JP2007525480A - リシンａ鎖の遷移状態類似体阻害剤 - Google Patents

Abstract

リシン毒素Ａの遷移状態類似体改良阻害剤が提供される。リシン毒素Ａを阻害し、哺乳類におけるリシン毒素Ａの毒性を防ぐためにこれら阻害剤を使用する方法も提供される。

Description

この出願は、２００３年９月９日出願の米国仮出願第６０／５０１，３８８号の利益を請求する。

連邦協賛研究開発についての陳述
米国政府は、本発明において支払い済みのライセンスを持っており、限られた条件下、ＮＩＨにより承認された第ＣＡ７２４４４号の支払いにより準備されるような合理的な状況において、本特許権者が他者にライセンスを付与するよう要求する権利を持つ。

（１）本発明分野
本発明は一般的に、酵素阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態類似体阻害剤のデザインにおける改良、リシン毒素Ａの遷移状態類似体改良阻害剤、ならびにこれら阻害剤を使用する方法に関する。

（２）関連技術の記載
参照文献
Baluna R. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 3957-3962.
Endo, Y. et al., 1991, J. Mol. Biol. 221: 193-207.
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Hesselberth, JR et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4937-4942.
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Taneka, KSE et al., 2001, Biochemistry 40: 6845-6851.
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Yan, X et al., 1997, J. Mol. Biol. 266: 1043-1049.

リシンは、蓖麻豆から単離された細胞毒性ヘテロダイマータンパクである。リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）は、Ｎ−グリコシダーゼである。これは、特定のアデノシン（Ａ４３２４）のＣ１’−Ｎ９結合を開裂させるが、これは、２８ＳｒＲＮＡ上の５’−ＧＡＧＡ−３’テトラループ２次構造エレメント中の、２番目の残基である（図１）。該アデノシンの加水分解は結果的に、６０Ｓリボゾームサブユニットの、延長因子に結合する能力を反故にし、タンパク合成阻害および細胞死へと至る。

リシン毒素Ｂ鎖は、細胞表面受容体へと結合するガラクトース特異的レクチンであり、これゆえ、受容体媒介エンドサイトーシスによる取り込みへとリシン毒素Ａ鎖を向かわせるように働く（図２）。これは次いで、ゴルジ装置（ゴルジ体）を介してＥＲへと、ＥＲＡＤ経路を通って逆行輸送されると考えられる。ＲＴＡは次いで細胞質へと、Ｓｅｃ６１ｐチャネルを介して放出される。

リシンは、哺乳類では非常に高い毒性を持っており、μｇ／ｋｇの範疇である。このため、これは、政治的な暗殺において使用され、テロリストの武器として使用されるべく開発されてきた（Ｙａｎら、１９９７年、および、Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈら、２０００年中の引用文献参照）。ＲＴＡはまた抗体へと共有結合し、これは「魔法の弾丸」である免疫毒のデザインにおいて利用されてきたが、顕著な抗癌活性を有する（Ｅｎｇｅｒｔら、１９９８年；Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、１９９８年）。しかしながら、非特異的な副作用が、その使用を限定してしまう（Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、１９９８年；Ｂａｌｕｎａら、１９９９年）。ＲＴＡ阻害剤はこれゆえ、リシンの急性毒性およびＲＴＡ免疫毒の副作用を防ぐことにおけるそれらの潜在能力に関して、有用である。

ある幾つかのＲＴＡ阻害剤が開発されてきたが、構造に基づく阻害剤（Ｙａｎら、１９９７年）およびアプタマー（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈら、２０００年）を包含する。もう１つ別のアプローチにおいて、ＲＴＡのオキサカルベニウムイオン遷移状態に似ている阻害剤が開発された（Ｔａｎａｋａら、２００１年）。本発明はこのアプローチを引き継ぎ、オリゴヌクレオチド類似体改良阻害剤および新規小分子阻害剤を提供する。

従って、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤における改良を与える。

これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤に関する。本阻害剤は、配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡを含み、ここで（ｄ）ＧはＧもしくはｄＧであり、Ｘはリシン毒素Ａの遷移状態のアデノシン類似体であり、ここで少なくとも１つの（ｄ）Ｇ部分がｄＧであり、配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡから伸びてきた如何なる更なるヌクレオチド配列も、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を含む。これら阻害剤はまた、互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、もしくはプロドラッグの形態であってもよい。

他の実施形態において、本発明は、リシン毒素Ａの他の遷移状態阻害剤に関する。これら阻害剤は、アデノシン類似体（Ｘ）、および、配列ＣＧＣＧＸＧＡＧＣＧの内の少なくとも９リボヌクレオチドのステム・ループ構造を含み、ここで本遷移状態阻害剤はまた、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を含み、ここでＸが、ＢＺ、ＰＺ、およびＤＡからなる群から選択され、図９に与えられるとおりである。これら阻害剤はまた、互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、もしくはプロドラッグであってもよい。

加えて、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤に関し、ＤＡＤＭｅ−Ａ（図１４）のように、ピロリジンを含むが更なるリボヌクレオチドはない。これら阻害剤はまた、互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、もしくはプロドラッグであってもよい。

更なる実施形態において、本発明は、リシン毒素Ａ遷移状態阻害剤に関し、これは、式（Ｉ）：

の化合物からなり、式中：
Ａｄは、アデニン−９−イルであり；
Ｇｕは、グアニン−９−イルであり；
Ｒ^１は、１〜１０の３’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、シチジンおよびグアノシンヌクレオチド単位に代わるものであり；
Ｒ^２は、１〜１０の５’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、グアノシンもしくはシチジンヌクレオチド単位に代わるものであり；
ＶはＣＨ_２およびＮＨから選択され、ＷはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され；または、ＶはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され、ＷはＣＨ_２およびＮＨから選択され；
ＸはＣＨ_２およびＣＨＯＨ（ＲもしくはＳ配置）から選択されるが、Ｗが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時ＸはＣＨ_２であり；
Ｙは、水素、ハロゲン、およびヒドロキシから選択され、Ｖが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時Ｙは水素であり；
Ｚ^１およびＺ^２は独立に、水素およびヒドロキシルから選択され；ならびに
Ｒ^１は式（ＩＩ）：

の基であり、Ｒ^２は式（ＩＩＩ）：

の基であり、式中：
Ａは、Ｎ、ＣＨ、およびＣＲから選択され、ここでＲが、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、アラルキルもしくはアリール、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、およびＳＲ^５から選択され；ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が各々、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｂは、ＮＨ_２、ＮＨＲ^６から選択され、ここでＲ^６が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^７、水素、ハロゲン、およびＳＣＨ_３から選択され、ここでＲ^７が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択され；
Ｇは、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、およびＮＨから選択されるかまたは存在せず、但し、ＷがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、ＶがＣＨ_２であり、但し、ＶがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、ＷがＣＨ_２である。上記した阻害剤のように、これら阻害剤も、互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、もしくはプロドラッグであってよい。

本発明はまた、リシン毒素Ａを阻害する方法に関する。本方法は、リシン毒素Ａを、上記遷移状態阻害剤のいずれかと組み合わせることを含む。

加えて、本発明は、哺乳類を、リシン毒素Ａ抗体免疫毒で処理する方法に関する。本方法は、哺乳類を、該リシン毒素Ａ抗体免疫毒、および、上記いずれかの遷移状態阻害剤で処理することを含む。

本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態改良阻害剤を提供する。これら改良された阻害剤は、ＲＴＡの反応遷移状態を解明していく実施例１に記載された作業に一部基づいて発見された。

ある幾つかの実施形態において、本発明はリシン毒素Ａの遷移状態阻害剤に関する。これら阻害剤は、配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡを含み、ここで（ｄ）ＧはＧもしくはｄＧであり、Ｘはリシン毒素Ａの遷移状態のアデノシン類似体であり、ここで少なくとも１つの（ｄ）Ｇ部分がｄＧであり、配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡから伸びてきた如何なる更なるヌクレオチド配列も、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を含む（付番はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ１０８８０におけるとおりであり、ヒト２８ＳｒＲＮＡの位置Ａ４５６５に類似し；該ステム・ループ構造のヒトでの配列は、ラットでの該ステム・ループ配列に相同である）。このステム・ループ配列は、哺乳類２８ＳｒＲＮＡのサルシン−リシン・ループと呼ばれる。

実施例１に論じられる探索において発見されたとおり、その脱プリン化部位に先行する部位のデオキシグアノシンは、ここでは該遷移状態類似体はラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に類似しているアデノシンに置き換わるものであり（Ｅｎｄｏら、１９９１年）、そこで測定されたとおり、この酵素反応の減少したＫｃａｔにより、改良された阻害剤を提供する。当業者であれば、該脱プリン化部位以降のデオキシグアノシンもまた、該脱プリン化部位前のデオキシグアノシンを置換しているものであってもこれに加わっているものであっても、該遷移状態阻害剤に対して改良された阻害を与えるということを理解するものである。この改良はまた、ＲＴＡ遷移状態の電荷および形状に似ている如何なるアデノシン置換（Ｘ）、例えば、Ｐ、ＩＡ、Ｅ、Ｄ、ＩＲ、１Ｎ、ＢＺ、ＰＺ、ＤＡ、およびＤＡＤＭｅ−Ａを伴う場合でも期待されるが、これらは、図６、７、９、および１４に与えられるとおりである。これら化合物の互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、およびプロドラッグもまた有効な阻害剤であるものであり、ここでこれらエステルおよびプロドラッグが特に、ＲＴＡ毒性を阻害するｉｎ ｖｉｖｏでの処置において有用であることも、理解されるものである。これら互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、およびプロドラッグは、過度な実験なしに、当業者により調製され得る。

好ましい実施形態において、該阻害剤配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡは、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を持っている、ステム・ループ構造の一部である。これら阻害剤の例は、配列Ｃ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧ、ＣＧＣ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧＣＧ、ＣＧＣＧＣ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧＣＧＣＧ、ＣＧＣｄＧＸｄＧＡＧＣＧ、ＣＧＣＧＸｄＧＡＧＣＧ、もしくはＣＧＣｄＧＸｄＧＡＧＣＧを含む。

好ましい実施形態において、Ｘは、ＢＺ、ＰＺ、もしくはＤＡであり；最も好ましい実施形態において、ＸはＢＺである。好ましい阻害剤の例は、図１６のＢＺ−５ｄＧ−１０である。

本発明はまた、リシン毒素Ａの遷移状態の更なる阻害剤に関する。これら阻害剤は、アデノシン類似体（Ｘ）、および、配列ＣＧＣＧＸＧＡＧＣＧを持っている少なくとも９ヌクレオチドのステム・ループ構造配列を含み、ここで該遷移状態阻害剤はまた、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を持っており、ここでＸは、図９および図１４に与えられるとおり、ＢＺ、ＰＺ、もしくはＤＡである。

更なる実施形態において、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態小分子阻害剤に関する。これら小分子は、ステム・ループ構造中へと取り込まれることなく、ＲＴＡを阻害できる。これら阻害剤は、ＲＴＡの遷移状態類似の電荷および形状を持っているピロリジンを含む。これら小分子阻害剤の例は、ＤＡＤＭｅ−Ａである（図１４）。これら阻害剤の互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、およびプロドラッグも、上記阻害剤と共に、効果的なＲＴＡ阻害を与えると思われる。

これら遷移状態阻害剤ピロリジンの好ましい例はＤＡＤＭｅ−Ａであり、図１４に与えられるとおりである。これら遷移状態阻害剤ピロリジンはＤＡＤＭｅ−Ａを包含し、任意に、３’−ホスフェート、５’−ホスフェート、もしくは３’−ホスフェートと５’−ホスフェートとの両方を含み得、阻害活性を妨げるものとは予期されない。

更なる実施形態において、本発明は、リシン毒素Ａの遷移状態の更なる阻害剤に関する。これら阻害剤は、式（Ｉ）：

の化合物からなり、式中：
Ａｄは、アデニン−９−イルであり；
Ｇｕは、グアニン−９−イルであり；
Ｒ^１は、１〜１０の３’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、シチジンおよびグアノシンヌクレオチド単位に代わるものであり；
Ｒ^２は、１〜１０の５’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、グアノシンもしくはシチジンヌクレオチド単位に代わるものであり；
ＶはＣＨ_２およびＮＨから選択され、ＷはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され；または、ＶはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され、ＷはＣＨ_２およびＮＨから選択され；
ＸはＣＨ_２およびＣＨＯＨ（ＲもしくはＳ配置）から選択されるが、Ｗが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時ＸはＣＨ_２であり；
Ｙは、水素、ハロゲン、およびヒドロキシから選択され、Ｖが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時Ｙは水素であり；
Ｚ^１およびＺ^２は独立に、水素およびヒドロキシルから選択され；ならびに
Ｒ^１は式（ＩＩ）：

の基であり、Ｒ^２は式（ＩＩＩ）：

の基であり、式中：
Ａは、Ｎ、ＣＨ、およびＣＲから選択され、ここでＲが、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、アラルキルもしくはアリール、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、およびＳＲ^５から選択され；ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が各々、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｂは、ＮＨ_２およびＮＨＲ^６から選択され、ここでＲ^６が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^７、水素、ハロゲン、およびＳＣＨ_３から選択され、ここでＲ^７が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択され；
Ｇは、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、およびＮＨから選択されるかまたは存在せず、但し、ＷがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、その時ＶがＣＨ_２であり、但し、ＶがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、その時ＷがＣＨ_２である。これら阻害剤の互変異性体、医薬的に許容可能な塩、エステル、およびプロドラッグも、本発明の範囲内と見込まれる。

上記ＲＴＡ遷移状態阻害剤のいずれもが、ヒトを包含する哺乳類への医薬投与用に、医薬的に許容可能な賦形剤中に処方され得る。これら処方は、如何なる特定適用に関しても、過度の実験なく、投与用に調製され得る。本阻害剤組成物はまた、単独、または、化学療法剤のような他の医薬品と組み合わせて、調製され得る。加えて、本阻害剤の適切な用量は、過度の実験なく、標準的な用量−応答プロトコールを使用しつつ、求められ得る。

従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用にデザインされた本阻害剤組成物は、過度な実験を伴わず、当業界において既知の手段により、例えば、不活性希釈剤もしくは浸食性担体を用いて、調製され得る。本組成物はゼラチンカプセル中に密封されてもよく、錠剤へと圧縮されてもよい。経口投与治療目的では、本発明の阻害剤医薬組成物は賦形剤と共に取り込まれてもよく、錠剤、トローチ、カプセル、チンキ、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイングガム、および同様なものの形態で使用されてもよい。

錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様なものは、バインダー、受容物質、崩壊剤、滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーのある幾つかの例は、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤のある幾つかの例は、アルギン酸、コーン・スターチ、および同様なものを包含する。滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。滑沢剤のある１例は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料のある幾つかの例は、スクロース、サッカリン、および同様なものを包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様なものを包含する。これら種々の組成物を調製するのに使用される材料は、医薬的に純粋であり、使用量では無毒性であるべきである。

本発明の阻害剤組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、くも膜下、もしくは皮下注入によるもののように、単独で、もしくは、もう１つ別の医薬品、例えば化学療法剤と組み合わせて、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中へと取り込ませることにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、生理食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌希釈剤をも包含してよい。非経口用処方は、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびにＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。アセテート、シトレート、もしくはホスフェートのような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製品は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジ、もしくは多数回用バイアル中に封入され得る。

直腸投与は、本医薬阻害剤組成物を、直腸もしくは大腸中へと投与することを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬用処方は容易に、当業界において既知の方法により、調製され得る。例えば、坐薬用処方は、グリセリンを約１２０℃まで熱し、本組成物を該グリセリンに溶解させ、熱せられた該グリセリンを混合し、その後に精製水が加えられてもよく、熱い該混合物を坐薬の型中へと注ぐことにより、調製され得る。

経皮投与は、皮膚を通した本阻害剤組成物の経皮吸収を包含する。経皮用処方は、パッチ（よく知られているニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏、および同様なものを包含する。

本発明は、哺乳類へと、治療に有効な量の本阻害剤組成物を鼻から投与することを包含する。本明細書において使用される場合、「鼻から投与すること」もしくは「鼻からの投与」は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜へと投与することを包含する。本明細書において使用される場合、組成物の鼻からの投与用の医薬組成物は、よく知られた方法により、例えば、鼻用スプレー、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として、治療に有効な量で投与されるべき本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻用栓もしくは鼻用スポンジを使用しながら行われてもよい。

本発明は、リシン毒素Ａを阻害する方法にも関する。本方法は、リシン毒素Ａを、上記遷移状態阻害剤のいずれかと組み合わせることを含む。好ましい実施形態において、リシン毒素Ａは哺乳類生存細胞中にあり、ここで、充分な濃度の本阻害剤の存在が、リシン毒素Ａにより誘導される該細胞の死を防ぐことがある。これらの方法は、生存哺乳類、特にヒト中にある細胞において特に有用であると考えられ、ここで、本阻害剤が、該哺乳類の深刻な病気もしくは死を防ぎ得るものと考えられる。

これらの方法の１態様において、該哺乳類（例えばヒト）は、例えば癌用のリシン毒素Ａ抗体免疫毒を用いて処置を受けていき、ここで、本阻害剤が、このような「魔法の弾丸」の免疫毒により臨床試験を苦しめてきた非特異的副作用を防ぐものと期待される。上記「背景技術」セクション中の議論参照。

これらの方法のもう１つ別の態様において、本阻害剤が、哺乳類、例えば蓖麻豆混入時に草食した牛またはテロリストの攻撃によるヒト犠牲者の、事故的もしくは意図的なリシン中毒に抗するものと期待される。

本発明は更に、哺乳類を、リシン毒素Ａ抗体免疫毒を用いて処置する方法に関する。本方法は、哺乳類を、医薬的に許容可能な賦形剤中の上記遷移状態阻害剤のいずれかを用いて処置することを含む。好ましい実施形態において、該哺乳類は、該免疫毒を用いて癌に関して治療を受けているヒトである。これら方法では、該哺乳類が、最大阻害効果を達成すべく、該免疫毒を用いた処置前もしくは処置中、本阻害剤と共に処置されるのが好ましい。

本発明の好ましい実施形態が、以下の実施例中記載される。本明細書における請求項の範囲内の他の実施形態は、本明細書において開示されるような本発明の明細もしくは実施の考慮から、当業者にとって明らかなものである。本明細書は、本実施例によって例示的なだけであると考慮されるべきであると意図され、本発明の範囲および思想は、本請求項により指し示され、本実施例を以下に伴う。

実施例１．リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤
リシンＡ鎖の触媒機序
遷移状態阻害剤のデザインは、反応遷移状態に関する知識を必要とする。そのリボース環上もしくはアデニン塩基上の異なる位置において、^１４Ｃ、^３Ｈ、もしくは^１５Ｎを用いて標識された感光性アデノシンを持たせたステム・テトラループ型ＲＮＡオリゴヌクレオチド１０量体（図６では、Ａ−１０が標識された）を用い、リシン毒素Ｓ（ＲＴＡ）の加水分解反応に関して、速度論的同位体効果が測定された。平衡同位体効果も算出された。その速度論的機序が、図３に示される。

実験による最初の１’−^１４ＣのＫＩＥは反対（inverse）であったが、このことは、求核置換に関する伝統的な、協奏的で（ＫＩＥ〜１．０１）段階的な（ＫＩＥ〜１．０１８）機序と一致しない。しかしながら、これは、オキサカルベニウムイオン中間体に関して算出された平衡同位体効果の値と一致する（速度論スキーム中の［Ｅ・Ｏ］）。ＥＩＥは、モデル化合物２’−ヒドロキシプリンリボシドとその３’−エンド（内部）オキサカルベニウムイオンとの間の平衡に関して算出された。図４中の構造は、該オキサカルベニウムイオンの、量子メカニズムにより最適化された３’−エンドおよび３’−エクソ（末端）コンホメーション上に、ＧＡＧＡテトラループ（薄い灰色）の切断アデノシン残基のＸ線構造の重ね図を示す。該図から分かるように、該遷移状態において３’−エクソのコンホメーションを採ると、ＲＮＡ主鎖において大きな構造変化を要すると思われる。２’−^３ＨのＫＩＥ １．０１２は、算出されたｐ軌道のＣ１’−Ｃ２’−Ｈ２’２面角４８°に基づき、３’−エンドのコンホメーションを裏付ける。

これらの研究は、オキサカルベニウムイオン中間体を経由して進行する加水分解に関して、Ｄ_Ｎ＊Ａ_Ｎの解離の機序を示唆する。該研究はまた、酵素が結合した該オキサカルベニウムイオンにおける、通常でない３’−エンドのコンホメーションも示唆する。図５において同定された結合のＫＩＥの実験値に関しては、表１参照。

リシンＡ鎖の阻害
短いステム・ループ構造のＲＮＡはリシンの基質であるが、その加水分解反応のｋｃａｔは、無処理のリボゾームのそれ（１７７７／分）に比べ遙かに小さい（１０〜１００／分）。その脱プリン化部位中に修飾されたアデノシン類似体を有するステム・ループ構造のＲＮＡが、ＲＴＡの潜在的阻害剤として考えられ、合成された。これらが、図６に示される。該加水分解に関する遷移状態は、２つの部分を保有する。オキサカルベニウムイオン部分と、脱離基部分とである。その脱プリン化部位中に非天然類似体を有するステム・ループ構造が、アデノシン加水分解に関する遷移状態を模倣し、その環窒素が、該酵素上でプロトン化されると考えられ、該酵素が、それにオキサカルベニウムイオンの特徴を付与する。ＲＴＡはプロトン化により、脱離へと向かって該脱離基を活性化し、その大きな反対の（inverse）７−^１５ＮのＫＩＥは、Ｎ７が該遷移状態においてプロトン化されることを示唆する。この特徴が、図６に示される阻害剤ＩＡ−１０およびＥ−１０中へと取り込まれている。非塩基性（abasic）阻害剤Ｄ−１０およびＩＲ−１０も示されるが、これらは、該遷移状態のオキサカルベニウム部分から、結合エネルギーを捕捉することができるに過ぎない。

阻害：１−アザ糖
図６に示される構造は、イミノリビトール部分を、リボース等価体およびオキサカルベニウムイオン模倣体として含有する。第２世代の阻害剤が次いでデザインされ、結合親和性を向上させた。これら構造は、ポリヒドロキシピロリジンを、そのリボース等価体として取り込む。該ピロリジンはまた、該オキサカルベニウムイオン中間体の、該イミノリビトールよりも近い模倣体でもあるが、これは、Ｃ１’上の＋電荷が基質の加水分解へと向かう遷移状態にあると思われる場合、その窒素上の＋電荷が残るからである。非塩基性（abasic）類似体１Ｎ−１４が左手に示され、ＩＲ−１０（Ｋｉ＝１．３μＭ）と比較されているが、これはイミノリビトールを取り込み、１Ｎ−１４が２倍良好に結合することを示す。両分子とも非塩基性（abasic）であるので、それらの親和性における違いは、該遷移状態のオキサカルベニウムイオン部分を模倣するそれら能力における違いを反映する。

次の論理段階は、該脱離基の特徴を、本デザイン中へと取り込むことであった。ＲＴＡ、１Ｎ−１４、およびアデニンの３成分複合体の阻害は、オキサカルベニウムイオンとしての特徴と該脱離基の特徴との両方を併せ持つが、これが研究された。図８に示される熱力学図に記載のモデルへと適合させることにより、１２ｎＭのＫｉが求められた。これは、ＲＴＡに関して知られている最も密接な結合である。興味深いことに、９−デアザアデニンを用いた同様の複合体が、１００ｎＭの結合定数を持っていた。

阻害：遷移状態エネルギーのより良い捕捉へ向けて
Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎら（１９９２年）は、アデノシン脱アミノ化酵素（デアミナーゼ）の遷移状態類似体を解体し、７〜１０ｋｃａｌ／ｍｏｌが断片の適切な繋ぎ合わせから得られると結論付ける。この仮説に基づき、そのメチレン架橋がそのピロリジン１−アザ位中へと取り込まれ、Ｎ１上の＋電荷（ａ。その基質およびｂのＣ１’における電荷の模倣）を満たすようにし、反応中心（Ｎ１’／Ｃ１’）と該脱離基との間の距離を模倣した。表２は、合成された異なるメチレン架橋化合物（図９）のＫｉ値を示す。

ホスホロアミダイトカップリングの標準プロトコールを、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機上で使用し、修飾された該塩基を、ステム・ループ構造のＲＮＡ中へ取り込ませた。これらオリゴ体はＲＰ ＨＰＬＣにより精製され、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルにより分析され、組成分析がＨＰＬＣ上、ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびアルカリホスファターゼを用いた酵素消化後に実施された。

阻害の速度論：
反応速度が、１ｍＭのＥＤＴＡを含有している１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で求められた。Ａ−１０が競合基質として使用され、その濃度はＫｍを２．５倍上回った。２０％未満の変換を示している時間中に初期速度が求められ、アデニン放出がＨＰＬＣにより定量された。競合阻害式：
ｖ＝ｋｃａｔ＊Ｓ／（Ｋｍ＊（１＋Ｉ／Ｋｉ）＋Ｓ）
式中、ｖが初期反応速度、Ｓが基質濃度
を使用し、阻害定数Ｋｉが求められた。該式への代表的な適合が、図１０に、ＢＺ−１０の場合に関して示される。プログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈを使用し、これらの適合が行われた。

阻害：遷移状態における親和性を得ること
小さな基質「Ａ１２」の、脱プリン化部位に先行する部位でのグアノシンに代わるデオキシグアノシン置換（つまり、ＧＡＧＡの代わりのｄＧＡＧＡ）が結果的に、Ｋｃａｔの３倍の減少（１／３）を与えた一方、Ｋｍが約７〜８倍減少した（１／７〜８）。Ｋｃａｔの減少は恐らく、該脱プリン化部位中のアデノシンの直後の先行グアノシン２’−ＯＨと、該グアノシンＮ７との間の水素結合の喪失に由来する（例えば図６において、Ａ１２−５ｄＧに関するＫｍを、Ａ−１４に関するものと比較）。この結果に基づき、我々は、２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）置換を、前記１−アザ糖隣接部位において含有するようにさせた阻害剤を考えた。この構造はＮＢｚ−５ｄＧ−１０であり、図１２に示される。ＢＺ−１０（Ｋｉ〜９９ｎＭ）を凌駕するＮＢｚ−５ｄＧ−１０（Ｋｉ〜２６ｎＭ）の４倍増強された結合は、基質Ａ１２を凌駕するＡ１２−５ｄＧのＫｍの８倍の減少（１／８）に一致する。この阻害剤の増加した親和性は、デオキシグアノシン置換による可能性があり、このＮ−ベンジル−１−アザ糖の、脱プリン化部位における増強された「遷移状態のような」特徴に加え、これは、僅かに変化した、より良く結合したテトラループ・コンホメーションに至る。

ＲＴＡ小分子阻害剤の特徴付け
ピロリジン化合物ＤＡＤＭｅ−Ａ（図１４）が、ＲＴＡ阻害剤としてテストされた。Ｋｉ値が、Ａ−１０を基質として用いた競合アッセイ（図１５）から、８５μＭであると見出された。しかしながら、Ｋｍの＞１０倍の基質濃度では、反応速度において２０％までの活性化が、低い阻害剤濃度では見出された。このことは、２つの結合部位の関わりを示唆する。低濃度では、該阻害剤は恐らく、前向きに協力的にアロステリック部位へと結合する。しかしながら、高濃度では、活性部位へと結合し、競合的に基質を追い出す。

阻害は、ＲＴＡ、ＤＡＤＭｅ−Ａ、および９−デアザアデニンの３成分複合体に関しても測定された。９−デアザアデニンは、活性化効果を廃することができ、該３成分複合体において、ＤＡＤＭｅ−Ａが該活性部位を占める一方、プリンが第２の部位へと結合することを示唆している。この３成分複合体に関するＫｉは、２０μＭであった。

この小分子によるアプローチは、以前に開発された通常のオリゴヌクレオチド様阻害剤構造の代案を提供し、細胞への向上した進入（改良されたエンドサイトーシス）において長所を与えることがある。

実施例２．ＲＴＡの更なる阻害剤
新しい第２世代のアザ糖（図１６）が、ステム・ループＲＮＡ中へと取り込まれて使用され、ＲＴＡを特徴化した。化学合成は結果的に、ヒドロキシルとして存在しているオリゴヌクレオチド５’−および３’−両末端を与える。該ＲＮＡ構造中へと取り込まれた置換基が太字として指し示され、リシン感受性アデニンが類似のステム・ループ構造中にあると思われる場合、その位置を占める。これらアザ糖は、ＲＴＡの加水分解機序において提案されたオキサカルベニウムイオン遷移状態に似ている。個々の速度定数が、表３に与えられる。

阻害速度論
反応速度が、１ｍＭのＥＤＴＡを含有している１０ｍＭのクエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で求められた。合計の反応容積は、１００μＬであった。反応が、濃度２６〜４８ｎＭでのＲＴＡの添加により開始された。該反応バイアルの３７℃での決まった時間のインキュベート後、該反応は、酵素を５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３、１Ｍ溶液１００μＬ）を用いて不活性化することにより止められた。これらサンプルが次いで、逆相 Ｃ１８ Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ 保護および分析カラム（３．９×３００ｍｍ）へと注入され、５％メタノールを含有している５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）中に、流速１ｍＬ／分で定組成溶離させた。酵素タンパクはこれら条件下に、該保護カラムに保持される。ＲＴＡによるＲＮＡ加水分解の規模が、２６０ｎｍにおいてピークをモニターしながら、同一プロトコールで処理された標準との比較に基づき、放出されたアデニンを定量することにより測定された。基質も阻害剤も、これらアッセイ混合物への添加前に、８０℃まで１分間熱せられ、氷冷され、３７℃で１５分間インキュベートされ、回転（ターン・オーバー）の割合の変動を抑制したが、これは、溶液中でのコンホメーションの不均一さ（ヘアピン対他の形態）からもたらされる可能性がある。

初期速度実験では、基質加水分解の程度は１５％未満であった。生成物形成が、このアッセイ期間の初期速度条件を形作ることが示された。阻害解離定数（Ｋｉ）に関する値が、該初期速度を競合阻害式：
ν＝ｋｃａｔＳ／（Ｓ＋Ｋｍ（１＋Ｉ／Ｋｉ））
式中、νが初期反応速度、Ｓが基質濃度、Ｋｍがミカエリス定数（今回のアッセイ条件下では、競合基質Ａ１０に関して２．９μＭ）、Ｉが阻害剤濃度、ｋｃａｔが基質飽和時の触媒回転数（ターン・オーバー）
に適合させることにより、求められた。このアッセイにおいてＡ１０に関して使用された７〜１５μＭの濃度範囲は、そのＫｍを２．５〜５倍上回る値を提示し、競合阻害剤解析には便利な範囲であった。阻害剤濃度は、強い阻害剤の１ケースを除き、酵素濃度＞５倍に保たれ、ここでは酵素濃度および阻害剤濃度は同様であったが、遊離阻害剤濃度が関係式Ｉ＝Ｉ_ｔ−（１−ν_ｉ／ν_０）Ｅ_ｔにより求められた場合、Ｉ_ｔは合計阻害剤濃度であり、ν_ｉおよびν_０は阻害および非阻害定常状態速度であり、Ｅ_ｔは合計酵素濃度である。

上記に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が獲得されることが、理解されるものである。

種々の変更が、本発明範囲を逸脱することなく、上記方法および組成物においてなされ得ると思われるので、上記記載に含まれ添付図面に示される全事項は例示的なものとして解釈され、限定的な意味合いではないと意図される。

この明細書において引用された全文献が、本明細書において援用される。本明細書におけるこれら文献についての議論は、その著者によりなされた主張を単に要約するよう意図され、如何なる文献も、先行技術を構成すると認められるものではない。出願人は、これら引用文献の正確さおよび適切さに挑む権利を留保する。

図１は、リシン毒素Ａの化学反応を与えるものである。 図２は、哺乳類細胞でのリシンの作用機序を示している略図である。 図３は、リシン毒素Ａの化学反応の速度論的機序のグラフである。 図４は、オキサカルベニウムイオンの、量子メカニズムにより最適化された３’−エンドおよび３’−エクソでの確認に関する、ＧＡＧＡテトラループ（灰色）の切断してきたアデノシン残基のＸ線構造の２重の棒状図である。 図５は付番された原子と共にリシン毒素Ａ基質を示し、これが速度論的同位体効果（ＫＩＥ）解析に付された。 図６は、リシン毒素Ａの基質もしくは阻害剤である幾つかの化合物を、それらのＫｍ（基質に関して）もしくはＫｉ（阻害剤に関して）値と共に示す。ＩＡ−１０、Ｅ−１０、Ｄ−１０、およびＩＲ−１０に関するＫｉ値は、示された化合物に関する測定値であり、Ａ−１０のステム・ループ中へと、該ループ中最初のＡ部分の代わりに取り込まれた時のものである（２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４と対応している）。 図７は、Ａ−１４のステム・ループ中へと、該ループ中最初のＡ部分の代わりに取り込まれ、化合物１Ｎ−１４を生み出す阻害剤部分の化学構造を、１Ｎ−１４のＫｉ値と共に示す（２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４と対応している）。 図８は、１Ｎ−１４＋アデニン＋ＲＴＡ３成分複合体の熱力学ボックス領域を示し、該３成分複合体に関するＫｉ値を算出するのに使用された。 図９は、ＢＺ、ＤＡ、およびＰＺの化学構造を示し、これらは本発明の遷移状態阻害剤中のアデノシンに置き換わる。 図１０は、ＢＺ−１０を用いたＲＴＡ阻害のグラフであり、その相互作用に関して算出されたＫｉ値もある。 図１１は、ＲＴＡを用いたＡ１２−５ｄＧの速度論グラフであり、その反応に関するＫｃａｔ（分^−１、／分）およびＫｍ（μＭ）の計算もある。 図１２は、Ｎｂｎ−５ｄＧ−１０の化学構造を示す。 図１３は、Ｎｂｚ−５ｄＧ−１０を用いたＲＴＡ阻害のグラフである。 図１４は、ＤＡＤＭｅ−Ａの化学構造を示す。 図１５は、ＤＡＤＭｅ−Ａを用いたＲＴＡ阻害のグラフである。 図１６は、ＲＴＡ阻害活性に関してテストされた化合物を示す。

Claims (23)

1. リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤であって：
   配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡ
   ［（ｄ）ＧがＧもしくはｄＧであり、Ｘがリシン毒素Ａの遷移状態のアデノシン類似体であり、（ｄ）Ｇ部分の少なくとも１つがｄＧであり、配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡから伸びた如何なる更なるヌクレオチド配列も、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を含む］；
   配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡの互変異性体；
   配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡの医薬的に許容可能な塩；
   配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡのエステル；あるいは
   配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡのプロドラッグ
   を含む、遷移状態阻害剤。
2. Ｘが、図６、７、９、および１４に与えられるとおりの、Ｐ、ＩＡ、Ｅ、Ｄ、ＩＲ、１Ｎ、ＢＺ、ＰＺ、ＤＡ、およびＤＡＤＭｅ−Ａと名付けられた化学構造、これらの互変異性体、これらの医薬的に許容可能な塩、これらのエステル、あるいはこれらのプロドラッグからなる群から選択される、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
3. 前記阻害剤の配列（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡが、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列を持っているステム・ループ構造の一部である、請求項１に記載の遷移状態阻害剤。
4. 配列Ｃ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧを含む、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
5. 配列ＣＧＣ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧＣＧを含む、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
6. 配列ＣＧＣＧＣ（ｄ）ＧＸ（ｄ）ＧＡＧＣＧＣＧを含む、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
7. ＣＧＣｄＧＸＧＡＧＣＧ、ＣＧＣＧＸｄＧＡＧＣＧ、およびＣＧＣｄＧＸｄＧＡＧＣＧからなる群から選択される配列を含む、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
8. Ｘが、ＢＺ、ＰＺ、もしくはＤＡである、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
9. Ｘが、ＢＺである、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
10. 図１６のＢＺ−５ｄＧ−１０からなる、請求項３に記載の遷移状態阻害剤。
11. リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤であって：
    アデノシン類似体（Ｘ）ならびに
    配列ＣＧＣＧＸＧＡＧＣＧを持っている少なくとも９リボヌクレオチドのステム・ループ構造
    ［該遷移状態阻害剤は、ラット２８ＳｒＲＮＡのＡ４３２４に隣接しているステム・ループ構造配列も持ち、Ｘが、図９および１４に与えられるとおりの、ＢＺ、ＰＺ、ＤＡ、およびＤＡＤＭｅ−Ａからなる群から選択される］；
    該ステム・ループ構造の互変異性体；
    該ステム・ループ構造の医薬的に許容可能な塩；
    該ステム・ループ構造のエステル；あるいは
    該ステム・ループ構造のプロドラッグ
    を含む、遷移状態阻害剤。
12. リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤であって：
    更なるリボヌクレオチドがなく、ポリヒドロキシピロリジンまたはそのモノもしくはジホスフェート；
    これらの互変異性体；
    これらの医薬的に許容可能な塩；
    これらのエステル；あるいは
    これらのプロドラッグ
    を含む、遷移状態阻害剤。
13. 図１４に与えられるとおりのＤＡＤＭｅ−Ａ；
    ［ここで、ＤＡＤＭｅ−Ａが任意に、３’ホスフェート、５’ホスフェート、もしくは３’ホスフェートと５’ホスフェートとの両者を含む］
    ＤＡＤＭｅ−Ａの互変異性体；
    ＤＡＤＭｅ−Ａの医薬的に許容可能な塩；
    ＤＡＤＭｅ−Ａのエステル；あるいは
    ＤＡＤＭｅ−Ａのプロドラッグ
    を含む、請求項１２に記載のピロリジン遷移状態阻害剤。
14. リシン毒素Ａの遷移状態阻害剤であって、式（Ｉ）：
    

    

    の化合物
    ［式中：
    Ａｄは、アデニン−９−イルであり；
    Ｇｕは、グアニン−９−イルであり；
    Ｒ^１は、１〜１０の３’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、シチジンおよびグアノシンヌクレオチド単位に代わるものであり；
    Ｒ^２は、１〜１０の５’−結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、グアノシンもしくはシチジンヌクレオチド単位に代わるものであり；
    ＶはＣＨ_２およびＮＨから選択され、ＷはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され；または、ＶはＮＲ^１およびＮＲ^２から選択され、ＷはＣＨ_２およびＮＨから選択され；
    ＸはＣＨ_２およびＣＨＯＨ（ＲもしくはＳ配置）から選択されるが、Ｗが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時ＸはＣＨ_２であり；
    Ｙは、水素、ハロゲン、およびヒドロキシから選択され、Ｖが、ＮＨ、ＮＲ^１、およびＮＲ^２から選択される場合を除き、その時Ｙは水素であり；
    Ｚ^１およびＺ^２は独立に、水素およびヒドロキシルから選択され；ならびに
    Ｒ^１は式（ＩＩ）：
    

    

    の基であり、Ｒ^２は式（ＩＩＩ）：
    

    

    の基であり、式中：
    Ａは、Ｎ、ＣＨ、およびＣＲから選択され、ここでＲが、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、アラルキルもしくはアリール、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、およびＳＲ^５から選択され；ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が各々、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
    Ｂは、ＮＨ_２、ＮＨＲ^６から選択され、ここでＲ^６が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
    Ｄは、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^７、水素、ハロゲン、およびＳＣＨ_３から選択され、ここでＲ^７が、任意に置換されたアルキル、アラルキル、もしくはアリール基であり；
    Ｅは、ＮおよびＣＨから選択され；
    Ｇは、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、およびＮＨから選択されるかまたは存在せず、但し、ＷがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、ＶがＣＨ_２であり、但し、ＶがＮＲ^１もしくはＮＲ^２でありＧがＮＨである場合、ＷがＣＨ_２である］；
    該化合物の互変異性体；
    該化合物の医薬的に許容可能な塩；
    該化合物のエステル；あるいは
    該化合物のプロドラッグ
    からなる、遷移状態阻害剤。
15. 医薬的に許容可能な賦形剤中の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、遷移状態阻害剤、その互変異性体、その医薬的に許容可能な塩、そのエステル、またはそのプロドラッグ。
16. リシン毒素Ａを阻害する方法であって、リシン毒素Ａを、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、遷移状態阻害剤、その互変異性体、その医薬的に許容可能な塩、そのエステル、またはそのプロドラッグと組み合わせることを含む方法。
17. リシン毒素Ａが、生存哺乳類細胞中にある、請求項１６に記載の方法。
18. 前記生存哺乳類細胞が、生存哺乳類中にある、請求項１７に記載の方法。
19. 前記生存哺乳類がヒトである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記生存哺乳類が、リシン毒素Ａ抗体免疫毒を用いる処置を受ける、請求項１８に記載の方法。
21. 前記生存哺乳類が、リシン毒素Ａにより中毒されている、請求項１８に記載の方法。
22. 哺乳類を、リシン毒素Ａ抗体免疫毒を用いて処置する方法であって、哺乳類を、リシン毒素Ａ抗体免疫毒、ならびに、請求項１５に記載の遷移状態阻害剤、その互変異性体、その医薬的に許容可能な塩、そのエステル、もしくはそのプロドラッグを用いて処置することを含む方法。
23. 前記哺乳類が、癌に関して前記免疫毒を用いて処置を受けているヒトである、請求項２２に記載の方法。
    

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