JP2007328134A - 観察装置、および観察プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】光を照射することによる対象物への悪影響を排除すること。
【解決手段】制御装置１０５は、対物レンズ１０３を移動させながら対物レンズ１０３を通して入力される対象物の像をカメラ１０４で撮影し、対象物を撮影する際に、カメラ１０４による撮影時のみ対象物に光を照射するように透過光照明装置１０６およびシャッター１０７を制御する。制御装置１０５は、対物レンズ１０３を移動させながら撮影した複数の画像をつなぎ合わせて１枚の結合画像を生成して、ＰＣ１０９へ出力する。
【選択図】図１

Description

本発明は、観察対象物を観察するための観察装置、および観察プログラムに関する。

次のような蛍光顕微鏡を使用した蛍光法による細胞の観察方法が非特許文献１によって知られている。この方法によれば、細胞に励起光を照射し、細胞から放出される蛍光を観察する。そして、観察前に観察位置の設定を行うが、この際、細胞へ励起光を照射し、蛍光画像から観察位置の設定を行っている。

バイオイメージングがわかる Ｐ２２〜２４（２００５年９月 羊土社発行）

しかしながら、従来の観察方法においては、細胞に励起光を照射する時間が長くなるにつれて、光退色によって蛍光が弱まったり、光毒性により細胞にダメージを与えてしまうことになる。このため、観察対象とする細胞を選択し、観察位置を設定する際、細胞の選択作業に時間を要すると、選択段階で細胞に光退色や光毒性による悪影響を及ぼしてしまい、実際の観察時には正確な観察が行えない可能性がある。

本発明は、観察対象物の像を小領域ごとに撮影し、撮影時のみ前記観察対象物に光を照射し、小領域ごとに撮影した複数の画像をつなぎ合わせた結合画像を生成することを特徴とする。

本発明によれば、光を照射することによる対象物への悪影響を軽減することができる。

図1は、本実施の形態における細胞観察装置の構成を模式的に示した図である。細胞観察装置１００は、ステージ１０１と、チャンバー１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、制御装置１０５と、透過光照明装置１０６と、シャッター１０７と、励起用光源装置１０８と、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１０９と、モニタ１１０と、環境制御装置１１１とを備えている。なお、ステージ１０１と、チャンバー１０２と、対物レンズ１０３と、カメラ１０４と、制御装置１０５と、透過光照明装置１０６と、シャッター１０７と、励起用光源装置１０８は顕微鏡を構成する。

この細胞観察装置１００においては、使用者はＰＣ１０９を操作することによって、細胞観察装置１００に対する種々の指示を出すことができ、ＰＣ１０９は、使用者からの指示に応じた制御信号を制御装置１０５へ出力する。制御装置１０５は、ＰＣ１０９からの制御信号に基づいて使用者からの指示に応じた種々の処理を実行する。本実施の形態では、使用者がステージ１０１上のチャンバー１０２内にセットされた細胞培養容器Ａ内の細胞を観察する場合の処理について説明する。

なお、細胞培養容器Ａは、例えば３５ｍｍディッシュが使用される。また、チャンバー１０２内は密閉されており、その内部環境は、環境制御装置１１１によって細胞の培養に適した環境に維持されている。例えば、チャンバー１０２内のＣＯ_２濃度はＣＯ_２混合機１１１ａによって５％に維持され、湿度は湿度調整機１１１ｂによって９５％に維持され、温度は温度調整機１１１ｃによって３７℃に維持されている。

励起用光源装置１０８は、細胞を蛍光染色している色素を励起する波長の励起光をチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに照射する。なお、励起用光源装置１０８から出力される励起光は、シャッター１０７により遮断することが可能である。透過光照明装置１０６は、光源としてＬＥＤを備えており、シャッター１０７により励起光が遮断されているときに、ＬＥＤを発光させて、チャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに透過光（照明光）を照射することもできる。シャッター１０７による励起光の遮断、および透過光照明装置１０６からのＬＥＤの発光は、全て制御装置１０５によって制御される。

顕微鏡は、位相差観察モードと蛍光観察モードとを備え、透過光照明装置１０６からチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに透過光を照射して細胞を位相差観察することができ、また、励起用光源装置１０８からチャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに励起光を照射して、蛍光試薬で染色した細胞を蛍光観察することもできる。カメラ１０４は、ＣＣＤなどの撮像素子を備えており、対物レンズ１０３を通して入力される細胞の像（拡大像）を撮像して顕微鏡画像、すなわち位相差画像と蛍光画像とを得ることができる。

なお、顕微鏡は、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行うことができる。例えば、複数の蛍光試薬で染色した多重染色の場合には、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行うことによって、複数の蛍光色を観察することができる。これにより、カメラ１０４は、蛍光フィルタごとの複数の蛍光画像を撮像することができる。

カメラ１０４によって撮影された顕微鏡画像は制御装置１０５へ出力され、さらにＰＣ１０９に出力された後にモニタ１１０に表示される。これによって、使用者は顕微鏡画像をモニタ１１０上で確認することができる。

本実施の形態における細胞観察装置１００においては、使用者は、ＰＣ１０９を操作して観察対象の細胞の種類に応じた蛍光画像の撮影条件を指示することができる。例えば撮影条件として励起光量、カメラゲイン、露光時間、焦点面、フィルタ種類を指示する。この撮影条件は、細胞の種類ごとにあらかじめ設定してＰＣ１０９が備えるメモリ内に記憶しておき、使用者が観察対象の細胞の種類に応じて設定内容を選択するようにしてもよく、観察の都度、撮影条件を設定するようにしてもよい。

一般的に、細胞を蛍光観察する場合には、細胞に励起光を照射する時間が長くなるにつれて、光退色によって蛍光が弱まったり、光毒性により細胞にダメージを与えてしまう。このため、実際の蛍光観察（本蛍光観察）を行う前段階として観察対象とする細胞を選ぶための蛍光観察（準備蛍光観察）を行った場合に、準備蛍光観察に時間をかけてしまうと、準備蛍光観察の段階で細胞に光退色や光毒性による悪影響を及ぼしてしまい、本蛍光観察で正確な実験データが得られないなど、期待通りの観察結果が得られない可能性が生じる。

本実施の形態では、準備観察段階で細胞に及ぼす悪影響を最小限に抑えるために、準備観察段階における励起光の照射時間を極力抑える方法について説明する。

使用者は、細胞培養容器Ａ内から観察対象の細胞を選択するために後述するナビゲーションを実行して顕微鏡画像を撮影する範囲（ナビゲーション範囲）を指定する。このために制御装置１０５は、まず、顕微鏡を位相差観察モードにセットして、シャッター１０７を閉じて励起光を遮断した後、透過光照明装置１０６を制御してＬＥＤを発光させ、チャンバー１０２内の細胞培養容器Ａに透過光を照射する。そして、対物レンズ１０３を低倍率にセットし、カメラ１０４を制御して対物レンズ１０３を通して入力される像を撮影する。このように撮影した細胞培養容器Ａの位相差画像をＰＣ１０９へ出力する。

ＰＣ１０９が備えるＣＰＵは、制御装置１０５から入力される細胞培養容器Ａの位相差画像をモニタ１１０上に表示し、使用者はモニタ１１０に表示された位相差画像上でＰＣ１０９が備えるマウスを使用して後述するナビゲーション範囲を指定する。ナビゲーション範囲としては、例えば、細胞培養容器Ａの内部全体を指定することもでき、細胞培養容器Ａの内部の内、所定の範囲内を選択して指定することもできる。ＰＣ１０９が備えるＣＰＵは、使用者によってナビゲーション範囲が指定されると、指定されたナビゲーション範囲の位置を示す情報（ナビゲーション範囲情報）と上述した撮影条件とを格納したレシピを作成する。

制御装置１０５は、ＰＣ１０９からレシピが入力されると、レシピに格納されているナビゲーション範囲情報と撮影条件とを読み込んで、ナビゲーション範囲内に対してナビゲーションを実行する。すなわち、対物レンズ１０３、カメラ１０４、透過光照明装置１０６、およびシャッター１０７を制御して、ナビゲーション範囲内で対物レンズ１０３を移動させながら位相差画像と蛍光画像を撮影する。具体的には、制御装置１０５は、次のようにしてナビゲーションを実行する。

制御装置１０５は、まず、指定されたナビゲーション範囲に基づいてナビゲーション範囲の開始点の座標値（Ｘ，Ｙ）を特定する。例えば、ナビゲーション範囲の左上の端点の座標値をナビゲーション範囲の開始点の座標値（Ｘ，Ｙ）として特定する。そして、顕微鏡を位相差観察モードにセットして特定したナビゲーション範囲の開始点に対物レンズ１０３を移動させ、シャッター１０７を閉じて励起光を遮断した後、透過光照明装置１０６を制御して位相差画像の撮影に必要な時間だけ、例えばカメラ１０４の露光時間だけＬＥＤを発光させる。のときに対物レンズ１０３を通して入力される像をカメラ１０４を制御して撮影し、記憶する。これによって、ナビゲーション範囲の開始点における位相差画像を撮影することができる。

さらに、制御装置１０５は、顕微鏡を蛍光観察モードにセットして、透過光照明装置１０６を制御してＬＥＤを消灯し、蛍光画像の撮影に必要な時間、例えばカメラ１０４の露光時間だけシャッター１０７を開けて励起光を照射する。そして、カメラ１０４を制御して対物レンズ１０３を通して入力される像を撮影し、記憶する。これによって、ナビゲーション範囲の開始点における蛍光画像を撮影することができる。なお、このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、蛍光フィルタを切り替えて、各蛍光フィルタごとに蛍光画像をそれぞれ撮影する。

その後、制御装置１０５は、ナビゲーション範囲内の次の領域を撮影するように対物レンズ１０３を移動させる。すなわち、制御装置１０５は、移動後の対物レンズ位置におけるカメラ１０４の撮影範囲が移動前の対物レンズ位置におけるカメラ１０４の撮影範囲と隣接し、かつ両範囲が重複しないように、対物レンズ１０３の移動量を制御する。そして、移動後の対物レンズ位置において上述した処理を実行し、移動後の対物レンズ位置における位相差画像と蛍光画像を撮影し、記憶する。この処理をナビゲーション範囲の全範囲に対して実行することによって、ナビゲーション範囲内において複数の小領域ごとに位相差画像と、蛍光フィルタの種類分の複数枚の蛍光画像を撮影することができる。

そして、制御装置１０５は、ナビゲーションを実行して撮影され、記憶された各小領域に対応する位相差画像をつなぎ合わせて（タイリングして）、ナビゲーション範囲全体を撮影した１枚の結合画像（マクロ位相差画像）を生成する。さらに、制御装置１０５は、各蛍光フィルタの蛍光画像ごとに、同様にして各小領域に対応する蛍光画像をタイリングして蛍光フィルタごとの結合画像（マクロ蛍光画像）を生成する。

図２を用いて、マクロ位相差画像の生成方法を具体的に説明する。この図２は、４つの小領域に対してナビゲーションを実行した場合に撮影される位相差画像に基づいてマクロ位相差画像を生成する手順を模式的に示した図である。ここでは、４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図２（ａ）に示す４枚の位相差画像２ａ〜２ｄが撮影されている。制御装置１０５は、この４枚の位相差画像をナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま図２（ｂ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図２（ｃ）に示すようなマクロ位相差画像２ｅが生成される。

次に、図３を用いて、マクロ蛍光画像の生成方法を具体的に説明する。この図３は、４つの小領域に対して２種類の蛍光フィルタを使用してナビゲーションを実行した場合に撮影される蛍光画像に基づいてマクロ蛍光画像を生成する手順を模式的に示した図である。ここでは、第１の蛍光フィルタを使用して４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図３（ａ）に示す４枚の蛍光画像３ａ〜３ｄが撮影されている。また、第２の蛍光フィルタを使用して４つの小領域を対象としてナビゲーションが実行された結果、図３（ｄ）に示す４枚の蛍光画像３ｆ〜３ｉが撮影されている。

制御装置１０５は、まず、図３（ａ）に示す４枚の蛍光画像３ａ〜３ｄを、ナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま図３（ｂ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図３（ｃ）に示すような第１の蛍光フィルタのマクロ位相差画像３ｅが生成される。次に、図３（ｄ）に示す４枚の蛍光画像３ｆ〜３ｉを、ナビゲーション範囲内におけるそれぞれの小領域の位置関係を保持したまま、図３（ｅ）のように並べて結合することによってタイリングを行う。これによって図３（ｆ）に示すような第２の蛍光フィルタのマクロ位相差画像３ｊが生成される。

制御装置１０５は、このように生成したマクロ位相差画像と蛍光フィルタごとのマクロ蛍光画像とをＰＣ１０９へ出力する。

ＰＣ１０９においてＣＰＵは、例えば図４に示すようなＧＵＩ画面をモニタ１１０に表示する。使用者は、モニタ１１０上でこのＧＵＩ画面を操作することにより、マクロ位相差画像および複数の蛍光フィルタを使用して撮影した複数のマクロ蛍光画像に基づいて、次のように観察対象の細胞を選択する。なお、使用者はＰＣ１０９が備えている不図示の入力部材、例えばキーボードやマウスを操作することによって図４に示すＧＵＩ画面を操作する。また、図４のＧＵＩ画面については、本実施の形態に関連する項目についてのみ説明し、それ以外の項目については説明を省略する。

まず使用者は、ＧＵＩ画面上で位相差画像表示ボタン４ａを選択して、ＧＵＩ画面上の画像表示領域４ｄ内にマクロ位相差画像を表示する。使用者はこのマクロ位相差画像によって細胞の形状を確認することができる。そして、このマクロ位相差画像をベースとして、その上に任意の蛍光フィルタで撮影したマクロ蛍光画像（フィルタ画像）を重ね合わせて（重畳して）表示することができる。例えば、蛍光観察によって赤色に発光した画像を撮影したフィルタ画像をマクロ位相差画像に重ね合わせて表示する場合には、使用者はＧＵＩ画面上で赤色フィルタ画像表示ボタン４ｂを選択する。すなわち、位相差画像表示ボタン４ａと赤色フィルタ画像表示ボタン４ｂとがいずれも選択された状態にすることで、画像表示領域４ｄ内にベースとなるマクロ位相差画像上に赤色フィルタ画像を重ね合わせて表示することができる。

同様に、蛍光観察によって青色に発光した画像を撮影したフィルタ画像をマクロ位相差画像に重ね合わせて表示する場合には、使用者はＧＵＩ画面上で位相差画像表示ボタン４ａと共に青色フィルタ画像表示ボタン４ｃを選択する。また、マクロ位相差画像に赤色フィルタ画像と青色フィルタ画像のいずれも重ね合わせて表示したい場合には、位相差画像表示ボタン４ａ、赤色フィルタ画像表示ボタン４ｂ、および青色フィルタ画像表示ボタン４ｃを全て選択すればよい。

例えば、図２に示したマクロ位相差画像２ｅに、図３に示した第１の蛍光フィルタ画像３ｅと第２のフィルタ画像３ｊを重ね合わせて表示した場合には、図５に示すような合成画像（重畳画像）が画像表示領域４ｄ内に表示される。

このように合成されたマクロ位相差画像と合成されたマクロ蛍光画像（フィルタ画像）とを重ね合わせて表示することによって、使用者は細胞の形状とともに蛍光試薬による蛍光状態を確認しながら、観察対象とする細胞の選択を行うことができる。具体的には、使用者は、画像表示領域４ｄ内のマクロ画像上に表示されたカーソル４ｅを移動ボタン４ｆをマウスで操作して移動させ、本観察の観察対象とする細胞に当てた後、選択ボタン４ｇをマウスでクリックすることによって、本観察の観察対象とする細胞を選択する。使用者は、本観察の観察対象として複数の細胞を選択したい場合には、この処理を繰り返し行う。

なお、図４に示す例では、移動ボタン４ｆは円形状のボタンであり、マウスでクリックされたボタン上の位置に応じてカーソル４ｅの画面上での移動方向が決定される。また、マウスによる押下回数、または押下時間に応じてカーソル４ｅの画面上での移動量が決定される。

使用者によって本観察の観察対象とする細胞が選択されると、ＣＰＵは、選択ボタン４ｇがクリックされた時点におけるカーソル４ｅの位置を特定する情報を本観察対象表示領域４ｈ内に追加する。

これによって、使用者はモニタ１１０に表示されたマクロ画像を見ながら本観察前の準備段階として観察対象の細胞を選択することができ、細胞を選択するために透過光や励起光を細胞に長時間照射し続けなくても済むことになる。すなわち、励起光の照射時間も蛍光画像の撮影に必要な時間だけで済むことから、準備段階での細胞の光退色や光毒性によるダメージを最小限に抑えることができる。また、透過光の照射時間は位相差画像の撮影に必要な時間だけで済むことから、細胞が透過光によっても悪影響を受ける場合でも、この悪影響を最小限に抑えることができる。

その後、使用者がＰＣ１０９を操作して本観察の開始を指示すると、ＣＰＵは、本観察対象表示領域４ｈ内に表示された情報とともに本観察の実行指示信号を制御装置１０５へ出力する。例えば、使用者は、図４に示すタイムラプス実行ボタン４ｉをクリックすることによって、本観察対象表示領域４ｈ内に表示されている選択済みの細胞に対する本観察の開始を指示する。

制御装置１０５は本観察の実行指示信号が入力されると、観察対象の細胞に対して、例えばタイムラプス処理を実行して細胞の観察、すなわち本観察を行う。本観察の結果は制御装置１０５を介してＰＣ１０９に出力され、観察データ（試験データ）がＰＣ１０９内のハードディスクに記録され、同時にモニタ１１０に表示される。

図６は、本実施の形態における制御装置１０５の処理を示すフローチャートである。図６に示す処理は、使用者によってＰＣ１０９が操作されて試験準備の開始が指示され、ＰＣ１０９から試験開始信号を受信すると起動するプログラムとして制御装置１０５によって実行される。

ステップＳ１０において、顕微鏡を位相差観察モードにセットし、対物レンズ１０３、カメラ１０４、およびシャッター１０７を制御して低倍率で撮影した細胞培養容器Ａの位相差画像をＰＣ１０９へ出力してステップＳ２０へ進む。ステップＳ２０では、ＰＣ１０９から上述したレシピが入力されたか否かを判断する。レシピが入力されたと判断した場合には、ステップＳ３０へ進む。

ステップＳ３０では、レシピに格納されている撮影条件とナビゲーション範囲情報とを読み込んでステップＳ４０へ進む。ステップＳ４０では、ナビゲーション範囲の開始点を特定し、特定したナビゲーション範囲の開始点に対物レンズ１０３を移動させる。

その後、ステップＳ５０へ進み、顕微鏡の位相差観察モードと蛍光観察モードとを切替ながら、上述したように対物レンズ１０３、カメラ１０４、透過光照明装置１０６、およびシャッター１０７を制御してナビゲーションを実行し、小領域ごとに位相差画像および蛍光画像を撮影する。このとき、撮影条件として複数の蛍光フィルタの種類が指定されている場合には、複数の蛍光フィルタを切り替えて、そのフィルタの種類ごとに蛍光画像を撮影する。その後、ステップＳ６０へ進む。

ステップＳ６０では、ナビゲーション範囲の全範囲についてナビゲーションの実行が完了したか否かを判断する。ナビゲーションの実行が完了していないと判断した場合には、ステップＳ４０へ戻って隣接する小領域を撮影するために対物レンズ１０３を移動させて処理を繰り返す。これに対してナビゲーションの実行が完了したと判断した場合には、ステップＳ７０へ進む。

ステップＳ７０では、ナビゲーションを実行して撮影した小領域ごとの位相差画像、および少なくとも１種類の蛍光フィルタで撮影した蛍光画像のそれぞれをタイリングして、上述したマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像を作成する。その後、ステップＳ８０へ進み、作成したマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像をＰＣ１０９へ出力して、ステップＳ９０へ進む。

ステップＳ９０では、ＰＣ１０９から本観察の実行指示信号を受信したか否かを判断する。本観察の実行指示信号を受信したと判断した場合にはステップＳ１００へ進み、ＰＣ１０９上で使用者によって選択された観察対象の細胞に対してタイムラプス処理を実行する。その後、ステップＳ１１０へ進み、タイムラプス処理の結果をＰＣ１０９へ出力して、処理を終了する。

図７は、本実施の形態におけるＰＣ１０９の処理を示すフローチャートである。図７に示す処理は、制御装置１０５から上述したナビゲーション範囲を指定するための細胞培養容器Ａの位相差画像が入力されると起動するプログラムとしてＰＣ１０９が有するＣＰＵによって実行される。

ステップＳ２００において、制御装置１０５から入力された細胞培養容器Ａの位相差画像をモニタ１１０に表示してステップＳ２１０へ進む。ステップＳ２１０では、位相差画像上で使用者によってナビゲーション範囲が指定されたか否かを判断する。ナビゲーション範囲が指定されたと判断した場合にはステップＳ２２０へ進み、指定されたナビゲーション範囲のナビゲーション範囲情報と撮影条件とを格納したレシピを作成し、レシピを制御装置１０５へ出力してステップＳ２３０へ進む。

ステップＳ２３０では、制御装置１０５から上述したマクロ位相差画像およびマクロ蛍光画像が入力されたか否かを判断する。これらの画像が入力されたと判断した場合にはステップＳ２４０へ進み、図４に示したＧＵＩ画面をモニタ１１０に表示する。その後、ステップＳ２５０へ進む。

ステップＳ２５０では、使用者によって不図示の入力部材が操作され、図４に示すＧＵＩ画面上で位相差画像表示ボタン４ａが選択されることにより、マクロ位相差画像の表示が指示されたか否かを判断する。マクロ位相差画像の表示が指示されたと判断した場合には、ステップＳ２６０へ進み、ＧＵＩ画面上の画像表示領域４ｄ内にマクロ位相差画像を表示する。その後、ステップＳ２７０へ進む。

ステップＳ２７０では、使用者によって不図示の入力部材が操作され、図４に示すＧＵＩ画面上で蛍光フィルタの種類に応じた蛍光画像表示ボタンが選択されることにより、マクロ蛍光画像の表示が指示されたか否かを判断する。マクロ蛍光画像の表示が指示されていないと判断した場合には、後述するステップＳ２９０へ進む。これに対して、マクロ蛍光画像の表示が指示されたと判断した場合には、ステップＳ２８０へ進み、画像表示領域４ｄ内に表示されているマクロ位相差画像に指示された蛍光フィルタのマクロ蛍光画像を重ね合わせて表示する。その後、ステップＳ２９０へ進む。

ステップＳ２９０では、使用者によって観察対象の細胞が選択されたか否かを判断する。観察対象の細胞が選択されていないと判断した場合には、ステップＳ２７０へ戻って処理を繰り返す。これに対して観察対象の細胞が選択されたと判断した場合には、ステップＳ３００へ進む。ステップＳ３００では、使用者によって本観察の実行が指示されたか否かを判断する。本観察の実行が指示されたと判断した場合には、ステップＳ３１０へ進み、本観察の実行指示信号を制御装置１０５へ出力して処理を終了する。

以上説明した本実施の形態によれば、以下のような作用効果を得ることができる。
（１）蛍光画像を取得する領域を設定する際、励起光を照射することなく、ナビゲーション範囲内の小領域ごとに、画像を撮影するために必要な時間だけ励起光を細胞に照射して蛍光画像を撮影し、撮影した小領域ごとの蛍光画像をタイリングしたマクロ蛍光画像を使用者に提供するようにした。これによって準備段階での細胞の光退色や光毒性によるダメージを最小限に抑えることができる。また、使用者は、励起光を照射し続けることによる細胞への悪影響を気にせずに、マクロ位相差画像上で時間をかけて観察対象の細胞を選択することができる。

（２）ナビゲーション範囲内の小領域ごとに、画像を撮影するために必要な時間だけ透過光を細胞に照射して位相差画像を撮影し、撮影した小領域ごとの位相差画像をタイリングしたマクロ位相差画像を使用者に提供するようにした。これによって、励起光だけではなく透過光を照射することによっても悪影響を受ける可能性がある細胞を観察する場合にも、透過光の照射による細胞への悪影響を最小限に抑えて位相差画像を撮影することができる。

（３）対物レンズ１０３は、複数の蛍光フィルタを切り替えて蛍光観察を行えるようにし、カメラ１０４は、各蛍光フィルタごとに蛍光画像を撮影するようにした。これによって、複数の蛍光試薬で染色した多重染色の場合でも、蛍光色ごとの蛍光画像を撮影することができる。

（４）ナビゲーションを実行して撮影した小領域ごとの位相差画像および蛍光画像をそれぞれタイリングしてナビゲーション範囲全体を撮影した１枚のマクロ画像を生成し、このマクロ画像をモニタ１１０に表示するようにした。これによって、使用者はナビゲーション範囲全体から観察対象の細胞を選択することができる。

（５）使用者は、モニタ１１０に表示されたＧＵＩ画面上の画像表示領域４ｄ内にマクロ位相差画像と、複数のマクロ蛍光画像のそれぞれとを重ね合わせて表示して、細胞を選択できるようにした。これによって、使用者は細胞の形状とともに蛍光試薬による蛍光状態を確認しながら、観察対象とする細胞の選択を行うことができる。

―変形例―
なお、上述した実施の形態の細胞観察装置は、以下のように変形することもできる。
（１）上述した実施の形態では、モニタ１１０に表示されたＧＵＩ画面上の画像表示領域４ｄ内に位相差画像の上に複数の蛍光画像の少なくとも１つを重ね合わせて表示して細胞を選択できるようにした。しかしこれに限定されず、複数の蛍光画像のうち２枚以上を重ね合わせるようにしてもよい。また、画像表示領域４ｄ内に表示したマクロ画像を拡大できるようにしてもよい。これによって、使用者はマクロ画像をさらに拡大して観察対象の細胞を容易に選択できるようになる。

（２）上述した実施の形態では、ナビゲーション範囲に対してナビゲーション処理を実行して得た小領域ごとの位相差画像と蛍光画像とをそれぞれ合成してマクロ位相差画像とマクロ蛍光画像を生成する例について説明した。しかしながら、位相差画像または蛍光画像のいずれか一方のみを撮影するようにしてもよい。この場合、使用者は観察対象選択用画面上でマクロ位相差画像またはマクロ蛍光画像のいずれか一方のみを確認しながら本観察対象の細胞を選択すればよい。

（３）上述した実施の形態では、使用者は図４に示すＧＵＩ画面上で観察対象の細胞を選択する例について説明したが、ＧＵＩ画面のレイアウトは図４に示すものに限られない。

（４）上述した実施の形態では、制御装置１０５が図６に示した処理を実行し、ＰＣ１０９が図７に示した処理を実行する例について説明した。しかしながら、制御装置１０５またはＰＣ１０９のいずれか一方が図６および図７の処理を全て行うようにしてもよい。

（５）上述した実施の形態では、本観察として観察対象の細胞に対してタイムラプス処理を実行する例について説明したが、本発明は、その他の観察方法による観察や試験を行う場合の前準備として対象の細胞を選択する場合にも適用可能である。

（６）上述した実施の形態では、細胞を観察対象とする場合について説明したが、本発明は、光を照射することによって観察することができ、かつ光を照射することによって悪影響が生じる可能性があるその他の観察対象、例えば鉱物などにも適用可能である。

（７）上述した実施の形態では、位相差画像を取得し、ナビゲーションを行う基本となる画像としたが、微分干渉画像、偏光画像等、他のコントラスト生成方法を用いることも可能である。

なお、本発明の特徴的な機能を損なわない限り、本発明は、上述した実施の形態における構成に何ら限定されない。

細胞観察装置の構成を模式的に示す図である。 マクロ位相差画像の作成手順を模式的に示した図である。 マクロ蛍光画像の作成手順を模式的に示した図である。 使用者によって操作されるＧＵＩ画面の具体例を示す図である。 マクロ位相差画とマクロ蛍光画像とを重ね合わせた場合の具体例を示す図である。 制御装置１０５の処理を示すフローチャート図である。 ＰＣ１０９の処理を示すフローチャート図である。

符号の説明

１００ 細胞観察装置、１０１ ステージ、１０２ チャンバー、１０３ 対物レンズ、１０４ カメラ、１０５ 制御装置、１０６ 透過光照明装置、１０７ シャッター、１０８ 励起用光源装置、１０９ パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、１１０ モニタ、１１１ 環境制御装置、１１１ａ ＣＯ_２混合機、１１１ｂ 湿度調整機、１１１ｃ 温度調整機

Claims (8)

1. 観察対象物の像を小領域ごとに撮影する撮影手段と、
   前記撮影手段による撮影時のみ前記観察対象物に光を照射する照明手段と、
   前記撮影手段により小領域ごとに撮影した複数の画像をつなぎ合わせた結合画像を生成する制御手段とを備えることを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記照明手段は、前記観察対象物を位相差観察するための透過光、および前記観察対象物を蛍光観察するための励起光を異なるタイミングで照射し、
   前記撮影手段は、前記観察対象物の位相差観察によって得られる位相差画像、および前記観察対象物の蛍光観察によって得られる蛍光画像を撮影することを特徴とする観察装置。
3. 請求項２に記載の観察装置において、
   複数の蛍光フィルタをさらに備え、
   前記撮影手段は、前記複数の蛍光フィルタを切り替えて、複数の蛍光フィルタごとに前記蛍光画像を撮影することを特徴とする観察装置。
4. 請求項３に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、前記位相差画像の結合画像、および前記複数の蛍光画像のそれぞれの結合画像を生成することを特徴とする観察装置。
5. 請求項４に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、前記位相差画像の結合画像、および前記複数の蛍光画像のそれぞれの結合画像のうち、少なくとも２枚の結合画像を重畳してモニタに表示することを特徴とする観察装置。
6. 請求項４に記載の観察装置で生成した位相差画像の結合画像、および複数の蛍光画像のそれぞれの結合画像のうち、少なくとも２枚の結合画像を重畳して表示する制御手段を備えることを特徴とする観察装置。
7. 請求項５または６に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、前記重畳して表示した画像を拡大表示することを特徴とする観察装置。
8. コンピュータに、
   観察対象物の像を小領域ごとに撮影する撮影手順と、
   前記撮影手順による撮影時のみ前記観察対象物に光を照射する照明手順と、
   前記撮影手順により小領域ごとに撮影した複数の画像をつなぎ合わせた結合画像を生成する制御手順とを実行させるための観察プログラム。

Images