JP2007298521A - 多機能オリゴマープローブアレイおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子発現分析と遺伝子型分析など互いに異なる分析を同時に行うことができる多機能オリゴマープローブアレイが提供される。
【解決手段】多機能オリゴマープローブアレイは基板、表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、基板上または内に形成された多数の第１プローブセルアクティブ、および各第１プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第１アレイ領域、表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、基板上または内に形成された多数の第２プローブセルアクティブ、および各第２プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第２アレイ領域、およびクロストークを遮断するコラムスペーサを含む。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明はオリゴマープローブアレイに関するもので、より詳細には互いに異なる種類の分析を一つのオリゴマープローブアレイを使用し行うことができる多機能オリゴマープローブアレイおよびその製造方法に関するものである。

オリゴマープローブアレイは遺伝子発現分析（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、ＳＮＰのような突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）および多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の検出による遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、蛋白質およびペプチド分析、潜在的な薬のスクリーニング、新薬開発と製造等に広く使用される道具である。

オリゴマープローブアレイのうち、オリゴヌクレオチドプローブアレイを利用した生体試料の分析は大きく遺伝子発現分析と遺伝子型分析に区分することができる。この二つの分析は互いに異なる用途と重要性を有するため、ある個体に対して遺伝子発現分析と遺伝子型分析を同時に行わなければならない必要性がある。

ところで、現在広く使用されるオリゴマープローブアレイは一種類の分析だけを行うことができるよう製作されている。したがって、同時に色々な分析、例えば遺伝子発現分析と遺伝子型分析を同時に行おうとする場合には複数のオリゴマープローブアレイを使用しなければならない。これは複数のオリゴマープローブアレイ使用による費用増加を伴うため分析の効率性が顕著に落ちる。
米国公開特許２００１−００５５７６０号

本発明が解決しようとする課題は、互いに異なる種類の分析を一つのオリゴマープローブアレイを使用して行うことができる多機能オリゴマープローブアレイを提供しようとするものである。

本発明が解決しようとする他の課題は多機能オリゴマープローブアレイの製造方法を提供しようとするものである。

本発明が解決しようとする課題は以上で言及した技術的課題に制限されず、言及されていないまた他の課題は次の記載から当業者に明確に理解できるであろう。

本発明の例示的な実施形態はターゲットサンプルのクロストークが生じない２個以上の互いに異なるアレイ領域を含み、２種類以上の分析を一つのオリゴマープローブアレイで行うことによって従来のオリゴマープローブアレイの問題点を取り除く。

本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは、基板、表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第１プローブセルアクティブ、および前記各第１プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第１アレイ領域、表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第２プローブセルアクティブ、および前記各第２プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第２アレイ領域、および前記第１アレイと第２アレイに適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを含む。

本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの製造方法は、第１アレイ領域と第２アレイ領域を含む基板を提供するが、前記第１アレイ領域は表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第１プローブセルアクティブ、および前記第１プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含み、前記第２アレイ領域は表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第２プローブセルアクティブ、
および前記第２プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む基板を提供し、前記基板上に前記第１アレイと第２アレイに適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを付着するものを含む。

本発明のいくつかの他の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの製造方法は、基板を提供し、前記基板をエッチングして第１アレイ領域と前記第２アレイ領域を定義し前記第１アレイ領域と第２アレイ領域に適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを形成し、前記第１アレイ領域の前記基板上または前記基板内にプローブセル分離領域によって分離される多数の第１オリゴマープローブセルアクティブを前記第２アレイ領域の前記基板上または前記基板内に前記プローブセル分離領域によって分離される多数の第２オリゴマープローブセルアクティブを形成するが、前記プローブセル分離領域の表面はオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないように形成し、前記多数の第１および第２オリゴマープローブセルアクティブ別に互いに異なる序列のオリゴマープローブをカップリングするのを含む。

その他実施形態の具体的な事項は詳細な説明および図に含まれている。

本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは、互いに異なる分析、例えば遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）と遺伝子発現分析（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を同時に行うことができて分析の効率性を高めることができ、分析費用もまた顕著に減少させることができる。

また、本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは、プローブセルアクティブの表面にはオリゴマープローブとカップリングすることができる官能基を含む反面、プローブセル分離領域の表面は官能基を含まない。したがって、オリゴマープローブがプローブセルアクティブにだけがカップリングされプローブセルアクティブを囲むプローブセル分離領域ではカップリングされない。したがって、オリゴマープローブアレイを利用した分析時、ＳＮＲを増大させられるため分析の正確度を高めることができる。

また、プローブセルアクティブが３次元表面を有する場合には同一デザインルールが適用されるプローブセルアレイに比べ、オリゴマープローブがカップリングされる面積を増大させることができる。したがって、同一デザインルールが適用される従来のプローブセルアレイに比べ、各プローブセルアクティブにカップリングされるオリゴマープローブの数を増加させることができる。このためデザインルールが減少しても望む検出輝度を確保することができる。

本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は添付される図面と共に詳細に後述されている実施形態を参照すれば明確になるだろう。しかし本発明は以下で開示される実施形態に限定されるものではなく互いに異なる多様な形態で具現されるものであり、単に本実施形態は本発明の開示が完全なようにし、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されているものであり、本発明は請求項の範囲によってのみ定義される。

したがって、いくつかの実施形態で、よく知られた工程段階、よく知られた構造およびよく知られた技術は本発明が曖昧に解釈されることを避けるために具体的に説明されない。

本明細書で使用された用語は実施形態を説明するためのものであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書で、単数型は文書で特別に言及しない限り複数型も含む。明細書で使用される、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）および／または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は言及された構成要素、段階、動作および／または素子以外の一つ以上の他の構成要素、段階、動作および／または素子の存在または追加を排除しない意味として使用する。そして、“および／または”は言及されたアイテムの各々および一つ以上のすべての組合せを含む。また、以下明細書全体にかけて、同一参照符号は同一構成要素を指称する。

また、本明細書で記述する実施形態は本発明の理想的な例示図の断面図および／または概略図を参考にして説明されるだろう。したがって、製造技術および／または許容誤差等によって例示図の形態が変形され得る。したがって、本発明の実施形態は図示された特定形態に制限されるものではなく製造工程により生成される形態の変化も含むものである。また本発明に図示された各図面において各構成要素は説明の便宜を考慮して、多少拡大または縮小されて図示され得る。

図１Ａないし図３Ｃは本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの実施形態を示す断面図である。

本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは互いに異なる分析、例えば遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）と遺伝子発現分析（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を各々行うことができる第１アレイ領域と第２アレイ領域を含む。

遺伝子発現分析は転写体の分析を通して、特定生体、特定組織（ｔｉｓｓｕｅ）等の発現型を分析するものである。したがって、生体によって、または同一生体内でも組織によって、または同一組織内でも生体の状態によって異なって表れ得る。言い換えれば、遺伝子発現分析は正常個体と特定疾病または特定生命現象を見せる個体の発現状態を比較分析するものである。

反面、遺伝子型分析は遺伝子型自体を分析するもので同一個体の遺伝子型分析結果は組織の種類および状態によって変化しない。すなわち、遺伝子型分析は各個体間の源泉的および遺伝的形質の差異を理解するためのものであるといえる。同一種内の各個体は全般的に類似のゲノム遺伝序列を有する反面、一部序列変移があり、この序列変移によって各個体は互いに異なる形質を有するようになる。
例えば、６０億の人類は９９．９％の塩基序列が同一な反面、０．１％の塩基序列だけが異なり、これによって多様性が得られる。したがって、０．１％の塩基序列の差異を分析することによって人種間の差異、特定遺伝病を誘発する基本的な塩基序列などを分析するのが遺伝子型分析である。例えば、ヒトゲノムには１４２万種のＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が存在する。また、このＳＮＰ間の多様な組合せによって６０億人口の個体間異形質発現の最小単位がハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）となる。すなわち、遺伝子発現分析と遺伝子型分析は互いに異なる生物学的意味を持っているので同一個体に対して遺伝子型分析と遺伝子発現分析を同時に実施する必要性が非常に大きい。

したがって、本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは、互いに異なる分析を同時に実施できる第１アレイ領域と第２アレイ領域を具備するが、図１Ａないし図３Ｃに例示されているように第１アレイ領域と第２アレイ領域に適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するためのコラムスペーサ１００ｂを含む。ターゲットサンプルのクロストークを効果的に遮断するためにコラムスペーサ１００ｂの高さが１００ないし５００μｍであり、幅が１ないし２０ｍｍであることが好ましい。

コラムスペーサ１００ｂは基板をエッチングし、各プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”、２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’が提供される基板１００ａと一体型で形成した一体型コラムスペーサまたは基板１００ａに付着した付着型コラムスペーサであり得る。コラムスペーサ１００ｂは直線型で例示されているが形態は多様に変形され得る。

一般的に、ヒトゲノム内の多様な遺伝情報を検出するために要求されるプローブの個数とプローブがカップリングされる領域のデザインルールが下表１に例示されている。

前記表１から分かるように、得ようとする情報によってデザインルールが変わることが分かる。デザインルールが１０μｍ以上の場合には染色体内の特定位置のＤＮＡ糸に対する遺伝子情報を得ることができる。反面、デザインルールを５μｍ以下に減少させる場合には遺伝情報発現の最小単位のエクソンの分析、個体間異形質発現の最小単位のハプロタイプ観点での分析、ＳＮＰ分析などを多様に試みることができる。また、デザインルールを１μｍ以下に減少させる場合にはＤＮＡの最小構成単位のヌクレオチド序列までも分析することができる。

したがって、図１Ａないし図３Ｃに例示されているオリゴマープローブアレイで、第１アレイ領域と第２アレイ領域を構成する第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”とこれに対応する第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’のデザインルールは一つのオリゴマープローブアレイで同時に分析しようとする分析の種類によって多様に選択され得る。

図１Ａないし図３Ｃでは第１アレイ領域を構成する第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”のデザインルールが第２アレイ領域を構成する第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’のデザインルールより小さい場合を例示しているが、これは必要によって多様に変形され得るのは言うまでもない。

図１Ａないし図１Ｃは表面にオリゴマープローブ１６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域１１３０によって分離され、基板１００ａ上にパターニングされ形成された第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”から成る第１アレイ領域と表面にオリゴマープローブ２６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域２１３０によって分離され、基板１００ａ上にパターニングされ形成された第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’から成る第２アレイ領域を含む多機能オリゴマープローブアレイの実施形態を示す。

図２Ａないし図２Ｃは表面にオリゴマープローブ１６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域１１３０によって分離され、基板１００ａを局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ（ＬＯＣａｌ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ）酸化膜で成された第１プローブセルアクティブ１２２０、１２２０’、１２２０”から成る第１アレイ領域と、表面にオリゴマープローブ２６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域２１３０により分離され、基板１００ａを局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ（ＬＯＣａｌ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ）酸化膜で成された第２プローブセルアクティブ２２２０、２２２０’から成る第２アレイ領域を含む多機能オリゴマープローブアレイの実施形態を示す。

図３Ａないし図３Ｃは表面にオリゴマープローブ１６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域１１３０によって分離され、基板１００ａ内に形成されたトレンチ型第１プローブセルアクティブ１３２０、１３２０’、１３２０”から成る第１アレイ領域と表面にオリゴマープローブ２６０とカップリングされる官能基１５０を含まないセル分離領域２１３０により分離され、基板１００ａ内に形成されたトレンチ型第２プローブセルアクティブ２３２０、２３２０’から成る第２アレイ領域を含む多機能オリゴマープローブアレイの実施形態を示す。

オリゴマーとは共有結合した２つ以上のモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）から成るポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）のうち分子量が概ね１０００以下のものを指称するがこの数値に限定されるものではない。オリゴマーは約２−５００個のモノマー、好ましくは５−３０個のモノマーを含むであろう。モノマーはプローブの種類によってヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド等がなることができる。オリゴマープローブはあらかじめ合成されものでもあり得、アクティブ上にインサイツフォトリソグラフィ工程によって合成されたものでもあり得る。

ヌクレオシドおよびヌクレオチドは公知のプリンおよびピリジン塩基を含むだけでなくメチル化されたプリンまたはピリジン、アシル化されたプリンまたはピリジンなどを含み得る。また、ヌクレオシドおよびヌクレオチドは従来のリボスおよびデオキシリボース糖を含むだけでなく一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族で置換されたり、エーテル、アミドなどの官能基が結合した変形された糖を含み得る。

基板１００ａは混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）過程の間、望みでない非特異的結合を最小化さらには実質的に０にすることができ、可視光および／またはＵＶなどに透明な物質でなされ得る。基板は可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）または剛性（ｒｉｇｉｄ）基板であり得る。可撓性基板はナイロン、ニトロセルロースなどのメンブレインまたはプラスチックフィルムなどであり得る。剛性基板はシリコン基板、ソーダ石灰ガラスのような透明ガラス基板などであり得る。シリコン基板または透明ガラス基板の場合には混成化過程の間、非特異的結合がほとんど生じないという長所がある。

また、透明ガラス基板の場合には可視光および／またはＵＶなどに透明で、蛍光物質の検出に有利である。シリコン基板または透明ガラス基板は半導体素子の製造工程またはＬＣＤパネルの製造工程ですでに安定的に確立され適用される多様な薄膜の製造工程および写真エッチング工程などをそのまま適用することができるという長所がある。
第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’は混成化分析条件、例えばｐＨ６−９の燐酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはＴＲＩＳバッファと接触時、加水分解されず実質的に安定した物質で形成されるのが好ましい。したがって、ＰＥ−ＴＥＯＳ膜、ＨＤＰ酸化膜またはＰ−ＳｉＨ４酸化膜、熱酸化膜などのシリコン酸化膜、ハフニウムシリケート、ジルコニウムシリケートなどのシリケート、シリコン窒化膜、シリコン酸窒化膜、ハフニウム酸窒化膜、ジルコニウム酸窒化膜などの金属酸窒化膜、チタニウム酸化膜、タンタル酸化膜、アルミニウム酸化膜、ハフニウム酸化膜、ジルコニウム酸化膜、ＩＴＯなどの金属酸化膜、ポリイミド、ポリアミン、金、銀、銅、パラジウムなどの金属、またはポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリビニールなどのポリマーで形成され得る。

図１Ａないし図３Ｃに図示されている本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイは第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’の表面にはオリゴマープローブ１６０、２６０またはオリゴマープローブ１６０、２６０のインサイツ合成のためのモノマーとカップリングできる官能基１５０（以下オリゴマープローブ１６０、２６０とカップリングできる官能基と略していう）を含む反面、プローブセル分離領域１１３０、２１３０の表面は官能基１５０を含まない。

官能基１５０とは有機合成工程の出発点（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）として使用されえる基を指称する。すなわちあらかじめ合成された（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）オリゴマープローブ１６０、２６０またはインサイツ合成のためのモノマー、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドなどのモノマーがカップリング、例えば共有または非共有結合することができる基を指称し、カップリングされ得る限り特定の制限がない。官能基１５０としてはヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、チオール基、ハロ基またはスルホン酸基などを例にあげることができる。

したがって、オリゴマープローブ１６０、２６０が第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’の表面にだけカップリングされプローブセル分離領域１１３０、２１３０にはカップリングされない。そのため、各アレイ領域で分析を行う時、信号対雑音比を増大させることができるため分析の正確度を高めることができる。

図１Ａないし図３Ｃでは第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’の表面にオリゴマープローブ１６０、２６０とカップリング、例えば共有結合できる官能基１５０がリンカー１４０と一緒に提供されていたものと例示されている。

しかし、第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’を構成する物質自体に官能基１５０を含む場合にはリンカー１４０が省略されることもある。また、第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０’、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’を構成する物質自体が官能基１５０を含まない場合であるとしても表面処理によって官能基１５０が直接提供され得る。表面処理の例としてはオゾン処理（ｏｚｏｎｏｌｙｓｉｓ）、酸処理、塩基処理など多様であり得る。すなわち、リンカー１４０の形成は選択的（ｏｐｔｉｏｎａｌ）であり得る。

リンカー１４０を使用する場合にはプローブ１６０、２６０がターゲットサンプルと自由に相互作用、例えば混成化が起きるようにできる長所がある。
したがって、リンカー１４０はプローブ１６０、２６０とターゲットサンプル間の自由な相互作用が可能なように十分な長さを有するのが好ましい。したがって、リンカー分子の長さは６ないし５０ａｔｏｍｓであり得るが、これに制限されるものではない。

リンカー１４０は第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”および第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’とカップリングできるカップリング基とオリゴマープローブ１６０、２６０のインサイツフォトリソグラフィ合成時、モノマーとカップリングできる官能基１５０を含む物質で形成され得る。官能基は保護基によって保護され得る。また、オリゴマープローブ１６０、２６０のインサイツ合成前、第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’に提供されていているリンカー１４０には保存目的のための保護基が付着し得る。

保護基は付着している位置が化学反応に参与するのを遮断する基を指称し、脱保護は保護基が付着位置から分離され前記位置が化学反応に参与することができるようにすることを指称する。例えばリンカー１４０に結合している官能基１５０に酸分解（ａｃｉｄ ｌａｂｉｌｅ）性または光分解（ｐｈｏｔｏ ｌａｂｉｌｅ）性保護基が付着されており、官能基１５０を保護していてインサイツフォトリソグラフィ合成のためのモノマーのカップリングまたは合成オリゴマープローブ１６０、２６０のカップリング前に除去され官能基１５０を露出させることができる。

第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’がシリコン酸化膜、シリケートまたはシリコン酸窒化膜から成る場合、リンカー１４０のカップリング基はＳｉ（ＯＨ）基と反応し、シロキサン（Ｓｉ−Ｏ）結合を生成することができるシリコン基を含み得る。

例えば−Ｓｉ（ＯＭｅ）_３、−ＳｉＭｅ（ＯＭｅ）_２、−ＳｉＭｅＣｌ_２、−ＳｉＭｅ（ＯＥｔ）_２、−ＳｉＣｌ_３、−Ｓｉ（ＯＥｔ）_３であり得る。官能基１５０を含み、シロキサン結合を生成することができるシリコン基を含む物質としてはＮ−（３−（トリエトキシシリル）−プロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｎ−（３−（ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｍｉｄｅ）、Ｎ、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピル−トリエトキシシラン（Ｎ、Ｎ−ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、アセトキシプロピル−トリエトキシシラン（ａｃｅｔｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−グリシデキシプロピルトリメトキシシラン（３−Ｇｌｙｃｉｄｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、国際公開特許ＷＯ ００／２１９６７号に開示されたシリコン化合物などを例にあげることができ、前記公開特許の内容は本明細書に十分に開示されたように援用され統合される。

第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’が金属酸化膜で成された場合、リンカー１４０のカップリング基は金属アルコキシド（ｍｅｔａｌ ａｌｋｏｘｉｄｅ）または金属カルボキシラート（ｍｅｔａｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）基を含み得る。

第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’がシリコン窒化膜、シリコン酸窒化膜、金属酸窒化膜、ポリイミドまたはポリアミンなどで成された場合、リンカー１４０のカップリング基は無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、塩酸（ａｃｉｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルキル ハロゲン化物（ａｌｋｙｌ ｈａｌｉｄｅｓ）または塩化炭酸塩（ｃｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅｓ）基を含み得る。

第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’が金属で成された場合、リンカー１４０のカップリング基は硫化物（ｓｕｌｆｉｄｅｓ）、セレン化物（ｓｅｌｅｎｉｄｅｓ）、ヒ化物（ａｒｓｅｎｉｄｅｓ）、テルル化物（ｔｅｌｌｕｒｉｄｅｓ）、アンチモン化物（ａｎｔｉｍｏｎｉｄｅｓ）基を含み得る。

第１プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’がポリマーで成された場合、リンカー１４０のカップリング基はアクリル基（ａｃｒｙｌｉｃ）、スチリル基（ｓｔｙｒｙｌ）、ビニル基（ｖｉｎｙｌ）基を含み得る。

図１Ａ、図２Ａおよび図３Ａは第１プローブセルアクティブ１１２０、１２２０、１３２０と第２プローブセルアクティブ２１２０、２２２０、２３２０が実質的に平たい上面を有する場合を例示している。図１Ｂ、図２Ｂおよび図３Ｂには３次元表面を有する第１プローブセルアクティブ１１２０’、１２２０’、１３２０’が例示されている。

３次元表面を有することによって同一デザインルールが適用される図１Ａ、図２Ａおよび図３Ａの第１プローブセルアクティブ１１２０、１２２０、１３２０に比べ、オリゴマープローブ１６０がカップリングされ得る面積を増大させることができる。したがって、カップリングされるオリゴマープローブ１６０の数を増加させることができる。このためデザインルールが減少したとしても望みの検出輝度を確保することができる。

第１プローブセルアクティブ１１２０’、１２２０’、１３２０’内に形成されたグルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）（Ｇ１）等によって第１プローブセルアクティブ１１２０’、１２２０’、１３２０’の表面が３次元形態を示すことができる。しかし、３次元表面を示すことができる構造であれば、いかなる構造であっても適用可能なのはもちろんである。

図１Ｃ、図２Ｃおよび図３Ｃでは表面に形成された第１および第２グルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）（Ｇ１、Ｇ２）等によって３次元表面を有する第１プローブセルアクティブ１１２０”、１２２０”、１３２０”と第２プローブセルアクティブ２１２０’、２２２０’、２３２０’が例示されている。

第１アレイ領域と第２アレイ領域のデザインルールが顕著に小さくなっても３次元表面を提供することによってカップリングされるオリゴマープローブ１６０、２６０の数を増加させることによって望みの検出輝度で確保することができる。

また、第１アレイ領域と第２アレイ領域に同一デザインルールを適用したとしても第１および第２グルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）（Ｇ１、Ｇ２）の形態を異にすることによって多機能オリゴマープローブアレイを具現することもできる。

図１Ａないし図３Ｃに図示されている本発明のいくつかの実施形態ではオリゴマープローブ１６０、２６０とカップリングされる官能基１５０を含まないプローブセル分離領域１１３０、２１３０が露出されたシリコン基板表面または露出された透明基板表面であり得る。

本発明のいくつかの他の実施形態では、図４に図示されているように、プローブセル分離領域（１１３０、２１３０）が基板１００ａ全面に形成されプローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、２１２０、２１２０’により露出されたオリゴマープローブカップリングブロッキング膜（１１３２）またはプローブセルアクティブ１２２０、１２２０’、１２２０”、２２２０、２２２０’、１３２０、１３２０’、１３２０”、２３２０、２３２０’により露出された基板１００ａ領域上に形成されたカップリングブロッキング膜１１３２、２１３２であり得る。カップリングブロッキング膜１１３２、２１３２はフルオルシラン膜のようにフッ素基を含むフッ化物であり得る。また、カップリングブロッキング膜（１１３２、２１３２）はシリサイド膜、ポリシリコン膜またはＳｉ、ＳｉＧｅ等のエピタキシャル膜であり得る。

また、本発明のいくつかのまた他の実施形態は、図５に例示されているように、プローブセル分離領域１１３０、２１３０がオリゴマープローブカップリングブロッキング特性を有し、プローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”、２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’の間を充填するオリゴマープローブカップリングブロッキング充填材（ｆｉｌｌｅｒ）（１１３４、２１３４）であり得る。カップリングブロッキング充填物またフッ素基を含むフッ化物、ポリシリコン膜等であり得る。

また、本発明のいくつかのまた他の実施形態は、図６に例示されているように、プローブセル分離領域１１３０がプローブセルアクティブ１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０”、２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’の間を充填する充填材（ｆｉｌｌｅｒ）１１３６、２１３６とその上面のカップリングブロック膜（１１３８、２１３８）であり得る。この場合充填材１１３６、２１３６は必ずしもオリゴマープローブ１６０、２６０カップリングブロッキング特性を有する物質で形成される必要はない。

図７Ａおよび図７Ｂは本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの製造工程中間段階構造物の断面図である。
図７Ａを参照すれば、第１アレイ領域と第２アレイ領域の定義された基板１００を準備した後、基板１００上に第１アレイ領域と第２アレイ領域を区分するコラムスペーサが形成される領域を定義するフォトレジストパターン（ＰＲ）を形成する。

図７ｂを参照すれば、フォトレジストパターン（ＰＲ）をエッチングマスクとして使用し高さが１００ないし５００μｍであり幅が１ないし２０ｍｍのコラムスペーサ１００ｂを形成し、オリゴマープローブアレイが形成される基板１００ａを提供する。

その後、第１アレイ領域および第２アレイ領域にオリゴマープローブアレイを各々形成する工程は本発明の出願人によって出願され、発明の名称が「向上した雑音率を示すオリゴマープローブアレイおよびその製造方法」と「向上した雑音率と検出輝度を示すオリゴマープローブアレイおよびその製造方法」である出願明細書に十分に開示されており、前記明細書の内容は本明細書に十分に開示されたもののように援用され統合される。

図８Ａおよび図８Ｂは、図１Ａに例示されている本発明の一実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの他の製造工程中間段階構造物の断面図である。
図８Ａを参照すれば、基板１００ａの第１アレイ領域と第２アレイ領域上にそれぞれのオリゴマープローブアレイを完成する。

図８Ｂを参考にすれば、高さが１００ないし５００μｍで幅が１ないし２０ｍｍのコラムスペーサ１００ｂを基板１００ａ上面に付着し、多機能オリゴマープローブアレイを完成する。
本発明に関するより詳細な内容は次の具体的な実験例によって説明し、ここに記載されない内容はこの技術分野で熟練した者ならば十分に技術的に類推できるものであるため説明を省略する。
［実験例１］

シリコン基板上にＣＶＤ方法を使用しＰＥ−ＴＥＯＳ膜を５００ｎｍ厚さで形成した。前記基板上にフォトレジスト膜３．０μｍをスピンコーティング法によって形成した後、１００℃で６０秒間ベイクした。３６５ｎｍ波長の投影露光装置でフォトレジスト膜を露光した後、２．３８％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄ）水溶液で現像し、碁盤形態の縦横交差する直線領域を露出させるフォトレジストパターンを形成した。

フォトレジストパターンをエッジングマスクとして使用しＰＥ−ＴＥＯＳ膜をエッチングし、第１アレイ領域には５μｍサイズのＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターンアレイを、第２アレイ領域には１０μｍサイズのＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターンアレイを形成した。ＣＶＤ方法を使用し、ポリシリコンを基板全面に形成した後、ＣＭＰを行い、オリゴマープローブカップリングブロッキング特性を有し、ＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターンの間を充填する充填材を形成した。

続いて、ＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターン上にビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランをコーティングした後、アミダイト活性化されたＮＮＰＯＣ−テトラエチレングリコール（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）とテトラゾール（ｔｅｔｒａｚｏｌｅ）の１：１アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）溶液で処理して、光分解性基で保護されたホスホラミダイトをカップリングし、アセチルキャッピングして保護されたリンカー構造を完成した。

続いて、オリゴヌクレオチドプローブのインサイツ合成をフォトリソグラフィに方式で行った。望みのプローブセルアクティブ領域を露出させるバイナリマスクを使用して３６５ｎｍ波長の投影露光装置で１０００ｍＪ／μｍのエネルギーで１分間露光し、リンカー構造の末端を脱保護した。

続いて、アミダイト活性化されたヌクレオチドとテトラゾールの１：１アセトニトリル溶液で処理して、保護されたヌクレオチドモノマーをカップリングし、アセト酸無水物（Ａｃ２０）／ピリジン（ｐｙ）／メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）＝１：１：１のＴＨＦ溶液および０．０２ＭのヨードＴＨＦ溶液で処理して、キャッピングおよび酸化工程を行った。

このような脱保護、カップリング、キャッピング、酸化工程を繰り返して、第１アレイ領域のＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターンで成されたプローブセルアクティブには全体ゲノムの転写体、ｍＲＮＡ、または遺伝子の特定領域に詳報的な序列を持つオリゴヌクレオチドプローブを形成し、第２アレイ領域のＰＥ−ＴＥＯＳ膜パターンで成された各プローブセルアクティブには全体ゲノムの多形質位置またはアップ／ダウンストリーム（ｕｐ／ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ）の特定領域に相補的な序列を有するオリゴヌクレオチドプローブを形成した。

続いて、第１アレイ領域と第２アレイ領域の境界の部分に１ｍｍ幅、１００μｍ高さのコラムスペーサを付着し、第１アレイ領域では遺伝子発現分析が可能で第２アレイ領域では遺伝子型分析が可能な多機能オリゴヌクレオチドプローブアレイを完成した。
［実験例２］

シリコン基板上に１．２μｍ厚さのフォトレジスト膜をスピン−コーティングした後、１００℃で６０秒間ベイクした。続いて３６５ｎｍ波長の投影露光装置でフォトレジスト膜を露光した後、２．３８％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄ）水溶液で現像し、フォトレジストパターンを形成した。フォトレジストパターンをエッジングマスクとして使用し下部シリコン基板をＣＦ_４系列のプラズマでエッチングして、１ｍｍ幅、１００μｍ高さのコラムスペーサを形成し、第１アレイ領域と第２アレイ領域が定義された基板を完成した。

その後、プローブセルアクティブ形成、リンカー形成、オリゴヌクレオチドプローブのインサイツ合成を実験例１と実質的に同一に行い、多機能オリゴヌクレオチドプローブアレイを完成した。

以上添付された図面を参照し、本発明の実施形態を説明したが、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は本発明のその技術的思想や必須の特徴を変更せずとも他の具体的な形態で実施され得るということを理解できるであろう。そのため以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。

遺伝子発現分析と遺伝子型分析分野に使用され得る。

基板上にパターニングされて形成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板上にパターニングされて形成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板上にパターニングされて形成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板を局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ（ＬＯＣａｌ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ）酸化膜で成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板を局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ（ＬＯＣａｌ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ）酸化膜で成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板を局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ（ＬＯＣａｌ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ）酸化膜で成されたプローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板内に形成したトレンチ型プローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板内に形成したトレンチ型プローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 基板内に形成したトレンチ型プローブセルアクティブを含む本発明のいくつかの実施形態による多機能オリゴマープローブアレイを示す断面図である。 図１Ａないし図３Ｃに例示されている多機能オリゴマープローブアレイ実施形態の多様な変形例を示す表である。 図１Ａないし図３Ｃに例示されている多機能オリゴマープローブアレイ実施形態の他の多様な変形例を示す表である。 図１Ａないし図３Ｃに例示されている多機能オリゴマープローブアレイ実施形態のまた他の多様な変形例を示す表である。 本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの製造工程中間段階構造物の断面図である。 本発明の実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの製造工程中間段階構造物の断面図である。 図１Ａに例示されている本発明の一実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの他の製造工程中間段階構造物の断面図である。 図１Ａに例示されている本発明の一実施形態による多機能オリゴマープローブアレイの他の製造工程中間段階構造物の断面図である。

符号の説明

１１２０、１１２０’、１１２０”、１２２０、１２２０’、１２２０”、１３２０、１３２０’、１３２０” 第１プローブセルアクティブ
２１２０、２１２０’、２２２０、２２２０’、２３２０、２３２０’ 第２プローブセルアクティブ
１００ａ 基板
１５０ 官能基
１６０、２６０ オリゴマープローブ
１１３０、２１３０ セル分離領域

Claims (17)

1. 基板と、
   表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第１プローブセルアクティブ、および前記各第１プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第１アレイ領域と、
   表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないプローブセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第２プローブセルアクティブ、および前記各第２プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む第２アレイ領域、および
   前記第１アレイと第２アレイに適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを含む多機能オリゴマープローブアレイ。
2. 前記第１アレイ領域は、遺伝子発現分析のためのアレイであり、前記第２アレイ領域は遺伝子型分析のためのアレイである請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
3. 前記コラムスペーサは、前記基板をエッチングし形成した一体型コラムスペーサ、または前記基板に付着した付着型コラムスペーサである請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
4. 前記コラムスペーサは１００ないし５００μｍの高さと、１ないし２０ｍｍの幅を有する請求項３に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
5. 前記第１および第２プローブセルアクティブの表面は、各々平たい表面、または３次元表面を有する請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
6. 前記３次元表面は、前記第１プローブセルアクティブおよび／または第２プローブセルアクティブに形成された一つ以上のグルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）によって提供される請求項５に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
7. 前記第１および第２プローブセルアクティブの表面は、前記オリゴマープローブとカップリングされる官能基を含むが、前記官能基の一部は前記オリゴマープローブとカップリングされ、残りの官能基は非活性キャッピングされている請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
8. 前記第１および第２プローブセルアクティブは、前記基板上に形成された膜のパターン、前記基板を局部的に酸化し形成したＬＯＣＯＳ酸化膜、または基板内に形成されたトレンチを埋め立てるトレンチ型アクティブである請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
9. 前記プローブセル分離領域の表面は、露出されたシリコン基板表面、または透明ガラス基板表面である請求項８に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
10. 前記プローブセル分離領域の表面は、前記基板上面に形成されたオリゴマープローブカップリングブロッキング膜表面である請求項８に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
11. 前記プローブセル分離領域の表面は、前記第１および第２プローブセルアクティブの間を埋め立て、オリゴマープローブカップリングブロッキング特性を有する充填材表面である請求項８に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
12. 前記プローブセル分離領域の表面は、前記第１および第２プローブセルアクティブの間を埋め立てる充填材上面に形成されたオリゴマープローブカップリングブロッキング膜表面である請求項８に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
13. 前記オリゴマープローブは、リンカーを介在して前記第１および第２プローブセルアクティブにカップリングされた請求項１に記載の多機能オリゴマープローブアレイ。
14. 第１アレイ領域と第２アレイ領域を含む基板を提供するが、前記第１アレイ領域は表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第１プローブセルアクティブ、および前記第１プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含み、
    前記第２アレイ領域は表面にオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないセル分離領域によって分離され、前記基板上または内に形成された多数の第２プローブセルアクティブ、および前記第２プローブセルアクティブ別にカップリングされた互いに異なる序列の多数のオリゴマープローブを含む基板を提供し、
    前記基板上に前記第１アレイと第２アレイに適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを付着することを含む多機能オリゴマープローブアレイの製造方法。
15. 前記第１アレイ領域は遺伝子発現分析のためのアレイであり、前記第２アレイ領域は遺伝子型分析のためのアレイである請求項１４に記載の多機能オリゴマープローブアレイの製造方法。
16. 基板を提供し、
    前記基板をエッチングして、第１アレイ領域と前記第２アレイ領域を定義し、前記第１アレイ領域と第２アレイ領域に適用されるターゲットサンプルのクロストークを遮断するコラムスペーサを形成し、
    前記第１アレイ領域の前記基板上または前記基板内にプローブセル分離領域によって分離される多数の第１オリゴマープローブセルアクティブを形成し、前記第２アレイ領域の前記基板上または前記基板内に前記プローブセル分離領域によって分離される多数の第２オリゴマープローブセルアクティブを形成するが、前記プローブセル分離領域の表面はオリゴマープローブとカップリングされる官能基を含まないように形成し、
    前記多数の第１および第２オリゴマープローブセルアクティブ別に互いに異なる序列のオリゴマープローブをカップリングすることを含む多機能オリゴマープローブアレイの製造方法。
17. 前記第１アレイ領域は遺伝子発現分析のためのアレイであり、前記第２アレイ領域は遺伝子型分析のためのアレイである請求項１６に記載の多機能オリゴマープローブアレイの製造方法。

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