JP2007501203A5 - - Google Patents
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Description
《増殖試験》
９６ウェル培養プレートに５％ウシ新生仔血清を加えたＤＭＥＭでウェルあたり１０００ＦＢＡＥ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５で刺激するか、又はＶＥＧＦ１６５で刺激しない状態でにおいて、各種の濃度のＮＯＶで刺激した。５日後、ウェルはＤＭＥＭで穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルアルデヒド、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した（Ｋｕｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で、同様の結果が得られた（図４参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
９６ウェル培養プレートに５％ウシ新生仔血清を加えたＤＭＥＭでウェルあたり１０００ＦＢＡＥ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５で刺激するか、又はＶＥＧＦ１６５で刺激しない状態でにおいて、各種の濃度のＮＯＶで刺激した。５日後、ウェルはＤＭＥＭで穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルアルデヒド、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した（Ｋｕｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で、同様の結果が得られた（図４参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
《増殖試験》（図７）
９６ウェル培養プレートに１０％ＮＢＣＳ添加ＳＦＭ培養液でウェルあたり２０００のＨＵＡＥＣ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の刺激下か、又はｂＦＧＦの刺激下で、各種の濃度のＮＯＶの存在下又はＣ−Ｔｅｒフラグメントで刺激した。５日後、ウェルはＳＦＭ培養液で穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルアルデヒド）、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で同様の結果が得られた（図７参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
９６ウェル培養プレートに１０％ＮＢＣＳ添加ＳＦＭ培養液でウェルあたり２０００のＨＵＡＥＣ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の刺激下か、又はｂＦＧＦの刺激下で、各種の濃度のＮＯＶの存在下又はＣ−Ｔｅｒフラグメントで刺激した。５日後、ウェルはＳＦＭ培養液で穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルアルデヒド）、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で同様の結果が得られた（図７参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
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