CN101463087B

CN101463087B - 一种抗蓖麻毒蛋白的抗体

Info

Publication number: CN101463087B
Application number: CN2009100761891A
Authority: CN
Inventors: 周丽君; 王欲晓; 乔媛媛; 王玉霞; 王琰; 贾蓓媛
Original assignee: General Hospital of PLA Navy
Current assignee: General Hospital of PLA Navy
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2029-01-13
Also published as: CN101463087A

Abstract

本发明公开了一种抗蓖麻毒蛋白的抗体。本发明所提供的抗蓖麻毒蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第134-259位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-112位氨基酸残基。本发明以固相化的蓖麻毒素为抗原，运用构建的大容量噬菌体抗体库，成功地筛选到人源抗蓖麻毒素抗体，经ELISA鉴定，本发明的抗蓖麻毒蛋白的抗体具有很好的特异性，与蓖麻毒蛋白的结合活性490nm(吸光度值)达1.20±0.02。

Description

一种抗蓖麻毒蛋白的抗体

技术领域

本发明涉及一种抗蓖麻毒蛋白的抗体。

背景技术

蓖麻毒素(ricin toxin)是一种剧毒物质，能够使真核细胞的核糖体失活，对细胞的毒性很强，还能使肝、肾细胞受损，对红细胞有凝集和溶解作用，并对呼吸中枢和血管中枢有麻痹作用(曾佑炜，宋光泉，彭永宏，等.蓖麻毒蛋白研究及应用进展亚热带植物科学，2004，33(1)：60.)。蓖麻毒中毒后可采用特异性抗体中和，使中毒的情况缓解，因而抗蓖麻毒的抗体在临床上具有广泛的应用前景；近几年来，有人发现蓖麻毒素在肿瘤等疾病上的导向治疗作用，但由于处于尝试阶段，治疗量与中毒量较难掌握，发生中毒后的治疗就非常有必要。另外蓖麻毒是从蓖麻种籽中提取，制作成本低、材料来源广、毒性强烈，已多次在恐怖事件中使用，制备抗蓖麻毒蛋白的抗体具有一定潜在的军事价值。

传统的杂交瘤技术获取抗体的方法复杂，并且获得的抗体是鼠源性的，大大限制了其作为治疗性抗体的应用。噬菌体抗体库技术是全套抗体基因展示在噬菌体表面，并能在体外模拟抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选。经过几轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛，可使特异性噬菌体抗体得到富集。利用噬菌体抗体库技术借助高效筛选系统，可以不经免疫方便地制备出人源抗体(王琰，化冰，刘群英，等.半合成抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19(3)：23.)。过去制备大容量抗体库是利用电转化法积累转化次数来增大库容，由于大肠杆菌的转化率有限以及PCR扩增的重复克隆和无效克隆，依靠积累转化次数来增大库容工作量非常大，多样性有限，因而难以广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗蓖麻毒蛋白的抗体。

本发明所提供的抗蓖麻毒蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第134-259位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-112位氨基酸残基。

上述抗体具体可为单链抗体。

上述抗体的重链可变区和轻链可变区之间还可以有连接肽，所述连接肽的长度具体可为21个氨基酸残基。

上述抗蓖麻毒蛋白的抗体为如下1)或2)所示的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗蓖麻毒蛋白功能的由1)衍生的蛋白质。

上述抗蓖麻毒蛋白抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述抗蓖麻毒蛋白抗体的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码上述任一抗体的DNA分子；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性且编码上述任一抗体的DNA分子。

含有上述抗蓖麻毒蛋白抗体编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的抗蓖麻毒蛋白的抗体可以用于制备治疗抗蓖麻毒蛋白的药物。

本发明的另一个目的是提供一种治疗抗蓖麻毒蛋白的药物。

本发明所提供的治疗抗蓖麻毒蛋白的药物，它的活性成分是上述任一所述抗蓖麻毒蛋白的抗体。

本发明采用单噬粒载体通过loxp-cre定位重组构建工作库，将轻重链基因构建在同一载体PDF上，重链可变区基因两端插入loxp和loxp511序列，构建成的噬菌体抗体库以超量的噬菌体颗粒感染BS1365菌，同一个细菌内载体之间轻重链互换，再以少量噬菌体颗粒低感染XL-blue菌，制备成大容量的噬菌体抗体工作库。所建立的初级库库容为10⁷，轻重链随机配对后可产生的理论多样性为10¹⁴，重组后得到的抗体库一般库容为10¹⁰～10¹¹(1000ml菌液)，因此再次重组后构建的库可具有不同的多样性，为抗体筛选提供了更大的回旋余地。以固相化的蓖麻毒素为抗原，运用上述构建的大容量噬菌体抗体库，成功地筛选到人源抗蓖麻毒素抗体，经ELISA鉴定，本发明的抗蓖麻毒蛋白的抗体具有很好的特异性，与蓖麻毒蛋白的结合活性490nm(吸光度值)达1.20±0.02。

小分子ScFv是由VH和VL中间加一段Linker构成(Weight A，Shin SU，MorrisonSI.Genetically engineered antibodies：progress and prospect.Crit Rev Immunol，1992，12：125.)，它因分子量小而具有免疫原性低、穿透力强等优点，利于作为“导向载体”应用于人体。在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与GIII基因之间引入了一个琥珀终止密码子，在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，抗体基因和GIII成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白呈现在噬菌体表面，而在不带有琥珀抑制基因的宿主菌HB2151中，由于终止密码子的存在，抗体分子不与GIII融合表达，在信号肽介导下分泌到质周腔中进行折叠，便产生了可溶性的抗体片段(Bayly AM，Kortt A A，Hudson P J，et al.Large-scale bacterial fermentation and isolationof ScFv multimers using a heat-inducible bacterial expression vector[J].J ImmunolMethods，2002，262：217-227.)。将融合的噬菌体抗体转染大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导，分泌有功能的可溶性抗体，排除了噬菌体蛋白的干扰，获得可以和蓖麻蛋白结合的抗体。

附图说明

图1为阳性克隆可变区基因的指纹图谱

具体实施方式

实施例1、抗蓖麻毒蛋白的抗体的获得

一、工作库(大容量噬菌体抗体库)的制备

具体制备方法参见如下文献：Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombinationin single bacteria to make large phage antibody libraries.Nat Biotechnol，2000；18：74.

从原始噬菌体抗体库(乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(3)，194-197.中国人民解放军海军总医院)中取出7×10¹²cfu的噬菌体颗粒以100∶1的感染复数(multiplicityof infection，MOI＝100/1)超感染BS1365细胞(王琰，王欲晓，陈晓穗，化冰，刘晓林，用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定，中国免疫学杂志，2003，19(2)，93-96.中国人民解放军海军总医院)，37℃水浴保温1小时，使多副本载体进入同一个细胞，通过cre-loxp介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻、重链随机交换配对。加入2YT培养基(含有1.6％质量百分含量的蛋白胨、1％质量百分含量的酵母提取物和0.5％质量百分含量的氯化钠)至400ml，补足Amp，使其在培养基中的终浓度为100μg/ml，振荡培养至OD₄₉₀＝0.5。再在培养基中加入5ml辅助病毒VCSM13(pfu 1.7×10¹²)(Merck ST200251)，30℃培养过夜，次日收集噬菌体抗体库，测定滴度。所获噬菌体上清再以MOI≤1的比例感染1000ml对数生长期的XL1-Blue菌(Stratagen，货号：200228)，37℃静置30min；取少许菌铺含Amp的培养盘计算库容，补足Amp至100μg/ml，再加入10ml VCSM13，30℃培养过夜，次日回收上清，PEG8000(购自Promege公司)进行沉淀，获得工作库。计算工作库的库容和抗体库滴度，结果表明，获得库容为7×10¹⁰的大容量人源噬菌体抗体库，所获抗体库的滴度为1×10¹³cfu/ml。

二、抗蓖麻毒蛋白噬菌体抗体的筛选、制备及ELISA检测

具体的筛选方法参见如下文献：乔媛媛，王琰，陈晓穗，等.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，2004；24(3)：194.王琰，刘群英，化，冰，等.从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆.中国免疫学杂志，1998，14(1)：115.

将蓖麻毒蛋白(贺永怀，刘演波，陈兴，一种快速简便的提取和纯化蓖麻毒素的方法，生物化学和生物物理进展，1987，6：64-66.中国人民解放军海军总医院)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(每升碳酸盐缓冲液中含有0.05M碳酸钠300ml，0.05M碳酸氢钠700ml)稀释至50μg/ml，以1ml包被免疫管(购自丹麦NUNC公司)，4℃过夜，次日以含2.5％质量百分含量脱脂奶粉的封闭液加满免疫管，37℃封闭2小时，倒去封闭液，加入1ml上述步骤一构建的噬菌体抗体库(抗体库滴度为1×10¹³cfu/ml)，37℃孵育2小时，吸去噬菌体抗体液，以含0.05％质量百分含量吐温20的PBS溶液洗涤5次(第二轮洗15次，以后各轮洗涤20次以上)，然后用蒸馏水洗涤一次。回收结合于固相的噬菌体抗体，先加入1ml新鲜XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15min后，加入10ml含20μg/ml Amp的SB培养基(每升SB培养基中含有胰蛋白胨30克、酵母粉20克、3-(N-吗啉代)丙磺酸10克，其余为水)；再将细菌感染回收后的免疫管用PBS及蒸馏水各洗涤2次，加入1ml洗脱液(含0.1mlHCl，以甘氨酸调至pH至2.2，再加入BSA使其在洗脱液中的质量百分含量为0.1％)37℃静置15min后再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后，加入45μl 2mol/L Tris中和，再加入10ml XL1-Blue细胞37℃静置15min后，加入10ml含100μg/ml Amp的SB培养基。从两次回收的菌液中分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37℃培养3小时，扩大体积到100ml，加入1.7×10¹²pfu的辅助病毒VCSM13，30℃振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体库的投入产出比(即回收率)，作为特异性噬菌体抗体富集的指标，噬菌体抗体库投入产出比的结果如表2所示。次日回收上清，PEG8000(购自Promege公司)进行沉淀，所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选。

表2噬菌体抗体库的投入产出比

经过5轮的筛选，测定每轮洗脱回收的噬菌体滴度，发现有一定的富集。从第三、第四和第五轮筛选得到的菌落中随机挑取250个克隆，接种在含有100μg/mlAmp的2YT培养液中培养过夜，第二天分别取30μl菌液到1ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，收取上清即得到噬菌体抗体。

将上述制备的噬菌体抗体进行ELISA检测，同时以卵清蛋白(OA)和铁蛋白(Fer)(均购自Sigma公司)作为对照。将蓖麻毒蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(每升碳酸盐缓冲液中含有0.05M碳酸钠300ml，0.05M碳酸氢钠700ml)稀释至10μg/ml，以50μl包被ELISA板，1小时后弃去孔内液体，用含2.5％质量百分含量脱脂奶粉的PBS封闭后分别加入上述制备的噬菌体抗体，37℃孵育1小时，用含0.05％质量百分含量Tween20的PBS溶液洗涤3次，加入HRP标记的抗M13鼠单抗(Pharmacia，27-9420-01)进行反应，洗涤后加入OPD底物显色，读取A490。

实验设三次重复，结果表明，所制备的噬菌体抗体中，有88个能与蓖麻毒蛋白结合，阳性率为35％，其中特异性结合的克隆为40个。选取其中6个结合活性高的克隆的噬菌体抗体进行ELISA检测，结果如表3所示。

表3噬菌体抗体与不同抗原反应的ELISA检测

表3中，Ricin表示蓖麻毒素蛋白，OA表示卵清蛋白，Fer表示铁蛋白，1-6分别为6个结合活性高的克隆的噬菌体抗体。

三、可溶性抗蓖麻毒蛋白抗体的表达与ELISA鉴定

将上述步骤二ELISA鉴定出的40个特异性阳性的蓖麻毒蛋白噬菌体抗体10⁸倍稀释后感染大肠杆菌HB2151(王琰，刘群英，化冰，陈宇萍，朱迎春，陈晓穗，从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体，免疫学杂志，1999，15(4)：87-89.中国人民解放军海军总医院)，37℃孵育15分钟后铺培养盘。挑取单个集落接种于含有100μg/ml Amp的2YT培养液中培养过夜，第二天取30μl菌液接种到1ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入IPTG(购自Promege公司)使其在培养基中的终浓度为1mmol/L，30℃培养过夜，收取上清即得到可溶性抗体。

非抑制表型菌HB2151中，ScFv以游离可溶的形式存在，在GIII信号肽介导下分泌表达。将上述获得的可溶性抗体进行ELISA检测，同时以卵清蛋白(OA)和铁蛋白(Fer)(均购自Sigma公司)作为对照。将蓖麻毒蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(每升碳酸盐缓冲液中含有0.05M碳酸钠300ml，0.05M碳酸氢钠700ml)稀释至10μg/ml，以50μl包被ELISA板，1小时后弃去孔内液体，用含2.5％质量百分含量脱脂奶粉的PBS封闭后分别加入上述获得的可溶性抗体，37℃孵育1小时，用含0.05％质量百分含量Tween20的PBS溶液洗涤3次，加入HRP标记的抗V5抗体(Invitrogen，R961-25)，37℃孵育1小时后加入OPD底物显色，读取A490。

实验设三次重复，结果表明，有14个克隆ELISA检测有活性，其中特异性结合的克隆为12个。挑选其中6个结合活性高的克隆的可溶性抗体及进行ELISA检测，结果如表4所示。

表4可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测

表4中，Ricin表示蓖麻毒素蛋白，OA表示卵清蛋白，Fer表示铁蛋白，1-6分别为6个结合活性高的克隆的可溶性抗体。

上述实验结果中，可溶性表达后的活性与噬菌体表达不完全一致，可能是诱导条件发生了变化，或表面表达的抗体片段受周围膜环境的影响，立体结构有所不同导致结合活性发生了改变。此外用ELISA检测噬菌体抗体，也可导致ELISA结果有所不同。

四、抗体可变区基因的多样性分析(DNA指纹)

提取上述步骤三筛选到的特异性结合克隆的质粒，并以其为模板，以P1：5’-CGGCAGCCGCTGGATTGTTA-3’为上游引物，以P2：5’-CTAAACAACTTTCAACAGT-3’为下游引物，PCR扩增ScFv基因；PCR扩增产物用CL-6B凝胶(购自Phamacia公司)微型柱离心纯化，再用限制性内切酶MvaI(购自TAKARA公司)37℃消化过夜，取10μl酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后根据DNA指纹图谱分析其多样性。阳性克隆可变区基因的指纹图谱如图1所示。其中，泳道M为DNA分子量标准，泳道1-7分别为7种不同的指纹图谱。

挑出上述7个指纹图谱不同的克隆测定其可变区基因的序列，结果表明，其中5株抗体的编码基因(图1中泳道1、4、5、6和7)来源于不同的胚系，重链可变区基因均来自VH3亚群，轻链可变区分属于Vλ I亚群、VK I亚群及VK II亚群。而另外2株抗体的编码基因(图1中泳道2和3)尽管指纹图谱不同，但DNA序列分析却发现其重链可变区基因相同，轻链可变区基因序列的同源性达97.6％，其不同分别在轻链的FR1区(3个氨基酸)，CDR1区(1个氨基酸)，CDR2区(2个氨基酸)和Linker区(1个氨基酸)。

上述ELISA检测结合活性最高的抗蓖麻毒蛋白的抗体(图1中泳道4)的氨基酸序列如序列1所示，其中自氨基末端第134-259位为重链可变区，自氨基末端第1-112位为轻链可变区。

序列表

<110>中国人民解放军海军总医院

<120>一种抗蓖麻毒蛋白的抗体

<130>CGGNARZ92022

<160>2

<210>1

<211>259

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Phe Asp Val Thr Thr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Leu

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Gly

85 90 95

Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Leu

115 120 125

Ser Ser Ser Gly Thr Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val

130 135 140

Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn

180 185 190

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser

195 200 205

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Met Val Arg Gly Val Trp

225 230 235 240

Ala Glu Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser

<210>2

<211>777

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cagtctgtgc tgacgcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tttgatgtca ctactcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgcc tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggttgagg acgaggctga ttattattgc agctcatata gtagtggcag cactcttgtg 300

gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggttccg gagggtcgac cataacttcg 360

tatgatgtat actatacgaa gttatcctcg agcggtaccc aggtgcagct gttggagtct 420

ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggaggc 480

accttcagca gctatgctat cagctgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg 540

atgggaggga tcatccctat ctttggtaca gcaaactacg cacagaagtt ccagggcaga 600

gtcacgatta ccgcggacga atccacgagc acagcctaca tggagctgag cagcctgaga 660

tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg agaggaggcc ctatggttcg gggagtttgg 720

gcagagatgg gtgcttttga tatctggggc ccagggacaa tggtcactgt ctcttca 777

Claims

1.一种抗蓖麻毒蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第134-259位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-112位氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体为单链抗体。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：所述抗体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.权利要求1-3中任一所述抗体的编码基因。

5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2。

6.含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体或表达盒。

7.含有权利要求4或5所述基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求4或5所述基因的重组菌。