KR20090037498A

KR20090037498A - 포스포리파제 Ｄ와 랩터의 상호작용에 의해 ｍＴＯＲ활성을조절하는 방법

Info

Publication number: KR20090037498A
Application number: KR1020097004570A
Authority: KR
Inventors: 류성호; 서판길; 하상훈; 김도형; 김일신; 김정환; 이미남; 이현주; 김종헌; 장승기; 이태훈
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2009-04-15
Also published as: WO2008016281A1; US20100184636A1; US8278263B2

Abstract

본 발명은 mTOR과 복합체를 발생시키는 포스포리파제 디(phospholipase D, PLD) 활성을 조절함으로써 포유류 라파마이신의 표적(mammalian target-of-rapamycin, mTOR)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 또한 mTOR 억제제를 선별하는 방법 및 mTOR를 억제함으로써 mTOR과 관련된 대사질환의 치료용 조성물 및 치료방법에 관한 것이다.

포스포리파제 디, PLD, 랩터, mTOR

Description

포스포리파제 Ｄ와 랩터의 상호작용에 의해 ｍＴＯＲ활성을 조절하는 방법{METHOD OF REGULATING MAMMALIAN TARGET-OF-RAPAMYCIN ACTIVITY BY INTERACTION BETWEEN PHOSPHOLIPASE D AND RAPTOR}

본 발명은 mTOR과 복합체를 생성시키는 포스포리파제 D(phospholipase D, PLD) 활성을 조절함으로써 포유류 라파마이신 표적(mammalian target-of-rapamycin, mTOR)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 또한 mTOR 억제제를 선별하는 방법 및 mTOR를 억제에 의한 mTOR과 관련된 대사질환의 치료 방법 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 출원은 2006년 8월 4일자로 출원된 미국 가출원 제60/821,535호를 우선권으로 주장하고, 본 명세서에 포함된 것과 같이 모든 목적을 위해 참조로서 포함한다.

mTOR은 세린/트레오닌 단백질 키나아제이며, 촉매 도메인의 서열 유사성을 근거로 PIKKs(PI 3-kinase related kinases)라고 불리는 신호 단백질(signaling proteins)의 신규한 상과(superfamily)에 속한다. 상기 mTOR 경로는 최근 대두된 암, 당뇨병, 및 비만 치료의 새로운 표적이다. 나아가 최근 많은 연구에서 상기 mTOR이 소선충(C. elegans) 및 초파리의 수명 조절의 매개체로써의 역할을 할 수 있음을 증명하였다. 그러나 그 다양한 생물학적 과정에서 상기 경로가 중요함에도 불구하고, 상위 신호 (upstream signals)에 의한 그 조절 기작은 여전히 밝혀지지 못하고 있다.

또한, mTOR은 그 활성을 위해 포스파티드산(phosphatidic acid, PA)을 필요로 한다. 상기 포스파티드산은 PLD의 효소 산물이다. 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)을 가수분해하여 포스파티드산을 생산하는 상기 PLD는 또 다른 지류(branch)의 mTOR 상위 조절인자를 구성하며 이를 통해 상기 mTOR 경로에서 분열신호가 촉발된다. 지금까지 PLD1 및 PLD2로 확인된 포유류의 PLD 아이소자임(isozyme)은 신경전달물질, 호르몬 및 성장인자와 같은 다양한 신호들을 감지하여, 증식, 분비, 호흡급증(respiratory burst) 및 액틴 세포골격 재구성등과 같은 복합적인 생리적인 사건들을 조절한다.

본 발명자들은 mTOR 신호 조절 기작과 관련된 연구를 하여, 분열촉진인자(mitogen)로 야기된 포스파티드산 생산 및 그 작동체인 mTOR과의 물리적/기능적 관계를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다(도 21 참조).

(발명의 요약)

본 발명의 일 측면은 PLD, 랩터(raptor) 및 mTOR의 기능적/물리적 관계 및 상기 mTOR 활성을 활성화시키는 PLD/랩터/mTOR 복합체의 형성 기작을 밝히는 것이다.

상기한 것을 근거로, 본 발명의 또 다른 일 측면은 PLD와 랩터의 상호작용을 조절하여 랩터를 통한 PLD와 mTOR 복합체 형성을 조절함으로써 mTOR 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 조절방법은 PLD와 랩터의 상호작용을 억제하여 랩터를 통한 PLD 및 mTOR 복합체 형성을 억제하여 mTOR 활성을 억제하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 활성 억제제를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 상기 mTOR 억제제를 선별하는 방법은

샘플세포에 후보화합물(candidate compound)을 접촉하는 단계;

PLD/랩터/mTOR 복합체를 형성하기 위한 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용을 검사하는 단계; 및

랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용 수준 또는 상기 복합체의 형성 수준이 상기 화합물을 접촉하지 않은 다른 샘플 세포와 비교할 때 감소하는 경우 상기 화합물을 mTOR 억제제로써 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR과 관련된 대사질환의 치료제를 선별하기 위한 표적으로써 서열번호 4의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 상기 mTOR과 관련된 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합(tuberous sclerosis complex)을 포함한 과오종 증후군(hamartoma syndrome), 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등을 포함할 수 있다.

나아가 본 발명의 다른 측면은 mTOR 활성을 억제함으로써, 보다 구체적으로 PLD2와 랩터의 상호작용을 억제함으로써 랩터를 통한 PLD2 및 mTOR의 복합체(PLD/랩터/mTOR complex) 형성을 억제하여 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 mTOR과 관련된 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합을 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등을 포함할 수 있다.

(기술적 해결방법)

하기 본 발명의 상세한 설명을 참조하면 본 발명을 더 잘 이해할 수 있으며 동시에 본 발명의 보다 완전한 이해와 그것의 수반된 많은 이점이 쉽게 분명해 질 것이다.

본 발명자들은 PLD2가 신규한 랩터 결합 파트너임을 확인하고, 분열촉진물질(mitogen)로 조절되는 mTOR 신호에서 PLD2가 중요한 분자적 연결고리임을 제안하고, 상기 PLD2가 대사질환의 치료를 위해 표적이 될 수 있는 신규한 조절점(regulatory point)임을 제안하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 mTOR 신호의 조절 기작을 연구하여, 세포 증식의 적절한 제어를 위하여 상위 신호에 대응하는데, 랩터와 GβL을 함유하는 mTOR 복합체((mTOR/raptor))가 관여하고 액틴 세포골격의 제어를 위해서는 릭터(rictor)와 GβL을 함유하는 다른 mTOR 복합체(mTOR/rictor)가 관여함을 밝혔다(Kim, D.H., Sarbassov, D.D., Ali, S.M., Latek, R.R., Guntur, K.V., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Sabatini, D.M. Mol. Cell 11 (2003) 895, 참조로써 본 명세서에 삽입함). 상기 상위 신호는 인슐린, 영양원(nutrient), 및/또는 분열촉진인자(mitogens)에서 유래될 수 있다. mTOR 복합체와 상위 조절인자간의 기능적 관계뿐만 아니라 물리적 관계를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

또한 본 발명에서, 분열촉진인자로 유도되는 mTOR 활성에 어떤 이소자임이 주로 관여하는지를 연구하여, PLD2가 mTOR/랩터에 세포분열촉진신호(mitogenic signaling)을 도입하는 중요한 이소자임인 것을 밝히고 또한 PLD2 및 mTOR/랩터 간의 복합체 형성을 통하여 mTOR 활성이 이루어짐을 밝혔다. 결국 본 발명은 분열촉진인자로 유도되는 포스파티드산과 그 작동인자(effector)인 mTOR간의 물리적/기능적 관계를 제안하여 암, 당뇨병 및 비만과 같은 mTOR 관련 대사질환을 더 잘 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 PLD2가 분열촉진인자로 유도되는 mTOR 활성의 매개체로서 기능할 수 있음을 제안한다. 나아가 본 발명에서, PLD2가 TOS 모티프 유사서열을 통해 랩터에 결합함과(도 21), 분열촉진인자로 유도되는 PLD2-랩터의 상호작용에 의해 mTOR 주변에 포스파티드산이 축적되어 포스파티드산-의존적 mTOR 활성이 이루어짐으로써 S6K1, 4EBP1 등과 같은 mTOR 작동인자(effectors)의 인산화가 일어나게 된다는 것을 밝혔다.

정의

본 발명에서 'mTOR'이라는 용어는 포유류 라파마이신의 표적(mammalian target-of-rapamycin)을 말한다. 본 발명에서 mTOR은 인간을 포함하는 모든 포유류로부터 유래된 것일 수 있으며, 유래 종(source species)에 따른 그 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서 상기 mTOR은 예를 들어, Homo sapiens(NP 004949) 등의 모든 포유동물, Drosophila melanogaster(NP524891), Caenorhabditis elegans(Q95Q95) 등으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 인간의 mTOR을 사용할 수 있다.

본 발명에서 'PLD'는 포스포리파제 D(phospholipase D)를 말하며, 포유류의 PLD 아이소자임(isozymes)은 PLD1 및 PLD2와 같은 클래스들을 포함한다. 본 발명에서 PLD는 인간을 포함한 포유류로부터 유래된 것일 수 있으며, 유래 종(source species)에 따른 그 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 PLD1(예, Rattus norvegicus에서 유래된 NM 030992) 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 PLD2(예, 인간에서 유래된 NM 002663)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 'PA'라는 용어는 PLD의 효소 산물인 포스파티드산(phosphatidic acid)을 말한다. mTOR은 활성화를 위해 지질 2차 전령물질(lipid second messenger)인 포스파티드산을 필요로 한다.

본 발명에서 'TOR 신호 모티프 유사서열'(TOR signal(TOS) motif-like sequence)은 실제로 랩터(raptor)에 결합하여 기능하는 mTOR의 상위 또는 하위 조절인자의 아미노산 서열을 말한다. 본 발명의 일 구체예에서, PLD2의 TOS 모티프 유사서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 '랩터'(raptor)는 mTOR의 조절-관련 단백질을 말한다. 본 발명에서, 랩터는 인간을 포함한 모든 포유류에서 유래된 것일 수 있으며, 유래 종(source species)에 따른 그 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 랩터는 인간에서 유래된 것일 수 있으며, 서열번호 5(Accession No. Q8N122)의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 측면은 PLD, 랩터 및 mTOR간의 기능적/물리적 관계 및 mTOR 활성의 활성화를 위해 PLD/랩터/mTOR 복합체를 형성하는 기작을 밝히는 것이다.

상기한 것을 기초로, 본 발명의 다른 측면은 PLD2와 랩터의 상호작용을 조절하여, 랩터를 통한 PLD2 및 mTOR 복합체(PLD/랩터/mTOR complex) 형성을 조절함으로써 mTOR 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 조절하는 방법은 mTOR 활성을 억제하기 위해, PLD 및 랩터의 상호작용을 억제하여 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 복합체 형성을 억제하는 단계를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 PLD 및 랩터의 상호작용을 억제하여 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 복합체(PLD/랩터/mTOR 복합체, 도 24) 형성을 억제함으로써 mTOR을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 PLD/랩터/mTOR 복합체 형성을 억제하는 것은 랩터에 결합할 수 있는 PLD, 특히 PLD2 결합 도메인 (PLD 또는 PLD2의 랩터 결합 도메인)을 비활성화 시키거나, PLD, 특히 PLD2에 결합할 수 있는 랩터 결합 도메인(랩터의 PLD- 또는 PLD2 결합 도메인)을 비활성화 시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 PLD의 랩터 결합 도메인은 TOR 신호(TOS) 모티프 유사서열을 포함할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 PLD는 PLD2일 수 있으며, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인은 50 내지 200개의 아미노산, 더 바람직하게는 100 내지 180개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있으며, 필수적으로 PLD2의 PH 도메인, 더 바람직하게는 TOS 모티프 유사서열의 하나인 FEVQV(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 일 구체예에서, PLD2의 랩터 결합 도메인은 PLD2의 전장 아미노산 서열(서열번호 2)에서 186번부터 308번까지의 아미노산 잔기를 포함한다.

상기 PLD의 랩터 결합 도메인 비활성화는 랩터 결합 도메인의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 PLD의 랩터 결합 도메인 변형은 상기 TOS 모티프 유사서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을 결실(deletion)시키는 것일 수 있다. 한편, 상기 PLD의 랩터 결합 도메인 변형은 상기 TOS 모티프 유사서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을, 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 다른 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다. 한편, 상기 PLD의 랩터 결합 도메인 변형은 TOS 모티프 유사서열, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열에 한 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 한 개 이상의 아미노산을 추가하는 것일 수 있다.

상기 랩터의 PLD 결합 도메인은 랩터의 전장 아미노산 서열(서열번호 5)에서 1020번부터 1335번까지의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 랩터의 PLD 결합 도메인 비활성화는 상기 랩터 결합 도메인의 아미노산 서열을 필수적으로 구성하는 폴리펩티드 단편을 결실시킴으로써 수행될 수 있다.

한편, 상기 PLD의 랩터 결합 도메인 비활성화는 PLD2의 랩터 결합 도메인 또는 랩터의 PLD2 결합 도메인 등의 pH 또는 온도 변화에 의해 수행될 수 있다.

상기 PLD2 및 랩터의 상호작용은 영양원(nutrient) 수준, 바람직하게는 아미노산 수준, 더 바람직하게는 루신(leucine) 수준에 의해 조절되어, 상기 상호작용은 고 영양상태에서 안정화되고 저 영양상태에서 약화된다. 따라서 PLD2 및 랩터의 상호작용은 영양원(nutrient) 수준, 바람직하게는 아미노산 수준, 더 바람직하게는 루신(leucine) 수준을 감소시킴으로써 억제될 수 있다.

본 발명에 따른 mTOR를 억제하는 방법으로, S6K1(ribosomal protein S6 kinase 1; 예, NP 003152, NP 082535, etc.), 및 4EBP1(4E-binding protein-1; 예, NP 004086)로 구성된 그룹에서 선택된 한 개 이상의 mTOR 작동인자(effector)에 대한 mTOR의 인산화 활성을 억제하게 된다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 활성의 억제제를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 mTOR 억제제를 선별하는 방법은

샘플세포에 후보화합물(candidate compound)을 접촉하는 단계;

복합체를 형성하기 위한 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용을 검사하는 단계; 및

PLD 및 mTOR의 상호작용 수준이 상기 화합물을 접촉하지 않은 다른 샘플 세포와 비교할 때 감소하는 경우 상기 화합물을 mTOR 활성 억제제로써 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 샘플 세포는 PLD, 더 바람직하게는 PLD2, 발현이 가능한 모든 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 샘플 세포는 인간 태아 신장 세포(HEK293), 인간 상피성 난소암 세포(OVCAR-3), COS7 세포, 인간 자궁 경부암 세포(HeLa), 인간 결장암 세포(PC-3), 인간 유방암 세포(MB231), 인간 간암 세포(HepG2), 인간 유방암 세포(MCF-7) 및 인간 T 세포 백혈병(Jurkat) 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 상기 mTOR 억제제는 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합을 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등과 같은 mTOR 관련 대사질환의 치료용으로 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 본 발명의 방법은 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합체를 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등과 같은 mTOR 관련 대사질환의 약제를 선별하는데 사용될 수 있다.

상기 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용은 이에 한정되지 않으나 공지된 방법, 예를 들어 면역침전 방법에 따라 탐지될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 관련 대사질환의 치료제를 선별하기 위한 표적으로써 서열번호 4의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 상기 mTOR 관련 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합을 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 다른 측면은 mTOR 활성을 억제함으로써, 보다 구체적으로 PLD2 및 랩터의 상호작용을 억제하여, 랩터를 통한 PLD2 및 mTOR 복합체(PLD/랩터/mTOR complex) 형성을 억제함으로써 mTOR 관련 대사 질환의 치료용 조성물 및 치료방법을 제공하는 것이다. 상기 치료방법은 PLD의 랩터 결합 도메인을 비활성화하여 랩터를 통한 PLD 및 mTOR 복합체 형성을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. PLD의 랩터 결합 도메인의 비활성화하는 앞서 기술한 바와 같다. 한편, 상기 치료방법은 유효성분으로 mTOR 억제제를 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 mTOR 억제제는 본 발명에 따른 선별 방법으로 선별될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로 mTOR 억제제를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 mTOR 억제제는 PLD가 랩터에 결합하는 것을 방해하는 활성을 가지고 있어, 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 복합체 형성을 억제하는 물질일 수 있다. 상기 mTOR 억제제는 앞서 기술한 다양한 방법으로 PLD의 랩터 결합 도메인을 비활성화시킬 수 있는 물질일 수 있다. 한편 상기 mTOR 억제제는 본 발명에 따른 선별 방법으로 선별된 화합물일 수 있다.

상기 mTOR 관련 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합을 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등을 포함할 수 있다.

복합체 형성을 통해 포스파티드산의 형태와 같은 분열촉진 신호를 감지한다는 점에서, 이는 신속하고 특이적으로 반응할 수 있는 효과적인 수단임이 분명하다. 나아가, KSR로 매개된 MAPK 조절(Raabe, T., Rapp, U.R. Science's STKE (2002) http://www.stke.org/cgi/content/full/sigtrans;2002/136/pe28, 참조로써 본 명세서에 삽입)에서 예시된 것과 같이, 골격단백질(scaffold proteins)에 의해 다수의 단백질이 조화롭게 조직화된다는 것은 신호 전달 효율과 특이성에 중요하다. Ras의 키나제 억제인자인 KSR은 골격 단백질로 기능하여 국소화된 신호전달 복합체에서 MAPK 경로에 참여하는 구성인자들이 결합할 수 있도록 한다. 골격(다시 말해, 랩터)과 상위 조절인자(다시 말해, PLD2)의 상호작용은 국소화된 mTOR 신호 전달 복합체에 중요한 것 같다. 이는 하위 작동인자(다시 말해, S6K1 및 4EBP1)도 mTOR 복합체에 위치하기 위해 동일한 골격(다시 말해, 랩터)을 이용하기 때문이다. 나아가 mTOR뿐만 아니라 다양한 단백질이 포스파티드산과 상호작용할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 흥미롭게도, 본 발명에서는 mTOR과 같은 다른 포스파티드산 결합 단백질을 조절하는데 있어서, PLD2의 신규한 역할이 조사되었다.

S6K1 및 4EBP1은 유사한 방법으로 랩터와 상호작용하기 위해 그들의 TOS 모티프를 사용하므로 랩터와 결합하기 위해 서로서로 경쟁한다(도 6 참조). 그럼에도 불구하고, 본 발명에서 PLD2는 TOS 모티프 유사서열을 가지고 있음에도 불구하고 S6K1 또는 4EBP1와 랩터를 공유하고 있음을 밝혔다. 본 발명은 랩터의 PLD2 결합 위치가 C-말단에 WD40 반복을 포함하는 전장 랩터(서열번호 5)의 1020-1335번까지의 아미노산임을 알아내었다(도 11 참조). PLD2가 랩터에 결합하기 위해 C-말단의 WD40 도메인을 선호하는 이유는 명확하지 않다. PLD2가 상기 도메인과 상호작용하는 추가적인 결합 모티프를 가지고 있을 가능성은 있다.

비록 HEK293 세포에서 PLD2뿐만 아니라 PLD1의 과발현으로 mTOR 경로가 활성화되지만, mTOR은 아마 Cdc42/S6K1 신호전달을 통해 단지 PLD2와 상호작용을 하는 것 같으며, 이는 mTOR 경로에서 PLD1-의존적 활성에 대한 대체 경로(alternative pathway)임을 의미한다. 상기와 같은 결과는 또한, mTOR 신호전달에서 PLD1을 침묵시켜 발생하는 효과는 별로 크지 않고 포스파티드산 치료에 의해 완전히 회복되는 반면, mTOR 신호전달에서 PLD2의 효과는 외인성 포스파티드산 치료에 의해 회복되지 않아, PLD1 및 PLD2간에 분명한 차이가 있음을 증명해 준다. 나아가 PLD1이 phosphoinositide 4-phosphate 5 키나제를 통해 PLD2에 신호를 보내기 때문에 PLD2는 PLD1의 통제하에 있을 수 있다.

세포의 영양상태에 의해 상기 mTOR 경로가 조절되는 분자적 기작에 대한 지식 그리고 상기 경로의 어떤 손상이 암, 당뇨병, 비만, 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome), 코우덴 병, 결절경화증 복합을 포함한 과오종 증후군, 심장 비대증을 포함한 조직/장기 비대증 등과 같은 대사질환을 일으키는지에 대한 지식이 엄밀히 요구된다. 본 발명의 발견은 상기와 같은 지식을 수득하기 위한 초석이 될 수 있다. mTOR 경로의 Rheb로 매개된 조절을 결정함으로써 이것이 입증될 수 있다. Rheb와 PLD2의 상호작용은 영양이 충분한 상태에서 안정화된다. 또한 랩터와 PLD2의 상호작용은 양이 충분한 상태에서 안정화된다. 상기 두 가지의 상호작용은 영양원으로 유도된 mTOR 활성을 위한 조절점이라고 생각될 수 있다. 분자적 기작을 확인함으로써 어떤 영양원이 mTOR 복합체에 영향을 미치는지에 대한 중요한 이해를 제공할 수 있다.

전립선 암 및 유방암을 포함한 다양한 암 조직 및 종양에서 포스파티드산 생산이 증대되는 것으로 보고되고 있다. 대부분의 경우에, 이는 PLD의 과발현과 일치한다. 그러나 이것이 어떻게 종양발생과 관련이 있는지에 대한 기작은 아직 밝혀지지 못하고 있다. 본 발명자가 mTOR 신호전달에서 PLD2의 역할을 확인함으로써 PLD2로 매개된 종양발생의 가능한 분자적 기작이 제안된다.

도 1은 다양한 PLD 1 또는 PLD 2 knock-down 세포에서의 S6K1 및 4EBP1의 인산화에 대한 전기영동 결과를 보여준다.

도 2는 포스파티드산이 외인성(exogenously)으로 첨가된 경우, 다양한 PLD 1 또는 PLD 2 knock-down 세포에서의 S6K1의 인산화에 대한 전기영동 결과를 보여준다.

도 3은 COS7 세포에서 PLD2, mTOR 및 랩터의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 4는 재조합 mTOR 및 PLD 1 또는 PLD 2의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 5는 PLD2와 사이트 맵핑 분석을 위하여 PLD2의 N-말단이 절단된 단편의 모식도를 보여준다.

도 6은 다양한 TOS 모티프 패턴과 그것의 다양한 변이체에 대한 전기영동 결과를 보여준다.

도 7은 랩터와 PLD 1 또는 PLD2의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 8은 트리톤 X-100 또는 CHAPS 용해 상태에서 PLD2와 랩터 간의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 9는 mTOR, PLD2 및 랩터의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 10은 PLD2의 다양한 TOR-유사 서열에 따른 PLD2 및 랩터의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 11은 랩터 또는 사이트 맵핑 분석을 위해 랩터의 절단된 단편의 모식도를 보여주며, 또한 PLD2 및 다양한 랩터의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 12는 랩터에 대한 PLD2, S6K1 및 4EBP1의 상호작용에 있어서 우선순위를 보여준다.

도 13은 랩터를 통한 PLD2와 S6K1 또는 4EBP1의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 14는 다양한 PLD2의 TOR-유사서열에 따른 PLD2 및 S6K1 또는 4EBP1의 상호작용에 관한 전기영동 결과를 보여준다.

도 15는 TOR-유사서열에서 PLD2 점 돌연변이에 따른 PBt 형성 결과를 보여준다.

도 16은 TOR-유사서열에서 PLD2 점 돌연변이에 따른 S6K1 인산화 결과를 보여준다.

도 17은 TOR-유사서열에서 PLD2 점 돌연변이에 따른 mTOR 키나아제 활성을 보여준다.

도 18은 mTOR-랩터 상호작용으로부터 수득한 전기영동 결과를 보여준다.

도 19는 PLD knock-down 세포에서 분열촉진인자(mitogen)-의존적 S6K1 인산 화를 보여준다.

도 20은 TOR-유사서열에서 PLD2 점 돌연변이에 따른 분열촉진인자(mitogen)-의존적 S6K1 인산화를 보여준다.

도 21은 루신이 존재 또는 부존재하는 경우 PBt 형성 수준을 보여준다.

도 22는 루신이 존재 또는 부존재하는 경우, COS7 및 HEK293 세포에서 항- mTOR 항체를 사용한 IP 분석 결과를 보여준다.

도 23은 루신 처리 후 HA-raptor^wt/PLD2^wt 형질감염체(transfectant)에서 웨스턴 블랏 분석 결과를 보여준다.

도 24는 PLD2/raptor/mTOR 복합체의 모식도이다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 구체적으로 설명된다. 그러나 상기 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

< 실시예 1>

재료의 제조

하기 실시예에서 사용된 재료는 다음과 같다:

ECL(enhanced chemiluminescence) 키트와 3H-DPPC(dipalmitoylphosphatidyl [methyl-³H]choline)을 Amersham Biosciences에서 구입하였다. HRP가 결합된 염소 항-토끼 IgG 및 염소 항-마우스 IgA, IgM, 및 IgG를 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.(Gaithersburg, MD)에서 구입하였다. 다클론 항체는 종래 문헌(Lee, T. G., Park, J. B., Lee, S. D., Hong, S., Kim, J. H., Kim, Y., Yi, K. S., Bae, S., Hannun, Y. A., Obeid, L. M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1347 (1997) 199, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바와 같이 PLD에 대하여 생성되었따. mTOR, pS6K1 (pThr 389), S6K1, p4EBP1(pThr 37/46), 및 4EBP1와 라파마이신은 Dr. David M. Sabatini (MIT, 미국)로부터 수득하였다. 단백질 A-Sepharose는 RepliGen(Needham, MA)에서 구입하고 CHAPS는 Sigma에서, DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 LipofectAMINE은 Invitrogen에서 구입하였다. C-6 포스파티드산은 Avanti에서 재조합 4EBP1은 Stratagen에서 구입하였다. 다른 언급이 없다면 하기 실시예에서 사용된 세포와 벡터는 Invitrogen에서 구입하였다.

< 실시예 2>

플라스미드의 제조

PLD1^wt, PLD2^wt, PLD2^DN184, PLD2^DN308, 및 PLD2^K758R의 포유류 발현 벡터를 종래 문헌(Park, J.B., Kim, J.H., Kim, Y., Ha, S.H., Yoo, J.S., Du, G., Frohman, M.A., Suh, P.G., Ryu, S.H. J. Biol. Chem. 275 (2000) 21295; Kim, J.H., Kim, J.H., Ohba, M., Suh, P.G., Ryu, S.H. Mol. Cell. Biol. 25 (2005) 3194; Lee, J.S., Kim, J.H., Jang, I.H., Kim, H.S., Han, J.M., Kazlauskas, A., Yagaisawa, H., Suh, P.G., Ryu,S.H. J. Cell Sci. 118 (2005) 4405, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바와 같이 사용하였다. HA-mTOR^wt, myc-mTOR^wt, myc-raptor^wt, HA-raptor^wt 및 HA-raptor^194YDC ^/ ^AAAmt 의 발현벡터를 Dr. David M. Sabatini(MIT)로부터 수득하였다(Kim, D.H., et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell 110, 163-175 (2002), 본 명세서에 참조로 포함). PLD2에 TOS-모티프 변이를 유도하기 위해, 야생형 PLD2를 포함하는 pCDNA3.1(+)/PLD2를 하기 올리고머(oligomers)를 사용하여 PCR로 증폭하였다; 센스 (5’GGC CGA GAC CAA GTT TGT TAT CGC3’ 서열번호: 6), 안티센스 (F265A:5’CCA TCG ATC CGC ACG CCG TGC CGT GCC TCC GTG CTC CTT TTC CCC ACT TGC ACC TCA GCG CCA GG3’ 서열번호: 7), 안티센스 (E266R:5’CCA TCG ATC CGC ACG CCG TGC CGT GCC TCC GTG CTC CTT TTC CCC ACT TGC ACC CTA AAG CCA GG3’ 서열번호: 8). PCR로 증폭된 DNA 단편과 pCDNA3.1(+)/PLD2(WT)을 XhoI 및 ClaI로 처리하였다.

< 실시예 3>

RNA 간섭

Dharmacon Research, Inc.(Lafayette, CO)가 각 쌍의 21-뉴클레오티드 센스 및 안티센스 RNA 올리고머를 합성하여 결합(anneal)하였다. 서열번호 9의 센스(5'- AAG AGG UGG CUG GUG GUG AAG-3') 및 서열번호 10의 안티센스(5'-CUU CAC CAC CAG CCA CCU CUU-3')를 상기 PLD2의 올리고뉴클레오티드로 사용하였으며 상기 올리고뉴클레오티드는 인간의 PLD2를 코딩하는 뉴클레오티드 703-723에 대응한다. 또한 서열번호 11의 센스(5'-AAG GUG GGA CGA CAA UGA GCA-3') 및 서열번호 12의 안티센스(5'-UGC UCA UUG UCG UCC CAC CUU-3')를 상기 PLD1의 올리고뉴클레오티드로 사용하였으며 상기 올리고뉴클레오티드는 인간의 PLD1a를 코딩하는 뉴클레오티드 1455-1475에 대응한다. NCBI 데이터베이스에서 BLAST를 이용하여 모든 siRNA 서열을 분석하여 오직 PLD2 서열과 완전히 일치하는 서열을 알아내었다. Luciferase GL2 duplex를 Dharmacon Research, Inc에서 구입하여 음성 대조군으로 사용하였다. PLD2 침묵(silencing)에 대한 추가실험을 위해, 인간의 PLD2 cDNA(PLD2의 뉴클레오티드 703-723; AAGAGGTGGCTGGTGGTGAAG; 서열번호: 13)의 3개 잔기를 PLD2^wt의 추가 변이를 위해 AAGAGATGGCTAGTAGTGAAG로 대체하였다(Kim, J.H., Kim, J.H., Ohba, M., Suh, P.G., Ryu, S.H. Mol. Cell. Biol. 25 (2005) 3194, 본 명세서에 참조로 포함). 상기 변이는 침묵변이(silencing mutations)이다. 상기 유전자를 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1(Invitrogen)에 서브클론하고 제한효소 KpnI 및 XbaI로 절단하였다. 상기 변이를 뉴클레오티드 서열 분석을 통해 확인하였다.

< 실시예 4>

세포 배양 및 플라스미드/ siRNA 형질감염

COS7 세포(ATCC, CRL-1651)를 37℃, 5% CO₂의 습한 공기에서 보관하고, 10% 우아혈청(HyClone)이 추가된 DMEM에서 배양하였다. HEK293 세포(ATCC, CRL-1573) 및 OVCAR-3 세포(ATCC, HTB-161)를 10% 우아혈청(HyClone)이 추가된 DMEM에서 배양하였다. 조직배양접시에서 배양된 세포들을 종래 문헌(Kim, J.H., Kim, J.H., Ohba, M., Suh, P.G., Ryu, S.H. Mol. Cell. Biol. 25 (2005) 3194 및 Lee, J.S., Kim, J.H., Jang, I.H., Kim, H.S., Han, J.M., Kazlauskas, A., Yagaisawa, H., Suh, P.G., Ryu,S.H. J. Cell Sci. 118 (2005) 4405, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바와 같이 LipofectAMINE을 사용하여 일시적으로 형질감염하였다. 형질감염후 24시간 동안 상기 세포들이 재조합 단백질을 발현하도록 하고, 추가 24시간 동안 혈청을 제거하였다. 상기 세포들을 면역침전(co-immunoprecipitation) 분석에 사용하였다. siRNA로 넉다운(knockdown)시키기 위해, 세포를 혈청을 제거하기 전 36-48시간 동안 배양하였다.

< 실시예 5>

면역침전법( Co - immunoprecipitation )

COS7 세포를 수집한 후, 모든 추출물을 용해 버퍼 (ice-cold lysis buffer; 40mM HEPES pH7.5, 120mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM pyrophosphate, 10mM glycerophosphate, 50mM NaF, 1.5mM Na₃VO₄, 0.5% CHAPS, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktails)에서 간단히 초음파 처리하였다. 정제된 추출물을 2 mg의 각 항체들로 혼합하였다. 이후 상기 항체 복합체를 분리하기 위해 단백질 A-Sepharose beads를 추가하였다. 용해 버퍼로 4번 세척한 후, 최종 면역 침전물을 워시 버퍼(50mM HEPES pH7.5, 150mM NaCl)로 한번 수세하고 Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech), 니트로셀룰로스막(Watmann), 전원공급장치 (Amersham Pharmacia Biotech), Electrophoretic Transfer unit(Hoefer Scientific Instruments), 및 ECL^TM (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다.

< 실시예 6>

웨스턴 블랏 분석

단백질을 8-16%의 구배 겔상에서 SDS-PAGE로 분리하고 상기 분리된 단백질을 니트로셀룰로스막으로 옮겨 5% 탈지분유가 함유된 TTBS 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 7.6, 150mM NaCl, 및 0.05% Tween-20)로 블랏하였다. Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech), 니트로셀룰로스막 (Watmann), 전원공급장치 (Amersham Pharmacia Biotech), Electrophoretic Transfer unit (Hoefer Scientific Instruments), 및 ECL^TM (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 상기 SDS-PAGE를 수행하였다. 그리고 나서, 상온에서 4시간 동안 제조자가 지시한 농도로 1차 항체와 함께 상기 세포막을 배양하였다. 결합하지 못한 항체를 TTBS 버퍼로 수세하였다. 그 후에 세포막을 상온에서 1시간 동안 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 함께 배양하고 TTBS 버퍼로 5번 수세하고 ECL 시스템을 사용하여 현상하였다.

< 실시예 7>

PLD 분석 ( In vivo )

종래 문헌(Lee, J.S., Kim, J.H., Jang, I.H., Kim, H.S., Han, J.M., Kazlauskas, A., Yagaisawa, H., Suh, P.G., Ryu,S.H. J. Cell Sci. 118 (2005) 4405, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바와 같이 포스파티딜-부탄올(phosphatidyl-butanol) 형성을 측정함으로써 체내 PLD 활성을 분석하였다. 요약하면, 세포를 8시간 동안 [³H]myristic acid (2mCi/ml)로 로드하고 DMEM으로 2번 수세하였다. 기본적인 PLD 활성을 측정하기 위해 표지된 세포를 10분 동안 0.4% 부탄올로 배양하였다. 모든 지질을 1.2 ml의 메탄올:1M NaCl: 클로로포름(1:1:1부피비)으로 추출하고 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography)으로 분리하였다. 세포 표지 효율성 차이(cell labeling efficiency differences)를 나타내기 위해 생성된 [³H]포스파티딜-부탄올 양을 총 [³H]지질의 퍼센트로 표현하였다.

< 실시예 8>

mTOR 활성을 위한 키나제 분석 ( In vitro )

종래 공지 문헌(Kim, D.H., Sarbassov, D.D., Ali, S.M., King, J.E., Latek, R.R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Sabatini, D.M. Cell 110 (2002) 163, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바와 같이, 재조합 myc-mTOR을 표지된 단백질로 표현하고, 항-myc 항체로 면역침전 분석을 실시하였다. 체내 키나제 분석의 기질로 재조합 4EBP1(Stratagen)을 사용하였다. 항-포스포-4EBP1 항체(포스포-37/46)를 사용하여 활성을 측정하였다. 25mM Hepes pH7.4, 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 4mM MnCl₂, 20% 글리세롤, 2mM DTT, 0.1mM ATP, 1mg 4EBP1가 함유된 혼합 버퍼를 사용하여 표지된 면역침전물로 상기 키나제 분석을 수행한 다음 15분 동안 30℃에서 배양하였다.

< 실시예 9>

PLD2 에 의한 mTOR 활성의 조사

PLD는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 가수분해하여 포스파티드산을 생성하고 이러한 과정은 하나의 연결고리를 이루며 이를 통해 분열촉진 신호가 상기 mTOR 경로에 작용한다. 그러나 세포에서 포스파티드산이 mTOR을 활성화 시키는 기작에 대해서는 여전히 밝혀지지 않고 있다. 이러한 과정을 좀더 살펴보기 위해, 본 실시예에서는 HEK(human embryonic kidney) 293 세포, 인간 난소암에서 유래된 OVCAR-3 세포, 및 원숭이 상피 COS7 세포에서 아이소자임-특이적 siRNAs를 사용하여 mTOR 활성에 대한 2개의 포유류 PLD 아이소자임인, PLD1 및 PLD2의 효과를 비교 하였다.

상기 실시예 3 및 실시예4 에 기재된 바와 같이, 리포펙타민(lipofectamine)을 사용하여 PLD1 또는 PLD1에 대한 siRNAs를 HEK293, OVCAR-3, 및 COS7 세포에 각각 형질감염시켰다. 36시간 후에 상기 세포에서 24시간 동안 혈청을 제거하고 난 다음, 상기 기재한 것과 같이 CHPAS를 함유한 용해버퍼(Sigma)에 용해시켰다. 루시퍼라제에 대한 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다. 액틴에 대하여 동등한 단백질 로딩을 확인하였다. 이후, 상기 세포에서 S6K1 및 4EBP1 인산화를 관찰하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 기재된 바와 같이, PLD1 넉다운과 비교할 때 PLD2 넉다운으로 기존에 알려진 mTOR 작동자인 S6K1 및 4EBP1의 인산화가 현저히 감소되었다. 상기 결과를 통해 PLD가 mTOR 활성에 필수적인 역할을 함을 알 수 있었다.

다음으로, PLD2가 넉다운된 세포에서 외인성 포스파티드산으로 mTOR 신호방해를 해소할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 또 다른 실험을 수행하였다. 리포펙타민을 사용하여 HEK293 및 COS7 세포를 특정 siRNAs으로 형질감염하였다. 36시간 후에 세포에서 24시간 동안 혈청을 제거하였다. 이후, 증류수에 용해된 100mM의 C-6 포스파티드산을 30분 동안 처리하였다. 상기 처리결과 생성된 용해물을 SDS-PAGE하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.

본 발명자들은 mTOR 활성에서 PLD2 역할이 오직 포스파티드산 생산에 한한다면, PLD2 발현에도 불구하고 외부에서 포스파티드산의 추가로 mTOR 신호전달이 완전히 회복될 것으로 생각하였다. 그러나 도 2에 나타낸 바와 같이, 포스파티드산이 PLD2가 넉다운된 HEK293 및 COS7 세포에서 S6K1 인산화를 촉진할 수 없음을 알 수 있었다. 요약하면, siRNA을 이용한 PLD의 이소자임 특이적 넉다운을 통해, mTOR 신호전달에서 PLD2가 심오한 역할을 하며 포스파티드산 생산과 함께 mTOR 신호전달을 활성화시키는 또 다른 기작을 가지고 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 10>

PLD2 의 TOS 모티프 유사서열을 통한 mTOR 과 PLD2 의 복합체 형성

본 실시예에서는 PLD2가 발현되지 않는 경우, 포스파티드산이 더 이상 mTOR을 활성화 시킬 수 없는 이유를 연구하였다. 한 가지 가능성은 mTOR 복합체 부근에 PLD2가 근접하는 것에 관련이 있다. 포스파티드산은 막 이동성을 제한할 수 있는 긴 아실 사슬(acyl chain)을 함유한다; 더욱이 포스파티드산은 일과성 화학종(transient species)이다. 이러한 포스파티산의 특징을 통해 본 발명자들은 mTOR이 PLD 부근에 위치하여 상위 신호에 따라 생산된 포스파티드산을 탐지할 수 있다고 생각하였다; 더욱이 상기와 같은 가능성을 통해 mTOR 복합체와 PLD간의 물질적인 연결이 존재할 수 있다고 생각하였다.

상기와 같은 가능성을 시험하기 위해, 항-mTOR 항체로 내인성 mTOR을 면역침전하였다. Triton X-100 또는 CHPAS를 사용하여 다양한 용해 조건으로 COS7 세포 용해물(10mg)을 제조한 다음, 상기 실시예 1 내지 5에 기재한 것과 같이 항-mTOR 항체에 대해 면역침전(co-immunoprecipitation) 분석을 실시하였다. 상기 실시 결과 생성된 면역침전물로 SDS-PAGE를 실시하였다. 상기 실시 결과를 도 3(화살표는 블랏된 단백질의 위치를 지시함)에 기재하였다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 COS7 및 HEK293에서의 면역침전물은 내인성 PLD2를 함유함을 알 수 있었다. mTOR 및 PLD2간의 상호작용은 mTOR-랩터 상호작용과 유사하게 Triton X-100에는 민감하지만, CHAPS를 함유하는 용해 조건에서는 안정됨을 알 수 있었다.

나아가, 상시 실시예 1 내지 5에 기재된 바와 같이, 상기 myc-mTOR 및 PLD1 또는 PLD2을 과발현하는 COS7 세포 용해물을 항-myc 항체로 면역침전(co-immunoprecipitate)하고 항-PLD 항체로 면역블랏하였다. 상기 수득한 SDS-PAGE 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 PLD2는 또한 재조합 mTOR과 복합체를 형성하고 이러한 상호작용은, 재조합 PLD1의 경우 mTOR과 상호작용을 하지 않기 때문에, PLD2에 특이적임을 알 수 있었다. 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템에서 hPLD2를 발현하고 바큘로바이러스가 감염된 Sf9 세포(Invitrogen)의 계면활성제 추출물로부터 크로마토그래피(chelating Sepharose affinity column chromatography)를 이용해 그 발현물을 정제함으로써 재조합 PLD2를 제조하였다. 상기 재조합 myc-mTOR를 발현하고 항- myc 항체로 면역침전하였다.

mTOR 과 상호작용을 담당하는 PLD2 부위를 동정하기 위하여, N-말단이 절단된 PLD2 단편을 종래 문헌(Park, J.B., Kim, J.H., Kim, Y., Ha, S.H., Yoo, J.S., Du, G., Frohman, M.A., Suh, P.G., Ryu, S.H. J. Biol. Chem. 275 (2000) 21295, 본 명세서에 참조로 포함)에 기재된 바에 따라 제조하고 사이트-맵핑 분석에 사용하였다. 상기 과정은 결국 PLD2에서 PH 도메인을 포함하는 부위를 동정하는 것이다(i.e., a.a.185-308). 수득한 PLD2의 개략도를 도 5 상단에 나타내었으며, 이는 전체 PLD2에 대한 PLD2의 N- 말단이 절단된 단편의 개략도를 보여주는 것이다. 이후, myc-mTOR^wt을 특정 PLD2 단편으로 형질감염하고 면역침전 분석을 상기와 같이 실시하였다. 그 실시 결과를 도 5의 하단(IP; 면역침전, T.Lys.; 총 용해물)에 기재하였으며 이는 야생형 PLD2 또는 ΔN184 PLD2(N-말단의 184번째 아미노산 잔기가 결손)을 사용할 때, mTOR 면역침전이 발생하지만, ΔN308 PLD2를 사용한 경우 그렇지 않음을 보여준다. 이러한 사실로부터 PLD2의 랩터 결합 부위는 185 및 308 아미노산 잔기 사이에 존재함을 알 수 있었다.

흥미롭게도, PLD1이 아닌 PLD2에서 상기 부위가 FEVQV(a.a. PLD2의 265-269; 서열번호: 4)를 함유하는 것으로 발견되었다. 상기 FEVQV는 S6K1 및 4EBP1에 모두 존재하는 TOS 모티프 형태로 랩터를 통해 mTOR과 결합할 수 있도록 한다(도 6 상단; 인간의 S6K1 및 4EBP1의 TOS 모티프를 인간/래트/마우스(human/rat/mouse) PLD2의 추정된 TOS 모티프와 비교하였다. 인간/래트/마우스에서 일치하는 부위를 나타내고 차이를 표시하기 위해 별표를 사용하였다). 따라서 점변이(point mutants), PLD2^F265A 및 PLD2^E266R를 제조하고 mTOR과 그들이 결합하는지를 탐지하였다. 특정 PLD2 변이들로 myc-mTOR를 발현시키고 그 결과 생성된 용해물을 면역침전 분석에 사용하였다. 상기 기재한 항-랩터 다클론 항체로 내인성 랩터를 면역 블랏하였다. 그 결과를 도 6의 하단에 나타내었다. 상기 PLD2의 점변이는 모두 mTOR과의 상호작용을 방해함을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 상기 잔기들이 PLD2-mTOR 결합에 중요하고 S6K1 및 4EBP1에서 발견된 것과 같이 TOS 모티프를 구성할 수 있 음을 입증해 주었다.

< 실시예 11>

랩터를 통한 mTOR 과 PLD2 의 복합체 형성

mTOR은 포유류 세포에서 2가지 단백질 복합체로 존재한다. 다시 말해, 세포 증식과 관련된 mTOR은 랩터와 협력하여 기능하는 반면, 세포 골격을 조직화하는 것과 관련된 mTOR은 rictor/mAVO3와 협력하여 기능한다. PLD2의 TOS 모티프 유사서열과 관련한 실시예 10의 발견으로 PLD2가 랩터와 상호작용함으로써 mTOR과 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다. 본 실시예는 PLD2가 랩터에 결합함으로써 mTOR과 복합체를 형성할 수 있는지 여부를 실험한 것이다.

상기 기재한 바와 같이, myc-랩터는 PLD1 또는 PLD2와 함께 COS7 세포안으로 발현된다. Triton X-100을 함유하는 용해 조건을 사용하여 용해 산물을 제조하고 이를 대상으로 면역침전 분석을 실시하였다. 상기 실시 결과를 도 7에 기재하였다. HA-랩터 및 PLD2를 발현시켜 다른 계면활성제, Triton X-100 및 CHAPS 함유하는 용해 버퍼에 용해시킨 다음, 이를 대상으로 면역침전 분석을 실시하였다. 내인성 mTOR을 항- mTOR 항체로 블랏하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. PLD2를 HA-raptor^wt 또는 HA-raptor^194YDC ^/ ^AAAmt로 발현시키고 그 용해 산물을 항- HA 항체로 면역침전시켰다. 면역블랏을 통해 결합한 mTOR 및 PLD2을 검출하였다. 상기 결과를 도 9에 나타내었다. HA-랩터는 COS7 세포안으로 특정 PLD2 컨스트럭트로 발현되었다. 세포를 Triton X-100을 함유하는 용해 버퍼로 용해시키고 항- HA 항체를 이용하여 면역침전 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 10에 기재하였다.

본 실시예에서는, 1) 재조합 PLD2가 Triton X-100의 용해 조건에서 조차 특이적으로 재조합 랩터와 상호작용한다(도 7); 2) PLD2와 랩터의 상호작용은 Triton X-100에 영향을 받지 않으며(도 8), 또한 랩터 및 mTOR 간의 상호작용을 필요로 하지 않는다(도 9); 3) Triton X-100 용해 조건에서 PLD2와 랩터의 상호작용은 PLD2의 TOS 모티프 유사서열에 의존적임을(도 10) 알 수 있었다.

상기와 같은 연구로, PLD2-랩터 상호작용은 mTOR에 비의존적일 가능성이 있음을 알 수 있다. 그러나 내인성 mTOR 복합체는 랩터와 PLD2를 포함하는 것을 알 수 있었다(도 3). 또한 mTOR 및 PLD2의 상호작용은 그 TOS 모티프 유사서열에 의존적임을 알 수 있었다(도 6). 이러한 발견은 PLD2가 mTOR-랩터와 복합체를 형성하고 이러한 맥락에서 랩터는 PLD2의 TOS 모티프 유사서열과 상호작용함으로써 PLD2에 대해 도킹 장소를 제공하게 된다는 것을 강하게 시사한다.

< 실시예 12>

랩터에서 PLD2 결합 위치

랩터는 중심부위에 3개의 HEAT 반복을 따라 보존된 N-말단(RNC) 도메인을 포함하고 있으며 C-말단 부분에는 7 WD40 반복을 포함하고 있다. 나아가 상기 HEAT 및 WD40 반복은 단백질-단백질 상호작용 모티브이며 많은 진핵세포 단백질에 존재한다.

랩터에 PLD2 결합 부위를 동정하기 위해, 사이트 맵핑 분석을 위해 절단된 랩터 변이체들을 사용하였다. 도 11은 랩터 단편과 전체 랩터의 개략도를 나타낸 것이다(좌측). 특정 HA-랩터 컨스트럭트로 PLD2^wt를 형질감염시키고 상기 기재한 바와 같이 항-HA 항체로 면역침전 분석을 실시하였다. 상기 결과를 도 11의 우측에 나타내었다(별표는 발현된 랩터 단편을 나타낸다). WD40 반복을 포함하는 랩터의 1020-1335 아미노산이 PLD2와 상호작용할 수 있기 때문에, 랩터의 WD40 반복이 PLD2 결합을 담당함을 알 수 있었다.

다음으로, S6K1 및 4EBP1이 랩터와 상호작용하기 위해 주로 TOS 모티프를 이용하므로, 랩터에 대한 PLD2, S6K1 및 4EBP1의 상호작용 선호도를 직접 비교하였다. PLD2, myc-S6K1, 또는 myc-4EBP1으로 HA-raptor¹ ^-646및 HA-raptor¹⁰²⁰ ^-1335를 발현시켰다. 항-HA 항체로 면역침전 분석을 한 후에, 그 결과 생성된 면역친전물로 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. myc-S6K1 및 myc-4EBP1 수준을 결정하기 위해 항- myc 항체를 이용하였다. 상기 수득한 결과를 도 12에 나타내었다(별표는 발현된 랩터 단편을 지시한다).

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 비록 4EBP1은 PLD2와 랩터 결합에 대해서는 다른 선호를 보여주지만, 랩터의 N-말단 부위(a.a. 1-646)를 선호하는 것을 알 수 있었다. 상기와 같은 결과로 PLD2는 랩터를 통해 S6K1 또는 4EBP1과 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, PLD2가 S6K1 또는 4EBP1와 함께 랩터 면역침전물 에서 발견되는 것과 같은 경우가 있음을 알 수 있었다. 특정 재조합 단백질이 COS7 세포안으로 발현되었다. 용해 산물을 CHAPS를 함유하는 조건하에서 수득하고 2개로 나누어 이를 대상으로 항-HA 또는 항-myc 항체로 면역침전을 실시하였다. 상기 실시 결과를 도 13에 나타내었다. 마찬가지로, 재조합 S6K1 또는 4EBP1로 실시한 면역침전 결과, 또한 S6K1 또는 4EBP1와 함께 PLD2에 결합한 랩터를 보여주었다.

예상했던 바와 같이, PLD2-랩터-S6K1 복합체 형성을 위해서는 도 14에 나타낸 것과 같이 PLD2 TOS 모티프-유사서열의 보존이 필요하다는 것을 알 수 있었다. 특정 단백질이 COS7 세포에서 발현되고, 그 용해 산물을 대상으로 항-myc 항체로 면역침전 분석을 실시하였다. 상기 실시 결과를 도 14에 나타내었다. S6K1 및 4EBP1의 경우, 랩터와 상호작용을 하기 위해 경쟁하는 것으로 알려져 있다. 그러나 PLD2는 상호작용하기 위해 랩터의 WD40 부위를 사용한다. 따라서 PLD2가 랩터를 통해 S6K1 또는 4EBP1과 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있다. 또한 더 자세한 분자적 분석을 통해 PLD2가 랩터를 통하여 mTOR/랩터 복합체와 결합하는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 13>

PLD2 - 랩터 상호작용 및 PLD2 의 효소 활성

PLD2-랩터 결합이 mTOR 경로 활성의 일 측면인지 여부를 결정하기 위해, S6K1 인산화를 자극하는 PLD2 점변이(point mutants)능력을 조사하였다.

도 15에서 나타낸 다양한 PLD2 컨스트럭트를 발현하는 COS7 세포에서 체내 PLD 분석을 수행하였다. 상기 수득한 포스파티딜-부탄올(phosphatidyl-butanol) 형성 결과를 도 15에 나타내었다. 상기 도 15에 나타낸 바와 같이, PLD2^F265A 및 PLD2^E266R 는 PLD2^wt ^와비교할 때 비슷한 효소 활성 수준을 가지고 있으며, 이를 통해 mTOR 복합체에서 PLD2의 위치는 효소 특성에 있어서 중요하지 않음을 알 수 있었다.

그러나, 도 16에 나타낸 바와 같이, PLD2^F265A 및 PLD2 ^E266R는 PLD2^wt에 대하여 S6K1 인산화를 촉진하지 않으며 이는 상기 수득한 용해물을 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 설명해 준다(도 15).

도 17에 나타낸 바와 같이, 특정 PLD2 컨스트럭트로 myc가 붙은 재조합 mTOR을 발현시켰다. 상기 수득한 myc-면역침전물을 이용하여 면역침전 분석을 실시하였다. 면역친전 분석 후, 상기 기재한 것과 같이 myc-면역침전물을 대상으로 체외에서 mTOR에 대한 키나제 분석(IVK)을 실시하였다. 그 결과를 도 17에 기재하였다. 상기 수득한 결과는 PLD2^F265A 및 PLD2^E266R가 mTOR 키나제 활성을 촉진할 수 없는 것만큼이나 S6K1 인산화의 결과와 서로 관련이 있었다. PLD2 자체는 랩터 또는 GβL처럼 mTOR 키나제 활성에 대해서도 어떤 효과를 가지고 있을 가능성이 있다. 그러나 mTOR-랩터에 결합할 수 있는 리파제-비활성 PLD2^K758R는 mTOR 키나제 활성을 촉진하지 못하여 mTOR 키나제 활성에 대한 PLD2의 어떤 직접적인 효과를 제외하였다. 또한 상기 활성은 키나제 분석동안 포스파티드산의 생산 때문은 아니며 체외에서 본 발명자의 키나제 분석은 PLD의 필수적인 기질인 포스파티딜콜린을 포함하고 있지 않기 때문이다. 따라서 이러한 발견으로 상기 조건하에서 포스파티드산에 의한 mTOR 활성을 배제하였다. PLD2는 입체형태적 변화 또는 번역후의 수정(posttranslational modification)과 같은 미확인된 기작을 통해 세포 용해 전 mTOR을 활성화 시킨다.

Myc-mTOR 및 HA-PLD2는 COS7 세포에서 발현된다. 24시간 후, 24시간동안 세포에서 혈청을 제거하고 난 다음, mTOR 신호전달을 자극하기 위해 특정 시간 동안 20%의 BCS로 처리하였다. 항- myc 항체로 면역침전 분석후, 결합한 HA-PLD2를 항-HA 항체를 사용하여 입증하였다. 상기 수득한 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에 나타낸 바와 같이, PLD2는 mTOR-랩터 상호작용에 어떤 효과를 가지고 있지 않기 때문에 PLD2에 의한 mTOR-랩터 상호작용의 조절은 제외될 수 있다. 또한 1-부탄올로 포스파티드산 생산을 감소시키거나, 포스파티드산을 추가하거나 어떤 것도 mTOR-랩터 상호작용을 조절하지 못한다. 상기와 같은 결과로, PLD2 및 랩터의 물질적인 상호작용 및 PLD2의 효소 활성은 mTOR 경로 자극을 위해 모두 필요한 것임을 알 수 있었다.

mTOR-랩터 상호작용은 분열촉진인자의 자극으로 변하지 않는다고 알려져 있다(Kim, D.H., Sarbassov, D.D., Ali, S.M., King, J.E., Latek, R.R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Sabatini, D.M. Cell 110 (2002) 163, 본 명세서에 참조로 포함). 이러한 사실로 분열촉진인자 신호를 감지하기 위해서는 미확인된 기작이 존재함을 알 수 있다. 다양한 분열촉진인자는 PLD를 활성화 시키고, 포스파티드산 을 생산하도록 하는 것으로 알려져 있다(Exton, J.H. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 144 (2002) 1; 및 Cockcroft, S. Cell Mol. Life Sci. 58 (2001) 1674, 본 명세서에 참조로 포함). mTOR 활성에서 PLD2가 관여한다는 사실로부터 본 발명자들은 PLD2가 mTOR 신호전달의 분열촉진 활성을 매개하는지 여부를 확인해 보았다.

먼저 PLD2-mTOR 상호작용의 동적성(dynamicity)을 시험하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 20% 우아혈청(bovine calf serum)이 처리 후 1분 이내에 PLD2 및 mTOR의 상호작용을 상당히 증가시키고 이를 30분 동안 유지하였다. S6K1 및 4EBP1의 인산화는 5분 후에 일어났다.

특정 siRNAs를 COS7 세포 안으로 형질감염시키고 36시간 후에 세포에서 24시간 동안 혈청을 제거하고 20%의 우아혈청을 처리하였다. 그 용해 산물로 SDS-PAGE를 실시하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. 예상했던 것과 같이, PLD2의 넉다운으로 S6K1의 분열촉진인자-의존적 인산화가 완전히 감소하였다. 반면 PLD1 넉다운은 S6K1 인산화에 대해서는 별로 크지 않은 효과를 나타내었다. 이러한 사실로부터 PLD2가 분열촉진인자에 의해 유도되는 mTOR 신호전달에 주로 관여함을 알 수 있었다.

분열촉진인자-의존적 mTOR 신호전달에서 PLD2의 중요성을 좀 더 살펴보기 위해, siRNA-억제 발현 컨스트럭트(siRNA-resistant expression constructs)를 이용하여 PLD2 발현을 감소시켰다. PLD2 siRNAs를 실험과정에 기재된 것과 같이 특정 PLD2 추가 컨스트럭트로 형질감염시켰다. 20%의 우아혈청 또는 100mM의 C-6 포스파 티드산을 사용하여 mTOR 신호전달을 자극하였다. 그 결과를 도 20에 기재하였다. 상기 도 20에 나타낸 바와 같이, 분열촉진인자에 의해 유도되는 S6K1 인산화가 단지 PLD2^wt에 의해서만 회복하였다. PLD2^F265A, PLD2 ^E266R, 및 PLD2^K758R 추가한 경우, PLD2 넉다운 세포에서 S6K1 인산화 감소가 회복되지 않았다. 흥미롭게도, S6K1의 외인성 포스파티드산-의존적 인산화의 경우 PLD2^wt 및 PLD2^K758R에 의해 회복되었지만, PLD2^F265A 및 PLD2 ^E266R에 의해서는 그러하지 않았다. 이는 랩터와 PLD2 상호작용을 위해서 그리고 PLD2-의존적 mTOR 활성을 위한 mTOR 복합체에 포스파티드산 생산을 위해서도 그 필요성을 다시금 강조한다.

< 실시예 14>

영양원 의존적 PLD2 활성의 조사

상기 실시예를 통하여 mTOR 경로 자극을 위해서는 PLD2/랩터 상호작용 및 PLD2의 효소 활성이 필요함을 알 수 있었다. 또한 이러한 관계로부터 PLD2가 mTOR 복합체와 물질적 및 기능적으로 연결된 신규한 결합 단백질임을 알 수 있었다.

지금까지, 영양원 신호전달에 있어서 PLD2의 기능이 제시된 바가 없다. 마지막으로 영양원 신호전달에 있어서 PLD2의 중요성을 시험하였다. S6K1에 대한 루신의 자극 효과가 1-부탄올에 의해 상당히 감소하였다. 이러한 결과를 바탕으로 영양 수준에 대응하는 PLD2 활성을 확인하였다. PLD2^wt를 형질감염시키고 24시간 동안 발 현하도록 하였다. 16시간 동안 혈청을 제거하고 8시간 동안 [³H]미리스트산(2(Ci/ml)으로 표지한 다음, 세포에 라파마이신(20nM), D-PBS, 및 루신-결핍 배지 를 처리하였다. 45분 후에, PBt 형성을 측정하기 위해 0.4% 1-부탄올을 첨가하여 루신이 첨가된 배지를 포함한 동일한 처리를 하였다. 상기 처리 결과를 도 21에 나타내었다. 상기 도 21에 나타낸 바와 같이, PLD2 활성이 아미노산 수준, 특히 루신 수준에 의해 반대로 조절됨을 알 수 있었다.

PLD2 활성과 복합체 형성의 관계를 살펴보기 위해, PLD2 및 mTOR의 상호작용을 시험하였다. mTOR에 특이적 억제제인 라파마이신에 의한 mTOR를 억제한 경우 PLD2 및 mTOR의 상호작용에 어떤 효과도 없었다. 그러나 도 22에 나타낸 바와 같이, 루신이 제거된 COS7 및 HEK293 세포에 루신을 처리한 경우 내인성 PLD2 및 내인성 mTOR 복합체의 상호작용이 증가하였다. 도 22의 결과는 융합된 COS7 및 HEK293 세포를 용해시키고 루신이 제거된 세포에 루신을 처리한 다음, 항-mTOR 항체로 면역침전을 수행함으로써 수득하였다.

HA-raptor^wt/PLD2^wt를 HEK293 세포안으로 형질감염시키고 그 세포에게서 루신을 제거하였다. 루신 처리후 면역침전 분석을 실시하고 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 그 실시 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 루신의 증가로 PLD2와 랩터의 결합이 강화되었다. 중요하게도, Rheb 및 PLD2의 상호작용은 또한 고 영영원 조건에서는 안정화되고 저 영양원 수준에서는 약화되는 것과 같이 영양원 수준에 따라 조절된다. 이러한 사실로부터 mTOR, raptor, PLD2, 및 Rheb로 구성된 영양원-의존적 mTOR 복합체가 동정될 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는 루신 수준과는 반대로 PLD2 활성이 조절되는 것과 잘 일치한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD OF REGULATING MAMMALIAN TARGET-OF-RAPAMYCIN ACTIVITY BY INTERACTION BETWEEN PHOSPHOLIPASE D AND RAPTOR <130> DPP20085581 <150> US 60/821,535 <151> 2006-08-04 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2549 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mammalian target-of-rapamycin (mTOR) [Homo sapiens] <400> 1 Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg 20 25 30 Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val 35 40 45 Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr 50 55 60 Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala 65 70 75 80 Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val 85 90 95 Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg 100 105 110 Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys 115 120 125 Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr 130 135 140 Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg 145 150 155 160 Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala 165 170 175 Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp 180 185 190 Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly 195 200 205 Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu 210 215 220 Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu 225 230 235 240 Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn 245 250 255 Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val 260 265 270 Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu 275 280 285 Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met 290 295 300 Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln 305 310 315 320 Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr 325 330 335 Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala 340 345 350 Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu 355 360 365 Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys 370 375 380 Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala 385 390 395 400 Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr 405 410 415 Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala 420 425 430 Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe 435 440 445 Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro 450 455 460 Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala 465 470 475 480 Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly 485 490 495 Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly 500 505 510 Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile 515 520 525 Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser 530 535 540 Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly 545 550 555 560 Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala 565 570 575 Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe 580 585 590 Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp 595 600 605 His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg 610 615 620 Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His 625 630 635 640 Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu 645 650 655 Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg 660 665 670 Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala 675 680 685 Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val 690 695 700 Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser 705 710 715 720 Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln 725 730 735 Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln 740 745 750 Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile 755 760 765 Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys 770 775 780 Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala 785 790 795 800 Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp 805 810 815 Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser 820 825 830 Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val 835 840 845 Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu 850 855 860 Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr 865 870 875 880 Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro 885 890 895 Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala 900 905 910 Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp 915 920 925 Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp 930 935 940 Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg 945 950 955 960 Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr 965 970 975 Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln 980 985 990 Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile 995 1000 1005 Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val Lys 1010 1015 1020 Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met Arg Glu 1025 1030 1035 1040 Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile Leu Leu Ile 1045 1050 1055 Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys Leu Tyr Leu Pro 1060 1065 1070 Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met His Asp Asn Ser Pro 1075 1080 1085 Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala Ala Ile Gln Leu Phe Gly 1090 1095 1100 Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys 1105 1110 1115 1120 Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu 1125 1130 1135 Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala 1140 1145 1150 Ser Arg Ile Ile His Pro Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu 1155 1160 1165 Leu Arg Ser Thr Ala Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu 1170 1175 1180 Gly Lys Lys Tyr Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val 1185 1190 1195 1200 Arg His Arg Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile 1205 1210 1215 Val Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr 1220 1225 1230 Gln His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly 1235 1240 1245 Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile Asn 1250 1255 1260 Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp Asp Trp 1265 1270 1275 1280 Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Ser 1285 1290 1295 Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln Ala Tyr Asn Pro 1300 1305 1310 Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val Ser Cys Trp Ser Glu 1315 1320 1325 Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ser Ile Glu Leu Ala 1330 1335 1340 Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu 1345 1350 1355 1360 Ala Glu Phe Met Glu 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Ala Thr Val Asn Ala Arg Pro Gln 835 840 845 Arg Val Leu Asp Thr Ser Ser Leu Thr Gln Ser Ala Pro Ala Ser Pro 850 855 860 Thr Asn Lys Gly Val His Ile His Gln Ala Gly Gly Ser Pro Pro Ala 865 870 875 880 Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Val Ala Lys Gln Pro 885 890 895 Val Ser Arg Asp Leu Pro Ser Gly Arg Pro Gly Thr Thr Gly Pro Ala 900 905 910 Gly Ala Gln Tyr Thr Pro His Ser His Gln Phe Pro Arg Thr Arg Lys 915 920 925 Met Phe Asp Lys Gly Pro Glu Gln Thr Ala Asp Asp Ala Asp Asp Ala 930 935 940 Ala Gly His Lys Ser Phe Ile Ser Ala Thr Val Gln Thr Gly Phe Cys 945 950 955 960 Asp Trp Ser Ala Arg Tyr Phe Ala Gln Pro Val Met Lys Ile Pro Glu 965 970 975 Glu His Asp Leu Glu Ser Gln Ile Arg Lys Glu Arg Glu Trp Arg Phe 980 985 990 Leu Arg Asn Ser Arg Val Arg Arg Gln Ala Gln Gln Val Ile Gln Lys 995 1000 1005 Gly Ile Thr Arg Leu Asp Asp Gln Ile Phe Leu Asn Arg Asn Pro Gly 1010 1015 1020 Val Pro Ser Val Val Lys Phe His Pro Phe Thr Pro Cys Ile Ala Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asp Lys Asp Ser Ile Cys Phe Trp Asp Trp Glu Lys Gly Glu Lys 1045 1050 1055 Leu Asp Tyr Phe His Asn Gly Asn Pro Arg Tyr Thr Arg Val Thr Ala 1060 1065 1070 Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gln Asp Cys Ser Leu Leu Leu Thr Ala Thr 1075 1080 1085 Asp Asp Gly Ala Ile Arg Val Trp Lys Asn Phe Ala Asp Leu Glu Lys 1090 1095 1100 Asn Pro Glu Met Val Thr Ala Trp Gln Gly Leu Ser Asp Met Leu Pro 1105 1110 1115 1120 Thr Thr Arg Gly Ala Gly Met Val Val Asp Trp Glu Gln Glu Thr Gly 1125 1130 1135 Leu Leu Met Ser Ser Gly Asp Val Arg Ile Val Arg Ile Trp Asp Thr 1140 1145 1150 Asp Arg Glu Met Lys Val Gln Asp Ile Pro Thr Gly Ala Asp Ser Cys 1155 1160 1165 Val Thr Ser Leu Ser Cys Asp Ser His Arg Ser Leu Ile Val Ala Gly 1170 1175 1180 Leu Gly Asp Gly Ser Ile Arg Val Tyr Asp Arg Arg Met Ala Leu Ser 1185 1190 1195 1200 Glu Cys Arg Val Met Thr Tyr Arg Glu His Thr Ala Trp Val Val Lys 1205 1210 1215 Ala Ser Leu Gln Lys Arg Pro Asp Gly His Ile Val Ser Val Ser Val 1220 1225 1230 Asn Gly Asp Val Arg Ile Phe Asp Pro Arg Met Pro Glu Ser Val Asn 1235 1240 1245 Val Leu Gln Ile Val Lys Gly Leu Thr Ala Leu Asp Ile His Pro Gln 1250 1255 1260 Ala Asp Leu Ile Ala Cys Gly Ser Val Asn Gln Phe Thr Ala Ile Tyr 1265 1270 1275 1280 Asn Ser Ser Gly Glu Leu Ile Asn Asn Ile Lys Tyr Tyr Asp Gly Phe 1285 1290 1295 Met Gly Gln Arg Val Gly Ala Ile Ser Cys Leu Ala Phe His Pro His 1300 1305 1310 Trp Pro His Leu Ala Val Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ile Ser Val Tyr 1315 1320 1325 Ser Val Glu Lys Arg Val Arg 1330 1335 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide for PCR of PLD2 <400> 6 ggccgagacc aagtttgtta tcgc 24 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide (F265A) <400> 7 ccatcgatcc gcacgccgtg ccgtgcctcc gtgctccttt tccccacttg cacctcagcg 60 ccagg 65 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide (E266R) <400> 8 ccatcgatcc gcacgccgtg ccgtgcctcc gtgctccttt tccccacttg caccctaaag 60 ccagg 65 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide corresponding to human PLD2 coding nucleotides 703-723 <400> 9 aagagguggc ugguggugaa g 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide corresponding to human PLD2 coding nucleotides 703-723 <400> 10 cuucaccacc agccaccucu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide corresponding to human PLD1a coding nucleotides 1455-1475 <400> 11 aaggugggac gacaaugagc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide corresponding to human PLD1a coding nucleotides 1455-1475 <400> 12 ugcucauugu cgucccaccu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotides 703-723 of PLD2 <400> 13 aagaggtggc tggtggtgaa g 21

Claims

PLD2와 랩터의 상호작용을 억제하여, 랩터를 통한 PLD2 및 mTOR 복합체(PLD/랩터/mTOR complex) 형성을 억제함으로써 mTOR을 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 PLD/랩터/mTOR 복합체 형성을 억제하는 것은 PLD2의 랩터 결합 도메인 또는 랩터의 PLD2 결합 도메인을 비활성화함으로써 수행되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인은 50 내지 200개의 아미노산으로 구성되고 TOS 모티프-유사서열(TOS motif-like sequence)을 포함하며, 상기 랩터의 PLD2 결합 도메인은 랩터의 전장 아미노산 서열(서열번호 5)에서 1020번부터 1335번까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 TOS 모티프-유사서열(TOS motif-like sequence)은 FEVQV(서열번호 4)인 mTOR을 억제하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인은 PLD2의 전장 아미노산 서열(서열번호 2)에서 186번부터 308번까지의 아미노산 잔기로 구성되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을 결손함으로써 수행되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 다른 아미노산으로 치환함으로써 수행되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으로 이루어진 그룹에서 바람직하게 선택된 한 개 이상의 아미노산을 추가함으로써 수행되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 pH 또는 온도 변화에 의해 수행되는 것인 mTOR을 억제하는 방법.
샘플세포에 후보화합물(candidate compound)을 접촉하는 단계;

PLD/랩터/mTOR 복합체를 형성하기 위한 랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용을 검사하는 단계; 및

랩터를 통한 PLD 및 mTOR의 상호작용 수준 또는 상기 복합체의 형성 수준이 상기 화합물을 접촉하지 않은 다른 샘플 세포와 비교할 때 감소하는 경우 상기 화합물을 mTOR 억제제로써 결정하는 단계;

를 포함하는 mTOR 억제제를 선별하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 샘플 세포는 인간 태아 신장 세포, 인간 상피성 난소암 세포, COS7 세포, 인간 자궁 경부암 세포, 인간 결장암 세포, 인간 유방암 세포, 인간 간암 세포, 인간 유방암 세포 및 인간 T 세포 백혈병으로 이루어진 그룹에서 선택된 것인 mTOR 억제제를 선별하는 방법.
PLD2와 랩터의 상호작용을 억제하여 랩터를 통한 PLD2 및 mTOR 복합체(PLD/랩터/mTOR complex) 형성을 억제함으로써 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법
제12항에 있어서, 상기 PLD/랩터/mTOR 복합체 형성을 억제하는 것은 PLD2의 랩터 결합 도메인 또는 랩터의 PLD2 결합 도메인을 비활성화함으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인은 50 내지 200개의 아미노산으로 구성되고 필수적으로 TOS 모티프-유사서열(TOS motif-like sequence)을 포함하며, 상기 랩터의 PLD2 결합 도메인은 랩터의 전장 아미노산 서열(서열번호 5)에서 1020번부터 1335번까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 TOS 모티프-유사서열(TOS motif-like sequence)은 FEVQV(서열번호 4)인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인은 PLD2의 전장 아미노산 서열(서열번호 2)에서 186번부터 308번까지의 아미노산 잔기로 구성되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을 결손함으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 위치한 한 개 이상의 아미노산을 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 다른 아미노산으로 치환함으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 서열번호 4의 아미노산 서열에 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 발린(valine), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 및 리신(lysine)으 로 이루어진 그룹에서 바람직하게 선택된 한 개 이상의 아미노산을 추가함으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD2의 랩터 결합 도메인을 비활성화하는 것은 pH 또는 온도 변화, 또는 루신(leucine) 수준을 감소시킴으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 PLD/랩터/mTOR 복합체 형성을 억제하는 것은 유효 성분으로 상기 제10항에 따른 방법으로 선별된 mTOR 억제제를 유효한 양으로 투여함으로써 수행되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 mTOR과 관련된 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 과오종 증후군 및 조직/장기 비대증으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 것인 mTOR과 관련된 대사질환을 치료하는 방법
PLD2의 랩터 결합 도메인 또는 랩터의 PLD2 결합 도메인을 비활성화하여 랩 터를 통한 PLD 및 mTOR 복합체 형성을 억제하는 활성을 가진 mTOR 억제제를 유효성분으로 함유하는 mTOR과 관련된 대사질환의 치료용 조성물.
제23항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 PLD2에서 FEVQV 아미노산 서열(서열번호 4) 또는 랩터의 전장 아미노산 서열(서열번호 5)에서 1020번부터 1335번까지의 아미노산 서열을 비활성화시키는 물질인 mTOR과 관련된 대사질환의 치료용 조성물.
제23항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 PLD2의 랩터 결합 도메인 또는 랩터의 PLD2 결합 도메인의 pH 또는 온도를 변화시키는 물질인 mTOR과 관련된 대사질환의 치료용 조성물.
제23항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 제10항에 따른 방법에 의해 선별되는 것인 mTOR과 관련된 대사질환의 치료용 조성물.
제23항에 있어서, 상기 mTOR과 관련된 대사질환은 암, 당뇨병, 비만, 과오종 증후군 및 조직/장기 비대증으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 것인 mTOR 과 관련된 대사질환의 치료용 조성물.