JP2007298486A - 血管内皮細胞を用いた血栓観測方法および血栓観測装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 その内部の少なくとも一部に血管内皮細胞が付着した細胞培養室に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除しつつ流して前記細胞培養室における血栓の生成を観測することを特徴とする血栓形成観測方法、および、血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、その内部の少なくとも一部に血管内皮細胞が付着した細胞培養室と、該細胞培養室に接続されて前記細胞培養室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置。
【選択図】 図1
Description
一方、エコノミークラス症候群や深部静脈血栓症等の静脈血栓症は、血管内皮細胞に覆われた血管内において、主に静脈内血の鬱滞によって発症する。血流の鬱滞に加え、凝固制御系や線溶系因子の先天異常や糖尿病、外傷、癌等の基礎疾患等、種々の凝固亢進要因が複合し静脈血栓症の発症リスクを高める。
このようにアテローム血栓症は明らかに血管病変に起因して血栓形成が起きるのに対して、静脈血栓症は血管内皮細胞に覆われた血管内において起こる血栓症で有り、鬱血に加え、凝固系活性化、血小板及び白血球の活性化、及び血管内皮細胞の活性化等が総合的に関与する。白血球の活性化は内皮細胞との接着能を高め、その結果、内皮細胞を活性化する。活性化した白血球や内皮細胞は表面に組織因子を発現し、凝固系を活性化し、活性化した凝固系はさらに血小板、白血球、内皮細胞を活性化する。
このような静脈血栓症におけるリスクの評価、抗血栓療法における抗血栓効果のモニタリングには試験管内における静的な試験では不十分であり、血流の存在下、凝固、血小板、白血球、内皮細胞の総合的な評価が重要である。
しかしながら、生体内では血流下で血栓が成長するのに対し、上記の検査方法等は閉鎖された試験管内での測定であるため、血栓が生体内で成長する状態を反映することはできない。
しかし、この文献に記載の発明は、抗凝固薬の存在下で観測を行うために、凝固系によって起こる血小板の粘着、凝集による血栓が形成されず、また、血栓の生成能の低下を、血小板の形態変化を観測することで評価するものであり、凝固系と連動した血小板活性化が反映されない。したがって、抗血小板薬の薬効を評価するには使用できるが、血栓そのものや血栓形成過程全体をモニターする事はできない。血小板は凝固系によって活性化され、凝固系は活性化血小板によって促進される。すなわち抗凝固処理された血液は、血小板の活性化も抑制されてしまい抗血栓薬の効能を観測することはできない。さりとて、抗凝固処理を行わなければ血液は直ちに凝固してしまうので、試験に供することはできない。
また、特許文献2には、血管内皮細胞が培養されたチャンバ内に白血球を含む溶液を流し込んで、白血球と血管内皮細胞とのインタラクションを発生させて、白血球接着現象を画像解析する方法が開示されている。
しかしながら、この方法でも凝固系の活性化等は反映されず、観察できる血栓形成は生体内で生じる血栓形成を十分反映しているとはいえないものであった。
本発明の血栓観測方法においては、白血球および/または血小板の血管内皮細胞への接着を指標にして血栓形成を観測することが好ましい。
また、白血球および/または血小板を標識物質で標識し、該標識を検出することにより白血球および/または血小板の血管内皮細胞への接着を観測することが好ましい。
また、抗凝固処理はトロンビン阻害効果を有する1本鎖DNA又はRNAによる処理が好ましく、抗凝固処理を解除するためには、前記トロンビン阻害効果を有する1本鎖DNA又はRNAに対するアンチセンスDNA又はアンチセンスRNAを用いることが好ましい。
該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血管内皮細胞が付着した細胞培養室と、該細胞培養室に接続されて前記細胞培養室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置を提供する。
また、細胞培養室における血液の流入時および/または流出時の圧力を測定することで、極めて簡易な装置で容易に、血栓形成の有無を確認することができる。
むものであればよいが、例えば、全血や多血小板血漿などを用いることができる。
血液は、抗凝固処理をしたものを使用する。抗凝固処理に使用できる抗凝固剤としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、ACD(Acid Citrate Dextrose)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)塩などを挙げることができる。このような抗凝固剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができるが、既存の3.2%クエン酸ナトリウムを用いるのが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液9容に対してこの抗凝固剤1容とするのが好ましい。
なお、抗凝固剤は2種類以上用いてもよい。
なお、抗凝固剤としてトロンビンアプタマーを用いた場合には、患者の血液中のカルシウム、マグネシウム、亜鉛等の種々の2価金属イオン濃度を的確に反映した試験が可能で有り、キレート剤添加による細胞のダメージも起こらない。
例えば、終濃度5μMのトロンビンアプタマーを用いて抗凝固処理を行い、15μMのトロンビンアプタマーアンチセンスDNAを用いて可逆的に抗凝固処理を解除することができる。より血液サンプル保存が長時間に及ぶ場合には、30μg/mlのコーン由来トリプシンインヒビター等で接触因子の活性化を阻害してもよい。
なお、観測する血液試料が希釈されない為に、抗凝固解除試薬の容量は抗凝固処理血液
に対し10分の1もしくはそれ以下であることが望ましい。
ここで、細胞培養室に付着させる血管内皮細胞としては、株化細胞でも初代培養細胞でもよい。血管内皮細胞の由来は特に制限されないが、ヒトにおける血栓形成を評価するためにはヒト由来の血管内皮細胞を使用することが好ましい。血管内皮細胞としては、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠状動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞などが例示できる。
血管内皮細胞は、シートやプレート上であらかじめ培養したものを細胞培養室に設置するか、あるいは、細胞培養室内であらかじめ培養したものを使用することが可能である。血管内皮細胞を培養する場合、細胞の接着をよくするため、細胞培養室内の血管内皮細胞接着面をあらかじめコラーゲンコートしておき、その上に血管内皮細胞を培養することが好ましい。
取り扱いを考慮して、図1に示されるような、スライドグラス(またはプラスチック製プレート)と流路部材を接着させてなるマイクロチップ内に血管内皮細胞を培養して細胞培養室とすることが望ましい。また、血管内皮細胞は、血栓観測時にコンフルエントの状態になっているものを使用することが好ましい。
白血球および/または血小板を標識するための標識物質としては、蛍光物質、放射性物質などが挙げられる。
白血球および/または血小板を標識するための蛍光物質としては、メパクリンなどが挙げられ、蛍光光学顕微鏡や蛍光実態顕微鏡を用いて血栓形成を観察することができる。
例えば、10μM程度のメパクリンを血液に加えることにより、簡便に白血球、血小板を緑色に染色することが可能である。
白血球および/または血小板を蛍光標識して蛍光顕微鏡でモニターする方法としては、特許文献1に開示されている方法が例示される。本発明の方法によれば、共焦点レーザー顕微鏡を用いずとも、安価な蛍光実体顕微鏡を用いることでリアルタイムに血栓形成が観測でき、より簡便な観測が可能である。
なお、蛍光を利用して血栓形成を観察する際には、細胞培養室を透明な素材とし、細胞培養室の細胞が付着している側、すなわち、血液が流れる側とは反対側から観察することが好ましい。
なお、標識物質はそれ自体が白血球および/または血小板と結合しうるものであってもよいし、白血球および/または血小板を認識しうる物質が標識されていてもよい。例えば、白血球および/または血小板に特異的な抗体を標識物質で標識して検出に使用してもよい。このような抗体としては、抗GPIIbIIIa抗体などが挙げられる。
とを特徴とする血栓観測装置である。
本発明の血栓観測装置は、さらに、細胞培養室に接続された、細胞培養室を通過した血液を排出するための排出管を備えるものであることが好ましい。
本発明の血栓観測装置は、さらに、流入管および/または薬剤管を加圧するポンプを備えるものであることが好ましい。
本発明の血栓観測装置は、さらに、圧力測定装置を備えるものであることが好ましい。
流入管、薬剤管及び排出管も、透明な、ガラスや熱可塑性樹脂などで製造することができ、管内部がヘパリン、シリコン、もしくはPVLAなどで表面処理されていることが好ましい。
図1に示すように、本形態例に係る血栓観測装置1は、細胞培養室10と、該細胞培養室10に接続されて前記細胞培養室に血液を流入させる流入管11と、該流入管11に接続されて前記流入管11に抗凝固処理を解除する薬剤を投入する薬剤管12と、該細胞培養室10に接続されて前記細胞培養室から血液を排出させる排出管13を備える。
PDMS(ポリジメチルシロキサン)製の流路部材Aは、血液の流路となりうる、上面から下面に貫通した溝を有する構造を持つ。流路部材Aの長さは1mm〜10cmとすることが好ましく、溝を、流路幅20μm〜1cm、深さ20μm〜1cmとすることが好ましい。
スライドガラスBは流路部材Aとの接着面がコラーゲンコートされており、このスライドガラスBを流路部材Aと可逆または不可逆的に接着させることにより、流路部材Aの溝とスライドガラスBに囲まれた空間が生じる。なお、流路部材Aの素材をPDMSとすることで接着剤等を用いずとも、自己接着性によってスライドガラスBを圧着させることが可能である。
次に、別途、細胞培養ディッシュ内で培養された血管内皮細胞をトリプシン処理等によってディッシュから剥離させ、血管内皮細胞を回収した後、培地に懸濁する。該血管内皮細胞懸濁液を流路部材AとスライドガラスBの接着によって出来る空間に添加し、1時間程度インキュベートしてスライドガラスBへ血管内皮細胞を接着させる。こうして得られた血管内皮細胞を接着させた流路部材A及びスライドガラスBからなるユニットを新たに用意したディッシュに入れ、培地でディッシュ全体を満たしCO2インキュベーター内で血管内皮細胞を培養する。以上の細胞の取り扱いは無菌条件下で行うことが望ましい。
目的とする細胞密度まで培養を行った後、流路部材AとスライドグラスBからなるユニットに蓋Cを圧着させる。蓋Cは内面(ユニットとの接着面)がへパリンまたはPVLA等で抗血栓処理された透明プラスチックかシリコンコートされている板状のガラス又は透明プラスチックを用いる事が望ましい。流路部材A、スライドガラスB、および蓋Cをクリップ等で固定することにより流路からの液漏れを簡単に防ぐことが可能である。
なお、流路部材A、スライドガラスB、および蓋Cは滅菌して使用される。これらは放射線又は加圧蒸気によって滅菌されることが望ましい。
また、蓋Cには、流路部材Aの溝の両端に相当する箇所に穴が2箇所設けられている。蓋Cの穴に接続された流入管11より抗凝固処理血液を流入させ、該流入管に分岐して接
続された薬剤管12より抗凝固解除液を流入させ、抗凝固処理血液を抗凝固処理を解除しながら細胞培養室に流入させる。また、蓋Cの他方の穴には排出管を接続し、細胞培養室を通過した血液が排出されるようにする。
細胞培養室を顕微鏡観測することで、血液凝固、内皮細胞、血小板、白血球の各因子の相互作用や血栓形成を観測することが可能である。流入する血液を例えばメパクリン処理し、メパクリンの蛍光を観察することで、白血球、血小板の血管内皮細胞との相互作用をリアルタイムに観測することができる。なお、蛍光を観察するときはスライドガラスB側から細胞培養室を観察することが好ましい。
また、一定時間血液を流入させた後、内部を生理食塩水等で洗浄することで、付着する血栓を直接的に目視確認することも可能である。
蓋Cの各穴に流入管、薬剤管および排出管のチューブを図2のように接続することにより血栓観測装置が得られる。流入管11より抗凝固処理血液を、薬剤管12より抗凝固解除液をそれぞれ流入させることにより、Y字の流路内で抗凝固処理血液が抗凝固処理解除剤と混合され、混合された血液が細胞培養室に流入し、血栓が形成される。これを図1と同様にして観測する。
20…スライドガラスB、21…流路部材A、22…蓋C
Claims (5)
- その内部の少なくとも一部に血管内皮細胞が付着した細胞培養室に、抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除しつつ流して前記細胞培養室における血栓の生成を観測することを特徴とする、血栓観測方法。
- 白血球および/または血小板の血管内皮細胞への接着を指標にして血栓の形成を観測する、請求項1に記載の方法。
- 白血球および/または血小板を標識物質で標識し、該標識を検出することにより白血球および/または血小板の血管内皮細胞への接着を観測する、請求項2に記載の方法。
- 前記抗凝固処理がトロンビン阻害効果を有する1本鎖DNA又はRNAによる処理であり、該トロンビン阻害効果を有する1本鎖DNA又はRNAに対するアンチセンスDNA又はアンチセンスRNAを用いて抗凝固処理を解除することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の血栓観測方法。
- 血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除しつつ流して血栓の形成を観測する血栓観測装置であって、
該血栓観測装置は、その内部の少なくとも一部に血管内皮細胞が付着した細胞培養室と、該細胞培養室に接続されて前記細胞培養室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置。
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