JP2007507688A - 液晶ベースの分析物検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、液晶アッセイフォーマットを使用する、分析物の検出の分野、特にウイルス、細胞、細菌、脂質膜含有生物、タンパク質、核酸、炭水化物、ならびに他の生体分子、有機分子および無機分子の検出に関する。
生物学的試料中の病原体、タンパク質、および核酸標的の検出は、数十億ドル規模のインビトロ診断産業の基礎を形成する。タンパク質標的および核酸標的の検出は、診断ベースと研究ベースの市場に分けることができる。診断市場は、ウイルスおよび細菌などの病原体の検出および同定、様々な遺伝子マーカーの同定、および腫瘍の存在に関連したマーカーの同定を含む。研究市場は、解析技術、創薬技術、およびハイスループットスクリーニング技術を必要とする、ゲノムおよびプロテオミクス産業を含む。
本発明は、液晶アッセイフォーマットを使用する、分析物の検出の分野、特にウイルス、細胞、細菌、脂質膜含有生物、タンパク質、核酸、炭水化物および他の生体分子、有機分子および無機分子の検出に関する。従って本発明は、以下を含むウイルスを検出する方法を提供する:a)i)ウイルスを含むことが疑わしい試料;ii)その上に固定された第一のウイルス認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む基板を含む、検出装置;および、iii)メソゲン;を提供すること;b)該検出領域を該試料と接触すること;ならびに、c)該基板を該メソゲンと接触することを含み、ここで該ウイルスの存在は、該検出領域にわたる該メソゲンの変化により示され、かつここで該変化は、該検出領域上の追加のホメオトロピックディレクターの存在とは無関係である。本発明は、液晶を形成するメソゲンの特定の変化の検出に限定されるものではない。実際、様々な変化が検出され、これは色の変化、質感の変化、チルト角の変化、およびホメオトロピック配向を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書において使用される用語「認識部分」は、関心のある分析物と共有または非共有のいずれかの様式で相互作用する組成物を意味する。
本発明は、液晶アッセイフォーマットを使用する、分析物検出の分野、特にウイルス、細胞、細菌、脂質膜含有生物、タンパク質、核酸、炭水化物、および他の生体分子、有機分子および無機分子の検出に関する。液晶ベースのアッセイシステム(LCアッセイ)は、米国特許第6,284,197;国際公開公報第01/61357号;第01/61325号;第99/63329号;Gupta et al., Science, 279:2077-2080(1998);Seung-Ryeol Kim, Rahul R. Shah, and Nicholas L. Abbott;Orientations of Liquid Crystals on Mechanically Rubbed Films of Bovine Serum Albumin: A Possible Substrate for Biomolecular Assays Based on Liquid Crystals, Analytical Chemistry, 2000;72(19):4646-4653;Justin J. Skaife and Nicholas L. Abbott, Quantitative Interpretation of the Optical Textures of Liquid Crystals Caused by Specific Binding of Immunoglobulins to Surface-Bound Antigens, Langmuir, 2000;16(7):3529-3536;Vinay K. Gupta and Nicholas L. Abbott, Using Droplets of Nematic Liquid Crystal To Probe the Microscopic and Mesoscopic Structure of Organic Surfaces, Langmuir, 1999;15(21):7213-7223において開示されており、これらは全て本明細書に参照として組入れられている。
様々な認識部分の本発明における使用を認める。好ましい態様において、認識部分は、基板の検出領域上に固定される(以下により詳細に説明する)。本発明のいくつかの態様において、基板に付着または会合した「認識部分」は、別の1個または複数の分子(例えば分析物)と結合またはそうでなければ相互作用するために利用される。例えばいくつかの態様において、認識部分は、ω-官能基化されたスペーサーアームまたはω-官能基化されたSAM成分のいずれかに付着され、これは次に基板に付着または会合される。更に認識部分は、ポリマー表面(例えば、ラビングされたポリマー表面)により提示することができる。
本発明の実践において有用な基板は、実質的にいずれか物理化学的に安定した材料で製造することができる。好ましい態様において、基板材料は、メソゲン層の構成成分に対し非反応性である。基板は、剛性または柔軟性のいずれかであることができ、かつ光学的に透明または光学的に不透明であることができる。これらの基板は、電気的に絶縁体、導体または半導体であることができる。更に基板は、液体、蒸気および/または気体に対し実質的に非透過性であるか、あるいは基板は、これらの種類の1種または複数の物質に対し透過性であることができる。基板材料の例は、無機結晶、無機ガラス、無機酸化物、金属、有機ポリマー、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様において、基板は、試料および/または他の試薬を、基板表面またはその上の検出領域へ送達するためのマイクロチャネルをその中に有する。マイクロチャネルのデザインおよび使用は、例えば、米国特許第6425972号、第6418968号、第6447727号、第6432720号、第5976336号、第5882465号、第5876675号、第6186660号、第6100541号、第6379974号、第6267858号、第6251343号、第6238538号、第6182733号、第6068752号、第6429025号、第6413782号、第6274089号、第6150180号、第6046056号、第6358387号、第6321791号、第6326083号、第6171067号、および第6167910号に開示され、これらは全て本明細書に参照として組入れられている。
本発明のいくつかの態様において、無機結晶および無機ガラスが、基板材料として利用される(例えば、LiF、NaF、NaCl、KBr、KI、CaF2、MgF2、HgF2、BN、AsS3、ZnS、Si3N4など)。結晶およびガラスは、当該技術分野の標準技法により調製することができる(例えば、Goodman, C. H. L., Crystal Growth Theory and Techniques, Plenum Press, ニューヨーク、1974参照)。あるいは、これらの結晶は、商業的に購入することができる(例えば、Fischer Scientific)。結晶は、基板の単独成分であるか、または1種または複数の追加基板成分で被覆することができる。従って、例えば1種または複数の金属フィルムまたは1種の金属フィルムおよび有機ポリマーで被覆された結晶を利用することは、本発明の範囲内である。加えて結晶は、様々な材料、または同じ材料の異なる物理的形(例えばガラス)で製造された基板の別の部分と接触する基板の一部を構成することができる。無機結晶および/またはガラスを利用する他の有用な基板の構成は、当業者には明らかであろう。
本発明の別の態様において、無機酸化物が基板として利用される。本発明において使用する無機酸化物は、例えば、Cs2O、Mg(OH)2、TiO2、ZrO2、CeO2、Y2O3、Cr2O3、Fe2O3、NiO、ZnO、Al2O3、SiO2(ガラス)、石英、In2O3、SnO2、PbO2などを含む。無機酸化物は、フィルム、支持材入り粉末(supported powders)、ガラス、結晶などの様々な物理的形で利用することができる。基板は、単独の無機酸化物または1種よりも多い無機酸化物の複合体からなることができる。例えば、無機酸化物の複合体は、 層状構造を有する(すなわち、第一の酸化物上に沈着した第二の酸化物)か、または2種もしくはそれよりも多い酸化物を連続して非層状構造で配置することができる。加えて1種または複数の酸化物を、様々なサイズの粒子として混合し、かつガラスまたは金属シートのような支持体上に沈着することができる。更に1種または複数の無機酸化物の層は、ふたつの別の基板層の間に挟むことができる(例えば、金属-酸化物-金属、金属-酸化物-結晶)。
本発明のより更なる態様において、金属が基板として利用される。金属は、結晶、シートまたは粉末として使用することができる。金属は、蒸着、スパッタリング、無電解沈着、電着、および金属ナノ粒子を含有する金属のプレフォーム粒子の吸着または沈着を含むが、これらに限定されるものではない当業者に公知のいずれかの方法により、裏当て上に沈着することができる。
更に別の本発明の態様において、有機ポリマーが基板材料として利用される。本発明の基板として有用な有機ポリマーは、気体、液体および溶液中の分子に対し透過性であるポリマーを含む。他の有用なポリマーは、1種または複数のこれらの同種化合物に非透過性であるものである。
本発明の基板は、様々なフォーマットで提供される。例えば基板は、平面もしくは曲面で存在するか、またはビーズであることができる。ビーズフォーマットは、以下に説明する間接的検出法に特に有用である。本発明のビーズ基板は、先に説明した基板材料のいずれかを含むことができる。いくつかの好ましい態様において、ビーズは、アガロースビーズ、アクリル系ビーズ、またはラテックスビーズなどの、市販のビーズである。いくつかの態様において、ビーズは磁気性である。更に別の態様において、ビーズは、銀または金などの金属で被覆される。更に別の態様において、カラムクロマトグラフィー媒体のような基板を、分析物を捕獲するために使用してもよい。このような基板の例は、免疫親和性カラム(すなわち、抗原結合タンパク質により機能化された媒体を含むカラム)、プロテインA親和性カラム、S-SEPHAROSE、SP-SEPHAROSE、およびカルボキシメチルセルロースなどのカチオン交換カラム、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX、およびFAST Q SEPHAROSEなどのアニオン交換カラム、ULTRAGELカラムのようなサイジングカラム、ホスホセルロースカラム、ヘパリン硫酸カラムなどである。カラムの溶離後、分析物は以下に詳細に説明されたように検出される。
いくつかの態様において、基板の表面は、認識部分が基板の表面上に固定されるように機能化されている。いくつかの態様において、固定された認識部分は、検出領域を形成する。いくつかの態様において、複数の検出領域が、基板の表面に形成される。いくつかの態様において、同じ認識部分が、複数の検出領域の2個またはそれ以上に提供されるのに対し、別の態様においては、少なくとも2個の異なる認識部分が、複数の検出領域の1個または複数の上に固定される。いくつかの態様において、認識部分は、以下により詳細に説明される方法により、基板表面上の不連続の検出領域にアレイ形成されている。
いくつかの態様において、基板の表面は、基板表面上に自己組織化された単分子層(SAM)を形成することにより、最初に機能化される。自己組織化された単分子層は一般に、組織化され、密集された(closely packed)線状分子の集成体として示される。固形基板上に単分子層を沈着するための、2種の広く使用される方法が存在する:Langmuir-Blodgettトランスファーおよび自己組織化。追加の方法は、単分子層前駆体の蒸気の基板表面への沈着、ならびに溶液からのポリマーおよび高分子電解質の層毎の沈着のような技術を含む(Ladam et al., Protein Adsorption onto Auto-Assembled Polyelectrolyte Films, Langmuir, 2001;17(3):878-882)。
下記の考察は、反応性SAM成分の基板表面への付着に焦点を当てている。この焦点は単に便宜上であり、当業者は、本考察が、SAM成分-認識部分が基板へのその付着の前にプレフォームされる態様に、同等に適用可能であることを理解するであろう。本明細書において使用される用語「反応性SAM成分」とは、認識部分または他の種との反応、その後の成分の基板への付着に利用可能な官能基を有する成分を意味する。
(RO)3-Si-R1-X1 (1)
ここで、Rは、アルキル基、例えばメチルまたはエチルであり、R1は、ケイ素とXの間の連結基であり、Xは、反応基または保護された反応基である。反応基は、以下に考察したように認識部分であることもできる。示されたアルコキシ基に加え、ハロゲンまたは他の脱離基を有するシラン誘導体も、本発明において有用である。
1. ヒドロキシアルキルシロキサン(シリル化された表面、ジボランによる官能基化、およびH2O2のアルコールへの酸化)
a.アリルトリクロロシラン 3-ヒドロキシプロピル
b.7-oct-1-エニルトリクロロシラン 8-ヒドロキシオクチル
2.ジオール(ジヒドロキシアルキル)シロキサン(シリル化された表面およびジオールへの加水分解)
a.(グリシジルトリメトキシシラン (2,3-ジヒドロキシプロピルオキシ)プロピル
3.アミノアルキルシロキサン(中間体の官能基化段階が不要なアミン)
a.3-アミノプロピルトリメトキシシラン アミノプロピル
4.二量体第2級アミノアルキルシロキサン
a.ビス(3-トリメトキシシリルプロピル)アミン ビス(シリルオキシルプロピル)アミン
Y-S-R2-X2 (2)
R2はイオウとX2の間の連結基であり、およびX2は反応基または保護された反応基である。X2は、以下に説明されるような認識部分であることもできる。Yは、H、R3およびR3-S-からなる群より選択される一員であり、ここでR2およびR3は、独立して選択される。R2およびR3が同じである場合、対称のスルフィドおよびジスルフィドが生じ、かつこれらが異なる場合は、非対称のスルフィドおよびジスルフィドが生じる。
(RO)3-Si-R2-(X2)n (3)
ここでRはメチルのようなアルキル基であり、R2はケイ素とX2の間の連結基であり、X2は反応基または保護された反応基であり、ならびにnは、2〜50の間の、より好ましくは2〜20の整数である。
Y-S-R2-(X2)n (4)
X1Q2C(CQ1 2)mZ1(CQ2 2)nSH (5)
ここでX1は、H、ハロゲン反応基および保護された反応基からなる群より選択される一員である。反応基は、以下に考察するように認識部分であることもできる。Q、Q1およびQ2は、独立してHおよびハロゲンからなる群より選択される一員である。Z1は、-CQ2-、-CQ1 2-、-CQ2 2-、-O-、-S-、NR4-、-C(O)NR4およびR4NC(O0-からなる群より選択される一員であり、ここでR4は、H、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールおよびヘテロ環式基からなる群より選択される一員であり、ならびにmおよびnは独立して0〜40の間の数である。
CF3(CF2)mZ1(CH2)nSH (6)
CF3(CF2)oZ2(CH2)pSH (7)
ここで、Z1およびZ2は、-CH2-、-O-、-S-、NR4、-C(O)NR4およびR4NC(O)-からなる群より独立して選択される一員であり、ここでR4は、H、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリールおよびヘテロ環式基からなる群より選択される一員である。現在好ましい態様において、隣接分子のZ基は、引力(例えば水素結合)または反発(例えばファンデルワールス力)のいずれかの相互作用に参加する。
(a)カルボキシル基およびそれらの様々な誘導体、これはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p-ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むが、これらに限定されるものではない;
(b)エステル、エーテル、アルデヒドなどに転換することができる、ヒドロキシル基
(c)ハロゲン化物が、例えば、アミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基と後で交換することができ、これによりハロゲン原子の位置の新たな基の共有的付着を生じる、ハロアルキル基;
(d)例えばマレイミド基のような、ディールス-アルダー反応に参加することが可能である、ジエノフィル基;
(e)その後の誘導体化が、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成により、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加のような機構により可能である、アルデヒド基またはケトン基;
(f)例えばスルホンアミドを形成するための、アミンとの引き続きの反応のための、ハロゲン化スルホニル基;
(g)ジスルフィドに転換またはハロゲン化アシルと反応することができる、チオール基;
(h)例えばアシル化またはアルキル化することができる、アミン基またはスルフヒドリル基;
(i)例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加などを受けることができる、アルケン;ならびに
(j)例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができる、エポキシド。
いくつかの態様において、基板は、ポリイミド層で被覆される。ポリイミド被覆された基板は、場合によっては、その表面は液晶をホメオトロピック配向する一方で、別の場合は表面はラビングされ、液晶の配向のための異方性表面を提供することができるので、特に有用であることが企図されている。好ましい態様において、シリコンウエハのような基板は、ポリイミドで被覆される。好ましい態様において、基板は、ポリイミドでスピンコーティングされる。液晶の平面配列のためのNissan 7210、Nissan 3510、Nissan 410、Nissan 3140、Nissan 5291、およびJapan Synthetic Rubber JALS 146-R19、ならびに液晶のホメオトロピック配向のためのNissan 7511LおよびSE 1211を含むが、これらに限定されるものではない様々なポリイミドが、本発明での使用が認められる。驚くべきことに、ラビングされたポリイミド表面の液晶を配向させる能力は、認識部分がラビングされた表面上に表示される場合に維持され、その後分析物が認識部分へ結合する場合に、マスキングされることがわかった。従って分析物が結合された区域は、秩序のない液晶を有し、交差分極により目視した場合に白色または明るく見え、ならびに分析物が結合されなかった区域は、秩序を保ち続け、交差分極により目視した場合に暗く見える。驚くべきことに、液晶をホメオトロピック配向するポリイミド表面を用い、表面への非特異的結合を報告することができることもわかった。これらの態様において、分析物が結合した区域は無秩序な液晶を有し、交差分極により目視した場合に白色または明るく見え、ならびに分析物が結合されなかった区域は、ホメオトロピック配向を維持し、暗く見える。これらの様々なポリイミドは、タンパク質間の結合事象を探査および報告するために使用することができる様々なタンパク質に対し、異なる係留特性および異なる結合親和性を提供する。同様に異なる液晶は、特異的結合事象に対する異なる反応を示す。従って、異なる光学特性および誘電特性を伴う様々な液晶系の材料、例えば5CB、BL093、TL216、ZLI5800、MLC6613、および(p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン(MBBA)を使用することによりアッセイを調節することが可能である。
いくつかの態様において、認識部分は、直接吸着により基板上に固定されている。例えば抗体は、金基板表面上にスピンコーティングされたポリウレタンの薄フィルム上に固定することができる。
ウイルス認識部分がポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるようないくつかの態様において、複数のウイルス認識部分が、光活性化化学、マイクロコンタクトプリンティング、およびインクジェット印刷を用い、基板上にアレイ形成されている。特に好ましい態様において、フォトリソグラフィーが利用される(例えば、米国特許第6,045,996号;第5,925,525号;および第5,858,659号参照;各々本明細書に参照として組入れられている)。基板露出部位を規定するために連続フォトリソグラフィーを用いマスキングし、その後特異的化学合成段階が続くこのプロセスは、アレイ内の予め決められた位置に各プローブを伴う、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを構成する。マルチプローブアレイが、例えば大型ガラスウエハ上で同時に合成される。その後ウエハは四角に切断され、個々のプローブアレイが、それらを環境から保護し、かつハイブリダイゼーションチャンバーとして役立つような、注入成形されたプラスチック製カートリッジ中に包装される。
いくつかの態様において、認識部分の基板表面への固定後、基板の残余は、基板表面への非特異的結合に対して保護するために、ブロックされる。適当なブロック剤の例は、血清アルブミン、双性イオン性ポリマー、吸着された脂質層、デキストランおよび他の糖類、架橋した脂質、ポリエチレンオキシド、ポリオキサゾリン、ヒドロゲルおよびミルクを含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、ブロック剤は、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンまたはウマ血清アルブミンである。
メソゲン層を形成するいずれかの化合物または化合物の混合物は、本発明と組合せて使用することができる。メソゲンは、サーモトロピック液晶またはライオトロピック液晶を形成することができる。サーモトロピックおよびライオトロピックの両液晶は、ネマチック、キラルネマチック、スメクチック、極性スメクチック、キラルスメクチック、フラストレート相およびディスコチック相を含む、多くの形で存在することができる。
本発明は、病原体であるウイルスおよび細菌を含む、生体膜を有する実体を直接検出する方法および装置を提供する。本発明のシステムおよび装置は、メソゲン層の、有機層または無機層(例えば金属、金属塩または金属酸化物)との接触を可能にする構造のいずれかであることができる。サイズおよび形状に関する唯一の制限は、装置が使用される状況または意図された目的から生じる制限である。この装置は、平面または非平面であることができる。従って本発明を実施するための、いくつかの偏光子、レンズ、フィルター光などの使用は、本発明の範囲内である。
いくつかの態様において、本アッセイは、特異的捕獲後の分析物の非特異的検出のための使用を認める。これらの態様において、分析物は、分析物と相互作用する認識部分を表示している捕獲基板(例えば、PDMSスタンプまたはビーズ)により捕獲される。その後分析物は、分析物が非特異的に結合する検出基板へ移動される。第二の基板上の分析物の存在は、第二の基板の液晶との接触により検出される。液晶内の無秩序なまたは秩序のある区域は、分析物の存在の指標である。前述のように、様々な方法が、装置のメソゲンの配向の変化が存在するかどうかの決定に有用である。いくつかの態様において、アッセイ装置は、電流の使用により分析物がアッセイ装置の表面へ移動することができるように(例えば二元電気泳動による)、前述のような電極が構成されている。これらの電極は、液晶配向の変化の結果としての、装置の電気的特性(例えば誘電キャパシタンス)の変化を測定するためにも使用される。
いくつかの態様において、リポソームのような脂質の液晶を配向させる能力を利用し、分析物が検出される。先に説明されたように、本発明は、脂質と複合された認識部分またはリガンドの使用を企図している。いくつかの態様において、これらの脂質複合体(例えばリポソーム)を利用し、試料中のまたは基板上の分析物の存在を検出する。例えば先に説明したように、脂質およびリポソームのような脂質含有実体は、誘導体化し、タンパク質または核酸などの認識部分を表示することができる。試料またはその上に試料が塗布された基板は、その後、脂質-認識部分複合体と接触され、その結果認識部分は分析物と結合し、そうでなければ会合し始める。得られる分析物-認識部分-脂質複合体は、必要ならば複合体を基板へ移し、次に液晶を伴う基板と接触することにより検出することができる。本発明は、いずれか特定の作用機序に限定されるものではない。実際作用機序の理解は、本発明の実践には不要である。しかしながら複合体の脂質部分は、脂質と接触している液晶部分にホメオトロピック配向を提供することが企図される。ホメオトロピック配向は、先に説明された方法により検出することができる。基板それ自身が液晶を配向させることは不要であることは認められるであろう。従ってこれらのアッセイは、異方性表面またはそうでなければ有機層で誘導体化される表面を提供しない、低コストの単純な基板を使用することができる。当然これらの基板は、望ましいならば先に説明されたような、異方性表面または誘導体化された表面を有する。
いくつかの態様において、本発明は、分析物の検出のためのキットを提供する。好ましい態様において、キットは、先に説明されたような基板を1個または複数含む。いくつかの態様において、キットは、捕獲基板および検出基板を含む。いくつかの好ましい態様において、捕獲基板は、ビーズまたはスタンプである。更なる態様において、キットは、液晶セルと集成するために、検出基板と組合せて使用することができる基板を含む。いくつかの態様において、キットは、メソゲンを含むバイアルを含む。更に別の態様において、キットは、対照の1種または複数の分析物を含む少なくとも1個のバイアルを含む。更に別の態様において、キットは、少なくとも1種の分析物の検出のためにキットに含まれた試薬の使用説明書を含む。いくつかの態様において、この説明書は更に、インビトロ診断用製品のラベリング中に、米国食品医薬品局(FDA)により要求された意図された用途に関する陳述を含む。FDAは、インビトロ診断薬を医療器具として分類し、かつ510(k)手順により承認されることを要求している。510(k)申請(市販前申請)に必要な情報は以下を含む:1)インビトロ診断用製品の名称で、器具の商用名または商標名、一般名または通称、および分類名を含むもの;2)製品の意図された用途;3)入手可能であるならば、510(k)申請を提出する所有者または操業者の確定された登録番号;既知であるならば、食品医薬品化粧品法(FD&C Act)513条の下での、当該インビトロ診断用製品の属するクラス、その適切なパネル、または所有者もしくは操業者がそのような条項下で当該器具が分類されないと決定した場合は、その決定に関する陳述およびインビトロ診断用製品がそのように分類されないという決定の根拠;4)当該インビトロ診断用製品、その意図された用途、および用法の指示を説明するのに十分な、提唱されたラベル、ラベリングおよび広告。使用可能であるならば、写真および技術的図面が供給されるべきである;5)当該器具は、米国において流通している同等の型の他のインビトロ診断用製品と類似しているおよび/または異なることを示す陳述と、その陳述を裏付けるデータの添付;6)実質的に同等であるという決定の基になった、安全性および有効性のデータの510(k)まとめ;または、実質的に同等であるというFDA見解を裏付ける、510(k)安全性および有効性の情報が、書面による請求の30日以内に誰もが入手可能であることの陳述;7)申請者が、自身の最善の知識において、市販前通知において申請された全てのデータおよび情報が信頼できかつ正確であるとみなすこと、および重要事実の省略がないことに関する陳述;8)実質的に同等性の決定を成す上で、FDAが必要として求めたインビトロ診断用製品に関する追加情報。追加情報は、米国FDAのインターネットウェブページ上で入手可能である。
本発明のある好ましい態様および局面を明らかにしかつ更に例証するために、下記実施例が提供されるが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
本実施例は、抗体を基板上に固定する様々な方法を説明している。5種の異なる固定化の戦略が、評価された:
1)HEXA:金フィルム表面上のCH3(CH2)15SH(HEXA)から形成された疎水性単分子層上への、プロテインA、その後の西ナイルウイルスモノクローナル抗体(WNV Mab)の吸着。この表面は、抗体の固定後、BSAによりブロックされた。
2)SPDP:スルフヒドリル反応性(タンパク質)およびアミン反応性(単分子層)異種二官能性架橋剤N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸エステル(SPDP)を用いることによる、金フィルム上の2-メルカプトエチルアミン(2-MEA)により形成された単分子層への、WNV Mabの共有的付着。この表面は、抗体の固定後、BSAによりブロックされた。
3)PMPI:スルフヒドリル反応性(タンパク質)およびヒドロキシル反応性(単分子層)異種二官能性架橋剤N-(p-マレイミドフェニル)イソシアナート(PMPI)を用いることによる、金フィルム上の11-メルカプトウンデカノール(11-MU)により形成された単分子層への、Rasポリクローナル抗体(Ras Pab)の共有的付着。この表面は、抗体の固定後、BSAによりブロックされた。
4)DSS:アミノ反応性同種二官能性架橋剤スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)を用いることによる、金フィルム上の2-MEAから形成された単分子層への、Ras Pabの共有的付着。この表面は、抗体の固定後、BSAによりブロックされた。
5)Adsp:金表面上にスピンコーティングされた薄フィルム上への、WNV Mabの、直接吸着。この表面は、抗体の固定後、BSAによりブロックされた。
検出領域がトポグラフィ的特徴を含む液晶アッセイによるウイルスの検出は、国際公開公報第01/61357号に開示されている。液晶と組合せたこれらの表面の種類をうまく使用し、そのような基板の表面に捕獲された西ナイルウイルス(WNV)の存在を報告した。しかし驚くべきことにここで、報告する機構は、表面上のトポグラフィーを必要としないことがわかった。この予想外の結果は、液晶を使用するウイルス検出のための基板の二次加工を実質的に単純化する。以下に説明するように、この報告する機構は、様々なウイルスに適用することができることが明らかにされている。
抗体を固定する様々な方法を調べ、最良の結果をもたらす手法を決定した。簡単に述べると、ポリウレタン基板を、(a)1μM WNVモノクローナル抗体、(b)5μM WNVモノクローナル抗体、および(c)最初1mg/mlプロテインA、その後1μM WNVモノクローナル抗体で機能化した。全ての機能化された基板をその後、WNVストックと共にインキュベーションした。結果は、ポリウレタンが1μMまたは5μM抗体により機能化された場合、同じく基板が最初にプロテインA(抗体を正確に配向させる分子)とインキュベーションされ、その後1μM抗体で機能化された場合に、実質的に同じホメオトロピック反応が観察されたことを示した。これらの結果は、強力な ホメオトロピック反応は、プロテインAを伴うまたは伴わずに、比較的低い濃度の抗体で得られることを示している。現在の方法は、基板全体の1mg/mlプロテインAによるコーティング、それに続く基板上の特異的検出領域における抗体の固定が関連している。
先に説明した結果は、表面を、ウイルス溶液と共に、最大20時間インキュベーションすることにより得た。次に、表面に固定されたWNVモノクローナル抗体へのウイルス送達を最適化し、従って結合時間を最小化する方法を調べた。下記の3種のパラメータを調べた:a)インキュベーションの温度;b)対流を発生するための、試料の前後の揺動;および、(c)抗体のスポットサイズの影響。
液晶のホメオトロピック反応を介して、WNV以外のウイルスを報告する方法の一般性を評価するために、SLEに対する抗体を提示している表面上に捕獲されたSLEに対する液晶の反応を介して、SLEが検出されるかどうかを決定する実験を行った。SLEのアッセイは、本質的にWNVについて先に説明したように行った。SLEウイルスがこのアッセイにおいて試験される各々の場合において、ホメオトロピック配列の区域は、スライドの縁の上、診断用ゾーンの外側、しかしPBS洗浄の方向に認められた。診断用表面上に形成された抗原抗体複合体は、PBSすすぎの間に洗浄除去され、一部の残留物のみが、液晶のホメオトロピック配列により目視されるスライドの縁の近傍に残存しているように見える。これは、WNVアッセイでは起こらなかった。これらの区域は、SLEは、液晶のホメオトロピック反応を介して検出することができることを示している。この結果は液晶のホメオトロピック反応は、WNVに制限されないが、WNV以外のウイルスの検出に活用することができることを示唆しているので、この結果は重要である。WNV、SLEおよびEEEの大発生が同時に生じ、迅速な多重アッセイが利用可能である場合に、このことは何倍も(in times)価値があるであろう。
ウイルスアッセイの有用なフォーマットは、同じ表面上に空間的にパターン化されたいくつかのウイルスに対する抗体を伴うマルチアレイである。表面上の抗体のパターン化、およびそれらへのウイルス結合の検出の実行可能性を明らかにするために、WNVに対する抗体を、表面の3領域にパターン化した実験を行った。簡単に述べると、ポリウレタン基板は、レーンフォーマットでWNVモノクローナル抗体で機能化した。WNVは、基板上で35℃で2時間揺動した。3種のホメオトロピックレーンを観察したところ、これは結合したウイルスの配置を示した。
この実施例は、トリ組織からのWNVの検出を説明している。ポリウレタン基板を、表面のプロテインAの1mg/mlと一緒のインキュベーションにより調製した。次に、1μM WNVモノクローナル抗体を含有する液滴4滴を、いくつかの試料の各区域内に固定した。腎/脾組織懸濁液を含有するカラス試料を、NWHC's Diagnostic Virologyラボから入手した。これらの試料を、リアルタイムRT-PCRによるか、または組織培養単離により、各々、陽性または陰性であると決定した。組織懸濁液は、2,000rpmで10分間遠心し、上清を直接試料区域に塗布した。107.7pfu/.2mlのWNVストックをこれらの実験において使用した。インキュベーションは、35℃で一晩行った。WNVモノクローナル抗体で機能化されたポリウレタン基板を、陽性または陰性Americanカラス組織懸濁液、培養培地、または陽性対照としてWNVストックで処理した。陽性カラスおよびWNV試料の領域は、ホメオトロピック配列を示し、このことは、結合した西ナイルウイルスの存在を示している。陰性カラスおよび培養培地試料の領域は、無秩序なおよび明るく着色したLCを示し、これは結合したウイルスの欠如を示している。本発明者らは、陽性対照および陰性対照が、液晶の正確な反応を生じたことに注目している。
この実施例は、組織培養細胞によるホメオトロピック配向を明らかにしている。組織培養細胞は、スライドガラス表面に付着することができる。この表面を洗浄し、メソゲンを表面に配置した。細胞により占拠された表面の区域は、均一に暗く見える。細胞領域により占拠されなかった表面の区域は、均一に暗く見える。細胞領域により占拠されなかった区域は、無秩序であり、明るく着色したLCを示している。
この実施例は、リガンドを含むスタンプ基板から検出基板へ移動された抗体の検出を説明している。スタンプ基板を形成するために、Sylgard 184 Elastomer Kit(Dow Corning)の硬化剤1部に対しエラストマー10部を一緒に混合し、真空デシケーター内で脱気し、〜65℃で1時間PDMSへ硬化した。PDMSスタンプは、硬化したPDMSからFisher's Finest顕微鏡ガラススライドに切出した。次にPDMSスタンプを、それらを清浄にするために、エタノールですすぎ、窒素で乾燥した。次にPDMSスタンプを、酸素プラズマ(200mTorr O2バックフィル圧(backfill pressure))中、275ワットで4分間、プラズマ集塵(plasma ash)し、PDMS表面を酸化し、ガラスに似た表面を作成した。このPDMSスタンプを次に、2%APES/98%無水アセトン溶液に一定に攪拌しながら2分間浸漬した。PDMSスタンプを次に、アセトンへ5分間一定に攪拌しながら移した。PDMSスタンプをその後、アセトンから取り出し、アセトンですすぎ、窒素で乾燥した。PMDSスタンプは次に、100℃の蓋のない炉の中に30分間放置した。PDMSスタンプを炉から取り出し、室温に冷却し、その後無水メタノール198mlと混合した2mlのDMSO中の74mgのDSSの溶解から作成した1mM DSS(Pierce)溶液中に配置した。スタンプは、DSS化学物質20ml中に一定で攪拌しながら1時間維持した。その後PDMSスタンプをDSSから取り出し、メタノールですすぎ、引き続き窒素流でこれらを乾燥した。その後0.25μMのEタンパク(L2 Diagnostics, LLC)の20μL液滴を個々のスタンプ上で、4℃で一晩、および室温で1.5時間インキュベーションした。
本実験は、溶液中の2種の抗体の混合物からの特異的抗体の捕獲を明らかにしている。図4を参照し、6ボタン式PDMSスタンプを、O2クラウド(cloud)中で8分間プラズマ集塵し、PDMSの表面を酸化した。次にスタンプを、無水アセトン溶液中の2%APES内に2分間攪拌しながら放置した。スタンプを次に、アセトン内に5分間攪拌しながら放置した。その後スタンプをアセトンですすぎ、窒素で乾燥し、100℃の炉に30分間放置した。スタンプを次に、1mM DSS溶液中に1時間攪拌しながら放置した。スタンプをDSSから取り出し、メタノールですすぎ、窒素で乾燥した。6ボタン式PDMSαスタンプの3個のボタン上で、0.25μMのEタンパクの20μl液滴を4℃で一晩インキュベーションした。残りの3個のボタンには、0.25μMビオチン化したBSAの20μl液滴を入れ、4℃で一晩インキュベーションした。これらのタンパク質を、水ですすぎ落とし、αスタンプを窒素で乾燥した。3個のEタンパクで機能化されたボタンの2個および3個のビオチン化されたBSAで機能化されたボタンの2個には、抗ビオチンおよび抗E抗体の0.25μM混合物の20μl液滴を入れ、これらを室温で6時間インキュベーションした。3番目のEタンパクで機能化されたボタンには、0.25μM抗ビオチン抗体の20μl液滴を有し、これを陰性対照として、室温で6時間インキュベーションした。3番目のビオチン化したBSAで機能化されたボタンには、0.25μM抗E抗体の20μl液滴を入れ、これを陰性対照として、室温で6時間インキュベーションした。6個のボタンの各々は、最初に、PBS中の0.01%Tritonの〜5液滴ですすぎ、引き続きミリQ水で15秒間すすぎ、その後窒素で乾燥した。次に6ボタン式αスタンプを、1mM ATP処理した35°斜めに沈着したAuスライドと〜1分間接触させ、接触を確実にするために、接触の開始時にはゆるい圧力を数秒間加えた。その後αスタンプを剥離し、光学セルをOTSスライドおよび5CB液晶と共に配置した。その後光学セルを、40℃で2日間インキュベーションし、バックグラウンドLCホメオトロピックに戻した。結果は、図5の画像に示している。
シリコンウエハは、1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)でスクラビングした。スクラビングしたウエハは、NMPにより1700rpmで回転洗浄し、およびこのウエハは、1.0%固形SE-7210ポリイミドにより1700rpmでスピンコーティングした。ウエハは、85℃で10分間予備硬化し、その後最終硬化を180℃で15分間行った。ポリイミド表面は、機械により、下記設定でラビングした:
ホイールスピード:343rpm、
テーブルスピード:3cm/秒
非負荷ホイール電流:0.065amp
負荷ホイール電流:0.055amp
左高さ読取り:2.530
右高さ読取り:2.530
プロテインA:1mg/ml
ウシ血清アルブミン:0.1mg/ml
マウスIgG:1μM
ポリイミド被覆したウエハ:21.0、21.1
プロテインA:23.4、22.9、22.9
BSA:22.3、21.8、22.2
マウス抗体:24.9、24.2
ガラススライドを、1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)でスクラビングし、NMPにより1700rpmで回転洗浄し、および1.0%固形ポリイミドSE-7210により1700rpmでスピンコーティングした。スライドは、85℃で10分間予備硬化し、その後最終硬化を180℃で15分間行った。下記の材料を、列記した順番で、液滴インキュベーションにより添加した:
プロテインA:1mg/ml
BSA:0.1mg/ml
マウス抗体:1μM
液晶と組合せたポリイミド表面(SE-7210)を用い、標的分子を特異的に検出することができる。この実験において、本発明者らは、プロテインAで処理した表面上のマウスIgGの検出およびラットIgGの検出の欠損を明らかにしている。プロテインAは、マウスIgGに強力に結合することがわかっているが、これは弱いか無のラットIgGの結合親和性を示す。
プロテインA:1mg/ml
BSA:0.1mg/ml
マウスIgG 2a:1μM
ラットIgG:1μM
ガラススライドは、ポリイミドで被覆し、先に説明した標準プロトコールを用いてラビングした。スライドは、下記の試薬により、各試薬について30分間のインキュベーション期間を用い、機能化した。ブロック剤魚ゼラチン中のプロテインAの連続希釈1:99、10:90、25:75および50:50を作成し、表面の標的分子に対する感度を制御した:
プロテインA:1.0mg/ml
魚ゼラチンの30%ストック液を0.1%希釈
抗ビオチン抗体:100μg/ml
ビオチン(100μg/ml)を、各機能化された区域に添加した。二次抗ビオチン抗体(100μg/ml)を塗布した。下記のように処理された対照領域を含んだ:
1.プロテインA+魚ゼラチン
2.プロテインA+魚ゼラチン+抗体1
3.プロテインA+魚ゼラチン+抗体1+ビオチン
ポリイミド表面は、実施例12および13に説明されたものと同様に調製した。表面に塗布した試薬も、先の実験と同じであった。この場合、各段階のインキュベーション時間を、2時間から10分間に短縮した。液晶E7を使用した。
ポリイミド表面は、実施例12および13に説明されたものと同様に調製した。各試薬について、インキュベーション時間10分を使用した。LC ZL1-1221を使用した。標的タンパク質(マウス抗体)の濃度は変動し(0.1μM、0.01μMおよび1.0μM)、ラット抗体を陰性対照として使用した。
ポリイミド表面は、実施例12および13に説明されたものと同様に調製した。全ての試薬は、これらの実施例において使用したものと同じであった。ラット抗体を陰性対照として使用した。LC ZL1-1221を使用した。プロテインAおよびBSA曝露に関しては、10分のインキュベーション時間を使用したが、抗体曝露には2時間のインキュベーションを使用した。
4個のポリイミドで被覆およびラビングしたスライドを、以下に列記した材料でブロットした。スライドは、各材料について30分間のインキュベーション時間を用いてブロットした。連続希釈は、プロテインAと希釈した魚ゼラチンの比1:99、10:90、25:75および50:50を用いて行った。各スライドは、4種の混合したプロテインA/魚ゼラチン希釈試料のひとつでブロッティングした。一次抗体(抗ビオチン)、ビオチン、および二次抗体(抗ビオチン)の連続添加を、特定された区域に添加した。スライドのコーティングおよびラビング手法は、先の実施例において使用されるものと同一であった。試薬は以下である:
プロテインA:1.0mg/ml
魚ゼラチン:30%ストックの0.1%希釈
抗ビオチン抗体:100μg/ml
ビオチン抗原:100μg/ml
ZL1-1221
全般的材料:
ウイルス:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(Chantilly, VA)から入手した小胞口内炎ウイルス-インディアナ株(VSV-I)を、BHK-21細胞上で増殖した。最初のストックのアリコートを、-80℃で貯蔵し、作業用ストックウイルス調製のために提供した。ウイルス力価は、BHK細胞上でのプラーク形成により計算した。ウイルスは、試験のために、10%ウシ胎仔血清を含む増殖培地で希釈した。
抗体:VSV-Iに対する抗体は、National Veterinary Diagnostic Laboratory(Ames、Iowa)およびATCC(Chantilly, VA)から入手した。
ポリウレタン:Norland Optical Adhesive 61(Norland Products, Cranbury, NJ)
液晶:5CB、E7、ZLI 1221、MLC 1400-100、MLC10000-100(EMD Chemicals)
ポリイミド配列層:SE 7210、SE 7511L(Nissan Chemicals)
ガラススライド:アルミノケイ酸塩、Corning 1737 F
Coulomb 3Dなどの利用可能なソフトウェアを用い、電界をシミュレーションし、平面内の電極間のキャパシタンスを計算した。シミュレーションの結果を基に、適当な電極形状(三角、双曲、交差指状など)およびパラメータ(厚さ、幅、間隔)は、電極の間のキャパシタンスが、容易に検出可能な範囲に、典型的にはpF範囲内に収まるように確定される。
先に説明したように加工した電極を用い、実験測定を行い、既知の配向で電極に係留された液晶のキャパシタンスを測定した。これらの測定は、LCの既知の配向を生じているLC配列フィルムで電極をコーティングすることにより行った。薄い(20nm-厚さ)LC配列層(Nissan SE 7210)を、2個のガラス基板(1個は最適化した電極を伴い、他方は電極を伴わない)上にコーティングし、緩衝し、電極指に対し垂直の予め決定された方位角方向にLC材料を配列している表面形態の異方性を生じた。約25μmの厚さの光学セルを、各端をMylarフィルムで分離した、これらの2個の基板を一緒にしたクランプ締めにより加工した。液晶4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル(5CB)を、等方相(40℃)で基板間のギャップに注入し、室温に冷却した。精密LCRメーター(HP 42841, Agilent Technologies)を用い、電極間のキャパシタンスを測定した。
その上に抗体が固定される(ウイルス捕獲のため)化学的に均一な表面を提供するために、同一平面電極アレイを薄いポリマー層でコーティングした。前記実施例は、ポリウレタンフィルム上に固定された抗体は、WNVの検出に十分な結合能を有し、従ってポリウレタンの薄層は、電極アレイ上にスピンコーティングされることを確立した。特にポリウレタンNOA61の薄層を、表面上にスピンコーティングし、真空デシケータ内で脱気した。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の平らな小片を、NOA61コーティングしたガラススライド上に配置し、圧縮し脱気した。このサンドイッチを、365nmの紫外光中で30分間架橋した。PDMSを、表面から剥離し、基板上にポリウレタンの薄い〜40μm層を得た。PUフィルムが液晶の再配向のために変化を見るには厚すぎる場合は、表面上をスピンコーティングする前に、NOA61をアセトンで希釈することにより、より薄い層を作成した。電極指の間のキャパシタンスを参照のために測定した。
抗体の固定にはふたつの手法を利用した。両方とも、前記実施例においてVSVの検出が可能なことがわかった。第一の方法は、ポリウレタン表面への抗体の受動吸着を使用する。第二の方法は、抗体の配向した固定を実現するために、プロテインAを利用する。抗体(モノクローナルまたはウサギポリクローナル)は、20μl液滴からの表面への吸着が可能である。これらの表面のVSV結合能は、機能化された区域のVSV-Iの溶液への35℃で1.5時間の揺動を伴う曝露によりバリデーションした。試料はPBSですすぎ、厚さ20μmのMylarスペーサーを、スライドの各端に配置した。トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシラン被覆したスライドを、最上部に置き、底のスライドへクランプ締めし、光学セルを形成した。15μlの5CBをセルに添加した。その後表面を、交差(90°)分極フィルター間で目視した。目視の暗視野は、LCのホメオトロピック配列を証明した。
キャパシタンスの測定
実施例19に説明したようなバリデーションされた表面および電極幾何学的形状を使用し、高精度のLCRメーターを使用し、ウイルスに未結合の表面上の液晶フィルムおよび結合したウイルスを伴う表面上の液晶フィルムを支えている電極間のキャパシタンスの変化を測定した。配向遷移により誘導されたキャパシタンスの変化を決定するために、5種の光学セルを構成した:
1)未処理のポリウレタン(PU)表面;
2)VSV-Iに対する抗体で処理したPU表面;
3)VSV-Iおよび単純ヘルペスなどの非特異的ウイルスに対する抗体で処理したPU表面;
4)VSV-Iに対する抗体、およびVSV-Iウイルスで処理したPU表面;および
5)非特異的抗体(例えば抗ビオチンIgG)およびVSV-Iウイルスで処理したPU表面。
LCを基にしたアッセイ感度は、ウイルスの結合時に平面からホメオトロピック構成への配向遷移を受けるLCの能力に左右されることが企図されている。この配向遷移を受ける傾向は、LC分子とウイルス粒子の間の詳細な分子レベルの相互作用に左右される。本発明者らは、5CB、E7、MLC 1400-100、MLC10000-100、TL-205を含む様々なLC材料を、配向遷移を受けるそれらの適用性および有効性に関して評価した。予備的試験において、14種の液晶を、脂質に対するそれらの反応について試験し、脂質への反応においてホメオトロピック配向を呈するものとしてそれらを同定した(表1)。2個の電極の間のキャパシタンスの変化も、LC材料の誘電体異方性により左右され、これは市販のLC材料について最大30である。しかしいくつかの報告書は、少量の極性材料の添加が、LC材料の誘電体異方性を有意に増加することを示唆している。従って、アッセイ感度を究極的に増大するLCの誘電体異方性の増強のためのドーパントとして、Sn2P2S6などの既知の強誘電性材料を含む装置が構成された(Ouskovaら、Dielectric relaxation spectroscopy of a nematic liquid crystal doped with ferroelectric Sn2P2S6 nanoparticles、Liquid Crystals、30:1-5(2003))。
キャパシタンス測定のために利用した電極の存在は、全表面ベースの分析法に立ち向かう基礎となる挑戦に取り組む機会を提供する。すなわち、分析物の試料マトリックスから分析表面への輸送は一般に、表面ベースの分析において律速段階である(時々、十分な結合を生じるために延長されたインキュベーション時間が必要なことがある)。本発明のある方法は、二元電気泳動を介した表面へのウイルス輸送を促進するために、分析表面上に存在する電極を利用する。従って装置内の電極は、多機能であり−これらは、表面へのウイルス輸送速度を増加し(以下に説明されるように、二元電気泳動を介して)、および結合したウイルスの存在を報告するために感度のある方法の基礎を形成する(実施例1〜20に説明されたように)の両方の機能がある。
FDEP=2πrp 3εmRe[Ke]∇│Erms│2
ここでεmは、媒体の誘電率であり、Ermsは、電界強度の二乗平均平方根であり、およびRe[Ke]は、下記式で与えられるクラウジス-モソティ因子の実数部であり、
ここでε* pおよびε* mは、各々、粒子および媒体の有効誘電率である。二元電気泳動の力の方向は、粒子および媒体の相対導電率および誘電率により左右されるRe[KE]の相対符号により決定される。例えば、σm=600mSm-1、およびεm=80εoを有するTSEのような生理的媒体中に懸濁された球形のウイルス粒子に関して、単独殻(single shell)モデルは、10MHzでRe[KE]=-0.46を生じる。この結果は、このウイルス粒子は、10MHzでより低い電界領域に向かい移動することを示している。これは「負の(negative)二元電気泳動」と称される。それらの間の5VppのAC電界強度で10μm間隔の双曲電極により規定される電界勾配において、電極の端に配置された半径250nmのウイルス粒子に発揮された二元電気泳動力は、3pNである。比較のために、媒体内のこの粒子のブラウン運度に関連した力は、FB=KBT/(2rp)の桁であり、ここでKBはボルツマン定数であり、Tは絶対温度である。従って室温で、このウイルス粒子が経験した力は10-2pNの桁である。これらの結果は、二元電気泳動力は、ウイルス粒子の拡散輸送が原因である粒子に働く熱の力からよりも、大きさが少なくとも2桁より強力であることを明確に指摘している。粒子の運動式は、粒子に働くブラウン力および浮力を無視し、二元電気泳動力およびそれに作用する粘度抵抗により決定される。二元電気泳動力3pNを用い、ウイルス粒子の速度を、700μms-1と推定した。従ってこの粒子が100μmの距離を移動するのに必要な時間は、0.1秒の桁である。水中に懸濁された粒子の拡散係数は、ストークス-アインシュタイン式を用い概算することができる;D=KBT/(6πηrp)、ここでηは媒体の粘度係数である。拡散係数は、10-12m2s-1と概算される。ウイルス粒子が二元電気泳動力の非存在下で同じ100μmの距離を拡散するのに必要な時間は、1.4時間である。この簡単な概算推定値は、媒体内に懸濁されたウイルス粒子に働いた二元電気泳動力は、拡散プロセス単独によるものよりも、少なくとも4桁の大きさでより早くウイルス粒子を推進することを示している。これらの結果は、二元電気泳動力の印加は、表面上のウイルス粒子の大量輸送を著しく増強し、その結果リアルタイムウイルス検出の基礎を提供することを明確に示している。
ウイルス粒子に働くDEP力は、ふたつの電極間の電界の勾配に強力に左右される。この課題において、交差指状、双曲、長方形および三角形などの異なる電極幾何学的形状を、電極間の領域に最大電界勾配を作成するそれらの能力について調べた。この研究は、異なる電極アレイにより形成された電界のコンピューターモデリングにより導かれる。このモデリングは、Coulomb 3Dのような市販のソフトウェアを使用する。図6は、双曲電極のシミュレーションの結果を示している。これらの結果は、電界勾配は、負の二元電気泳動のためのウイルス収集区域である電極の中心に局所的最小を発揮することを示している。
Morganらの結果(Separation of submicron bioparticles by dielectrophoresis、Biophysical Journal, 77:516-525(1999))は、ウイルスは、電界周波数(frequency)の関数として正および負の両二元電気泳動を発揮し、ならびにこの挙動は懸濁媒体の誘電特性に左右されることを指摘している。周波数領域中のこのクロスオーバー作用を、ウイルス粒子の異なる懸濁媒体を用いて調べた。 Tris生理食塩水EDTA、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、10%ウシ胎仔血清に加え様々な動物およびヒト血清を含む最小必須培地などの増殖培地、ならびに標準ウイルス輸送媒体は、それらの誘電特性およびウイルスに働く二元電気泳動力に対するそれらの作用について試験した。最短の時間および最小量の試料で最大反応を生じる、印加されたAC場の強度および周波数、ならびに懸濁媒体のイオン強度などの変数の組合せを確定した。リアルタイムでこれらの事象をモニタリングするために、ウイルス粒子を標識した。Akinらにより最近公開された方法(Real-time virus trapping and fluorescent imaging in microfluidic devices、Nano Letters、4:257-259(2004))は、ワクシニアウイルスのエンベロープを標識するために親油性カルボシアニン色素を使用する方法を利用している。これらの色素(DiOC63およびDIL、Molecular Probes, CA)は、ウイルスの脂質膜およびキャプシドタンパク質を標識し、倍率400Xのデジタルエピ蛍光顕微鏡による表面結合したワクシニアの可視化を可能にした。
ビーズの調製。Sera-Magビーズ(直径0.8μM)を、0.4mg/mL EDC(Aldrich)または1.1mg/mL Sulfo-NHS(Pierce)のいずれかで、機能化した。最初に5%Sera-Magビーズ27μlを、機能化剤1mL中に希釈した。15分間反応を実行し、その後2-メルカプトエタノールで停止した。ビーズを、25mM MESおよび37.5mM NaClで3回洗浄した。洗浄したビーズを、11,300rpmで5分間遠心した。緩衝液を除去し、その後新たな緩衝液を添加した。次に0.06μM aF1pAb(100μg/mL)を1.5〜2時間添加し、その間ビーズを回転および混合した。ビーズに、最終濃度10mM D-グルコースアミンを添加することにより、アミンについて反応停止した。その後ビーズを、PBS+D-グルコースアミン(10mM)で20分間洗浄した。ビーズを、通常の微量遠心管に移し、BSAでブロックし、非標的分子のビーズへの非特異的結合を阻止した。
表2および3は、様々な液晶が、培養細胞によりホメオトロピック配向されるそれらの能力について調べた実験の結果を示している。多くの液晶は、リン脂質およびコレステロールに対する反応において、ホメオトロピックに配列する。リン脂質(2ul;クロロホルム中0.01M)を、ガラススライド上の区切られた印を付けた区域に塗布した。リン脂質は、ジオレオイルアルキル鎖および下記のヘッド基を有した:ホスファチジルセリン(DOPS)、ホスファチジルグリセロール(DOPG)、ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルセリン(DOPS)、ホスファチジル酸(DOPA)、およびリソホスファチジルコリン(DOLPC)。溶媒を乾燥した後、光学セルを、ネマチックに適用した液晶と共に集成し、かつ等方性に加熱した。ホメオトロピック配列を、コノスコープ分析により確認した。Chol=コレステロール;C=コレステリック配列;Bkg=バックグランド配列;U=未配列;H=ホメオトロピックな配列;NDはバックグランドのために行わなかったことを示す;40CB、4-オクチル-4-ビフェニル-カルボニトリル(Aldrich);6CHBT、1-(trans-4-ヘキシルクロヘキシル)-4-イソチオシアナト-ベンゼン。他の液晶は全てEM Industries/Merckから得た。
この実験は、液晶を用いる、固定された抗ビオチン抗体に対するビオチンで標識したリポソームの結合の検出を説明している。抗ビオチン抗体が固定されたガラス基板は、下記のように調製した。プラズマ集塵機(20分間、275ワット、200millitor)中で洗浄したPrecisionCTスライド(Bioslide Technologies;カタログ番号BSP-SC02-C)を、無水アセトン中の2%APES(3-アミノプロピルトリエトキシシラン;Pierce)中に2分間含浸した。スライドを、純粋なアセトンに移し、5分間攪拌し、アセトンで洗浄し、過剰なシランを除去した。スライドを、窒素で乾燥し、110℃の炉の中に45分間放置した。スライドを炉から取り出し、これらが室温に達した後、スライドの片側に区域に印を付けた。BS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート;Pierce)架橋剤1mg/mlを、印を付けた区域に10μl液滴として塗布し、室温で15分間インキュベーションした。水で過剰な架橋剤をすすいだ後、表面を窒素ガスで乾燥した。100ug/mlおよび20ug/ml抗ビオチン抗体(Sigma;ヤギにおいて産生した抗ビオチン抗体)を、BS3処理した表面に塗布し、室温で2時間または室温で1時間インキュベーションし、その後4℃で一晩移した。抗体が固定された表面を、ミリQ水ですすぎ、未結合のタンパク質を除去し、N2で乾燥した。ビオチンで標識したリポソーム(17.84μmolリン脂質/ml)および未標識のリポソーム(18.7μmolリン脂質/ml)を、PBS緩衝液で100倍希釈し、リポソーム10ulを抗ビオチン抗体処理した表面に塗布した。PBS緩衝液を、緩衝液対照としてひとつの区域に添加した。室温で1.5時間インキュベーションした後、表面を、水ですすぎ、N2で乾燥した。2種のタンパク質で処理した表面を、二つの側に20μm Mylarスペーサーを挿入することにより離れて維持し、ふたつの表面を、逆平行に配列した。ふたつの表面は、Mylarを配置した側に沿って配置したブルドッグクリップを用い、互いに一緒に保持した。セルを、ホットプレート上に配置することにより、〜40℃で加熱した。同じく熱空気を使用し、セルの周囲の空気を温めた。5CBを、ガラスシリンジ内でその等方相に加熱した。5CBの液滴を、毛管力により、ふたつの表面の間の洞に垂らした。一旦5CBが充填されると、セルはホットプレートから取り除いた。室温に達した後、5CBの等方相は、ネマチック状態に変換した。光学画像を、偏光顕微鏡を用い、交差分極位置で撮影した。前記実験を、3つ組で行った。1回の実験のデータを、図15に示した。
試料(ビオチン)リポソーム:17.84μmolリン脂質/ml
対照リポソーム:18.7μmolリン脂質/ml
リポソームは、それらのサイズについて、Nicomp 380粒子選別器を用いて分析した。容積加重したガウス平均直径は以下であった:
試料(ビオチン)リポソーム:134nm
対照リポソーム:157nm。
Claims (209)
- a)
i)ウイルスを含むことが疑わしい試料;
ii)その上に固定された第一のウイルス認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む基板を含む、検出装置;
iii)メソゲンを提供する段階;
b)該検出領域を該試料と接触する段階;
c)該基板を該メソゲンと接触する段階
を含むウイルス検出法であって、
ここで該ウイルスの存在は、該検出領域にわたる該メソゲンの変化により示され、かつここで該変化は、該検出領域上に加えられたホメオトロピックディレクターの存在とは無関係である、方法。 - メソゲン中の変化が、色の変化、質感の変化、傾斜角度の変化、およびホメオトロピック配向からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- メソゲン中の変化が、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される方法により検出される、請求項1記載の方法。
- ウイルスが、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科, コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、イリドウイルス科、フィロウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科、バドナウイルス、ブロモウイルス科、コモウイルス科、ジェミニウイルス科、パルティティウイルス科、ポティウイルス科、セキウイルス科、およびトンブスウイルス科の科からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ウイルスが、日本脳炎ウイルス群のウイルスである、請求項1記載の方法。
- 日本脳炎ウイルス群のウイルスが、西ナイルウイルスおよびセントルイス脳炎ウイルスからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- ウイルスが、エンベロープを持つウイルスである、請求項4記載の方法。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 高分子材料が、ポリウレタン、PDMS、ポリイミド、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリイソシアノアクリレートからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- メソゲンが、4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル、N-(4-メトキシベンジリデン)-4-ブチルアニリンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ウイルス認識部分が、抗原結合タンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、免疫グロブリンである、請求項11記載の方法。
- 基板が、複数の検出領域を含む、請求項1記載の方法。
- 複数の検出領域が、それらに結合する同じウイルス認識部分を有する、請求項1記載の方法。
- 複数の検出領域が、それらに結合する異なるウイルス認識部分を有する、請求項1記載の方法。
- 検出装置が、セルを形成するために、第一の基板と反対に配置された第二の基板を更に含む、請求項1記載の方法。
- メソゲンの変化が、交差分極レンズ間の検出装置を目視する段階により検出される、請求項1記載の方法。
- 検出領域が、ウイルス非存在下では、メソゲンをホメオトロピック配向しない、請求項1記載の方法。
- 試料が、生体液、組織ホモジネート、糞便、水疱液、開口部または組織のスワブ、およびウイルスが培養または調製された培地からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 生体液が、脳脊髄液、尿、血清、血漿、鼻分泌液、痰、精液および唾液からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ホメオトロピックな秩序が、試料を検出領域に塗布後48時間以内に認められる、請求項1記載の方法。
- その上に固定された第一のウイルスに特異的な該ウイルス認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む第一の基板を含み、ここで該検出領域は、該ウイルスの非存在下では添加されたメソゲンをホメオトロピック配向しない、ウイルス検出装置。
- 第一の基板が、複数の検出領域を含む、請求項22記載の装置。
- ウイルス認識部分が、抗原結合タンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項22記載の装置。
- 複数の検出領域が、アレイ内に配置されている、請求項23記載の装置。
- 固定されたウイルスを含む少なくとも1個の対照領域を更に含む、請求項22記載の装置。
- メソゲンを含むセルを形成するために、第一の基板と反対に配向された第二の基板を更に含む、請求項22記載の装置。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項22記載の装置。
- a)その上に固定された第一のウイルスに特異的な該ウイルス認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む第一の基板を含み、ここで該検出領域は、該ウイルス非存在下では添加されたメソゲンをホメオトロピック配向しない、ウイルス検出装置;および
b)該ウイルス検出に関する説明書を含む、キット。 - メソゲンを含むバイアルを更に含む、請求項29記載のキット。
- 陽性対照として使用するためのウイルスを含むバイアルを更に含む、請求項29記載のキット。
- a)
i)脂質膜を伴う実体を含むことが疑わしい試料;
ii)少なくとも1個の検出領域を含む基板を含む、検出装置;
iii)メソゲンを提供する段階;
b)該検出領域を該試料と接触する段階;
c)該基板を該メソゲンと接触する段階
を含む、脂質膜を含む実体を検出する方法であり、
ここで該脂質膜を伴う生物学的実体の存在は、該検出領域にわたる該メソゲンの変化により示される、方法。 - メソゲン中の変化が、色の変化、質感の変化、傾斜角の変化、およびホメオトロピック配向からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- メソゲン中の変化が、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される方法により検出される、請求項32記載の方法。
- 実体が、細胞、細菌、マイコプラスマ、ウイルス、およびリポソームまたはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- 高分子材料が、ポリウレタン、PDMS、ポリイミド、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリイソシアノアクリレートからなる群より選択される、請求項36記載の方法。
- メソゲンが、4-シアノ-4'-ペンチルビフェニル、N-(4-メトキシベンジリデン)-4-ブチルアニリンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- メソゲンが、4-シアノ-4'-ペンチルビフェニルである、請求項32記載の方法。
- 検出領域が、生物学的実体を認識する認識部分を更に含む、請求項32記載の方法。
- 認識部分が、抗原結合タンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、免疫グロブリンである、請求項41記載の方法。
- 基板が、複数の検出領域を含む、請求項32記載の方法。
- 複数の検出領域が、それらに結合する同じ認識部分を有する、請求項43記載の方法。
- 複数の検出領域が、それらに結合する異なる認識部分を有する、請求項43記載の方法。
- 検出装置が、セルを形成するために、第一の基板と反対に配置された第二の基板を更に含む、請求項32記載の方法。
- メソゲンが、交差分極レンズ間の検出装置を目視する段階により検出される、請求項32記載の方法。
- 検出領域が、ウイルス非存在下では、メソゲンをホメオトロピック配向しない、請求項32記載の方法。
- 試料は、生体液、組織ホモジネート、糞便、水疱液、開口部または組織のスワブ、およびウイルスが培養または調製された培地からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- 生体液が、脳脊髄液、尿、血清、血漿、鼻分泌液、痰、精液および唾液からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- ホメオトロピックな秩序が、試料を検出領域に塗布後48時間以内に認められる、請求項33記載の方法。
- 脂質膜を含む実体は、リガンドを表示するリポソームである、請求項32記載の方法。
- 装置が、その上に固定された脂質膜を含む実体に特異的な少なくとも1個の認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む第一の基板を含み、ここで該検出領域は、該脂質膜を含む実体の非存在下では添加されたメソゲンをホメオトロピック配向しない、脂質膜を含む実体の検出装置。
- 第一の基板が、複数の検出領域を含む、請求項53記載の装置。
- 認識部分が、抗原結合タンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項53記載の装置。
- 複数の検出領域が、認識部分を含む、請求項54記載の装置。
- 複数の検出領域の少なくとも2個は、同じ認識部分を含む、請求項56記載の装置。
- 複数の検出領域が、アレイ内に配置されている、請求項56記載の装置。
- 生体膜を含む固定された対照実体を含む少なくとも1個の対照領域を更に含む、請求項54記載の装置。
- メソゲンを含むセルを形成するために、第一の基板に反対に配向された第二の基板を更に含む、請求項54記載の装置。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項54記載の装置。
- a)その上に固定された脂質膜を含む実体に特異的な第一の認識部分を有する少なくとも1個の検出領域を含む第一の基板を含み、ここで検出領域は、脂質膜を含む該実体の非存在下では添加されたメソゲンをホメオトロピック配向しない、脂質膜を含む実体の検出装置;および
b)該脂質膜を含む実体の検出に関する説明書を含む、キット。 - メソゲンを含むバイアルを更に含む、請求項62記載のキット。
- 陽性対照として使用するための脂質膜を含む実体を含むバイアルを更に含む、請求項62記載のキット。
- a)メソゲンを配列するように処理された機能化された検出基板、少なくとも1個の認識部分を表示するスタンプ基板、該認識部分の結合パートナーを含むと疑われる生物学的被験試料、およびメソゲンを提供する段階;
b)該被験試料を、該スタンプ基板に、該結合パートナーが該認識部分に結合することができるような条件下で接触する段階;
c)該検出基板を、該スタンプ基板と、該認識部分に対する該結合パートナーが該検出基板に移されるような条件下で接触する段階;
d)該メソゲンを該基板に塗布する段階により、該検出基板上の該認識部分に対する該結合パートナーの存在を検出する段階
を含む、方法。 - 生物学的試料が、全血、血清、脳脊髄液、鼻咽頭吸引液、および鼻分泌液からなる群より選択される、請求項65記載の方法。
- 検出基板によるメソゲンの配列が、認識部分への結合パートナーの存在により破壊される、請求項65記載の方法。
- 配列が、ホメオトロピックである、請求項67記載の方法。
- メソゲンが、認識部分の結合パートナーが存在する検出基板の区域にわたりホメオトロピックに配列されていない、請求項65記載の方法。
- 検出基板が、光学セルを形成するために使用される、請求項65記載の方法。
- 検出が、検出基板の交差分極レンズによる分析により行われる、請求項65記載の方法。
- ホメオトロピックに配列されたメソゲンを伴う検出基板の区域が、暗く見える、請求項71記載の方法。
- 実質的に非ホメオトロピックに配列されたメソゲンを伴う検出基板の区域が、明るく見える、請求項71記載の方法。
- 二次的結合剤を提供し、かつ検出前に分析物または認識部分を該二次的結合剤と接触する段階を更に含む、請求項65記載の方法。
- 二次的結合剤が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸からなる群より選択される、請求項74記載の方法。
- 二次的結合剤が、アビジンまたはビオチンである、請求項75記載の方法。
- 二次的結合剤が、脂質と複合されている、請求項75記載の方法。
- 二次的結合剤が、リポソーム上に表示されている、請求項74記載の方法。
- 認識部分が、病原生物由来の抗原性物質である、請求項65記載の方法。
- 抗原性物質が、タンパク質である、請求項79記載の方法。
- タンパク質が、ウイルスのエンベロープタンパク質である、請求項80記載の方法。
- エンベロープタンパク質が、西ナイルウイルス由来のEタンパクである、請求項81記載の方法。
- 結合パートナーが抗体である、請求項65記載の方法。
- スタンプ基板が、アレイ内に2個またはそれよりも多い認識部分を含む、請求項65記載の方法。
- リガンドが、複数の種または属由来の結合パートナーにより結合されている、請求項65記載の方法。
- メソゲンが5CBである、請求項65記載の方法。
- スタンプ基板が、PDMSを含む、請求項65記載の方法。
- 検出基板が、斜めに沈着された金を含む、請求項65記載の方法。
- a)少なくとも1個の認識部分を表示するスタンプ基板;
b)メソゲンを配向する機能化された検出基板;および
c)認識部分の結合パートナーを検出するための該基板の使用に関する説明書
を含む、キット。 - メソゲンの容器を更に含む、請求項89記載のキット。
- 二次的結合剤を含む容器を更に含む、請求項89記載のキット。
- a)認識部分を表示している第一の基板であり、ここで該認識部分は分析物と相互作用する、基板;
b)該認識部分と相互作用する該分析物を受け取るように構成された表面を含む第二の基板;および
c)該第二の基板にオーバーレイしている液晶
を含む、分析物を検出するためのシステム。 - 第一の基板が、スタンプ、ビーズ、およびカラムからなる群より選択される、請求項92記載のシステム。
- スタンプが、PDMSを含む、請求項92記載のシステム。
- ビーズが、磁気ビーズである、請求項92記載のシステム。
- カラムが、免疫親和性カラムである、請求項92記載のシステム。
- 認識部分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項92記載のシステム。
- 液晶が、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)からなる群より選択されるメソゲンを含む、請求項92記載のシステム。
- 第二の基板が、機能化された表面を含む、請求項92記載のシステム。
- 機能化された表面が、ポリイミドを含む、請求項92記載のシステム。
- ポリイミドが、ラビング(rubbed)されている、請求項100記載のシステム。
- ポリイミドが、Nissan 7210、Nissan 3510、Nissan 410、Nissan 3140、Nissan 5291、およびJapan Synthetic Rubber JALS 146-Rl9からなる群より選択される、請求項101記載のシステム。
- ポリイミドが、液晶をホメオトロピックに配向する、請求項100記載のシステム。
- ポリイミドが、Nissan 7511LおよびSE 1211からなる群より選択される、請求項103記載のシステム。
- a)認識部分を表示する第一の基板、第二の基板、メソゲン、および分析物を含むことが疑われる試料を提供する段階;
b)該認識部分を表示する第一の基板を、分析物を含むことが疑われる該試料と接触させ、該分析物を該認識部分と相互作用させる段階;
c)該認識部分と相互作用する該分析物を、該第二の基板へ移動する段階;ならびに
d)該第二の基板を該メソゲンと接触させ、該第二の基板上の該分析物の存在を検出する段階
を含む、分析物を検出する方法。 - 認識部分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 分析物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、有機分子、無機分子、ウイルス、リポソーム、細菌、真菌、および細胞からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 第一の基板が、スタンプ、ビーズ、およびカラムからなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 第二の基板が、シリコン、ガラス、ポリマー、ダイヤモンド、および金属からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 第二の基板が、ポリイミドで機能化された表面を含む、請求項105記載の方法。
- ポリイミドが、ラビングされている、請求項110記載の方法。
- ポリイミドが、Nissan 7210、Nissan 3510、Nissan 410、Nissan 3140、Nissan 5291、およびJapan Synthetic Rubber JALS 146-R19からなる群より選択される、請求項111記載の方法。
- ポリイミドが、液晶をホメオトロピックに配向する、請求項110記載の方法。
- ポリイミドが、Nissan 7511LおよびSE 1211からなる群より選択される、請求項113記載の方法。
- 分析物の存在が、交差分極レンズにより目視した場合に白色または明色に見える秩序のない液晶により示され、ならびに分析物が結合されない区域は、秩序を維持し、および交差分極レンズにより目視した場合に暗色に見える、請求項105記載の方法。
- 分析物の存在が、交差分極レンズにより目視した場合に白色または明色に見える無秩序な液晶により示され、ならびに分析物が結合されない区域は、ホメオトロピック配向を維持し、および暗色に見える、請求項105記載の方法。
- メソゲンが、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- 第二の基板上の分析物の存在が、メソゲンの配向の差異により示される、請求項105記載の方法。
- メソゲンの配向の差異が、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される方法により検出される、請求項118記載の方法。
- 移動段階が、分析物を第一の基板から溶離する段階を更に含む、請求項105記載の方法。
- 分析物-認識部分複合体を、二次的結合剤と接触する段階を更に含む、請求項105記載の方法。
- 二次的結合剤が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、および核酸からなる群より選択される、請求項121記載の方法。
- 二次的結合剤が、アビジンまたはビオチンである、請求項121記載の方法。
- 二次的結合剤の存在が、第二の基板への移動後の、分析物の検出を増強する、請求項121記載の方法。
- 二次的結合剤が、脂質と複合されている、請求項122記載の方法。
- 二次的結合剤が、リポソーム上に表示される、請求項125記載の方法。
- a)分析物と相互作用する認識部分を表示する第一の基板;
b)該認識部分と相互作用している分析物を受け取るように構成された表面を含む第二の基板;
c)メソゲンを含むバイアル;および
d)分析物の検出に関する説明書
を含む、キット。 - 第一の基板が、スタンプ、ビーズ、およびカラム媒体からなる群より選択される、請求項127記載のキット。
- a)
i)分析物を含むことが疑われる試料;
ii)少なくとも1個の電極および少なくとも1個の検出領域を含む基板を含む、検出装置;
iii)メソゲンを提供する段階、
b)少なくとも1個の電極に電位を加え、該分析物を該基板に輸送する段階;
c)該基板を該メソゲンと接触させ、ここで該分析物の存在が、該少なくとも1個の検出領域にわたる該メソゲンの配列の差異により示される段階
を含む、分析物を検出する方法。 - 電位が交流である、請求項129記載の方法。
- 輸送が、二元電気泳動(dielectrophoresis)により生じる、請求項129記載の方法。
- メソゲンの配列における差異は、色の変化、質感の変化、傾斜角度の変化、およびホメオトロピック配向からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- メソゲンの配列の差異は、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- 分析物が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、有機分子、無機分子、ウイルス、細菌、リポソーム、細胞、および真菌からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- 高分子材料が、ポリウレタン、PDMS、ポリイミド、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリイソシアノアクリレートからなる群より選択される、請求項135記載の方法。
- メソゲンが、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- メソゲンが、5CBである、請求項137記載の方法。
- 検出領域が、認識部分を含む、請求項129記載の方法。
- 認識部分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、および無機分子からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項140記載の方法。
- 基板が、複数の検出領域を含む、請求項129記載の方法。
- 複数の検出領域が、同じ認識部分を表示する、請求項142記載の方法。
- 複数の検出領域が、異なる認識部分を表示する、請求項142記載の方法。
- 検出装置が、セルを形成するために、第一の基板の反対に配置された第二の基板を更に含む、請求項129記載の方法。
- 試料が、生体液、組織ホモジネート、糞便、水疱液、開口部または組織のスワブ、およびそこでウイルスが培養または調製された培地からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- 生体液が、脳脊髄液、尿、血清、血漿、鼻分泌液、痰、精液、および唾液からなる群より選択される、請求項146記載の方法。
- 検出装置のインピーダンスを測定する段階による、結合している分析物を検出する段階を更に含み、ここでキャパシタンスの変化は、分析物結合の指標である、請求項129記載の方法。
- インピーダンスが、キャパシタンスまたは抵抗である、請求項148記載の方法。
- 測定がリアルタイムである、請求項148記載の方法。
- 少なくとも1個の電極および少なくとも1個の検出領域を含む第一の基板であり、ここで該少なくとも1個の電極が、分析物を該基板に引きつけるための電位を提供し、かつ装置の電気特性の測定により、該分析物の存在を決定するように構成された基板、ならびに
該第一の基板の反対に配向された第二の基板であり、ここで該第一の基板および第二の基板が、液晶を含むためのチャンバーを形成する基板を含む、分析物の検出装置。 - 電気的特性が、インピーダンスである、請求項151記載の装置。
- インピーダンスが、キャパシタンスまたは抵抗である、請求項152記載の装置。
- インピーダンスが、キャパシタンスである、請求項153記載の装置。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項151記載の装置。
- 高分子材料が、ポリウレタン、PDMS、ポリイミド、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリイソシアノアクリレートからなる群より選択される、請求項155記載の装置。
- メソゲンを更に含み、該メソゲンがE7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項151記載の装置。
- 検出領域が、認識部分を含む、請求項151記載の装置。
- 認識部分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、および無機分子からなる群より選択される、請求項158記載の装置。
- タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項159記載の装置。
- 第一の基板が、複数の検出領域を含む、請求項151記載の装置。
- 複数の検出領域が、同じ認識部分を表示する、請求項161記載の装置。
- 複数の検出領域が、異なる認識部分を表示する、請求項161記載の装置。
- 少なくとも1個の電極が、交差指状(インターデジタル)電極、双曲電極、三角型電極、および長方形型電極からなる群より選択される、請求項151記載の装置。
- 第一の基板が、少なくとも2個の電極を含む、請求項151記載の装置。
- 請求項151記載の検出装置および読取り装置を含む、分析物を検出するシステムであり、該読取り装置が、該検出装置、および該検出装置が該読取り装置と接触される場合に少なくとも1個の電極と接続している電気回路を受けるように構成された開口部を含む、システム。
- 読取り装置が、コンピュータープロセッサーとインターフェース接続している、請求項166記載のシステム。
- 読取り装置が、電子ディスプレイを含む、請求項166記載のシステム。
- 読取り装置が、LCDディスプレイを含む、請求項166記載のシステム。
- 電気回路が、発振回路である、請求項166記載のシステム。
- 発振回路が、マイクロプロセッサーを含む、請求項170記載のシステム。
- 読取り装置が、電気キャパシタンスを測定するために構成されたマイクロプロセッサーを含む、請求項166記載のシステム。
- 読取り装置が、電源を含む、請求項166記載のシステム。
- a)分析物を含むことが疑わしい試料、ポリイミドを含む表面を有する基板、およびメソゲンを提供する段階;
b)該ポリイミドを含む表面を、該分析物を含むことが疑わしい試料と接触する段階;
c)該ポリイミドを含む表面を、該メソゲンと接触し、ここで該分析物の存在は、該メソゲンの配向の差異により示される段階
を含む、分析物を検出する方法。 - 分析物は、ポリイミドを含む表面と非特異的に相互作用する、請求項174記載の方法。
- ポリイミドを含む表面は、認識部分を表示する、請求項175記載の方法。
- 認識部分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項174記載の方法。
- メソゲンが、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)からなる群より選択される、請求項174記載の方法。
- ポリイミドが、ラビングされている、請求項174記載の方法。
- ポリイミドが、Nissan 7210、Nissan 3510、Nissan 410、Nissan 3140、Nissan 5291、およびJapan Synthetic Rubber JALS 146-Rl9からなる群より選択される、請求項179記載の方法。
- ポリイミドが、メソゲンをホメオトロピックに配向する、請求項174記載の方法。
- ポリイミドが、Nissan 7511LおよびSE 1211からなる群より選択される、請求項181記載の方法。
- 分析物の存在が、交差分極レンズにより目視した場合に白色または明色に見える無秩序な液晶により示され、ならびに分析物が結合されない区域は、秩序を維持し、および交差分極レンズにより目視した場合に暗色に見える、請求項174記載の方法。
- 分析物の存在が、交差分極レンズにより目視した場合に白色または明色に見える無秩序な液晶により示され、ならびに分析物が結合されない区域は、ホメオトロピック配向を維持し、および暗色に見える、請求項174記載の方法。
- 液晶のホメオトロピック配向が、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される方法により検出される、請求項185記載の方法。
- a)少なくとも1種のリガンド分子および結合パートナー分子が、脂質と複合されている、該リガンドおよび該結合パートナー、ならびにメソゲンを提供する段階;
b)該リガンド分子および該結合パートナー分子を、該リガンド分子と該結合パートナー分子が相互作用し、リガンド-結合パートナー複合体を形成するような条件下で接触させる段階;
c)該複合体をメソゲンと接触させる段階により、該リガンド-結合パートナー複合体を検出する段階
を含む、リガンドとその結合パートナーの間の結合相互作用を検出する方法。 - メソゲンが、ホメオトロピックに配向されている、請求項186記載の方法。
- 結合パートナーが、認識部分である、請求項186記載の方法。
- リガンドが、分析物である、請求項186記載の方法。
- 検出段階が、メソゲンと接触させる前に、複合体を基板と接触させる段階を更に含む、請求項186記載の方法。
- メソゲンのホメオトロピックな配列が、目視検査、光学的検出、分光法、光透過法、および電気的検出からなる群より選択される方法により検出される、請求項187記載の方法。
- 分析物が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、有機分子、無機分子、ウイルス、細菌、リポソーム、細胞、および真菌からなる群より選択される、請求項189記載の方法。
- 基板が、金属フィルム、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび高分子材料からなる群より選択される、請求項190記載の方法。
- 高分子材料が、ポリウレタン、PDMS、ポリイミド、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびポリイソシアノアクリレートからなる群より選択される、請求項193記載の方法。
- メソゲンが、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項186記載の方法。
- 基板が、認識部分を含む検出領域を含む、請求項129記載の方法。
- 認識部分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、および無機分子からなる群より選択される、請求項196記載の方法。
- タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項197記載の方法。
- 基板が、複数の検出領域を含む、請求項196記載の方法。
- 複数の検出領域が、同じ認識部分を表示する、請求項199記載の方法。
- 複数の検出領域が、異なる認識部分を表示する、請求項199記載の方法。
- a)脂質に複合された認識部分;
b)メソゲンを含むバイアル;および
c)分析物の検出に関する説明書
を含む、分析物を検出するためのキット。 - 基板を更に含む、請求項202記載のキット。
- a)脂質に複合された認識部分;および
b)液晶
を含む、分析物の検出のためのシステム。 - 基板を更に含む、請求項204記載のシステム。
- 認識部分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項204記載のシステム。
- 基板が、シリコン、ガラス、ポリマー、ダイヤモンド、および金属からなる群より選択される、請求項205記載のシステム。
- 基板が、液晶を配向させない、請求項205記載のシステム。
- メソゲンが、E7、MLC、5CB(4-n-ペンチル-4'-シアノビフェニル)、8CB(4-シアノ-4'オクチルビフェニル)、BL093、TL 216、ZLI 5800、MLC 6613、およびMBBA((p-メトキシベンジリデン)-p-ブチルアニリン)からなる群より選択される、請求項204記載のシステム。
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