JP2007523595A - Ｎｐｃ１ｌ１（ｎｐｃ３）およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト、ラットおよびマウスのＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストおよびアンタゴニストを検出するための方法もまた提供される。ＮＰＣ１Ｌ１のインヒビターは、被験体において腸コレステロール吸収を阻害するために使用され得る。１つの実施形態において、内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性変異を含む、変異トランスジェニックマウスであって、マウスが、いかなる機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質も産生しない、マウスが提供される。

Description

本願は、２００３年９月１６日に出願した米国特許出願番号１０／６６３，２０８の一部継続であり；その出願は、２００３年８月２２日に出願した米国特許出願番号１０／６４６，３０１の一部継続であり；その出願は、２００３年７月１７日に出願した米国特許出願番号１０／６２１，７５８の一部継続であり；その出願は、２００２年７月１９日に出願した米国仮特許出願番号６０／３９７，４４２の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
（発明の分野）
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それらの使用方法とともに包含する。
（発明の背景）
先進国における主要死亡原因である脈管疾患の発症をもたらす要因は、血清コレステロールの増加である。２０歳〜７４歳のアメリカ人のうちの１９％が、高い血清コレステロールを有すると推定される。脈管疾患の最も有力な形態は、動脈硬化症であり、これは、動脈壁の肥厚および硬化に関連する状態である。大きな脈管の動脈硬化症は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれる。アテローム性動脈硬化症は、脈管障害（例えば、冠状動脈疾患、大動脈瘤、下肢の動脈疾患、および脳血管疾患）における優勢な原因因子である。
コレステリルエステルは、アテローム性動脈硬化症病変の主要成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。コレステリルエステルの形成はまた、食餌コレステロールの腸吸収における一段階である。従って、コレステリルエステル形成の阻害および血清コレステロールの減少は、アテローム性動脈硬化症病変形成の進行を阻害し得、動脈壁におけるコレステリルエステルの蓄積を減少し得、そして食餌コレステロールの腸吸収をブロックし得る。
哺乳動物および動物における身体全体のコレステロールホメオスタシスの調節は、腸のコレステロール吸収の調節、細胞コレステロール輸送、食餌コレステロールおよびコレステロール生合成の調節、胆汁酸生合成、ステロイド生合成、およびコレステロール含有血漿リポタンパク質の異化を包含する。腸のコレステロール吸収の調節は、血清コレステロールレベルを調節するための有効な手段であることが証明されている。例えば、コレステロール吸収インヒビターであるエゼチミブ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）
Figure 2007523595
 は、この点に関して有効であることが示されている。エゼチミブを含有する薬学的組成物は、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商品名Ｚｅｔｉａ（登録商標）として、商業的に入手可能である。エゼチミブが作用する遺伝子標的の同定は、コレステロール吸収プロセスを理解するため、および他の新規な吸収インヒビターの開発のために、重要である。本発明は、このエゼチミブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても公知である；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２；Ｄａｖｉｅｓら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（２）：１３７〜４５およびＩｏａｎｎｏｕ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１（１〜２）：１７５〜８１）のラットホモログおよびマウスホモログを提供することによって、この必要性に取り組む。
ＮＰＣ１Ｌ１は、ＹＱＲＬ（配列番号３８）モチーフ（すなわち、形質膜輸送シグナルへのトランスゴルジネットワークである；Ｂｏｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２２１９−２２２８；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：１１２３−１１３５；Ｐｏｎｎａｍｂａｌａｍら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：２５３−２６８およびＲｏｔｈｍａｎら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２２７−２３４を参照のこと）を含むＮグリコシル化タンパク質であり、これは、限定的な組織分布および胃腸量を示す。また、ヒトＮＰＣ１Ｌ１プロモーターは、ステロール調節エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ１）結合コンセンサス配列を含む （Ａｔｈａｎｉｋａｒら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９３５−４９４０；Ｅｒｉｃｓｓｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９４５−９５０；Ｍｅｔｈｅｒａｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５６３４−１５６４１；Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２３０６−２３１０；Ｂｅｎｎｅｔｔら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３０２５−１３０３２、およびＢｒｏｗｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９：３３１−３４０）。ＮＰＣ１Ｌ１は、ヒトＮＰＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００２０２０）に対して４２％のアミノ酸配列相同性を有し、このＮＰＣ１は、ニーマン−ピックＣ１疾患の原因となるレセプターである（Ｃａｒｓｔｅａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：２２８−２３１）。ニーマン−ピックＣ１疾患は、リソソーム中での低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）由来非エステル化コレステロールの蓄積を生じる、ヒトにおいて稀な遺伝性疾患である（Ｐｅｎｔｃｈｅｖら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２２５：２３５−２４３およびＶａｎｉｅｒら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９６：３２８−３３７）。さらに、ｎｐｃ１−細胞のトランスゴルジネットワークにおけるコレステロール蓄積、および形質膜へのコレステロールの再配置および形質膜からのコレステロールの再配置が、遅れる。ＮＰＣ１およびＮＰＣ１Ｌ１は、各々、１３回膜貫通セグメントおよびステロール検知ドメイン（ＳＳＤ）を保有する。いくつかの他のタンパク質（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｒ）、パッチド（Ｐａｔｃｈｅｄ）（ＰＴＣ）およびステロール調節エレメント結合タンパク質切断−活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）を含む）は、おそらく直接的コレステロール結合を含む機構によるコレステロールレベルの検知に関与するＳＳＤを含む（Ｇｉｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：２４９−２５８；Ｋｕｍａｇａｉら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９１０７−１９１１３およびＨｕａら、（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：４１５−４２６）。
（発明の要旨）
本発明は、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列の４２個以上連続するアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを包含し、好ましくは、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号２、配列番号４または配列番号１２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５〜配列番号１０、配列番号１１および配列番号１３から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターもまた、そのベクターを含む宿主細胞とともに提供される。
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１もしくはヒトＮＰＣ１Ｌ１）に特異的に結合するか、またはＮＰＣ１Ｌ１に対して産生された単離された抗体、あるいはその任意の抗原性フラグメント（好ましくは、ラットＮＰＣ１Ｌ１、より好ましくは、配列番号３９〜配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）に特異的に結合するか、または抗原性フラグメントに対して産生された単離された抗体を提供する。好ましくは、この抗体は、単離されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、この抗体は、ウサギから得られる。
本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを生成するための方法を包含し、この方法は、本発明の宿主細胞を、その細胞中にあるＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードすする核酸が発現される条件下で培養する工程、を包含する。好ましくは、この方法は、上記ポリペプチドを、上記培養物から単離する工程を包含する。
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストもしくはアンタゴニストを同定するための方法を包含し、この方法は、
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、またはＣａｃｏ２細胞）を、既知量の検出可能に（例えば、３Ｈ、１４Ｃまたは１２５Ｉで）標識された置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）の存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触させる工程；ならびに
（ｂ）そのポリペプチドに特異的に結合した検出可能に標識された置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）の量を測定する工程；
を包含し、このサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの非存在下で測定される結合と比較して、そのポリペプチドに対する検出可能に標識された置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）の実質的に減少した結合を測定することによって同定される。
ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための別の方法もまた、提供される。この方法は、
（ａ）水性懸濁物中に、蛍光剤（例えば、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウム、ジフェニルオキサゾール、およびポリビニルトルエン）を浸漬させた複数の支持体粒子を配置する工程であって、その粒子に、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、またはＣａｃｏ２細胞）が結合している、工程；
（ｂ）その懸濁物に、（例えば、３Ｈ、１４Ｃまたは１２５Ｉによる）放射標識置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）と、アンタゴニストまたはアゴニストの存在について試験されるべきサンプルとを添加する工程であって、その放射標識は、その置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）がそのポリペプチドに結合した際にその蛍光剤を活性化して光エネルギーを生成可能な放射線エネルギーを発し、一方、そのポリペプチドに結合しない放射標識置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）は、概して、その放射エネルギーがその蛍光剤を活性化するのを可能にするにはその支持体粒子から離れすぎている、工程；ならびに
（ｃ）その懸濁物においてその蛍光剤により発せられた光エネルギーを測定する工程；
を包含し、
そのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの非存在下で測定される光エネルギー放出と比較して、実質的に減少した光エネルギー放出を測定することによって同定される。
ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法もまた、提供され、この方法は、
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、またはＣａｃｏ２細胞）を、（例えば、３Ｈ、１４Ｃまたは１２５Ｉで）検出可能に標識されたステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールと、およびアンタゴニストまたはアゴニストの存在について試験されるべきサンプルと、接触させる工程；ならびに
（ｂ）その細胞における検出可能に標識されたステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの量を測定する工程；
を包含し、
そのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される場合と比較して、その宿主細胞中の実質的に減少した検出可能に標識されたステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを測定することによって同定され、そしてそのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストは、そのようなアゴニストの非存在下で測定される場合と比較して、その宿主細胞中の実質的に増加した検出可能に標識されたステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを測定することによって同定される。
本発明は、本明細書中で記載されたスクリーニング方法によって同定された物質を被験体に投与する工程によって、被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性腸ステロール（例えば、コレステロール）摂取または５α−スタノール摂取を阻害するための方法を包含する。そのような物質としては、化合物（例えば、エゼチミブ以外のＮＰＣ１Ｌ１の低分子アンタゴニスト）が挙げられる。抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を投与する工程によって、ＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収をアンタゴナイズするための方法もまた企図される。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１媒介性吸収もまた、生物におけるＮＰＣ１Ｌ１の発現を減少させる任意の方法によって、アンタゴナイズされ得る。例えば、ＮＰＣ１Ｌ１発現は、生物の細胞中へのアンチセンスＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの導入によって、または生物体におけるＮＰＣ１Ｌ１遺伝子の遺伝子変異によって（例えば、完全なノックアウト、破壊、短縮によって、または１つ以上の点変異の導入によって）減少され得る。
変異トランスジェニック哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ブタ、モルモット、ネコ、ウマ）、好ましくは、内因性の染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性変異またはヘテロ接合性変異（例えば、破壊、短縮、１つ以上の点変異、ノックアウト）を含むマウスもまた、本発明に包含され、ここで、好ましくは、マウスは、任意の機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を生成しない。好ましくは、機能性ＮＰＣ１Ｌ１を欠く変異マウスは、機能性ＮＰＣ１Ｌ１を含む非変異マウスと比べて、減少したレベルの腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収もしくは５α−スタノール吸収および／または減少したレベルの血清ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールおよび／または減少したレベルの肝ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールを示す。好ましくは、変異マウスの染色体において、欠失されたＮＰＣ１Ｌ１の領域（配列番号４５）は、ヌクレオチド７９０〜ヌクレオチド９９８である。１つの実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号１１）は、ヌクレオチド７６７〜ヌクレオチド９７５を欠失される。遺伝したｎｐｃ１ｌ１変異対立遺伝子を有する本発明の親ＮＰＣ１Ｌ１変異マウス（すなわち、ｎｐｃ１ｌ１）のいかなる子または子孫もまた、本発明の一部である。
本発明の範囲はまた、腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収のアンタゴニストについてサンプルをスクリーニングするための方法も包含し、この方法は、
（ａ）ステロール（例えば、コレステロール）含有物質または５α−スタノール含有物質（例えば、放射標識したコレステロール（例えば、１４Ｃ−コレステロールまたは３Ｈ−コレステロール）を含む）を、機能性ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を含む第１および第２のマウス、ならびに機能性ＮＰＣ１Ｌ１を欠く第３の変異マウスに供給する工程；
（ｂ）そのサンプルを、機能性ＮＰＣ１Ｌ１を含む第１のマウスに投与するが、第２のマウスに投与しない工程；
（ｃ）上記第１、第２および第３のマウスの腸におけるステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収の量を測定する（例えば、血清コレステロールを測定することによる）工程；ならびに
（ｄ）各マウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収のレベルを比較する工程；
を包含し、ここで、そのサンプルは、第１のマウスおよび第３のマウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収のレベルが、第２のマウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収の量に満たない場合、腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収アンタゴニストまたは５α−スタノール吸収アンタゴニストを含むことが決定される。
本発明はまた、キットを包含し、そのキットは、
（ａ）薬学的な投薬形態（例えば、１０ｍｇの置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）を含む丸剤または錠剤）における置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）；および
（ｂ）例えば、挿入物の形態において、ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの標的であることを示す情報、
を包含する。そのキットはまた、薬学的な投薬形態（例えば、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇまたは８０ｍｇのシンバスタチンを含む丸剤または錠剤）においてシンバスタチンを包含し得る。薬学的な投薬形態におけるシンバスタチンおよび薬学的な投薬形態におけるエゼチミブは、単一の丸剤または錠剤あるいは別々の丸剤または錠剤において関連付けられ得る。
本発明はまた、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードするか、または生成し得る遺伝子を欠く任意の単離された哺乳動物細胞（例えば、単離されたマウス細胞、単離されたラット細胞または単離されたヒト細胞）を提供する。変異マウスから単離され得る単離された細胞は、内因性の染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性変異を含み、ここで、そのマウスは、任意の機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を生成しない。さらに、変異は、遺伝子中であり得、それは、変異されていない場合、配列番号１２（例えば、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む）のアミノ酸配列をコードする。その細胞は、十二指腸、胆嚢、肝臓、小腸または胃の組織から単離または誘導され得る。その細胞は腸細胞であり得る。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ラット、ヒトおよびマウス由来のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを、個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに包含する。好ましくは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトＮＰＣ１Ｌ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、マウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。配列番号１または配列番号１０のラットＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。配列番号３のヒトＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドは、ヒトＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。配列番号１１または配列番号１３のマウスＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドは、マウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。
本発明は、以下の表１において言及されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む、任意の単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリペプチドを包含する。
Figure 2007523595
 ヒトＮＰＣ１Ｌ１はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２の下で開示される。下記に考察されるように、配列番号１に示されるラットＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列は、ラット空腸細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の発現配列タグ（ＥＳＴ）から得られた。配列番号５〜７は、３つの独立したｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列を含む。配列番号５の下流配列ＥＳＴ（６０３６６２０８０Ｆ１）が、決定され；これらの実験からの配列決定データは、配列番号８に示される。上流配列もまた、決定され；これらのデータは、配列番号９に示される。
配列番号４３および４４は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２の下で開示されるヒトＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である（Ｄａｖｉｅｓら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（２）：１３７−４５を参照のこと）。
配列番号４５は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＫ０７８９４７の下で開示されるマウスＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列である。
ＮＰＣ１Ｌ１は、腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収を媒介する。患者におけるＮＰＣ１Ｌ１の阻害は、患者における腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収および血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを減少させるための有用な方法である。患者における腸ステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収および血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのレベルを減少させることは、アテローム性動脈硬化、特に食餌誘発のアテローム性動脈硬化の発生を処置または予防するために有用な方法である。
本明細書中で使用される場合、用語「ステロール」としては、コレステロールおよびフィトステロール（シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびアベノステロール（ａｖｅｎｏｓｔｅｒｏｌ）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「５α−スタノール」としては、コレスタノール、５α−カンペスタノールおよび５α−シトスタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
（分子生物学）
本発明に従って、当業者の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。そのような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
配列番号１０および配列番号１３の逆翻訳配列は、ＰＣＴ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの添付物２付属書Ｃの表１に示される１文字コードを使用する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
用語「遺伝子」とは、１つ以上のＲＮＡ分子、タンパク質、もしくは酵素のすべてもしくは一部を含むリボヌクレオチドもしくはアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはその特定の配列に対応する、ＤＮＡ配列を意味する。このＤＮＡ配列は、例えばその遺伝子が発現される条件を決定する調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでもよいし、含まなくてもよい。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得、このＲＮＡは、アミノ酸配列に翻訳されても翻訳されなくてもよい。
本発明は、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれかの核酸フラグメントを包含する。核酸「フラグメント」とは、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれか由来の少なくとも３０個（例えば、３１、３２、３３、３４個）、好ましくは少なくとも約３５個（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、もしくは３４個）、より好ましくは少なくとも４５個（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、もしくは４４個）、そして最も好ましくは少なくとも約１２６個以上連続するヌクレオチド（例えば、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、１０００または１２００個）を含む。
本発明はまた、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれか由来の少なくとも約７個（例えば、９、１２、１７、１９個）、好ましくは少なくとも約２０個（例えば、３０、４０、５０、６０個）、より好ましくは約７０個（例えば、８０、９０、９５個）、なおより好ましくは少なくとも約１００個（例えば、１０５、１１０、１１４個）そしてなおより好ましくは少なくとも約１１５個（例えば、１１７、１１９、１２０、１２２、１２４、１２５、１２６個）連続するヌクレオチドからなる核酸フラグメントを包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に約１００個を越えない（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０個）のヌクレオチドからなる核酸をいい、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは目的とする他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチド、または標識（例えば、ビオチン）が共有結合されているヌクレオチドの取り込みにより、標識され得る。一つの実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、（その一方、または両方が標識され得る）オリゴヌクレオチドは、全長遺伝子または遺伝子フラグメントをクローニングすること、または核酸の存在を検出することのいずれかのために、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般的に、オリゴヌクレオチドは合成的に（好ましくは、核酸合成機にて）調製される。
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」または「ポリペプチド配列」、あるいは「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドにおける一連の２つ以上のアミノ酸を指し得る。
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続する列を含む。本発明の好ましいペプチドとしては、配列番号２または配列番号１２のいずれかに示されるもの、ならびにそれらの改変体およびフラグメントが挙げられる。このようなフラグメントは、配列番号２または配列番号１２のいずれか由来の、好ましくは、少なくとも約１０個（例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個または１９個）、より好ましくは、少なくとも約２０個（例えば、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個）、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４２個（例えば、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個または１３０個）あるいはそれ以上の連続するアミノ酸残基を含有する。
本発明はまた、配列番号２または配列番号１２のいずれか由来の、少なくとも約７個（例えば、９個、１０個、１３個、１５個、１７個、１９個）、好ましくは、少なくとも約２０個（例えば、２２個、２４個、２６個、２８個）、なおより好ましくは、少なくとも約３０個（例えば、３２個、３４個、３６個、３８個）、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４０個（例えば、４１個、４２個）の連続するアミノ酸からなるポリペプチド（好ましくは、抗原性ポリペプチド）を含む。
本発明のポリペプチドは、インタクトなペプチドのタンパク質分解切断により、化学合成により、または組み換えＤＮＡ技術の適用により、産生され得、そしてタンパク質分解切断部位により切断されたポリペプチドに限定されない。上記のポリペプチドは、単独でか、またはそのポリペプチドをより免疫原性にするために架橋されるかもしくはキャリア分子に結合されて、抗体および抗体フラグメントの産生を惹起するための抗原として有用である。この抗体は、例えば、免疫親和性精製のためのイムノアッセイにおいて、またはＮＰＣ１Ｌ１の阻害のためなどに、使用され得る。
用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」は、細胞または組み換えＤＮＡ発現系において通常見出される他の成分から、部分的または完全に分離された、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、あるいは混合ポリマー）またはポリペプチドをそれぞれ含む。これらの成分としては、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。
単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくは、本質的に均質な分子組成であるが、いくらかの不均質性を含み得る。
本明細書中で使用される場合、ＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を意味し得る。ＰＣＲの説明については、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照のこと。
用語「宿主細胞」は、その細胞による物質の産生（例えば、その細胞による遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、あるいはタンパク質の、発現または複製）のために、選択、改変、トランスフェクト、形質導入、増殖されるか、あるいは任意の方法で使用または操作される、任意の生物体の任意の細胞を含む。好ましい宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスマクロファージＪ７７４細胞または任意の他のマクロファージ細胞株およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
核酸のヌクレオチド配列は、当該分野において公知である任意の方法（例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定）により、決定され得る。ＤＮＡの「化学的配列決定」としては、例えばＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０）の方法のような方法が挙げられる（この方法ではＤＮＡが、個々の塩基特異的な反応を使用してランダムに切断される）。ＤＮＡの「酵素的配列決定」としては、例えば、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら、(１９７７)Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）の方法のような方法が挙げられる。
本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列により隣接され得るか、または異種配列（プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−非コード領域および３’−非コード領域などを含む）に結合され得る。
一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに（例えば、直接にか、または他のプロモーター結合タンパク質もしくはプロモーター結合物質を介して）結合可能であり、かつコード配列の転写を開始し得る、ＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、その３’末端で転写開始部位に結合しており、そして上流（５’方向）に延びて、任意のレベルで転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。このプロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって、簡便に規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、見出され得る。このプロモーターは、他の発現制御配列（エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含む）と、または本発明の核酸と、作動可能に結合され得る。遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーター）（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５））（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４の「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」もまた参照のこと）；ならびに酵母もしくは他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）またはアルカリホスファターゼプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
コード配列は、細胞中の転写制御配列および翻訳制御配列が、そのコード配列のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）へのＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写に関し、次いでそのＲＮＡが、（イントロンを含む場合には）ＲＮＡスプライシングされ得、そして必要に応じて、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合に、それらの転写制御配列よび翻訳制御配列「の制御下にある」か、「と機能的に結合している」か、または「と作動可能に結合している」。
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中で、または細胞によって、「発現産物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現産物自体もまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、この供給源は、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を宿主細胞中に導入し得るビヒクル（例えば、プラスミド）を包含する。
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中での使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５および補遺、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって実行され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、原核生物系において最も頻繁に使用されるが、他の多くの細菌（例えば、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株およびＢａｃｉｌｌｕｓ株）が、当該分野で公知であり、そして同様に使用され得る。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を包含する。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）ならびに哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための多種多様なベクターを包含する。ＤＮＡ増幅のための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多く（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）である。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターまたはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯＴＳ）；あるいはハイブリッドプロモーター（例えば、ｐｔａｃ）を含むベクター（ｐＤＲ５４０）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，２０５〜２３６ページを参照のこと。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２０３５〜２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：２５９に開示されるようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において、高レベルで発現され得る。
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの組換え体作製のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。本発明の１つの実施形態は、膜結合型ＮＰＣ１Ｌ１を包含する。この実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１は、真核生物細胞の細胞膜において発現され得、そしてその膜結合型タンパク質は、当該分野で公知の従来の方法によって、その細胞から単離され得る。
本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合物は、表１に示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのいずれか、またはそれらの任意の部分配列もしくはフラグメント（上記に考察される）を含み得る。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易にするタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、非常に従来的であり、当該分野で周知である。
ポリペプチドにおいて生じる改変（例えば、翻訳後修飾）は、しばしば、そのポリペプチドを作製する方法に関係するである。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現することによって生成されるポリペプチドについて、その改変の性質および程度は、大部分は、宿主細胞の翻訳後修飾能力、およびそのポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって、決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、しばしば、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において生じない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主（一般的には、真核生物細胞）において発現され得る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様に翻訳後グリコシル化を行う。この理由のために、昆虫細胞発現系は、グリコシル化のネイティブパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現するために開発されている。本発明において使用され得る昆虫細胞は、Ｉｎｓｅｃｔａ綱の生物に由来する任意の細胞である。好ましくは、その昆虫は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｉｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９もしくはＳｆ２ｌ）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ ５）である。本発明によって、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを生成するために使用され得る昆虫発現系の例としては、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。望ましい場合、脱グリコシル化酵素が、真核生物発現系における生成の間に結合した糖質を除去するために、使用され得る。
他の改変としては、ポリペプチドカルボキシル末端への脂肪族エステルまたはアミドの付加もまた、挙げられ得る。本発明はまた、改変（例えば、非天然アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基、もしくはホスホスレオニン残基）の取り込み）を含むＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドアナログを包含する。他の潜在的な改変としては、硫酸化、ビオチン化、または他の部分の付加が挙げられる。例えば、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、被験体の身体においてそのペプチドの半減期を増加するポリマーを結合され得る。好ましいポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。
本発明のペプチドはまた、環化され得る。具体的には、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドのアミノ末端残基もしくはカルボキシ末端残基、または本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの２つの内部残基が、融合されて、環化ペプチドを生成し得る。ペプチドを環化するための方法は、従来的かつ当該分野において非常に周知である。例えば、Ｇｕｒｒａｔｈら、（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：９１１〜９２１を参照のこと。
本発明は、本発明のポリペプチドに対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対するあらゆる表面的な改変またはわずかな改変を企図する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸の配列保存的改変体を企図する。ポリペプチド配列の「配列保存的改変体」は、所定のコドンの１つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置においてコードされるアミノ酸の変化をもたらさない改変体である。本発明のポリペプチドの機能保存的改変体もまた、本発明によって企図される。「機能保存的改変体」は、タンパク質または酵素中の１つ以上のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体的立体構造および機能を変化することなく変化された改変体であるが、アミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換することには、決して限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は、当該分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる；交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる；交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、そして交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
本発明は、ラット、ヒトもしくはマウスのＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ならびにそれらのポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、その核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズする。核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、適切な温度条件および溶液イオン強度条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）下で他の核酸分子にアニーリングし得る場合に、別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）に対して「ハイブリダイズ可能である」。温度条件およびイオン強度条件が、そのハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。代表的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ミルク、４２℃のホルムアミドなし、；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、４２℃である。代表的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのハイブリダイゼーションが、４０％ホルムアミド中で、５×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＣを用いて４２℃で実行されることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、このハイブリダイゼーション条件が、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＣ中で、必要に応じて、より高温（例えば、４２℃より高温：５７℃，５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃、または６８℃）で実行されることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般に、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、その２つの核酸が、相補的配列を含むことが必要とするが、そのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きい程、より高いストリンジェンシー下でそれらの核酸がハイブリダイズし得る。１００ヌクレオチド長より長いハイブリッドについて、その融解温度を計算するための式が、誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置が、より重要になり、そのオリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）。
本発明にまた含まれるのは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を実施した場合に、参照ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１または５〜１０）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号２）、参照ヒトＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド配列（例えば、配列番号３）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号４）または参照マウスＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号１１または１３）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号１２）に対して、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、そして最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびそのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドである。このＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、このアルゴリズムのパラメーターは、個々の参照配列の長さ全体にわたって個々の配列間で最大の一致を生じるように選択される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を実施した場合に、配列番号２の参照ラットＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４の参照ヒトＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列または配列番号１２の参照マウスＮＰＣ１ＬＣアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％類似し、好ましくは少なくとも約８０％類似し、より好ましくは少なくとも約９０％類似し、そして最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似する、アミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に包含される。ここで、このアルゴリズムのパラメーターは、個々の参照配列の長さ全体にわたって個々の配列間で最大の一致を生じるように選択される。
配列同一性とは、比較されている２つの配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間での正確な一致を指す。配列類似性とは、比較されている２つのポリペプチドのアミノ酸間での正確な一致、および同一でない生化学的に関連するアミノ酸間の一致の両方をさす。類似する特性を共有しており、かつ交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸は、上記に考察されている。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻、補遺３、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら「Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）第５巻，補遺３．，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２．２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
（タンパク質精製）
本発明のタンパク質、ポリペプチド、および抗原性フラグメントは、標準的方法（塩沈もしくはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、上記で考察したようなタグ化ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの精製と組み合わせて使用する）、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー、および分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配が挙げられるが、これらに限定されない）によって、精製され得る。そのような精製方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に開示される。
精製工程の後には、下記に記載されるようなレセプター結合活性についてのアッセイの実行が行われ得る。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが細胞供給源もしくは組織供給源から単離される場合には特に、アッセイ系にタンパク質分解酵素の１つ以上のインヒビター（例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチン、およびＥＤＴＡ）を含むことが、好ましい。
（抗体分子）
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの抗原性（免疫原性を含む）フラグメント（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２由来の４２個以上連続するアミノ酸）は、本発明の範囲内にある。その抗原性ペプチドは、ＮＰＣ１Ｌ１を認識する単離された抗体分子を調製するために、特に有用であり得る。単離された抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、有用なＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストである。
抗原は、抗体に特異的に結合し得る任意の分子である。いくつかの抗原は、単独では、抗体生成を惹起し得ない。抗体生成を誘導し得る抗原は、免疫原である。
好ましくは、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体は、配列番号３９〜４２から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性ペプチド（例えば、ラットＮＰＣ１Ｌ１由来の抗原）を認識する。より好ましくは、その抗体は、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０７１７、Ａ０７１８、Ａ０８６７、Ａ０８６８、Ａ１８０１、またはＡ１８０２である。
用語「抗体分子」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。
常に必要であるわけではないが、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが、免疫学的に適格な宿主において抗体生成を惹起するための抗原として使用される場合、より小さい抗原性フラグメントが、好ましくは、まず、架橋もしくはコンカテマー形成によってか、または免疫原性キャリア分子（すなわち、宿主動物において免疫学的応答を独立して惹起する特性を有する高分子（例えば、ジフテリア毒素または破傷風毒素））に結合体化することによって、より免疫原性にされる。架橋またはキャリア分子への結合体化が、必要とされ得る。なぜなら、小さいポリペプチドフラグメントは、時には、ハプテン（抗体に特異的に結合可能であるが抗体生成を惹起する能力はない（すなわち、免疫原性ではない）分子）として作用するからである。免疫原性キャリア分子にこのようなフラグメントを結合体化すると、そのようなフラグメントは、一般的には「キャリア効果」として既知であるものを介して、より免疫原性になる。
キャリア分子としては、例えば、タンパク質、および天然ポリマー化合物または合成ポリマー化合物（例えば、ポリペプチド、多糖、リポ多糖など）が挙げられる。タンパク質キャリア分子が、特に好ましく、それには、キーホールリンペットヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク質（例えば、ヒトガンマグロブリンもしくはウシガンマグロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、もしくはウサギ血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘導体もしくは他の誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない。他のタンパク質キャリアは、当業者にとって明らかである。好ましくは、このタンパク質キャリアは、そのフラグメントに対する抗体が惹起される宿主動物に対して、異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）である。
このキャリア分子に対する共有結合は、当該分野で周知の方法を使用して達成され得、その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質によって示される。その免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、本発明のフラグメントは、例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒド）を使用して、結合され得る。
これらのようなカップリング剤はまた、別のキャリア分子を使用することなく、そのフラグメントをそのカップリング剤自体に架橋するために使用され得る。凝集物へのそのような架橋はまた、免疫原性を増加し得る。免疫原性はまた、既知のアジュバントを単独でかまたはカップリングもしくは凝集と組み合わせて使用することによって、増加され得る。
動物のワクチン接種のためのアジュバントとしては、アジュバント６５（落花生油、モノオレイン酸マンノイド（ｍａｎｎｉｄｅ）、およびモノステアリン酸アルミニウムを含有する）；フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、およびカルボポール）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）；ならびに油乳濁物が挙げられるが、これらに限定されない。このポリペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリア中に組み込まれた後に、投与され得る。
アジュバントおよび免疫アッセイの種々の局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによるシリーズ中に開示される。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を網羅する他の有用な参考文献としては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９，Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９６２，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻，１９６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋが挙げられる。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、ヒト、マウス、またはラットのＮＰＣ１Ｌ１を好ましくは認識するが、本発明は、任意の種（好ましくは、哺乳動物（例えば、ネコ、ヒツジ、またはウマ）由来のＮＰＣ１Ｌ１を認識する抗体分子を包含する。本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドと抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子とを含む、複合体を包含する。そのような複合体は、抗体分子を、その同族ポリペプチドと単に接触することによって、生成され得る。
種々の方法が、本発明の抗体分子を生成するために使用され得る。ヒト抗体は、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，８７７，３９７号；同第６，２５５，４５８号；同第６，０２３，０１０号および同第５，８７４，２９９号に開示される方法と同様の方法によって、生成され得る。
モノクローナル抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、当該分野で一般的に既知である方法によって生成され得る。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）によって元々開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら、（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら、（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２およびＣｏｔｅら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６−２０３０）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡは、ハイブリドーマ細胞が抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を発現しているか否かを決定するために、使用され得る。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子はまた、組換えにより（例えば、上記で考察したようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において）生成され得る。この実施形態において、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸は、ｐｅｔベースのプラスミド中に挿入され得、そしてＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系において発現され得る。組換え抗体を生成するために、当該分野で既知であるいくつかの方法が、存在する。抗体の組換え生成のための方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される。また、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６もまた、参照のこと。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的な均質な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する変異以外は同一である）を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物（特に、他の免疫グロブリンによって汚染されていない）によって合成され得るという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的な均質な抗体集団から得られたものとしてのその抗体の特徴を示し、特定の何らかの方法によるその抗体の生成を必要とするものとしては、解釈されるべきではない。本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されるハイブリドーマ方法によって生成され得る。
用語「ポリクローナル抗体」は、他の１つ以上の同一でない抗体とともにか、またはそのような抗体の存在下で、生成された抗体を包含する。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を生成した他のいくつかのＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から生成される。代表的には、ポリクローナル抗体は、免疫された動物（例えば、ウサギ）から直接得られる。
「二重特異性抗体」は、別個の抗原に結合する２つの異なる抗原結合領域を含む。二重特異性抗体、ならびにその抗体を生成する方法および使用する方法は、従来通りであり、当該分野で非常に周知である。
抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプとは、別の抗体分子の抗原結合領域または可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対する抗体である。Ｊｅｒｎｅ（Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．，（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５ｃ：３７３およびＪｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．ら、（１９８２）ＥＭＢＯ １：２３４）により開示されるように、所定の抗原（例えば、ＮＰＣ１Ｌ１）に対するパラトープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫は、一群の抗抗体を生成し、その抗抗体のいくつかは、その抗原と、そのパラトープに対する相補的構造を共有する。その抗イディオタイプ抗体の部分集団による免疫は、その後、最初の抗原に対して反応性である抗体部分集団を生成するか、または免疫細胞サブセットを免疫する。
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
「ヒト／マウスキメラ抗体」とは、ヒト定常領域に融合されたマウス可変領域（ＶＨおよおびＶＬ）を含む抗体をいう。
「ヒト化」抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、キメラ免疫グロブリンであり、これは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。多くは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）の相補性決定領域由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、そのヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基もまた、対応する非ヒト残基によって置換される。
「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓＦｖポリペプチドは、このＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、そのｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成可能であるようにするポリペプチドリンカーを、さらに含む。単鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第５，４７６，７８６号；同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号）は、抗ＮＰＣ１Ｌ１特異的単鎖抗体を生成するために適合され得る。ｓＦｖの概説について、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド架橋によって連結された可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する分子を包含する。
本発明の範囲内にある抗体フラグメントはまた、ＩｇＧの酵素（例えば、ペプシン）切断により生成され得るＦ（ａｂ）２フラグメントを包含する。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いるＦ（ａｂ）２の還元によって、生成され得る。
Ｆｖフラグメントは、ＶＬ領域またはＶＨ領域である。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、種々のクラスへと割当てられ得る。免疫グロブリンについて、少なくとも５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）へと分類され得る。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子はまた、化学部分に結合体化され得る。この化学部分は、特に、ポリマー、放射性核種または細胞傷害性因子であり得る。好ましくは、この化学部分は、被験体の身体におけるその抗体分子の半減期を増加するポリマーである。適切なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。米国特許第６，１３３，４２６号に記載されるＰＥＧ化抗ＩＬ−８抗体を生成するための方法は、本発明のＰＥＧ化抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体の生成に適用され得る。Ｌｅｅら、（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合体化単鎖抗体を開示する。Ｗｅｎら、（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））に結合されたＰＥＧと抗体を結合体化することを開示する。
本発明の抗体分子はまた、標識（例えば、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒまたは５６Ｆｅ）と結合体化され得る。
本発明の抗体分子はまた、蛍光標識または化学発光標識（フルオロフォア（例えば、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン（ｓｐｉｎ）標識、および安定なフリーラジカルを包含する）と結合体化され得る。
この抗体分子はまた、細胞傷害性因子（例えば、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉのタンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシンおよびエノマイシン）に結合体化され得る。
本発明の抗体分子を種々の部分に結合体化するための当該分野で既知の任意の方法が、使用され得、その方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら、（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら、（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７が挙げられる。
抗体を結合体化するための方法は、従来通りであり、当該分野で非常に周知である。
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、種々の医学的状態（増加された血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを含む）の処置および管理において有用であり得る、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）の選択的アゴニストおよびアンタゴニストの発見を可能にする。従って、本発明のＮＰＣ１Ｌ１は、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにスクリーニング系において使用され得る。本質的には、これらの系は、ＮＰＣ１Ｌ１を、適切な既知のリガンドまたは既知のアゴニストもしくはアンタゴニストに架橋するための方法を提供する。上記適切な既知のリガンドまたは既知のアゴニストもしくはアンタゴニストとしては、ステロール（例えば、コレステロール、フィトスレテロール（シトステロール、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）およびアヴェノステロール（ａｖｅｎｏｓｔｅｒｏｌ）が挙げられるが、これらに限定されない）、５α−スタノール（ｓｔａｎｏｌ）（コレスタノール、５α−カンペスタノールおよび５α−シトスタノールが挙げられるが、これらに限定されない）、コレステロール酸化生成物、置換されたアゼチジノン（例えば、エゼチミブ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ））、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブ（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７−９３）もしくはＤｅＮｉｎｎｏら、（１９９７）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（１６）：２５４７〜５４）（Ｍｅｒｃｋ；Ｌ−１６６，１４３）に記載されるような１１−ケトチゴゲニンの４’’，６’’−ビス［（２−フルオロフェニル）カルバモイル］−β−Ｄ−セロビオシル誘導体、または、任意の置換されたアゼチジノン、およびＮＰＣ１Ｌ１アゴニストもしくはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルが挙げられる。
用語「特異的」は、例えばスクリーニングアッセイにおけるＮＰＣ１Ｌ１のリガンドもしくはＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストの結合を記載するために使用される場合、上記リガンドまたはアンタゴニスト（例えば、検出可能に標識されて置換されたアゼチジノン、検出可能に標識されたエゼチミブ、検出可能に標識されたステロール（例えば、コレステロール）もしくは検出可能に標識された５α−スタノール）が、このアッセイ系において他のタンパク質の程度を超えて、優先的にＮＰＣ１Ｌ１に結合する程度をいう技術用語である。例えば、このアッセイにおいて生成され、このような結合を示すシグナルが、ネガティブコントロール実験におけるバックグランドのシグナルを任意の程度で凌ぐ場合（ここで、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１またはアンタゴニストもしくはリガンドが存在しない）、ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストまたはリガンドは、ＮＰＣ１Ｌ１に特異的に結合する。さらに、「特異的な結合」としては、アンタゴニストもしくはリガンドの、ＮＰＣ１Ｌ１への直接的な結合、または、例えばＮＰＣ１Ｌ１がその一部である複合体における別の部分を介した間接的な結合のいずれかが挙げられる。ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドまたはアンタゴニストが結合する部分は、別のタンパク質またはＮＰＣ１Ｌ１の翻訳後の修飾（例えば、脂質鎖もしくは炭水化物鎖）であり得る。
適切なアゼチジノンの非限定的な例としては、米国再発行特許発明第３７，７２１号；同５，６３１，３６５号；同５，７６７，１１５号；同５，８４６，９６６号；同５，６８８，９９０号；同５，６５６，６２４号；同５，６２４，９２０号；同５，６９８，５４８号；および同５，７５６，４７０号ならびに米国特許出願公開番号２００３／０１０５０２８に開示されるものが挙げられ、これらの各々は、本明細書中でその全体が参考文献として援用される。
サンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含有するか否かを評価するための簡便な方法は、このサンプルが、既知のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、エゼチミブ）とＮＰＣ１Ｌ１との間で結合に関して競合する物質を含有するか否かを決定することである。
エゼチミブは、当業者に周知の種々の方法（例えば、米国特許第５，６３１，３６５号、同５，７６７，１１５号、同５，８４６，９６６号、同６，２０７，８２２号、米国特許出願公開番号２００２／０１９３６０７およびＰＣＴ特許出願ＷＯ ９３／０２０４８に開示されている）により調製され得、上記の文献の各々は、本明細書中でその全体が参考文献として援用される。
「サンプル」、「候補化合物」または「候補物質」とは、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号１２）またはその機能性フラグメントをアゴナイズまたはアンタゴナイズするために結合する能力について、試験またはアッセイにおいて評価される組成物をいう。この組成物は、低分子、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、亜原子粒子（例えば、α粒子、β粒子）、または抗体であり得る。
使用され得る２つの基本的な型のスクリーニング系としては、標識−リガンド結合アッセイ（例えば、直接結合アッセイまたはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ））および「ステロール（すなわち、コレステロール）または５α−スタノールの取り込み」アッセイが挙げられる。この結合アッセイにおける使用のための標識リガンドは、ステロール（すなわち、コレステロール）もしくは５α−スタノール、または既知のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストもしくは既知のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを、測定可能な基（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）で標識することによって、得られ得る。種々の標識形態のステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールが、市販されているか、または標準的な技術を使用して生成され得る（例えば、コレステロール−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］、コレステロール−［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］またはコレステロール−［７−３Ｈ（Ｎ）］；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。好ましい実施形態において、エゼチマイブは、ＢＯＤＩＰＹ基で蛍光標識される（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７−９３）か、または検出可能な基（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）で標識される。
（直接結合アッセイ）
代表的には、所定量の本発明のＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）またはＮＰＣ１Ｌ１を含む錯体が、漸増量の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニスト（上記に考察される）と接触され、結合した標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの量が、未結合の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストを洗浄により除去した後に、測定される。標識されたリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストの量が増加した場合、すべてのレセプター結合部位が占有されるかまたは飽和される点に、最終的に到達する。その標識されたリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストの特異的レセプター結合は、大過剰の標識されていないリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストによって、廃止される。
好ましくは、レセプターに対する上記標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの非特異的結合が最小限であるアッセイ系が、使用される。非特異的結合は、代表的には、標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの全結合のうちの５０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満である。
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）をコードする核酸は、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、それにより、上記レセプターは、その細胞の膜に組み込まれる。次いで、膜画分が、その細胞から単離され得、アッセイのためにそのレセプターの供給源として使用され得る。あるいは、その細胞表面においてそのレセプターを発現する細胞全体が、アッセイにおいて使用され得る。好ましくは、トランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞に対するか、またはトランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞由来の膜画分に対する、上記の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの特異的結合は、無視できる。
原理的には、本発明の結合アッセイは、本発明の可溶性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系からの標準的方法による生成およびリフォールディングの後に使用して、実行され得る。生じたレセプター−標識リガンド複合体は、例えば、そのレセプターに対する抗体を使用して沈殿され得る。その後、その沈殿物は、洗浄され得、結合した標識されたリガンドまたはアンタゴニストもしくはアゴニストの量が、測定され得る。
基本的結合アッセイにおいて、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを同定するための方法は、
（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２または配列番号４または配列番号１２）、その部分配列またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体を、既知量の標識されたステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニスト（例えば、標識されたエゼチマイブ、または標識Ｌ−１６６，１４３）の存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触させる工程；ならびに
（ｂ）ＮＰＣ１Ｌ１に直接的または間接的に結合した標識されたステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの量を測定する工程；
を包含する。
サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストは、そのようなアンタゴニストまたはアゴニストの非存在下で測定される結合と比較して、ＮＰＣ１Ｌ１に対する上記標識されたステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの、実質的に減少した直接的な結合または間接的な結合を測定することによって、同定される。例えば、サンプルの存在下での［３Ｈ］−コレステロールとＮＰＣ１Ｌ１との間における減少した直接的な結合または間接的な結合は、そのサンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１結合について［３Ｈ］−コレステロールと競合している物質を含むことを示唆し得る。
このアッセイは、任意のＮＰＣ１Ｌ１依存性リガンド（例えば、ステロール（例えば、コレステロールまたは５α−スタノール）結合を欠く、コントロール実験を含む得る。本アッセイにおいて、例えば、任意の機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く細胞全体または細胞膜（例えば、本発明のトランスジェニック変異体ｎｐｃ１ｌ１−マウスから単離されたか、または本発明のトランスジェニック変異体ｎｐｃ１ｌ１−マウスに由来する細胞あるいは細胞膜）は、リガンド結合についてアッセイされる。サンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在についてスクリーニングされる場合、試験されるサンプルの存在下において観察される結合のレベルを、本明細書中に記載されるようなコントロール実験の結合のレベル（これは、ＮＰＣ１Ｌ１依存性結合を完全に欠く）と比較することは有用である。理想的には、必然的にではないが、アンタゴニストを含むサンプルの存在下で示される結合のレベルは、コントロール実験のレベルと類似している。
あるいは、サンプルは、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）に対する結合について直接試験され得る。この型の基本的アッセイは、以下の工程を包含し得る：
（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２または配列番号４または配列番号１２）、その部分配列、またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体を、標識候補化合物（例えば、［３Ｈ］−エゼチマイブ）と接触する工程；および
（ｂ）その標識候補化合物と、ＮＰＣ１Ｌ１との間の直接的な結合または間接的な結合を検出する工程。
さらに、これらの実験は、コントロール実験（ここで、ＮＰＣ１Ｌ１依存性結合は、完全に欠いている）に沿って実行され得る。例えば、このアッセイは、任意の機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く細胞全体または細胞膜（例えば、本明細書中に記載されるようなトランスジェニック変異体ｎｐｃ１ｌ１−マウスに由来する細胞または細胞膜）を使用して実行され得る。
ＮＰＣ１Ｌ１に結合することが見出される候補化合物は、（例えば、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの取り込みの阻害によって）ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。
（ＳＰＡアッセイ）
ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストはまた、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して測定され得る。ＳＰＡアッセイは、従来的であり、当該分野で非常に周知である。例えば、米国特許第４，５６８，６４９号を参照のこと。ＳＰＡにおいて、目的の標的は、直径約５ミクロンの小さいミクロスフェアに固定される。このミクロスフェアは、代表的には、ポリヒドロキシフィルムでコートされた固体シンチラントコアを含み、これは次いで、カップリング分子を含み、このカップリング分子は、アッセイ設計のための遺伝的関連付けを可能にする。放射性同位体標識された分子がこのミクロスフェアに結合する場合、この放射性同位体は、シンチラントに非常に近接され、この同位体により発せられる電子からの有効なエネルギー移動が生じて、光の発生をもたらす。その放射性同位体が自由溶液中に残る間、その放射性同位体は、シンチラントからあまりにも遠すぎであり、そして電子は、水性媒体中にエネルギーを散逸し、従って、検出されないままである。シンチレーションは、シンチレーションカウンターを用いて検出され得る。一般に、３Ｈ標識および１２５Ｉ標識が、ＳＰＡにとって十分に適切である。
レセプター媒介結合事象のアッセイのために、レクチンの小麦胚芽レクチン（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＷＧＡ）が、ＳＰＡビーズカップリング分子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）として使用され得る。このＷＧＡ結合ビーズは、グリコシル化された細胞膜および糖タンパク質を捕捉する。このビーズは、広範な種類のレセプター供給源および培養細胞膜のために使用されている。このレセプターは、ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ上に固定され、シグナルが、同位体標識されたリガンドの結合に際して生成される。レセプター結合ＳＰＡアッセイのために有用であり得る他のカップリング分子としては、ポリ−Ｌ−リジンおよびＷＧＡ／ポリエチレンイミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７（Ｓｕｐｐｌ．７）：Ｓ１４３−Ｓ１４５；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．ら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：７０−７５；Ｋｉｅｎｈｕｓら、（１９９２）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８９−３９９；Ｊｉｎｇ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ９：１０６７〜１０６９を参照のこと。
ＳＰＡビーズ中に含まれるシンチラントとしては、例えば、ジフェニルアントラシン（ＤＰＡ）の固体溶媒として作用する、ケイ酸イットリウム（ＹＳｉ）、酸化イットリウム（ＹＯｘ）、ジフェニルオキサゾールまたはポリビニルトルエン（ＰＶＴ）が挙げられ得る。
ＳＰＡアッセイは、サンプルがＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストを含むか否かを分析するために使用され得る。これらのアッセイにおいて、細胞表面上にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２または配列番号４または配列番号１２）を発現する宿主細胞またはその膜画分が、ＳＰＡビーズ（例えば、ＷＧＡコートＹＯｘビーズ、またはＷＧＡコートＹＳｉビーズ）と共にインキュベートされ、ＳＰＡビーズによって捕獲される。ＮＰＣ１Ｌ１を有するビーズは、標識された既知リガンドまたは標識された既知アゴニストもしくは標識された既知アンタゴニスト（例えば、３Ｈ−コレステロール、３Ｈ−エゼチマイブまたは１２５Ｉ−エゼチマイブ）とともにインキュベートされる。このアッセイ混合物は、試験されるべきサンプル、またはブランク（例えば、水）のいずれかをさらに含み得る。必要に応じたインキュベーションの後に、シンチレーションが、シンチレーションカウンターを使用して測定される。ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、そのようなアゴニストまたはアンタゴニスト（ブランク）の非存在下で測定される蛍光と比較して、実質的に減少した蛍光を測定することによって、サンプル中で同定され得る。実質的に減少した蛍光を測定することは、そのサンプルが、上記の既知リガンド、既知アゴニストまたは既知アンタゴニストとの直接的なＮＰＣ１Ｌ１結合または間接的なＮＰＣ１Ｌ１結合について競合する物質を含むことを、示唆し得る。
あるいは、サンプルは、ＳＰＡアッセイにおいて結合を直接検出することによって、ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストまたはアゴニストとして同定され得る。このアッセイにおいて、試験されるべき候補化合物の標識形態が、ＳＰＡビーズに結合された、ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞またはその膜画分と接触するように配置され得る。その後、蛍光は、標識候補化合物と、ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞または膜画分との間の複合体の存在、またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体の存在を検出するためにアッセイされ得る。ＮＰＣ１Ｌ１に直接的または間接的に結合する候補化合物は、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニスト活性またはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト活性を保有し得る。
ＳＰＡアッセイは、任意のＮＰＣ１Ｌ１依存性結合を欠くコントロール実験に沿って実行され得る。このコントロール実験は、例えば、任意の機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く細胞または細胞膜（例えば、本明細書中に記載されるようなトランスジェニック変異体ｎｐｃ１ｌ１−マウスに由来する細胞または細胞膜）を用いて実行され得る。コントロール実験が実行される場合、アンタゴニストの存在について試験されるサンプルの存在下において観察される結合のレベルは、コントロール実験において観察されるレベルと比較され得る。
ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞は、本発明のＮＰＣ１Ｌ１をコードする核酸を適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトし、それによりそのレセプターがその細胞の膜中に組み込まれることによって調製され得る。その後、膜画分が、その細胞から単離され得、そしてアッセイについてそのレセプター供給源として使用され得る。あるいは、その細胞表面上でそのレセプターを発現する細胞全体が、アッセイにおいて使用され得る。好ましくは、トランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞、またはランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞由来の膜画分に対する、上記の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの特異的結合は、無視できる。好ましい宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスマクロファージＪ７７４細胞または他の任意のマクロファージ細胞株、およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
（ステロール／５α−スタノールの取り込みアッセイ）
アッセイはまた、サンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１媒介性のステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの取り込みをアゴナイズまたはアンタゴナイズし得るか否かを決定するために実施され得る。これらのアッセイにおいて、（上記で考察された）細胞表面にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２または配列番号４または配列番号１２）を発現する宿主細胞が、検出可能に標識されたステロール（例えば、３Ｈ−コレステロールまたは１２５Ｉ−コレステロール）または５α−スタノールと、サンプルまたはブランクのいずれかとともに接触され得る。必要に応じたインキュベーションの後、その細胞は、吸収されていないステロールまたは５α−スタノールを除去するために洗浄され得る。ステロールまたは５α−スタノールの取り込みは、宿主細胞における標識ステロールまたは標識５α−スタノールの存在を検出することによって、決定され得る。例えば、アッセイされる細胞またはその溶解物もしくは画分（例えば、薄層クロマトグラフィーにより分離された画分）は、液体シンチラントと接触され得、そしてシンチレーションが、シンチレーションカウンターを使用して測定され得る。
これらのアッセイにおいて、サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される取り込みと比較して、実質的に減少した標識ステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）または５α−スタノールの取り込みを測定することによって同定され得、アゴニストは、そのようなアゴニストの非存在下で測定される取り込みと比較して、実質的に増加した標識ステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）または５α−スタノールの取り込みを測定することによって同定され得る。
取り込みアッセイは、任意のＮＰＣ１Ｌ１依存性取り込みを欠くコントロール実験に沿って実行さ得る。このコントロール実験は、例えば、任意の機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く細胞（例えば、本明細書中に記載されるようなトランスジェニック変異体ｎｐｃ１ｌ１−マウスに由来する細胞）を使用して、実行され得る。コントロール実験が実行される場合、アンタゴニストの存在について試験されるサンプルの存在下で観察される取り込みのレベルは、コントロール実験において観察される取り込みのレベルと比較され得る。
（マウスアッセイ）
本発明は、任意の機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く変異体トランスジェニックマウスを含む。このマウスは、腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のインヒビター（好ましくは、ＮＰＣ１Ｌ１のインヒビター）を同定するためのスクリーニングアッセイにおける従来のコントロール実験として役目を果たし得る。好ましくは、本発明のマウスアッセイは、以下の工程を包含する：
（ａ）ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを含む物質（例えば、放射標識コレステロール（例えば、１４Ｃ−コレステロールまたは３Ｈ−コレステロール）を含む）を、機能的ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を含む第一のマウスおよび第二のマウス、および機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く第三の変異体マウスに与える工程；
上記ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを含む物質は、好ましくは、標識されたコレステロール（例えば、放射標識コレステロール（例えば、３Ｈ標識コレステロールまたは１４Ｃ標識コレステロール）を含む。上記ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを含む物質はまた、例えば、トウモロコシ油中のコールドの標識されていないステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを含み得る。
これらのアッセイにおいて、第三のｎｐｃ１ｌ１変異体マウスは、低いレベルの腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収を示す（＋）コントロール実験として役目を果たし、第二のマウスは、正常な阻害されていないレベルの腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収を示す（−）コントロール実験として役目を果たす。第二のマウスは、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストについて試験されるサンプルを投与されていない。第一のマウスが、実験である。
（ｂ）機能的ＮＰＣ１Ｌ１を含む第一のマウスにサンプルを投与するが、第二のマウスには投与しない工程；
（ｃ）第一のマウス、第二のマウス、および第三のマウスの、腸におけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収の量を測定する工程；
腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。例えば、腸吸収のレベルは、血清のステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのレベルを測定することによってアッセイされ得る。
（ｄ）各マウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のレベルを比較する工程；
ここで、上記サンプルは、第一のマウスおよび第三のマウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のレベルが、第二のマウスにおける腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収の量に満たない場合、腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のアンタゴニストを含むことが決定される。
好ましくは、上記サンプルが、腸ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のインヒビター（例えば、ＮＰＣ１Ｌ１インヒビター）を含む場合、第一のマウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収のレベルは、第三のｎｐｃ１ｌ１変異体マウスの吸収のレベルと類似する。
これらのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る、代替的な（＋）コントロール実験は、公知のＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニスト（例えば、エゼチマイブ）を投与された機能的ＮＰＣ１Ｌ１を含むマウスである。
（薬学的組成物）
例えば、上記のスクリーニング方法によって発見されたＮＰＣ１Ｌ１アゴニストおよびＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、ＮＰＣ１Ｌ１の活性を刺激またはブロックするために治療的に（例えば、薬学的組成物中で）使用されて、それにより、ＮＰＣ１Ｌ１により引き起こされるかまたは媒介される任意の医学的状態を処置し得る。加えて、本発明の抗体分子はまた、ＮＰＣ１Ｌ１に結合するために治療的に（例えば、薬学的組成物中で）使用されて、それにより、ＮＰＣ１Ｌ１がステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールに結合する能力をブロックし得る。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの結合をブロックすることは、（例えば、腸細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）（例えば、腸細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ））による）その分子の吸収を防止し得る。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収をブロックすることは、被験体における血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのレベルを低下させ、それによって、例えば、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患、脳卒中または動脈硬化症の発生を減少するために有用な方法であり得る。
用語「被験体」または「患者」は、任意の生物（好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、霊長類、ネコ）、および最も好ましくはヒト）を包含する。
用語「薬学的組成物」は、活性成分と薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントとを含む組成物をいう。
本発明の組成物は、単純溶液中で投与され得るが、それらの組成物は、より代表的には、他の材料（例えば、キャリア、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア）と組み合わせて使用される。有用な薬学的に受容可能なキャリアは、本発明の組成物を被験体に送達するために適切な、任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、蝋、および不活性固体が、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれ得る。薬学的に受容可能なアジュバント（緩衝剤、分散剤）はまた、薬学的組成物中に組み込まれ得る。
好ましくは、本発明の薬学的組成物は、丸剤またはカプセル剤の形態である。丸剤およびカプセル剤を処方するための方法は、当該分野で非常に周知である。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、任意の経口非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、ラクトース、デンプン、ショ糖、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、滑石、マンニトール、エチルアルコール（液体形態）など）と合わされ得る。さらに、望ましい場合または必要な場合には、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた、この混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、トウモロコシ甘味料、天然ガムおよび合成ガム（例えば、アラビアゴム）、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、および蝋が挙げられる。この滑沢剤の中には、これらの投薬形態での使用について言及され得るホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、グアールーガムなどが挙げられる。甘味料および矯味矯臭剤および保存剤もまた、適切な場合に含まれ得る。
本発明の薬学的組成物は、第２の薬学的組成物または物質と組み合わせて投与され得る。好ましい実施形態において、この第２の組成物は、コレステロール低下薬物を含む。併用治療が使用される場合、両方の組成物が、同時送達のために単一組成物へと処方され得るか、または２つ以上の組成物（例えば、キット）へと別々に処方され得る。
この処方物は、単位投薬形態で簡便に提示され得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出），Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）、（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
治療適用に関与する投薬レジメンは、治療物質の作用を改変し得る種々の要因（例えば、患者の状態、体重、性別および食事、任意の感染の重篤度、投与回数、ならびに他の臨床因子）を考慮して、医師によって決定され得る。多くの場合、処置投薬量は、低レベルから増量して、安全性および効力を最適にする。投薬量は、小さい分子サイズおよび投与後の半減期の減少の可能性（クリアランス時間）を計上するように調整され得る。
本発明のアンタゴニストの「有効量」は、腸ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタロールの吸収のレベルを検出可能に減少するか、またはその組成物を投与された被験体中の血清のステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタロールのレベルを検出可能に減少する量であり得る。
そのような物質の治療投与のための代表的なプロトコルは、当該分野で周知である。本発明の薬学的組成物は、例えば、任意の腸管外経路または非腸管外経路によって、投与され得る。
本発明の丸剤およびカプセル剤は、経口投与され得る。注射可能な組成物が、当該分野で公知の医療デバイスを用いて、例えば、皮下注射針を用いる注射によって、投与され得る。
本発明の注射可能な薬学的組成物はまた、針なし皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス）を用いて、投与され得る。
（アンチセンス）
本発明はまた、例えば配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２またはその部分配列により規定されるアミノ酸配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５〜配列番号１１または配列番号１３のいずれか）に特異的にハイブリダイズして、そのｍＲＮＡの翻訳を防止することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。さらに、本発明は、例えば配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２またはその部分配列により規定されるアミノ酸配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするゲノムＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを企図する。
本発明はさらに、（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール（例えば、コレステロール）吸収またはＮＰＣ１Ｌ１媒介性５α−スタノール吸収を、細胞膜を通過してその細胞中のＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡに特異的に結合してそのｍＲＮＡの翻訳を防止することによって減少するために有効な量のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）細胞膜を通過可能な薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、薬学的組成物を提供する。一実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活化する物質に結合されている。別の実施形態において、ｍＲＮＡを不活化する物質は、リボザイムである。
患者の細胞にアンチセンスＮＰＣ１Ｌ１ ＲＮＡを導入することによってＮＰＣ１Ｌ１の発現レベルを減少させることは、患者における腸のステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収および血清コレステロールを減少する有用な方法である。
（キット）
本発明のキットは、より好ましくは薬学的投薬形態（例えば、丸剤、散剤、注射用液体、錠剤、分散顆粒、カプセル剤、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔ）または坐剤）の薬学的処方物中に、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせたエゼチミブを含む。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（前出），Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。好ましくは、上記投薬形態は、Ｚｅｔｉａ（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐ．）である。エゼチミブは、任意の従来の形態で供給され得る。例えば、エゼチミブを含む錠剤は、３０、９０または５００のビンで供給され得る。
本発明のキットはまた、例えば、包装挿入物中の形態の情報を含み、これは、エゼチミブの標的が、ＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３）であることを示す。用語「エゼチミブの標的」は、エゼチミブが、ＮＰＣ１Ｌ１を拮抗することによって、直接的または間接的のいずれかで、腸のステロール（例えば、コレステロール）吸収または５α−スタノール吸収を低下させることを示す。上記挿入物の形態は、任意の形態（例えば、紙または電子媒体（例えば、磁気記録媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク（登録商標））またはＣＤ−ＲＯＭ）をとる。
上記パッケージ挿入物はまた、上記キットの薬学的組成物および投薬形態に関する他の情報を含み得る。概して、このような情報は、患者および医師が、同封の薬学的組成物および投薬形態を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば、エゼチミブ（例えば、Ｚｅｔｉａ（登録商標））および／またはシンバスタチン（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標））に関する以下の情報が、上記挿入物に供給され得る：薬物速度論、薬力学、臨床研究、有効性パラメータ、適応および用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過剰投薬、適切な用量および投与、供給方法、適切な保存条件、参照ならびに特許情報。
本発明のキットはまた、より好ましくは薬学的投薬形態（例えば、丸剤、散剤、注射用液体、錠剤、分散顆粒、カプセル剤、カシェ剤または坐剤）の薬学的処方物中に、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせたシンバスタチン（
Figure 2007523595
 ）を含む。好ましくは、シンバスタチンの投薬形態は、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）である。
シンバスタチンを含む錠剤または丸剤は、任意の簡便な形態で供給され得る。例えば、５ｍｇのシンバスタチンを含む錠剤または丸剤が、以下のとおり供給され得る：３０、６０、９０、１００または１０００のビン。１０ｍｇのシンバスタチンを含む錠剤または丸剤が、以下のとおり供給され得る：３０、６０、９０、１００、１０００または１０，０００のビン。２０ｍｇのシンバスタチンを含む錠剤または丸剤が、以下のとおり供給され得る：３０、６０、９０、１００、１０００または１０，０００のビン。４０ｍｇのシンバスタチンを含む錠剤または丸剤が、以下のとおり供給され得る：３０、６０、９０、１００または１０００のビン。８０ｍｇのシンバスタチンを含む錠剤または丸剤が、以下のとおり供給され得る：３０、６０、９０、１００、１０００または１０，０００のビン。
エゼチミブおよびシンバスタチンは、別々の組成物としてか、または単一の組成物に組み合わされて、キット中に供給され得る。例えば、エゼチミブおよびシンバスタチンは、別々の薬学的投薬形態（例えば、２つの別々の丸剤または錠剤）として、単一の通常の薬学的投薬形態（例えば、丸剤または錠剤）中で供給され得る。
（ｎｐｃ１ｌ１−細胞）
本発明は、機能的なＮＰＣ１Ｌ１タンパク質をコードするか、産生し得るＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を欠損する任意の単離された哺乳類細胞（例えば、単離されたマウス細胞、単離されたラット細胞または単離されたヒト細胞）を提供する。任意の調節エレメント（例えば、プロモーター）の遺伝子コード領域の、点変異、切断、欠失を含む変異ｎｐｃ１ｌ１遺伝子は、本実施形態に含まれる。
例えば、上記細胞は、内在性の染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合変異を含む変異マウスから単離され得、ここで、このマウスは、機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を産生しない（例えば、以下の実施例２２に記載されるマウス）。さらに、本発明は、このような変異マウス（特に、機能的ＮＰＣ１Ｌ１を産生しない変異、トランスジェニックマウス）に由来するか、または単離された、任意の細胞、組織、器官、流体、核酸、ペプチドまたは他の生物学的物質を包含し、ここで、このマウスで欠失された内在性の染色体ＮＰＣ１Ｌ１の領域は、配列番号４５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド７９０〜９９８に対応する。
単離された細胞は、例えば、上記変異マウスの十二指腸、胆嚢、肝臓、小腸または胃から単離され得るか、または由来し得る。さらに、上記細胞は、腸細胞であり得る。
ｎｐｃ１ｌ１−変異細胞は、例えば、スクリーニングアッセイ（例えば、前出を参照のこと）におけるコントロール実験での使用に有用である。なぜなら、ｎｐｃ１ｌ１−変異細胞は、ステロール、５α−スタノールもしくはエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１依存性の、取り込みまたは結合を欠如しているからである。スクリーニングアッセイにおいて、特定のサンプルによって引き起こされる阻害レベルは、上記変異細胞で達成されるアッセイの阻害レベルと比較され得る。理想的には、決して必ずではないが、例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて、変異ｎｐｃ１ｌ１−細胞または変異ｎｐｃ１ｌ１−細胞膜単独との結合において観察されるのと同一量の結合が、アンタゴニストの存在下で、非変異細胞または非変異細胞膜によって観察される。
以下の実施例は、本発明をより明確に記載するために提供されており、本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
（実施例１：ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１のクローニングおよび発現）
ラットＮＰＣ、マウスＮＰＣ１Ｌ１またはヒトＮＰＣ１Ｌ１は、全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して簡便に増幅され得る。このアプローチにおいて、ラットｃＤＮＡライブラリー、マウスｃＤＮＡライブラリーまたはヒトｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡは、適切なプライマーおよび標準的ＰＣＲ条件を使用して増幅され得る。プライマーの設計および最適な増幅条件は、当該分野で一般的に公知である標準的技術を構成する。
増幅したＮＰＣ１Ｌ１遺伝子は、さらに、当該分野で一般的に公知である方法を使用して、簡便に発現され得る。例えば、ＮＰＣ１Ｌ１は、ｐＥＴベースのプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｏｌａ，ＣＡ）中のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に挿入され得る。その後、このプラスミドは、Ｔ７発現系（例えば、ＢＬ２１ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中に形質転換され得、液体培養中で増殖し得、そして（例えば、ＩＰＴＧをその細菌培養物に添加することによって）誘導され得る。
（実施例２：直接的結合アッセイ）
（膜調製）
ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトしたＣａｃｏ２細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡ／リン酸緩衝化生理食塩水中でインキュベートし、その後、繰返しピペッティングすることによって収集する。その細胞を、１０００×ｇにて５分間遠心分離する。このＥＤＴＡ／ＰＢＳを捨て、等容量の氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５を添加し、細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎ（ＰＴ１０チップ、設定５、３０秒）で破壊する。核および未破壊の細胞を、１０００×ｇにて１０分間沈降させ、次いで、上清を５０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。その上清を捨て、ペレットをＰｏｌｙｔｒｏｎにより再懸濁し、サンプルをタンパク質アッセイ（ビシンコニニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ），Ｐｉｅｒｃｅ）用にとり、この組織を再度５０，０００×ｇで遠心分離する。ペレットを、−２０℃にて凍結保存する。
（結合アッセイ）
飽和結合のために、４種類の濃度の［３Ｈ］−エゼチミブ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、１０−５Ｍエゼチミブの有り無しで、総容量２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、５０μｇの膜タンパク質とともに、３０℃にて３０分間、３連でインキュベートする。サンプルをＧＦ／Ｂフィルターにて濾過し、２ｍｌの冷Ｔｒｉｓ緩衝液で３回洗浄する。フィルターを電子レンジ中で乾燥し、Ｍｅｌｔｉｌｅｘワックスシンチラントに浸漬し、そして４５％効率で計数する。競合結合アッセイのために、５種類の濃度のサンプルを、上記の条件下で１８ｎＭ［３Ｈ］−エゼチミブおよび７０μｇの膜タンパク質とともに３連でインキュベートする。曲線を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）非線形最小二乗曲線フィットプログラムを用いてこのデータにフィットさせ、Ｋｉ値を、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ．ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９〜３１０８）に従ってＩＣ５０値から得る。
（実施例３：ＳＰＡアッセイ）
９６ウェルプレートの各ウェルについて、１０μｇのヒトＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ）と２００μｇ／ウェルのＹＳｉ−ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との反応混合物（１００μｌ）を、ＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）中にて調製する。０．４ｎＭのリガンド−［１２５Ｉ］−エゼチミブストックを、ＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液中で調製する。上記の溶液を、以下のように９６ウェルアッセイプレートに添加する：５０μｌのＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液、１００μｌの反応混合物、５０μｌのリガンドストック（最終リガンド濃度は、０．１ｎＭである）。このアッセイプレートを、プレート振盪機にて５分間振盪し、その後、８時間インキュベートした後に、ｃｐｍ／ウェルを、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて決定する。
これらのアッセイは、［１２５Ｉ］−エゼチミブが、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜に結合することを示す。同様の結果が、同じ実験を放射標識コレステロール（例えば、１２５Ｉ−コレステロール）を用いて実施した場合に得られる。
（実施例４：コレステロール取り込みアッセイ）
ＳＲ−Ｂ１、またはラットＮＰＣ１Ｌ１の３種の異なるクローンもしくは１種のマウスＮＰＣ１Ｌ１クローンのいずれかを発現するＣＨＯ細胞を、無コレステロール培地中で一晩飢餓させ、その後、混合合成ミセルエマルジョン中の［３Ｈ］−コレステロールを、１０μＭエゼチミブの非存在下または存在下で４分間、８分間、１２分間、または２４分間投与した。その細胞を採取し、脂質を有機的に抽出した。抽出した脂質を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上にスポットし、有機蒸気相内で分離した。各アッセイについての遊離コレステロールのバンドを単離し、シンチレーションカウンターにて計数した。
ＳＲ−Ｂ１発現細胞は、４分間程度の初期に［３Ｈ］−コレステロール取り込みの増加を示した。この増加はまた、エゼチミブによって抑制された。これらの３種のラットクローンおよび１種のマウスクローンは、バックグラウンドレベルの［３Ｈ］−コレステロール取り込みを生じるように見えた。この取り込みは、非形質転換ＣＨＯ細胞の取り込みと同様であった。
これらの実験は、ＣＨＯ細胞が、より最適な実験条件が開発された場合には、マウスＮＰＣ１Ｌ１依存性、ラットＮＰＣ１Ｌ１依存性、およびヒトＮＰＣ１Ｌ１依存性の［３Ｈ］−コレステロール取り込みを実施し得ることを示すデータを生じる。
（実施例５：Ｗｉｓｔａｒラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、いくつかのラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現を評価した。評価した組織は、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、遠位結腸、肝臓、膵臓、心臓、大動脈、脾臓、肺、腎臓、脳、筋肉、精巣、卵巣、子宮、副腎および甲状腺であった。全ＲＮＡサンプルを、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、そしてプールした。その後、それらのサンプルを、標準的二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用するＴａｑｍａｎ分析を使用したリアルタイム定量ＰＣＲに供した。代表的なプローブの設計は、５’レポーター色素（例えば、６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）またはＶＩＣ）および３’クエンチ色素（例えば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチル−ローダミン））を組み込んだ。
（ラットＮＰＣ１Ｌ１）
Figure 2007523595
 （ラットβ−アクチン）
Figure 2007523595
 。
ＰＣＲ反応を、各ウェル中に以下を含む２５μｌ反応混合物を用いた９６ウェル形式でで実行した：Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１２．５μｌ）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（０．５μｌ）、５０ｍＭ塩化マグネシウム（２μｌ）、ＲＴ反応からのｃＤＮＡ（０．２μｌ）。多重反応は、各々２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、および１００ｎＭのＦＡＭ標識プローブ、ならびに各々１００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、および５０ｎＭのＶＩＣ標識プローブを含んだ。反応は、標準的な２段階サイクリングプログラム（９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル）を用いて実行した。
最高レベルの発現が、十二指腸、空腸、および回腸組織において観察された。これらのデータは、ＮＰＣ１Ｌ１が、腸におけるコレステロール吸収において役割を果たすことを示す。
（実施例６：マウス組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、いくつかの組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現を評価した。評価した組織は、副腎、ＢＭ、脳、心臓、ランゲルハンス島、ＬＩ、小腸、腎臓、肝臓、肺、ＭＬＮ、ＰＬＮ、筋肉、卵巣、下垂体、胎盤、パイアー斑、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、子宮および気管であった。全ＲＮＡサンプルを、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、そしてプールした。その後、それらのサンプルを、以下のプライマーおよびプローブを使用するＴａｑｍａｎ分析を使用したリアルタイム定量ＰＣＲに供した：
（マウスＮＰＣ１Ｌ１）
Figure 2007523595
 。
最高レベルの発現が、パイアー斑、小腸、胆嚢、および胃の組織において観察された。これらのデータは、消化系において生じるＮＰＣ１Ｌ１のコレステロール吸収の役割と一致する。
（実施例７：ヒト組織におけるヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、４６種の正常組織を示す２０４５種のサンプルにおけるヒトＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。マイクロアレイベースの遺伝子発現分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの確立されたプロトコルに厳密に従って、塩基対４１９２〜５１１７（配列番号４３）に対応するｃＲＮＡプローブを使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ９５ ＧｅｎｅＣｈｉｐにて実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐを、低光増幅管（ＰＭＴ）下でスキャンし、データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ４．０アルゴリズムまたはＭＡＳ ５．０アルゴリズムのいずれかを使用して正規化した。さらに、ほとんどのサンプルについての「スパイクイン（ｓｐｉｋｅ ｉｎ）」を使用して、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃアルゴリズムおよび手順に従って標準曲線を構築し、ＲＮＡ濃度値を得た。これらの結果の要約が、以下の表２に示される。
（表２．種々のヒト組織におけるＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現レベル）
Figure 2007523595
 影を付けたデータは、最高レベルのＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡが検出された組織に対応する。「存在する」の欄は、ＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡが検出された、評価された特定の組織サンプルの割合を示す。「存在せず」の欄は、ＮＰＣ１Ｌ１ ＲＮＡが検出されなかった評価された特定の組織サンプルの割合を示す。「下位２５％」の欄、「中間」の欄および「上位７５％」の欄は、評価された各組織セットについて観察された相対的ＮＰＣ１Ｌ１シグナル強度の統計的分布を示す。
（実施例８：ラット小腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ ｍＲＮＡ、またはラットＳＲ−Ｂ１ ｍＲＮＡの分布）
これらの実験において、ラット小腸の近位−遠位軸に沿ったラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの分布を評価した。腸を、５匹の独立した動物から単離し、ほぼ等しい長さの１０個の切片に分割した。全ＲＮＡを単離し、そしてラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ（回腸胆汁酸輸送体）ｍＲＮＡまたはラットＳＲ−Ｂ１ ｍＲＮＡの局所発現レベルについて、Ｔａｑｍａｎ分析を使用したリアルタイム定量ＰＣＲによって分析した。この分析において使用したプライマーおよびプローブは、以下である：
（ラットＮＰＣ１Ｌ１）
Figure 2007523595
 （ラットビリン（Ｖｉｌｌｉｎ））
Figure 2007523595
 （ラットＳＲ−Ｂ１）
Figure 2007523595
 （ラットＩＢＡＴ）
Figure 2007523595
 。
各動物の小腸切片のｍＲＮＡ発現レベルを、別個に分析し、その後、観察された発現レベルを、その小腸切片において観察されたビリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。その後、各切片について観察された、正規化したｍＲＮＡ発現レベルを、平均化した。
ＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１の発現レベルは、より遠位の回腸切片と比較して、空腸（切片２〜５）において最高であった。空腸は、コレステロール吸収の部位であると考えられるので、これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１についてのそのような役割を示唆する。回腸を好むＩＢＡＴ分布が、十分に記録され、この実験についてのコントロールとして役立った。
（実施例９：ラット空腸組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡのインサイチュ分析）
ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの局在化を、ラット空腸連続切片のインサイチュハイブリダイゼーション分析によって特徴付けた。この分析において使用したプローブは、
（Ｔ７−センスプローブ）
Figure 2007523595
 （Ｔ７−アンチセンスプローブ）
Figure 2007523595
 であった。
これらのＲＮＡプローブを、ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチドの３３１８〜３６７２（配列番号１）に対応するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅を使用して、合成した。センスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブおよびアンチセンスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブを、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して、Ｔ７プロモーターから作製した。ラット空腸の連続凍結切片を、このセンスプローブおよびアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン標識を、先の方法に基づいてＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて検出した。ポジティブシグナルを、ハイブリダイゼーション部位における赤色反応産物の沈着によって特徴付ける。
このアンチセンスプローブは、低倍率（４０×）下で、陰窩−絨毛軸に沿って、上皮の強い染色を示した。観察されたラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡ発現レベルは、絨毛先端よりも陰窩において、いくらか高かったようであり得る。高倍率（２００×）下では、染色は、腸細胞において観察されたが、杯細胞では観察されなかった。センスプローブ（コントロール）で染色が観察されなかったことにより、ＮＰＣ１Ｌ１アンチセンスシグナルの高い特異性が確認された。これらのデータは、腸コレステロール吸収におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割のさらなる証拠を提供した。
（実施例１０：一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞への蛍光標識エゼチミブの結合のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチミブ（Ａｌｔｍａｎｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７〜９３）がＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１に結合する能力を評価した。「ＢＩＯＤＩＰＹ」とは、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブを検出するために使用した蛍光基である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ（ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ（ｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウスＳＲ−Ｂ１ ＤＮＡ（ｍＳＲＢＩ／ＣＨＯ）またはＥＧＦＰ ＤＮＡ（ＥＧＦＰ／ＣＨＯ）で一過性トランスフェクトした。ＥＧＦＰとは、ポジティブコントロールとして使用した増強型緑色蛍光タンパク質である。次いで、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチミブで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。コントロール実験もまた実施し、その実験において、細胞を、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブで標識せず、非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブで標識した。
染色は、非トランスフェクトＣＨＯ細胞でも、ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞でも、ｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞でも観察されなかった。蛍光を、ポジティブコントロールＥＧＦＰ／ＣＨＯ細胞において検出した。染色をまた、マウスＳＲ−Ｂ１／ＣＨＯ細胞において検出した。これらのデータは、試験した条件下で、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブが、ＳＲ−Ｂ１に結合可能であること、およびそのような結合は、蛍光ＢＯＤＩＰＹ基の存在によって剥離されないことを示す。より好適な条件が決定された場合、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブは、ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞およびｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞を標識することが示される。
（実施例１１：抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２で標識した一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧタグ化ＮＰＣ１Ｌ１の発現を、評価した。ＣＨＯ細胞を、マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ、ＦＬＡＧ−ラット ＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。使用した８アミノ酸ＦＬＡＧタグは、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３７）であり、このタグは、分泌シグナル配列直後のアミノ末端細胞外ループ上に挿入した。これらの細胞を、市販の抗ＦＬＡＧモノクローナルマウス抗体Ｍ２とともにインキュベートし、その後、ＢＯＤＩＰＹタグ化抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。次いで、処理した細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。
このＭ２抗体は、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色した。マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においては、染色は観察されなかった。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１およびマウスＮＰＣ１Ｌ１が、何ら有意な固有の蛍光を有さず、抗ＦＬＡＧ抗体によって結合されないことを示した。これらの細胞の観察されたＦＬＡＧ依存性標識は、このＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞の細胞膜に局在化することを示した。
（実施例１２：一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の表面および細胞質での局在化を評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。これらの融合物において、そのＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、ＥＧＦＰ融合物は、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にある。次いで、これらの細胞を、Ｍ２抗ＦＬＡＧマウス（一次）抗体で染色し、その後、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス抗体で二次染色した。コントロール実験において、細胞を、この二次抗体のみで染色し、上記一次抗体（Ｍ２）では染色しなかった。次いで、染色した細胞を、ＦＡＣＳにより分析した。
コントロール実験において、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトした細胞を、ＢＯＤＩＰＹ抗マウス二次抗体で染色したが、上記一次抗体では染色しなかった。そのデータは、その二次抗マウス抗体が、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１について何ら有意な特異性を有さないこと、およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１自体が、何ら有意な蛍光を有さないことを示した。
別のコントロール実験において、非標識ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を、ＦＡＣＳ分析した。これらの実験において、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の自己蛍光を、検出した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。この分析からのデータは、これらの細胞が、二次ＢＯＤＩＰＹ標識抗体で標識されたことを示した。このことは、ＣＨＯ細胞の表面上でのＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質の発現を示した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。この分析からのデータは、上記キメラタンパク質の表面発現を示す、両方のマーカー（ＢＯＤＩＰＹおよびＥＧＦＰ）が存在することを示した。このデータはまた、上記タンパク質の一部が、上記細胞内に位置し、輸送小胞と関連し得ることを示した。これらのデータは、コレステロール、または非細胞小器官（例えば、粗面小胞体）において発現したタンパク質の小胞輸送におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割を支持した。
（実施例１３：クローン化ＣＨＯ細胞株におけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ分析および蛍光顕微鏡検査）
これらの実験において、ラットＮＰＣ１Ｌ１の細胞局在化を、ＦＡＣＳ分析および免疫組織化学によって評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡでトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、次いで、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。この融合物において、ＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にある。次いで、染色した細胞を、ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡検査法によって分析した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡでトランスフェクトした細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、次いで、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。これらの細胞のＦＡＣＳ分析によって、上記キメラタンパク質の表面発現を示す両方のマーカーを検出した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰトランスフェクト細胞を、６３×倍率で蛍光顕微鏡によって分析した。これらの細胞の蛍光顕微鏡分析は、有意な核周囲オルガネラ染色を伴う非核染色を示した。その画像を解像しても、小胞関連タンパク質の存在は確認し得なかった。これらのデータは、上記融合タンパク質が、ＣＨＯ細胞の細胞膜上で発現されたことを示した。
（実施例１４：ポリクローナル抗ラットＮＰＣ１Ｌ１ウサギ抗体の作製）
アミノ末端システイン残基またはカルボキシ末端システイン残基を含む合成ペプチド（配列番号３９〜４２）を、ジスルフィド結合を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリアタンパク質に結合し、抗原として使用して、ニュージーランド白色ウサギ（３ヶ月齢〜９ヶ月齢の範囲）においてポリクローナル抗血清を惹起した。このＫＬＨ−ペプチドを、等容量のフロイントアジュバントと混合することによって乳化し、３箇所の皮下背面部位に注射した。１６週間の免疫スケジュールの前に、免疫前血清サンプルを収集し、その後、０．２５ｍｇ ＫＬＨ−ペプチドを初回注射し、そして０．１ｍｇ ＫＬＨ−ペプチドを３回、計画的にブースター注射した。動物の耳介動脈から採血し、その血液を凝固させ、その後、その血清を遠心分離によって収集した。
抗ペプチド抗体力価を、固相において結合した遊離ペプチド（１μｇ／ウェル）を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。結果を、０．２のＯＤ４５０を生じた血清希釈の逆数として表す。検出を、ビオチニル化抗ウサギＩｇＧ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）結合体、およびＡＢＴＳを使用して得た。
（実施例１５：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１発現のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞の表面におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を評価した。ＣＨＯ細胞を、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトし、次いで、ウサギ免疫前血清または上記実施例１４に記載した１０週間抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清（すなわち、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０８６７またはＡ０８６８）のいずれかとともにインキュベートした。次いで、一次抗血清で標識した細胞を、ＢＯＤＩＰＹ改変抗ウサギ二次抗体で染色し、その後、ＦＡＣＳ分析した。
抗体表面標識は、免疫前血清サンプルのいずれについても観察されなかった。ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の特異的細胞表面標識が、Ａ０７１５およびＡ０８６８の両方について観察された。抗血清Ａ０７１６およびＡ０８６７は、このアッセイ様式におけるラットＮＰＣ１Ｌ１表面発現を認識しなかった。このことは、ネイティブの非融合ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞において発現され、ＣＨＯ細胞膜に局在化することを示す。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
（実施例１６：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞または非トランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。このＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞を、Ａ０８０１血清、Ａ０８０２血清、Ａ０７１５血清、またはＡ０８６８血清（実施例１４参照）または抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２のいずれかで標識した。次いで、これらの標識細胞を、ＢＯＤＩＰＹ標識抗ウサギ二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、上記のトランスフェクト細胞株と同じ様式で分析した。
非トランスフェクトＣＨＯ細胞のポジティブ染色は、試験した抗血清のいずれについても観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の血清Ａ０８０１依存性標識が観察されたが、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞のそのような標識は、観察されなかった。ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞またはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の血清Ａ０８０２依存性標識は、観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の強い血清Ａ０７１５依存性標識が観察され、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の弱い血清Ａ０７１５依存性標識が観察された。ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびマウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の弱い血清Ａ０８６８依存性標識が、観察された。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の強い抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体依存性標識が、観察された。この強いＭ２染色は、Ｍ２が、既知の濃度の親和性精製されたモノクローナル抗体であるという事実に起因する可能性がある。対照的に、個々の抗血清は、ポリクローナルであり、未精製であり、非特定濃度の抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗体を含有する。これらのデータは、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞において発現され、そしてＣＨＯ細胞膜に局在化されるというさらなる証拠を提供する。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
（実施例１７：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５を用いるラット空腸組織の免疫組織化学分析）
これらの実験において、ラット空腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の局在化を、免疫組織化学により分析した。ラット空腸を取り出し、すぐにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中に包埋し、そして液体窒素中に凍結した。切片（６μｍ）を、低温槽ミクロトームを用いて切断し、そしてスライドガラス上にマウントした。切片を室温で風乾し、その後、ブワン固定液中に固定した。ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ免疫染色を、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰキットを使用して実行した。内因性組織ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートしてブロックし、非特異的抗体結合を、１０％非免疫ウサギ血清中で４５分間インキュベートして最小にした。切片を、ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５またはＡ０８６８とともに１：５００希釈にて４℃でインキュベートし、その後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとともにインキュベートした。引き続いて、これらの切片を、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）−Ｈ２Ｏ２染色系において発色させ、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、そして顕微鏡検査法により試験した。このプロトコルを使用する陽性反応を、抗原−抗体反応部位での赤色反応産物の沈着によって特徴付ける。核は、ヘマトキシリン対比染色物から青色を呈した。コントロールを、同じ組織ブロックからの近傍切片に対して同時に実施した。コントロール手順は、以下からなった：（１）一次抗体を免疫前血清で置換すること、（２）一次抗体を非免疫ウサギ血清で置換すること、（３）一次抗体をＰＢＳで置換すること、（４）二次抗体をＰＢＳで置換すること。
本実施例は、低倍率（４０×）および高倍率（２００×）で分析した、抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清Ａ０７１５または免疫前血清で染色した組織を示す。Ａ０７１５染色組織は、低倍率で絨毛上皮層（腸細胞）の強い陽性染色を示した。Ａ０７１５染色組織は、高倍率で腸細胞頂端膜の強い陽性染色を示した。免疫前血清のみで処理した組織において、染色は観察されなかった。同様の結果が、血清Ａ０８６８を用いて得られた。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１が、ラット空腸において発現されることを示し、これは、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
（実施例１８：標識コレステロール取り込みアッセイ）
本実施例において、ラットＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を、評価した。これらのアッセイにおいて、単一濃度におけるコレステロール取り込みを、パルスチェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータが、以下の表３において示される。
（細胞）
Ａ．ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
細胞を、１２ウェルプレート中に５００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
（手順）
すべての試薬および培養プレートを、特に記載しない限り、３７℃で維持した。
（飢餓）維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％ ＦＣＳ）を除去し、細胞を、無血清ＨＡＭＳ培地でリンスした。次いで、この無血清培地を、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））で置換した。
各細胞株１プレートを、一晩飢餓させた。残りの２プレートを、「飢餓なし」と表記した（以下を参照のこと）。
（プレインキュベーション） 培地をすべてのプレートから除去し、無血清ＨＡＭＳでリンスし、そして飢餓培地で３０分間置換した。
（３Ｈ−コレステロールパルス） 以下を、各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁塩（ｂｉｌｅ ｓａｌｔ）ミセル中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール（約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散される
最終の培地コレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ。
標識コレステロールパルスの時点は、０分、４分、１２分、および２４分であった。各処理について３連のウェルを調製した。
（洗浄） 指定した時間に、培地を吸引し、そして細胞を、３７℃でＨｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、０．２％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４））で一回洗浄し、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
（処理／分析） 細胞を０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温で一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、そしてシンチレーション計数により放射能を計数した。すべてのウェルからの５０μｌアリコートさらに２つずつを、Ｐｉｅｒｃｅ ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ法により総タンパク質についてアッセイした。この細胞において観察された標識コレステロールの量を、その細胞におけるタンパク質の量により正規化した。
Figure 2007523595
 ｄｐｍ＝１分間当たりの崩壊
ｓｅｍ＝平均の標準誤差。
（実施例１９：コレステロール取り込みに対するエゼチミブの効果）
マウスＮＰＣ１Ｌ１またはラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が３Ｈ−標識コレステロールを取り込む能力に対するエゼチミブの効果を、パルスチェイス実験において評価した。１種類のマウスＮＰＣ１Ｌ１のｃＤＮＡクローン（Ｃ７）および３種類のラットＮＰＣ１Ｌ１クローン（Ｃ７、Ｃ１７、およびＣ２１）を、評価した。マウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、マウスＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトした細胞が、エゼチミブの非存在下で標識コレステロールを取り込む能力もまた、パルスチェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータを、以下の表４および表５に示す。さらに、４種類の異なる非標識コレステロール濃度の存在下において、トランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞によって取り込まれる総コレステロール量もまた評価した。これらの実験からのデータを、以下の表６に示す。
（細胞）
Ａ．ラットまたはマウスＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
Ｃ．ＳＲ−Ｂ１トランスフェクトＣＨＯ細胞
細胞を、１２ウェルプレート中に５００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
（手順）
全ての試薬および培養プレートを、他に記載しない限り、３７℃で維持した。
（飢餓）
維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシ、１０％ ＦＣＳ）を除去し、細胞を無血清ＨＡＭＳ培地でリンスした。次いで、この無血清培地を、１ｍＬの「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、ペニシリン／ストレプトマイシ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））と交換した。次いでこの細胞を、一晩飢餓状態においた。
（予備インキュベーション／予備投薬）
培地を全てのプレートから除去し、新鮮な飢餓培地と交換し、３０分間予備インキュベーションした。ウェルの半数を、エゼチミブ（ＥｔＯＨ中のストック溶液；最終濃度＝１０μＭ）含有培地を受けた。
（３Ｈ−コレステロールパルス）
以下を各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁酸塩ミセル中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール （約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
超音波振動によって、「飢餓」培地中に分散させた
最終培地コレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ
標識されたコレステロールパルス時点は、４分、１２分、２４分および４時間であった。
各処理について、３つのウェルを調製した。
（洗浄）
指定された時間に培地を吸引し、細胞を、３７℃で、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４）で一度、そしてＨｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＢＳＡなし））で一度洗浄した。
（処理／分析）
Ａ．４分、１２分、２４分時点：細胞を、０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）によって、室温で一晩消化した。１．５ｍＬアリコートを各ウェルから除去し、中和し、そしてシンチレーションカウンタによって放射能を計算した。
Ｂ．４時間時点：消化した細胞を、薄層クロマトグラフィーによって分析し、細胞中のコレステロールエステルの含有量を決定した。
抽出物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、３０分間２ｍｌヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相で３０分間泳動し、続いて１ｍｌヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相で１５分間第二泳動した。
Ｃ．細胞抽出物のタンパク質決定：細胞抽出物のサンプルを含有するプレートを、指示された時間、１２０ｒｐｍで回転振とう機上におき、次いで抽出物を１２×７５チューブ中でプールした。プレートを乾燥させ、ＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を添加した。次いで、このサンプルのタンパク質含有量を決定した。全てのウェルからの２つのさらなる５０μｌアリコートを、ＰｉｅｒｃｅのマイクロＢＣＡ法によって、総タンパク質についてアッセイした。細胞中に観察された標識されたコレステロールの量を、細胞中のタンパク質量に対して正規化した。
（表４．エゼチミブの存在下および非存在下における、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中の総コレステロール）
Figure 2007523595
 （表５．エゼチミブの存在下または非存在下における、ＣＨＯ細胞中のコレステロールエステル）
Figure 2007523595
 （表６．増加した量の非標識コレステロールの存在下における、標識コレステロールの取り込み）
Figure 2007523595
 （実施例２０：標識コレステロール取り込みアッセイ）
この実施例において、ラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１によって一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の、標識コレステロールを取り込む能力を評価した。
また、ラットＮＰＣ１Ｌ１の、マウスＳＲ−Ｂ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を増強する能力を、評価した。これらのアッセイにおいて、一つの濃度において、コレステロール取り込みを、パルス−チェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータを、下記の表７に示す。
（細胞）
Ａ．ＣＨＯバックグラウンド細胞（偽トランスフェクション）
Ｂ．マウスＳＲ−Ｂ１によって一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞
Ｃ．ラットＮＰＣ１ＬＩ ｃＤＮＡによって一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ（ｎ＝８クローン）。
一過性にトランスフェクトした細胞を、１２ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
（手順）
全ての試薬および培養プレートを、他に記載されない限り、３７℃で維持した。
（飢餓）
維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシ、１０％ ＦＣＳ）を細胞から除去し、１ｍＬの「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、ペニシリン／ストレプトマイシ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））と交換した。細胞を、一時間飢餓状態においた。
（３Ｈ−コレステロールパルス）
以下を各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁酸塩ミセル中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール （約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
超音波振動によって、「飢餓」培地中に分散させた
最終培地コレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ
標識されたコレステロールパルス時点は、２４分および４時間であった。各処理について３ウェル。
（洗浄）
指定された時間に培地を吸引し、細胞を、３７℃で、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、０．２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）で一度、そしてＨｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＢＳＡなし））で一度洗浄した。
（処理／分析）
Ａ．２４分時点：細胞を、０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）によって、室温で一晩消化した。１．５ｍＬアリコートを各ウェルから除去し、中和し、そしてシンチレーションカウンタによって放射能を計算した。
Ｂ．４時間時点：消化した細胞を、薄層クロマトグラフィーによって分析し、細胞中のコレステロールエステルの含有量を決定した。
抽出物を、薄層クロマトグラフィー上にスポットし、２ｍｌヘキサン：イソプロパノール（３：２）含有移動相で３０分間泳動し、続いて１ｍｌヘキサン：イソプロパノール（３：２）含有移動相で１５分間第二泳動した。
Ｃ．細胞抽出物のタンパク質決定：細胞抽出物のサンプルを含有するプレートを、指示された時間、１２０ｒｐｍで回転振とう機上におき、次いで抽出物を１２×７５チューブ中でプールした。プレートを乾燥させ、ＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を添加した。次いで、このサンプルのタンパク質含有量を決定した。全てのウェルからの２つのさらなる５０μｌアリコートを、ＰｉｅｒｃｅのマイクロＢＣＡ法によって、総タンパク質についてアッセイした。細胞中に観察された標識されたコレステロールの量を、細胞中のタンパク質量に対して正規化した。
（表７．一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞における標識コレステロール取り込み）
Figure 2007523595
 （実施例２１：ラット、マウスおよびヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現）
この実施例において、ＮＰＣ１Ｌ１を細胞に導入し、発現させた。種特異的ＮＰＣ１Ｌ１発現構築物を、クローン特異的ＰＣＲプライマーを用いてプラスミドｐＣＤＮＡ３中にクローニングし、ベクターのポリリンカーに適合する適切な制限部位が隣接したＯＲＦを作製した。ＮＰＣ１Ｌ１の３つの種全てについて、小腸総組織ＲＮＡを、オリゴｄＴをテンプレートプライマーとして用いた逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用した。ラットＮＰＣ１Ｌ１をＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングし、ヒトＮＰＣ１ＬＩをＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングし、そしてマウスＮＰＣ１Ｌ１をＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングした。各クローンのフォワード鎖およびリバース鎖配列決を実施し、配列完全性を確認した。標準的一過性トランスフェクション手順を、ＣＨＯ細胞に用いた。６ウェルプレートのＣＨＯ細胞を、トランスフェクション前に１日、２×１０５細胞／ウェルの平板培養密度で平板培養した。翌日、細胞を２μｇプラスミドＤＮＡおよび６μＬリポフェクタミンとともに、５時間インキュベートし、続いて新鮮培地に交換した。４８時間後、細胞を、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清を用いて、ＦＡＣＳまたはウェスタンブロットのいずれかによって、ＮＰＣ１Ｌ１発現について分析した。安定な長期細胞株を確立するため、ゲネシチン（Ｇ４１８、０．８ｍｇ／ｍｌ）の存在下で、製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって推奨されるように、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選別した。培養物における選別の１ヶ月後、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清で細胞集団を染色し、ＦＡＣＳによって選別した。限界希釈による単離後、個々の陽性染色集団をクローニングし、次いで、ゲネシチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）含有選択培地中に維持した。
トランスフェクション手順に対してより感受性の低い他の細胞型は、アデノウイルスベクター系を用いて作製された。ＮＰＣ１Ｌ１を発現するために使用されたこの系は、Ａｄ５、Ｃ型アデノウイルスに由来する。この組み換え型複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域の改変を介して欠損を作製する。このベクターはまた、Ｅ３領域にさらなる改変を有する。この改変は、一般に、Ｅ３ｂ領域遺伝子ＲＩＤａおよびＲＩＤｂに影響を及ぼす。ＮＰＣ１Ｌ１発現を、アデノウイルスのＥ３領域において置換された発現カセットとしてＣＭＶプロモーターを用いて促進した。ラットおよびマウスのＮＰＣ１Ｌ１を、アデノウイルスベクターに適合する制限部位に隣接するクローン特異的プライマーを用いて増幅した。アデノウイルス感染性粒子を、５×１０１０Ｐ／ｍＬの力価で２９３−Ｄ２２細胞から産生した。ウイルス溶解物を使用して、標準的トランスフェクション法に抵抗性の細胞を感染させた。Ｃａｃｏ２細胞（異種タンパク質発現に高抵抗性である）において、ＮＰＣ１Ｌ１のアデノウイルス媒介性発現は、ウェスタンブロット分析によって、少なくとも感染後２１日において持続していることが示された。
（実施例２２：ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトトランスジェニックマウス）
ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウスを、標的化突然変異誘発を介して構築した。この方法は、マウスＮＰＣ１Ｌ１遺伝子の特定領域を欠失するように設計された標的性構築物を利用した。標的プロセスの間、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺレポーター遺伝子を、内因性ＮＰＣ１Ｌ１プロモーターの制御下で挿入した。ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号４５）の欠失された領域は、ヌクレオチド７９０〜ヌクレオチド９９８に由来する。標的性ベクターは、ヌクレオチド７８９で終わる１．９ｋｂ ５’アームおよびヌクレオチド９９９で始まる３．２ｋｂ ３’アームに隣接するＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを含む。組み換え胚性幹細胞株由来ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを用いて相同組み換えについてアッセイした。増幅されたＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって可視化した。試験ＰＣＲは、遺伝子特異的プライマーを利用した。このプライマーは、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット配列に対して特異的な３つのプライマーのうちの１つと対合する、標的性ベクターアームの外部かまたはそれに隣接して位置する。５’ＰＣＲ再確認のため、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチドＡＴＧＴＴＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＣＣＣ（配列番号４６）を、そして３’ＰＣＲ再確認のため、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチドＧＧＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣ（配列番号４７）を用いた。Ｆ２マウスの遺伝子型決定を、マルチプレックスＰＣＲによって実施した。マルチプレックスＰＣＲには、ＮＰＣ１Ｌ１特異的フォワードプライマーＴＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＣ（配列番号４８）、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット特異的フォワードプライマーＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣ（配列番号４９）を、ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子特異的リバースプライマーＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＣ（配列番号５０）と組み合わせて用い、標的化対立遺伝子および内因性対立遺伝子の両方の決定を可能にした。アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分析は、野生型と、ヘテロ接合体と、ホモ接合体ヌルマウスとを互いに区別した。
（実施例２３：ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスにおける急性コレステロール吸収）
ＮＰＣ１Ｌ１がコレステロール吸収において役割を果たすか否かを決定するため、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスを研究した。
ＮＰＣ１Ｌ１（−／−）欠損マウスを、ヘテロ接合体マウス（＋／）を交配することによって作製し、野生型（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）を得た。非絶食マウス（６．５〜９週齢、１２９およびＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの混合）を計量し、グループ分けした（ｎ＝２の−／−およびｎ＝４の＋／＋）。１μＣｉ １４Ｃ−コレステロール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、［４〜１４Ｃ］コレステロール、ＮＥＣ−０１８）および０．１ｍｇキャリアコレステロール塊（ｃａｒｒｉｅｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍａｓｓ）（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する０．１ｍｌコーン油（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、全ての動物を胃瘻栄養（給餌針、２４Ｇ×１インチ、Ｐｏｐｐｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）した。２時間後、心臓穿刺によって血液を採取した。肝臓を取り出し、計量し、そして３サンプルを２０ｍｌ計数バイアル中に配置した。組織を、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨで、６０℃で一晩消化した。組織消化物を、液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）の前に、２５０μｌの４Ｎ ＨＣｌの添加によって酸性化した。微量遠心機における１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって血漿を単離し、２つの１００μｌ血漿アリコートをＬＳＣにかけた。
コレステロール吸収（この急性技術によって評価され、血漿中および肝臓中の放射性コレステロールの総量として表現される）は、野生型マウス（＋／＋）が平均１１，７７３ｄｐｍの１４Ｃ−コレステロールを吸収し、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスが９９２ｄｐｍの１４Ｃ−コレステロールを吸収したことを示した。これらの結果は、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスが９２％のコレステロール吸収の減少を有することを示す。これらのデータは、腸管コレステロール吸収におけるＮＰＣ１Ｌ１の役割を確証する。ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト（例えば、エゼチミブ）を被験体に投与することによる、被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性コレステロール吸収の阻害は、被験体において血清コレステロールレベルを低下させ、アテローム性動脈硬化症の発症を低減させる、有用な方法である。
（実施例２４：ＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３）ノックアウトマウスにおけるコレステロール吸収（糞便比法（Ｆｅｃａｌ Ｒａｔｉｏ Ｍｅｔｈｏｄ）：コレステロール／シトスタノール））
この実施例においては、コレステロール吸収およびエゼチミブの活性を、ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（−／−）、ヘテロ接合体マウス（＋／−）、および年齢の対応する野生型マウス（＋／＋）において決定した。
マウスにおけるコレステロール吸収を、Ａｌｔｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５８０（１）：７７−９３（２００２））によって記載されている二重糞便同位体比法（ｄｕａｌ ｆｅｃａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｒａｔｉｏ ｍｅｔｈｏｄ）によって決定した。マウス（ｎ＝４〜６／群）に、標準的げっ歯類用固形飼料を与え、そしていくつかの群においては、最大有効用量のエゼチミブで毎日処置した（１０ｍｇ／ｋｇ）。マウスを、０．１ｍｌコーン油中の１４Ｃ−コレステロール（１μＣｉ、０．１ｍｇ未標識コレステロール）および３Ｈ−シトスタノール（２μＣｉ）を用いて胃瘻栄養した。２日間糞便を回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｘｉｄｉｚｅｒ中での燃焼によって糞便の１４Ｃ−コレステロールレベルおよび３Ｈ−シトスタノールレベルを決定した。吸収されたコレステロールの分画は、二重糞便同位体技術によって評価した場合、固形飼料を給餌された野生型（＋／＋）とヘテロ接合体マウス（＋／−）とで同様であった。（ヘテロ接合体マウスは、１４Ｃ−コレステロールの用量の４６±５％を吸収し、そして年齢の対応する野生型マウスは、５１±３％を吸収した。）ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（−／−）は、１４Ｃ−コレステロールの１５．６±０．４％を吸収した。これは、最大有効用量のエゼチミブで処置された野生型マウス（１６．１±０．３％）と同様であり、野生型マウスと比較して６９％まで低下した（ｐ＜０．００１）。１０ｍｇ／ｋｇ／日でエゼチミブ処置されたＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトにおいては、コレステロール吸収は、未処置ノックアウトマウスにおいて見られた吸収と同様であった（未処置ノックアウトでの１５．６％±０．４％と比較して、エゼチミブ処置されたＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトで１６．２±０．６％）。したがって、コレステロール吸収の大部分はＮＰＣ１Ｌ１の存在に依存し、ＮＰＣ１Ｌ１を欠損したマウスにおける残りのコレステロール吸収は、エゼチミブ処置に非感受性である。これらの結果は、ＮＰＣ１Ｌ１が小腸腸細胞の取り込みおよびコレステロール吸収に関与すること、ならびにＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブ感受性経路にあることを示す。
（実施例２５：マウススクリーニングアッセイ（急性コレステロール吸収））
以下のスクリーニングアッセイは、サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在を同定するために用いられる。
ヘテロ接合体マウス（＋／）を交配することによってＮＰＣ１Ｌ１欠損（−／−）マウスを作製し、野生型（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）を得る。
第一の実験セットにおいて、非絶食マウス（６．５〜９週齢、１２９およびＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの混合）を計量し、グループ分けした（ｎ＝１〜４の−／−およびｎ＝１〜４の＋／＋）。１μＣｉ １４Ｃ−コレステロール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、［４〜１４Ｃ］コレステロール、ＮＥＣ−０１８）および０．１ｍｇキャリアコレステロール塊（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する０．１ｍｌコーン油（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、全ての動物を胃瘻栄養（給餌針、２４Ｇ×１インチ、Ｐｏｐｐｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）した。
実験の別のセットにおいて、１〜４匹の野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）を、マウスが、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験するためのサンプルをさらに与えられることを除いて、上記第一の実験セットにおけるマウスと同様に処置する。
２時間後、各マウスから心臓穿刺によって血液を採取した。肝臓を取り出し、計量し、そして３サンプルを２０ｍｌ計数バイアル中に配置した。組織を、１ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨで、６０℃で一晩消化した。組織消化物を、液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）の前に、２５０μｌの４Ｎ ＨＣｌの添加によって酸性化した。微量遠心機における１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって血漿を単離し、２つの１００μｌ血漿アリコートをＬＳＣにかけた。
コレステロール吸収は、この急性技術によって評価され、血漿中および肝臓中の放射性コレステロールの総量として表現される。サンプルを与えられた野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）における（上記の方法によって測定される）コレステロール吸収レベルが、サンプルを与えられなかった野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）におけるコレステロール吸収量より低い場合、この試験されたサンプルは、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含有すると決定される。
（実施例２６：マウススクリーニングアッセイ（糞便比法：コレステロール／シトスタノール）
以下のスクリーニングアッセイは、サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在を同定するために用いられる。
マウスにおけるコレステロール吸収を、Ａｌｔｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５８０（１）：７７−９３（２００２））によって記載されている二重糞便同位体比法によって決定する。
マウスの３つの群（ｎ＝１〜６／群）を構築した。２つの別個の群は、野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）を含み、一つの群は、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）を含む。
各群に、標準的げっ歯類用固形飼料を与え、そしていくつかの群においては、毎日処置する。マウスを、０．１ｍｌコーン油中の１４Ｃ−コレステロール（１μＣｉ、０．１ｍｇ未標識コレステロール）および３Ｈ−シトスタノール（２μＣｉ）を用いて胃瘻栄養する。１群のマウス（野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）を含む）に、サンプルをさらに与え、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験する。２日間糞便を回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｘｉｄｉｚｅｒ中での燃焼によって糞便の１４Ｃ−コレステロールレベルおよび３Ｈ−シトスタノールレベルを決定する。
サンプルを与えられた野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）における（上記の方法によって測定される）コレステロールおよび／またはシトスタノール吸収レベルが、サンプルを与えられなかった野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）におけるコレステロールおよび／またはシトスタノール吸収量より低い場合、試験されたサンプルは、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含有すると決定される。
本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本発明の種々の改変が、本明細書において記載されるものに加えて、上記から当業者に明らかとなる。このような改変が添付の特許請求の範囲に含まれることが、意図される。
特許、特許出願、刊行物、製品に関する文書、Ｇｅｎｂａｎｋ登録商標番号およびプロトコールは、本出願全体を通じて引用され、これらの開示は、本明細書において、あらゆる目的でその全体が参考として援用される。

Claims (49)

  1. 内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性変異を含む、変異トランスジェニックマウスであって、該マウスが、いかなる機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質も産生しない、マウス。
  2. 請求項１に記載のマウスであって、前記マウスが、低下した血清ステロールレベルもしくは５α−スタノールレベル、低下した肝臓ステロールレベルもしくは５α−スタノールレベル、またはステロールもしくは５α−スタノールの腸吸収の低下したレベルを示す、マウス。
  3. 請求項１に記載のマウスであって、前記欠失した内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１の領域が、配列番号４５に記載されるヌクレオチド配列のヌクレオチド７９０〜９９８に対応する、マウス。
  4. 請求項１に記載のマウスの子または子孫であって、該子または子孫が、該マウスの変異ＮＰＣ１Ｌ１対立遺伝子を受け継いでいる、子または子孫。
  5. 腸ステロール吸収アンタゴニストまたは腸５α−スタノール吸収アンタゴニストについてサンプルをスクリーニングするための方法であって、以下：
    （ａ）ステロールまたは５α−スタノールを含有する物質を、機能性ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を含む第１のマウスおよび第２のマウス、ならびに請求項１に記載の第３の変異マウスに給餌する工程；
    （ｂ）該サンプルを該第１のマウスに投与するが、該第２のマウスに投与しない工程；
    （ｃ）該第１のマウス、第２のマウスおよび第３のマウスの腸におけるステロールまたは５α−スタノールの吸収の量を測定する工程；ならびに
    （ｄ）該第１のマウス、第２のマウスおよび第３のマウスにおける腸ステロール吸収または５α−スタノール吸収のレベルを比較する工程、
    を包含し、ここで、該第１のマウスおよび第３のマウスにおける腸のステロール吸収または５α−スタノール吸収のレベルが、該第２のマウスにおける腸のステロール吸収または５α−スタノール吸収のレベルの量より少ない場合、該サンプルが、腸ステロールアンタゴニストまたは５α−スタノール吸収アンタゴニストを含むことが決定される、
    方法。
  6. 請求項５に記載の方法であって、前記ステロールが、コレステロールである、方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、前記コレステロールが、放射性標識されている、方法。
  8. 請求項５に記載の方法であって、前記ステロールまたは５α−スタノールコレステロールの吸収のレベルは、前記マウスにおける血清ステロールまたは５α−スタノールのレベルを測定することによって決定される、方法。
  9. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法によって同定された物質を被験体に投与することによって、被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール摂取または５α−スタノール摂取を阻害するための方法であって、該同定するための方法が、以下：
    （ａ）既知量の検出可能に標識されたエゼチミブの存在下で、細胞表面上に配列番号２、４および１２またはそれらの機能的フラグメントから選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する宿主細胞を、該アンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触させる工程；および
    （ｂ）該ポリペプチドに直接的または間接的に、特異的に結合された検出可能に標識されたエゼチミブの量を測定する工程、
    を包含し、
    ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に低下した、該ポリペプチドに対する検出可能に標識されたエゼチミブの直接的または間接的結合を測定することによって同定される、方法。
  10. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法によって同定された物質を被験体に投与することによって、被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール摂取または５α−スタノール摂取を阻害するための方法であって、該同定するための方法が、以下：
    （ａ）蛍光剤を含浸した複数の支持粒子を水性懸濁液中に配置する工程であって、配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞表面に発現する宿主細胞が、該支持粒子に結合されている、工程；
    （ｂ）該懸濁液に、放射標識されたエゼチミブおよび該アンタゴニストの存在を試験されるサンプルを添加する工程であって、ここで、該放射標識が、該エゼチミブが該ポリペプチドに直接的または間接的に結合する際に、該蛍光剤を活性化し得る放射エネルギーを発して、光エネルギーを生成するが、該ポリペプチドに直接的にも間接的にも結合していない放射標識化エゼチミブが、一般的に、該支持粒子から離れすぎて、放射性エネルギーが該蛍光剤を活性化し得ない、工程；ならびに
    （ｃ）該懸濁液中で該蛍光剤によって発せられる該光エネルギーを測定する工程、
    を包含し、ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に減少した光エネルギー放射を測定することによって同定される、
    方法。
  11. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法によって同定された物質を被験体に投与することによって、被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール摂取または５α−スタノール摂取を阻害するための方法であって、該同定するための方法が、以下：
    （ａ）配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞を、検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールと、そして該アンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該細胞中の検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールの量を測定する工程、
    を包含し、ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、該宿主細胞において、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に減少した検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールを測定することによって同定される、方法。
  12. 被験体に、請求項５に記載の方法によって同定された物質を投与することによって、該被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１媒介性ステロール摂取または５α−スタノール摂取を阻害するための方法。
  13. キットであって、以下：
    （ａ）薬学的投薬形態のエゼチミブ；および
    （ｂ）ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの標的であることを示す情報、
    を含む、キット。
  14. 前記投薬形態が、１０ｍｇエゼチミブを含む錠剤である、請求項１３に記載のキット。
  15. 薬学的投薬形態のシンバスタチンをさらに備える、請求項１３に記載のキット。
  16. 前記薬学的投薬形態のシンバスタチンが、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、または８０ｍｇのシンバスタチンを含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 前記薬学的投薬形態のシンバスタチンおよび前記薬学的投薬形態のエゼチミブが、単一の丸剤または錠剤で結合されている、請求項１５に記載のキット。
  18. 被験体において腸のステロールまたは５α−スタノールのレベルを減少させるための方法であって、該被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１の発現のレベルを減少させる工程を包含する、方法。
  19. 前記被験体が、マウス、ラットまたはヒトである、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１８に記載の方法であって、前記被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１の発現のレベルが、該被験体のＮＰＣ１Ｌ１を変異させることによって減少する、方法。
  21. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項１８に記載の方法。
  22. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
    （ａ）既知量の検出可能に標識された置換アゼチジノンの存在下で、配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞を、該アンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触さる工程；ならびに
    （ｂ）該ポリペプチドに直接的または間接的に特異的に結合された、検出可能に標識された置換アゼチジノンの量を測定する工程、
    を包含し、ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に減少した検出可能に標識された置換アゼチジノンの該ポリペプチドへの直接的または間接的結合を測定することによって同定される、方法。
  23. キットであって、以下：
    （ａ）薬学的投薬形態の置換アゼチジノン；および
    （ｂ）ＮＰＣ１Ｌ１が置換アゼチジノンの標的であることを示す情報、
    を含む、キット。
  24. 機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質をコードする遺伝子を欠く、単離された哺乳動物細胞。
  25. 内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性変異を含む変異マウスから単離された請求項２４に記載の細胞であって、該マウスが、いかなる機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質も産生しない、細胞。
  26. 請求項２５に記載の細胞であって、前記変異が、変異していない場合、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子の変異である、細胞。
  27. 十二指腸、胆嚢、肝臓、肝臓、小腸または胃の組織から単離されるかまたはこれらに由来する、請求項２４に記載の細胞。
  28. 腸細胞である、請求項２７に記載の細胞。
  29. 配列番号２および１２から選択されたアミノ酸配列の４２以上の連続したアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
  30. 配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  31. 請求項２９に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  32. 配列番号１、３および１１から選択されたヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  33. 請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  34. 請求項３３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  35. 配列番号２および１２から選択されたアミノ酸配列の４２以上の連続したアミノ酸を含むポリペプチド、または配列番号４のアミノ酸を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  36. 配列番号３９〜４２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  37. ポリペプチドが発現される条件下で、請求項３４に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ポリペプチドを作製するための方法。
  38. 前記ポリペプチドが培養物から単離される、請求項３７に記載の方法。
  39. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
    （ａ）既知量の検出可能に標識されたエゼチミブの存在下で、細胞表面上に配列番号２、４および１２またはそれらの機能的フラグメントから選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する宿主細胞を、該アンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触させる工程；および
    （ｂ）該ポリペプチドに直接的または間接的に、特異的に結合された検出可能に標識されたエゼチミブの量を測定する工程、
    を包含し、
    ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に低下した、該ポリペプチドに対する検出可能に標識されたエゼチミブの直接的または間接的結合を測定することによって同定される、方法。
  40. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
    （ａ）蛍光剤を含浸した複数の支持粒子を水性懸濁液中に配置する工程であって、配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞表面に発現する宿主細胞が、該支持粒子に結合されている、工程；
    （ｂ）該懸濁液に、放射標識されたエゼチミブおよび該アンタゴニストの存在を試験されるサンプルを添加する工程であって、ここで、該放射標識が、該エゼチミブを該ポリペプチドに直接的または間接的に結合する際に、該蛍光剤を活性化し得る放射エネルギーを発して、光エネルギーを生成するが、該ポリペプチドに直接的にも間接的にも結合していない放射標識化エゼチミブが、一般的に、該支持粒子から離れすぎて、放射性エネルギーが該蛍光剤を活性化し得ない、工程；ならびに
    （ｃ）該懸濁液中で該蛍光剤によって発せられる該光エネルギーを測定する工程、
    を包含し、ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に減少した光エネルギー放射を測定することによって同定される、
    方法。
  41. 請求項４０に記載の方法であって、前記蛍光剤が、イットリウムシリケート、イットリウムオキシド、ジフェニルオキサゾールおよびポリビニルトルエンから選択される、方法。
  42. 前記エゼチミブが、３Ｈおよび１２５Ｉから選択された放射標識で標識されている、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記エゼチミブが、３Ｈおよび１２５Ｉから選択された放射標識で標識されている、請求項４０に記載の方法。
  44. ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、以下：
    （ａ）配列番号２、４および１２から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞を、検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールと、そして該アンタゴニストの存在について試験されるサンプルと接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該細胞中の検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールの量を測定する工程、
    を包含し、ここで、該サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、該宿主細胞において、このようなアンタゴニストの非存在下で測定された場合と比較して、実質的に減少した検出可能に標識されたステロールまたは５α−スタノールを測定することによって同定される、方法。
  45. 前記ステロールまたは５α−スタノールが、３Ｈ、１４Ｃおよび１２５Ｉから選択された放射標識で検出可能に標識されている、請求項４４に記載の方法。
  46. 請求項４４に記載の方法であって、前記ステロールが、コレステロールである、方法。
  47. 請求項３９に記載の方法であって、前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞およびＣａｃｏ２細胞から選択される、方法。
  48. 請求項４０に記載の方法であって、前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞およびＣａｃｏ２細胞から選択される、方法。
  49. 請求項４４に記載の方法であって、前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞およびＣａｃｏ２細胞から選択される、方法。
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