JP2007525973A - 抗体の特徴を改善した遺伝子組み換え抗体産生細胞株 - Google Patents

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Abstract

【解決手段】 ヒトミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を利用し、高頻度変異細胞および生物を作成することができる。活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）が発現した細胞が選択され、ＡＩＤを産生するように刺激され、操作されて、さらに高頻度変異が増強するようにＡＩＤを発現してもよい。これらの方法は、対象抗原に対する免疫グロブリン遺伝子に遺伝的多様性を発生させ、生化学的活性が上昇するように変化した抗体を産生するために有用である。さらに、これらの方法は、抗体産生レベルが上昇した抗体産生細胞を発生させるために有用である。
【選択図】 図７

Description

関連出願書類の相互参照
本出願は、２００３年９月３日に出願された米国仮出願番号第６０／５００，０７１号に対して優先権を主張した２００４年９月２日の顧客参照番号ＭＯＲ−０３７１として出願された米国出願番号第 号に対して優先権を主張するものであり、それぞれの全体はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。
本発明は、抗体の成熟と細胞生産の分野に関するものである。特に、変異誘発性の分野に関係する。
外来性および／または内因性ポリペプチドの活性を遮断するために抗体を使用する方法は、疾患の基礎原因の治療に効果的で選択的な戦略を提供する。特に、ＦＤＡで承認された、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの抗血小板ＭＡｂであるＲｅｏＰｒｏ（Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．（１９９６）Ｃａｎ ＲｅｏＰｒｏ ｒｅｐｏｌｉｓｈ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６〜１２１７）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ ＭＡｂであるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９９）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３〜５１）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより生産された抗呼吸器合胞体ウイルスＭＡｂのＳｙｎａｇｉｓ（Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ．Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７〜７９１）など、効果的な治療法としてモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が使用されている。
候補タンパク質標的に対するＭＡｂｓを作成する標準的な方法は、当業者に知られている。簡単に言えば、マウスやラットなどの齧歯類に、免疫反応を発生させるアジュバント存在下、精製された抗原が注射される（Ｓｈｉｅｌｄ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯＫＴ３ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｄａｖｅｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２７：８５５〜８６４）。免疫血清が陽性の齧歯類は屠殺され、脾細胞が単離される。単離された脾細胞はメラノーマと融合され、不死化細胞株を生産し、その抗体生産がスクリーニングされる。陽性細胞株が単離され、抗体生産の特徴が決定される。ヒト治療薬として齧歯類のＭＡｂｓを直接使用することは、ヒト抗齧歯類抗体（ＨＡＲＡ）反応が、有意な数の齧歯類由来抗体を投与した患者で発生した（Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２〜５２）という事実により混乱した。ＨＡＲＡの問題を回避するため、前記抗原結合ドメインを作り、前記免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットの重鎖および軽鎖可変領域にみられる重要なモチーフである相補性決定領域（ＣＤＲ）をこれらのキメラ分子に見られるヒト抗体骨格に接合すると、抗原結合活性を保持することができるが、前記ＨＡＲＡ反応はなくなる（Ｅｍｅｒｙ， Ｓ．Ｃ．， ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"Ｉｎ：ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９５．ｐｐ．１５９〜１８３）。齧歯類由来ＭＡｂｓ（本文ではＨＡｂと呼ぶ）の「ヒト化」中の共通の問題は、ヒトＩｇ骨格に接合すると、ＣＤＲドメインの３次元骨格で立体配座が変化することにより、結合親和性が失われることである（Ｑｕｅｅｎらの米国特許番号５，５３０，１０１）。この問題を克服するため、通常はフレームワーク領域および／またはＣＤＲコード化領域自体の中でさらにアミノ酸残基を挿入するか、欠失することで、ＨＡｂの親和性を再び高くし、追加ＨＡｂベクターを作成する必要がある（Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号）。このプロセスは、高価なコンピュータモデリングプログラムを使用し、ＨＡｂの親和性を高める可能性がある変化を予測することを含む、非常に時間のかかる方法である。場合によってはＨＡｂの親和性がＭＡｂの親和性を復元せず、治療にほとんど使用されないこともある。
抗体作成における別の問題は、臨床材料となる分子を生産するために必要な、安定的、高収率産生細胞株の作成法である。この問題を回避するため、当業者によって標準的な方法にいくつかの戦略が採用された。１つの方法は、前記接合したヒト軽鎖および重鎖を含む外因性Ｉｇ融合遺伝子を形質転換し、抗体全体または単鎖抗体を作成するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用するものであり、この抗体は抗原結合ペプチドを形成する軽鎖および重鎖をいずれも含むキメラ分子である（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３〜５７６）。別の方法では、ヒト移植免疫系を含むトランスジェニックマウスまたはヒトＩｇ遺伝子レパートリーを含むトランスジェニックマウス由来のヒトリンパ球を使用している。さらに別の方法では、霊長類のＭａｂを生産するためにサルを利用し、ヒト抗サル反応がないことが報告された（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．（１９９７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｉｃｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３８６：２５〜２６）。すべてのケースで、十分な量の高親和性抗体を作成することができる細胞株の作成では、臨床研究用に十分な材料を作成するには大きな制約がある。これらの制約があるため、植物など他の組み換え系の有用性は、現在、ヒト化抗体を安定的に高レベルで生産する系として調査されている（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．（１９９５）Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｓ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１０９０〜１０９３）。
天然で抗体の多様性に寄与する他の因子は、クラススイッチ組み換え（ＣＳＲ）現象と体細胞超変異現象である。クラススイッチ組み換えはＤＮＡレベルでの領域特異的組み換えであり、免疫グロブリン重鎖領域を互いに置換する。体細胞超変異は、免疫グロブリン遺伝子が完全に構築されているにもかかわらず、可変領域のみで変異がある現象の名称である。体細胞超変異は抗体の親和性成熟を促すと考えられる。
ＣＳＲおよび体細胞超変異の両方で重要な役割を果たすことが分かっている酵素は、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」または「ＡＩＣＤＡ」）である。ＭｕｒａｍａｔｓｕらはマウスＡＩＤをクローニングしたが（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２６）：１８４７０〜１８４７６）、前記ヒトＡＩＤはＭｕｔｏらによってクローニングされた（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６８：８５〜８８）。マウスとヒトのＡＩＤはアミノ酸レベルで９２％同一であり、いずれも１９８アミノ酸と保存されたシチジンデアミナーゼモチーフを含む。ＡＩＤはＤＮＡに障害を誘導するように作用すると考えられている（つまり、デオキシシチジンの脱アミノ化によりｄＵ／ｄＧペアとなる）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｍａｈｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：９９〜１０４）。ＡＩＤは胚中心の刺激されたＢ細胞のみで発現されるように思われ（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１６：３４０〜３４５）、ＣＳＲ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：６６０〜６６５）および体細胞超変異（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２０３３〜２０３６）両方の原因となっているように思われる。
Ｒｅｖｙらは、ＡＩＤ遺伝子に欠陥があるヒト患者（高ＩｇＭ症候群またはＨＩＧＭ２）には、ＣＳＲおよび体細胞超変異活性の両方がないことを示した（Ｒｅｖｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ １０２：５６５〜５７５）。同様に、ＡＩＤ−／−マウスの脾臓細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激しても、体細胞超変異またはＣＳＲを行わなかった（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ １０２：５５３〜５６３）。
ＨＡｂｓおよびＭＡｂｓとなり、抗原親和性が高い可変ドメイン内で様々な抗体配列を作成する方法は、それぞれ、より強力な治療薬および診断薬の作成に有用であろう。さらに、抗体分子全体でランダムに変化させたヌクレオチドおよびポリペプチド残基を生成すると新しい試薬ができ、これは抗原性が低く、および／または有益な薬物動態学的性質を有する。
ここで説明した発明は、宿主細胞の内在性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性を遮断し、ＡＩＤ活性を刺激することで、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗体構造全体のランダム遺伝子変異を利用し、生化学的に活性な抗体をコードする、免疫グロブリンを生産することに関するものである。本発明は、結合強化と薬物動態学的プロフィールにより、繰り返しｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子変化と抗体の選択に利用される方法に関するものでもある。
さらに、より多くの抗体を分泌できる遺伝子組み換え宿主細胞を開発することができれば、製品開発用の細胞宿主を作成する貴重な方法を提供することになる。ここで説明した発明は、ＭＭＲを遮断し、ＡＩＤを刺激することによる抗体生産の亢進と、遺伝子組み換え細胞宿主の作成に関するものである。
本発明は、高親和性抗体の作成と、抗体生産レベルが上昇した細胞株の生産を促進する。本発明の他の利点は、ここで説明される実施例と図で述べられる。
本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで（単鎖分子を含む）遺伝子組み換え抗体と抗体産生細胞宿主を作成する方法を提供し、それによって抗体がこれだけに限らないが、抗原結合性の亢進、遺伝子発現の亢進、および／または前記宿主細胞による細胞外分泌の亢進など、望みの生化学的性質を有する。結合活性が上昇した抗体または抗体産生が増加した細胞を同定する１つの方法は、結合活性が上昇した分子または多量の抗体産物を産生するように遺伝子組み換えされたクローンを産生する、ＭＭＲ欠損抗体産生細胞クローンのスクリーニングを介している。
本発明での使用に適した抗体産生細胞には、これだけに限らないが、齧歯類、霊長類、またはヒトハイブリドーマまたはリンパ芽球様細胞、外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を形質転換するか、発現した哺乳類細胞、外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を形質転換するか、発現した植物細胞、酵母、または細菌を含む。
従って、本発明では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを抗体を産生することができる細胞に導入することで、高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法を提供する。抗体を産生することができる細胞には、自然に抗体を産生する細胞、免疫グロブリンコード化配列の導入により抗体を産生するように設計された細胞を含む。都合の良いことに、ポリヌクレオチド配列の細胞への導入は、形質転換により達成される。
本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫性を与えられた免疫グロブリン産生細胞から高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を生産する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血細胞と免疫原性抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせる工程と、（ｂ）親ハイブリドーマ細胞を形成するために、前記免疫グロブリン産生細胞と骨髄腫細胞を融合する工程であって、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する、工程と、（ｃ）活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現について、スクリーニングを行う工程と、（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートする工程によって、突然変異を誘発させることが可能となり、高頻度変異ハイブリドーマ細胞を形成するものである工程とを有する。前記細胞は、さらに前記免疫抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞についてスクリーニングされうる。前記選択された細胞が操作され、前記細胞のゲノムを再安定化するため、前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を不活化してもよい。前記選択された細胞も操作され、ＡＩＤの発現を不活化してもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫法の特定の実施例では、前記免疫グロブリン産生細胞および／または前記骨髄腫細胞でミスマッチ修復が自然に欠乏し、融合した時点で、得られたハイブリドーマ細胞でミスマッチ修復が自然に欠乏している。そのようなケースでは、前記ゲノムを再安定化した場合、前記細胞が操作され、当該分野で知られているどの方法によっても、遺伝的に補完される必要がある。例えば、これだけに限らないが、前記ＭＭＲ欠乏症はミスマッチ修復に対して重要な遺伝子がないことが原因の場合、前記正常ＭＭＲ遺伝子が置換され、ＭＭＲ活性が回復されるように、前記遺伝子は発現制御配列と操作により結合した細胞に再導入されてもよい。前記ＭＭＲ遺伝子の発現は構成または誘導プロモーターの制御下とすることができる。前記ＭＭＲの欠陥が前記ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現である他のケースでは、前記ゲノムが前記ＭＭＲ遺伝子の不活化によって補足されうる。例えば、これだけに限らないが、前記不完全ＭＭＲ対立遺伝子は前記技術者に既知の方法で、全体または一部がノックアウトされ、前記対立遺伝子がもはやミスマッチ修復に対するドミナントネガティブ効果を示さないようにしてもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫法の他の実施例では、前記ハイブリドーマ細胞がＭＭＲ欠乏性となるように操作される。特定の実施例では、前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が、前記抗体産生細胞に導入される。他の実施例では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が、前記骨髄腫細胞に導入される。他の実施例では、前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が、前記ハイブリドーマ細胞に導入される。前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の導入が、これだけに限らないが、形質転換など当該分野で既知の方法により行うことができる。
本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫性を与えられた免疫グロブリン産生細胞から高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を生産する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血細胞と免疫原性抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせる工程と、（ｂ）親ハイブリドーマ細胞を形成するために、前記免疫グロブリン産生細胞とミエローマ細胞を融合する工程と、（ｃ）活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現について、スクリーニングを行う工程と、（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートする工程によって、突然変異を誘発させることが可能となり、高頻度変異ハイブリドーマ細胞を形成するものである工程とを有する。前記細胞は、さらに前記免疫抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞についてスクリーニングされうる。前記選択された細胞も操作され、ＡＩＤの発現を不活化してもよい。
本発明では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫性を与えられた免疫グロブリン産生細胞から高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を生産する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血細胞と免疫原性抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせる工程と、（ｂ）親ハイブリドーマ細胞を形成するために、前記免疫グロブリン産生細胞とミエローマ細胞を融合する工程であって、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現するものである、工程と、（ｃ）活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現を誘導する工程と、（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートする工程によって、突然変異を誘発させることが可能となり、高頻度変異ハイブリドーマ細胞を形成するものである工程とを有する。前記細胞は、さらに前記免疫抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞についてスクリーニングされうる。前記選択された細胞が操作され、前記細胞のゲノムを再安定化するため、前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を不活化してもよい。前記選択された細胞も操作され、ＡＩＤの発現を不活化してもよい。
いくつかの実施例では、前記ＡＩＤ遺伝子が前記抗体産生細胞に導入され、ミエローマ細胞またはハイブリドーマ細胞が操作可能な結合を作り、ＡＩＤが前記細胞に発現されるように、発現制御配列を発現する。特定の実施例では、ＡＩＤが誘導プロモーターと操作可能な結合を作る。いくつかの実施例では、細胞が望みの表現型についてスクリーニングされると、前記遺伝子を部分的または完全にノックアウトする、前記誘導プロモーターの誘導因子を取り除くなどにより、前記ＡＩＤを不活化するなど、当該分野で既知の方法により、ＡＩＤの発現がオフになる。いくつかの実施例では、前記抗体産生細胞、ミエローマ細胞、および／またはハイブリドーマ細胞がさらに操作され、ミスマッチ修復が欠失する可能性がある。いくつかの実施例では、これがミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を細胞に導入することで達成される。他の実施例では、ＷＯ ０２／０５４８５６（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、２００１年１月１５日に提出）で説明されているとおり、これはミスマッチ修復の化学的阻害剤中で前記細胞をインキュベートすることで達成される。前記細胞のゲノムを再固定するため、ＭＭＲが化学的に抑制される場合に、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子が不活化されるか、例えば、前記化学的阻害剤が中止または希釈されてもよい。
本発明では、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２などのドミナントネガティブミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を、抗体を産生することができる細胞に導入することで、高頻度変異可能な抗体を産生する細胞を作成する方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４の切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジン）。本発明では、ミスマッチ修復遺伝子活性が抑制される方法も提供する。これは、例えばミスマッチ修復遺伝子または転写物のアンチセンス分子を用いて達成されてもよい。
本発明の他の実施例では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを動物の受精卵に導入することで、高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法を提供する。これらの方法には、その後、前記受精卵を疑似妊娠した女性に移植する段階も含み、それによって前記受精卵が成熟トランスジェニック動物に発達する。このミスマッチ修復遺伝子には、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４の切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジン）。
本発明はさらに、抗体を生産でき、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む、培養された高頻度変異哺乳類細胞の均一な組成を提供する。このミスマッチ修復遺伝子には、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の切断変異としてもよい（好ましくはコドン１３４の切断変異、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジン）。前記培養細胞には、ＰＭＳ２、（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１を含むか、ヒトｍｕｔＬホモローグ、またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現してもよい。
本発明では、さらに対象免疫グロブリンを選択する免疫グロブリン産生細胞を培養することで、対象の免疫グロブリン遺伝子の変異を作成する方法を提供し、前記細胞にはミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。前記細胞から産生される免疫グロブリンの性質がアッセイされ、前記免疫グロブリン遺伝子が変異を含むか否かを確認することができる。前記アッセイは、前記免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを分析するように指示されてもよく、前記免疫グロブリンポリペプチド自体を対象としてもよい。
本発明では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現した細胞を培養し、前記細胞を検査して、前記細胞に新しい生化学的特徴など、対象遺伝子内に変異があるか否かを決定することで、抗体産生細胞の遺伝子に影響する抗体産生で変異を作成する方法も提供する。前記検査には、対象免疫グロブリン遺伝子の定常状態での発現分析、および／または対象免疫グロブリン遺伝子でコードされた分泌タンパク質量の分析を含んでもよい。前記発明には、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒトの細胞など、このプロセスで作成された原核細胞と真核細胞のトランスジェニック細胞も含む。
本発明の他の観点には、抗体産生細胞の高頻度変異を可逆的に変化させる方法を含み、誘導プロモーターに結合するように操作可能なミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む誘導ベクターが、抗体産生細胞に導入される。前記細胞が誘導因子で処理され、前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現する（これは、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１とすることができる）。代わりに、前記細胞を導入し、ヒトｍｕｔＬホモローグまたはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現してもよい。別の実施例では、事前に選択された対象免疫グロブリン遺伝子を同時に形質転換することで、前記細胞が抗体を産生できてもよい。前記高頻度変異細胞の免疫グロブリン遺伝子、またはこれらの方法で作成されたタンパク質の望みの性質が分析されてもよく、導入を中止し、前記宿主細胞の遺伝的安定性を復元してもよい。
本発明には、（自然に、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子が前記細胞に導入されるように）免疫グロブリンタンパク質をドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を含む細胞に形質転換し、前記免疫グロブリン遺伝子が変異し、変異型免疫グロブリンを産生できるように前記細胞を培養し、前記免疫グロブリンタンパク質の望みの性質をスクリーニングし、前記望みの性質を有する前記選択変異型免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド分子を単離し、前記変異型ポリヌクレオチドを遺伝的に安定な細胞に形質転換し、これ以上遺伝子組み換えを行わずに前記変異型抗体が常に生産されるようにすることで、遺伝子組み換え抗体を作成する方法も含む。前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子はＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１としてもよい。代わりに、前記細胞が、ヒトｍｕｔＬホモローグまたはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現してもよい。
本発明は、さらに抗原結合ポリペプチドの発現量が増加した遺伝子組み換え細胞株を作成する方法も提供する。これらの抗原結合ポリペプチドは、例えば免疫グロブリンとしてもよい。本発明の方法は、抗原結合ポリペプチドの分泌量が増加した遺伝子組み換え細胞株を作成する方法も含む。前記細胞株はドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子により高頻度変異が可能となり、抗体などの細胞産生抗原結合ポリペプチドで遺伝子高頻度変異率の上昇を提供する。そのような細胞には、これだけに限らないが、ハイブリドーマを含む。抗原結合ポリペプチドの量が増加する発現は、例えば、前記抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写または翻訳を増加することで、または前記抗原結合ポリペプチドの分泌を増加することで行われてもよい。
前記細胞宿主のＭＭＲ活性を遮断するか、ＭＭＲ不完全細胞宿主の免疫グロブリンをコードする遺伝子を形質転換することで、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子組み換え抗体を作成する方法も提供される。
前記様々なドメインで遺伝子が変化したため、抗原に対する結合性が上昇した抗体は、前記細胞宿主の外因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法で提供される。軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ領域で遺伝子が変化したため、抗原に対する結合性が上昇した抗体も、前記細胞宿主の外因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法で提供される。
本発明では、これだけに限らないが、齧歯類、霊長類、ヒトを含む宿主生物の薬物動態特性を強化し、ＭＭＲ不完全Ａｂ産生細胞株で遺伝子操作した抗体を作成する方法を提供する。
これらの本発明の観点は、以下に説明される実施例の１若しくはそれ以上で提供される。本発明の１つの実施例では、抗体産生細胞株に高頻度変異を生じさせる方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、抗体産生細胞に導入される。前記遺伝子を導入した結果として、前記細胞は高頻度変異可能となる。
本発明の別の実施例では、免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする外因性遺伝子に変異を導入する方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。前記ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を導入、発現した結果として、前記細胞は高頻度変異可能となる。前記細胞はさらに対象免疫グロブリン遺伝子を有する。前記細胞は増殖、検討され、対象の免疫グロブリンまたは単鎖抗体をコードする遺伝子に変異があるか否かを決定する。本発明の別の観点では、前記変異型免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする遺伝子が、遺伝的に安定した細胞で単離、発現されてもよい。好適な実施例では、これだけに限らないが、結合性の上昇など、少なくとも１つの望ましい特性について、前記変異型抗体がスクリーニングされる。
本発明の別の実施例では、Ｉｇの軽鎖と重鎖またはその組み合わせをコードする遺伝子または遺伝子セットが、ＭＭＲの不完全な哺乳類細胞宿主に導入される。前記細胞が増殖され、クローンで結合性が上昇した抗体が分析される。
本発明の別の実施例では、細胞の新しい表現型を作る方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。前記遺伝子を導入した結果として、前記細胞は高頻度変異可能となる。前記細胞が増殖され、ポリペプチドの分泌増加など、新しい表現型の発現が検討される。
本発明のこれらの実施例では、細胞と動物で変異性を上昇させることができる方法を用いた技術を提供するだけでなく、有益な薬理学的プロフィールがある高親和性抗体の大規模生産に有用と考えられる変異を有する細胞と動物も提供する。
ここで引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列の受入番号を含む参考文献、特許、特許出願書類、科学文献では当業者の知識を確立するものであり、それぞれ明確に、個別に参照によって組み込まれると指示されたのと同程度に、それらの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれるものである。ここで引用されている参考文献と本明細書の特定の教示に矛盾がある場合は、本明細書の教示を優先して解決されるものとする。同様に、当該分野で理解される用語の定義と本明細書で特に教示されている用語に矛盾がある場合は、本明細書の用語を優先して解決されるものとする。
当業者に既知の組み換え型ＤＮＡ技術の一般原則を説明した基準となる参考文献には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ＮＤ ＥＤ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）を含む。
ここで用いるとおり、「サイトカインの活性化」は、新しいタンパク質を発現し、分化、または増殖した細胞を刺激する可溶性分子を意味する。
ここで用いるとおり、「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の一部を指す。
ここで用いるとおり、「立体構造エピトープ」は連続したアミノ酸以外の抗原アミノ酸の間の空間的関係によって形成された不連続エピトープを指す。
ここで用いるとおり、「イソ型」という用語は特定のポリペプチドの特定の形を指す。
ここで用いるとおり、「免疫学的（ｉｍｍｕｎｏｂａｓｅｄ）」という用語は、標的を有する細胞を特異的または優先的に殺すことができる免疫反応を作る、タンパク質を基にした治療を指す。
「予防する」という用語は、微生物が感染するか、異常な状態を発症する可能性が低下することを指す。
「治療する」という用語は、治療効果を有し、少なくとも部分的に前記微生物の異常な状態を軽減するか、排除することを指す。
「治療効果」という用語は、異常な状態の抑制を指す。治療効果は、前記異常な状態の１若しくはそれ以上の症状を、ある程度軽減する。異常な状態の治療に関し、治療効果とは（ａ）細胞の増殖、成長、および／または分化の増減、（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖抑制（つまり、遅くするか、停止すること）（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の抑制、（ｅ）前記異常な状態と関連した１若しくはそれ以上の症状のある程度の軽減、（ｆ）細胞集団の機能向上の１若しくはそれ以上を指している可能性がある。ここに説明されたモノクローナル抗体とその誘導体は、単独、または本発明の組成の結合型または追加成分と併用した場合に、治療効果を達成する。
ここで用いるとおり、「約」という用語は許容範囲内で述べられた値の近似値を指す。好ましくは、前記範囲は前記述べられた値の＋／−５％である。
ここで用いるとおり、「ドミナントネガティブ効果」とは、ミスマッチ修復遺伝子の対立遺伝子が細胞の正常ミスマッチ修復を抑制する能力を指し、マイクロサテライトの不安定性を示す細胞により評価されうる。
発現刺激には、核酸配列またはペプチドの発現の発現を増加させる方法を含み、これだけに限らないが、内因性発現の刺激、誘導発現、構成的活性化プロモーターを挿入するなどの方法を含む。
ここで用いるとおり、「マイトジェンポリペプチド」は、前記抗原に対する前記免疫系の刺激を上昇させる免疫原に結合されうるポリペプチドを指す。
ここで用いるとおり、「抗体を産生することができる細胞」は、免疫グロブリンを天然で作成することができる細胞を指す。例えば、そのような細胞供給源はリンパ節細胞、脾臓細胞、末梢血細胞、抗体産生細胞株である。
宿主細胞の保存ミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスをうまく利用することで、高頻度変異抗体産生細胞を作成する方法が発見された。そのような遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を細胞またはトランスジェニック動物に導入すると、ＤＮＡ修復の有効性が低下し、それによって細胞または動物が高頻度変異することで、自然突然変異率が上昇する。次に高頻度変異細胞または動物が利用され、対象遺伝子で新しい変異を生じる可能性がある。（これだけに限らないが、ハイブリドーマ、Ｉｇ軽鎖および重鎖をコードした遺伝子を形質転換した哺乳類細胞、単鎖抗体をコードした遺伝子を形質転換した哺乳類細胞、Ｉｇ遺伝子を形質転換した真核細胞などの）抗体産生細胞でＭＭＲを遮断すると、これらの細胞の変異率が上昇し、抗体産生が増加したクローン、および／または遺伝子組み換え抗体を含む細胞が生じ、抗原結合性の上昇など、生化学的特性が上昇する。細菌から哺乳類細胞の範囲で、細胞のタンパク質複合体により、ミスマッチ校正と呼ばれるＭＭＲのプロセスが実施される。ＭＭＲ遺伝子は、ミスマッチ修復複合体などのタンパク質の１つをコードした遺伝子である。特定の作用機序の理論に縛られたくはないが、ＭＭＲ複合体はＤＮＡらせんのゆがみを検出し、ヌクレオチド塩基の非相補的ペアから生じると考えられる。新しいＤＮＡ鎖の非相補的塩基は除去され、前記切除された塩基は前記適当な塩基と交換され、これは前記古いＤＮＡ鎖と相補的である。このように、細胞はＤＮＡ複製の誤りの結果発生する多くの突然変異を排除する。
ドミナントネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞に野生型対立遺伝子が存在する場合でも、ＭＭＲ不完全表現型を発生させる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の例は、前記ヒト遺伝子のｈＰＭＳ２−１３４であり、コドン１３４（配列ＩＤ番号：５）に短縮型変異を有する。前記変異は前記１３４番目のアミノ酸の位置でこの遺伝子産物を異常に停止させ、前記Ｎ末端１３３アミノ酸を含む短縮型ポリペプチドとなる。そのような変異は変異率を上昇させ、ＤＮＡ複製後の細胞を蓄積する。野生型対立遺伝子がある場合でも、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が発現することで、ミスマッチ修復活性が障害される。そのような作用を生じる対立遺伝子は、すべて本発明で利用することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌、その他の生物の細胞から入手されうる。そのような対立遺伝子は、細胞の不完全ＭＭＲ活性をスクリーニングすることで同定されうる。癌のある動物またはヒトの細胞では、不完全ミスマッチ修復をスクリーニングすることができる。結腸癌患者の細胞は、特に有用と考えられる。ＭＭＲタンパク質をコードする細胞のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡでは、前記野生型配列の変異を分析することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、例えば前記ｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子または他のＭＭＲ遺伝子の変異株を産生することで、人工的に作成されることも可能である。部位特異的突然変異誘発の様々な技術が利用されうる。そのような対立遺伝子を高頻度変異細胞または動物の作成に使用する場合の適合性は、天然か人工かによらず、１若しくはそれ以上の野生型対立遺伝子の存在下、前記対立遺伝子によって生じるミスマッチ修復活性を検討することで評価し、ドミナントネガティブ対立遺伝子か否かを決定することができる。
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が導入された細胞または動物は、高頻度変異可能となる。これは、そのような細胞または動物の自然突然変異率が、そのような対立遺伝子のない細胞または動物と比べて上昇していることを意味する。前記自然突然変異率の上昇度は、正常な細胞または動物の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍の可能性がある。これだけに限らないが、メタンスルホン酸塩、ジメチルスルホン酸塩、Ｏ６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵなどの化学的突然変異誘発要因をＭＭＲ不完全細胞に使用することで、突然変異率を前記ＭＭＲの不完全率自体のさらに１０〜１００倍に上昇させることができる。
本発明の１つの観点では、ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。前記遺伝子はタンパク質をコードするすべてのドミナントネガティブ対立遺伝子とすることができ、タンパク質は例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、またはＭＳＨ２など、ＭＭＲ複合体の一部である。前記ドミナントネガティブ対立遺伝子は自然に発生するか、実験室で作成することができる。前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学合成されたポリヌクレオチドの形とすることができる。
前記ポリヌクレオチドは、構成的活性化プロモーターセグメント（これだけに限らないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列など）を含む発現ベクター、または前記ステロイド誘導ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの誘導プロモーター配列にクローニングされる可能性があり、前記ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現が制御される可能性がある。前記ポリヌクレオチドは、形質移入によって前記細胞に導入される可能性がある。
本発明の別の観点では、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、Ｉｇ遺伝子セット、Ｉｇ遺伝子の全体または一部を含むキメラ遺伝子がＭＭＲ不完全細胞宿主に形質転換される可能性があり、新しい生化学的特徴を持った遺伝子組み換えＩｇ遺伝子を含むクローンについて、前記細胞が増殖、スクリーニングされる。ＭＭＲ不完全細胞は、ヒト、霊長類、哺乳類、齧歯類、植物、酵母、または原核界の細胞としてもよい。新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードする突然変異遺伝子は、それぞれのクローンから単離され、遺伝的に安定な細胞（つまり、正常ＭＭＲを持った細胞）に導入され、前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇを一貫して生産するクローンを提供してもよい。前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードするＩｇ遺伝子を単離する方法は、当該分野で既知のいずれの方法であってもよい。前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードする単離ポリヌクレオチドの導入は、これだけに限らないが、前記新しい生化学的特徴を持ったＩｇをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形質転換を含む、当該分野で既知の方法により実施されうる。Ｉｇ遺伝子、Ｉｇ遺伝子セット、Ｉｇ遺伝子全体または一部を含むキメラ遺伝子をＭＭＲ不完全宿主細胞に形質転換する代わりに、そのようなＩｇ遺伝子を、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子と同時に、遺伝的に安定な細胞に形質転換し、前記細胞を高頻度変異可能にしてもよい。
形質転換は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されるプロセスである。形質転換のプロセスは生きている動物で、例えば遺伝子療法のベクターを用いて実行される可能性があり、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば１若しくはそれ以上の単離細胞を培養液に懸濁することで実施される可能性もある。前記細胞は、例えばヒトまたは他の霊長類、哺乳類、その他の脊椎動物、無脊椎動物、原虫、酵母、または細菌などの単細胞生物から単離された細胞を含む、すべてのタイプの真核細胞とすることができる。
一般に、形質転換は細胞懸濁液、または単細胞を用いて実施されるが、前記処理細胞または組織の十分な分画が前記ポリヌクレオチドを含む限り、他の方法を適用してもよく、形質転換した細胞が増殖、利用できるようにする。前記ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、前記細胞に一時的または安定的に発現されてもよい。形質転換技術も周知である。ポリヌクレオチドの導入に利用できる方法には、これだけに限らないが、電気穿孔法、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの利用、前記ポリヌクレオチドと脂質のパッケージングにより対象細胞と融合させる方法を含む。細胞に前記ＭＭＲ遺伝子が形質転換されると、前記細胞が増殖され、培養液で再生産されうる。前記形質転換が安定し、前記遺伝子が多数の細胞世代で一貫したレベルで発現されていれば、細胞株が生じる。
単離細胞は、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンなどの酵素で前記組織を前処理した場合と前処理しない場合で、個々の細胞を機械的に分離し、適当な細胞培養液に移動することでヒトまたは動物組織から得られた細胞である。そのような単離細胞は、典型的には他の細胞タイプがない状態で培養される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入するために選択された細胞は、初代細胞培養または不死化細胞株の形で真核生物由来であってもよく、または単細胞生物の懸濁液に由来してもよい。
ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を生産することで、動物のゲノムに導入されうる。前記動物はどの種であってもよく、適当な技術を利用し、トランスジェニック動物を作成する。例えば、トランスジェニック動物は、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜から、例えばミルクに組み換えポリペプチドを発現したウシ、ブタ、ヒツジなど、組み換えタンパク質を生産するために利用される動物から、または例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど、研究または製品検査用の実験動物から調整されうる。次にＭＭＲが不完全であると判定された細胞株は、未処理の免疫グロブリン遺伝子全体および／または単鎖抗体をコードするキメラ遺伝子を、前記ＭＭＲ不完全動物組織のＭＭＲ不完全細胞に導入することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子組み換え免疫グロブリン遺伝子を産生する供給源として使用されうる。
形質転換された細胞株またはトランスジェニック動物のコロニーが生産されると、１若しくはそれ以上の対象遺伝子で新たな突然変異を発生させるために利用されうる。対象遺伝子は、前記細胞株またはトランスジェニック動物で自然に処理されたか、前記細胞株またはトランスジェニック動物に導入された遺伝子とすることができる。そのような細胞または動物を用いて突然変異を誘導する利点は、前記細胞または動物が変異原性化学物質に曝露されるか、照射される必要がない点であり、これは前記曝露および前記作業員のいずれも対象とし、二次的な有害作用を有する可能性がある。しかし、化学的変異はＭＭＲ不完全性と組み合わせて利用することができ、未確定のメカニズムにより、そのような変異はあまり毒性がなくなる。次に高頻度変異動物が飼育され、遺伝的に変化するＢ細胞を生産する動物が選択され、これが単離、クローニングされ、遺伝的に可変性の細胞を生産するために有用な新しい細胞株を同定することができる。一度新しい形質が同定されると、前記ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、当業者が利用する技術により前記対立遺伝子を直接ノックアウトするか、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子がない動物とつがいにするように飼育し、望みの形質および安定的なゲノムを持つ子孫を選択することで除去されうる。別の代替法としてＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を利用し、遺伝的に多様な免疫グロブリンプロフィールを含む動物が確立されると、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子が前記動物ゲノムからスプライスされる。さらに別の代替法として、コルチコステロイド存在下、外因性遺伝子を発現した前記ステロイド誘導ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）ベクターなどの誘導ベクターを利用する。
変異は、前記細胞または動物の遺伝子型の変化を分析することで、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または対象遺伝子と関連したアミノ酸を検討することで、検出されうる。変異は、抗体力価の産生をスクリーニングすることで検出されうる。変異型ポリペプチドは、変異型遺伝子でコードされるタンパク質の電気泳動移動度、分光学的特性、または他の物理的または構造的特徴の変化を同定することで検出されうる。ｉｎ ｓｉｔｕで、単離型またはモデル系で、タンパク質の機能変化をスクリーニングすることもできる。これだけに限らないが、Ｉｇ分泌など、対象遺伝子の機能と関連した細胞または動物の特徴変化をスクリーニングすることができる。
本発明の方法で有用なミスマッチ修復タンパク質をコードする核酸配列の例には、これだけに限らないが、ＰＭＳ１（配列ＩＤ番号：１）；ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：３）；ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：５）；ＰＭＳＲ２（配列ＩＤ番号：７）；ＰＭＳＲ３（配列ＩＤ番号：９）；ＭＬＨ１（配列ＩＤ番号：１１）；ＭＬＨ３（配列ＩＤ番号：１３）；ＭＳＨ２（配列ＩＤ番号：１５）；ＭＳＨ３（配列ＩＤ番号：１７）；ＭＳＨ４（配列ＩＤ番号：１９）；ＭＳＨ５（配列ＩＤ番号：２１）；ＭＳＨ６（配列ＩＤ番号：２３）；ＰＭＳＲ６（配列ＩＤ番号：２５）；ＰＭＳＬ９（配列ＩＤ番号：２７）；ｙｅａｓｔ ＭＬＨ１（配列ＩＤ番号：２９）；ｍｏｕｓｅ ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：３１）；ｍｏｕｓｅ ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：３３）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：３５）；およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：３７）を含む。前記掲載された核酸配列に対応するアミノ酸配列は、ＰＭＳ１（配列ＩＤ番号：２）；ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：４）；ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：６）；ＰＭＳＲ２（配列ＩＤ番号：８）；ＰＭＳＲ３（配列ＩＤ番号：１０）；ＭＬＨ１（配列ＩＤ番号：１２）；ＭＬＨ３（配列ＩＤ番号：１４）；ＭＳＨ２（配列ＩＤ番号：１６）；ＭＳＨ３（配列ＩＤ番号：１８）；ＭＳＨ４（配列ＩＤ番号：２０）；ＭＳＨ５（配列ＩＤ番号：２２）；ＭＳＨ６（配列ＩＤ番号：２４）；ＰＭＳＲ６（配列ＩＤ番号：２６）；ＰＭＳＬ９（配列ＩＤ番号：２８）；ｙｅａｓｔ ＭＬＨ１（配列ＩＤ番号：３０）；ｍｏｕｓｅ ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：３２）；ｍｏｕｓｅ ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：３４）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＭＳ２（配列ＩＤ番号：３６）；およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号：３８）である。
本発明では、前記細胞が抗原特異的抗体を産生するような、抗体産生可能な細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫法を含む。抗体産生可能な細胞は、末梢血、リンパ節、脾臓など、リンパ球を含む供給源由来の細胞である。免疫原には、精製抗原、変性タンパク質、可溶化細胞、タンパク質混合物、膜標本、全細胞、細かく刻んだ組織と腫瘍、微生物、ウイルスなどを含むことができる。本発明の方法では、前記免疫原が、これだけに限らないが、破傷風トキソイド、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリア毒素、ＢＣＧ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素の少なくとも一部など、マイトジェンポリペプチドと結合されうる。
抗原は当該分野で既知のいずれかの方法において、マイトジェンポリペプチドと結合されてもよい。例えば、融合タンパク質は、少なくとも前記マイトジェンポリペプチドの一部をコードしたポリヌクレオチドに、骨格で結合した前記抗原の少なくとも一部をコードしたポリヌクレオチドを有する、組み換え型発現系でポリヌクレオチドを発現することにより、発生されてもよい。前記融合タンパク質は、前記抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端で結合した、前記マイトジェンポリペプチドを有してもよい。いくつかの実施例では、１若しくはそれ以上の抗原が、マイトジェンポリペプチドと組み合わせて、融合タンパク質として発現されてもよい。他の実施例では、１若しくはそれ以上のマイトジェンポリペプチドが、前記抗原との、融合タンパク質として発現されてもよい。他の実施例では、１若しくはそれ以上のマイトジェンポリペプチドと１若しくはそれ以上の抗原が単一の融合タンパク質として発現されてもよい。
代わりの実施例では、少なくとも前記マイトジェンポリペプチドの一部が化学的架橋剤を用いて前記抗原の少なくとも一部に結合される。化学的架橋剤の例には、これだけに限らないが、グルタールアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、ホルムアルデヒド、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸塩）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステルを用いたエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド）を含む。メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は光活性化可能な中間体を生じ、光存在下、架橋を形成することができる。代わりに、例えば前記マイトジェンポリペプチドまたは抗原のリジン残基が、Ｎ−γ−マレイミドブチリロキシ−スクシニミドを用いた治療により、それぞれ前記抗原またはマイトジェンポリペプチドのＣ末端または他のシステイン残基に結合されてもよい（Ｋｉｔａｇａｗａ ａｎｄ Ａｉｋａｗａ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９，２３３〜２３６）。
代わりに、前記マイトジェンポリペプチドまたは抗原のリジン残基が、それぞれイソブチルクロロギ酸エステルを用いて前記抗原またはマイトジェンポリペプチドのグルタミン酸またはアスパラギン酸残基に結合されてもよい（Ｔｈｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅ Ｌａｒｓｏｎ（１９７８）ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ：ＭＥＴＨＯＤＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐ．２８８）。他のカップリング反応と試薬は文献に報告されている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫法の条件が、いくつかの実施例では、約５〜１０％ ＣＯ２が供給された約２５〜３７℃（好ましくは３７℃）の細胞をインキュベートすることを有し、前記インキュベーションが約６〜９％ ＣＯ２で実施され、他の実施例では、前記インキュベーションが約８％ ＣＯ２で実施される。前記細胞密度は培地中、約２．５〜５×１０６細胞／ｍｌである。いくつかの実施例では、前記培地に約２〜２０％ ＦＢＳが追加される。他の実施例では、前記培地に約５〜１５％ ＦＢＳが追加される。他の実施例では、前記培地に約７〜１２％ ＦＢＳが追加される。他の実施例では、前記培地に約１０％ ＦＢＳが追加される。
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激培地にサイトカインが補充され、前記細胞を刺激し、前記免疫反応が亢進する。一般に、ＩＬ−２が前記培地に供給される。さらに、他のサイトカインと添加物も含まれ、前記免疫反応を亢進してもよい。そのようなサイトカインと因子には、例えばＩＬ−４と抗ＣＤ４０抗体を含めてもよい。
前記免疫原刺激細胞が不死化細胞に融合され、ハイブリドーマ細胞を作る。典型的には、前記免疫細胞がミエローマ細胞である。前記免疫グロブリン産生細胞を用いた前記ミエローマ細胞の融合は、ハイブリドーマ細胞を作成するため、当該分野で既知の方法によって行うことができる。これらの方法には、これだけに限らないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７；及び米国特許第４，３７６，１１０号）（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９〜５４６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１１）：４９８０〜４９８３；Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７〜２９３１；およびＹｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９〜２７５も参照）、前記ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６〜２０３０）、前記ＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６）を含む。本発明のハイブリドーマ産生は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養されてもよい。
モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生する技術は当業者に周知であり、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＮＥＷ ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＥＳ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７〜４０２；Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２；およびＧｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１〜２３６で説明されている。しかし、そのような方法には多くの変更が可能であり、当業者に理解されることとする。したがって、ハイブリドーマ作成法は、これらの参考文献の開示に限定されない。
すべてのミエローマ細胞は、本発明の方法で利用されてもよい。好ましくは、前記ミエローマ細胞がヒト細胞であるが、本発明はここに限定されない。いくつかの実施例では、前記細胞がヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ培地）を含む培地に感受性が高い。いくつかの実施例では、前記ミエローマ細胞が免疫グロブリン遺伝子を発現していない。いくつかの実施例では、前記ミエローマ細胞がＥＢウイルス（ＥＢＶ）感染に対して陰性である。好適な実施例では、前記ミエローマ細胞がＨＡＴ感受性、ＥＢＶ陰性、Ｉｇ発現陰性である。適した骨髄腫が利用されてもよい。そのような骨髄腫の例は、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅの米国特許番号第４，７２０，４５９号に説明されており、ＣＲＬ ８６４４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に貯蔵されている。マウスミエローマ細胞株を用い、マウスハイブリドーマが作成されてもよい（例えば、前記Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞株）。これらのマウスミエローマ細胞株は、前記ＡＴＣＣから入手できる。
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫法には、抗体産生可能な細胞の刺激を促す条件下、免疫原を用いて抗体を産生することができる細胞をインキュベートする段階を含む。いくつかの実施例では、前記細胞がＬ−ロイシル−Ｌ−リジンメチルエステル臭化水素酸塩（ＬＬＯＭｅ）にインキュベートされうる。特定の操作理論に縛られたくはないが、ＬＬＯｍｅはｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃであり、（ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞などの）前記細胞プールの細胞障害性細胞を特異的に殺すと考えられているが、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、アクセサリー細胞、線維芽細胞に対する効果はない（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９（１１）：３５５〜３５９）。一般に、前記細胞には１〜３０分間、ＬＬＯＭｅがインキュベートされうる。いくつかの実施例では、前記インキュベーションが１０〜２０分間実施される。他の実施例では、前記インキュベーションが１５分間実施される。前記ＬＬＯＭｅは例えばＲＰＭＩ １６４０などの培地成分であり、約０．１０〜１ｍＭの濃度で提供される。いくつかの実施例では、ＬＬＯＭｅが約０．１０〜０．５０ｍＭの量で提供される。他の実施例では、ＬＬＯＭｅが約０．２５ｍＭの量で提供される。
本発明の方法に関するいくつかの実施例では、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入することで、前記ハイブリドーマ細胞が高頻度変異可能となってもよい。前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が前記ハイブリドーマ細胞に導入されるか（つまり、前記ハイブリドーマ細胞と免疫グロブリン産生細胞の融合後）、前記融合前に前記ミエローマ細胞に導入されてもよい。
前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学合成ポリヌクレオチドの形とすることができるポリヌクレオチドの形である。前記ポリヌクレオチドは、構成的活性化プロモーターセグメント（これだけに限らないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１ Ｄｏｒ ＬＴＲ配列など）を含む発現ベクター、またはテトラサイクリンなどの誘導プロモーター配列、またはエクジソン／グルココルチコイド誘導ベクターにクローニングされる可能性があり、前記ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現が制御される可能性がある。前記ポリヌクレオチドは、形質移入によって前記細胞に導入される可能性がある。
前記ハイブリドーマ細胞では、前記免疫法に利用される抗原に特異的に結合する抗体がスクリーニングされる。１つの実施例では、ＡＩＤを発現したクローンで、前記細胞もスクリーニングされる。これらのクローンでは体細胞超変異率が高く、クラススイッチ組み換えを有することが予想される。これらのクローンは、特異的に抗原に結合し、ＣＳＲと体細胞超変異を行う抗体を作成するように、選択、単離される。望みの表現型が達成されたら、これだけに限らないが、前記ＡＩＤ遺伝子のすべてまたは一部をノックアウトし、前記ＡＩＤ遺伝子のフレームシフトを導入し、相同的組み換えにより別の配列で前記ＡＩＤ遺伝子を妨害するなどの方法により、当該分野で既知の方法によりＡＩＤを不活化することができる。
本発明の他の実施例では、活性化サイトカインを用いて前記ハイブリドーマ細胞を刺激することで、前記ハイブリドーマ細胞が導入され、ＡＩＤを発現する。前記活性化サイトカインはリポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＧＦβ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−４、およびその組み合わせとしてもよい。
本発明の他の実施例では、前記ハイブリドーマ細胞が誘導され、前記ハイブリドーマ細胞に、発現制御配列に操作可能な結合を作ったＡＩＤをコードする配列を有するポリヌクレオチドを形質転換することで、ＡＩＤを発現する。前記ハイブリドーマ細胞は、ＡＩＤを構成的に発現しているか、ＡＩＤを発現するように誘導されてもよい。望みの表現型が達成されると、当該分野で既知の方法により、前記ＡＩＤを不活化することができる。
本発明の他の実施例では、（天然あるいはＡＩＤを発現するように誘導された）ＡＩＤを発現した細胞を選択することに加え、前記細胞のミスマッチ修復が自然に欠損するか、ミスマッチ修復が欠損するように誘導されてもよい。抗体を産生することができる細胞でミスマッチ修復が自然に欠損しているという事実のため、前記ハイブリドーマ細胞はミスマッチ修復が不完全であってもよい。代わりに、前記不死化細胞ではミスマッチ修復が自然に欠損していてもよい。代わりに、抗体を産生することができる細胞と前記不死化細胞の両方で、ミスマッチ修復が自然に欠損していてもよい。いくつかの実施例では、ミスマッチ修復の原因となっている１若しくはそれ以上の遺伝子のノックアウトにより、前記のとおり、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入し、またはその開示全体がこの参照によって明白に組み込まれている、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，国際公開第ＷＯ ０２／０５４５６号，"Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ"で説明されているとおり、ミスマッチ修復を化学的に抑制することで、前記細胞が操作され、ミスマッチ修復が欠損している。
本発明の別の実施例では、前記抗体産生細胞を新規で作られたハイブリドーマよりも抗体を産生するハイブリドーマとしてもよい。他の実施例では、前記抗体産生細胞は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを用い、前記細胞を形質転換するため、抗体を産生する哺乳類発現細胞としてもよい。前記発現細胞は、免疫グロブリンまたはその誘導体を発現していてもよい。そのような産物には、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体ホモローグ、ヒト化抗体ホモローグ、キメラ抗体ホモローグ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）抗体フラグメント、一本鎖抗体、抗体重鎖または軽鎖のモノマーまたはダイマー、またはその混合物を含む。ＡＩＤの発現を同時に、または別に刺激することでミスマッチ修復を阻害することで（またはＡＩＤを自然に発現した細胞を単純に選択することで）、前記既知のハイブリドーマおよび哺乳類発現細胞（トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ））は、上述のとおり、さらに操作されうる。
各ケースで、望みの表現型が達成されると、前述のとおりゲノム安定性が回復され、それ以上の変異は発生しないようになる。
本発明は、前述の方法のいずれかにより産生された、単離抗体産生細胞も有する。
本発明の背景に関するさらなる情報については、以下の参考文献を参照してもよく、それぞれ全体がこの参照によって本明細書に組み込まれている。
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３．Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ．Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７〜７９１．
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１２．Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｈＭＬＨ１ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２５８〜２６１．
１３．ｄｅ Ｗｉｎｄ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｍｓｈ２ ｇｅｎｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｈｙｐｅｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ ８２：３２１〜３００．
１４．Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｈＭＳＨ２-ｐ１６０ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｔｈａｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１９０９〜１９１２．
１５．Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５９〜１９６０．
１６．Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１．
１７．Ｐｒｏｌｌａ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＭＬＨ１，ＰＭＳ１，ａｎｄ ＭＳＨ２ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１０９１〜１０９３．
１８．Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ． Ｎａｔｕｒｅ ３６５：２７４〜２７６．
１９．Ｓｕ，Ｓ．Ｓ．，Ｒ．Ｓ．Ｌａｈｕｅ，Ｋ．Ｇ．Ａｕ，ａｎｄ Ｐ．Ｍｏｄｒｉｃｈ（１９８８）Ｍｉｓｐａｉｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６８２９〜６８３５．
２０．Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ＲＥＲ＋ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ７５：１２２７〜１２３６．
２１．Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔＬ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１６２５〜１６２９．
２２．Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５〜６８４．
２３．Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，ａｎｄ Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９９５）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：３２９〜３３４．
２４．Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＰＭＳ２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５〜２０６．
２５．Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３６：４１７．
２６．Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓ．Ｄ．Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（１９９６）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９〜４９４．
２７．Ｌｉｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：１７〜２５．
２８．Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｊｕｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ，ｃ−ＪＵＮ ａｎｄ ＪＵＮＤ，ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ−ｍｙｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ａｎ Ａｐ１ ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６６５−１９６７２．
２９．Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２〜４１３．
３０．Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：１４８３〜１４９４．
３１．Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ： ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１〜８２．
３２．Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｕｔＬａ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９６４５〜１９６４８．
３３．Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｅｒｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＭｕｔＳ ａｎｄ ＭｕｔＬ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３２３１．
前記参考文献は、一般に本発明について説明している。以下の実施例を参照することでより完全な理解が得られるが、これは説明のみの目的でここに提供されているものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。
ハイブリドーマ細胞のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の安定的な発現
他にＭＭＲ成熟細胞のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現がこれらの宿主細胞のＭＭＲを不完全性にすることできることは、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）によってこれまでに示された。ＭＭＲ不完全細胞を作成することで、宿主生物の子孫のゲノム全体で遺伝子を変化させることができ、特徴が変化した生化学物質を生産することができる遺伝子組み換え子孫または同胞の集団を生み出すことができる。本特許出願では、抗体産生細胞のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の使用について示し、これだけに限らないが、齧歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、ヒト免疫グロブリン遺伝子産物を産生するキメラ齧歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト細胞、単鎖抗体を産生する哺乳類細胞、哺乳類免疫グロブリン遺伝子、または単鎖抗体に含まれる分子など、キメラ免疫グロブリン分子を産生する原核細胞を含む。抗体を産生するために使用される上述の細胞発現系は、抗体治療の分野で当業者に周知である。
ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を用い、ＭＭＲ不完全ハイブリドーマを作成する能力について証明するため、我々は、まず、前記ヒトＰＭＳ２（ＨＢＰＭＳ２と呼ばれる細胞株）を含む発現ベクター、ここでＰＭＳ１３４（ＨＢ１３４と呼ばれる細胞株）と呼ばれるこれまでに発表されたドミナントネガティブＰＭＳ２変異株を用い、またはインサートを用いずに（ＨＢｖｅｃと呼ばれる細胞株）、前記ヒトＩｇＥタンパク質に対する抗体を産生することが知られているマウスハイブリドーマ細胞株を形質転換した。前記結果は、前記ＰＭＳ１３４変異株が実際に強いドミナントネガティブ効果を示し、ＭＭＲ不完全性を生化学的、遺伝的に発現させることができることを示した。前記完全な長さのＰＭＳ２によりＭＭＲ活性が低下するが、前記空のベクターを含む細胞に効果は認められないという所見は意外であった。前記方法の簡単な説明が以下に示されている。
前記ＭＭＲ成熟マウスＨ３６ハイブリドーマ細胞株に、ＭＭＲ活性を評価するため、様々なｈＰＭＳ２発現プラスミドとレポーター構築が形質転換された。前記ＭＭＲ遺伝子は前記ｐＥＦ発現ベクターにクローニングされ、前記クローニング部位の上流に伸長因子プロモーターを含み、次に哺乳類ポリアデニル化シグナルを含む。このベクターには、このプラスミドを保持する細胞を選択することができるＮＥＯｒ遺伝子を含む。簡潔に言えば、前記製造業者のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ポリリポソームを用いて各ベクター１μｇが細胞に形質転換された。１０日間、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞が選択され、Ｇ４１８耐性細胞が一緒にプールされ、遺伝子発現が分析された。前記ｐＥＦ作成物には、エクソン２から前記ＥＦ遺伝子のエクソン１を分離したイントロンが含まれ、前記ポリリンカークローニング部位の５’末端に並列に並べられた。これにより、前記スプライスされた作成物を発現した細胞の急速逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）スクリーニングが可能となる。１７日の時点で１００，０００細胞が単離され、これまでに説明されたとおり、前記トリゾール法によりそのＲＮＡが抽出された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９５）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：３２９〜３３４）。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写され、前記ＥＦ遺伝子のエクソン１に位置するセンスプライマー（５’−ｔｔｔ ｃｇｃ ａａｃ ｇｇｇ ｔｔｔ ｇｃｃ ｇ−３’）（配列ＩＤ番号：４９）と前記発表されたヒトＰＭＳ２ ｃＤＮＡのｎｔ ２８３を中心としたアンチセンスプライマー（５’−ｇｔｔ ｔｃａ ｇａｇ ｔｔａ ａｇｃ ｃｔｔ ｃｇ−３’）（配列ＩＤ番号：５０）を用いてＰＣＲ増幅され、全長と前記ＰＭＳ１３４遺伝子発現の両方を検出する。反応はこれまでに説明された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ， Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＰＭＳ２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６）緩衝液と条件により実施され、９４℃で３０秒、５２℃で２分、７２℃で２分を３０サイクルの増幅パラメータを用いた。反応はアガロースゲルで分析された。図１は、安定的に形質導入されたＨ３６細胞でＰＭＳ発現のそれぞれの例を示している。
これらの遺伝子でコードされたタンパク質の発現は、これまでに報告された手順に従い、前記タンパク質のＮ末端に位置する最初の２０アミノ酸に対するポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロット法で確認された（データは示されていない）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。
ｈＰＭＳ１３４はハイブリドーマ細胞のＭＭＲ活性と高頻度変異に異常を発生させる
ＭＭＲ不完全性の特徴は、宿主細胞のゲノムに不安定なマイクロサテライト反復が発生していることである。この表現型はマイクロサテライト不安定性（ＭＩ）と呼ばれる（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５９〜１９６０；Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３６：４１７）。ＭＩは、宿主細胞のゲノム全体にある反復モノ、ジ、および／またはトリヌクレオチドの欠失および／または挿入から成る。真核細胞の広範な遺伝分析では、ＭＩを作成できる生化学的欠損のみが不完全ＭＭＲであることが分かった（Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３６５：２７４〜２７６；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．３７７：６７５〜６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９〜４９４）。ＭＩを促す際に不完全ＭＭＲが有するこの固有の特徴を考慮し、現在は宿主細胞にＭＭＲ活性がない調査での生化学的マーカーとして利用されている（Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．３７７：６７５〜６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９〜４９４；Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：１７〜２５）。
真核細胞のＭＭＲ不完全性の検出に用いる方法は、フレームシフトのためリーディングフレームが中断したコード領域に挿入された、ポリヌクレオチド反復配列を有するレポーター遺伝子を採用することである。ＭＭＲが不完全な場合、前記レポーター遺伝子が前記ポリヌクレオチド反復配列にランダム突然変異を獲得し（つまり、挿入および／または欠失）、オープンリーディングフレームとレポーターを含むクローンを生じる。我々は、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を利用し、ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、ＨＢＰＭＳ １３４細胞のＭＭＲ活性を測定した。前記レポーター作成物ではｐＣＡＲ−ＯＦを利用し、これはハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子とそのコード領域の５’末端に２９ ｂｐのフレーム外ポリＣＡ領域を含むβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。フレームを復元する変異（つまり、挿入または欠失）が形質転換後に生じない限り、前記ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターはβガラクトシダーゼ活性を発生させない。ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、ＨＢ１３４細胞は、例１で説明したプロトコールの後、復元反応によりｐＣＡＲ−ＯＦベクターをそれぞれ形質転換された。細胞は０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８および０．５ｍｇ／ｍｌ ＨＹＧ中で選択され、前記ＭＭＲエフェクターと前記ｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの両方を保持する細胞を選択した。前記ｐＣＡＲベクターを形質転換した細胞すべてで、同数のＨＹＧ／Ｇ４１８耐性細胞が生じた。培養液は次に増殖され、ｉｎ ｓｉｔｕでβ−ガラクトシダーゼ活性について、また細胞抽出物の生化学的分析により検討された。ｉｎ ｓｉｔｕ分析では、１００，０００個の細胞が収集され、１％グルタールアルデヒドで固定され、リン酸緩衝生理食塩水溶液で洗浄され、２時間、３７℃で２４ウェルプレート中に１ｍｌのＸ−ガル基質溶液［０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％ Ｘ−Ｇａｌ］でインキュベートされた。反応は５００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液で停止され、分析のため、顕微鏡スライドに移動された。細胞２００個のフィールド３種類それぞれを青色（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）または白色（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）で計算し、ＭＭＲの不活化を評価した。表１は、これらの研究の結果を示している。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞はＨＢｖｅｃ細胞で観察されたが、１フィールド当たり１０％の細胞がＨＢ１３４培養でβ−ガラクトシダーゼ陽性であり、１フィールド当たり２％の細胞がＨＢＰＭＳ２培養でβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
細胞抽出物は上記の培養から調整され、これまでに報告されたとおり、定量的生化学アッセイによりβ−ガラクトシダーゼを測定した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｊｕｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ， ｃ−ＪＵＮ ａｎｄ ＪＵＮＤ， ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ−ｍｙｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ａｎ Ａｐ１ ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６６５〜１９６７２）。簡潔に言えば、１００，０００個の細胞が２００μｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ中、ｐＨ８．０で回収、遠心分離、再懸濁された。細胞は３回冷凍／解凍で溶解させ、上清を１４，０００ｒｐｍｓでマイクロフュージョン後に回収し、細胞片を除去した。タンパク質含有量は、ＯＤ２８０で分光学的分析により決定した。生化学的アッセイでは、２０μｇのタンパク質が４５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＰＯ４、０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む緩衝液に追加された。反応は１時間インキュベートされ、０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を追加して終了され、５７６ｎｍにて分光測光法で分析された。Ｈ３６細胞溶解物を使用し、バックグラウンドを差し引いた。図２は、前記様々な細胞株の抽出物における前記β−ガラクトシダーゼ活性を示している。示されているとおり、前記ＨＢ１３４細胞は最高量のβ−ガラクトシダーゼを産生したが、前記ｐＣＡＲ−ＯＦを含む前記ＨＢｖｅｃ細胞に活性は認められなかった。これらのデータは、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を用い、ＭＭＲ不完全ハイブリドーマ細胞を生成する能力を証明している。
表１．ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターを形質転換したＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、ＨＢ１３４細胞のβ−ガラクトシダーゼの発現細胞に前記ｐＣＡＲ−ＯＦ β−ガラクトシダーゼレポータープラスミドを形質転換された。ハイグロマイシンとＧ４１８で形質転換された細胞が選択され、増殖、Ｘ−ｇａｌ溶液で染色され、β−ガラクトシダーゼ活性が測定された（青色の細胞）。それぞれ２００細胞のフィールド３種類が顕微鏡で分析された。以下の結果は、これらの実験の＋／−標準偏差の平均を示している。
Figure 2007525973
結合親和性が高く、および／または免疫グロブリン産生が増加した抗体を産生するハイブリドーマクローンを同定するスクリーニング戦略
本書内で紹介されている方法の応用は、ＭＭＲ不完全ハイブリドーマまたは細胞を産生する他の免疫グロブリンを利用し、生化学的特徴が変化した抗体を産生する免疫グロブリン遺伝子を遺伝的に変化させるものである。本応用の実例はこの例の中で証明され、これによって、抗ヒト免疫グロブリンタイプＥ（ｈＩｇＥ）ＭＡｂを産生するＭＭＲ不完全細胞株のＨＢ１３４ハイブリドーマ（例１）が２０世代増殖され、クローンが９６ウェルプレートで単離され、ｈＩｇＥ結合がスクリーニングされた。図３は、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンを同定するスクリーニング法の概要を示しており、前記タンパク質の軽鎖または重鎖可変領域の変化が原因と推定される。前記アッセイではプレート酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用し、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンをスクリーニングする。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４プールの単細胞を含む９６ウェルプレートは、増殖培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎仔血清）＋０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で９日間増殖され、クローンが前記発現ベクターを保持していることを確認する。９日後、プレートはｈＩｇＥプレートＥＬＩＳＡによりスクリーニングされ、それによって９６ウェルプレートが５０μｌｓの１μｇ／ｍｌ ｈＩｇＥ溶液で４時間、４℃でコーティングされる。プレートはカルシウムとマグネシウムのないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄され、室温で１時間１００μｌｓのＰＢＳ−／−と５％ドライミルク中でブロッキングされる。ウェルは、１：５に希釈した各細胞クローンの条件培地を含む１００μｌｓのＰＢＳ溶液で、２時間洗浄、インキュベートされる。次にプレートがＰＢＳ−／−で３回洗浄され、室温で１時間、１：３０００に希釈し、２次抗体と結合したヒツジ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む５０μｌｓのＰＢＳ−／−溶液によりインキュベートされる。次にプレートがＰＢＳ−／−で３回洗浄され、室温で１５分間、５０μｌｓのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（ＢｉｏＲａｄ）でインキュベートされ、各クローンで生産された抗体量を検出する。反応は５０μｌｓの５００ｍＭ重炭酸ナトリウムを追加することで停止され、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーを用い、４１５ｎｍでＯＤにより分析される。次に、バックグラウンド細胞（Ｈ３６コントロール細胞）でシグナルが増強することが示されたクローンが単離され、１０ｍｌの培地に増殖され、３回の実験でさらにＥＬＩＳＡデータの特徴が決定、確認される。ＥＬＩＳＡは前記同じクローンの条件付け（ＣＭ）で実施され、各ウェルの条件培地で総Ｉｇの生産を測定する。次に、ＥＬＩＳＡシグナルを増強させ、抗体レベルが上昇したクローンでさらに、実施例４で説明されるとおり、抗体が過剰発現および／または過剰分泌した変異体が分析される。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４細胞の９６ウェルプレート５枚を分析し、前記ＨＢｖｅｃコントロールと比べ、光学濃度（ＯＤ）値が高い、有意な数のクローンが前記ＭＭＲ不完全ＨＢ１３４細胞で観察されることが分かった。図４は、親和性が高く、（ＩｇＥの場合）特異的抗原に結合する抗体を産生するＨＢ１３４クローンの代表例を示している。図４では、９６ウェルのＨＢｖｅｃ（左のグラフ）またはＨＢ１３４（右のグラフ）の分析による生データを提供し、１）ＩｇＥ抗体への結合力が上昇する抗体可変ドメインの遺伝的変化、または２）前記抗体分子の過剰生産／分泌につながる細胞宿主の遺伝的変化により、ＨＢ１３４プレートの２クローンでＯＤの読み値が高くなることを示している。抗Ｉｇ ＥＬＩＳＡでは、図４で示される２種類のクローンで、ＩｇレベルがＣＭ内にあり、ＯＤ値が低いことを示す周囲のウェルと同等であることが分かった。これらのデータは、前記抗体の抗原結合ドメインで遺伝的変化が発生し、これにより抗原結合力が高くなる可能性があることを示している。
ＥＬＩＳＡで決定されたとおり、ＯＤ値が高いクローンが前記遺伝子レベルでさらに分析され、前記軽鎖または重鎖可変領域に変異が発生し、結合親和性が高くなり、ＥＬＩＳＡシグナルが強くなることが確認された。簡潔に言うと、上述の通り、トリアゾール法により１００，０００個の細胞が採取され、ＲＮＡが抽出された。ＲＮＡは前記製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が示したとおり、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩで逆転写され、前記可変部の軽鎖と重鎖に含まれる抗原結合部位でＰＣＲ増幅される。これらの遺伝子の性質は不均一であるため、以下の縮重プライマーが利用され、前記親Ｈ３６株の軽鎖および重鎖対立遺伝子が増幅される。
軽鎖センス：５’−ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：４５）
軽鎖アンチセンス：５’−ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ−３’（配列ＩＤ番号：４６）
重鎖センス：５’−Ａ（Ｇ／Ｔ） ＧＴＮ （Ａ／Ｃ）ＡＧ ＣＴＮ ＣＡＧ （Ｃ／Ｇ）ＡＧ ＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：４７）
重鎖アンチセンス：５’−ＴＮＣ ＣＴＴ Ｇ（Ａ／Ｇ）Ｃ ＣＣＣ ＡＧＴ Ａ（Ｇ／Ａ）（Ａ／Ｔ）Ｃ−３’（配列ＩＤ番号：４８）。
変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応が９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、７２℃で１分間、３５サイクル実施される。生成物はアガロースゲルで分析される。予想される分子量の生成物はＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１）で前記ゲルから精製され、Ｔ−ｔａｉｌｅｄベクターにクローニング、配列決定され、前記可変部の軽鎖と重鎖の野生型配列を同定する。前記野生型配列が決定したら、非変性プライマーが作られ、ポジティブＨＢ１３４クローンがＲＴ−ＰＣＲ増幅された。軽鎖および重鎖の両方が増幅、ゲル精製され、対応するセンスおよびアンチセンスプライマーで配列決定された。前記ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列では、前記内因性免疫グロブリン遺伝子それぞれの配列データを示しているが、ＰＣＲで誘導された変異によるものではない。クローンの配列は、次に配列比較で前記野生型配列と比較された。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖にｉｎ ｖｉｖｏで変異を作る能力の例が図５に示されており、ＨＢ１３４クローン９２は、ＥＬＩＳＡでｈＩｇＥシグナルが上昇していることが同定された。特異的センスおよびアンチセンスプライマーにより、前記軽鎖が増幅された。前記軽鎖はＲＴ−ＰＣＲ増幅され、前記で得られた生成物は精製され、自動ＡＢＩ３７７シーケンサーで分析された。クローンＡに示されるとおり、前記ＣＤＲ領域３の上流にある残基−４はＡＣＴからＴＣＴの遺伝的変化を有し、ＣＤＲ＃３のすぐ前にあるフレームワーク領域でＴｈｒがＳｅｒに変化している。クローンＢでは、前記ＣＤＲ領域の上流にある残基−６がＣＣＣからＣＴＣへの遺伝的変化を有し、ＣＤＲ＃２の前にあるフレームワーク領域でＰｒｏがＬｅｕに変化している。
免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン遺伝子のランダム変異を発生させる能力は、ハイブリドーマに限定されない。Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）は、これまでに高頻度変異可能なハムスター細胞を作成、外来遺伝子で変異を発生させる能力を示した。ヒト化抗体を作成する一般的な方法は、ＭＡｂ（齧歯類宿主に免疫性を与えることで作成）からヒトＩｇ骨格にＣＤＲ配列を移植するものであり、前記キメラ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質転換し、これが前記ＣＨＯ細胞から分泌される機能性Ａｂを産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２〜４１３）。この応用に説明されている方法は、齧歯類細胞株、植物、酵母、原核細胞などの宿主細胞に形質転換されたＩｇ遺伝子またはキメラＩｇの遺伝的変化を作成するためにも有用である（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２３：１４８３〜１４９４）。
これらのデータは、高頻度変異可能なハイブリドーマ、または他の増殖および選択可能なＩｇ産生宿主細胞を作成し、これだけに限らないが、抗原結合親和性が上昇するなど、生化学的特徴が増強された抗体を産生する、構造が変化した免疫グロブリンを同定する能力を証明している。さらに、アミノ酸が変化した免疫グロブリン遺伝子にミスセンス変異を含む高頻度変異可能なクローンで、さらにｉｎ ｖｉｖｏ安定性、抗原除去、抗原結合のオン・オフなどの特徴が決定されうる。クローンはさらにその後のｉｎ ｖｉｖｏ変異で増殖され、前述の戦略によりスクリーニングされうる。
細胞または生物全体の遺伝的変異を生じる化学的突然変異誘発要因の利用は、これらの因子が「正常な」細胞に有する毒性作用のため、制限されている。ＭＭＲ不完全生物のＭＮＵなどの化学的突然変異誘発要因の利用でははるかに耐性があり、ＭＭＲ不完全性のみの遺伝的変異が１０〜１００倍増加する（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１〜８２）。この戦略では、化学的突然変異誘発要因を利用するため、免疫グロブリン遺伝子またはキメラにさらに変異を増加し、抗原結合親和性の向上などの生化学的特徴が変化した機能性Ａｂを生じることができる方法として、ＭＭＲ不完全Ａｂ産生細胞で利用できる。
抗体産生が増加した抗体産生細胞の生成
前述のスクリーニング戦略後、Ｈ３６およびＨＢ１３４のクローンを分析することで、前記培地への抗体生産量が増加した、有意な数のクローンを同定した。これらのクローンのサブセットはＥＬＩＳＡで決定されたとおり、前記可変領域に含まれる前記抗原結合ドメインの変異の結果として、より高いＩｇ結合性のデータを示したが、その他は抗体産生の「増加」を含むことが分かった。Ｍａｂの産生分泌量が増加したクローンのまとめは表２に示されており、ＨＢ１３４細胞の有意な数のクローンで、Ｈ３６コントロール細胞と比べ、前記条件培地のＡｂ産生が亢進することが分かった。
表２．高レベルの抗体を産生するハイブリドーマ細胞の生成。Ｉｇレベルが上昇したＥＬＩＳＡにより、ＨＢ１３４クローンがアッセイされた。４８０クローンの分析では、有意な数のクローンでＣＭのＭＡｂ産物のレベルが上昇したことが示された。定量化では、前記Ｈ３６細胞株のクローンと比べ、発現および／または分泌が上昇することにより、これらのクローンのいくつかで５００ｎｇｓ／ｍｌ以上のＭＡｂが産生されることが示された。
Figure 2007525973
前記条件培地（ＣＭ）のＭＡｂレベルが高いＨＢ１３４クローンの細胞分析で分析され、前記産生増加が単に前記Ｉｇ遺伝子座の遺伝的変化のためであり、前記抗体を産生するポリペプチドを過剰発現する可能性があるか否か、または分泌経路のメカニズムに影響する遺伝的変化により、分泌が亢進したためであるか否かを決定した。この問題を扱うため、ＣＭ内の抗体レベルが上昇した３種類のＨＢ１３４クローンが増殖された。ウエスタンブロット分析用に１０，０００個の細胞が調整され、細胞内定常状態のＩｇタンパク質レベルをアッセイした（図６）。さらに、Ｈ３６細胞が標準的基準として利用され（レーン２）、齧歯類の線維芽細胞（レーン１）がＩｇネガティブコントロールとして利用された。簡潔に言えば、細胞が遠心分離によりペレット化され、３００μｌのＳＤＳ溶解緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ ブロモフェノールブルー）で直接溶解され、５分間沸騰された。溶解物タンパク質が、４〜１２％の（Ｉｇ重鎖の分析用）ＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動により分離された。ゲルは４８ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、４０ｍＭグリシン、０．０３７５％ ＳＤＳ、２０％メタノール中、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気ブロットされ、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０および５％コンデンスミルク中、１時間、室温でブロックされた。フィルターが１：１０，０００に希釈されたヒツジ抗マウス西洋わさびベルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体を用い、ＴＢＳ緩衝液中でプローブされ、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、化学発光で検出された。実験は２回繰り返され、再現性が確認された。図６は代表的な分析を示しており、あるクローンのサブセットでＩｇ産生が亢進し、これはＡｂ産生の増加を説明しているが（レーン５）、他のクローンサブセットでは前記コントロールサンプルと同様の定常状態レベルを有し、前記ＣＭ内でＡｂレベルが高かった。これらのデータは、ＨＢ１３４クローンのサブセットに遺伝的変化が含まれ、これによって抗体の分泌が上昇するメカニズムを示唆している。
細胞または生物全体の遺伝的変異を生じる化学的突然変異誘発要因の利用は、これらの因子が「正常な」細胞に有する毒性作用のため、制限されている。ＭＭＲ不完全生物のＭＮＵなどの化学的突然変異誘発要因の利用でははるかに耐性があり、ＭＭＲ不完全性のみの遺伝的変異が１０〜１００倍増加する（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ： ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１〜８２）。この戦略では、化学的突然変異誘発要因を利用するため、免疫グロブリン遺伝子またはキメラにさらに変異を増加し、抗原結合親和性の向上などの生化学的特徴が変化した機能性Ａｂを生じることができる方法として、ＭＭＲ不完全Ａｂ産生細胞で利用できる。
新しいアウトプット形質を持つハイブリドーマ細胞の遺伝的安定性の確立
ＭＭＲの初期段階は、ＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２種類の蛋白質複合体に依存している（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。ドミナントネガティブＭＭＲ対立遺伝子は、前記「補正された」ヌクレオチドを有するヌクレオチドの切除と重合に関与する下流生化学物質を用いた、これらの複合体形成を混乱させることができる。この応用の例は、ハイブリドーマ細胞株に発現され、ＭＭＲをブロッキングし、細胞分裂ごとにゲノム全体で遺伝的変化を獲得する高頻度変異細胞株とすることができる場合、切断されたＭＭＲ対立遺伝子（ＰＭＳ１３４）と完全な長さのヒトＰＭＳ２の能力を示している。抗体、単鎖抗体、免疫グロブリン遺伝子の過剰発現、および／または抗体分泌の亢進をコードする遺伝子に遺伝的変化を含む細胞株が産生されると、前記細胞宿主の遺伝的統合性を回復することが望ましい。これは、誘導ベクターを利用することで達成される可能性があり、それによってドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子はそのようなベクターにクローニングされ、Ａｂ産生細胞に導入され、前記細胞が誘導分子および／または状態存在下、培養される。誘導ベクターには、これだけに限らないが、前記ステロイド誘導ＭＭＴＶ、テトラサイクリン制御プロモーター、温度感受性ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子、温度感受性プロモーターなど、化学的に制御されたプロモーターを含む。
上述の結果から、いくつかの結論が得られる。まず、ｈＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４が発現することで、ハイブリドーマ細胞のマイクロサテライト不安定性が上昇する。このマイクロサテライト不安定性の上昇がＭＭＲ不完全性が原因であることは、安定的に形質導入された細胞の抽出物を評価することで証明された。ＰＭＳ１３４が発現するとＭＭＲの極性に異常が生じ、５’方向からの修復を検査するようにデザインされた異種二重性（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ）を利用した場合にのみ観察された（前記３’方向からの修復で、同じ抽出物に重大な異常が観察された）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５〜１６４１）。興味深いことに、ｈＭＬＨ１が不十分な細胞もＭＭＲに極性の異常を有しているが、この場合、３’方向から選択的に修復に影響する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ， Ｊ．Ｔ， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｕｔＬａ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９６４５〜１９６４８）。これまでの研究から、原核細胞および真核細胞の両方で、前記別の酵素成分が前記２種類の方向から修復を媒介することが分かっている。我々の結果は、Ｄｒｕｍｍｏｎｄらの結果と組み合わせると（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２〜４１３）、５’修復が主にｈＰＭＳ２に依存しているが、３’修復は主にｈＭＬＨ１に依存しているモデルを強く示唆している。ＰＭＳ２とＭＬＨ１の二量体複合体がこの方向性をどのように設定するかを想定することは容易である。前記総合的結果も、方向性ＭＭＲの異常がＭＭＲ不完全表現型を生じるために不十分であることを証明しており、すべてのＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子が遺伝子組み換えハイブリドーマ細胞、またはＩｇ遺伝子産物を生産する細胞株の産生に有用であることを示している。さらに、そのようなＭＭＲ対立遺伝子の利用が、生化学的特徴が変化した遺伝子組み換えＩｇポリペプチド、および多量の抗体分子を生産する宿主細胞の生成に有用である。
本応用から分かる別の方法は、ＭＭＲの遮断に利用されるすべての方法を実行し、抗体産生細胞で高頻度変異を作成できる方法であり、これだけに限らないが、抗原結合性の上昇、薬物動態学的プロフィールなどの生化学的特徴が亢進した遺伝子組み換え抗体ができる可能性がある。これらのプロセスを利用して、例４、図６に示されるとおりＩｇ発現が亢進し、および／または表２に示されるとおり抗体分泌が上昇した抗体産生細胞を作成することもできる。
さらに、我々は、抗体産生細胞でＭＭＲのブロッキングを利用し、Ｉｇ遺伝子の遺伝的変化を促すことにより、これだけに限らないが、抗原結合親和性の上昇など、生化学的特徴が変化する可能性があることを証明する（図５Ａおよび５Ｂ）。そのような細胞におけるＭＭＲの遮断は、細菌、酵母、原虫、昆虫、齧歯類、霊長類、哺乳類細胞、ヒトを含むすべての種のドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を利用して行うことができる。ＭＭＲの遮断は、前記ＭＭＲ生化学的経路に関与するすべての遺伝子に関与するアンチセンスＲＮＡまたはデオキシヌクレオチドを利用することで発生させることもできる。ＭＭＲの遮断は、これだけに限らないが、抗体などの前記ＭＭＲ複合体サブユニットと干渉するポリペプチドを利用して行うことができる。最後に、ＭＭＲの遮断は、これだけに限らないが、ＭＭＲを遮断することが示された非加水分解性ＡＴＰアナローグなどの化学物質を利用して行うことができる（Ｇａｌｉｏ，Ｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｅｒｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＭｕｔＳ ａｎｄ ＭｕｔＬ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２３２５〜２３２３１）。
細胞がＡＩＤを発現するように選択されうることを証明するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫により作成されるハイブリドーマ細胞のｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（クローン５−８用）またはＥｘｐｒｅｓｓＤｉｒｅｃｔ（クローン７−６、８−２、３−３２用）を用いて作成された。ＡＩＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０２０６６１（配列ＩＤ番号：３９）、前記ＡＩＤタンパク質（配列ＩＤ番号：４０）をコード）がプライマーＡＩＤ−７７−Ｆ（ＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡ）（配列ＩＤ番号：４１）およびＡＩＤ−５６１−Ｒ（ＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣ）（配列ＩＤ番号：４２）を用いて増幅され、４８４ｂｐの単位複製配列を作成した。ＰＣＲ条件：９５°Ｃ、５分を１回：９４°Ｃ、３０秒；５５°Ｃ、３０秒；７２°Ｃ、３０秒を３５回；７２°Ｃ、７分を１回。反応混合物の１０％が１％アガロースゲルで分析された。結果は図７に示す。
図１は、安定的にＰＭＳ２とＰＭＳ１３４ ＭＭＲ遺伝子を発現したハイブリドーマ細胞を示している。マウスハイブリドーマ細胞株に形質転換されたＭＭＲ遺伝子の定常状態でのｍＲＮＡ発現が示されている。３ヵ月間継続的に増殖した後、安定的な発現が認められた。（−）レーンは逆転写酵素を追加しなかったネガティブコントロールを示し、（＋）レーンは逆転写し、ＭＭＲ遺伝子をＰＣＲ増幅したサンプルと、コントロールとして内部ハウスキーピング遺伝子を示す。 図２は、遺伝的に高頻度変異可能なハイブリドーマ細胞の作成を示している。ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を発現した細胞で発現された。ＰＭＳ１３４などのドミナントネガティブ対立遺伝子と他の種からのＭＭＲ遺伝子の発現により、高頻度変異表現型を有する抗体産生細胞が生じ、これを利用し、生化学的特徴が向上した遺伝子組み換え免疫グロブリン遺伝子と、Ｉｇ発現および／または分泌が上昇した細胞株を産生することができる。示された値は変換されたＣＰＲＧ基質量を示し、前記ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター遺伝子の遺伝的変化から細胞に含まれる機能性β−ガラクトシダーゼの量を反映している。β−ガラクトシダーゼ活性の量が高いことが不完全ＭＭＲによる変異率が高いことを反映している。 図３は、抗体を含み、結合活性が上昇し、および／または発現／分泌が上昇した抗体産生細胞を同定するスクリーニング方法を示している。 図４は、結合活性が上昇した遺伝子組み換え抗体の作成について示している。ｈＩｇＥ特異的抗体をスクリーニングした９６ウェルプレートのＥＬＩＳＡ値が示されている。ＨＢ１３４培地に高結合値をもつ２つのクローンが認められた。 図５Ａでは、様々な抗体鎖の配列変化（ＭＭＲ不完全ＨＢ１３４抗体産生細胞の軽鎖可変領域の変異）について示している。矢印は、ＨＢ１３４細胞由来のクローンから細胞サブセットに変異が発生したヌクレオチドを示している。上段には前記ＨＢ１３４配列（配列ＩＤ番号：５１）が示され、前記親Ｈ３６配列（配列ＩＤ番号：５２）が配列トレーシングの上下に示されている。この変化により、軽鎖可変領域のＴｈｒがＳｅｒに変化している。前記コード化配列はアンチセンス方向である。 図５Ｂでは、様々な抗体鎖の配列変化（ＭＭＲ不完全ＨＢ１３４抗体産生細胞の軽鎖可変領域の変異）について示している。前記ＨＢ１３４配列のトレーシングの上下に前記ＨＢ１３４配列（配列ＩＤ番号：５３）が示され、前記Ｈ３６配列のトレーシングの上下に前記親Ｈ３６配列（配列ＩＤ番号：５４）が示されている。コンセンサス配列（配列ＩＤ番号：５５）は図の下に示されている。矢印は、ＨＢ１３４細胞由来のクローンから細胞サブセットに変異が発生したヌクレオチドを示している。この変化により、軽鎖可変領域のＰｒｏがＬｅｕに変化している。 図６は、定常状態のＩｇタンパク質レベルが上昇したＭＭＲ不完全クローンの作成について示している。条件培地でＭＡｂ（>５００ｎｇｓ／ｍｌ）のレベルが高いＨＢ１３４クローンの重鎖免疫グロブリンのウエスタンブロットは、クローンのサブセットがより高レベルの定常状態免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現することを示している。前記Ｈ３６細胞株がコントロールとして使用され、前記親株の定常状態レベルを測定した。レーン１：線維芽細胞（ネガティブコントロール）；レーン２：Ｈ３６細胞；レーン３：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン；レーン４：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン；レーン５：ＭＡｂレベルが上昇したＨＢ１３４クローン。 図７では、活性誘導シチジンデアミナーゼの特定クローンによる発現を示している。レーン１、水のコントロール；レーン２、５−８ ＲＴ＋（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ）；レーン３、５−８ ＲＴ−（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ）；レーン４、７−６（ＥＸＰＲＥＳＳＤＩＲＥＣＴ）；レーン５、８−２（ＥＸＰＲＥＳＳＤＩＲＥＣＴ）；レーン６、３−３２（ＥＸＰＲＥＳＳＤＩＲＥＣＴ）。

Claims (43)

  1. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法であって、
    抗体産生細胞にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを導入する工程と、
    活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現を刺激する工程を有し、
    それによって高頻度変異可能な抗体産生細胞を作成する方法。
  2. 請求項１の方法において、
    前記ミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ２の切断型をコードしているものである。
  3. 請求項２の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、哺乳類ＰＭＳ２である。
  4. 請求項２の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、齧歯類ＰＭＳ２である。
  5. 請求項２の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、ヒトＰＭＳ２である。
  6. 請求項２の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、植物ＰＭＳ２である。
  7. 請求項２の方法において、
    前記ＰＭＳ２の切断型は、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：３３、及び配列ＩＤ番号：３７から成るグループから選択されたアミノ酸配列から成るものである。
  8. 請求項１の方法において、
    前記活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現は、少なくとも１つの活性化サイトカインと共に前記細胞をインキュベートすることによって刺激されるものである。
  9. 請求項８の方法において、
    前記活性化サイトカインは、ＬＰＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦβ、及びＩＬ−４から成るグループから選択されるものである。
  10. 請求項１の方法により生産された、単離、高頻度変異、抗体産生細胞。
  11. 請求項１０の前記細胞の培養。
  12. 請求項１の方法であって、さらに、
    前記ポリヌクレオチドの前記ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を不活化する工程を有し、それによって遺伝的に安定な抗体産生細胞が産生されるものである、方法。
  13. 請求項１２の方法によって産生された、単離された、遺伝的に安定な、抗体産生細胞において、
    前記抗体産生細胞は、ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を有する前記ポリヌクレオチドの導入前に産生したものよりも高親和性を有する抗体を産生するものである。
  14. 請求項１３の細胞の培養。
  15. 請求項１２の方法によって産生された、単離された、遺伝的に安定な、抗体産生細胞において、
    前記抗体産生細胞は、ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を有する前記ポリヌクレオチドの導入前に産生したものよりも高力価抗体を産生するものである。
  16. 請求項１３の遺伝的に安定な細胞の均一な培養。
  17. ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化された免疫グロブリン産生細胞から、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、
    （ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫グロブリンを産生することができる細胞と免疫原性抗原とを混合する工程と、
    （ｂ）親ハイブリドーマ細胞を形成するために、前記細胞とミエローマ細胞を融合する工程と、
    （ｃ）活性化誘導シチジンデアミナーゼを発現する細胞を選択する工程と、
    （ｄ）前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異原性を可能にし、それによって高頻度変異可能なハイブリドーマ細胞を形成する工程と、
    （ｅ）抗原に特異的に結合する抗体を産生する、高頻度変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、
    それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化された免疫グロブリン産生細胞から、抗体を産生するハイブリドーマ細胞が産生されるものである、方法。
  18. 請求項１７の方法において、
    前記活性化誘導シチジンデアミナーゼは、哺乳類の活性化誘導シチジンデアミナーゼである。
  19. 請求項１８の方法において、
    前記活性化誘導シチジンデアミナーゼは、ヒトの活性化誘導シチジンデアミナーゼである。
  20. 請求項１７の方法において、
    前記活性化誘導シチジンデアミナーゼは、マウスの活性化誘導シチジンデアミナーゼである。
  21. 請求項１７の方法において、
    前記親ハイブリドーマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現するものである。
  22. 請求項１７の方法において、
    前記ミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＭＳＨ６、ＰＭＳＲ６、及びＰＭＳＬ９から成るグループから選択されるものである。
  23. 請求項２２の方法において、
    前記ミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ２タンパク質の切断型をコードしているものである。
  24. 請求項２３の方法において、
    前記ＰＭＳ２タンパク質の切断型は、ＰＭＳ２−１３４を有するものである。
  25. 請求項２３の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、植物ＰＭＳ２である。
  26. 請求項２３の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、哺乳類ＰＭＳ２である。
  27. 請求項２６の方法において、
    前記ＰＭＳ２は、ヒトＰＭＳ２である。
  28. 請求項１７の方法において、
    前記親ハイブリドーマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子で形質転換されたものである。
  29. 請求項１７の方法において、
    前記ミエローマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するものである。
  30. 請求項２９の方法において、
    前記ミエローマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子で形質転換されたものである。
  31. 請求項１７の方法において、
    前記抗体産生細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するものである。
  32. 請求項３１の方法において、
    前記抗体産生細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子で形質転換されるものである。
  33. 請求項１７の方法において、
    前記親ハイブリドーマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子で形質転換されるものである。
  34. 請求項１７の方法であって、さらに、
    前記親ハイブリドーマ細胞をミスマッチ修復の化学的阻害剤と共にインキュベートする工程を有するものである。
  35. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する方法であって、
    抗体産生細胞にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有するポリヌクレオチドを導入する工程と、
    抗体産生細胞の集団を産生するために、前記抗体産生細胞を培養する工程と、
    活性化誘導シチジンデアミナーゼを発現した前記集団から、抗体産生細胞を選択する工程とを有し、
    それによって高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する、方法。
  36. 請求項３５の方法において、
    前記抗体産生細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
  37. 請求項３５の方法において、
    前記抗体産生細胞は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードしたポリヌクレオチドで形質転換された哺乳類発現細胞である。
  38. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する方法であって、
    ミスマッチ修復欠損抗体産生細胞において、活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現を刺激する工程を有し、
    それによって高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する、方法。
  39. 請求項３８の方法において、
    前記抗体産生細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦβ、ＩＬ−ＩＬ−４、及びＬＰＳから成るグループから選択された少なくとも１つの活性化サイトカインで刺激されるものである。
  40. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する方法であって、
    抗体産生細胞において、活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現を刺激する工程を有し、それによって高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する、方法。
  41. 請求項４０の方法において、
    前記抗体産生細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦβ、ＩＬ−ＩＬ−４、及びＬＰＳから成るグループから選択された少なくとも１つの活性化サイトカインで刺激されるものである。
  42. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する方法であって、
    抗体産生細胞を培養する工程と、
    活性化誘導シチジンデアミナーゼを発現した抗体産生細胞を選択する工程とを有し、
    それによって高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する、方法。
  43. ｉｎ ｖｉｔｒｏで高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する方法であって、
    ミスマッチ修復を欠損する抗体産生細胞を培養する工程と、
    活性化誘導シチジンデアミナーゼを発現した抗体産生細胞を選択する工程とを有し、
    それにより高頻度変異可能な抗体産生細胞を産生する、方法。
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