンの結合を破壊する他の分子、を用いるP-セレクチン機能の遮断によって白血球のローリングおよびテターリングを遮断することができ、それによって内皮細胞または血小板への強固な接着を阻止することができる。P-セレクチンまたはPSGL-1を欠損するマウスもまた、活性化内皮細胞上への白血球のテターリングおよびローリングを維持することができない(72、74)。L-セレクチンは、それが循環白血球上に構成的に発現され、他の白血球上でPSGL-1と相互作用することによって“二次結合”を開始することができるという点で二重の役割を果たす(75)。このプロセスによって、炎症部位への新規白血球のさらなる動員がもたらされる。PSGL-1に結合したL-セレクチンは、二次リンパ系における高血管内皮(HEV)細静脈へのリンパ球のホーミングに役割を果たしている(76)。E-セレクチンは転写的に制御され、P-セレクチン媒介事象の数時間後に活性化内皮細胞上に発現される。E-セレクチンはPSGL-1と低い親和性で結合することができるが、他のリガンドにも結合することができる。各セレクチンに対する単一のトランスジェニックノックアウトマウスにより、これらの分子が、白血球のホーミングおよびローリングに関して代償性セレクチン機構を有することが示された(77)。
例示的な図面、実験、結果および実験室手順として本開示の発明の概念の少なくとも一実施形態を詳細に説明する前に、本発明の概念が、以下の説明で述べた、あるいは図面、実験および/または結果で示した成分の構造および配置の詳細にその適用が限定されないことが理解されなければならない。本発明の概念は、他の実施形態が可能であり、あるいは種々の方法で実施または実行することができる。そのようなものとして、本明細書で用いられる術語は、その最も広い範囲および意味を提供するものとし、その実施形態は、例示的であって限定するものではないものとする。本明細書で用いられる術後および用語法は説明することが目的であり、限定するものとみなしてはならないこともまた理解されるべきである。
本明細書において開示および請求されている組成物および/または方法は、すべて、本開示を考慮して、過度の実験を要することなく製造および実行することができる。本開示の発明の概念の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念の概念、精神および範囲から逸脱することなく、組成物および/または方法ならびに本明細書に記載の方法の段階および段階の順序に変更を加えることができることは、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなすべてのこれらの類似した代替物および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の概念の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
本特許請求の範囲および/または本明細書において、用語“含んでいる(comprising)”と組み合わせて用いられる場合、語句“1つの(a)”または“1つの(an)”の使用は、“1つの(one)”を意味することができるが、“1以上の”、“少なくとも1つの”および“1または2以上の”の意味と一致する場合もある。本特許請求の範囲における用語“または(or)”の使用は、たとえその開示が代替物のみならびに“および/または”のことを言う定義を支持するものであっても、代替物のみを指すかまたは代替物が相互排他的であると明確に記載されていない限り、“および/または”を意味するために用いられる。本願を通じて、用語“約”は、ある値が、その値を測定するために用いられている装置、方法に関する誤差の固有の変動または、被験者間に存在する変動を含むことを意味するために用いられる。用語“少なくとも1つの”の使用は、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100などを含むが限定されない、1ばかりでなく2以上の任意の量を含むと理解される。用語“少なくとも1つの”は、それが結合している用語に応じて100または1000以上にまで広げることができ、さらに、より高い限度が満足な結果を生じる限りは、100/1000の量は限度であると考えてはならない。
用語“約”は、ある値が、その値を測定するために用いられている装置、方法に関する誤差の固有の変動および/または被験者間に存在する変動を含むことを意味するために用いられる。
本明細書において、“白血球ローリング”は、血管の内皮細胞への白血球の弱い接着および、強固な接着が起こる前の血管の内皮細胞に沿った白血球のローリング、および、内皮組織への白血球の遊出を含む。白血球ローリング後に、これらの接着白血球は内皮を移動し、再潅流中に虚血組織を破壊することができる。従って、白血球ローリングの抑制は、急性炎症反応によって引き起こされる組織および器官への損傷の抑制をもたらす。
用語“有効量”とは、本開示の発明の概念に従って用いられた場合に合理的な便益/リスク比に比例した、好ましくは過度な副作用(例えば毒性、刺激およびアレルギー反応)を示さずに検出可能な治療効果を示すのに十分な生物活性分子もしくはコンジュゲートまたはそれらの誘導体の量のことを言う。用語“薬学的に許容される”とは、合理的な便益/リスク比に比例した、過度な副作用、例えば毒性、刺激および/またはアレルギー反応を示さない、ヒトおよび/または動物への投与に適した化合物および組成物のことを言う。本開示の発明の概念の化合物は、当該分野で公知の製剤技術を用いて遅延放出、制御放出または持続放出を提供するために設計されることができる。
用語“エピトープ”とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用するポリペプチドにおける抗原決定基のことを言う。エピトープは、直鎖状エピトープであることもできるし、立体配座エピトープであることもできる。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の種々のセグメントからアミノ酸を空間的に並置することによって生じる。
抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的な合成ブロックである免疫グロブリンフォールドまたはドメインは、免疫系および他の生体認識系の多くの分子に種々の形で用いられている。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として知られる抗原結合領域および定常領域として知られる非可変領域を含む4つのポリペプチド鎖を有する。
天然の抗体および免疫グロブリンは、通例、約150,000ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖で構成される。各L鎖は、1つの共役ジスルフィド結合によってH鎖に結合されるが、種々の免疫グロブリンアイソタイプのH鎖の間でジスルフィド結合の数は変化する。各H鎖およびL鎖は、規則的に配置された鎖間ジスルフィド架橋も有する。各H鎖は、1つの末端に可変ドメイン(VH)を有し、次いでいくつかの定常ドメインを有する。各L鎖は、1つの末端に可変ドメイン(VL)を有し、他の末端に定常ドメインを有する。L鎖の定常ドメインはH鎖の第1定常ドメインにアラインメントされ、L鎖の可変ドメインは、H鎖の可変ドメインにアラインメントされる。
Fabは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片である。Fab断片は、全長抗体を酵素パパインで消化し、無傷のL鎖およびH鎖の1つの一部を生じさせることによって製造することができる。
Fab'は、全長抗体をペプシンで処理し、次いで還元して、無傷のL鎖および1つのH鎖の一部を生じさせることによって得ることができる抗体分子の断片である。抗体1分子当たり2つのFab'断片が得られる。
Fab'断片は、抗体ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含むH鎖CH1ドメインのカルボキシル末端のいくつかの残基が加わっているだけFab断片と異なる。
(Fab')2は、全長抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元せずに得ることができ切る抗体の断片である。F(ab')2は、2つのFab'断片が2つのジスルフィド結合によって結合した二量体である。
本明細書において、一本鎖抗体(SCA)は、遺伝子融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって結合されたL鎖可変領域とH鎖可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される。このような一本鎖抗体は、“一本鎖Fv”または“sFv”または“scFv”抗体断片とも呼ばれる。一般に、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合性のための所望の構造の形成を可能にするために、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。
本明細書において、P-セレクチンまたはその立体配座エピトープに対する抗体の“親和性”は、そのKd、すなわち解離定数によって特徴付けられる。より強い親和性はより低いKdで表され、より弱い親和性はより高いKdで表される。そのようなものとして、本発明の抗体は、好ましくは、P-セレクチン立体配座エピトープに対して、Kd≦1000nMまたは≦500nMまたは≦100nMまたは≦50nM、あるいはより好ましくは、Kd≦25nM、よりさらに好ましくは、Kd≦10nM、よりさらに好ましくはKd≦5nMまたは≦1nMまたは≦0.1nMで表される親和性を有する。
モノクローナル抗体のin vitroおよびin vivoでの操作方法は当業者に公知である。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(85)によって最初に記載されたハイブリドーマ法で製造することもできるし、例えば、米国特許第4,816,567号の記載に従って、組換え法によって製造することもできる。
他の方法は、例えば、ヒトまたは霊長類に特異的で認識できる配列を含む抗体の作成を意味する、組換えによるモノクローナル抗体のヒト化を含む。
好ましくは、他で述べたように、野生型免疫グロブリンH鎖Fc領域のエフェクター機能と比較してエフェクター機能を調節する(すなわち抑制または亢進する)ために定常領域は改変されている。種々の実施形態において、IgG定常領域は抑制されたエフェクター機能を有する。あるいはIgG定常領域は、亢進したエフェクター機能を有する。Fcエフェクター機能は、例えば、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)、食作用、補体依存性細胞障害作用および半減期またはクリアランス速度の機能を含む。FcドメインのIgGアミノ酸配列は、Fcガンマ受容体への結合(従ってADCCまたは食作用機能)に作用するように改変されることもできるし、補体系との相互作用(補体依存性細胞障害機能)を改変するように改変されることもできる。
組換え産生のために、抗体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、適切な発現ビヒクル、例えば挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入される。次いで、発現ビヒクルは、該ペプチドを発現するための適切な標的細胞にトランスフェクトされる。当該技術分野で公知のトランスフェクション技術は、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿法(87)およびエレクトロポレーション(88)を含む。本明細書に記載の抗体タンパク質を発現するために、好ましくは真核細胞を含む種々の宿主-発現ベクター系を用いることができる。
他の実施形態において、本開示の発明の概念の抗体をコードする核酸分子は、例えば本明細書に開示された配列と少なくとも50%同一であるヌクレオチド配列もまた含む。本明細書に開示された配列に対して、配列が少なくとも60%同一である、少なくとも70%同一である、少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも91%同一である、少なくとも92%同一である、少なくとも93%同一である、少なくとも94%同一である、少なくとも95%同一である、少なくとも96%同一である、少なくとも97%同一である、少なくとも98%同一である、少なくとも99%同一であるまたは少なくとも99.5%同一である実施形態および/または高ストリンジェンシーまたは中程度のストリンジェンシーの条件下で本開示の発明の概念の配列にハイブリダイズする実施形態もまた考えられる。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。
本明細書において、“中程度のストリンジェンシー”は、例えばDNAの長さに基づいて、当業者によって容易に決定されることができる条件を含む。基本的な条件はSambrookら(79)によって示されており、ニトロセルロースフィルターのための予洗液5xSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の使用、50%ホルムアミド、6xSSC、42℃(または他の同様なハイブリダイゼーション溶液、例えばStark溶液(50%ホルムアミド、42℃))のハイブリダイゼーション条件および60℃、0.5xSSC、0.1%SDSの洗浄条件を含む。
次いで、このDNA配列は組換え発現ベクターに挿入されることができ、このベクターは任意のベクターであることができ、これは好都合には、組換えDNA手順に供されることができる。ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞によって左右される。従って、該ベクターは、自律複製型ベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは独立した染色体外実体、例えばプラスミドとして存在するベクターであることができる。あるいは、該ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体(単数または複数)と共に複製されるベクターであることができる。
該組換え発現ベクターは、さらに、当該の宿主細胞内で該ベクターを複製することを可能にするDNA配列を含むことができる。このような配列の例は(宿主細胞が哺乳動物細胞の場合)SV40複製起点である。このベクターはまた、選択マーカー、例えば、その生成物が宿主細胞における欠陥を補う遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする遺伝子または薬物、例えばネオマイシン、ハイドロマイシン(hydromycin)もしくはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子を含むことができる。
該タンパク質、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれコードするDNA配列をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる手順は当業者に公知である。
あるいは、宿主細胞として真菌細胞(酵母細胞を含む)を使用することができる。適切な酵母細胞の例は、サッカロミセス種(Sacchyromyces spp.)またはシゾサッカロミセス種(Schizosaccharomyces spp.)、特にサッカロミセス・セレビシエ(Sacchyromyces cerevisiae)株の細胞を含む。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス種(Aspergillus spp.)またはニューロスポラ種(Neurospora spp.)、特にアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)またはアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は、例えばEP238023に記載されている。
組換えにより細胞によって製造されるタンパク質は、次いで、遠心分離または濾過によって培地から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムによって上清または濾液のタンパク性成分を沈殿させ、種々のクロマトグラフ法、例えばHPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することを含む慣用法によって培地から回収することができる。
該抗体が得られたら、例えば個々のB細胞が同定され、かつ/またはモノクローナル抗体が製造されたら、これらの抗体の可変領域をコードする配列を得ることができる。可変領域配列は、例えば、ハイブリドーマ、B細胞またはファージによって産生される抗体タンパク質を最初に配列決定し、コードする核酸配列を決定することによって得ることができる。一実施形態において、免疫グロブリン可変領域(VHおよびVL)DNAまたはcDNAを代わりに配列決定することができる。抗体がハイブリドーマ細胞株または単離されたB細胞由来の場合、可変領域をコードするcDNAは、例えばBabcookら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996))および国際公開番号第WO92/02551号に記載されている方法によるPCRを用いて増幅することができる。両方の参照文献の内容は、その全体が参照により明示的に本願に組み込まれる。
ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術;ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Hybridoma, 2:7 (1983)参照)およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., PNAS, 82:859 (1985)参照)によって製造することができる。ヒトモノクローナル抗体は、本開示の請求された発明の概念(単数または複数)の実施に用いることができ、ヒトハイブリドーマを用いるか(Cote et al. PNAS, 80:2026 (1983)参照)、またはin vitroでEBウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換する(Coleら、(1985)参照)ことによって製造することができる。
用語“中和抗体”または“中和する抗体”とは、抗体が特異的に結合するエピトープを含むポリペプチドの少なくとも1つの活性を抑制する抗体のことを言う。特定の実施形態において、中和抗体は、in vitroおよび/またはin vivoで活性を抑制する。用語“抗原結合部位”とは、抗原に特異的に結合することができる抗体の一部のことを言う。特定の実施形態において、抗原結合部位は1以上の抗体可変領域によって提供される。
本開示の発明の概念は、P-セレクチンに特異的に結合し、PSGL-1のP-セレクチンへの結合を遮断するばかりでなく、また既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体も解離させる“二重機能”抗体およびその断片に関する。本開示は、これまで知られていなかった、二重機能抗体(例えばキメラ、ヒトまたはヒト化抗体またはその断片であることができる)が結合するP-セレクチンのレクチンドメイン(例えば、炭水化物認識ドメイン、CRD)内の抗体結合ドメイン(立体配座エピトープ)を記載する。本開示の発明の概念はまた、本明細書に記載の立体配座エピトープに結合し、かつ(1)PSGL-1のP-セレクチンへの結合を遮断し、(2)既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体を解離させる二重機能を有する抗P-セレクチン抗体に関する。本開示の発明の概念は、特に、血小板、鎌状赤血球、白血球、リンパ球および/または内皮細胞の接着が関与する、霊長類の動物(ヒトを含む)の炎症性、血栓性もしくは他の疾患または障害の治療における二重機能抗P-セレクチン抗体またはその抗体断片の使用であって、状態または障害が、限定するものではないが、鎌状細胞血管閉塞性クリーゼ、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および腸炎)、関節炎(例えば、関節リウマチ、変形性関節症および乾癬性関節炎)、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、皮膚炎、敗血症、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、虚血性再潅流障害(例えば、心筋梗塞、発作もしくは臓器移植による)ならびに広範囲にわたる外傷もしくは慢性炎症と関連する状態、例えば、IV型遅延型過敏症、例えば結核菌による感染と関連したものまたは全身性炎症反応症候群、または多臓器不全の少なくとも1つと関連するかまたはそれを含む前記使用に関する。
より具体的には、本開示の発明の概念は、P-セレクチンに対する精製された抗体(またはその断片)、このような抗P-セレクチン抗体(またはその断片)を産生する宿主細胞、白血球、鎌状赤血球、リンパ球、血小板および内皮細胞のP-セレクチン媒介接着を遮断し、さらにPSGL-1/P-セレクチン相互作用を介した既に形成された接着または細胞複合体解離を引き起こす抗P-セレクチン抗体(またはその断片)を同定するためのスクリーニングアッセイならびにこのような抗体(またはその結合断片)を用いる治療法に関する。本開示の発明の概念は、特に、限定するものではないが、G4、G4のヒト化型およびhSel001抗体を含む霊長類(ヒトを含む)P-セレクチンおよびその結合断片に対する新規抗体を含む。本開示の好ましい抗体は、霊長類(特にヒト)P-セレクチンに特異的に結合し、in vitroおよび/またはin vivoで1以上のP-セレクチン活性を抑制することができる。本明細書においては、用語“PSGL-1”はまた、鎌状赤血球(赤血球)の“PSGL-1様受容体”を含むものとする。
本明細書の他の部分で述べたように、本開示の発明の概念の抗体断片は、本明細書に記載のP-セレクチンに結合するエピトープの全部または一部に選択的に結合する能力を保持する。好ましくは、本発明の抗体の抗体または結合断片は、配列番号1に示す配列のアミノ酸残基1〜35またはより具体的には4〜23の1以上を含むエピトープに結合することができる。
好ましい実施形態において、上で述べたように、本開示の発明の概念の抗体または抗体断片は、好ましくはP-セレクチンに高親和性(例えばKdが≦1000nM)で結合し、好ましくはヒト定常領域を含み、好ましくはP-セレクチンのPSGL-1への結合を抑制し、より好ましくは既に形成された複合体におけるP-セレクチンのPSGL-1への結合の解消を引き起こすアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG2/G4キメラの免疫グロブリンを含む。さらにまた、抗P-セレクチン抗体またはその結合断片は、好ましくは、抗体のエフェクター機能と総称される、C1qとの相互作用によって古典的経路により補体を活性化せず、好ましくはFc受容体と結合しない。本開示の発明の概念は、特に、血小板、鎌状赤血球、白血球、リンパ球および/または内皮細胞の接着が関与する、霊長類の動物(ヒトを含む)の炎症性、血栓性もしくは他の疾患または障害の治療における本明細書において記載され同定された二重機能抗P-セレクチン抗体または抗体断片の使用であって、状態または障害が、限定するものではないが、鎌状細胞血管閉塞性クリーゼ、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および腸炎)、関節炎(例えば、関節リウマチ、変形性関節症および乾癬性関節炎)、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、皮膚炎、敗血症、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、虚血性再潅流障害(例えば、心筋梗塞、発作もしくは臓器移植による)ならびに広範囲にわたる外傷もしくは慢性炎症と関連する状態、例えば、IV型遅延型過敏症、例えばツベルクル・バシリによる感染と関連したものまたは全身性炎症反応症候群、または多臓器不全の少なくとも1つと関連するかまたはそれを含む前記使用に関する。
前述のように、例えば、白血球のテターリングおよびローリングならびに赤血球(すなわち鎌状赤血球)の接着を阻止するためにP-セレクチンに対する抗体を用いるP-セレクチン機能の遮断に関する治療によって、多くのタイプの炎症性および血栓性疾患に十分な効果を発揮することができる。内皮および血小板への白血球のローリングおよびテターリングの開始におけるその枢要な役割を考慮すれば、P-セレクチンは、炎症性および血栓性障害を治療する治療法の開発のための主要標的である。例えば、器官損傷ならびに関連合併症および病的状態の再発性慢性作用は急性期の鎌状赤血球貧血の一時的な性質と相まって、P-セレクチンとPSGL-1との結合による最初の接着の遮断および以前に、進行中の、あるいは既に形成された接着の解離の誘導の両方を示す治療介入が、このおよび他の炎症性および血栓性疾患に対する新規用途を有することを示唆している。従って、本開示の発明の概念は、P-セレクチン-PSGL-1結合を遮断するばかりでなく、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体の(従って細胞-細胞複合体の)解離も引き起こす、P-セレクチンに対する“二重機能”抗体をスクリーニングし同定するためのP-セレクチンの立体配座抗体結合エピトープの使用方法ならびに、疾患、例えば限定するものではないが炎症性および血栓性疾患の治療処置のためのこのような抗体を含む。
P-セレクチンに対するいくつかの抗体の結合領域は、マウスおよびヒトにおける天然タンパク質P-セレクチンのレクチン、上皮増殖因子(EGF)およびコンセンサスリピート(CR)領域を含む大きな機能性ドメインの構築物を用いて以前マッピングされている(90、70、91〜95)。これらの結果により、P-セレクチンに対するいくつかの機能遮断抗体の主要な結合部位は、天然P-セレクチンタンパク質のアミノ酸残基1〜120にまたがる領域であるレクチン結合ドメインまたはアミノ酸121〜154にまたがるEGFドメインに存在することが示された。
〔1〕P-セレクチンの立体配座エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその結合断片であって、前記立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸位置1〜35の範囲内にある前記単離された抗体またはその結合断片。
〔2〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸4〜23の範囲内にある、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔3〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、前記〔2〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔4〕アミノ酸位置4、14、17、21および22におけるアミノ酸が、それぞれH、I、K、NおよびRである、前記〔3〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔5〕アミノ酸位置4、14、17、21または22のいずれか1つ以上が、それぞれN、N、V、RまたはHで置換される場合に結合が阻害される、前記〔4〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔6〕P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)のP-セレクチンへの結合を遮断する能力を有する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔7〕既に形成されたP-セレクチン-PSGL-1複合体を解離させる能力をさらに含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔8〕活性化内皮細胞の白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板への結合を阻害することによってP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔9〕活性化血小板の白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板への結合を阻害することによってP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔10〕活性化内皮細胞と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔11〕活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔12〕抗体またはその断片がモノクローナル抗体またはその断片である、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔13〕抗体またはその断片が、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片である、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔14〕IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMからなるクラスから選択される免疫グロブリンを含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔15〕単離された抗体またはその結合断片が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG2/G4キメラからなるアイソタイプから選択されるIgGである、前記〔14〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔16〕Fab、Fab'、F(ab)2またはscFv断片の少なくとも1つを含む、前記〔1〕に記載の結合断片。
〔17〕Kd≦1000nM、Kd≦500nM、Kd≦100nM、Kd≦50nM、Kd≦25nM、Kd≦10nM、Kd≦5nM、Kd≦1nMまたはKd≦0.1nMで立体配座エピトープに結合する、前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片。
〔18〕ATCC番号PTA12154のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体のCDRを含むヒト化抗体である、前記〔1〕に記載の単離された抗体。
〔19〕薬学的に許容される担体、ビヒクルまたは希釈剤に配合される前記〔1〕に記載の単離された抗体または結合断片を含む組成物。
〔20〕前記〔1〕に記載の抗体または結合断片を発現する細胞株。
〔21〕ATCC番号PTA12154のハイブリドーマを含む、前記〔20〕に記載の細胞株。
〔22〕前記〔21〕に記載のハイブリドーマによって産生される、単離されたモノクローナル抗体。
〔23〕モノクローナル抗体がG4で表わされる、前記〔22〕に記載の単離されたモノクローナル抗体。
〔24〕前記〔21〕に記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のCDRを含む単離されたヒト化抗体。
〔25〕炎症性または血栓性状態または障害を治療または抑制する方法であって、配列番号1のアミノ酸位置1〜35の範囲内にあるP-セレクチンの立体配座エピトープに特異的に結合する抗体またはその結合断片の治療的有効量を被験者に投与することを含む前記方法。
〔26〕立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸位置4〜23の範囲内にある、前記〔25〕に記載の方法。
〔27〕立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔28〕アミノ酸位置4、14、17、21および22におけるアミノ酸が、それぞれH、I、K、NおよびRである、前記〔27〕に記載の方法。
〔29〕アミノ酸位置4、14、17、21または22のいずれか1つ以上が、それぞれN、N、V、RまたはHで置換される場合に結合が阻害される、前記〔28〕に記載の方法。
〔30〕抗体またはその結合断片が、P-セレクチンへのP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)の結合を遮断する能力を有する、前記〔25〕に記載の方法。
〔31〕抗体またはその結合断片が、既に形成されたP-セレクチン-PSGL-1複合体を解離させる能力をさらに含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔32〕前記〔1〕に記載の抗体または結合断片が、活性化内皮細胞と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔25〕に記載の方法。
〔33〕前記〔1〕に記載の抗体または結合断片が、活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔25〕に記載の方法。
〔34〕抗体またはその結合断片が、活性化内皮細胞の白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板への結合を阻害することによってP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔25〕に記載の方法。
〔35〕抗体またはその結合断片が、活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との結合を阻害することによるP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔25〕に記載の方法。
〔36〕抗体またはその結合断片がモノクローナル抗体またはその結合断片である、前記〔25〕に記載の方法。
〔37〕抗体またはその断片が、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体またはその断片である、前記〔25〕に記載の方法。
〔38〕抗体またはその結合断片が、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMからなるクラスから選択される免疫グロブリンを含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔39〕抗体またはその結合断片が、I gG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG2/G4キメラである、前記〔38〕に記載の方法。
〔40〕結合断片がFab、Fab'、F(ab)2またはscFv断片の少なくとも1つを含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔41〕抗体またはその結合断片が、Kd≦1000μM、Kd≦500nM、Kd≦100nM、Kd≦50nM、Kd≦5nM、Kd≦10nM、Kd≦5nM、Kd≦1nMまたはKd≦.1nMで立体配座エピトープに結合する、前記〔25〕に記載の方法。
〔42〕炎症性、血栓性の状態もしくは他の状態または障害が、血小板、鎌状赤血球、白血球、リンパ球もしくは内皮細胞の接着、血管閉塞性鎌形赤血球の疼痛クリーゼ、血栓症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、乾癬、皮膚炎、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、敗血症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、関節炎および虚血性再潅流障害、広範囲にわたる外傷もしくは慢性炎症と関連する状態、全身性炎症反応症候群ならびに多臓器不全の少なくとも1以上に関連する、前記〔25〕に記載の方法。
〔43〕虚血性再潅流障害が、心筋梗塞、発作および臓器移植の少なくとも1つによって引き起こされる、前記〔42〕に記載の方法。
〔44〕抗体が被験者に、非経口、筋肉内、腹腔内、硬膜外または経口、静脈内、皮下投与または噴霧型で投与される、前記〔25〕に記載の方法。
〔45〕抗体または結合断片が、1ng/kg〜100mg/kgの量で被験者に投与される、前記〔25〕に記載の方法。
〔46〕抗体が、本明細書でG1、hSel001、G4で表されるモノクローナル抗体であるか、または前記モノクローナル抗体のCDRを含むヒト化抗体である、前記〔25〕に記載の方法。
〔47〕P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)のP-セレクチンへの細胞-細胞間結合を遮断する方法であって、配列番号1のアミノ酸位置1〜35の範囲内にあるP-セレクチンの立体配座エピトープに特異的に結合する抗体またはその結合断片を活性化血小板、白血球、リンパ球および/または鎌状赤血球に投与することを含む前記方法。
〔48〕抗体またはその結合断片が、既に形成されたP-セレクチン-PSGL-1複合体を解離させる能力をさらに含む、前記〔47〕に記載の方法。
〔49〕前記〔1〕に記載の抗体または結合断片が、活性化内皮細胞と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔47〕に記載の方法。
〔50〕前記〔1〕に記載の抗体または結合断片が、活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を有する、前記〔47〕に記載の方法。
〔51〕抗体またはその結合断片が、活性化内皮細胞の白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板への結合を阻害することによってP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔47〕に記載の方法。
〔52〕抗体またはその結合断片が、活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との結合を阻害することによるP-セレクチンの機能を遮断する能力を有する、前記〔47〕に記載の方法。
〔53〕抗体が、本明細書においてG1、hSel001、G4で表されるモノクローナル抗体であるか、または前記モノクローナル抗体のCDRを含むヒト化抗体である、前記〔47〕に記載の方法。
〔54〕P-セレクチンの立体配座エピトープを、この立体配座エピトープに結合することができる試験抗体に暴露し、エピトープ-試験抗体複合体を形成させ;エピトープ-試験抗体複合体を、P-セレクチンに結合することができるPSGL-1またはPSGL-1ミメティックに暴露し;PSGL-1またはPSGL-1ミメティックがエピトープ-試験抗体複合体に結合することができない場合に、PSGL-1のP-セレクチンへの結合を試験抗体が遮断すると結論することを含む、スクリーニング方法。
〔55〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸1〜35の範囲内にある、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔56〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸4〜23の範囲内にある、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔57〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔58〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置20および23をさらに含む、前記〔57〕に記載のスクリーニング方法。
〔59〕配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22におけるアミノ酸が、それぞれH、I、K、NおよびRである、前記〔57〕に記載のスクリーニング方法。
〔60〕立体配座エピトープが、基体に結合している無傷のP-セレクチンタンパク質の構成要素として提供される、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔61〕立体配座エピトープが、基体に結合しているP-セレクチンタンパク質の一部の構成要素として提供される、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔62〕立体配座エピトープが支持基体に結合している、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔63〕PSGL-1またはPSGL-1ミメティックが支持基体に結合している、前記〔54〕に記載のスクリーニング方法。
〔64〕抗P-セレクチン抗体を特徴付ける方法であって、能遮断抗P-セレクチン抗体が結合することができる立体配座エピトープを含むP-セレクチンタンパク質またはその断片に結合した無傷のPSGL-1タンパク質、PSGL-1断片またはPSGL-1ミメティックを含む、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体を提供し;抗P-セレクチン抗体が立体配座エピトープに結合することができるようにするのに適した条件下で抗P-セレクチン抗体に既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体を暴露し;既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体を解離させる能力に関して抗P-セレクチン抗体を特徴付けることを含む前記方法。
〔65〕立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸1〜35の範囲内にある、前記〔64〕に記載の方法。
〔66〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸4〜23の範囲内にある、前記〔64〕に記載の方法。
〔67〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、前記〔64〕に記載の方法。
〔68〕アミノ酸位置4、14、17、21および22におけるアミノ酸が、それぞれH、I、K、NおよびRである、前記〔67〕に記載の方法。
〔69〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置20および23をさらに含む、前記〔67〕に記載の方法。
〔70〕立体配座エピトープを含むP-セレクチンタンパク質またはその断片が支持基体に結合している、前記〔64〕に記載の方法。
〔71〕無傷のPSGL-1タンパク質、そのPSGL-1断片またはPSGL-1ミメティックが支持基体に結合している、前記〔64〕に記載の方法。
〔72〕支持基体および、前記支持基体に結合する立体配座エピトープを含む試験基体であって、機能遮断抗P-セレクチン抗体が前記立体配座エピトープに結合することができ、前記立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸1〜35の範囲内にある、前記試験基体。
〔73〕立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸4〜23の範囲内にある、前記〔72〕に記載の試験基体。
〔74〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、前記〔72〕に記載の試験基体。
〔75〕立体配座エピトープが、配列番号1のアミノ酸位置20および23をさらに含む、前記〔72〕に記載の試験基体。
〔76〕配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22におけるアミノ酸がそれぞれH、I、K、NおよびRである、前記〔72〕に記載の試験基体。
〔77〕立体配座エピトープが、支持基体に結合した無傷のP-セレクチンタンパク質の構成要素として提供される、前記〔72〕に記載の試験基体。
〔78〕立体配座エピトープが、支持基体に結合したP-セレクチンタンパク質の一部の構成要素として提供される、前記〔72〕に記載の試験基体。
ヒトP-セレクチン配列に置換したマウスP-セレクチンのアミノ酸は、下記のキメラにおいてボールド体で示される。マウス配列に置換したヒトP-セレクチンのアミノ酸は、イタリックボールド体で示される。グルタミンのヒスチジンへの置換は、下線のボールド体で示される。
配列番号1
ヒトP-セレクチン レクチン、EGF、CR1、CR2ドメイン
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号2
マウスP-セレクチン レクチン、EGF、CR1、CR2ドメイン-ヒトとは異なるアミノ酸はボールド体
42 WTYNYSTKAYSWNNSRVFCRRHFTDLVAIQNKNEIAHLNDVIPFFNSYYWIGIRKINNKW
102 TWVGTNKTLTEEAENWADNEPNNKKNNQDCVEIYIKSNSAPGKWNDEPCFKRKRALCYTA
162 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
222 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
282 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
ヒト/マウスキメラ構築物
配列番号3
キメラ-1
(ヒトクラスターAにおけるマウス置換-N4N14V17F18R20R21H22F23)
1 WTYNYSTKAYSWNNSRVFCRRHFTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号4
キメラ-2
(I35までヒトクラスターA-その後はマウス)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIAHLNDVIPFFNSYYWIGIRKINNKW
61 TWVGTNKTLTEEAENWADNEPNNKKNNQDCVEIYIKSNSAPGKWNDEPCFKRKRALCYTA
121 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
241 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号5
キメラ-3
(ヒトクラスターAにおける置換-マウスN4N14V17F18への)
1 WTYNYSTKAYSWNNSRVFCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号6
キメラ-4
(ヒトクラスターAにおける置換-マウスR20R21H22F23への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCRRHFTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号7
キメラ-5
(単一アミノ酸変化-ヒトH4からマウスN4への)
1 WTYNYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号8
キメラ-5Q
(クラスターAにおけるQのH4への置換-推定上のグリコシル化部位の除去)
1 WTYQYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号9
キメラ-6
(EGF-S121までヒト配列-マウスEGF、CR1およびCR2)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
241 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号10
キメラ-7
(G177までヒト配列-その後はマウス)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
241 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号11
キメラ-7B
(EGF-V156の末端までヒト配列-その後はマウス)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
241 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号12
キメラ-8
(単一アミノ酸変化-ヒトI14からマウスN14への)
1 WTYNYSTKAYSWNNSRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号13
キメラ-9
(単一アミノ酸変化-ヒトK17からマウスV17への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRVYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号14
キメラ-10
(単一アミノ酸変化-ヒトY18からマウスF18への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKFCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号15
キメラ-11
(単一アミノ酸変化-ヒトQ20からマウスR20への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCRNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号16
キメラ-12
(単一アミノ酸変化-ヒトN21からマウスR21への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQRRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号17
キメラ-13
(単一アミノ酸変化-ヒトR22からマウスH22への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNHYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号18
キメラ-14
(単一アミノ酸変化-ヒトY23からマウスF23への)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRFTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
241 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号19
キメラ-15
(クラスターC2-S97までヒト配列-その後はマウス)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSNSAPGKWNDEPCFKRKRALCYTA
121 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
241 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号20
キメラ-16
(マウスクラスターAへのヒトH4I14K17N21R22の置換)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKFCRNRFTDLVAIQNKNEIAHLNDVIPFFNSYYWIGIRKINNKW
61 TWVGTNKTLTEEAENWADNEPNNKKNNQDCVEIYIKSNSAPGKWNDEPCFKRKRALCYTA
121 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
242 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号21
キメラ-17
(クラスターBのI35までヒト配列-I42までマウスクラスターB-CR1のE154までヒト-マウスCR1、CR2)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIAHLNDVIPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
242 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号22
キメラ-17B
(クラスターBのI35までヒト配列-I42までマウスクラスターB-その後はヒト)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIAHLNDVIPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
242 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号23
キメラ-18
(マウスクラスターC(C1、C2、C3)およびマウスCR1、CR2を有するヒト配列)
1WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPFFNSYYWIGIRKNNKTW
61TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSNSAPGKWNDEHCLKKKRALCYTA
121SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
242FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号24
キメラ-18B
(マウスクラスターC(C1、C2、C3)を有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPFFNSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSNSAPGKWNDEHCLKKKRALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
242 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号25
キメラ-19
(マウスクラスターDおよびマウスCR1、CR2を有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKINNKW
61 TWVGTNKTLTEEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
242 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号26
キメラ-19B
(マウスクラスターDを有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKINNKW
61 TWVGTNKTLTEEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
242 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号27
キメラ-20
(マウスクラスターEおよびマウスCR1、CR2を有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEPCFKRKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVKECGKVNIPQHVLMNCSHPLGEFS
181 FNSQCTFSCAEGYELDGPGELQCLASGIWTNNPPKCDAVQCQSLEAPPHGTMACMHPIAA
242 FAYDSSCKFECQPGYRARGSNTLHCTGSGQWSEPLPTCEAIA
配列番号28
キメラ-20B
(マウスクラスターEを有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEPCFKRKHALCYTA
121 SCQDMSCSKQGECLETIGNYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
242 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
配列番号29
キメラ-21
(マウスクラスターFを有するヒト配列)
1 WTYHYSTKAYSWNISRKYCQNRYTDLVAIQNKNEIDYLNKVLPYYSSYYWIGIRKNNKTW
61 TWVGTKKALTNEAENWADNEPNNKRNNEDCVEIYIKSPSAPGKWNDEHCLKKKHALCYTA
121 SCQDMSCSNQGECIETIGSYTCSCYPGFYGPECEYVRECGELELPQHVLMNCSHPLGNFS
181 FNSQCSFHCTDGYQVNGPSKLECLASGIWTNKPPQCLAAQCPPLKIPERGNMTCLHSAKA
242 FQHQSSCSFSCEEGFALVGPEVVQCTASGVWTAPAPVCK---
ヤギ抗ヒトFc抗体でコーティングされたビーズに結合されたヒト/マウスキメラに対する抗P-セレクチン抗体の結合を測定するために、例えばBD BIOSCIENCES FACS ARIAセルソーターシステムでのFACS分析を用いて、P-セレクチンのヒト/マウスキメラに対する抗体結合を分析した。キメラでコーティングされたこのようなビーズを試験抗P-セレクチン抗体と共にインキュベートし、次いでそれを、FACSシステムによる検出に適したレポーター、例えばFITCで標識された、抗マウスFcまたはアイソタイプ特異的抗体で検出した。
本開示の発明の概念の一側面において、試験抗P-セレクチン抗体を捕捉するためにBIACOREチップを用いた。本明細書に記載のヒト-マウスP-セレクチンキメラを該チップ上に配置し、予め結合させたこのチップに試験抗体を添加した。共鳴応答単位(resonance response unit)によって、試験抗体に対するキメラの結合を測定した。
本開示の発明の概念の他の側面において、その表面に共有結合させたヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体を有する捕捉チップ、例えばBIACOREチップが提供された。ヒトIgG Fc上のレクチン、EGF、CR1およびCR2ドメインのP-セレクチンキメラヒト/マウス構築物を該チップ上に注入し、共鳴応答によって測定される表面コーティングの標準的レベルを達成する濃度で捕捉させた。各P-セレクチンキメラ構築物のローディング後に達成される共鳴応答レベルを新規“二次ベースライン”レベルと呼んだ。次いで、試験抗P-セレクチン抗体(例えば、G1、G3、G4、G5およびhSel001を含むマウスまたはヒト化モノクローナル抗P-セレクチン抗体)をBIACOREチップ上に注入し、表面上にすでに補足させたP-セレクチンキメラ構築物に結合させるためにインキュベートした。この方法は、マウスIgG Fc上のP-セレクチン構築物を作成し、ヤギ抗マウスIgG Fcポリクローナル抗体で補足し、次いで試験ヒト化抗P-セレクチン抗体でプローブすることによって、ヒト化抗体を試験するために改変することができる。P-セレクチン構築物に結合する抗体は、二次ベースラインからの共鳴応答レベルの増加を引き起こす。得られた共鳴応答の増加は、“追加共鳴単位(resonance unit)(RU)”として測定することができ、従って、試験抗体の捕捉チップ上にプレコーティングしたP-セレクチン構築物への結合レベルを示す。これらの方法を用い、P-セレクチンキメラに対する抗P-セレクチン抗体の特定の立体配座エピトープへの結合のための最適の必要条件が精密にマッピングされた。
特異的抗P-セレクチン抗体の二重機能性(すなわち、上記のように、これらはP-セレクチンとPSGL-1との間の結合相互作用を遮断し、かつ解離させる(解消させる)ことができる)を発見するために、BIACORE分析もまた用いた。この方法において、PSGL-1またはPSGL-1の結合エピトープの小分子ミメティック、例えばビオチン化グリコスルホペプチドミメティック(例えば、GSP-6)またはPSGL-1のN末端を含むキメラタンパク質が、当業者に公知の方法を用いてBIACOREチップ、例えばストレプトアビジンチップ上に捕捉される(GSP-6は、例えば米国特許第6,593,459号に詳細に記載されている、PSGL-1の露出されたN末端のアミノ酸42〜60のグリコシル化され硫酸化された18アミノ酸からなるペプチドミメティックである)。最初に、一実施形態において、“機能遮断”能力を明らかにするために、抗P-セレクチン抗体は可溶性P-セレクチンとプレミックスされ、P-セレクチン/抗体複合体の形成を可能にする期間インキュベートされる。得られた抗P-セレクチン抗体/P-セレクチン複合体は、PSGL-1(またはPSGL-1ミメティック)を含むチップまたは他の基体上に導入され、PSGL-1またはそのミメティックへの結合が測定される。該チップ上でPSGL-1またはPSGL-1ミメティックへのP-セレクチンの結合を阻止する抗P-セレクチン抗体は、本明細書において、機能遮断抗体と呼ばれる。
成熟ヒトおよびマウスP-セレクチンタンパク質の三次元(3-D)構造を分析し、レクチンおよびEGFドメインにおけるアミノ酸の相違に関して比較した。タンパク質の露出面で、立体配座アミノ酸の相違に関する6つのクラスターを同定した。これらは、クラスターA、B、C、D、EおよびFと呼ばれた(図1)。残基1〜35にわたるヒトとマウスのP-セレクチンのN-末端は8つのアミノ酸の相違を含む。クラスターAは、最初のアミノ酸の相違(H4)および最後のアミノ酸の相違(Y23)の境界によって任意に定義された。クラスターAは20のアミノ酸を含み、該タンパク質のN末端付近のシステイン結合で堅いαへリックスを形成する(図5における領域“1”参照)。クラスターB(図1)はアミノ酸残基36〜42にわたる立体配座エピトープであり、ヒトとマウスのP-セレクチンの間に4つのアミノ酸の相違を含む。本明細書においては、用語“立体配座エピトープ”は、還元条件下では認識されないエピトープを指すものとする。クラスターCおよびE(図1)は立体配座であり、かつ不連続であり、天然P-セレクチンタンパク質のフォールディングによって近接させられている。クラスターCは、ヒトとマウスのP-セレクチンの間に5つのアミノ酸の相違を含む3つの配座領域(C1、C2、C3)を有する。クラスターC1は、51のアミノ酸によってC2と隔てられており、クラスターC2は15のアミノ酸によってC3と隔てられている。同様に、クラスターEは、ヒトとマウスのP-セレクチンの間に5つのアミノ酸の相違を含む2つの立体配座エピトープ(E1、E2)を有し、クラスターE1はE2と19のアミノ酸によって隔てられている。クラスターA、B、C、DおよびEは、P-セレクチンのコンセンサスレクチンドメイン内に存在する(図1)。クラスターFはEGFドメイン内に存在し、11のアミノ酸の内、3つのアミノ酸の相違を有する。クラスターC1、E1、C2、E2およびC3は、P-セレクチンとその生理学的リガンドPSGL-1との相互作用に関して以前同定された重要な接触残基を含む(Somers et al)。クラスターAおよびBは、これらの接触残基の遠位(上流)にある。
配列番号1〜29に対応する構築物またはキメラを用いた抗P-セレクチン抗体のFACS分析の結果を表1にまとめる。レクチンおよびEGFドメインを含むヒト組換えP-セレクチンを用いるマウスの免疫処置によって作成されたハイブリドーマから4つの抗P-セレクチン試験抗体(G1、G3、G4およびG5)が単離された(90および未公表データ)。これらの研究によって、これらの抗体はヒトP-セレクチンに特異的であり、G1、G3およびG4は機能遮断抗体であるが、G5は非遮断であることが示されている(90および未公表データ)。G1、G3およびG5をFACS分析によって分析した。この方法を用いたとき、G1、G3およびG5はすべてヒトP-セレクチン(配列番号1)に結合したが、マウスP-セレクチン(配列番号2)には結合しなかった。ヒト配列のクラスターAにおいて、対応する8つのマウスアミノ酸を置換した場合(キメラ1、配列番号3)、G1による結合は破壊されたが、G3またはG5による結合は破壊されなかった。このことは、クラスターAにおける対応する8つのアミノ酸位置の少なくとも1以上が、G1のP-セレクチンへの結合に必須であり、これらの1以上の位置での“マウス”アミノ酸による置換により結合が破壊されたことを示した。これらの残基の重要性を確認するために、位置1〜23における8つの異なるヒトアミノ酸をマウス配列のクラスターAにおいて置換した(配列番号4、キメラ-2)。これらの置換によって、G1にマウスタンパク質への結合が付与された。EGF、CR1およびCR2ドメインにマウスアミノ酸置換を有するヒトP-セレクチンレクチンドメインを含むキメラ(配列番号9、キメラ-6)ならびに、EGFドメインを通じ、かつCR1ドメインにヒト配列を含み、CR1ドメインの残りおよび全CR2ドメインにマウス配列を含むキメラ(配列番号10、キメラ-7)はG1およびG3によって結合されたが、これは、これらのマウスアミノ酸の置換後に主要な結合エピトープが無傷で残っており、抗体結合エピトープの立体配座が悪影響を受けていないことを示している。これらのデータにより、G1およびG3に対する結合エピトープがレクチンドメインに存在することが確定された。
前もって非遮断であることが示されている試験抗体G5もまたこの方法を用いて分析した。G5もまたヒトP-セレクチンに結合するが、マウスP-セレクチンには結合しないことが示されている。G5は、配列番号3および、EGFドメインにまたがり、N178までのCR1の最初の部分を含む配列番号10に結合したが、G5は、S128までまたがる配列番号9には結合しなかった。抗体G5は、CR1の最初の部分に結合し、少なくともアミノ酸R128からN178までを必要とすることをこれらの結果は示している。
G1抗体のP-セレクチンへの結合に対するクラスターAドメイン(アミノ酸4〜23)の重要性をさらに研究するために、1つまたは複数のマウスアミノ酸がヒトP-セレクチン配列に挿入されたいくつかのキメラ構築物を作成し、本明細書に開示された表面プラズモン共鳴(“1段階”BIACORE)法を用いて結合を分析した。1段階BIACORE結合結果を表1に示す。G1試験抗体はBIACOREチップに捕捉され、種々のキメラの結合が応答単位で測定された。ヒトP-セレクチン(配列番号1)、ヒトクラスターAを有するマウスP-セレクチン(配列番号4)およびマウスP-セレクチン(配列番号2)の構築物へのG1の結合を示す代表的センサグラムを図2に示す。この方法を用いたとき、G1はヒトP-セレクチンおよび配列番号4(マウスP-セレクチンのクラスターAにおいてヒトアミノ酸が置換されている)に結合するが、マウスP-セレクチン(配列番号2)には結合しないことが示された。これらの結果により、この方法がFACS結果と一致することが明らかとなった。
G1のヒト化型(hSel001)が親抗体の同一のエピトープ特異性を維持したことを確認するために、hSel001の配列番号1、2および20への結合をこの方法を用いて試験した。hSel001の結合パターンはG1の結合パターンと同一であった。これにより、ヒト化プロセスの間、エピトープ特異性が維持されていることが確認された。
追加のキメラへのG1、G3、G4およびG5(G5は非遮断性)の結合を評価するために、本明細書に記載の2段階表面プラズモン共鳴(“2段階”BIACORE)アッセイを用いた。試験抗体に関する“2段階”アッセイの結果を表1および図2に示す。この方法を用いたとき、研究された試験抗体のいずれもがマウスP-セレクチンに結合せず、すべてがヒトP-セレクチンに結合した。このことより、それらのヒトP-セレクチンへの特異性が明らかにされた。G1、G3、G4およびG5試験抗体はすべて配列番号10に結合した。このことは、それらすべてが、ヒトP-セレクチンのN末端からレクチンおよびEGFドメインにわたる領域に結合することを示唆している。G5非遮断抗体は、配列番号9に結合せず、配列番号10に結合したが、このことより、G5がCR1ドメインに結合することが確認された。
第1に、P-セレクチン抗体は、P-セレクチンに結合することができるが、P-セレクチンへのPSGL-1の結合には干渉しない(“非遮断”)。例えば、本明細書に記載されているように、抗体G5はアミノ酸157〜164に結合し、結合にはCR1のR157、E161、L162、E163およびL164を必要とするが、この結合はP-セレクチンのPSGL-1への結合を遮断しない。
第2に、P-セレクチン抗体は、P-セレクチンに結合し、P-セレクチンへのPSGL-1の結合に干渉することができるが(“機能遮断”)、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体に結合するかまたはそれを解離させない。例えば、本明細書に記載の結果は、抗体G3が、レクチン-リガンド結合ドメインにわたるP-セレクチンの異なる部分における立体配座クラスターに結合することを示す。G3はクラスターCに結合し、C1アミノ酸Y44、Y45、S46およびC2アミノ酸P98およびC3アミノ酸H114を必要とし、従って立体配座エピトープを必要とする。この抗体は、P-セレクチンとPSGL-1との間の相互作用を遮断するが、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体に結合するかまたはそれを解離させることができない。
第3に、P-セレクチンに結合することができる特別な特異性を有し、P-セレクチンへのPSGL-1の結合を遮断するばかりでなく(機能遮断抗体)、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1結合の解消(解離結合)も引き起こすことができるP-セレクチン抗体を我々は見出した。このような抗体は、本明細書において、“二重機能”抗体と呼ばれる。本明細書に開示された結果は、例えば、G1がクラスターAにおける立体配座エピトープに結合し、この結合が、アミノ酸位置4、14、17、21および22を含み、好ましくは、これらのアミノ酸がそれぞれH、I、K、NおよびRである、立体配座エピトープに関する絶対的な必要条件を有していたことを明らかにしている。本明細書の他の部分で先述のように、これらの位置のいずれか1つにおける“ヒト”アミノ酸(H、I、K、NおよびR)の、それぞれ、対応する“マウス”アミノ酸(N、N、V、RおよびH)での置換は、本明細書に記載の二重機能抗体による結合の解消をもたらすであろう。
抗体G1、G4およびhSel001の遮断および解離特性をさらに評価するために、低レベルおよび高レベルの膜P-セレクチンでコーティングされたフローチャンバ内で1.0dyn/cm2のフロー下で導入された新鮮分離ヒト好中球を用いて細胞ベースのin vitroローリングアッセイを行った。低密度P-セレクチンは0.25μg/mlでコーティングされ、高密度P-セレクチンは2μg/mlでコーティングされた。I125標識G1mAbを用いて、部位密度を50部位/mm2(低)および380部位/mm2(高)であると測定した。低密度P-セレクチン上では、好中球は、平均速度5μm/sまたは6.5μm/sのいずれかでローリングした。高密度P-セレクチン上では、好中球は平均速度1μm/sでローリングした。好中球は、緩衝液で、フロー下で導入し、ローリングおよびテターリングを開始させた。平衡化した後、試験抗体(G1、G3、G4およびhSel001)を無細胞緩衝液で、フロー下で導入した。抗体がチャンバに到達するまでに、約1分間の間隔のデッドボリュームが存在する。その後1分間隔で、結合したままの細胞を計数し、%結合細胞で表した。ビデオ顕微鏡検査でおおよそ0〜20分間結果を記録し、データをラン後に記録した。
高密度P-セレクチン上の図6パネル(B)および(D)における結果は、より多くの数のP-セレクチン結合部位が利用可能なため、好中球はかなり遅く(1μm/s)ローリングすることが示された。多くの好中球は、この密度で、P-セレクチン上でローリングを停止する。これらの条件下で、マウス抗体G1およびG4ならびにヒト化抗体hSel001は、直ちにそして1〜8分間、P-セレクチン/PSGL-1複合体の解離によって好中球をローリングおよびテターリングさせることができた。対照的に、G3抗P-セレクチン抗体は、好中球のローリングを遮断するのに16〜20分間を必要とした。このことにより、G3抗体は、占拠されていないP-セレクチン部位に結合し、従ってP-セレクチン/PSGL-1複合体を遮断することはできるが、あらかじめ形成された複合体に結合し、それを解離させることはできなかったことが示された。フロー下でのこれらの細胞-結合アッセイによって、マウス抗体G1およびG4ならびにヒト化抗体hSel001は、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体の遮断および解離を引き起こす二重機能特性をすべてが有することを示す、本明細書において以前報告したBIACORE結果が確認される。
G1およびhSel001のP-セレクチン結合親和性をin vitroで分析し、表面プラズモン共鳴(BIACORE)を用いて比較した。可溶性ヒトP-セレクチンをBIACORE CM5チップに共有結合させ、マウス抗体G1およびヒト化抗体hSel001をチップに導入することによって独立して試験した。
抗P-セレクチン抗体とP-セレクチン(抗原)との相互作用をさらに評価するために、表面プラズモン共鳴(SensiQ)を用いる速度論的解析を行った。マウスモノクローナル抗P-セレクチン抗体G1およびヒト化hSel001抗体を、SensiQでの表面プラズモン共鳴によって分析した。これらの2つの抗体の結合のキネティクスを分析するために、組換えタンパク質Gを共役結合させることによってセンサーチップを官能基化した。20nM溶液を1分間注入することによって、マウス抗体G1を導入し、チップ上に補足させた。10nM溶液を1分間注入することによって、同様に官能基化された別のチャンネル上へヒト化抗体hSel001を導入し捕捉させた。いくつかの濃度の可溶性ヒトP-セレクチン(100nM〜1.56nM)を導入し、結合を応答単位(RU)で測定した。それぞれの結合のデータをQdat分析ソフトウェアを用いて分析した。
図7は、単一のP1-セレクチン濃度での両方の抗体の結合結果を示す。
医薬組成物の製造のための前記抗体の抗体または機能的に活性な断片もしくはバリアントの使用ならびに、炎症反応または疾患または血栓症、例えば限定するものではないが本明細書に記載のものの予防および/または治療におけるその使用は、本開示の発明の概念の重要な目的である。
本明細書の他の部分で述べた様に、P-セレクチン/PSGL-1結合の現象は、鎌状赤血球、内皮細胞白血球および血小板相互作用および/または微小小胞接着、白血球ローリング、動員、凝集;サイトカインの白血球分泌;凝固の促進;ならびに、限定するものではないが、鎌状細胞血管閉塞性クリーゼ、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸炎)、関節炎(例えば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎)、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、皮膚炎、敗血症、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、虚血性再潅流障害(例えば、心筋梗塞、発作もしくは臓器移植による)ならびに広範囲にわたる外傷もしくは慢性炎症と関連する状態、例えば、IV型遅延型過敏症、例えばツベルクル・バシリによる感染と関連したものまたは全身性炎症反応症候群、または多臓器不全を含む炎症、血栓症、凝固、免疫応答およびシグナル伝達の他の側面に機能的重要性を有する。本明細書に記載のP-セレクチンに対する中和抗体(またはその断片)は、例えばin vivoまたはin vitroで、P-セレクチン/PSGL-1受容体結合(または鎌状赤血球の場合は、P-セレクチン/PSGL-1様受容体結合)を介した、患者におけるこれらの活性の1以上を抑制すると考えられる。従って、本明細書に記載の中和抗体(またはその断片)によるP-セレクチン/PSGL-1結合の阻害は、本明細書に記載のものを含むが限定されない種々の状態および障害の患者の治療に有用である。
上で述べたように、本開示の発明の概念は、P-セレクチンに対する抗体、このような抗P-セレクチン抗体を産生する宿主細胞、このような抗P-セレクチン抗体発現コードするDNAを含むベクターならびに、P-セレクチン/PSGL-1結合を遮断し、他の実施形態において既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体の解離も引き起こす“二重機能”を有する抗P-セレクチン抗体を同定するためのスクリーニング方法に関する。従って、一実施形態において、本開示の発明の概念は、ヒトP-セレクチン(配列番号1)のアミノ酸1〜35、より好ましくはアミノ酸4〜23における立体配座エピトープ(例えば本明細書に記載の立体配座エピトープ)に特異的に結合し、P-セレクチンへの結合からPSGL-1またはそのミメティックを遮断し、それへのこのような結合を解消させることができ、それによってP-セレクチン/PSGL-1結合によるセレクチン媒介接着を遮断し、既に形成されたP-セレクチン/PSGL-1複合体の解離を引き起こす二重機能を示す抗P-セレクチン抗体を同定する方法に関する。
このスクリーニングアッセイの別の実施形態において、立体配座エピトープを含むP-セレクチンまたはP-セレクチンの一部は、PSGL-1よりもむしろ支持基体に結合することができる。PSGL-1またはその高分子量ミメティック、例えばGSP-6/ビオチン/アビジン複合体は、次いで支持基体上のP-セレクチンに暴露され、PSGL-1/P-セレクチン複合体が形成される。次いで、PSGL-1/P-セレクチン複合体が機能遮断抗P-セレクチン抗体に暴露され、例えば本明細書の他の部分で記載のようにBIACORE法を用いて複合体の解離が評価される。
本アッセイのさらに他の実施形態において、抗P-セレクチン抗体自身が支持基体に結合しており、P-セレクチン/PSGL-1複合体がそれに暴露され、上記のようにその解離が測定される。
限定するものではないが、米国特許出願番号第12/974,539号;第12/974,739号;第12/516,987号;およびWO2008/069999を含む本明細書に記載の引用文献、特許または公報のそれぞれは、参照によりその全体が明示的に本願に組み込まれる。
Claims (16)
- 炎症性または血栓性状態または障害の慢性環境における進行中のP-セレクチン媒介接着の治療のための医薬組成物であって、配列番号1のアミノ酸位置1〜35の範囲内にあるP-セレクチンの立体配座エピトープに特異的に結合し、P-セレクチンへのP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)の結合を遮断する能力を含み、かつ、既に形成されたP-セレクチン-PSGL-1複合体を解離させる能力をさらに含む抗体またはその結合断片の治療的有効量を含む前記医薬組成物。
- 鎌状赤血球症における進行中の慢性血管閉塞の治療のための、請求項1記載の医薬組成物。
- 立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸位置4〜23の範囲内にある、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 立体配座エピトープが配列番号1のアミノ酸位置4、14、17、21および22を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体または結合断片が、活性化内皮細胞と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体または結合断片が、活性化血小板と白血球、リンパ球、鎌状赤血球および/または血小板との間の細胞-細胞間結合を解離させる能力を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体またはその結合断片がモノクローナル抗体またはその結合断片である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体またはその断片が、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体またはその断片である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体またはその結合断片が、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMからなるクラスから選択される免疫グロブリンを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体またはその結合断片が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG2/G4キメラである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 結合断片がFab、Fab’、F(ab)2またはscFv断片の少なくとも1つを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体またはその結合断片が、Kd≦1000nM、Kd≦500nM、Kd≦100nM、Kd≦50nM、Kd≦25nM、Kd≦10nM、Kd≦5nM、Kd≦1nMまたはKd≦0.1nMで立体配座エピトープに結合する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 炎症性、血栓性の状態もしくは他の状態または障害が、血小板、鎌状赤血球、白血球、リンパ球もしくは内皮細胞の接着、血管閉塞性鎌形赤血球疼痛クリーゼ、血栓症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍転移、アレルギー反応、甲状腺炎、乾癬、皮膚炎、腎炎、エリテマトーデス、強皮症、敗血症、鼻炎、アナフィラキシー、糖尿病、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、関節炎および虚血性再潅流傷害、広範囲にわたる外傷もしくは慢性炎症と関連する状態、全身性炎症反応症候群および多臓器不全の少なくとも1以上に関連する、請求項1または3〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体が被験者に、非経口、筋肉内、腹腔内、硬膜外、経口、静脈内、皮下投与または噴霧型で投与される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体または結合断片が、0.1mg/kg〜100mg/kgの量で被験者に投与される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 抗体が、本明細書でG1、hSel001、G4で表されるモノクローナル抗体であるか、または前記モノクローナル抗体のCDRを含むヒト化抗体である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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