JP2007513974A - プロテインキナーゼcのアイソザイム特異的アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アゴニストの生物学的作用をアンタゴニストへ変換する方法、特に、プロテインキナーゼCのアゴニストを、プロテインキナーゼCのアンタゴニストへ変換する方法に関する。本発明はまた、プロテインキナーゼCのアイソザイム特異的調節のためのペプチド組成物、およびプロテインキナーゼCの特定のアイソザイムの作用に拮抗する方法に関する。
プロテインキナーゼC(「PKC」)は、種々の細胞機能(細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性が挙げられる)に関するシグナル伝達において、重要な酵素である。PKCファミリーのアイソザイムとしては、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、このプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて、少なくとも3つのサブファミリーに分けられ得る。各々のアイソザイムは、アイソザイム固有(「可変」または「V」)ドメインが散在する、多くの相同(「保存」または「C」)ドメインを含む。「古典的」または「cPKC」サブファミリーのメンバー(αPKC、βIPKC、βIIPKC、およびγPKC)は、4つの相同ドメイン(C1、C2、C3およびC4)を含み、そしてカルシウム、ホスファチジルセリン、およびジアシルグリセロールまたはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。「新規」または「nPKC」サブファミリーのメンバー(δPKC、εPKC、ηPKC、およびθPKC)において、C2様ドメインは、C1ドメインの上位にある。しかし、C2ドメインは、カルシウムに結合せず、したがって、nPKCサブファミリーは、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、「異型」または「αPKC」サブファミリーのメンバー(ζPKC、およびλ/ιPKC)は、C2ドメインおよびC1相同ドメインの半分の両方を欠き、そしてジアセチルグリセロール、ホルボールエステルおよびカルシウムに、感受性である。
プロテインキナーゼC(PKC)アゴニストペプチドの少なくとも1つのアミノ酸を別のアミノ酸で置換して、(例えば、置換した位置における電荷を変化させることにより)ペプチドの電子分布を変更すること、そして/または、活性化Cキナーゼについてのレセプター(RACK)タンパク質にのそれぞれの上のプロテインキナーゼC結合部位内の配列に、このペプチドがより類似するように変更することは、PKC酵素の活性を阻害するために使用され得るPKCアンタゴニストを産生することが発見された。したがって、プロテインキナーゼCアゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼCアゴニストペプチド模倣物をプロテインキナーゼCアンタゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼCアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法が、提供される。1つの形態において、方法は、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも1つのアミノ酸を、PKCアゴニストペプチドまたはPKCアゴニストペプチド模倣物をPKCアンタゴニストペプチドまたはPKCアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する。本発明の特定の形態において、このペプチドアンタゴニストは、アンタゴニストが誘導されるアイソザイムの選択的インヒビターである。
本発明の原理の理解を進める目的のために、ここで、好ましい実施形態に対して参照がなされ、特定の用語が、同じものを記載するために使用される。それにもかかわらず、本発明の範囲が限定されないことが意図され、このような本発明の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書中に例示されるこのような本発明の原理のさらなる適用は、本発明に関する当業者に通常想像されるように企図されることが理解される。
(心筋細胞に対するN−ΨεRACKの効果)
(A.ペプチドの調製および細胞への送達)
以下のペプチドを、従来の技術により、合成し、そして精製した(95%より高く):
ΨεRACK(配列番号3、HDAPIGYD、εPKCアミノ酸残基85−92);
N−ΨεRACK(配列番号55、HNAPIGYD);
A−ΨεRACK(配列番号79、HAAPIGYD);
εV1−2(配列番号86、EAVSLKPT;εPKCアミノ酸残基14〜21、そして米国特許第6,165,977号に記載される);
ΨβRACK(配列番号7、SVEIWD、βPKCアミノ酸241−246)。
心筋細胞の収縮頻度の測定を、実質的に以前に記載されたとおりに実施した(Johnson,J.A.ら,J.Biol.Chem.271:24962−24966,(1996))。簡単に述べると、35mmプレート上で培養した心筋細胞を、37℃において、温度調節装置(Medical Systems Corp.)に置き、そして倒立顕微鏡(Carl Zeiss Inc.)のステージ上に配置した。1つの顕微鏡内の視野において、4つの細胞の収縮頻度を、2分間ごとに各々15秒間定量した。基底収縮頻度(約300ビート/分)は、長い時間にわたり、安定であった。
上記のように、配列番号1〜5により表されるペプチドを、合成し、そして精製した。詳細には、ΨεRACK(配列番号3、HDAPIGYD)、 N−ΨεRACK(配列番号55、HNAPIGYD)、A−ΨεRACK(配列番号79、HAAPIGYD);εV1−2(配列番号86、EAVSLKPT);ΨβRACK(配列番号7、SVEIWD)を、調製した。これらのペプチドを、改変しないか、あるいは、N末端Cys−Cys結合を介して、Drosophila Antennapediaのホメオドメイン由来のキャリアペプチド(配列番号81、C−RQIKIWFQNRRMKWKK)に架橋した。
(εPKCの転位に対するN−ΨεRACKの効果)
新生児ラットおよび成体ラットの心筋細胞における特異的PKCアイソザイムの転位を、以前に記載されたように(Johnson,J.A.およびMochly−Rosen,D.,Circ.Res.76:654−663,(1995))、処理した細胞の細胞質ゾル画分および粒子画分のウェスタンブロット分析(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)においてPKCアイソザイム特異的抗体を使用することにより、ペプチド処理後に、評価した。簡単に述べると、ペプチド処理後の細胞を、ホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εPKCでプローブし(図3A)、次にはがし、そして抗αPKCについて再度プローブした(図3B)。転位%(細胞内のPKCの全量にわたる、粒子画分中のPKCの量)を、図3A〜3Bのヒストグラムに示す。
ウェスタンブロット解析を使用して、εPKCの、細胞質ゾルから細胞下の粒子画分への転位(PKC活性化の特徴)を評価した。N−ΨεRACKペプチドまたはΨεRACKペプチドを、PMAの用量(1nM)の存在下にて、一過性の透過により細胞内へ導入した。実施例2に記載されるように、次いで、この細胞をホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εPKCでプローブした(図3A)。次いで、このブロットをはがし、図3Bに示されるように、抗αPKCで再度プローブした。転位%を、細胞のPKCの全量にわたる粒子画分のPKCの量として図3A〜3Bにヒストグラムで示す。ウェスタンブロットは、N−ΨεRACKが、PMAにより誘導される転位を阻害し、したがって、PMAおよびΨεRACKにより誘導されるεPKC転位のアンタゴニスト、そしてεPKC機能のアンタゴニストであることを示す(図2)。
(虚血からのΨεRACKに誘導される保護に対するN−ΨεRACKの効果)
心筋細胞を、以前に記載された(Chenら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96(22):12784(1999))とおりに、成体雄ラットから単離した。インキュベーション緩衝液中の筋細胞を、実施例1に記載されたように調製した、ペプチドまたはペプチドの組み合わせで、15分間処理した。次いで、筋細胞を、窒素で飽和した脱気したインキュベーション緩衝液中で、1分間1000rpmにてペレット化し、37℃にて3時間インキュベーションして虚血を刺激した。細胞の損傷を、トリパンブルーの除去により、3時間後に評価し、損傷を有する細胞%を、以前に記載された(Chenら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96(22):12784(1999))ように、決定した。
ΨεRACK(配列番号1)は、細胞に投与される場合、虚血に対する保護を与える(Dornら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96(22):12798(1999))。この実施例において、虚血エピソードに曝露された細胞に対するN−ΨεRACKの効果を、評価した。さらに、配列HAAPIGYD(配列番号3)を有するペプチドを(A−ΨεRACKと称される)を調製して、ΨεRACK(HDAPIGYD;配列番号3)におけるアスパラギン酸残基(D)の変化の効果を決定し、そこから、この残基が、アゴニストとしてのペプチドの作用に重要である場合、そのアラニン(A)(非荷電の、非極性アミノ酸)への置換により、ペプチドを不活性にさせるはずである。心臓の保護に対するこのペプチドの効果もまた、評価した。この実施例において記載されるように、心筋細胞を、虚血を刺激する前に、ΨεRACKペプチド、N−ΨεRACKペプチド、A−ΨεRACKペプチド、εV1−2ペプチド、およびこれらのペプチドの種々の組み合わせで処理した。虚血エピソードの刺激の後に、細胞損傷を、トリパンブルー色素排除により、評価した。結果を、図4に示す。
(異なるΨεRACKのεPKC変異体のプロテアーゼ分解に対する感受性)
ΨεRACKのD86部位が、RACK結合部位との分子内相互作用において、係合される場合、D(86)N変異体は、より閉じた状態(closed state)で存在し得、したがって、タンパク質分解により耐性である。対照的に、D(86)A変異体は、開いた立体配座を支持するはずであり得、したがって、タンパク質分解により感受性であるはずである。この仮説を試験するために、昆虫細胞内で発現されたεPKC Wtおよび変異体を、εPKCについて以前に示したように(Orr,J.W.ら,J.Biol.Chem.267:15263−15266(1992))、エンドペプチダーゼ(Arg C)によりタンパク質分解に供した。Arg Cによる分解を、全長εPKCの減少によりモニタリングした。
制限酵素を、New England Biolabsより得た。抗εPKC V5抗体を、Santa Cruz Biotechnologyより得た。
CHO−Hir細胞(BioImage A/S, Soeborg, Denmarkより好意で提供された)を、glutamax(Gibco−Brl)、10%ウシ胎仔血清(米国で認可された、Gibco−Brl)、および抗生物質(100単位/mlペニシリンおよび100μg/ml硫酸ストレプトマイシン、Gibco−Brl)を補充した、F−12(HAM)培養混合物の培地に維持した。MCF7細胞(James Ford,Stanford Universityからの贈与物)を、5% FBSおよび抗生物質を補充したRPMI 1640培地(Gibco−Brl)中に維持した。細胞を、37℃、5% CO2にて培養した。昆虫細胞を、26℃で増殖し、Sf9細胞を、10%ウシ胎仔血清(Gibco−Brl)および抗生物質を補充したSF900II SFM培地、Gibco−Brl)で培養した。Hi5昆虫細胞を、抗生物質を含有するInsect Xpress(Bio Whittaker)で培養した。
これらの研究において使用したEGFP−εPKC構築物は、BioImage A/S,Soeborg,Denmarkより好意で提供された。この構築物は、GenBank登録番号X65293で受託されたヒトεPKC配列と比較して、2つのアミノ酸置換(Q(34)AおよびS(336)G)を含んだ。このクローンの部位特異的変異誘発を、Quick Change特定部位変異誘発キット(Stratagene)を製造者の指示書に従って使用して実施した。この部位特異的変異誘発について使用したプライマーは:D(86)Nについて、順方向プライマー(5’−GTAGCCTATGGGGGCATTGTGAAAGACAGCCAG−3’)(配列番号87)、および逆方向プライマー(5’−CTGGCTGTCTTTCACAATGCCCCCATAGGCTAC−3’)(配列番号88)であった。D(86)Aについて、順方向プライマー(5’−CTGGCTGTCTTTCACGCTGCCCCCATAGGCTAC−3’)(配列番号89)、および逆方向プライマー(5’−GTAGCCTATGGGGGCAGCGTGAAAGACAGCCAG−3’)(配列番号90)であった。εPKC変異体を完全に配列決定し、XholおよびBamH1(New England Biolabs)部位に切断して、pEYFPC1およびpECFP C1(Clontech)に再度ライゲーションすることにより、サブクローン化した。バキュロウイルス発現系における発現について、GFP−εPKCを、XholおよびBamHIで切断して、インサートを放出し、Klenow(New England Biolabs)で満たし、そしてSmaI(New England Biolabs)で消化したpvL 1392(BD Biosciences)にクローン化した。これらの研究において使用した、PZeoSVへクローン化したヒトεRACK構築物は、BioImage A/S, Soeborg, Denmarkより好意で提供された。εRACKインサートを、Sca1(New England Biolabs)およびXho1で切断することにより放出し、Klenowで端部を平滑にし、そしてPacG3X(BD Biosciences)のSma1部位へ再度ライゲーションした。εRACKを、GST融合タンパク質として発現させた。
CHO−Hir細胞、MCF−7細胞およびHi5細胞のトランスフェクションを、FUGENE6(Roche)を使用して、製造者の指示書に従って、実施した。
バキュロウイルスを、Sf9細胞で産生し、全てのタンパク質を、Hi5細胞で発現した。全ての構築物の発現は、トランスフェクション後72時間で最適であった。感染されたHi5細胞を、ホモジナイズ緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM EDTA、10mM EGTA、0.25Mスクロース、12mM βME、およびプロテアーゼインヒビター:ロイペプチン(25μg/ml)、アプロチニン(25μg/ml)、PMSF(17μg/ml)、SBTI(20μg/ml)、E64(25μg/ml)(Sigma))で溶解した。49000gにて30分間スピン後に、可溶性画分を単離し、その上清を、さらに使用するまで、−20℃にて50%グリセロール中で保存した。
Arg C消化を、記載されるとおりに実施した(Orr,J.W.ら,J.Biol.Chem.267:15263−15266(1992))。約70ngのPKCを含有する粗昆虫細胞溶解物(標準(PKC(PanVera))とのウェスタンブロット比較により決定した)を、室温にて、20μlのエンドプロテイナーゼArg C(Boehringer Mannheim 25ユニット/ml)を含む520μlの20mM Tris(pH7.4)で消化した。アリコートを、8% SDS−PAGEゲル上で指定された時点において取り出し、次に抗εPKC抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
定量分析について、オートラジオグラフを走査し、そしてNIH画像化ソフトウェアを使用して定量した。吸光度データの分析を、MetaMorph(登録商標)(Universal Imaging Corporation)を使用して実施した。統計的有意差を決定するために、a1テイル2型のT検定(Microsoft excel)を使用した。時間の経過による曲線の有意差を、2つの様式のANOVA試験(Stat View(登録商標))を使用して決定した。
これらの実験条件下で、D(86)A変異体は、野生型(Wt)酵素を比較した場合に、Arg Cによる分解に対する酵素の感受性を変化しなかったが、D(86)N変異体は、D(86)AまたはWtのいずれよりも、タンパク質分解に対してより有意に耐性であった(図5A、B)。
(εPKC変異体のεRACKへの結合)
RACKは、活性なPKCに結合する(Mochly−Rosen,D.& Gordon,A.S.,FASEB J.12:35−42(1998);Mochly−Rosen,D.ら,Molec.Biol.Cell.(公式にはCell Regulation)1:693−706(1990)。ΨεRACKとRACK結合部位との間の分子内相互作用が、不活性な閉じた形態(closed form)を安定化する場合、この分子内相互作用の親和性の増加または減少は、酵素のそのRACKに対する結合能力において、対応する減少または増加を引き起こすはずである。不活性な閉じた形態を安定化する、本明細書中で提案されるΨεRACKとRACK結合部位との間の分子内相互作用の親和性の増加または減少が、酵素のそのRACKに対する結合能力において、減少または増加を引き起こすかどうかを試験するために、リン脂質(PL)アクチベーターの存在下および非存在下にて、昆虫細胞で発現するεPKC(WtおよびΨεRACK変異体)の免疫化されたGST−εRACKへの結合を、定量した。
εPKCまたはGST−εRACKのどちらかを発現する昆虫細胞を、実施例4に記載されるとおりに溶解した。GST−εRACK 10ngを、グルタチオン−セファロース4Bビーズ(bead)(Amersham−Pharmacia)に固定し、洗浄緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM EDTA、100mM NaCl、12mM βME、および0.1% TritonX−100)で、全体を洗浄した。次いで、固定したGST−εRACKを、リン脂質アクチベーター(PL)(1回の反応あたり12μgのホスファチジルセリン、1回の反応あたり400ngのSn−1,2ジオレオイルグリセロール)の存在下または非存在下にて、100ngのWt、D(86)A、またはD(86)N εPKCタンパク質を含有する昆虫細胞溶解物の可溶性画分とともに4℃にて1時間インキュベートした。洗浄緩衝液で全体を洗浄する際に、結合されたタンパク質を、SDS−PAGEサンプル緩衝液で溶出させ、タンパク質を、8% SDS−PAGEゲル上で分離した。εRACKと相互作用するεPKCの量を、抗εPKC−V5抗体を用いて、εPKCについてのウェスタンブロットプローブにより定量した。次いで、ブロットを、抗GST(Santa Cruz)で再度プローブ化し、等量のGST−εRACKが、各々の結合アッセイにおいて存在することを検証した。この実施例についての全ての他の方法を、例えば、実施例4に記載されるとおりに実施した。
PLアクチベーターの非存在下において、D(86)AεPKC変異体のεRACKへの結合は、D(86)NまたはWt酵素のいずれかの結合よりも、少なくとも2倍大きかった(図5C、D)。D(86)NおよびWt酵素のεRACKへの結合は、PLの存在下にて、有意に増加し、これに対して、D(86)A変異体のεRACKへの結合は、増加しなかった(図5C、D)。等しい濃度のPLの存在下にて、D(86)AまたはWtεPKCのいずれかよりも、D(86)NεPKCのεRACK結合は少なかった。これらの結果は、D(86)A変異体のεRACK結合部位は、εRACKへの結合についてすでに利用可能であるが、これに対して、この部位は、WtまたはD(86)NεPKCの両方で覆われ、活性化の際のみに、結合に対して接近可能である、という予測に一致する。
(細胞内のεPKCおよびεPKC変異体の転位の割合)
本明細書中に記載されるΨεRACK変異体およびWtεPKCのインビトロの研究は、ΨεRACKは、不活性な閉じた状態を安定化する分子内相互作用に関するという、本明細書中で提案された仮説を支持する。この仮説をさらに試験するために、刺激に対する応答において、細胞内のΨεRACK変異体およびWtεPKCの転位の割合を、試験した。転位プロセスの一部は、ΨεRACK部位と、εRACK結合部位との間の分子内相互作用の妨害を必要とする、と本明細書中で仮定した。この分子内相互作用の調節が、εPKCの転位の割合に影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、εPKC ΨεRACK変異体を、そのアミノ末端に、GFPタンパク質、CFPタンパク質またはYFPタンパク質を融合させ、そして、細胞分画法およびリアルタイム画像化法の両方により転位を分析した。
異なるεPKC変異体の基質をリン酸化する能力を、Kikkawa,U.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.135:636−643(1986)から改変された方法により、以下の[γ32P]ATPのミエリン塩基性タンパク質への取り込みによりアッセイした。ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を、液体シンチレーションによるか、または免疫沈降実験については、オートラジオグラフィーにより測定した。免疫沈降した酵素のキナーゼ反応について、ビーズを、20mM Tris(pH7.5)、一回の反応あたり0.3μCiの[γ32P]ATP(Amersham)、一回の反応あたり9μMのATP(Sigma)、一回の反応あたり12μgのミエリン塩基性タンパク質(Sigma)および一回の反応あたり50mM MgCl2からなる、20μlのキナーゼ反応緩衝液に再懸濁した。必要とされる場合、一回の反応あたり4μlのリン脂質を添加した。リン脂質を、上記のとおりに調製した。キナーゼ反応を、SDSサンプル緩衝液を用いて、煮沸して停止した。次いで、サンプルを12% SDS PAGEを進行させ、ニトロセルロースに移して、オートラジオグラフィーに曝露した。次いで、同じニトロセルロースを、抗εPKC(V5)抗体(Santa Cruz Biotechnology)で発展させて(develop)、免疫沈降した融合タンパク質の量を検証した。
トランスフェクションから24時間後の細胞を、以前に記載されたように(Schechtman,D & Mochly−Rosen,D.,Methods Enzymol.345:470−489(2002))、さらに24時間、血清を欠乏させ、そしてホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)(LC Laboratories)で、指定された時間および濃度で、室温にてインキュベートし、その後、分画した。PKCの分布を評価するために、異なる細胞画分を、SDS PAGEを進行させ、ウェスタンブロット分析に移し、そして抗εPKC V5抗体でプローブした。過剰発現したGFP−εPKCの溶解物を、約0.2μg/ウェルに希釈した。この濃度においては、内因性εPKCは、検出されなかった。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例4に記載されるとおりに実施した。
CHO細胞を、カバーガラス上で増殖させ、実施例4に記載されるように、血清を欠乏させた。各々の実験について、細胞を、市販の金属製カバーガラスホルダ(Molecular Probes)に移した。このホルダ内において、カバーガラスは、1ml浴の底部を構成した。次いで、培地を、細胞外緩衝液(120mM NaCl、5mM KCl、1.5mM CaCl2、1.5mM MgCl2、20mM HEPESおよび30mM グルコース)で置き換えた。細胞を、細胞外緩衝液中で、PMA(100nM)またはATP(1mM)のいずれかで、刺激した。GFPで標識した構築物の蛍光画像を、レーザー走査共焦点顕微鏡(Pascal,Zeiss)の、488nmの励起光線を使用して達成し、発光を、505〜550nmの帯域フィルタを通して収集した。細胞を、1.2開口数(NA)で40×Zeiss Plan−apo油浸対物レンズを使用して、倒立顕微鏡(Axiovert、100M)のステージ上で画像化した。CFPとYFPとの融合タンパク質の2色の画像化について、回転盤Nipkow共焦点顕微鏡を使用した。40×油浸Olympus対物レンズ(1.35NA)を有するOlympus IX70倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察し、CCDカメラ(Hamamatsu)および2×2ピクセルビニングで、画像を入手した。CFPを442nmのヘリウム−カドミウムレーザー(Kimmon)のレーザー光線で励起し、これに対して、YFPを、514nmのアルゴンイオンレーザー(Melles−Griot)の光線で画像化した。FRAP実験について、細胞質の局在領域のYFP標識タンパク質を選択的に光脱色する(photobleach)するために、514nmのEnterpriseレーザー(Coherent)の光線を、最大出力(約400mW)にて使用した。これらの実験について、60×油浸対物レンズ(1.4NA)を、使用した。これらの条件下で、そしてビーム経路に虹彩絞りを配置することにより、約35μm2を測定する細胞質の領域内において、500msのYFP蛍光の80%の脱色を可能にした。リアルタイム共焦点画像を、PMAを利用する実験について、20分間の間10〜15秒間ごとに入手し、ATPで刺激した細胞の場合においては、3分の全継続時間の間、5秒ごとに入手した。各々の時間の連続において、第5の画像の後に、試薬を、細胞チャンバに添加した。一般的な色素の光脱色レベルが10〜30%を超えないことを確認する実験において使用されたものと、同じ画像化条件を使用して、コントロール時間経過(control time lapse)を入手した。全ての画像を、室温で入手した。画像を12ビットまたは16ビットのファイルに書き出し、蛍光強度における変化を、MetaMorph(登録商標)データ分析ソフトウェア(Universal Imaging Corp.)を使用して測定した。PKCの転位をモニタリングするために、対象の小さな領域を、各細胞の細胞質内で選択し、蛍光強度値を、バックグラウンド値の減算後に、時間に対してグラフ化し、そして、正規化し、その結果、最初の蛍光値は、100%であった。3つの独立した実験からの10〜15個の細胞の平均を、使用した。統計学的有意性を決定するために、a1テイル2型のT検定(Microsoft excel)を使用した。
CHO−Hir細胞を、血清を含まない培地中で2回洗浄し、トランスフェクションから12〜24時間後に血清を枯渇させた。次いで、細胞を、血清を含まない培地中に約12時間維持し、その後、実験に供した。細胞を、ホモジネート緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM EDTA、10mM EGTA、0.25M スクロース、12mM β−メルカプトエタノール、PMSF(17μg/ml)、ダイズトリプシンインヒビター(SBTI)(20μg/ml)、ロイペプチン(25μg/ml)、アプロチニン(25μg/ml)、および0.1% Triton−X 100(Sigma))で溶解し、そして、1000×gで30分間遠心分離した。次いで、その上清を、免疫沈降実験のために使用した。免疫沈降を、抗GFPモノクローナル抗体3E6(Molecular Probes)を用いて、製造者の指示書に従って実施した。簡単に述べると、溶解物(約2mg/ml)を、プロテインGアガロースビーズ(25μlにパックされた容量、Invitrogen)中で、少なくとも30分間、前もって清澄化し、そして1000×gで回転した。次いで、この上清を、1μgの抗GFPモノクローナル抗体で、少なくとも2時間インキュベートした。次いで、プロテインGアガロースビーズ(25μlパックされた容量)を、溶解物−抗体複合体に添加し、少なくとも2時間インキュベートした(全てのインキュベーションは、4℃にて行った)。その後、ビーズを、緩衝液1(50mM Tris、0.15M NaCl、1mM EDTA、0.1% Triton X100、pH7.5)で3回、緩衝液2(50mM Tris、0.15M NaCl、0.1% Triton X100、pH7.5)で1回、そして緩衝液3(50mM Tris、0.1% Triton X100、pH7.5)で1回洗浄した。キナーゼアッセイについて、ビーズを、20mM Tris−HCl(pH7.5)でさらに1回洗浄した。
インビトロキナーゼアッセイにおいて、GFP融合タンパク質が、類似の触媒活性を有することは、最初に確認された。図6Aおよび図6Bに見られるように、免疫沈降したGFP−εPKC変異体は、活性化の際に、ミエリン塩基性タンパク質を同じ程度までリン酸化した。
(εPKC転位の数学的モデリングは、εPKC転位が、少なくとも2つの工程のプロセスであることを支持する)
異なるεPKC ΨεRACK変異体の転位の初期プロセスをさらに特徴付けるために、細胞質における蛍光の減少を、数学モデルに当てはめた。
数学的モデリングを、異なるεPKC ΨεRACK変異体の類似のレベルを発現する細胞のデータから、得た。非線形最小二乗回帰分析を、EViewソフトウェア(QMS)を使用して実施し、微分方程式分析を、Berkeley MadonnaTMを使用して実施した。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例4および実施例6に記載されるとおりに実施した。
2.I(t)=C1+C2e(−C3(t))+C4e(−C5(t))
D(86)A εPKC変異体の転位プロセスについて、一次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ(図8A)および二次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ(図8B)を、図8A〜図8Dに示す。D(86)NおよびWt εPKCについての残差分析は、同様の結果を示した(データは示さず)。より小さく、かつより等しく分布した誤差を有する優れたフィットを、二次の指数方程式で得たことから、2工程のモデルを採用して、εPKC転位の最初のプロセスを例示した。第1の工程は、εPKCが開くこと(opening)およびΨεRACKとεRACK結合部位との間の分子内相互作用の崩壊であり、第2工程は、εPKCの膜への結合である(この場合、膜への結合とは、脂質またはタンパク質のいずれかへの結合であり得る)。このプロセスは、以下のとおりに記載される:
C1の値は、安定状態の細胞質ゾルεPKCのレベルに対応する。次に、この値は、D(86)AならびにWt εPKCのC1およびC3について得た値が、統計学的に等しいかどうか、という仮説を決定する。WALDパラメータ検定を使用して、そしてF検定およびχi−Squared検定を使用して、それぞれ、0.9および0.7のp値を得た。したがって、AおよびD、C1についての安定状態レベルは等しいと、仮定した。また、第2工程(膜への結合)は、εRACK εPKC変異体の間で異なるはずはなく、これは、C3が、Wt εPKCとD(85)A εPKCとの両方で等しいと想定した。したがって、安定状態レベル(C1)は、D(86)A εPKCおよびWt εPKCについて等しく、そして第2工程(膜への結合)もまた等しい場合、D(86)AおよびD(86)A εPKCの両方についてのk−1(εPKCの閉じる速度)が無視できることは、もっともらしい。k−1が無視できる場合、以下の方程式(3−5)が適用でき、そしてk−2(方程式6)およびk2を計算するために使用され得る(表1)。
4.C3=(k2+k−2)
5.C5=k1
6.k−2=[(C1/100)(C3]
I0(t)が、時間(t)において細胞質内の閉じたεPKCの濃度に等しい場合、I1(t)が、時間(t)において細胞質内の開いたεPKCの濃度に等しい場合I2(t)が、時間(t)において膜でのεPKCの濃度に等しい場合、そしてI(t)が、時間(t)(I0(t)+I1(t))において細胞質内の開いたεPKCおよび閉じたεPKCの濃度に等しい場合、以下の微分方程式(7−9)が、このモデルを記載するために使用され得る。
8.dI1(t)/dt=−(K−1+K2)l1(t)+(K1)(I0(t))+(K−2)(I2(t))
9.dI2(t)=−(K−2)(I2(t))+(K2)(I1(t))。
(同じ細胞内でのD(86)A ΨεRACK変異体およびWtεPKCの同時のトランスフェクション)
1つの細胞内で、εPKC変異体の挙動をさらに調査するために、2つの異なるεPKC構築物を、YFPまたはCFPのいずれかに融合させて、CHO細胞内へ同時にトランスフェクトした。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例4、実施例6および実施例7に記載されるとおりに実施した。
YFP−AおよびCFP−D εPKCを、同様のレベルで同時に発現する代表的な細胞を、図9Aに示す。PMAを用いた刺激の際に、D(86)A変異体は、Wt酵素より早く転位した(図9A)。細胞質において蛍光強度の減少を表す、定量分析を、図9Cに示す。D(86)A変異体を、PMA刺激から1.5分後に、細胞末梢にて見出し、それに対して、WtεPKCの転位は、10分後においてさえも最小限であった(図9A)。したがって、D(86)A ΨεRACK変異体およびWtεPKCが、同じ細胞内にある場合でさえも、D(86)Aは、Wt εPKCより早く転位した。
(Gタンパク質共役レセプターによる細胞刺激の際のΨεRACK εPKC変異体の転位速度)
次に、PMAではなく、レセプターのシグナル伝達を介して、転位を刺激する場合に、異なるεPKCの転位速度における差異も観察されるかどうかを、決定した。ATPを、事前に使用して、プリン性Gタンパク質共役レセプターを刺激することにより、CHO細胞中のPKCを活性化した(Maasch,C.ら,FASEB J.14:1653−1663(2000))。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例4、実施例6および実施例7に記載されるとおりに実施した。
ATPを用いた刺激の際に、GFP−εPKCの細胞末梢への転位は、PMAにより誘導される転位よりも速いことが、本明細書中で見出された(図9Bに対して、図7A〜図7C)。D(86)AおよびWt εPKCの転位は、刺激から10秒後にすでに明らかであるが、D(86)N εPKC酵素の転位は、刺激の40秒後におこり、D(86)AまたはWt εPKCのいずれかよりもより有意に高いレベルで安定な状態に到達した(図9B)。細胞質の蛍光強度の減少で表す定量分析を、図9Dに示す。
(εPKC ΨεRACK変異体の拡散速度)
異なる転位速度は、細胞のεPKCの全体的な移動(拡散)における差異を反映し得る。したがって、細胞質酵素の光脱色後の蛍光強度の回復(FRAP)を測定した;εPKCの移動を、脱色した領域において蛍光を回復するのに必要な時間をモニタリングすることにより、測定した。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例4、実施例6および実施例7に記載されるとおりに実施した。
シグナル伝達において重要な要素は、細胞外刺激の非存在下において酵素が不活性なままである、固有の機構である。この機構は、活性部位が曝露されない閉じた立体配座を安定化する、分子内相互作用の使用に関する。刺激の際に、酵素は、開いた立体配座を採用し、これにより、分子内相互作用は中断されて、開いた形態を安定化する分子間相互作用のための結合部位が曝露され、触媒的に活性な酵素をもたらす。PKCの場合において、分子間相互作用部位は、リン脂質およびアンカータンパク質のための結合部位である(Mochly−Rosen,D & Gordon,A.S.FASEB J.12:35−42(1998);Oancea,E.ら,J.Cell.Biol.140:485−498(1998))。本明細書中で、εRACK結合部位およびΨεRACK部位との間の分子内相互作用における変更は、酵素の転位速度に影響を及ぼし、さらに、εPKCの転位およびシグナル伝達におけるこの分子内相互作用の役割を補助することが実証される。
3つの基準を使用して、εPKC内の分子内相互作用におけるΨεRACK部位の役割、およびこの相互作用におけるD86の役割を実証した。第1の基準は、プロテアーゼに対する酵素の感受性であった;開いた酵素は、活性化後のプロテアーゼ分解により感受性であった(Orr,J.W.ら,J.Biol.Chem.267:15263−15266(1992))。D(86)N変異体は、タンパク質分解により耐性であり;D(86)N変異体は、D(86)A酵素またはWt酵素のいずれかと同じ程度の分解について2倍の時間を必要とすることが、本明細書中で示された(図5)。したがって、D(86)N変異体は、より閉じているか、または不活性な酵素である。A変異体のタンパク質分解に対する感受性は、野生型D(86)εPKCと同じであったことから、この変異体は、野生型酵素と立体配座的に異なるかどうかは、この方法をもちいては、決定できなかった。
細胞内相互作用におけるΨεRACK部位の重要な役割を実証する、第3の基準は、細胞の活性化の際に、酵素の転位速度を試験した。D(86)A εPKC変異体は、細胞分画研究により測定すると、D(86)NまたはWt εPKCのどちらかよりも、有意に早く転位した。リアルタイム共焦点顕微鏡法を使用して、D(86)A変異体は、野生型εPKCよりも速く転位し、次に、D(86)N変異体よりも速く転位することを、本明細書中で実証した。同時に、ΨεRACK部位は、刺激の非存在下において、εPKCの閉じた立体配座を安定化する、重要な分子内相互作用を媒介するようである。
Claims (34)
- プロテインキナーゼC(PKC)アゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼC(PKC)アゴニストペプチド模倣物を、PKCアンタゴニストペプチドまたはPKCアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法であって、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも1つのアミノ酸を、PKCアゴニストペプチドまたはPKCアゴニストペプチド模倣物をPKCアンタゴニストペプチドまたはPKCペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する、方法。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記荷電アミノ酸がアスパラギン酸であり、前記非荷電アミノ酸がアスパラギンである、請求項2に記載の方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドは、古典的PKCアゴニスト、新規なPKCアゴニストまたは異型のPKCアゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドが、εPKCアゴニストペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記εPKCアゴニストペプチドが、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するΨεRACKペプチドである、請求項5に記載の方法。
- 前記εPKCアゴニストペプチドは、配列番号12;配列番号20;配列番号16;または配列番号21に示されるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記PKCアンタゴニストペプチドは、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;または配列番号57に示されるアミノ酸配列を有するεPKCアンタゴニストペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドが、εPKCアゴニストペプチドであり、前記少なくとも1つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- プロテインキナーゼC(PKC)酵素の活性を阻害する方法であって、該酵素を、PKCインヒビターペプチドまたはPKCインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、該ペプチドは、PKCアゴニストペプチドまたはPKCアゴニストペプチド模倣物由来であり、ここで該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも1つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な別のアミノ酸で置換される、方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドが、前記PKC酵素のΨ−RACK配列由来である、請求項10に記載の方法。
- 前記Ψ−RACK配列が、ΨεRACK配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼCが、εPKCであり、前記PKCアゴニストペプチドが、前記PKC酵素のΨ−RACK配列の誘導体である、請求項10に記載の方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するΨεRACKアゴニストペプチドである、請求項13に記載の方法。
- 前記PKCアゴニストペプチドは、配列番号12;配列番号16;配列番号20;または配列番号21に示されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の方法。
- 請求項13に記載の方法であって、前記PKCアゴニストペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するΨεRACKペプチドであり、前記PKCインヒビターペプチドは、配列番号3とは異なるアミノ酸配列を有し、該配列において、前記少なくとも1つのアミノ酸残基は、該少なくとも1つのアミノ酸と比較して電荷が低い別のアミノ酸で置換される、方法。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸は、負に荷電し、前記別のアミノ酸は、非荷電である、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸が、アスパラギン酸であり、前記別のアミノ酸が、アスパラギンである、請求項17に記載の方法。
- 前記PKCインヒビターペプチドは、配列番号55に示されるアミノ酸配列を有する、請求項16に記載の方法。
- 前記PKCインヒビターペプチドは、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;または配列番号57に示されるアミノ酸配列を有する、請求項10に記載の方法。
- PKCアンタゴニスト活性を有するペプチドを含むペプチドであって、該ペプチドは、PKCアゴニストペプチド由来であり、ここで該アゴニストペプチド中の少なくとも1つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドをアンタゴニストペプチドへ変換するのに十分である別のアミノ酸で置換される、ペプチド。
- 前記PKCが、εPKCであり、前記PKCアゴニストペプチドが、εPKCアゴニストペプチドである、請求項21に記載のペプチド。
- 前記ペプチドは、配列番号55に示されるアミノ酸配列を有する、請求項22に記載のペプチド。
- 前記アゴニストペプチドは、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;または配列番号57に示されるアミノ酸配列を有する、請求項21に記載のペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸は、置換された位置において、電荷の変化を提供するアミノ酸で置換され、請求項21に記載のペプチド。
- PKC拮抗活性を有するペプチドであって、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;または配列番号57に示されるアミノ酸配列を有する、ペプチド。
- 処置方法であって、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;または配列番号57に示されるアミノ酸配列、あるいはこれらの組み合わせを有する治療有効量のεPKCアンタゴニストペプチドを、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記処置は、εPKCにより調節される疾患または状態のためのものである、請求項27に記載の方法。
- 前記疾患または状態は、線維症疾患または炎症性疾患である、請求項28に記載の方法。
- 前記線維症疾患は、強皮症、肝線維症、または肺線維症である、請求項29に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は、自己免疫疾患または肺疾患である、請求項29に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、ギャン−バレー症候群、乾癬、グレーブス病、慢性関節リウマチ、およびI型真性糖尿病である、請求項31に記載の方法。
- 前記肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患またはぜん息である、請求項31に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は、敗血症性ショックまたは炎症性腸疾患である、請求項29に記載の方法。
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