JP2007282626A - Primer set for detecting a. deliciosa - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、食物アレルギーの原因となる可能性があるキウイ類を特異的にかつ高感度で検出することのできるプライマーセットに関する。 The present invention relates to a primer set that can specifically and sensitively detect kiwis that may cause food allergies.
キウイフルーツは、ビタミンＣ、ミネラル、食物繊維を豊富に含む果物として人気がある。その一方、キウイフルーツの摂取により口腔内にかゆみや腫れなどが認められる口腔アレルギー(OAS)、蕁麻疹やくしゃみ、さらには血管の浮腫や呼吸困難、血圧低下などのアナフィラキシーが引き起こされることが知られている。また、キウイフルーツアレルギー患者の中には、ラテックス、花粉やアボカド、バナナなどの果物と交差反応を示す患者もいる。 Kiwi fruit is popular as a fruit rich in vitamin C, minerals and dietary fiber. On the other hand, it is known that ingestion of kiwifruit may cause anaphylaxis such as oral allergy (OAS), urticaria and sneezing, which are observed in the oral cavity, vascular edema, respiratory distress, and blood pressure reduction. ing. Some kiwifruit allergic patients also cross-react with fruits such as latex, pollen, avocado and banana.
現在、アレルギー物質を含む食品については、症例数や重篤度を勘案して特に表示の必要性の高い、小麦、そば、卵、乳及び落花生の５品目（特定原材料）の表示が義務付けられている。また、特定のアレルギー体質を持つ人に対して過去に一定の頻度で重篤な健康危害が見られている20品目に関しては、これらを原材料として含む加工食品に可能な限り表示することが推奨されている。推奨品20品目のうち、果物としてはオレンジ、キウイフルーツ、モモ、リンゴ、バナナが含まれるが、なかでもキウイフルーツは症例数も多い。キウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)は、マタタビ属(Actinidia属)の植物であり、同じくマタタビ属の植物にはサルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)、マタタビ(A. polygama)等がある。サルナシ(A. arguta)の一部は、「ベビーキウイ」と呼ばれて市場に流通しており、また、キウイフルーツとの掛け合わせ品種も開発され、食用とされている。これらマタタビ属の植物の中には、キウイフルーツの主要アレルゲン蛋白質の一つと言われているアクチニジンの存在が確認されているものもあり、アレルギー患者が摂取することにより発症する可能性がある。 Currently, foods containing allergens are required to be labeled on five items (specific ingredients) of wheat, buckwheat, egg, milk, and peanuts, which are particularly necessary for labeling in consideration of the number of cases and severity. Yes. In addition, it is recommended to display as much as possible on processed foods that contain these as raw materials for 20 items that have had serious health hazards at a certain frequency in the past for people with specific allergic constitutions. ing. Of the 20 recommended products, fruits include orange, kiwifruit, peach, apple, and banana, but kiwifruit has many cases. Kiwi fruit (A. deliciosa, A. chinensis) is a plant of the genus Matabi (Actinidia genus), and the plants of the genus Matabi are also A. arguta, A. rufa, A. polygama ) Etc. A part of A. arguta is called “Baby Kiwi” and is distributed in the market. Also, cross-bred varieties with kiwifruit have been developed and used as food. Among these plants of the genus Matabi, there are some that have been confirmed to contain actinidine, which is said to be one of the major allergen proteins of kiwifruit, and may develop when ingested by allergic patients.
これまで特定原材料５品目については、ELISA法と確認試験（PCR法、ウェスタンブロット法）が公定法として示されているが、推奨品20品目については示されていない。従って、今後、推奨品20品目についても食品に対する安心・安全を確保する上で、検出法を確立する必要がある。キウイ類の検出に関しては、PCR法を用いてキウイフルーツを10mg/kg(10ppm)まで検出できたことが報告されているが(非特許文献１)、その詳細は不明であり、また、検出対象としているキウイ類の種類も不明である。また、キウイ類に関連する他の報告としては、PCR-RFLP法を用いてマタタビ属の種間掛け合わせ品種における葉緑体の多型を分析した例（非特許文献２）、キウイフルーツ(A. deliciosa)の品種をRAPD markerを用いて同定、系統分類した例（非特許文献３）があるが、いずれもキウイ類を他の果物と区別して特異的に検出するものではない。 So far, the ELISA method and confirmation test (PCR method, Western blot method) have been shown as official methods for 5 specific raw materials, but not 20 recommended products. Therefore, it is necessary to establish a detection method in order to ensure food safety and security for 20 recommended products. Regarding the detection of kiwis, it has been reported that kiwifruit could be detected up to 10 mg / kg (10 ppm) using the PCR method (Non-patent Document 1), but the details are unknown and the detection target The type of kiwis that are said to be unknown. Other reports related to kiwis include an example of analysis of polymorphism of chloroplasts in cross-species varieties of the genus Matabi, using the PCR-RFLP method (Non-patent Document 2), kiwifruit (A deliciosa) varieties have been identified and phylogenetically identified using RAPD markers (Non-patent Document 3), but none of them specifically detects kiwis separately from other fruits.
一方、リボソームRNAは、すべての生物の生命活動に不可欠なタンパク質合成に関わっており、リボソームRNAをコードする遺伝子（リボソームRNA遺伝子；rDNA）はほとんどの生物でゲノム内に複数コピー存在することが知られている。リボソームRNA遺伝子は、真核生物では一般に18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNAをコードする領域（それぞれ、18SrDNA, 5.8S rDNA, 28S rDNAという）が連続して存在し、反復配列を繰り返している。また、18Sと5.8Sの間、5.8Sと28Sの間にはそれぞれITS領域(ITS region：Internal Transcribed Spacer region)というスペーサー領域が存在し、それぞれITS-1,ITS-2と呼ばれている。このITS領域は、近縁種または種内系統群を識別する指標として用いられており、また、それを利用した植物の微量検出法についても報告（特許文献１）があるが、そばや落花生、小麦、大豆を他の植物と区別して特異的に検出するもので、キウイ類を他の果物と区別して特異的に検出するものではない。 On the other hand, ribosomal RNA is involved in protein synthesis that is indispensable for the life activity of all living organisms, and it is known that multiple copies of the ribosomal RNA-encoding gene (ribosomal RNA gene; rDNA) exist in the genome of most organisms. It has been. In eukaryotes, the ribosomal RNA gene generally has a region encoding 18S rRNA, 5.8S rRNA, and 28S rRNA (referred to as 18S rDNA, 5.8S rDNA, and 28S rDNA, respectively) and repeats a repetitive sequence. In addition, spacer regions called ITS regions (ITS region: Internal Transcribed Spacer regions) exist between 18S and 5.8S and between 5.8S and 28S, and are called ITS-1 and ITS-2, respectively. This ITS region is used as an index for identifying closely related species or in-species strains, and there is a report on a method for detecting trace amounts of plants using the same (Patent Document 1), but buckwheat, peanut, wheat The soybeans are specifically detected by distinguishing them from other plants, and the kiwis are not specifically detected by distinguishing them from other fruits.
従って、本発明は、キウイ類を特異的にかつ高感度で検出する簡便な手段を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a simple means for detecting kiwis specifically and with high sensitivity.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域における、マタタビ属植物に特異的な塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行えば、キウイ類を含む試料において特定のサイズの断片が増幅され、キウイ類を特異的にかつ高感度に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention have designed primers based on the base sequence specific to the genus Tabata in the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata When PCR was carried out using this, a fragment of a specific size was amplified in a sample containing kiwis, and it was found that kiwis could be detected specifically and with high sensitivity, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域における、マタタビ属植物に特異的な塩基配列に基づいて設計した一対のオリゴヌクレオチドから構成される、キウイ類検出用プライマーセット。
(2) 下記の配列番号１、２、又は３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの１種又は２種以上の混合物と、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、マタタビを除くキウイ類検出用プライマーセット(但し、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成されるものは除く)。
5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3' (配列番号１）
5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3' (配列番号２）
5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3' (配列番号３）
5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3' (配列番号４)
(3) 下記の配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、キウイ類検出用プライマーセット。
5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3' (配列番号５）
5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3' (配列番号６)
(4) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、（1）〜（3）のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅産物の有無を検出することを特徴とする、キウイ類の検出方法。
(5) (1)〜（3）のいずれかに記載のプライマーセットを含む、キウイ類検出用キット。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A primer set for detecting kiwis composed of a pair of oligonucleotides designed on the basis of a base sequence specific to the genus Tabata in the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata.
(2) Matatabi, comprising one or a mixture of two or more oligonucleotides having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 below and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 A primer set for detecting kiwis (excluding those comprising an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4).
5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3 '(SEQ ID NO: 4)
(3) A primer set for detecting kiwis comprising an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 below and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3 '(SEQ ID NO: 6)
(4) Using DNA extracted from the sample as a template, performing PCR using the primer set according to any of (1) to (3), and detecting the presence or absence of an amplification product obtained by the PCR A method for detecting kiwis.
(5) A kiwi detection kit comprising the primer set according to any one of (1) to (3).
本発明によれば、食物アレルギーの原因となる可能性があるキウイ類を特異的にかつ高感度で検出することのできるプライマーセットが提供される。本発明のプライマーセットを利用することにより、一回のPCRで、食品中に混入する微量のキウイ類の有無を検出することができる。また、本発明のプライマーセットを用いたPCRで増幅される産物は約100bpと短いため、食品の加工工程でDNAが断片化した場合も、検出感度の低下を最小限に抑えることができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the primer set which can detect specifically and highly sensitive kiwi which may cause a food allergy is provided. By using the primer set of the present invention, it is possible to detect the presence or absence of trace amounts of kiwis mixed in food by a single PCR. In addition, since the product amplified by PCR using the primer set of the present invention is as short as about 100 bp, even when DNA is fragmented during the food processing step, the decrease in detection sensitivity can be minimized.
本発明のキウイ類検出用プライマーセットは、マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS（Internal Transcribed Spacer）-1領域における、マタタビ属植物に特異的な塩基配列に基づいて設計した一対のオリゴヌクレオチドから構成される。当該オリゴヌクレオチドのうち、一方のオリゴヌクレオチドは、マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域における、マタタビ属植物に特異的な塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができ、キウイ類検出用プライマーセットのフォワードプライマーとして用いる。もう一方のオリゴヌクレオチドは、上記の特異的な塩基配列にアニーリングすることができ、キウイ類検出用プライマーセットのリバースプライマーとして用いる。 The primer set for detecting kiwis of the present invention is composed of a pair of oligonucleotides designed based on a base sequence specific to the genus Tabata in the ITS (Internal Transcribed Spacer) -1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata Is done. Among the oligonucleotides, one oligonucleotide can be annealed to a base sequence complementary to the base sequence specific to the genus Tabata in the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata, and kiwis Used as a forward primer in the detection primer set. The other oligonucleotide can be annealed to the specific base sequence described above and used as a reverse primer for the kiwi detection primer set.
本発明における「キウイ類の検出」とは、試料中に混入等により含まれているかもしれないキウイ類を他の果物等と判別しながら試料中のキウイ類の有無を判定することをいう。 “Detection of kiwis” in the present invention refers to determining the presence or absence of kiwis in a sample while discriminating kiwis that may be contained in the sample due to contamination or the like from other fruits or the like.
本明細書において「キウイ類」とはキウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)、食用とされているキウイフルーツの近縁種であるシマサルナシ(A. rufa)、キウイフルーツと交差反応性が確認されているサルナシ(A. arguta)、マタタビのほか、これらの掛け合わせ品種を含む総称である。 In this specification, “kiwi” refers to kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis), Kisarana pear (A. rufa), a related species of edible kiwifruit, and cross-reactivity with kiwifruit It is a general term that includes these cross varieties in addition to A. arguta and Matabi.
上記の「マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域における、マタタビ属植物に特異的な塩基配列」は、マタタビ属植物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域中に含まれ、他の植物種のリボソームRNA遺伝子のITS 領域中には含まれない配列をいう。この領域は、キウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)、サルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)、マタタビ(A. polygama)を含むマタタビ属植物、及びその他の果物から収集した複数のITS-1領域の塩基配列を整列（アラインメント）し、比較することにより特定することができる。具体的には、マタタビ属植物のITS-1領域における塩基配列のうち、マタタビ属植物に共通する複数の塩基を含み、その共通する塩基の中に他の果物と区別できる塩基が含まれる塩基配列を特定する。ここで、他の果物と区別できる塩基はプライマーの3'末端に置く。 The above-mentioned “base sequence specific to the Species of the genus Tabata in the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata” is contained in the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the Species of the genus Tabata, and other plant species. This sequence is not included in the ITS region of the ribosomal RNA gene. This area includes several species collected from plants of the genus Matabi, including Kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis), Sarnas (A. arguta), Shimasaruna (A. rufa), Matabi (A. polygama), and other fruits. The base sequences of the ITS-1 regions can be identified by aligning and comparing them. Specifically, among the base sequences in the ITS-1 region of the genus Tabata, the base sequence contains a plurality of bases common to the genus Tabata, and includes bases that can be distinguished from other fruits in the common bases Is identified. Here, a base distinguishable from other fruits is placed at the 3 ′ end of the primer.
アラインメントに用いる上記の複数の塩基配列のうち、公知の塩基配列としては、マタタビ属植物及びその他の果物のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域の塩基配列として知られているものであればいずれを用いてもよく、このような塩基配列はGenBank等のDNAデータベースを用いて検索し、入手することができる。また、データベースに塩基配列がないマタタビ属植物については、新たに塩基配列を分析することにより入手する。 Among the above-mentioned plurality of base sequences used for alignment, any known base sequence may be used as long as it is known as the base sequence of the ITS-1 region of the ribosomal RNA gene of the genus Tabata and other fruits. Such a base sequence can be obtained by searching using a DNA database such as GenBank. In addition, Matabia plants that do not have a base sequence in the database are obtained by newly analyzing the base sequence.
塩基配列の整列（アラインメント）には、インターネットで公開されているアラインメントソフト（例えば、CLUSTALW，URL：http：//www．ddbj．nig．ac．jp/）を利用することができる。 For alignment (alignment) of base sequences, alignment software (for example, CLUSTALW, URL: http://www.ddbj.nig.ac.jp/) published on the Internet can be used.
次に、特定した塩基配列に基づき、プライマーを設計する。プライマーの設計にあたっては、例えば「PCR法最前線−基礎技術から応用まで」（蛋白質・核酸・酵素 臨時増刊号1996年 共立出版株式会社）や「バイオ実験イラストレイテッド3本当に増えるPCR：細胞工学別紙 目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著1996年 株式会社秀潤社）、「PCRテクノロジー−DNA増幅の原理と応用−」（Henry A Erlich編、加藤邦之進 監修、宝酒造株式会社）等に基づいて設計すればよい。また、加工食品からの検出の場合には、DNAが分解して短くなっている可能性が考えられ、このような観点から100bp程度の増幅産物を得ることができるプライマーが高い感度を得ることができるという点から好ましい。 Next, a primer is designed based on the specified base sequence. For primer design, for example, “Forefront of PCR-From Basic Technology to Application” (Protein / Nucleic Acid / Enzyme Special Issue 1996 Kyoritsu Publishing Co., Ltd.) and “Bio-Experiment Illustrated 3 Really Increased PCR: Cell Engineering Attachment” Based on "Experimental note series to see" (Hiroki Nakayama 1996, Shujunsha Co., Ltd.), "PCR technology-Principle and application of DNA amplification" (Henry A Erlich edited by Kuniyuki Kato, Takara Shuzo Co., Ltd.) Design. In addition, in the case of detection from processed food, there is a possibility that DNA is degraded and shortened. From this viewpoint, a primer that can obtain an amplification product of about 100 bp can obtain high sensitivity. This is preferable because it can be performed.
プライマーとなるオリゴヌレクチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。 The oligonucleotide used as a primer can be synthesized by a method known in the art as an oligonucleotide synthesis method, for example, a phosphotriethyl method, a phosphodiester method, or the like, using a commonly used automatic DNA synthesizer. .
本発明のキウイ類検出用プライマーセットには、二通りある。第１のプライマーセットは、上記のようにして設計されたプライマーとなる一対のオリゴヌクレオチド、具体的には、配列番号１、２、又は３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド１種又は２種以上の混合物と、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される。但し、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成されるものは除く。 There are two types of primer sets for detecting kiwis of the present invention. The first primer set is a pair of oligonucleotides that serve as primers designed as described above, specifically, one or more oligonucleotides having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 And an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. However, those composed of the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 are excluded.
第２のプライマーセットは、配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される。 The second primer set is composed of an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
上記の各塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、該塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつキウイ類検出用プライマーとして機能しうる改変オリゴヌクレオチドであってもよい。 The oligonucleotide having each of the above base sequences is a modified oligo that has a base sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, inserted, or added in the base sequence and can function as a kiwi detection primer. It may be a nucleotide.
ここで、欠失等をする塩基の数は、改変オリゴヌクレオチドがそれぞれもとの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと実質的に同一の機能を有する限り特に限定されないが、通常、５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは１個である。 Here, the number of bases to be deleted and the like is not particularly limited as long as the modified oligonucleotide has substantially the same function as the oligonucleotide having the original base sequence, but usually 5 or less, preferably Three or less, more preferably one.
上記のキウイ類検出用プライマーセットとして、第1のプライマーセット（「プライマーセットＡ」という）は、マタタビを除くキウイ類を検出するのに使用される。また、第２のプライマーセット（「プライマーセットＢ」という）は、キウイ類全体を検出するのに使用することができる。従って、キウイフルーツ、サルナシ、シマサルナシを検出する場合はいずれのプライマーセットも使用することができる。一方、キウイ類全体を検出する必要がある場合は、プライマーセットＢを使用する。 As the above-mentioned primer set for detecting kiwis, the first primer set (referred to as “primer set A”) is used to detect kiwis excluding matabi. Further, the second primer set (referred to as “primer set B”) can be used to detect the entire kiwis. Therefore, any primer set can be used for detecting kiwifruit, saruna pear, and shimasaruna pear. On the other hand, when it is necessary to detect the whole kiwis, the primer set B is used.
上記のプライマーセットは各々キット化することもできる。本発明のキットは、上記プライマーセットを少なくとも含むものであればよく、必要に応じて、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬（プライマーセットを除く）、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。 Each of the above primer sets can also be made into a kit. The kit of the present invention only needs to contain at least the primer set described above, and if necessary, a DNA extraction reagent, a PCR reagent such as a PCR buffer or a DNA polymerase (excluding the primer set), a staining agent, It may contain a detection reagent such as an electrophoresis gel, instructions and the like.
本発明によればまた、上記のプライマーセットを用いたキウイ類の検出方法が提供される。本発明の方法によって検出可能なキウイ類は、前記のとおりである。本方法は、試料より抽出したDNAを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅産物の有無を検出することを特徴とする。 The present invention also provides a method for detecting kiwis using the above primer set. The kiwis detectable by the method of the present invention are as described above. This method is characterized in that DNA extracted from a sample is used as a template, PCR is performed using the above primer set, and the presence or absence of an amplification product obtained by the PCR is detected.
試料としては、キウイ類を含む可能性のある食品原料や製品、キウイ類が混入する可能性のある食品原料や製品であればよく、特に制限されない。本発明の方法により得られた検出結果は、食品のアレルギー表示に利用できるほか、生産者の意図していない製造ラインにおけるコンタミネーションの有無の確認に利用できる。 The sample is not particularly limited as long as it is a food raw material or product that may contain kiwis, or a food raw material or product that may contain kiwis. The detection result obtained by the method of the present invention can be used not only for food allergy labeling but also for confirming the presence or absence of contamination in the production line not intended by the producer.
試料からのDNAの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール/クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、などにより行うことができる。試薬メーカーより販売されている各種DNA抽出キットを用いても良い。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行う。 DNA extraction from a sample may be performed by any method known to those skilled in the art as a nucleic acid extraction method, for example, phenol / chloroform method, cell lysis with a surfactant, cell lysis with a protease enzyme, or physical with glass beads. It can be performed by a destruction method, a treatment method that repeats freeze-thaw, and the like. Various DNA extraction kits sold by reagent manufacturers may be used. Depending on the type of sample, filtration with a membrane filter or homogenization is performed.
PCRを行うには、プライマーセットとして上記のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、他の試薬、条件（温度条件、サイクルの回数等）は、当業者であれば適切に選択及び設定することができる。具体的には、鋳型DNA の変性、プライマーの鋳型へのアニーリング、及び耐熱性酵素（Taq ポリメラーゼやThermus thermophilis由来のTthDNAポリメラーゼなどのDNA ポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、ITS-1領域の特定の塩基配列を含む断片を増幅させる。上記のアニーリングの好適な条件として、60℃で、1.5mM程度のMgCl2を含むPCR反応液中で30秒間行うことが例示できるが、これは一例にすぎず、アニーリング温度、PCR反応液の組成、アニーリング時間は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。 For PCR, there is no particular limitation except that the above primer set is used as the primer set, and other reagents and conditions (temperature conditions, number of cycles, etc.) should be appropriately selected and set by those skilled in the art. Can do. Specifically, by repeating a cycle that includes denaturation of template DNA, annealing of the primer to the template, and primer extension reaction using a thermostable enzyme (DNA polymerase such as Taq polymerase or TthDNA polymerase from Thermus thermophilis). Amplify a fragment containing a specific base sequence of the ITS-1 region. As a preferable condition for the above annealing, it can be exemplified that it is performed in a PCR reaction solution containing about 1.5 mM MgCl 2 at 60 ° C. for 30 seconds, but this is only an example, and the annealing temperature and the composition of the PCR reaction solution are exemplified. The annealing time can be appropriately set according to the length of the oligonucleotide sequence serving as a primer, the base composition, and the like.
上記のプライマーセットのうち、「プライマーセットＡ」を用いてPCR増幅を行うと、試料にマタタビを除くキウイ類が含まれる場合に標的増幅産物が認められ、その他の果物では増幅産物が得られないか、得られるものの増幅産物の大きさが異なるため、それらとは区別して検出することができる。従って、マタタビを除くキウイ類に対する特異性は確保できる。 When PCR amplification is performed using “Primer Set A” among the above primer sets, target amplification products are observed when the sample contains kiwis other than matababi, and amplification products cannot be obtained with other fruits. However, since the size of the amplification product obtained is different, it can be detected separately. Therefore, the specificity with respect to kiwis except a matabi can be ensured.
また、「プライマーセットＢ」を用いてPCR増幅を行うと、試料にキウイ類が含まれる場合に標的増幅産物が認められ、その他の果物では増幅産物が得られないか、得られるものの増幅産物の大きさが異なるため、それらとは区別して検出することができる。また、キウイ類以外のマタタビ属植物もその他の果物とは区別して検出することができる。 In addition, when PCR amplification is performed using “Primer Set B”, a target amplification product is observed when the sample contains kiwis, and amplification products cannot be obtained with other fruits, or the amplification products obtained can be obtained. Since the sizes are different, they can be detected separately. In addition, Matabi species other than kiwi can be detected separately from other fruits.
PCRにより得られる増幅産物中に、目的の増幅断片が含まれるかどうかは、アガロースゲル電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやReal Time PCR等の公知の方法を用いて確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検出しようとするITS-1領域の塩基配列において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。例えば、前記の「プライマーセットＡ」を用いた場合には、目的とする増幅断片のサイズは約92bp、前記の「プライマーセットＢ」を用いた場合には、目的とする増幅断片のサイズは約74bpである。一般的な加工食品においては、加工工程でDNAが断片化している可能性が高いので、このようにPCR産物の長さが100bp程度であることは検出感度の低下を最小限に抑えられる点において有効である。 Whether or not the amplification product obtained by PCR contains the target amplification fragment can be confirmed by using a known method such as agarose gel electrophoresis, DNA hybridization or Real Time PCR. The size of the target amplified fragment is the number of bases in the region sandwiched between both primers in the base sequence of the ITS-1 region to be detected. For example, when the above “primer set A” is used, the size of the target amplified fragment is about 92 bp. When the above “primer set B” is used, the size of the target amplified fragment is about 74 bp. In general processed foods, there is a high possibility that DNA is fragmented in the processing process, so that the PCR product length of about 100 bp is that the decrease in detection sensitivity can be minimized. It is valid.
また、キウイ類の種類の同定が必要な場合は、PCR増幅産物（断片）の塩基配列を決定することによって行うことができる。 Moreover, when identification of the kind of kiwis is required, it can carry out by determining the base sequence of PCR amplification product (fragment).
具体的には、上記のPCR増幅産物（断片）をアガロース電気泳動等により精製し、バンドを切り出してDNAを抽出し、適当なベクターに挿入後、大腸菌等にクローニングして培養し、得られたDNA断片の塩基配列を決定する。配列の決定は、サンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって行うことができる。 Specifically, the PCR amplification product (fragment) described above was purified by agarose electrophoresis or the like, the band was cut out, DNA was extracted, inserted into an appropriate vector, cloned into E. coli, etc., and cultured. Determine the base sequence of the DNA fragment. The sequence can be determined by a general method such as the Sanger method or the Maxam-Gilbert method.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）キウイ類検出用プライマーの作製
(1) ITS（Internal Trascribed Spacer）-1領域のアラインメント
マタタビ属(Actinidia属)には、キウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)のほか、その近縁種であるサルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)、マタタビ(A. polygama)等が存在する。これらのうち、主に食用とされているのは、キウイフルーツとサルナシであり、キウイフルーツとサルナシの掛け合わせ品種もまた開発されている。また、シマサルナシは、キウイフルーツの近縁種であり、ジャム等で一部使用されているとの情報もある。従って、本実施例においては、主に食用とされ、掛け合わせによる品種改良が盛んなキウイフルーツとサルナシ、シマサルナシを少なくとも検出できるプライマーセットを設計することとした。
(Example 1) Preparation of primer for detecting kiwis
(1) Alignment of ITS (Internal Trascribed Spacer) -1 region In the genus Matabi (Actinidia), in addition to kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis), its related species, Sarnus (A. arguta) There are striped pears (A. rufa), matababi (A. polygama), etc. Of these, kiwifruit and sarnasi are mainly edible, and a hybrid varieties of kiwifruit and sarnash has also been developed. Moreover, there is information that shimasarnashi is a related species of kiwifruit and is partially used in jam and the like. Therefore, in this example, a primer set capable of detecting at least kiwifruit, sarnashi and shimasarnashi, which are mainly edible and actively improved by breeding, was designed.
プライマー設計のために、まず、キウイフルーツ、サルナシ、シマサルナシで調べられ、かつ分類学に用いられる遺伝子情報(rbcL、ITS、matK)をGenBankから取得した。また、近縁のマタタビ属植物、マタタビ科植物、その他の果物等についてもそれら配列情報を取得した。さらに、サンプルとして購入したキウイフルーツ(Hayward、Hort16A)、サルナシ（Issai）、サルナシ（Baby kiwi）、マタタビについてはシークエンスにより決定し、それらの情報も追加した。これらの配列情報を元に、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用い、同領域の配列をアラインメントし、比較することにより、プライマーを設計した。 For primer design, first, gene information (rbcL, ITS, matK), which was investigated in kiwifruit, sarnasi, shimasarnashi and used for taxonomy, was obtained from GenBank. In addition, the sequence information was also obtained for closely related plants of the genus Matabi, Matabidae, and other fruits. In addition, kiwifruit (Hayward, Hort16A), saruna (Issai), saruna (Baby kiwi), and matatabi, which were purchased as samples, were determined by sequencing and their information was also added. Based on these sequence information, primers were designed by aligning and comparing sequences in the same region using analysis software CLUSTAL X (1.8), FROG-Win, SEQ-09.
(2)プライマーの設計
以下の設計方法、設計基準に基づいてプライマーの設計、選択を行った。
(a) 検知対象としている種や属に共通で、かつ他の果物と区別可能な塩基を3’末端塩基とする。
(b) プライマーとテンプレートDNA配列との相同性が全体的に高く、特に3’側が高い配列とする。
(c) Tm値が60℃付近に設定できる領域を選択する。
(d) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこととする。
(e) PCR増幅産物が100bp程度とする。
(2) Primer design Primers were designed and selected based on the following design methods and design criteria.
(a) The base common to the species or genus to be detected and distinguishable from other fruits is the 3 ′ terminal base.
(b) The homology between the primer and the template DNA sequence is generally high, and the sequence is particularly high on the 3 ′ side.
(c) Select an area where the Tm value can be set around 60 ° C.
(d) Primers shall not form dimers or three-dimensional structures.
(e) The PCR amplification product should be about 100 bp.
rbcLでは、キウイ類をその他の果物と区別して検出することのできるプライマーセットは設計できなかった。matKでは、キウイ類をその他の果物と区別して検出すると予想されるプライマーセットを1組ずつ設計できたが、プライマーの3’末端塩基以外は、キウイ類とその他の果物の相同性が非常に高いことが明らかとなった。また、ITSでは、matKと比較して、属間の変異が多く、キウイ類とその他の果物とを区別しやすく、下記に示すプライマーセットＡ（配列番号１,２,３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチド）とプライマーセットＢ（配列番号５のオリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチド）を設計できた。プライマーセットＡについては、キウイフルーツ・サルナシのITS上におけるプライマー領域、殊にプライマー3’側領域の多様性に対応するため、配列番号１,２,３のMixプライマーを設計した。プライマーの合成は、通常のオリゴヌクレオチド合成法に従って、合成した。 rbcL could not design a primer set that could detect kiwis separately from other fruits. matK was able to design one set of primer sets that are expected to detect kiwis separately from other fruits, but the kiwis and other fruits have very high homology except the 3 'terminal base of the primer. It became clear. In addition, ITS has more genera variations than matK, making it easy to distinguish between kiwis and other fruits. Primer set A (the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 1, 2, and 3 and SEQ ID NO: 4) and primer set B (the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6) could be designed. For primer set A, a Mix primer of SEQ ID NOS: 1, 2 and 3 was designed in order to cope with the diversity of primer regions on the ITS of Kiwifruit and Sarnasi, especially the region on the primer 3 'side. The primer was synthesized according to a normal oligonucleotide synthesis method.
プライマーセットＡ(増幅産物92 bp)
F123: 5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3' (配列番号１）
: 5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3' (配列番号２）
: 5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3' (配列番号３）
R178: 5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3' (配列番号４）
プライマーセットＢ(増幅産物74 bp)
F151: 5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3' (配列番号５）
R182: 5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3' (配列番号６）
Primer set A (Amplification product 92 bp)
F123: 5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 1)
: 5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
: 5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 3)
R178: 5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3 '(SEQ ID NO: 4)
Primer set B (amplified product 74 bp)
F151: 5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
R182: 5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3 '(SEQ ID NO: 6)
(3) プライマーを用いたPCRシミュレーション
プライマーセットＡ（配列番号１,２,３のオリゴヌクレオチド混合物と配列番号４のオリゴヌクレオチド、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチド、配列番号２のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチド及び配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの４プライマーセット）、及びプライマーセットＢ（配列番号５のオリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチド）について、Amplify 1.0によるPCRシミュレーションを行い、キウイ類に特異的な増幅産物が得られるかどうかを確認した。塩基配列としてマタタビ属植物（キウイフルーツ、サルナシ、シマサルナシ、マタタビ等）、その他の果物及び穀物のITS配列を用いた。結果を下記表１および２に示す（表中、Accession No.：GenBankで取得したNo.、「H」：実際のシークエンスで得られた配列、Weight：増幅産物が得られる可能性の6段階評価(最大6、最小１)、「-」：増幅産物が得られないものを示す。）
(3) PCR simulation using primers Primer set A (the oligonucleotide mixture of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4, For the oligonucleotide and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 and the 4 primer set of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4) and primer set B (the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6), A PCR simulation using Amplify 1.0 was performed to confirm whether amplification products specific to kiwis could be obtained. As base sequences, ITS sequences of plants belonging to the genus Matabi (kiwifruit, sarunasi, shimasarunasi, matatabi, etc.), other fruits and grains were used. The results are shown in the following Tables 1 and 2 (in the table, Accession No .: No. obtained with GenBank, “H”: sequence obtained in actual sequence, Weight: 6-step evaluation of the possibility of obtaining an amplification product) (
上記のPCRシミュレーションの結果から明らかなように、配列番号１、２、又は３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの１種又は２種以上の混合物と配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるプライマーセットＡでは、配列番号１,２,３のオリゴヌクレオチド混合物と配列番号４のオリゴヌクレオチドのプライマーセット及び配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドのプライマーセットでキウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)、サルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)に増幅産物が得られることが予想され、その他の果物ではPCR産物の増幅は予想されなかった。また、配列番号２のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドのプライマーセットではほとんどのサルナシ(A. arguta) で増幅産物が得られることが予想されたが、一部で増幅産物が得られることが予想されなかった。また、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドのプライマーセットではキウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)とシマサルナシ(A. rufa)に増幅産物が得られることが予想されなかった。なお、表には記載していないが、プライマーセットＡのうち、配列番号３のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドのプライマーセット以外のプライマーセット、すなわち、配列番号１と配列番号４、配列番号１,２と配列番号４、配列番号１,３と配列番号４、配列番号２,３と配列番号４のプライマーセットでは、キウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)、サルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)に増幅産物が得られることが予想され、その他の果物ではPCR産物の増幅は予想されなかった。一方、プライマーセットＢでは、キウイフルーツ(A. deliciosa, A. chinensis)、サルナシ(A. arguta)、シマサルナシ(A. rufa)、マタタビ(A. polygama)を含むマタタビ属に増幅産物が予想され、その他の果物ではPCR産物の増幅は予想されなかった。 As is clear from the results of the PCR simulation, one or a mixture of two or more oligonucleotides having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 In the primer set A by the combination of the above, a mixture of the oligonucleotides of SEQ ID NO: 1, 2, 3 and the primer set of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 and the primer set of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 Amplification products were expected to be obtained for A. deliciosa, A. chinensis), A. arguta, and A. rufa, and amplification of PCR products was not expected for other fruits. In addition, it was expected that most of the A. arguta amplification products could be obtained with the oligonucleotide set of SEQ ID NO: 2 and the primer set of SEQ ID NO: 4, but some amplification products could be obtained. It was not expected. In addition, it was not expected that amplification products could be obtained in kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis) and simus pear (A. rufa) with the oligonucleotide set of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide set of SEQ ID NO: 4. In addition, although not described in the table, in the primer set A, a primer set other than the primer set of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4, ie, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1, 2 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOS: 1, 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOS: 2, 3 and SEQ ID NO: 4, in the primer set, kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis), monkey (A. arguta) Amplification products were expected to be obtained in A. rufa, and PCR products were not expected to be amplified in other fruits. On the other hand, in the primer set B, amplification products are expected in the genus Matabi, including Kiwifruit (A. deliciosa, A. chinensis), Sarnas (A. arguta), Shimasaruna (A. rufa), and Matabi (A. polygama). Amplification of PCR products was not expected for other fruits.
（実施例２）プライマーの特異性及び感度評価
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
キウイ類：キウイフルーツ(Hayward、Hort16A)（果肉）、サルナシ（Issai、Baby kiwi)（果肉）、マタタビ（果肉）
その他の果物類：アロエ（果肉）、パイナップル（果肉）、パパイヤ（果肉）、オレンジ（果肉）、ミカン（果肉）、メロン(果肉)、カキ(種)、イチジク(果肉)、リンゴ(種)、マンゴー(果肉)、バナナ(果肉)、アボカド(果肉)、アンズ(果肉)、サクランボ(葉)、ウメ(種)、モモ(果肉)、プルーン(果肉)、洋ナシ(種)、ラズベリー(果肉)、イチゴ、ブルーベリー（種）、ブドウ（種）
主要穀物：コメ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ
(Example 2) Specificity and sensitivity evaluation of primers
(1) Extraction of PCR template DNA
[sample]
Kiwi: Kiwi fruit (Hayward, Hort16A) (fruit), Sarnashi (Issai, Baby kiwi) (fruit), Matatabi (fruit)
Other fruits: aloe (fruit), pineapple (fruit), papaya (fruit), orange (fruit), mandarin (fruit), melon (fruit), oyster (seed), fig (fruit), apple (seed), Mango (fruit), banana (fruit), avocado (fruit), apricot (fruit), cherry (leaves), ume (seed), peach (fruit), prunes (fruit), pear (seed), raspberry (fruit) , Strawberry, blueberry (seed), grape (seed)
Main grains: rice, corn, wheat, soybean
[DNA抽出]
上記サンプルのうち、リンゴやモモなどの、加工品として使用する際に皮を剥くと考えられたものについては、皮を剥いで試験に用いた。また、イチゴ、ブルーベリーなどの、加工品として使用する際に皮を剥かないと考えられたものついてはそのまま試験に用いた。
[DNA extraction]
Among the samples, apples and peaches that were considered to be peeled when used as processed products were peeled off and used in the test. In addition, strawberry, blueberry, etc. that were considered not to be peeled when used as processed products were used in the test as they were.
約1gのサンプル及び3mm径のジルコニアビーズを2ml容チューブに入れ、Retsh MM 300(Retsh社製)を用いて組織片が肉眼で確認できなくなるまで適宜粉砕した。粉砕後のサンプル2gを50ml容チューブに入れ、20mlのバッファー G2（QIAGEN社製）、200μlのProteinase K（20mg／ml）（QIAGEN社製）、20μlのRNase A（100mg／ml）（QIAGEN社製）を添加して混合した後、50℃で2時間保温した。その後、約3,000×gで10分間遠心分離し、その上清液を得た。さらに上清液を2ml容チューブに入れ、約20,000×gで5分間遠心分離し、その上清液を得た。得られた上清液を、予め1mlのバッファー QBT（QIAGEN社製）で平衡化したGenomic-tip 20／G（QIAGEN社製）に供してDNAをカラムに吸着させた。その後、4mlのバッファーQC（QIAGEN社製）でカラムを洗浄し、予め50℃に加温した1mlのバッファーQF（QIAGEN社製）で溶出し、イソプロパノール沈澱により回収した沈澱物を20μlのバッファー TE(pH8.0)に溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。PCRの鋳型DNA試料には、バッファーTE(pH8.0)で20ng/μlに希釈したものを用いた。DNAの質は、厚生労働省からの通知法（アレルギー物質を含む食品の検査方法について：食安発第1011002号）で用いられている下記の植物検出用プライマー(CP03-5', CP03-3’)を用いて確認した。
CP03-5' ：5'-CGG ACG AGA ATA AAG ATA GAG T-3’（配列番号７）
CP03-3’：5'-TTT TGG GGA TAG AGG GAC TTG A-3’（配列番号８）
About 1 g of a sample and 3 mm-diameter zirconia beads were placed in a 2 ml tube, and appropriately pulverized using a Retsh MM 300 (manufactured by Retsh) until no tissue pieces could be confirmed with the naked eye. Place 2g of the crushed sample in a 50ml tube, 20ml of buffer G2 (QIAGEN), 200μl Proteinase K (20mg / ml) (QIAGEN), 20μl RNase A (100mg / ml) (QIAGEN) ) Was added and mixed, and then kept at 50 ° C. for 2 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at about 3,000 × g for 10 minutes to obtain the supernatant. Further, the supernatant was put into a 2 ml tube and centrifuged at about 20,000 × g for 5 minutes to obtain the supernatant. The obtained supernatant was subjected to Genomic-
CP03-5 ′: 5′-CGG ACG AGA ATA AAG ATA GAG T-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
CP03-3 ′: 5′-TTT TGG GGA TAG AGG GAC TTG A-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
(2) プライマーの特異性評価
上記のようにしてサンプルから抽出したDNAを、PCRのテンプレートとして各反応液（tubeあたり）のDNA量が50ngDNAになるように添加し、前記２組のプライマーセットＡ（配列番号１,２,３のオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号４のオリゴヌクレオチド）、及びプライマーセットＢ（配列番号５のオリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチド）を用いてPCR（アニーリング温度Ｔ：60℃、サイクル数Ｎ：40）を行った。
PCR反応は、AmpliTaqGold（Applied Biosystems社製）、0.2mlチューブ、GeneAmp PCR System2400,9600（PerkinElmer社製）を用い、下記表３に示す条件にて行った。
(2) Evaluation of primer specificity The DNA extracted from the sample as described above was added as a PCR template so that the amount of DNA in each reaction solution (per tube) was 50 ng DNA, and the above two sets of primer set A PCR (annealing temperature T: using a mixture of oligonucleotides of SEQ ID NO: 1, 2, 3 and oligonucleotide of SEQ ID NO: 4) and primer set B (oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 and oligonucleotide of SEQ ID NO: 6) 60 ° C., cycle number N: 40).
PCR reaction was performed using AmpliTaqGold (Applied Biosystems), 0.2 ml tube, GeneAmp PCR System 2400, 9600 (PerkinElmer) under the conditions shown in Table 3 below.
次に、PCR増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。
PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図１及び２に示す。プライマーセットＡでは、マタタビを除くキウイ類で約92bpの標的増幅産物が確認できたが、数種のその他の果物のサンプル（リンゴ、マンゴー、ミカン）で非標的増幅産物が見られた。しかしながら、標的増幅産物とはバンドの位置が異なるため、特異性は確保されると判断した(図１)。また、プライマーセットＢでは、キウイ類で約74bpの標的増幅産物が確認でき、その他のサンプル（その他の果物、穀物）について増幅産物は得られず、特異性が確認できた（図２)。
Next, PCR amplification products were separated by 2% agarose gel electrophoresis and detected.
An agarose gel electropherogram of the PCR amplification product is shown in FIGS. In primer set A, a target amplification product of about 92 bp was confirmed in kiwis except for matabi, but non-target amplification products were seen in several other fruit samples (apple, mango, mandarin orange). However, since the position of the band was different from the target amplification product, it was judged that the specificity was ensured (FIG. 1). In primer set B, a target amplification product of about 74 bp was confirmed for kiwis, and amplification products were not obtained for other samples (other fruits and grains), confirming specificity (FIG. 2).
(3) プライマーの感度評価
サンプルはキウイフルーツ(Hayward、Hort16A)、サルナシ(Issai)、サルナシ（Baby kiwi）、マタタビを用い、50〜500fg DNA/tubeを検出できるかどうかを指標にして評価した。上記と同様にしてサンプルから抽出・調製した20ng/μlDNAを5ng/μlサケ精子DNA緩衝液で段階希釈して、DNAテンプレートとし、前記２組のプライマーセットＡ（配列番号１,２,３のオリゴヌクレオチドの混合物と配列番号４のオリゴヌクレオチド）、及びプライマーセットＢ（配列番号５のオリゴヌクレオチドと配列番号６のオリゴヌクレオチド）を用いてPCRを行った。DNA量は1反応液 (25μl)あたり500pg、5pg、500fg、50fg、5fgに調製した。PCR反応は、前記表３と同じ条件で行った。
(3) Sensitivity evaluation of primer The sample was evaluated using Kiwifruit (Hayward, Hort16A), Sarnashi (Issai), Sarnashi (Baby kiwi), and Matabi as an index to determine whether 50 to 500 fg DNA / tube can be detected. 20 ng / μl DNA extracted and prepared from the sample in the same manner as above was serially diluted with 5 ng / μl salmon sperm DNA buffer to obtain a DNA template, and the two primer sets A (SEQ ID NOs: 1, 2, and 3) PCR was performed using a mixture of nucleotides and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4) and primer set B (the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6). The amount of DNA was adjusted to 500 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, and 5 fg per reaction solution (25 μl). The PCR reaction was performed under the same conditions as in Table 3 above.
PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図３及び４に示す。プライマーセットＡでは、キウイフルーツ(Hayward、Hort16A)、サルナシ(Issai)は50fg〜500fg、サルナシ(Baby kiwi)は500fg程度であった（図３）。 Agarose gel electropherograms of the PCR amplification products are shown in FIGS. In the primer set A, kiwifruit (Hayward, Hort16A), monkey (Issai) was about 50 fg to 500 fg, and monkey (Baby kiwi) was about 500 fg (FIG. 3).
一方、プライマーセットＢでは、キウイフルーツ(Hayward、Hort16A)、サルナシ(Issai)、マタタビに対しては50fg〜500fgの感度が得られたが、サルナシ(Baby kiwi)に対しては5pg DNAと劣り、改善の必要があった(図４)。 On the other hand, with primer set B, a sensitivity of 50 fg to 500 fg was obtained for kiwifruit (Hayward, Hort16A), monkey (Issai), and matabi, but it was inferior to 5 pg DNA for monkey (Baby kiwi). There was a need for improvement (Figure 4).
各プライマーセットで増幅した標的サイズ付近の産物は、シークエンス解析によって、標的としたITS-1領域であることを確認した。また、これら増幅産物をシークエンスし、塩基配列を確認することによって、キウイフルーツ、サルナシ、シマサルナシの判別を行うことが可能である。 The product near the target size amplified by each primer set was confirmed to be the targeted ITS-1 region by sequence analysis. In addition, it is possible to discriminate kiwifruit, saruna pear, and simus prunus by sequencing these amplification products and confirming the base sequence.
（実施例３）プライマーセットＢのアニーリング温度、サイクル数の検討
上記プライマーセットの内、プライマーセットＢについて、アニーリング温度(T)、サイクル数(N)を変更し、増幅条件を緩くすることによって感度が向上するかどうかを確認した。
(Example 3) Examination of annealing temperature and cycle number of primer set B For primer set B, the annealing temperature (T) and cycle number (N) of the primer set B were changed, and the sensitivity was reduced by loosening the amplification conditions. To see if it improves.
（1）アニーリング温度、サイクル数の変更
PCRのアニーリング温度(T)を60℃から58℃に、サイクル数(N)を40から50に変更する以外は、実施例２と同様のサンプル、反応条件にてPCRを行い、プライマーの特異性評価及び感度評価を行った。特異性評価試験結果を図５に、また、感度評価試験結果を図６に示す。本条件では、感度の最も悪かったサルナシ(Baby kiwi)に対して50fgの感度が得られた(図６)。また、特異性も確認できたが(図５)、アボカド、アロエ、メロンなどに非標的増幅産物が出現した。
(1) Change of annealing temperature and number of cycles
PCR was performed using the same sample and reaction conditions as in Example 2 except that the PCR annealing temperature (T) was changed from 60 ° C to 58 ° C and the cycle number (N) was changed from 40 to 50. Evaluation and sensitivity evaluation were performed. Specificity evaluation test results are shown in FIG. 5, and sensitivity evaluation test results are shown in FIG. Under this condition, a sensitivity of 50 fg was obtained for the baby kiwi having the lowest sensitivity (FIG. 6). Although specificity could be confirmed (FIG. 5), non-target amplification products appeared in avocado, aloe, melon and the like.
(2) サイクル数の変更
PCRのアニーリング温度(T)を60℃のままで、サイクル数(N)を40から50に変更にする以外は、実施例２と同様のサンプル、反応条件にてPCRを行い、プライマーの特異性評価及び感度評価を行った。特異性評価試験結果を図７に、また、感度評価試験結果を図８に示す。本条件では、感度が最も悪かったサルナシ(Baby kiwi)で50fgの感度が得られた(図８)。また、特異性も確認でき、しかも非標的増幅産物は減少した（図７）。再現性試験では、8回行った感度テストはすべてのサンプルで、8回とも50fgDNA/tubeが得られた。3回行った特異性については、同一抽出DNAを3回PCRに供したうち、1回でオレンジ、イチゴ、カキで非標的増幅産物が確認されたが、バンドの位置が異なるため、特異性はあると判断した。
(2) Changing the number of cycles
Perform PCR under the same sample and reaction conditions as in Example 2 except that the PCR annealing temperature (T) remains at 60 ° C and the cycle number (N) is changed from 40 to 50. Evaluation and sensitivity evaluation were performed. Specificity evaluation test results are shown in FIG. 7, and sensitivity evaluation test results are shown in FIG. Under this condition, a sensitivity of 50 fg was obtained for the baby pear (Baby kiwi) having the lowest sensitivity (FIG. 8). In addition, specificity could be confirmed, and non-target amplification products decreased (FIG. 7). In the reproducibility test, the sensitivity test performed 8 times gave 50 fgDNA / tube for all samples in all 8 samples. Regarding the specificity performed three times, non-target amplification products were confirmed in orange, strawberry and oyster in one out of the same extracted DNA subjected to PCR three times, but the specificity of the band is different, so the specificity is Judged that there was.
（実施例４）掛け合わせ品種に関するプライマーの感度評価
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
キウイフルーツ同士の掛け合わせ品種「さぬきゴールド」、サルナシとキウイフルーツの掛け合わせ品種「香粋」、「信山」の３種
[DNA抽出]
上記３種を使用すること以外は実施例２と同一の方法でDNAを抽出した。
(Example 4) Sensitivity evaluation of primers for crossed varieties
(1) Extraction of PCR template DNA
[sample]
Three kinds of varieties of “Sanuki Gold”, a combination of kiwifruits, “Kasuri”, and “Nobuyama”
[DNA extraction]
DNA was extracted by the same method as in Example 2 except that the above three types were used.
(2) プライマーの特異性評価
実施例２と同様の方法および条件でPCRを行った。次に、PCR増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図９及び図１０に示す。
プライマーセットＡでは、キウイフルーツと同様に前記各サンプルで約92dpの標的増幅産物が確認された（図９）。また、プライマーセットＢでは、キウイフルーツと同様に前記各サンプルで約74dpの標的増幅産物が確認された（図１０）。
(2) Evaluation of primer specificity PCR was performed in the same manner and under the same conditions as in Example 2. Next, PCR amplification products were separated by 2% agarose gel electrophoresis and detected. The agarose gel electropherograms of the PCR amplification products are shown in FIGS.
In primer set A, a target amplification product of about 92 dp was confirmed in each sample as in the case of kiwifruit (FIG. 9). In addition, in the primer set B, a target amplification product of about 74 dp was confirmed in each of the samples as in the kiwifruit (FIG. 10).
(3) プライマーの感度評価
前記サンプルに対し、50〜500fg DNA/tubeを検出できるかどうかを指標にして、実施例２と同様の方法でプライマーの感度評価を行った。その結果、プライマーセットＡでは、「香粋」、「さぬきゴールド」、「信山」共に50fg〜500fgであった（図９）。一方、プライマーセットＢでは、前記３種共に5fgの感度が得られた（図１０）。
(3) Evaluation of primer sensitivity The sensitivity of the primer was evaluated in the same manner as in Example 2 using whether or not 50 to 500 fg DNA / tube could be detected for the sample. As a result, in “Primer set A”, “Sanki”, “Sanuki gold”, and “Shinyama” were 50 fg to 500 fg (FIG. 9). On the other hand, with primer set B, a sensitivity of 5 fg was obtained for all three types (FIG. 10).
Claims (5)
5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3' (配列番号１）
5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3' (配列番号２）
5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3' (配列番号３）
5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3' (配列番号４) Kiwi excluding matababi, comprising one or a mixture of two or more oligonucleotides having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 below and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 A primer set for detection of a species (excluding those comprising an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4).
5'-CGGGTGTGCTCGTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-CGGGTGTGCTCGTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
5'-CGGGTGTGCTCGTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-CTTGTTCAAGTTCCTTGACGCG-3 '(SEQ ID NO: 4)
5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3' (配列番号５）
5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3' (配列番号６) A primer set for detecting kiwis, comprising an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
5'-GTGACACTCTCATTCCCCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-TTGCATTCTTGTTCAAGTTCCTTGA-3 '(SEQ ID NO: 6)
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