JP2010512535A - 細胞分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる方法及び装置が提供される。当該装置は、互いに空間的に隔てられた第１及び第２の基板；第１の基板の表面に形成された第１の電極アレイ；及び第１の電極アレイに面する側の第２の基板の表面に形成された少なくとも１つの電極を有する。前記少なくとも１つの電極と第１の電極アレイとが、流体を受け入れる分析容積の上側の境界と下側の境界とを定める。分析容積は容積部分のアレイを有する。当該装置の１つ以上の容積部分内で電界の発生及び変更を行うために、少なくとも第１の電極アレイに印加される電圧の振幅及び期間を変化させるように回路が構成される。故に、流体が配置される当該装置の１つ以上の容積部分内に、異なる振幅又は期間を有する電界を生成することによって、複数の細胞のエレクトロポレーション特性が調べられ得る。

Description

本発明は、細胞を分析する方法及び装置、より具体的には、流体中に懸濁された細胞を分析することに関する。

細胞分析は様々な手法で行われることが可能である。細胞分析のための既知の技術には、細胞を含む標本（例えば、２枚の顕微鏡ガラス板間に一滴の血液を配置する）の光学検査、細胞の機械的変形、及びレーザに基づく細胞の計数（フローサイトメトリーとしても知られる）が含まれる。これらの方法は、非常に正確であることも多いが、範囲及び多用途性において限界がある。

細胞のパラメータを調査するために細胞分析を行うことは、電気穿孔法（エレクトロポレーション）と呼ばれる細胞操作技術との関連で重要である。エレクトロポレーションは、分子（例えば、薬剤又は遺伝子など）を細胞内に送り込むことができるように、電界を用いて細胞膜に孔を作り出す技術である。

エレクトロポレーションは、遺伝子治療との関連で重要である。細胞内へのＤＮＡの制御された輸送が必要とされるからである。細胞への遺伝子送達を行う効率的な手法であるとしてウイルスベクターが知られているが、ウイルスベクターの使用は無リスクではない（非特許文献１参照）。エレクトロポレーション等の非ウイルス的な代替手法は、細胞膜を開くのに追加的な化学薬品又は物質を不要とし得るので、特に関心を持たれている。エレクトロポレーションはまた、細胞汚染の虞を低減し得るという利点を有する。

エレクトロポレーションに一般的に使用される装置においては、懸濁流体内の多数の細胞が一度に電気穿孔される。そのような装置の例は、ＢＴＸモレキュラデリバリーシステム社のエレクトロポレーション・ジェネレータ、又はトライテックリサーチ社のクローニングガン（登録商標）である。しかしながら、これらの装置は、装置構成内で電界が変化してしまうため、理想的なものではない。この欠点の結果として、典型的に細胞の９０％はエレクトロポレーション処理を生き残ることができない。

現在、エレクトロポレーションの機構はあまりよく理解されていない。しかしながら、適切な電気波形を選択することにより処理を最適化し得ることが知られている（非特許文献２参照）。そのような最適なエレクトロポレーションパラメータは細胞の型に依存する。故に、１つの細胞型ごとにエレクトロポレーションパラメータの最適化を行わなければならない。

上述の技術を含め、既知の細胞分析技術を用いると、細胞特性の分析及び最適化は労働集約的且つ時間消費型の処理である。

D.J.Wells、2004年、Gene therapy、第11巻、p.1363 Huang en Rubinski、2001年、Sensors and Actuators、第A89巻、p.242

故に、細胞のエレクトロポレーション特性が調査され得るように細胞の制御された検査及び／又は分析のための改善された細胞分析技術を作り出すことが望まれる。また、そのような分析を単一の装置及び／又は手順を用いて行うことを可能にすることが望まれる。

本発明の一態様に従って、流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置が提供される。当該装置は：
互いに空間的に隔てられた第１及び第２の基板；
第１の基板の表面に形成された第１の電極アレイ；
第１の電極アレイに面する側の第２の基板の表面に形成された少なくとも１つの電極であり、該少なくとも１つの電極と第１の電極アレイとが、流体を受け入れる分析容積の上側の境界と下側の境界とを定め、分析容積が容積部分のアレイを有する、少なくとも１つの電極；及び
当該装置の１つ以上の容積部分内で電界の発生及び変更を行うために、少なくとも第１の電極アレイに印加される電圧の振幅又は期間を変化させるように構成された回路；
を有する。

故に、個々の細胞ベースで印加電界を制御することが可能な、細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置が提供される。さらに、この装置は、複数の細胞の最適エレクトロポレーションパラメータを単一の測定手順を用いて見出すために用いられ得る。

本発明の他の一態様に従って、流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置の作動方法が提供される。前記装置は、容積部分のアレイを有する分析容積を間に定めるように空間的に隔てられた２枚の基板を有する。当該方法は、流体が配置される前記装置の１つ以上の容積部分内に、異なる振幅又は期間を有する電界を生成する段階を有する。

本発明の更なる他の一態様に従って、流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置を製造する方法が提供される。当該方法は：
第１の基板の表面に第１の電極アレイを形成する段階；
第２の基板の、第１の電極アレイに面する側の表面に、少なくとも１つの電極を形成する工程であり、第１の基板の前記表面と第２の基板の前記表面とが互いに面するように第１及び第２の基板を互いから空間的に隔て、それにより、前記少なくとも１つの電極と第１の電極アレイとが、流体を受け入れる分析容積の上側の境界と下側の境界とを定め、分析容積が容積部分のアレイを有する、少なくとも１つの電極を形成する段階；及び
前記装置の１つ以上の容積部分内で電界が発生あるいは変更され得るように、少なくとも第１の電極アレイに印加される電圧の振幅又は期間を変化させる回路を設ける段階；
を有する。

本発明の他の一態様に従って、流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置を製造する方法が提供される。当該方法は：
液晶ディスプレイを分解する段階；及び
液晶材料を除去する段階；
を有する。

本発明は、故に、細胞のエレクトロポレーションパラメータを調べるのに必要な時間及び労力を削減する。さらに、これらのパラメータはエレクトロポレーション処理の歩留まりを向上させるために使用され得る。

分析装置はアクティブマトリクスを基礎とする設計を有していてもよい。また、この装置は、誘電泳動（ＤＥＰ）、電気浸透、又は電気流体力学という既知の物理現象を用いて、細胞の電気的な輸送及び捕捉を行うことを可能にし得る。

以下の図を含む添付図面を参照して、本発明の実施例を詳細に説明する。
本発明の一実施形態に従ったマトリクス型細胞分析装置を示す図である。 流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を分析するために使用される装置を例示する、図１の直線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。 本発明の代替的な一実施形態に従ったマトリクス型細胞分析装置を示す図である。 図３に示した装置の概略的な回路図である。 本発明の一実施形態に従った、図３の装置の動作を例示する図である。 図５に例示した装置動作用の選択パルスを示すタイミング図である。 図４に示した回路図の一変形例を示す図である。 本発明の他の一実施形態に従った、図３の装置の動作を例示する図である。 全体を通して、同様の要素には同様の参照符号を付する。

図１を参照するに、本発明の第１実施形態に従ったマトリクスベースの細胞分析装置が示されている。この細胞分析装置は、互いに対して平行に且つ隔てて配置された第１の基板１０及び第２の基板１２を有しており、上下方向において第１の基板１０は第２基板の１２の下方に位置付けられている。

第１の基板１０の上向きの表面上に、第１アレイの電極１４ａ−１４ｄ（以下、第１電極アレイ１４と称する）が設けられている。第１電極アレイ１４の電極１４ａ−１４ｄは、概して細長くて横方向（横方向は矢印“Ｌ”によって大まかに指し示されている）に延在しており、互いに対して実質的に平行に且つ縦方向（縦方向は矢印“Ｍ”によって大まかに指し示されている）に隔てられるように配置されている。

電極に好適な材料の一例は、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）である。当然ながら、例えばＰｔ、Ａｕ、Ｔｉ、Ｔａ等のその他の好適材料が電極の形成のために用いられてもよい。必要に応じて、電極の腐食又は水ベースの流体内での電気分解の発生を防止するため、電極を薄い誘電体層で覆ってもよい。

第２の基板１２の下向きの表面上に、第２アレイの電極１６ａ−１６ｆ（以下、第２電極アレイ１６と称する）が設けられている。言い換えると、第２電極アレイ１６は、第１の基板１０及びその第１電極アレイ１４に面する第２の基板１２の表面に形成されている。第２電極アレイ１６の電極１６ａ−１６ｆは、概して細長くて縦方向に延在しており、互いに対して実質的に平行に且つ横方向に隔てられるように配置されている。

故に、これらの電極アレイは、細胞を含む流体を分析のために配置することが可能な分析容積１８の、上側の境界と下側の境界とを定める。第１電極アレイ１４の電極１４ａと第２電極アレイ１６の電極１６ｆとの交差部の間の容積部分は、分析容積の一部（陰影領域“Ｐ”によって指し示されている）を画成している。

得られたマトリクス構成（液晶ディスプレイ技術の分野で“パッシブマトリクス”と呼ばれる）は、故に、一組の容積体の一方側にロー（行）電極を有し、容積体の他方側に一組のコラム（列）電極を有する。図１に示した実施形態においては、行電極は第１電極アレイ１４の電極であり、電極は第２電極アレイ１６の電極である。

第１電極アレイ１４及び第２電極アレイ１６には電圧ドライバ回路（図示せず）が電気的に接続される。電圧ドライバ回路は、電極アレイに印加される電圧の振幅及び期間を変化させるように適応される。第１電極アレイ１４の電極１４ａ及び第２電極アレイ１６の電極１６ｆの双方への電圧印加により、これら電極の交差部間の容積部分Ｐに電界が生成される。故に、容積部分Ｐに電界を生成することによって、液体内に懸濁され且つ容積部分Ｐ内に位置付けられた細胞のエレクトロポレーション特性が調べられ得る。言い換えると、容積部分Ｐ内に細胞を配置し、容積部分Ｐを画成するように重なり合う電極に電圧を印加することにより、その細胞は電気穿孔される。エレクトロポレーションが完了すると、細胞を必要に応じて検査あるいは調査することができる。このような調査処理は、電気穿孔された細胞を光学的に検査する、あるいは細胞のインピーダンス等の細胞パラメータを測定する段階を含み得る。

従って、第１電極アレイ１４の特定の電極及び第２電極アレイ１６の特定の電極に電圧を印加することにより、分析容積１８の特定部分内に電界を生成することができる。内部に電界が生成される分析容積１８の部分は、電圧が印加される電極の交差位置に一致することになる。故に、認識されるように、第１電極アレイ１４及び第２電極アレイ１６に電圧を印加することによって、分析容積１８の複数の部分をアドレスすることが可能である。このようなアドレス処理は、必要とされる１つ以上の容積部分内に電界を生成するように、好適な制御手段によって制御され得る。

各アレイの電極には様々な振幅及び／又は期間の電圧を印加してもよい。このようにして、２つ以上の容積部分内に同時に様々な振幅及び期間の電界を生成することができる。故に、エレクトロポレーションパラメータが異なり得る２つ以上の細胞を一度に電気穿孔することが可能である。

この処理の一層十分な理解は、図２を参照することによって得られる。図２は、図１の直線Ｘ−Ｘに沿った断面図であり、流体２２内に懸濁された細胞２０を電気穿孔するために使用される分析装置を例示している。

分析する複数の細胞２０を含んだ流体２２が分析容積１８内に供給される。好ましくは、第１の基板１０及び第２の基板１２のうちの少なくとも１つは、流体２２を分析容積１８内の好適位置に導く流体系（図示せず）を備えて形成される。例えば、そのような流体系は、流体２２が導かれて流れるときに沿う基板内に設けられた、少なくとも１つのチャネルから形成されてもよい。代替的に、例えばＳＵ−８等のフォトレジスト層を用いて、基板上にチャネルが構築されてもよい。また、流体内の細胞２０は、誘電泳動（dielectrophoresis；ＤＥＰ）、電気浸透、又は電気流体力学という既知の物理現象を用いて、対向し合う電極間に位置付けられてもよい。

ＤＥＰは、不均一な、定常的（ＤＣ）から時変的（ＡＣ）な電界に晒されたときに中性粒子が、電界強度が増加する（ｐＤＥＰ）あるいは減少する（ｄＤＥＰ）位置に向かう正味の力を受ける物理現象である。誘電泳動力の向きに加え、誘電泳動力の強さは、粒子の誘電特性及び導電特性と、ボディが浸された媒質とに強く依存する。当然ながら、理解されるように、これらの特性はＡＣ電界の周波数の関数としても変化し得る。ＤＥＰに理論に関する更なる情報は、H.A.Pohlの論文「Dielectrophoresis」（ケンブリッジ大学出版、1978年）に記載されている。なお、この論文の内容をここに援用する。

第１電極アレイ１４の第１及び第２の電極１４ａ及び１４ｂに異なる期間及び／又は振幅の電圧を印加するのと同時に、第２電極アレイ１６の電極１６ｄに電圧を印加することにより、それぞれ、第１及び第２の容積部分２４及び２６内に位置付けられた第１及び第２の細胞２０ａ及び２０ｂは、異なる電界の下で電気穿孔される。故に、第１の細胞２０ａと第２の細胞２０ｂとの間で、エレクトロポレーション処理の結果を比較することができる。この概念は、各々が第１電極アレイ１４の１つの電極と第２電極アレイ１６の１つの電極との交差部間に画成された相異なる容積部分に各細胞を配置しておき、液体内に懸濁された任意の数の細胞を電気穿孔することに拡張されることが可能である。

電極アレイの電極群に印加される電圧の期間及び／又は振幅を変化させることにより、単一のエレクトロポレーション手順を用いながら、複数の細胞を異なるエレクトロポレーションパラメータの下で電気穿孔することができる。言い換えると、分析装置の１つ以上の容積部分内に異なる振幅又は期間の電界を生成することにより、複数の細胞のエレクトロポレーション特性を調査し得る。

図１に示した装置の基本構造は、薄い平坦な装置を形成するように厚さの小さい隙間だけ隔てられた、２枚の実質的に平坦な基板から成る。本発明に不可欠なことではないが、この分離の厚さは、第１の基板１０と第２の基板１２との間に配置されたスペーサ（図示せず）によって定められ得る。また、想像されるように、これら基板間の距離は、典型的に５μｍから５０μｍの範囲内であり、より好ましくは１０μｍから３０μｍの範囲内とし得る。しかしながら、理解されるように、この装置は、第１の基板１０と第２の基板１２との間の間隔を調整する調整手段を更に有していてもよい。こうすることにより、この装置は様々な大きさの細胞に応じたものになり得る。

また、当業者に認識されるように、図１の装置は、基板間から液晶が除去されてはいるが、従来からのパッシブマトリクス型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）の構造と同様の構造を有する。故に、想像されるように、本発明の一実施形態に従った細胞分析装置を製造することには、パッシブマトリクス型ＬＣＤを製造するために現在使用されている既知のテクノロジー及び技術を用い得る。

次に、図３を参照するに、本発明の代替的な一実施形態に従ったマトリクス型細胞分析装置が示されている。この細胞分析装置は、互いに対して平行に且つ隔てて配置された第１の基板３０及び第２の基板３２を有しており、上下方向において第１の基板３０は第２基板の３２の下方に位置付けられている。本発明に不可欠なことではないが、この分離距離は、第１の基板３０と第２の基板３２との間に配置されたスペーサ（図示せず）によって定められ得る。代替的に、この装置は、第１の基板３０と第２の基板３２との間の間隔を調整する調整手段を有していてもよい。こうすることにより、この装置は様々な大きさの細胞に応じたものになり得る。

第１の基板３０の上向きの表面上に、第１アレイの電極３４（以下、第１電極アレイと称する）が設けられている。第１電極アレイの電極３４は、複数の行及び列を為す空間的に隔てられた電極群３４を有するマトリクスを形成するように配置されている。電極３４は、ＩＴＯから形成された従来からの薄膜構造である。当然ながら、これらの電極を形成することには、如何なるその他の好適な技術及び材料も用いられ得る。

第２の基板３２の下向きの表面上に、単一の平板電極３６（以下、共通電極３６と称する）が設けられている。言い換えると、共通電極３６は、第１電極アレイに面する第２の基板３２の表面に形成されている。共通電極３６は、ＩＴＯから形成された薄膜構造であり、第２の基板３２の下面の大部分を覆うように構成されている。このように、共通電極３６は、第１電極アレイの全ての電極３４の範囲に及ぶように第１電極アレイの上方に位置付けられる。

故に、共通電極３６及び第１電極アレイは、それぞれ、細胞を含む流体を分析のために配置することが可能な分析容積３８の、上側の境界及び下側の境界を定める。共通電極３６と第１電極アレイの１つの電極３４との間の分析容積部分は、分析容積の第１部分（陰影領域“Ｐ”によって例示されている）を画成している。

本発明に不可欠なことではないが、第２の基板３２及び共通電極３６は、少なくとも部分的に透明である。こうすることにより、分析容積内に供給される液体は、裸眼で、あるいはこの装置の外部に配置された好適な光学機器を用いて、光学的に調査されてもよい。当然ながら、本発明の代替的な一実施形態においては、代わりに第１の基板３０及びその各電極３４が少なくとも部分的に透明にされてもよい。

第１電極アレイには、ロー（行）導体４０、コラム（列）導体４２、及びスイッチング素子４４のアレイを介して、電圧駆動回路（図示せず）が電気的に接続される。行導体４０、列導体４２、及びスイッチング素子４４は、薄膜構造であり、第１電極アレイの電極群３４の間に設けられた空間内で第１の基板３０の上面に形成されている。また、前段落に言及したように、これらの薄膜構造は、分析容積の光学検査を更に単純化するように、少なくとも部分的に透明であってもよい。典型的に、これらの薄膜構造は、表面積のうちの比較的小さい部分のみを覆うようにされ、また、例えばＡｌ及びアモルファスＳｉ等の不透明材料で形成され得る。

第１電極アレイの各電極３４は、スイッチング素子４４を介して、１つの行導体４０及び１つの列導体４２に電気的に接続される。得られたマトリクス構成（液晶ディスプレイ技術の分野において“アクティブマトリクス”として広く知られている）は、アクティブマトリクスにおいては各容積部分のアドレス手法及び電気活性化がデカップリングされることにより、単純なパッシブマトリクス構造とは根本的に異なるものである。言い換えると、各容積部分は、分析容積の残りの部分から分離されており、スイッチング素子を介してのみアドレス用電子回路に接続される。故に、各容積部分は、電界を調整するためにそれ自身のスイッチング素子を有する。各容積部分は、故に、短い時間の間だけ個々にアドレスされることが可能であり、時間フレームの残りの間は残りの容積部分から実質的に分離される。

アクティブマトリクスにおいては、ダイオード（例えば、金属−絶縁体−金属（ＭＩＭ）ＮＩＰ、ＰＩＮ、及びショットキー）及びトランジスタ（薄膜トランジスタ；ＴＦＴ）という２つの主要な型のスイッチング素子が一般的に使用される。薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）が、その優れた光学特性のため、ＬＣＤにおけるスイッチング素子として広く使用されている。しかしながら、ダイオードは、製造が比較的単純であるという利点を有する。図３の実施形態においては、スイッチング素子はＴＦＴであり、ＴＦＴの数は、この装置によって提供される容積部分の数と同じである。

図４を参照するに、各ＴＦＴ４４は、装置の１つの行導体４０及び列導体４２に電気的に接続されている。より具体的には、ＴＦＴ４４の各々は、列導体４２に接続されたソースと、行導体４０に接続されたゲートと、第１電極アレイの電極３４に接続されたドレインとを有する。

ＴＦＴ４４がそれぞれの行導体４０及び列導体４２によって電気的にアドレスされるとき、装置の選択された電極３４（すなわち、アドレスされた容積部分）が、ＴＦＴ４４がターンオンされるときのＴＦＴ４４のソース−ドレイン電流によって充電される。言い換えると、“オン”状態において、ＴＦＴスイッチング素子４４はアドレス信号に対して強い非線形応答を示し、それにより、第１電極アレイの電極３４と第２の基板３２の共通電極３６とから成る容積部キャパシタの高速充電（典型的に２μｓから１０μｓ）が可能である。

“オフ”状態においては、電荷は電極３４上に保持され、装置の残りの容積部分から分離された状態になる。これにより、容積部分内に構築される電界に関する定常状態が確保される。

行に沿ったＴＦＴ群の状態（オン又はオフ）を制御することによりＴＦＴアレイの行群をシーケンス制御するため、ロースキャナ４６（選択スキャナとも称する）が設けられている。また、列群をシーケンス制御しＴＦＴに適切な電圧を供給するため、コラムドライバ４８（データスキャナとも称する）が設けられている。好ましくは、所謂ライン−アット−ア−タイム・アドレス法にて、全ての列に同時にデータが与えられる。

行Ｒ_ｉがアドレスされるとき、その行のＴＦＴ群の全てのゲートが活性化される。列Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３等に活性化信号が供給され、且つその他全ての列に非活性化信号（例えば、共通電極上に存在するのと同一の電圧など）が供給されるとき、容積部分Ｒ_ｉＣ_１、Ｒ_ｉＣ_２、Ｒ_ｉＣ_３等のみが活性化される（すなわち、その行内の全ての電極がそれ自身の列から電圧を受ける）。

図４に示した装置はｍ個の列及びｎ個の行を含んでいる。ロースキャナ４６は行１のＴＦＴ群を、続いて行２を、そして行ｎで終わるまで、ＴＦＴ群をターンオンあるいはターンオフすることにより、ＴＦＴアレイをプログレッシブに走査する。行１が選択されるとき、コラムドライバ４８は列１から列ｍまでの各列に異なる電圧レベルを印加する。

選択される行が進められると、新たな電圧が列群に印加される。

従って、認識されるように、第１電極アレイの各電極（故に、各容積部分）を、各電極３４に印加される電圧を制御しながら個々にアドレスすることができる。

当然ながら、異なる所定電圧を各列に印加するようにコラムドライバ４８を構成し、異なる時間量にわたって各行をターンオンあるいはターンオフしてＴＦＴアレイの行群をプログレッシブ走査するようにロースキャナ４６を構成してもよい。こうすることにより、装置の相異なる容積部分に印加される電圧の期間及び振幅を変化させるために、ＴＦＴアレイの２つの軸が用いられる。

この概念を図５及び６に例示する。各行に沿った電圧は該行を左から右へと進むにつれて増大し、各列に沿った印加電圧の期間は上から下に進むにつれて増大する。

より具体的には、Ｖ_１＜Ｖ_２＜Ｖ_３＜・・・＜Ｖ_ｍとして、列Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、・・・、Ｃ_ｍにそれぞれＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、・・・、Ｖ_ｍが印加される。また、Ｔ_１＜Ｔ_２＜Ｔ_３＜・・・＜Ｔ_ｎとして、行Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、・・・、Ｒ_ｎはそれぞれ時間Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３、・・・、Ｔ_ｎだけ活性化される。

第１の行（行１）内の所与の電極に電圧を印加するため、行１のＴＦＴ群４４は選択信号を与えられて導通状態に切り替えられる。そして、列内のドライバ電圧が所定のレベルに設定され、それらの電圧が行１のＴＦＴ群を介して行１内の第１電極アレイの電極３４に送られる。この期間中、残りの行の選択信号が非選択状態に保持されることにより、第１電極アレイの残りの電極３４は、非導通のＴＦＴ４４を介してそれぞれの行導体４０及び列導体４２に接続され、電圧を受け取らない。

行１内の電極群３４が所定電圧に設定された後、行１内のＴＦＴ群４４が再び非導通状態に設定され、それにより、第１の行の電極群の電圧の更なる変化が防止される。

第２の行（行２）内の所与の電極３４に電圧を印加するため、行２のＴＦＴ群４４は選択信号を与えられて導通状態に切り替えられる。再び、列内のドライバ電圧が所定のレベルに設定される。それらの電圧は行１に印加されるのと同一であってもよいし、異なっていてもよい。そして、それらの電圧は、行２のＴＦＴ群を介して行２内の第１電極アレイの電極３４に送られる。この期間中、残りの行の選択信号が非選択状態に保持されることにより、第１電極アレイの残りの電極３４は、非導通のＴＦＴ４４を介してそれぞれの行導体４０及び列導体４２に接続され、電圧を受け取らない。

行２内の電極群３４が所定電圧に設定された後、行２内のＴＦＴ群４４が再び非導通状態に設定され、それにより、第２の行の電極群の電圧の更なる変化が防止される。

同様にして、全ての後続行の電極群３４がアドレスされる。この第１の時間フレームの終了時、第１電極アレイの全ての電極３４は所定の電圧を印加されている。この電圧は第１フレームの期間（典型的に１ｍｓ−１５０ｍｓ）中、各電極３４に留まる。必要に応じて、印加電圧が各電極に留まる時間の長さを増大させるため、エレクトロポレーション素子に並列に配置された蓄積キャパシタを設けてもよい。

代替的な実施形態において、各容積部分の電子回路は、非アドレス期間中に電極と共通電極又は隣接電極の何れかとの間で電荷がリークする場合であっても電圧が電極上で保持されるように変更されてもよい。例えば、図７に例示するように、回路は、電極が第２のスイッチ５０（例えば、ＴＦＴスイッチ等）を介して電源配線５２に接続されるように変更され得る。ＴＦＴスイッチ５０の場合、第１のスイッチ４４は、第２のスイッチングＴＦＴ５０のゲートに電圧を印加することによって第２のスイッチ５０の状態（導通又は非導通の何れか）を設定するために用いられる。この電圧を（第２のスイッチの自己容量又は更なる蓄積キャパシタ５４の何れかを用いて）ゲートに保存することにより、延長された期間にわたってスイッチを導通状態に保持することが可能である。これにより、電圧が電極上で保持されることが確実にされる。また、より多くの電圧レベルを可能にするため、複数の更なるスイッチを用いて、複数の電源配線のうちの１つに電極を接続することが可能である。

異なる幅の電圧パルスを実現するため、ディスプレイ内の異なる行をアドレスすることが、後続の時間フレームにおいて継続されてもよい。

第１の時間フレームにて行１の電極３４に印加された電圧は、電圧が共通電極上に存在するのと同一の電圧、例えば０Ｖ、に設定される後続アドレス期間（第２の時間フレーム内）まで電極３４上に存在する。この時点で、エレクトロポレーションは行１で停止する。その後の時間フレーム群において、行１は、アドレスされない（図６に示す）か、０Ｖの電圧で繰り返しアドレスされるかの何れかにされる。しかしながら、より長い期間の電圧を行２の電極群に印加するため、行２は第１の時間フレーム及び第２の時間フレームの双方でアドレスされる。代替的に、あまり好ましくはないが、行２は第２の時間フレームでアドレスされる必要はなく、第１の時間フレームにおいて印加された電圧が維持される。故に、印加電圧は第２のフレームにわたって行２内で維持される。そして、電圧は第３の時間フレームにおいてのみ０Ｖに設定される。この時点で、エレクトロポレーションは行２で停止する。故に、認識されるように、行２の電極群３４に印加される電圧の期間は、行１の電極群のそれの２倍である。

同様にして、更なる後続時間フレームにて行３、４及び５を所定の電圧でアドレスすることによって、これらの行の電極群に徐々に増大する電圧持続期間が適用される。

故に、相異なる容積部分に配置された細胞に印加される電気パルスの幅及び振幅を変化させるようにマトリクスの２つの軸を用いることにより、単一のエレクトロポレーション手順を用いながら、複数の細胞を異なるエレクトロポレーションパラメータの下で電気穿孔することができる。言い換えると、分析装置の１つ以上の容積部分内に異なる振幅又は期間の電界を生成することによって、複数の細胞のエレクトロポレーション特性を調査し得る。

エレクトロポレーション処理が完了すると、細胞を必要に応じて検査あるいは調査することができる。このような調査処理は、電気穿孔された細胞を光学的に検査する、あるいは細胞のインピーダンス等の細胞パラメータを測定する段階を含み得る。

図８は、本発明の他の一実施形態に従った、図３の装置の動作を例示している。この実施形態においては、マトリクスは１からＮまでの１次元電極アレイ（Ａ１−ＡＮ）に分割されており、各行の電極に沿った電圧は該行を左から右へと進むにつれて増大し、各行への印加電圧の期間は実質的に同一である。

より具体的には、Ｖ_１＜Ｖ_２＜Ｖ_３＜・・・＜Ｖ_ｍとして、列Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、・・・、Ｃ_ｍにそれぞれＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、・・・、Ｖ_ｍが印加される。また、行Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、・・・、Ｒ_ｎの各々は等しい時間Ｔ_Ｒだけ活性化される。

各アレイは、分析する細胞と異なる試薬とを格納するように封止され得る。故に、同一のマトリクスを用いて、各実験が特定の試薬内に懸濁された細胞に対して行われる相異なる複数のエレクトロポレーション実験を並行して実行し得る。

代替的な、より一般的な一実施形態において、装置は単純に、各アレイが異なる試薬を格納し印加電圧の振幅及び期間が可変にされ得る複数の部分アレイに分割されてもよい。

以上の説明から理解されるように、図３の実施形態は、基板間から液晶が除去されてはいるが、従来からのアクティブマトリクス型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）の構造と同様の構造を有する。故に、想像されるように、本発明の一実施形態に従った細胞分析装置を製造することには、アクティブマトリクス型ＬＣＤを製造するために使用されている既知のテクノロジー及び技術を用い得る。

パッシブマトリクスのアドレス手法と比較したとき、アクティブマトリクスのアドレス手法は、より長い時間にわたって電荷が保持されることを可能にし、それにより、電界が安定化されて疑似的な定常状態に留められることを可能にする。また、アクティブマトリクスは、高速充電と高速アドレス時間をもたらす電荷保持とを可能にするとともに、１５００を超える高マルチプレックス比を可能にする。また、アクティブマトリクス型装置において提供される各容積部分の電気的な分離により、容積部分間でのクロストークが抑制され、単純なパッシブマトリクスと比較して正確性が大幅に向上される。

なお、上述の実施形態は本発明を限定するものではなく例示するものであり、当業者は、請求項の範囲を逸脱することなく、数多くの代替実施形態を設計することが可能である。本発明は、幾つかの別個の素子を有するハードウェアによって、また、好適にプログラムされたコンピュータによって実現され得る。複数の手段を列挙する装置クレームにおいて、それらの手段の幾つかが１つ且つ同一のハードウェア品目によって具現化されてもよい。

Claims (13)

1. 流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置であって：
   互いに空間的に隔てられた第１及び第２の基板；
   前記第１の基板の表面に形成された第１の電極アレイ；
   前記第１の電極アレイに面する側の前記第２の基板の表面に形成された少なくとも１つの電極であり、該少なくとも１つの電極と前記第１の電極アレイとが、前記流体を受け入れる分析容積の上側の境界と下側の境界とを定め、前記分析容積が容積部分のアレイを有する、少なくとも１つの電極；及び
   当該装置の１つ以上の容積部分内で電界の発生及び変更を行うために、少なくとも前記第１の電極アレイに印加される電圧の振幅又は期間を変化させるように構成された回路；
   を有する細胞分析装置。
2. 前記第１及び第２の基板は液晶ディスプレイ基板を有する、請求項１に記載の細胞分析装置。
3. 前記第１及び第２の基板のうちの少なくとも一方は、前記流体を前記分析容積内の位置まで導く流体系を備えて形成されている、請求項１又は２に記載の細胞分析装置。
4. 前記第１及び第２の基板のうちの少なくとも一方、及びその電極は、少なくとも部分的に透明である、請求項１乃至３の何れかに記載の細胞分析装置。
5. 複数のスイッチング素子を更に有し、前記スイッチング素子は、前記第１の電極アレイの各電極が、該電極に印加される電圧を調整するために少なくとも１つのスイッチング素子に電気的に接続される、ように構成されている、請求項１乃至４の何れかに記載の細胞分析装置。
6. 前記第１の電極アレイの少なくとも１つの電極上に電圧を維持するための回路構成、を更に有する請求項５に記載の細胞分析装置。
7. 分析する細胞の大きさに適応するように前記第１の基板と前記第２の基板との間の間隔を調整する調整手段、を更に有する請求項１乃至６の何れかに記載の細胞分析装置。
8. 前記第１の電極アレイの少なくとも１つの電極、及び前記第２の基板の表面に形成された前記少なくとも１つの電極は薄膜構造である、請求項１乃至７の何れかに記載の細胞分析装置。
9. 前記分析容積は、２つ以上の、容積部分のアレイに分割されており、該容積部分のアレイの各々は異なる流体を受け入れるように適応されている、請求項１乃至８の何れかに記載の細胞分析装置。
10. 流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置の作動方法であって、前記装置は、容積部分のアレイを有する分析容積を間に定めるように空間的に隔てられた２枚の基板を有し、
    当該方法は、前記流体が配置される前記装置の１つ以上の容積部分内に、異なる振幅又は期間を有する電界を生成する段階を有する、
    方法。
11. 誘電泳動、電気浸透、及び電気流体力学のうちの少なくとも１つを用いて、前記細胞を操作する段階、を更に有する請求項１０に記載の方法。
12. 流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置を製造する方法であって：
    第１の基板の表面に第１の電極アレイを形成する段階；
    第２の基板の前記第１の電極アレイに面する側の表面に少なくとも１つの電極を形成する工程であり、前記第１の基板の前記表面と前記第２の基板の前記表面とが互いに面するように前記第１及び第２の基板を互いから空間的に隔て、それにより、前記少なくとも１つの電極と前記第１の電極アレイとが、前記流体を受け入れる分析容積の上側の境界と下側の境界とを定め、前記分析容積が容積部分のアレイを有する、少なくとも１つの電極を形成する段階；及び
    前記装置の１つ以上の容積部分内で電界が発生あるいは変更され得るように、少なくとも前記第１の電極アレイに印加される電圧の振幅又は期間を変化させる回路を設ける段階；
    を有する方法。
13. 流体内に懸濁された細胞のエレクトロポレーション特性を調べる細胞分析装置を製造する方法であって：
    液晶ディスプレイを分解する段階；及び
    液晶材料を除去する段階；
    を有する方法。

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