JP2011030567A - Dna identification method of paddy rice cultivar hikari shin-seiki of short culm koshihikari type - Google Patents
Dna identification method of paddy rice cultivar hikari shin-seiki of short culm koshihikari type Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011030567A JP2011030567A JP2010153970A JP2010153970A JP2011030567A JP 2011030567 A JP2011030567 A JP 2011030567A JP 2010153970 A JP2010153970 A JP 2010153970A JP 2010153970 A JP2010153970 A JP 2010153970A JP 2011030567 A JP2011030567 A JP 2011030567A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hikari
- base
- seq
- pcr
- koshihikari
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title description 28
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title description 27
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 30
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 30
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 9
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021329 brown rice Nutrition 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004226 microchip electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101100506686 Arabidopsis thaliana HSFA1B gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 101150017616 Hsf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100029154 Mus musculus Serpinf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101100071480 Oryza sativa subsp. japonica HSFA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、一塩基多型（single nucleotide polymorphism；ＳＮＰ）とマイクロサテライトマーカーに基づく、イネ品種のヒカリ新世紀の識別方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating new centuries of rice varieties based on single nucleotide polymorphism (SNP) and microsatellite markers.
良食味の品種「コシヒカリ」は、１９５６年に品種登録され、１９７９年以降作付け第１位となり、日本で最も消費需要が高い。しかし、コシヒカリは稈が長くて倒伏しやすいため、収穫を困難にして品質低下を招くことが問題であった。
本発明者は、短稈の在来種「十石」を利用してコシヒカリを短稈化した「ヒカリ新世紀」を開発し、２００４年に品種登録された（水稲品種第１２２７３号）。ヒカリ新世紀は、十石の半矮性遺伝子ｓｄ１を戻し交雑によってコシヒカリに導入したものと考えられている。
The good-tasting variety “Koshihikari” was registered in 1956 and became the No. 1 planting plant since 1979, and the demand for consumption is highest in Japan. However, since Koshihikari has a long cocoon and tends to fall, it has been a problem that it is difficult to harvest and deteriorates the quality.
The present inventor developed “Hikari New Century” in which Koshihikari was shortened by using the short varieties “Toshiishi” and was registered as a variety in 2004 (paddy rice variety No. 12273). Hikari New Century is thought to have introduced the ten stone semi-dwarfing gene sd1 into Koshihikari by backcrossing.
半矮性遺伝子ｓｄ１は、イネ（Oryza sativa L）のジベレリンＧＡ１の生合成系におけるＣ２０酸化酵素ＧＡ２０ｏｘ−２の欠損型遺伝子で、イネを短稈化する効果がある。非特許文献１〜３には、各種短稈品種におけるｓｄ１遺伝子の変異に関して、エキソン２における一塩基置換による一アミノ酸置換（Ｌｅｕ（２６６）→Ｐｈｅ；品種Ｃａｌｒｏｓｅ７６）、エキソン１−イントロン１−エキソン２に亘る３８３塩基対の欠失（停止コドンが生じる；品種Dee-Geo-Woo-Gen）、エキソン１における一塩基置換による一アミノ酸置換（Ｇｌｙ（９４）→Ｖａｌ；品種十石）が報告されている。 The semi-dwarfing gene sd1 is a defective gene of C20 oxidase GA20ox-2 in the biosynthetic system of gibberellin GA1 of rice (Oryza sativa L), and has the effect of shortening rice. In Non-Patent Documents 1 to 3, regarding mutations in the sd1 gene in various short varieties, single amino acid substitution (Leu (266) → Phe; variety Carrose 76), exon 1-intron 1-exon 2 in exon 2 383 base pair deletion (resulting in stop codon; breed Dee-Geo-Woo-Gen), single amino acid substitution (Gly (94) → Val; breed Toshi) in exon 1 has been reported Yes.
植物品種の鑑別には、簡易性および正確性の観点から、ＳＮＰよりもマイクロサテライトマーカーを利用することが、本願出願時における本技術分野の技術常識であった。
例えば、コシヒカリとの戻し交配を行ったｓｄ１を持つ品種、例えば、「コシヒカリつくばＳＤ１号」や「佐賀１号（ぴかいち）」であっても、マイクロサテライトマーカーによる識別が可能であった。
従って、十石ｓｄ１のＳＮＰが公知であるにもかかわらず、本願出願以前に、それをイネ品種識別に利用する動機づけは全くなく、また、本発明者の知る限りにおいて、本願出願以前に、十石ｓｄ１のＳＮＰをイネ品種識別に用いた報告はなかった。
In order to identify plant varieties, from the viewpoints of simplicity and accuracy, it was common technical knowledge in the present technical field to use a microsatellite marker rather than an SNP.
For example, even varieties having sd1 that have been backcrossed with Koshihikari, such as “Koshihikari Tsukuba SD1” and “Saga 1 (Pikaichi)”, could be identified by a microsatellite marker.
Therefore, despite the fact that the SNP of Toishi sd1 is known, there is no motivation to use it for rice variety identification prior to the filing of the present application. There was no report using the SNP of Togishi sd1 for rice variety identification.
本発明者は、ヒカリ新世紀の識別を目的として、常法に従って、５０種類以上の公知のマイクロサテライトマーカーを評価したが、驚くべきことに、すべてのマイクロサテライトマーカーについてコシヒカリと全く差異が見つからなかった。この結果は、コシヒカリとの戻し交配を行ったｓｄ１を持つ品種であっても、マイクロサテライトマーカーによる識別が可能であったことを考慮すると、本願出願時の本技術分野の当業者にとって、極めて予想外の事実であった。 The present inventor evaluated more than 50 kinds of known microsatellite markers in accordance with a conventional method for the purpose of identifying Hikari's new century. Surprisingly, no difference was found in all microsatellite markers from Koshihikari. It was. This result is highly expected for those skilled in the art at the time of filing this application, considering that even varieties having sd1 that had been backcrossed with Koshihikari could be identified by microsatellite markers. It was an outside fact.
このような状況下、本発明者は、ヒカリ新世紀が十石ｓｄ１を有すると考えられることに注目し、品種鑑別に一般的には利用されないことが常識となっているＳＮＰ法とマイクロサテライト法をあわせることにより、ヒカリ新世紀の識別が可能であることを見出した。
十石ｓｄ１がＳＮＰを有することが公知であったとしても、イネ品種の識別にＳＮＰを利用することは、先述のとおり、本願出願時の本技術分野の当業者にとって全く意外なアプローチであって、この発想自体は、ヒカリ新世紀の識別がマイクロサテライトマーカーではできないという、本発明者の新規な知見があって初めてもたらされたものである。
従って、本発明は、公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を正確に区別可能な識別方法を提供することにある。
Under such circumstances, the present inventor noticed that Hikari's new century has ten stones sd1, and the SNP method and the microsatellite method, which are not commonly used for differentiating varieties, are common sense. It was found that the new century can be identified by combining
Even if it is known that Toseki sd1 has SNP, using SNP to identify rice varieties is a completely unexpected approach for those skilled in the art at the time of filing this application, as described above. This idea itself was first brought about by the present inventor's new knowledge that the Hikari new century cannot be identified by a microsatellite marker.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide an identification method capable of accurately distinguishing Hikari New Century, which cannot be identified by a known microsatellite marker.
本発明は、
［１］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含むことを特徴とする、ヒカリ新世紀の識別方法、
［２］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及び／又は、マイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程が遺伝子増幅法を使用する、請求項１に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
［３］配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を、遺伝子増幅法を使用して同時に行う、請求項２に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
［４］前記マイクロサテライトマーカーとして、ＭＲＧ４６５３、ＭＲＧ６５４５、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＭＲＧ４９３１、ＲＭ２６４、ＲＭ１４４、ＲＭ７２、及びＲＭ６３３３からなる群から選んだ、少なくとも１つのマイクロサテライトマーカーを使用する、［１］〜［３］の識別方法、
［５］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド、
［６］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド、
［７］配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド
に関する。
The present invention
[1] A method for identifying Hikari New Century, comprising a step of determining the 281st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an analysis using a microsatellite marker,
[2] Hikari according to claim 1, wherein the step of determining the 281st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or the step of analyzing using a microsatellite marker uses a gene amplification method. New century identification method,
[3] The method according to claim 2, wherein the step of determining the 281st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the step of analyzing using a microsatellite marker are performed simultaneously using a gene amplification method. Hikari new century identification method,
[4] As the microsatellite marker, at least one microsatellite marker selected from the group consisting of MRG4653, MRG6545, RM153, RM253, MRG5375, MRG4931, RM264, RM144, RM72, and RM6333 is used. [3] identification method,
[5] A polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281 is t), a polynucleotide comprising 10 to 100 consecutive base sequences containing the 281 base, or a complementary base sequence thereof,
[6] In a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t), it consists of 10 to 100 consecutive base sequences, and the 3 ′ terminal base is t (the 281st t) Corresponding polynucleotide),
[7] In a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t), it consists of a complementary base sequence of 10 to 100 consecutive base sequences, and its 3 ′ terminal base is a ( Corresponding to the 281st t).
本発明によれば、公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を正確に識別することができる。 According to the present invention, it is possible to accurately identify Hikari New Century, which could not be identified with a known microsatellite marker.
本発明の識別方法では、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基を決定すると共に、マイクロサテライトマーカーを用いる解析を行うことにより、ヒカリ新世紀の識別を行う。配列番号１で表される塩基配列は、ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子（エキソン１〜エキソン３及びイントロン１〜イントロン２からなる）のエキソン１の塩基配列（２８１番目の塩基はｔ）である。ヒカリ新世紀のｓｄ１遺伝子は、その対立遺伝子である、イネのジベレリン（ＧＡ）２０−オキシダーゼ遺伝子（ＯｓＧＡ２０ｏｘ２）のエキソン１の塩基配列（配列番号２；Spielmeyer, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, vol. 99, no. 13, p. 9043-9048）において、２８０〜２８２番目の塩基配列ｇｇｇがｇｔｇに変異（一塩基置換）しており、その結果、９４番目のＧｌｙがＶａｌに変異（一アミノ酸置換）している。 In the identification method of the present invention, the 281st base in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is determined, and analysis using a microsatellite marker is performed to identify the new century of Hikari. The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of exon 1 (the 281st base is t) of the Hikari new century sd1 gene (consisting of exon 1 to exon 3 and intron 1 to intron 2). The Hikari New Century sd1 gene is exon 1 base sequence (SEQ ID NO: 2; Spielmeyer, W. et al., Proc. Natl.) Of its allele, the gibberellin (GA) 20-oxidase gene (OsGA20ox2) of rice. Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99, no. 13, p. 9043-9048), the base sequence ggg from 280 to 282 is mutated to gtg (single base substitution). Gly is mutated to Val (single amino acid substitution).
本発明の識別方法では、識別すべきイネ品種から核酸試料を調製し、それ自体公知の遺伝子分析方法を用いて、配列番号１で表される塩基配列（２８１番目の塩基はｔ）における２８１番目の塩基［あるいは、配列番号２で表される塩基配列（２８１番目の塩基はｇ）における２８１番目の塩基］を決定することにより、そのイネが十石ｓｄ１遺伝子を有する品種（例えば、ヒカリ新世紀、佐賀１号（ぴかいち））であるか、あるいは、それ以外の品種（例えば、コシヒカリ）であるかを判定する。本発明の識別方法では、後述するとおり、適当なマイクロサテライトマーカーを用いる解析により、識別すべきイネ品種がヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか否か（すなわち、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれであるか、あるいは、それら以外の品種であるか）を、予め決定することができる。以下、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを予め確認済みであることを前提として、本発明の識別方法におけるＳＮＰ分析工程を説明する。前記塩基がｔ（コードするアミノ酸はＶａｌ）であれば、ヒカリ新世紀と判定することができ、前記塩基がｇ（コードするアミノ酸はＧｌｙ）であれば、コシヒカリと判定することができる。なお、前記塩基がｇ及びｔ以外のアミノ酸である場合、すなわち、前記塩基がｃ（コードするアミノ酸は理論上、Ａｌａ）又はａ（コードするアミノ酸は理論上、ｇｌｕ）である場合には、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれでもないと判断することができる。 In the identification method of the present invention, a nucleic acid sample is prepared from the rice variety to be identified, and the 281st position in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st base is t) using a gene analysis method known per se. Of the rice [or the 281st base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (where the 281st base is g)], the rice varieties having the Togaishi sd1 gene (for example, Hikari New Century , Saga 1 (Pikaichi)) or other varieties (for example, Koshihikari). In the identification method of the present invention, as described later, whether or not the rice cultivar to be identified is Hikari New Century or Koshihikari by analysis using an appropriate microsatellite marker (that is, whether it is Hikari New Century or Koshihikari). Alternatively, it is possible to determine in advance whether it is a variety other than those. Hereinafter, the SNP analysis process in the identification method of the present invention will be described on the premise that it is confirmed in advance that it is Hikari New Century or Koshihikari. If the base is t (encoding amino acid is Val), it can be determined as Hikari New Century, and if the base is g (encoding amino acid is Gly), it can be determined as Koshihikari. When the base is an amino acid other than g and t, that is, when the base is c (the encoded amino acid is theoretically Ala) or a (the encoded amino acid is theoretically glu), It can be determined that it is neither a new century nor Koshihikari.
本発明で用いる核酸試料は、分析可能な核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）が含まれる限り、特に限定されるものではなく、イネから単離されるあらゆる細胞又は組織から調製することができる。例えば、種子、葉、根、茎、幼植物（シードリング）から調製することができ、前記種子としては、更に、籾、玄米、精米、米粉を挙げることができる。 The nucleic acid sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid (DNA, RNA, etc.) that can be analyzed, and can be prepared from any cell or tissue isolated from rice. For example, it can be prepared from seeds, leaves, roots, stems, seedlings (seed rings), and examples of the seeds include rice bran, brown rice, polished rice, and rice flour.
本発明で用いることのできる遺伝子分析方法としては、ＳＮＰの分析に用いる各種方法を挙げることができ、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）法、ハイブリダイゼーション法、ＡＳＰ（Allele Specific primer）−ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンス法などを挙げることができる。
また、ＰＣＲ法と同様な方法として、特異的に目的の遺伝子を増幅することができるものであれば、ＰＣＲ法の替わりに、既知の他の遺伝子増幅法も使用することができる。
Examples of gene analysis methods that can be used in the present invention include various methods used for SNP analysis. For example, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) method, hybridization method, ASP (Allele Specific primer)- Examples thereof include a PCR method and a direct sequence method.
Further, as a method similar to the PCR method, other known gene amplification methods can be used instead of the PCR method as long as the target gene can be specifically amplified.
前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、判定用のＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、前記ＳＮＰ部位を認識する制限酵素で消化反応を実施し、その反応産物を電気泳動することにより、各ＤＮＡ断片の大きさを解析する方法である。
具体的には、配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＰｍａＣＩ（認識部位＝ｃａｃ：ｇｔｇ）により切断する。
配列番号１で表される塩基配列の２７７〜２８２番目の塩基配列（またはその対応塩基配列）が、ヒカリ新世紀ではｃａｃｇｔｇであるのに対して、コシヒカリではｃａｃｇｇｇであるため、後述の実施例２に示すように、ヒカリ新世紀では２本のバンドが検出される（すなわち、制限酵素ＰｍａＣＩで切断される）のに対して、コシヒカリでは１本のバンドのみが検出される（すなわち、制限酵素ＰｍａＣＩで切断されない）。
In the PCR-RFLP method, PCR is performed using a primer set capable of amplifying a DNA fragment containing a SNP site for determination, a digestion reaction is performed with a restriction enzyme that recognizes the SNP site, and the reaction product is obtained. In this method, the size of each DNA fragment is analyzed by electrophoresis.
Specifically, after PCR was performed using a primer set capable of amplifying a DNA fragment containing the 281st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the restriction enzyme PmaCI (recognition site = cac: gtg) was used. Disconnect.
The 277-282nd base sequence (or the corresponding base sequence) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is cacgtg in Hikari New Century, whereas it is cacggg in Koshihikari. As shown in Fig. 2, two bands are detected in Hikari's new century (ie, cleaved with restriction enzyme PmaCI), whereas only one band is detected in Koshihikari (ie, restriction enzyme PmaCI). Is not cut in).
前記ハイブリダイゼーション法は、判定用のＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、品種識別用のプローブを使用してハイブリダイゼーションを実施し、プローブの結合の有無を解析する方法である。
具体的には、まず、配列番号１で表される塩基配列の２８１番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
ヒカリ新世紀を識別するプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００（好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０）の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。このプローブは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのセンス鎖の２８１番目の塩基がｔである場合に、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズするのに対して、前記塩基がｔ以外の塩基（特にｇ）である場合には、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズしない。従って、前記プローブを適当な手段で標識することにより、プローブのハイブリダイズの有無を容易に解析することができ、その結果に基づいて、ヒカリ新世紀であるか否かを判定することができる。
In the hybridization method, PCR is performed using a primer set capable of amplifying a DNA fragment containing a SNP site for determination, and then hybridization is performed using a probe for identifying a variety, and whether or not the probe is bound. Is a method of analyzing
Specifically, first, PCR is performed using a primer set capable of amplifying a DNA fragment containing the 281st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
As a probe for identifying Hikari New Century, 10 to 100 (preferably 15 to 50, more preferably 15 to 50) containing the 281st base in the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (281st is t) And a polynucleotide comprising a continuous base sequence of 20 to 30) or a complementary base sequence thereof. When the 281st base of the sense strand of the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is t, this probe hybridizes with a PCR amplification product using it as a template. When the base is a base other than t (particularly g), it does not hybridize with a PCR amplification product using it as a template. Therefore, by labeling the probe with an appropriate means, the presence or absence of hybridization of the probe can be easily analyzed, and based on the result, it can be determined whether or not it is the new century.
同様に、コシヒカリを識別するプローブとしては、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）［すなわち、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基ｔがｇに置換されていたこと以外は、配列番号１で表される塩基配列と同様の塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）］において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００（好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０）の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。このプローブは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのセンス鎖の２８１番目の塩基がｇである場合に、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズするのに対して、前記塩基がｇ以外の塩基（特にｔ）である場合には、それを鋳型とするＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズしない。従って、プローブのハイブリダイズの有無に基づいて、コシヒカリであるか否かを判定することができる。 Similarly, as a probe for identifying Koshihikari, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the 281st nucleotide is g) [that is, the 281st nucleotide t in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is g Except that the polynucleotide is a base sequence similar to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is g)], which contains 10 to 100 (preferably 15 to 50, more preferably 20-30), a polynucleotide comprising a continuous base sequence or a complementary base sequence thereof. This probe hybridizes with a PCR amplification product using the 281st base of the sense strand of the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a template, whereas g When the base is a base other than g (particularly t), it does not hybridize with a PCR amplification product using it as a template. Therefore, it can be determined whether or not Koshihikari is based on the presence or absence of hybridization of the probe.
前記ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、ＰＣＲプライマーセットの一方のプライマーとして、その３’末端塩基が判定用ＳＮＰ部位と相補的になるように設計されたプライマーを使用する方法である。ＰＣＲでは、プライマーの３’末端塩基が、鋳型となる塩基配列とミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が大幅に低下するが、それを利用した方法である。 The ASP-PCR method is a method in which a primer designed so that its 3 'terminal base is complementary to a SNP site for determination is used as one primer of a PCR primer set. In PCR, if the 3 'terminal base of a primer has a mismatch with the base sequence serving as a template, the efficiency of PCR is greatly reduced, but this is a method using this.
具体的には、ヒカリ新世紀で増幅産物が得られるプライマー（以下、ヒカリ新世紀用プライマーと称する）としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド（フォワードプライマー）、あるいは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド（リバースプライマー）を用いることができる。
一方、コシヒカリで増幅産物が得られるプライマー（以下、コシヒカリ用プライマーと称する）としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｇ（２８１番目のｇに対応）であるポリヌクレオチド（フォワードプライマー）、あるいは、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｇ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｃ（２８１番目のｇに対応）であるポリヌクレオチド（リバースプライマー）を用いることができる。
各プライマーの塩基長は、１０〜１００である限り、特に限定されるものではないが、好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜３０である。
Specifically, as a primer for obtaining an amplification product in Hikari New Century (hereinafter referred to as Hikari New Century Primer), for example, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t) A polynucleotide (forward primer) consisting of 10 to 100 consecutive base sequences and whose 3 ′ terminal base is t (corresponding to the 281st t), or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide (comprising a complementary base sequence of 10 to 100 consecutive base sequences) and having a 3 ′ terminal base a (corresponding to the 281st t) ( Reverse primer) can be used.
On the other hand, as a primer for obtaining an amplification product with Koshihikari (hereinafter referred to as a primer for Koshihikari), for example, a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the 281st is g), 10 to 100 consecutive A polynucleotide (forward primer) whose 3 ′ terminal base is g (corresponding to the 281st g), or a polynucleotide (281st nucleotide) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 G), a polynucleotide (reverse primer) consisting of a complementary base sequence of 10 to 100 consecutive base sequences and having a 3 ′ terminal base c (corresponding to the 281st g) is used. it can.
Although the base length of each primer is not specifically limited as long as it is 10-100, Preferably it is 15-50, More preferably, it is 20-30.
ＡＳＰ−ＰＣＲ法で用いることのできるこれらのプライマーとしては、例えば、以下の各種プライマーを挙げることができる。なお、各配列の下線で示す３’末端は、いずれも、配列番号１で表される塩基配列におけるＳＮＰ部位（２８１番目の塩基）に対応する塩基であることを意味する。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマーＳＤ１ＪＦ（配列番号８）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｃｇｔ−３
ヒカリ新世紀用リバースプライマーＳＤ１ＪＲ（配列番号９）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａａｃａ−３
コシヒカリ用フォワードプライマー（配列番号１０）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｃｇｇ−３
コシヒカリ用リバースプライマー（配列番号１１）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａａｃｃ−３
Examples of these primers that can be used in the ASP-PCR method include the following various primers. In addition, all 3 'terminal shown by the underline of each arrangement | sequence means that it is a base corresponding to the SNP site | part (281st base) in the base sequence represented by sequence number 1.
Hikari New Century Forward Primer SD1JF (SEQ ID NO: 8):
5-ccgcgtgcgccacgcacg t -3
Hikari new century reverse primer SD1JR (SEQ ID NO: 9):
5-cggacacctggagaacac a- 3
Forward primer for Koshihikari (SEQ ID NO: 10):
5-ccgcgtgcgccacgcacg g -3
Reverse primer for Koshihikari (SEQ ID NO: 11):
5-cggacacctggagaacac c- 3
ヒカリ新世紀用フォワードプライマー又はコシヒカリ用フォワードプライマーを用いる場合には、同時に、判定用ＳＮＰ部位から下流の領域を増幅可能なリバースプライマー、例えば、図１に示すリバースプライマーＲ１〜Ｒ５を使用してＰＣＲを実施する。一方、ヒカリ新世紀用リバースプライマー又はコシヒカリ用リバースプライマーを用いる場合には、同時に、判定用ＳＮＰ部位から上流の領域を増幅可能なフォワードプライマー、例えば、図１に示すフォワードプライマーＦ１〜Ｆ４を同時に使用してＰＣＲを実施する。 When using Hikari New Century Forward Primer or Koshihikari Forward Primer, PCR is performed simultaneously using reverse primers capable of amplifying a region downstream from the SNP site for determination, for example, reverse primers R1 to R5 shown in FIG. To implement. On the other hand, when using a reverse primer for Hikari New Century or a reverse primer for Koshihikari, simultaneously use forward primers that can amplify an upstream region from the SNP site for determination, for example, forward primers F1 to F4 shown in FIG. And perform PCR.
ヒカリ新世紀用プライマーを用いてＰＣＲを実施すると、識別する品種がヒカリ新世紀である場合には、前記プライマーの３’末端塩基と鋳型ＤＮＡの判定用ＳＮＰ部位とが塩基対を形成できるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られるが、識別する品種がコシヒカリである場合には、ミスマッチであるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られない。
一方、コシヒカリ用プライマーを用いてＰＣＲを実施すると、識別する品種がコシヒカリである場合には、前記プライマーの３’末端塩基と鋳型ＤＮＡの判定用ＳＮＰ部位とが塩基対を形成できるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られるが、識別する品種がヒカリ新世紀である場合には、ミスマッチであるため、ＰＣＲによる増幅産物が得られない。
この場合のＰＣＲ条件は、プライマー配列の３’末端の特異性に依存する方法であるので、一般的な条件で実施することができる。また、検出方法も、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認できれば良いため、簡易な検出手段、例えば、３％アガロースゲル電気泳動により充分に検出することができる。
例えば、実施例に示すように、ヒカリ新世紀が有するＳＮＰを判定するためには、フォワードプライマーＦ３（ＳＤ１Ｆ３）及びヒカリ新世紀用リバースプライマー（ＳＤ１ＪＲ）を使用すると、高感度かつ高精度に検出することができるので好ましく、更に、これらのプライマーは、他のマイクロサテライトマーカーを検出するためのマーカーと共存させて行うＰＣＲ（マルチプレックスＰＣＲ）にも使用できるので非常に有用である。
When PCR is performed using the primer for Hikari New Century, when the identified variety is Hikari New Century, the 3 ′ terminal base of the primer and the SNP site for determination of the template DNA can form a base pair. An amplification product by PCR can be obtained, but when the cultivar to be identified is Koshihikari, there is a mismatch, and therefore an amplification product by PCR cannot be obtained.
On the other hand, when PCR is performed using a primer for Koshihikari, when the cultivar to be identified is Koshihikari, the 3 ′ end base of the primer and the SNP site for determination of the template DNA can form a base pair. An amplification product can be obtained. However, when the identified variety is Hikari New Century, there is a mismatch, and therefore no PCR amplification product can be obtained.
Since the PCR conditions in this case are methods that depend on the specificity of the 3 ′ end of the primer sequence, they can be performed under general conditions. Moreover, since the detection method should just confirm the presence or absence of a PCR amplification product, it can fully detect by a simple detection means, for example, 3% agarose gel electrophoresis.
For example, as shown in the examples, in order to determine the SNP of Hikari New Century, the forward primer F3 (SD1F3) and the reverse primer for Hikari New Century (SD1JR) are used to detect with high sensitivity and high accuracy. Furthermore, these primers are very useful because they can also be used in PCR (multiplex PCR) performed in the presence of markers for detecting other microsatellite markers.
また、ＡＳＰ−ＰＣＲ法では、プライマーの３’末端の塩基に加え、３’末端から３番目の塩基をミスマッチ塩基としておくことにより、よりミスマッチを鋭敏に感知できることが知られている［Theor Appl Genet (2004) 108:1212-1220］。この手法を利用したプライマーとしては、例えば、以下のプライマーを挙げることができる。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマー（配列番号１２）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｄｇｔ−３
ヒカリ新世紀用リバースプライマー（配列番号１３）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｂｃａ−３
コシヒカリ用フォワードプライマー（配列番号１４）：
５−ｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｃｇｃａｄｇｇ−３
コシヒカリ用リバースプライマー（配列番号１５）：
５−ｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｂｃｃ−３
（配列中、ｄは、ｃ以外の塩基、すなわち、ａ、ｇ、又はｔであり、ｂは、ａ以外の塩基、すなわち、ｇ、ｃ、又はｔである）
また、ＡＳＰ−ＰＣＲにて、ヒカリ新世紀が有するＳＮＰとそれに対応するコシヒカリが有する塩基を同時に検出する場合、上記のプライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲとに加え、コシヒカリ用リバースプライマーを改変して作製したＳＤ１ＮＲＭを組み合わせて使用することができる。前記ＳＤ１ＮＲＭは、コシヒカリ用リバースプライマーのｂをｃとし、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲで増幅される塩基配列と容易に見分けられるようにするため、その５’側に３塩基付加したものである。例えば、実施例５に示すように、これらのプライマーを使用してマルチプレックスＰＣＲが行え、簡便かつ正確に、十石型ＳＮＰと野生型配列を識別できるので好ましい。
ＳＤ１ＮＲＭ（配列番号５５）：
５−ｇｃｔｃｇｇａｃａｃｃｔｇｇａａｇａｃｃｃ−３
In addition, in the ASP-PCR method, it is known that the mismatch can be sensed more sensitively by setting the third base from the 3 ′ end as a mismatch base in addition to the 3 ′ end base of the primer [Theor Appl Genet (2004) 108: 1212-1220]. Examples of primers using this technique include the following primers.
Hikari New Century Forward Primer (SEQ ID NO: 12):
5-ccgcgtgcgccacgca d g t -3
Hikari new century reverse primer (SEQ ID NO: 13):
5-cggacacctggaaga b c a -3
Forward primer for Koshihikari (SEQ ID NO: 14):
5-ccgcgtgcgccacgca d g g -3
Reverse primer for Koshihikari (SEQ ID NO: 15):
5-cggacacctggagaga b c c -3
(In the sequence, d is a base other than c, that is, a, g, or t, and b is a base other than a, that is, g, c, or t).
In addition, when simultaneously detecting the SNP possessed by Hikari New Century and the corresponding base possessed by Koshihikari by ASP-PCR, in addition to the primers SD1F3 and SD1JR described above, SD1NRM produced by modifying the reverse primer for Koshihikari Can be used in combination. The SD1NRM is a reverse primer for Koshihikari where c is c and 3 bases are added to the 5 ′ side so that it can be easily distinguished from the base sequences amplified by SD1F3 and SD1JR. For example, as shown in Example 5, multiplex PCR can be performed using these primers, and it is preferable because it can easily and accurately discriminate between the Togaishi type SNP and the wild type sequence.
SD1NRM (SEQ ID NO: 55):
5-gctcggacacctggaaga c c c -3
前記ダイレクトシークエンス法では、判定用ＳＮＰ部位を含む塩基配列を実際にシークエンスすることにより、判定用ＳＮＰ部位がｔである（すなわち、ヒカリ新世紀である）か、ｇである（すなわち、コシヒカリである）かを分析し、品種を識別する。 In the direct sequencing method, by actually sequencing a base sequence including a determination SNP site, the determination SNP site is t (that is, Hikari New Century) or g (that is, Koshihikari). ) Analyze and identify varieties.
本発明の識別方法では、特定のＳＮＰとマイクロサテライトを分析することにより、これまで公知のマイクロサテライトマーカーでは区別できなかったヒカリ新世紀を識別することができる。なお、本発明においては、ＳＮＰ分析とマイクロサテライト分析を実施する順序は、特に限定されるものではなく、いずれを先に実施しても、あるいは、両者を同時に実施することができる。例えば、公知のマイクロサテライトマーカーを用いて、識別対象品種が、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか、あるいは、それ以外の品種であるかを決定し、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを確認した後に、ＳＮＰによる識別方法を用いることができる。あるいは、ＳＮＰ分析により、十石ｓｄ１を有する品種（ヒカリ新世紀を含む）であるか、それ以外の品種（コシヒカリを含む）であるかを決定した後、マイクロサテライト分析を用いてヒカリ新世紀であるか否かを識別することができる。また、ＳＮＰ分析とマイクロサテライト分析とを同時に実施する場合には、例えば、上記で示したマルチプレックスＰＣＲ法によって、ＳＮＰを解析するＡＳＰ−ＰＣＲとマイクロサテライトマーカーを用いたＰＣＲを同時に実施することができる According to the identification method of the present invention, by analyzing a specific SNP and a microsatellite, it is possible to identify Hikari's new century that could not be distinguished by a known microsatellite marker. In the present invention, the order in which the SNP analysis and the microsatellite analysis are performed is not particularly limited, and either can be performed first or both can be performed simultaneously. For example, after determining whether the cultivar to be identified is Hikari New Century or Koshihikari or other varieties using a known microsatellite marker, and confirming that it is Hikari New Century or Koshihikari The identification method by SNP can be used. Alternatively, it is determined by SNP analysis whether the varieties have Toseki sd1 (including Hikari New Century) or other varieties (including Koshihikari), and then the microsatellite analysis is used for Hikari New Century. Whether or not there is can be identified. In the case where the SNP analysis and the microsatellite analysis are simultaneously performed, for example, the ASP-PCR for analyzing the SNP and the PCR using the microsatellite marker may be simultaneously performed by the multiplex PCR method described above. it can
本発明で用いるマイクロサテライトマーカーとしては、コシヒカリの同定に使用可能なマイクロサテライトマーカー［例えば、ＲＧＰ（Rice Genome Research Program）データベース（http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/data/SSRAll）、Ｇｒａｍｅｎｅデータベース（http://www.gramene.org/markers/index.html）、特開２００４−６５２５１号公報］を用いることができ、その一例を表１に示す。
表１に示す品種は、コシヒカリを除けば、十石に由来する品種である。表１に示す各マイクロサテライトマーカー毎に使用したプライマーセットの塩基配列を以下に示す。なお、下線で示す配列ｇｔｇｔｃｔｔは、明瞭なバンド（ピーク）を得るために付加したテール配列である。また、付加するテール配列や使用するプライマーの標識の種類は、使用するマイクロサテライトマーカーの組み合わせやプライマーの組み合わせによって、適宜変更することができる。
ＭＲＧ４６５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号１６）：
５−ｔｇａｔｔｔｃｔｃｇｇａｃａａｇｃａｔｇａｔｃｔ−３
ＭＲＧ４６５３Ｒ（配列番号１７）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃｇａｇｃｔａｃｃａａｃｃｇａｔｇｃａｇａｔ−３
ＭＲＧ６５４５Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号１８）：
５−ｔｃｃｇｃｔｃｃｇｔｔｔｔｃａｔｃｃｃａａｔａｇ−３
ＭＲＧ６５４５Ｒ２（配列番号１９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃａｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｇｇｇｔｇｔａｇａａ−３
ＲＭ１５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号２０）：
５−ｇｃｃｔｃｇａｇｃａｔｃａｔｃａｔｃａｇ−３
ＲＭ１５３Ｒ１１（配列番号２１）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｇｃｃｇａａｃｔｃｇａｔｃａａｃｃｔｇｃａｃｔｔ−３
ＲＭ２５３Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号２２）：
５−ｔｃｃｔｔｃａａｇａｇｔｇｃａａａｃｃｔｔａａｔａｃ−３
ＲＭ２５３Ｒ（配列番号２３）：
５−ｇｃａｔｔｇｔｃａｔｇｔｃｇａａｇｃｃｇｔｔｃｔａｃ−３
ＭＲＧ５３７５Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２４）：
５−ｇａａｔｇｇａａｃｇａｃａａｇａｇａｔｇｃａｃｇｔ−３
ＭＲＧ５３７５Ｒ（配列番号２５）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｔｔｃｇｔａｔｃｃａｃｃｔｔｃｇｇｇ−３
ＭＲＧ４９３１Ｆ２（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２６）：
５−ａｃａａａａｇｃｇａａｇｇｇａｇｇｃｇｇｔｇ−３
ＭＲＧ４９３１Ｒ１（配列番号２７）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｇｇｔａａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｔｇｔｔｔｔａｇ−３
ＭＲＧ６２８８Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号２８）：
５−ａｃａａｇａｔａａｔａｇａｃａａｃａｔｇｔｃｔｃａａａｔａｃｔ−３
ＭＲＧ６２８８Ｒ（配列番号２９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔａｔｇｔｇｇｃａｇｔｔｔａａｇａｇｃｇｔｔｔｃ−３
ＲＭ２２３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３０）：
５−ｇａｇｔｇａｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇａａａｃ−３
ＲＭ２２３Ｒ（配列番号３１）：
５−ｇａａｇｇｃａａｇｔｃｔｔｇｇｃａｃｔｇ−３
ＲＭ２６４Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３２）：
５−ｇｔｔｇｃｇｔｃｃｔａｃｔｇｃｔａｃｔｔｃ−３
ＲＭ２６４Ｒ（配列番号３３）：
５−ｇａｔｃｃｇｔｇｔｃｇａｔｇａｔｔａｇｃ−３
ＲＭ１４４Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号３４）：
５−ｔｇｃｃｃｔｇｇｃｇｃａａａｔｔｔｇａｔｃｃ−３
ＲＭ１４４Ｒ２（配列番号３５）：
５−ｇａｃａｔｃａｔｃａｃｔｔｃｔｃｃｔｃｇａ−３
ＲＭ３３６Ｆ（配列番号３６）：
５−ｃｔｔａｃａｇａｇａａａｃｇｇｃａｔｃｇ−３
ＲＭ３３６Ｒ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号３７）：
５−ｇｃｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｃａｇｇｔｔｃｇ−３
ＭＲＧ６２３７Ｆ（ＴｅｘａｓＲｅｄ標識）（配列番号３８）：
５−ａｔｔｔｃｔａｇｃｃｃｃａｃａｇｃｇａａｃｇｔ−３
ＭＲＧ６２３７Ｒ（配列番号３９）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｇｃａｃ−３
ＲＭ３３３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４０）：
５−ｇａｔｃｇａｃｔａｃｇａｇｔｇｔｃａｃｃａａ−３
ＲＭ３３３Ｒ（配列番号４１）：
５−ｇｔｃｔｔｃｇｃｇａｔｃａｃｔｃｇｃ−３
ＲＭ７２Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４２）：
５−ｃｃｇｇｃｇａｔａａａａｃａａｔｇａｇ−３
ＲＭ７２Ｒ（配列番号４３）：
５−ｇｃａｔｃｇｇｔｃｃｔａａｃｔａａｇｇｇ−３
ＲＭ６３３３Ｆ（ＦＩＴＣ標識）（配列番号４４）：
５−ａｇａｇａａｇａｃａｃｇｇｔｇｇａｔｇｇ−３
ＲＭ６３３３Ｒ（配列番号４５）：
５−ｇｔｇｔｃｔｔｃａａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｔｃｇｃｔｃｃ−３
The microsatellite marker used in the present invention is a microsatellite marker that can be used for identification of Koshihikari [for example, RGP (Rice Genome Research Program) database (http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/data/ SSRAll), Graphene database (http://www.gramene.org/markers/index.html), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-65251], and an example thereof is shown in Table 1.
The varieties shown in Table 1 are varieties derived from ten stones, except for Koshihikari. The base sequences of the primer sets used for each microsatellite marker shown in Table 1 are shown below. The underlined array gtgtctt is a tail array added to obtain a clear band (peak). The tail sequence to be added and the type of primer label used can be appropriately changed depending on the combination of microsatellite markers used and the combination of primers.
MRG4653F (TexasRed label) (SEQ ID NO: 16):
5-tgattttctcggacaagcatgattct-3
MRG4653R (SEQ ID NO: 17):
5- gtgtctt cgagctaccaccaccatgcagat-3
MRG6545F (TexasRed label) (SEQ ID NO: 18):
5-tccgctccgtttttcatcccaatag-3
MRG6545R2 (SEQ ID NO: 19):
5- gtgtctt catgggggggggggggtgtagaa-3
RM153F (TexasRed label) (SEQ ID NO: 20):
5-gcctcgagcatcatcatcag-3
RM153R11 (SEQ ID NO: 21):
5- gtgtctt tgccgaactcgatcaactgcactt-3
RM253F (TexasRed label) (SEQ ID NO: 22):
5-tccttcaagaggtgcaaacttataacac-3
RM253R (SEQ ID NO: 23):
5-gcatttgtcatgtcgaagccgtttctac-3
MRG5375F (FITC label) (SEQ ID NO: 24):
5-gaatggaacgacagagagatgcacgt-3
MRG5375R (SEQ ID NO: 25):
5- gtgtctt gtgctttcgttatccaccttcggg-3
MRG4931F2 (FITC label) (SEQ ID NO: 26):
5-acaaaagcgaaggggggggtg-3
MRG4931R1 (SEQ ID NO: 27):
5- gtgtctt gggtatatatggggcggctgttttag-3
MRG6288F (FITC label) (SEQ ID NO: 28):
5-acaagagataatagacaactatgtctcaaaatact-3
MRG6288R (SEQ ID NO: 29):
5- gtgtctt tatgtggcagtttagaggcgtttc-3
RM223F (FITC label) (SEQ ID NO: 30):
5-gagtgagctttggggctgaac-3
RM223R (SEQ ID NO: 31):
5-gaagcacagtctttggcactg-3
RM264F (FITC label) (SEQ ID NO: 32):
5-gtttgcgtcctactgctacttc-3
RM264R (SEQ ID NO: 33):
5-gatccgtgtcgatgatacc-3
RM144F (FITC label) (SEQ ID NO: 34):
5-tgcccctggcgcaatattgatcc-3
RM144R2 (SEQ ID NO: 35):
5-gacatcatcattctcctctga-3
RM336F (SEQ ID NO: 36):
5-ctttagagaagaacggcatcg-3
RM336R (TexasRed label) (SEQ ID NO: 37):
5-gctgggtttgtttcaggttcg-3
MRG6237F (TexasRed label) (SEQ ID NO: 38):
5-attttagtagccccacagcgaacgt-3
MRG6237R (SEQ ID NO: 39):
5- gtgtctttttctattgctgtttcggttttgcac -3
RM333F (FITC label) (SEQ ID NO: 40):
5-gatsgactacgagtgtcaccaa-3
RM333R (SEQ ID NO: 41):
5-gtctttcgcgatactactgc-3
RM72F (FITC label) (SEQ ID NO: 42):
5-ccggcgataataacaatgag-3
RM72R (SEQ ID NO: 43):
5-gcatcgggtcctaactagggg-3
RM6333F (FITC label) (SEQ ID NO: 44):
5-agagaagacacgggtggatgg-3
RM6333R (SEQ ID NO: 45):
5- gtgtctt caaactcctcatttcgctcc-3
これらのプライマーセットを用いた場合に増幅されるＤＮＡ断片の塩基長に応じて複数のクラスに分類することができ、その結果（例えば、ミナミヒカリであれば、クラスＡ〜Ｆ）を表１に示す。
また、表１に本発明の判定用ＳＮＰ部位による、十石型のｓｄ１遺伝子型（Ｊ）と野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型（Ｎ）判定クラスを示す。
When these primer sets are used, the DNA fragments can be classified into a plurality of classes according to the base lengths of DNA fragments to be amplified. The results (for example, Minamihikari, classes A to F) are shown in Table 1. Show.
In addition, Table 1 shows the Judgment-type sd1 genotype (J) and wild-type GA20ox-2 genotype (N) determination classes according to the determination SNP site of the present invention.
表１に示す入手機関欄の記号（１）〜（７）は、以下のとおりである：
（１）農業生物資源研究所
（２）九州沖縄農業研究センター
（３）佐賀農業試験研究センター
（４）高知県農業技術センター
（５）（株）植物ゲノムセンター
（６）兵庫県農業試験場
（７）鳥取大学
（８）鹿児島農業開発センター
（９）鹿児島農業試験場
The symbols (1) to (7) in the obtaining agency column shown in Table 1 are as follows:
(1) National Institute for Agrobiological Resources (2) Kyushu Okinawa Agricultural Research Center (3) Saga Agricultural Research Center (4) Kochi Prefectural Agricultural Technology Center (5) Plant Genome Center (6) Hyogo Prefectural Agricultural Experiment Station (7 ) Tottori University (8) Kagoshima Agricultural Development Center (9) Kagoshima Agricultural Experiment Station
表１から明らかなように、ヒカリ新世紀及びコシヒカリを同定するためには、表１に示す全てのマイクロサテライトマーカーを使用する必要はなく、例えば、表１に示す組合せ１〜１０のいずれかの組合せ中のマイクロサテライトマーカー、すなわち、ＭＲＧ４６５３、ＭＲＧ６５４５、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＭＲＧ４９３１、ＲＭ２６４、ＲＭ１４４、ＲＭ７２、ＲＭ６３３３の少なくとも一つ以上を使用することにより、ヒカリ新世紀及びコシヒカリと他の品種とを識別（すなわち、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれか一方であるか、あるいは、ヒカリ新世紀及びコシヒカリ以外の品種であるかを決定）することができる。識別すべき品種にあわせて、使用するマイクロサテライトマーカーの種類や数を変更することもできるし、１７０種類を超える品種（具体的には、後述の表２に示す１８８品種）全てと識別するためには、表１に示す組合せ１〜１０のいずれかの組合せを使用することもできる。なお、表１は、十石由来の各品種とヒカリ新世紀及びコシヒカリとが識別可能であることを示しているが、前記組合せは、１８８種類の品種からヒカリ新世紀及びコシヒカリを識別することができる。 As is clear from Table 1, it is not necessary to use all the microsatellite markers shown in Table 1 to identify Hikari New Century and Koshihikari. For example, any one of the combinations 1 to 10 shown in Table 1 By using at least one of the microsatellite markers in the combination, that is, MRG4653, MRG6545, RM153, RM253, MRG5375, MRG4931, RM264, RM144, RM72, RM6333, the Hikari New Century and Koshihikari and other varieties It is possible to identify (ie, determine whether it is either Hikari New Century or Koshihikari or a variety other than Hikari New Century or Koshihikari). The type and number of microsatellite markers to be used can be changed in accordance with the type to be identified. In order to identify all types exceeding 170 types (specifically, 188 types shown in Table 2 described later). Any of the combinations 1 to 10 shown in Table 1 can be used. Table 1 shows that each varieties derived from Togoku can be identified from Hikari New Century and Koshihikari. However, the combination can identify Hikari New Century and Koshihikari from 188 types of varieties. it can.
本発明では、これらのマイクロサテライトマーカーに対応する各種プライマーセットを用いてＰＣＲを実施することにより、１７０種類を超える品種の中から、識別対象品種が、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであるか、あるいは、それ以外の品種であるかを決定することができ、ヒカリ新世紀又はコシヒカリであることを確認すると共に、判定用ＳＮＰ部位の分析を行うことにより、ヒカリ新世紀又はコシヒカリのいずれであるか、すなわち、ヒカリ新世紀であるか否かを決定することができる。 In the present invention, by performing PCR using various primer sets corresponding to these microsatellite markers, the identification target variety is Hikari New Century or Koshihikari among more than 170 types, or It is possible to determine whether it is a variety other than that, and confirming that it is Hikari New Century or Koshihikari, and by analyzing the SNP site for judgment, it is either Hikari New Century or Koshihikari, Whether it is Hikari new century, can be determined.
また、本発明では、マイクロサテライト解析用の前記の各種プライマーセットを用いるＰＣＲと、判定用ＳＮＰ部位を分析するＡＳＰ−ＰＣＲとを同時に実施することにより、一度の分析で、１７０種類を超える品種の中からヒカリ新世紀を識別することもできる。例えば、１８８種類の品種からヒカリ新世紀を識別するために使用可能なマイクロサテライトマーカーと十石由来のｓｄ１遺伝子型（ＳＤ１Ｊ）の組み合わせは、１８８種類の品種識別データベースを使用することによって、適宜選択することができる。具体的には、実施例４に示す、ＲＭ１５３、ＲＭ２２３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５３７５、ＳＤ１Ｊを検出するプライマーを使用して、ヒカリ新世紀を容易に識別することができる。また、実施例５に示すように、ＳＤ１Ｊが検出されなかった（すなわち、野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型である）品種が、本当に野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型を有するか否かを同時に検証するために、ＳＤ１Ｊ検出用プライマーに加え、野生型ＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子型を特異的に検出するプライマーをＡＳＰ−ＰＣＲで使用することで、ＳＤ１Ｊの判定精度を高めることができるので好ましい。 In the present invention, PCR using the various primer sets for microsatellite analysis and ASP-PCR for analyzing the SNP site for determination are performed at the same time. The Hikari new century can also be identified from the inside. For example, the combination of the microsatellite marker that can be used to identify Hikari New Century from 188 varieties and the sd1 genotype (SD1J) derived from Toseki is appropriately selected by using the 188 variety identification database can do. Specifically, using the primers for detecting RM153, RM223, RM253, MRG5375, and SD1J shown in Example 4, the Hikari new century can be easily identified. In addition, as shown in Example 5, in order to simultaneously verify whether or not varieties for which SD1J was not detected (that is, the wild type GA20ox-2 genotype) really have the wild type GA20ox-2 genotype. In addition, it is preferable to use a primer that specifically detects the wild type GA20ox-2 genotype in ASP-PCR in addition to the SD1J detection primer, because the accuracy of SD1J determination can be increased.
前記ハイブリダイゼーション法において先述した、ヒカリ新世紀を識別するプローブとして用いることのできる、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、２８１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド」は、それ自体、新規化合物である。
また、前記ＡＳＰ−ＰＣＲ法においてヒカリ新世紀用プライマーとして用いることのできる、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がｔ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド」や、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（２８１番目はｔ）において、１０〜１００の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その３’末端塩基がａ（２８１番目のｔに対応）であるポリヌクレオチド」も、それ自体、新規化合物である。
As described above in the hybridization method, it can be used as a probe for identifying Hikari New Century. “In the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281 is t), the 10th containing the base 281” The “polynucleotide comprising ˜100 consecutive base sequences or its complementary base sequence” is itself a novel compound.
In addition, it can be used as a primer for Hikari New Century in the ASP-PCR method, “from a continuous nucleotide sequence of 10 to 100 in a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t)” And the 3 ′ terminal base is t (corresponding to the 281st t) ”or“ the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t), A “polynucleotide comprising a complementary base sequence of 100 consecutive base sequences and whose 3′-end base is a (corresponding to the 281st t)” is also a novel compound.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《実施例１：ｓｄ１遺伝子（ヒカリ新世紀）及びＧＡ２０ｏｘ２遺伝子（コシヒカリ）の塩基配列決定》
本実施例では、ヒカリ新世紀及びコシヒカリの玄米から、それぞれ、ＤＮＡサンプルを調製し、ｓｄ１遺伝子（ヒカリ新世紀）及びＧＡ２０ｏｘ２遺伝子（コシヒカリ）のエキソン１の塩基配列を決定した。
配列決定のためのイネ品種としては、鳥取大学農学部から入手したヒカリ新世紀（８個体）と、独立行政法人農業生物資源研究所から入手したコシヒカリ（８個体）を使用した。
<< Example 1: Determination of nucleotide sequences of sd1 gene (Hikari New Century) and GA20ox2 gene (Koshihikari) >>
In this example, DNA samples were prepared from Hikari New Century and Koshihikari brown rice, respectively, and the base sequences of exon 1 of sd1 gene (Hikari New Century) and GA20ox2 gene (Koshihikari) were determined.
As rice varieties for sequencing, Hikari New Century (8 individuals) obtained from Tottori University Faculty of Agriculture and Koshihikari (8 individuals) obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences were used.
玄米を１粒ずつ１．５ｍＬチューブにいれ、ジルコニアビーズを４粒加え蓋をして、ミキサーミル［ＭＭ３００；レッチェ（Ｒｅｔｓｃｈ）社］を用いて２５Ｈｚ６分間振とうさせ、玄米を粉砕した。次いで、抽出バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｎａ，０．１％ＳＤＳ）９００μＬ、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン１００μＬ、プロテイナーゼＫ溶液５０μＬを加え、ローテーターで撹拌しながら５６℃で３時間加温した。これを、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行って、１．５ｍＬのマイクロチューブに上清を移し、更に、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心を行った。ここで得られた上清から、ＤＮＡ精製キット（Wizard Clean-Up system；プロメガ社）によって、イネのゲノムＤＮＡを調製した。 Brown rice was put into a 1.5 mL tube one by one, 4 zirconia beads were added, the lid was covered, and the mixture was shaken at 25 Hz for 6 minutes using a mixer mill [MM300; Retsch] to grind the brown rice. Next, 900 μL of extraction buffer (10 mmol / L Tris-HCL, 0.15 mol / L NaCl, 10 mmol / L EDTA-2Na, 0.1% SDS), 5 μL / 100 μL of guanidine hydrochloride, and 50 μL of proteinase K solution were added. The mixture was heated at 56 ° C. for 3 hours with stirring. This was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was transferred to a 1.5 mL microtube, and further centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes. From the resulting supernatant, rice genomic DNA was prepared by a DNA purification kit (Wizard Clean-Up system; Promega).
得られた各ＤＮＡサンプルについて、以下の手順で塩基配列を決定した。
まず、下記のフォワードプライマーＦ３とリバースプライマーＲ３、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社）、ＧＣバッファー（タカラバイオ社）を用いて、９４℃３０秒間、５８℃３０秒間、７２℃１分間からなるサイクルを３５サイクル実施して、エキソン１全領域を含む領域を増幅した（図１参照）。
フォワードプライマーＦ３（配列番号６）：
５−ｇｃｔｃｇｔｃｔｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔａｃａａａｔａｃｃｃｃ−３
リバースプライマーＲ３（配列番号５）：
５−ｇａｃｇｔｃｇｔｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇａｔｇｇｔｇａｇｇｇｃ−３
増幅したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社）に連結し、市販の反応液（ABI-Terminator Ready Mix；ＡＢＩ社）で塩基配列決定反応後、ＤＮＡシークエンサー（ABI-Prism；ＡＢＩ社）で解読した。
About each obtained DNA sample, the base sequence was determined in the following procedures.
First, using the following forward primer F3 and reverse primer R3, LA-Taq (Takara Bio), GC buffer (Takara Bio), a cycle consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute is performed. 35 cycles were performed to amplify the region including the entire exon 1 region (see FIG. 1).
Forward primer F3 (SEQ ID NO: 6):
5-gctcgtctttctcccctgtcaaaaatacccc-3
Reverse primer R3 (SEQ ID NO: 5):
5-gacgtcgtcctggagggaggatgggtgaggc-3
The amplified PCR product was ligated to a pGEM-T vector (Promega), subjected to a base sequencing reaction with a commercially available reaction solution (ABI-Terminator Ready Mix; ABI), and then a DNA sequencer (ABI-Prism; ABI). Deciphered.
その結果、いずれの個体からも、ヒカリ新世紀については、配列番号１で表される塩基配列（２８１番目はｔ）が得られた。また、コシヒカリについては、配列番号２で表される塩基配列、すなわち、配列番号１で表される塩基配列における２８１番目の塩基ｔがｇに置換されていたこと以外は、配列番号１で表される塩基配列と同様の塩基配列（２８１番目はｇ）が得られた。 As a result, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the 281st is t) was obtained from any individual for Hikari New Century. Koshihikari is represented by SEQ ID NO: 1 except that the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, that is, the 281st base t in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with g. A base sequence similar to the base sequence (g at 281) was obtained.
《実施例２：イネ品種の識別（１）》
本実施例では、実施例１で得られたＤＮＡサンプルを用いて、下記手順（ＰＣＲ、制限酵素処理、及び電気泳動）を実施することにより、ヒカリ新世紀とコシヒカリとを視覚的に明確に識別可能であることを確認した。
まず、下記に示す反応条件でＰＣＲを実施した。
反応液組成：
ＤＮＡ（１０ｎｇ） １ μＬ
２×ＧＣバッファーＩ（タカラバイオ社） ５ μＬ
プライマーＨＳＦ３（２．５μｍｏｌ／Ｌ） ０．１μＬ
プライマーＨＳＲ５（２．５μｍｏｌ／Ｌ） ０．１μＬ
ｄ−ＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ） １．６μＬ
Ｌａ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ） ０．１μＬ
水 ２．１μＬ
総量 １０ μＬ
ＰＣＲ反応条件：
９４℃ １分間
サイクル（３５サイクル）
９４℃ ３０秒間
６２℃ ３０秒間
７２℃ ３０秒間
７２℃ ２分間
フォワードプライマーＦ３（配列番号６）：
５−ｇｃｔｃｇｔｃｔｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔａｃａａａｔａｃｃｃｃ−３
リバースプライマーＲ５（配列番号７）:
５−ｃａｃｃａｔｃｇｔｔｔｔａａｔｔａｃｃｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇ−３
<< Example 2: Identification of rice varieties (1) >>
In this example, the following procedures (PCR, restriction enzyme treatment, and electrophoresis) were carried out using the DNA sample obtained in Example 1 to clearly distinguish Hikari New Century from Koshihikari. Confirmed that it was possible.
First, PCR was performed under the reaction conditions shown below.
Reaction solution composition:
DNA (10 ng) 1 μL
2 × GC buffer I (Takara Bio Inc.) 5 μL
Primer HSF3 (2.5 μmol / L) 0.1 μL
Primer HSR5 (2.5 μmol / L) 0.1 μL
d-NTP (2.5 mmol / L) 1.6 μL
La Taq (5U / μL) 0.1μL
2.1μL of water
Total volume 10 μL
PCR reaction conditions:
94 ° C 1 minute cycle (35 cycles)
94 ° C 30 seconds 62 ° C 30 seconds 72 ° C 30 seconds 72 ° C 2 minutes
Forward primer F3 (SEQ ID NO: 6):
5-gctcgtctttctcccctgtcaaaaatacccc-3
Reverse primer R5 (SEQ ID NO: 7):
5-caccatcgtttttattaccccattggccg-3
続いて、得られたＰＣＲ増幅産物を用いて、下記条件で制限酵素ＰｍａＣＩ（認識部位＝ｃａｃ：ｇｔｇ）による切断を実施した。
反応液組成：
ＰＣＲ増幅産物 １０μＬ
１０×バッファーＬ（タカラバイオ社） ２μＬ
ＰｍａＣＩ（１０Ｕ／μＬ） １μＬ
水 ７μＬ
総量 ２０μＬ
制限酵素反応条件：
３７℃ ９０分間
６５℃ ２分間
８℃ （電気泳動まで静置）
Subsequently, the obtained PCR amplification product was used to cleave with the restriction enzyme PmaCI (recognition site = cac: gtg) under the following conditions.
Reaction solution composition:
PCR amplification product 10μL
10 x Buffer L (Takara Bio) 2 μL
PmaCI (10U / μL) 1μL
7μL of water
Total volume 20μL
Restriction enzyme reaction conditions:
37 ° C 90 minutes 65 ° C 2 minutes 8 ° C (still until electrophoresis)
得られた各制限酵素処理物を、マイクロチップ電位泳動装置（MCE-202 MultiNA；島津製作所）を用いて電気泳動したところ、ヒカリ新世紀では２本のバンド（４１７ｂｐ、２９６ｂｐ）が検出されたのに対して、コシヒカリでは１本のバンド（７１３ｂｐ）のみが検出された。この泳動パターンは、配列番号１で表される塩基配列の２７７〜２８２番目の塩基配列（またはその対応塩基配列）が、コシヒカリではｃａｃｇｇｇであるのに対して、ヒカリ新世紀ではｃａｃｇｔｇであることと完全に一致した。
また、フォワードプライマーＦ３及びリバースプライマーＲ５の上記組合せ以外にも、図１に示す各種フォワードプライマーＦ１〜Ｆ４と、各種リバースプライマーＲ１〜Ｒ５との任意の組合せを用いて得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｍａＣＩで処理しても、同様の結果が得られた。なお、加工品など、含有する遺伝子が断片化されているようなサンプルの場合は、増幅領域が短い方が好ましく使用できる。
従って、識別すべきイネ品種から、実施例１の手順に従ってＤＮＡサンプルを調製し、続いて、実施例２の手順に従って、ＰＣＲ、制限酵素処理、及び電気泳動を実施することにより、上記サイズの一本のバンドが検出された場合にはコシヒカリと、上記サイズの２本のバンドが検出された場合にはヒカリ新世紀と識別することができる。
When each restriction enzyme treatment product obtained was electrophoresed using a microchip electrophoretic apparatus (MCE-202 MultiNA; Shimadzu Corporation), two bands (417 bp, 296 bp) were detected in the new century. On the other hand, only one band (713 bp) was detected in Koshihikari. This electrophoretic pattern shows that the 277-282nd nucleotide sequence (or the corresponding nucleotide sequence) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is cacggg in Koshihikari, whereas it is cacgtg in Hikari New Century. Matched perfectly.
In addition to the above combinations of forward primer F3 and reverse primer R5, PCR amplification products obtained using any combination of various forward primers F1 to F4 and various reverse primers R1 to R5 shown in FIG. 1 are limited. Similar results were obtained when treated with the enzyme PmaCI. In the case of a sample such as a processed product in which the contained gene is fragmented, a shorter amplification region can be preferably used.
Therefore, a DNA sample is prepared from the rice varieties to be identified according to the procedure of Example 1, followed by PCR, restriction enzyme treatment, and electrophoresis according to the procedure of Example 2. When a band is detected, it can be distinguished from Koshihikari, and when two bands of the above size are detected, it can be identified as Hikari New Century.
《実施例３：イネ品種の識別（２）》
（１）基準品のＤＮＡの抽出
表２に示す基準品種（１８８品種）の種子（玄米）を各１粒用意し、２ｍＬマイクロチューブにジルコニアビーズ５粒と共に入れ、振とう後、抽出バッファー（10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA-2Na, 0.1% SDS, 5mol/L NaCl 30 mL/L）９００μＬ、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン１００μＬ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液５０μＬを加えた。これをローテーターで撹拌しながら、５５℃で３時間加温した後、マイクロチューブ遠心機を用いて１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
分離後、新たな２ｍＬ容量のマイクロチューブに上清各５００μＬを移し取り、市販の核酸精製キット（Wizard DNA Cleanupsystem；プロメガ社製）を用いてＤＮＡの精製を行った。精製は，全てキットに収載のプロトコールに従って行い、個体ごとにＤＮＡ溶液を１．５ｍＬマイクロチューブに得た。コシヒカリ及びヒカリ新世紀については各４個体からＤＮＡを抽出した。
<< Example 3: Identification of rice varieties (2) >>
(1) Extraction of DNA of the reference product One seed (brown rice) of the reference varieties (188 varieties) shown in Table 2 was prepared, put together with 5 zirconia beads in a 2 mL microtube, shaken, and then extracted with an extraction buffer (10 (mmol / L Tris-HCl, 10 mmol / L EDTA-2Na, 0.1% SDS, 5 mol / L NaCl 30 mL / L) 900 μL, 5 mol / L guanidine hydrochloride 100 μL, 20 mg / mL proteinase K solution 50 μL were added. This was heated at 55 ° C. for 3 hours while stirring with a rotator, and then centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes using a microtube centrifuge.
After separation, 500 μL of each supernatant was transferred to a new 2 mL volume microtube, and DNA was purified using a commercially available nucleic acid purification kit (Wizard DNA Cleanupsystem; manufactured by Promega). All purification was performed according to the protocol included in the kit, and a DNA solution was obtained for each individual in a 1.5 mL microtube. For Koshihikari and Hikari New Century, DNA was extracted from each of four individuals.
得られた１８８品種のＤＮＡ溶液について、市販のＤＮＡ定量キット（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；Molecular Probes社製）を用いて濃度測定を行った。各品種のＤＮＡ溶液は、それぞれ２μＬを分取してＴＥバッファー（10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA）９８μＬと混合し、計１００μＬを濃度測定用サンプルとして９６穴マイクロプレートのウェルに分注した。サンプルのほかに、キットに添付のスタンダード溶液（２０００、２００、２０、２ｎｇ／ｍＬ）及びブランク（ＴＥ）についても、各１００μＬを測定に供した。各ウェルにキットに添付の試薬（PicoGreen Reagent）をＴＥバッファーで２００倍希釈したものを１００μＬずつ加え、撹拌後、室温で２〜５分間インキュベーションを行った。このプレートを蛍光プレートリーダーに供して測定を行い（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）、スタンダード溶液の測定結果から得られた検量線を用いて、各ＤＮＡ溶液の濃度を算出した。 The obtained 188 varieties of DNA solutions were subjected to concentration measurement using a commercially available DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit; manufactured by Molecular Probes). For each kind of DNA solution, 2 μL is dispensed and mixed with 98 μL of TE buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol / L EDTA), and a total of 100 μL is used as a sample for concentration measurement. Dispense into microplate wells. In addition to the sample, 100 μL each of the standard solution (2000, 200, 20, 2 ng / mL) and blank (TE) attached to the kit was used for the measurement. To each well, 100 μL of the reagent (PicoGreen Reagent) attached to the kit diluted 200-fold with TE buffer was added, stirred, and incubated at room temperature for 2 to 5 minutes. The plate was subjected to measurement using an fluorescence plate reader (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 530 nm), and the concentration of each DNA solution was calculated using a calibration curve obtained from the measurement results of the standard solution.
（２）イネ品種「十石」に由来するｓｄ１遺伝子型を特異的に検出するＡＳＰ−ＰＣＲ（Allele Specific Primer PCR）法の開発
実施例２で示したようなＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるＳＮＰの判定は、電気泳動の前に、ＰＣＲ工程および増幅産物の制限酵素処理工程が必要であり、操作が煩雑である。品種識別技術に適用するには、従来のマイクロサテライトマーカーと同様にＰＣＲ工程と電気泳動工程のみで判定できることが望ましい。さらに、適切なプライマーを作製することで、マイクロサテライトマーカーと同一反応系にて検出を行えるマルチプレックスＰＣＲが可能になる。特に、半矮性はイネ育種上重要な表現型であり、戻し交配の繰返しによる育種法が多く用いられ、その結果、育成品種と親品種の遺伝的背景が非常に似ており、従来のマイクロサテライトマーカーだけでは、品種識別が困難となることが予想されるため、表現型に直接関与する遺伝子の塩基配列を簡便に検出する技術が必要である。
(2) Development of ASP-PCR (Allele Specific Primer PCR) method for specifically detecting the sd1 genotype derived from the rice cultivar “Toseki” SNP determination by PCR-RFLP method as shown in Example 2 Prior to electrophoresis, a PCR step and a restriction enzyme treatment step for the amplification product are necessary, and the operation is complicated. In order to apply to the type identification technology, it is desirable that the determination can be made only by the PCR process and the electrophoresis process as in the conventional microsatellite marker. Furthermore, by preparing an appropriate primer, multiplex PCR that enables detection in the same reaction system as the microsatellite marker becomes possible. In particular, semi-fertility is an important phenotype in rice breeding, and the breeding method by repeated backcrossing is often used. As a result, the genetic background of the breed and the parent variety is very similar, and the conventional microsatellite Since it is expected that it will be difficult to discriminate varieties only with markers, a technique for simply detecting the base sequence of a gene directly involved in the phenotype is required.
そこで、前記（１）において得られたもののうち、「十石」由来の変異型ｓｄ１遺伝子型を有する「ヒカリ新世紀」と、それを有しない野生型の「コシヒカリ」のＤＮＡを用いて、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法の開発を実施した。図２は、野生型のＧＡ２０ｏｘ−２遺伝子エクソン１周辺の塩基配列を示したものである。十石では、エクソン１の開始点から２８１番目にＳＮＰがあり、Ｇ（グアニン）がＴ（チミン）に変異している（非特許文献３）。そこで、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的にＰＣＲ増幅産物を得るために、ＳＮＰが存在する箇所の塩基を３’末端とした塩基配列をプライマーとし、ＡＳＰ−ＰＣＲ法に適したプライマーの検討を実施した。検討に用いたプライマー配列を表３に、プライマー位置を図２に示す。プライマー名の最後がＭのものは、３’末端から３塩基目に変異を導入し、ＰＣＲ増幅の特異性の向上（Hayashi, K. et al., (2004) Theor. Appl. Genet., 108: 1212-1220）を図ったものである。 Therefore, among those obtained in the above (1), using the DNA of “Hikari New Century” having the mutant sd1 genotype derived from “Juishi” and the wild-type “Koshihikari” having no sd1 genotype, An ASP-PCR method for stone-derived sd1 genotype was developed. FIG. 2 shows the nucleotide sequence around exon 1 of the wild type GA20ox-2 gene. In Toishi, there is a SNP at the 281st position from the start point of exon 1, and G (guanine) is mutated to T (thymine) (Non-patent Document 3). Therefore, in order to obtain a PCR amplification product specific to the sd1 genotype derived from Toseki, a primer suitable for the ASP-PCR method was examined using a base sequence having the 3 'end as the base where the SNP exists. Carried out. The primer sequences used for the study are shown in Table 3, and the primer positions are shown in FIG. When the primer name ends with M, a mutation is introduced at the third base from the 3 ′ end to improve the specificity of PCR amplification (Hayashi, K. et al., (2004) Theor. Appl. Genet., 108 : 1212-1220).
ＰＣＲの反応は、サーマルサイクラーとしてＶｅｒｉｔｉ（ＡＢＩ社製）を使用し、２０μＬの反応液量で行った。反応液２０μＬは、１μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）、１ｕｎｉｔのFastStartTaq（キアゲン社製）、４μＬのＧＣ−Ｒｉｃｈソリューション、０．２μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、フォワードプライマーとリバースプライマーを各々０．２５μｍｏｌ／Ｌを含むよう調製した。ＰＣＲバッファー及びＧＣ−Ｒｉｃｈソリューションは、FastStartTaqに添付のものを用いた。ＰＣＲ温度条件は、９５℃で４分の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を１サイクルとし、これを４０サイクル繰返し、最後に７２℃を７分とした。ＰＣＲ増幅産物の検出は、マイクロチップ電気泳動装置（MultiNA；島津製作所製）を用い、専用キット（DNA-1000）を用いて、添付の取扱い説明書に収載の通り実施した。将来、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＰＣＲとマイクロサテライトマーカーとのマルチプレックスＰＣＲを視野に入れ、ＰＣＲ条件は、なるべく既存のＳＳＲマーカー増幅における最適条件で固定した。 The PCR reaction was performed using Veriti (manufactured by ABI) as a thermal cycler with a reaction volume of 20 μL. 20 μL of the reaction solution consists of 1 μL template DNA (10 ng / μL), 1 unit FastStartTaq (Qiagen), 4 μL GC-Rich solution, 0.2 μmol / L dNTP, 2 mmol / L MgCl 2 , forward primer and reverse Primers were prepared each containing 0.25 μmol / L. The PCR buffer and GC-Rich solution attached to FastStartTaq were used. PCR temperature conditions were 95 ° C for 4 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds for one cycle. This was repeated 40 cycles, and finally 72 ° C for 7 minutes. It was. PCR amplification products were detected using a microchip electrophoresis apparatus (MultiNA; manufactured by Shimadzu Corporation) using a dedicated kit (DNA-1000) as described in the attached instruction manual. In the future, multiplex PCR of sd1 genotype-specific PCR derived from Toseki and a microsatellite marker was considered, and the PCR conditions were fixed under the optimum conditions for amplification of existing SSR markers as much as possible.
検討したプライマー組み合わせは、フォワードプライマーＳＤ１ＪＦ及びＳＤ１ＪＦＭに対し、リバースプライマーＳＤ１Ｒ１及びＳＤ１Ｒ２及びＳＤ１Ｒ５の組み合わせ（６通り）、あるいは、リバースプライマーＳＤ１ＪＲ及びＳＤ１ＪＲＭに対し、ＳＤ１Ｆ２及びＳＤ１Ｆ３及びＳＤ１Ｆ４及びＳＤ１Ｆ５及びＳＤ１Ｆ６の組み合わせ（１０通り）の１６通りである。鋭意検討の結果、プライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲ、ＳＤ１Ｆ２とＳＤ１ＪＲ、およびＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲＭの組み合わせを用いることで十石由来ｓｄ１を特異的に検出することができた。その中でも特にＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲでは強いシグナルで十石由来ｓｄ１特異的な増幅産物が得られ、この組合せでＰＣＲを実施することで、十石タイプのｓｄ１遺伝子型を検出できることが明らかとなった（図３）。 The primer combinations examined were the forward primers SD1JF and SD1JFM with the reverse primers SD1R1 and SD1R2 and SD1R5 (six combinations), or the reverse primers SD1JR and SD1JRM with the combinations of SD1F2, SD1F3, SD1F4, SD1F5 and SD1F6 ( 16 ways (10 ways). As a result of intensive studies, Toseki-derived sd1 could be specifically detected by using a combination of primers SD1F3 and SD1JR, SD1F2 and SD1JR, and SD1F3 and SD1JRM. Among them, in particular, SD1F3 and SD1JR obtained a sd1-specific amplification product derived from Togoku with a strong signal, and it was revealed that the Togoku type sd1 genotype can be detected by performing PCR with this combination (Fig. 3).
（３）十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＰＣＲの検証実験
前記（２）にて構築した、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法について、ヒカリ新世紀及びコシヒカリを含む１８８品種について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による結果との相関を確認した。その結果、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、十石由来のｓｄ１遺伝子型を示したのは、「ニシホマレ」「はなさつま」「ヒカリ新世紀」「ミナミヒカリ」「レイホウ」「サイワイモチ」「ヒヨクモチ」「彩南月」「ユメヒカリ」「夢はやと」であり、十石由来のｓｄ１遺伝子型特異的ＡＳＰ−ＰＣＲ法でも全く同一の結果が得られた。図４に、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とＡＳＰ−ＰＣＲ法の検出例を示す。これらのことから、プライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲを用いたＡＳＰ−ＰＣＲによって十石由来のｓｄ１遺伝子型を正確に検出できることが明らかになった。
(3) Verification experiment of sd1 genotype-specific PCR derived from Toseki About the ASP-PCR method for sd1 genotype derived from Toseki constructed in (2) above, about 188 varieties including Hikari New Century and Koshihikari, The correlation with the result by PCR-RFLP method was confirmed. As a result, the sd1 genotype derived from Togoku by the PCR-RFLP method is “Nishihomare” “Hanasatsuma” “Hikari New Century” “Minamihikari” “Reihou” “Saiwaimochi” “Hiyokomochi” Nantsuki, Yumehikari, and Yume-Hayato, and exactly the same results were obtained by the sd1 genotype-specific ASP-PCR method derived from Togoku. FIG. 4 shows detection examples of the PCR-RFLP method and the ASP-PCR method. From these facts, it was revealed that the sd1 genotype derived from Toishi could be accurately detected by ASP-PCR using the primers SD1F3 and SD1JR.
また、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）を用いて検出を行う場合は、プライマーＳＤ１ＪＲの５’末端を蛍光色素で標識することで実施することができる。図５は、５’末端を蛍光色素ＶＩＣで標識したプライマーＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲを用いて、コシヒカリ及びヒカリ新世紀各４個体から抽出したＤＮＡを用いたＡＳＰ−ＰＣＲ法の検出結果を示したものである。マイクロチップ電気泳動装置MultiNAによる非標識プライマーを用いたときと同様、十石由来のｓｄ１遺伝子型を持つヒカリ新世紀でのみ特異的に増幅産物が得られた。 Further, when detection is performed using a 3730 DNA analyzer (manufactured by ABI), it can be carried out by labeling the 5 'end of the primer SD1JR with a fluorescent dye. FIG. 5 shows the detection results of the ASP-PCR method using DNA extracted from 4 individuals of Koshihikari and Hikari New Century each using the primers SD1F3 and SD1JR labeled at the 5 ′ end with a fluorescent dye VIC. . As in the case of using the unlabeled primer by the microchip electrophoresis apparatus MultiNA, the amplification product was obtained specifically only in Hikari New Century with the sd1 genotype derived from Toseki.
《実施例４：イネの品種識別（３）》
ＡＳＰ−ＰＣＲとＳＳＲ−ＰＣＲのマルチプレックスＰＣＲによる品種識別
前記の実施例のように、簡便に両品種を区別することが可能になった。さらに、従来のマイクロサテライトマーカーによる識別法を組み合わせることにより、多くの品種から、ヒカリ新世紀を同定することができる。例えば、１８８品種に対して、特開２００４−６５２５１号公報に記載のようにマイクロサテライトマーカーのデータベースを作成し、前記で構築されたＡＳＰ−ＰＣＲ法で得られた遺伝子型（十石型ｓｄ１あるいは野生型ＳＤ１）から成るデータベースを組み合わせて使用すれば、ヒカリ新世紀とコシヒカリを加えた１８８品種が同定可能になる。そこで、さらに検査工程の簡便化を考慮し、十石由来ｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲとＳＳＲマーカーを組み合わせたマルチプレックスＰＣＲの検討を実施した。
Example 4: Rice Variety Identification (3)
Variety identification by multiplex PCR of ASP-PCR and SSR-PCR As in the above-described example, it is possible to easily distinguish both varieties. Furthermore, Hikari New Century can be identified from many varieties by combining conventional identification methods using microsatellite markers. For example, a database of microsatellite markers is created for 188 varieties as described in JP-A-2004-65251, and the genotype (togoku type sd1 or sd1 or If a database consisting of wild-type SD1) is used in combination, 188 varieties including Hikari New Century and Koshihikari can be identified. Therefore, in consideration of simplification of the inspection process, multiplex PCR combining ASP-PCR and SSR markers for sd1 genotype derived from Toseki was studied.
ＰＣＲの反応は、サーマルサイクラーとしてＶｅｒｉｔｉ（ＡＢＩ社製）を使用し、２０μＬの反応液量で行った。反応液２０μＬは、１μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）、１ｕｎｉｔのFastStartTaq（キアゲン社製）、０．２μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、プライマーとして、ＲＭ１５３Ｆ（配列番号２０）、ＲＭ１５３Ｒ１１（配列番号２１）、ＲＭ２２３Ｆ（配列番号３０）、ＲＭ２２３Ｒ（配列番号３１）、ＲＭ２５３Ｆ（配列番号２２）、ＲＭ２５３Ｒ（配列番号２３）、ＭＲＧ５３７５Ｆ（配列番号２４）、ＭＲＧ５３７５Ｒ（配列番号２５）、ＳＤ１Ｆ３、ＳＤ１ＪＲを各々０．２５μｍｏｌ／Ｌを含むよう調製した。ＰＣＲバッファー及びＧＣ−Ｒｉｃｈソリューションは、FastStartTaq（キアゲン社製）に添付のものを用いた。プライマーは、ＲＭ１５３Ｆ及びＲＭ２２３Ｆは蛍光色素ＮＥＤ（ＡＢＩ社製）で、ＲＭ２２３Ｆ及びＭＲＧ５３７５Ｆは蛍光色素ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）で、ＳＤ１ＪＲは蛍光色素ＶＩＣ（ＡＢＩ社製）で、それぞれ、５’末端を標識した。ＰＣＲ温度条件は、９５℃で４分の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を１サイクルとし、これを４０サイクル繰返し、最後に７２℃を７分とした。次に、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）を用いて検出を実施した。ＲＭ１５３ＦとＲＭ１５３ＲによってＲＭ１５３を検出し、ＲＭ２２３ＦとＲＭ２２３ＲによってＲＭ２２３を検出し、ＲＭ２５３ＦとＲＭ２５３ＲによってＲＭ２５３を検出し、ＭＲＧ５３７５ＦとＭＲＧ５３７５ＲとによってＭＲＧ５３７５を検出し、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＪＲによって十石由来のｓｄ１遺伝子型（ＳＤ１Ｊ）を検出した。その結果、５種類の座位について増幅産物が得られ、これらの品種において、使用したマイクロサテライトマーカーの有無や十石由来のｓｄ１遺伝子型の判定が可能であった（図６）。本５種類のマーカーを用いて、1８８品種識別用データベースを用いることで、表２の１８８品種の中からヒカリ新世紀を同定することができた。 The PCR reaction was performed using Veriti (manufactured by ABI) as a thermal cycler with a reaction volume of 20 μL. 20 μL of the reaction solution consists of 1 μL template DNA (10 ng / μL), 1 unit FastStartTaq (Qiagen), 0.2 μmol / L dNTP, 2 mmol / L MgCl 2 , RM153F (SEQ ID NO: 20), RM153R11 as primers. (SEQ ID NO: 21), RM223F (SEQ ID NO: 30), RM223R (SEQ ID NO: 31), RM253F (SEQ ID NO: 22), RM253R (SEQ ID NO: 23), MRG5375F (SEQ ID NO: 24), MRG5375R (SEQ ID NO: 25), SD1F3, SD1JR was prepared to contain 0.25 μmol / L each. The PCR buffer and GC-Rich solution attached to FastStartTaq (Qiagen) were used. RM153F and RM223F are fluorescent dyes NED (manufactured by ABI), RM223F and MRG5375F are fluorescent dyes FAM (manufactured by ABI), and SD1JR is a fluorescent dye VIC (manufactured by ABI). did. PCR temperature conditions were 95 ° C for 4 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds for one cycle. This was repeated 40 cycles, and finally 72 ° C for 7 minutes. It was. Next, detection was performed using a 3730 DNA analyzer (manufactured by ABI). RM153 is detected by RM153F and RM153R, RM223 is detected by RM223F and RM223R, RM253 is detected by RM253F and RM253R, MRG5375 is detected by MRG5375F and MRG5375R, and SD1F3 and SD1JR ) Was detected. As a result, amplification products were obtained for five types of loci, and in these varieties, it was possible to determine the presence or absence of the microsatellite marker used and the sd1 genotype derived from Toseki (FIG. 6). By using a database for identifying 188 varieties using these five types of markers, it was possible to identify Hikari's new century among 188 varieties in Table 2.
《実施例５：イネの品種識別（４）》
十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法の精度向上
前記のように、プライマーＳＤ１ＪＲとＳＤ１Ｆ３を用いることで、十石由来のｓｄ１遺伝子型に関するＡＳＰ−ＰＣＲ法を開発した。本発明を用いた遺伝子型の判定は、増幅産物の有無により実施される。つまりＡＳＰ−ＰＣＲは優性マーカーである。優性マーカーを、検査に実用化する場合、一般的に検査精度の維持が難しい。例えば、ＡＳＰ−ＰＣＲで増幅産物が得られなかった場合、その原因としては、ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡが十石由来ｓｄ１遺伝子型では無い場合の他にも、テクニカルエラーなどによりＰＣＲ増幅が正常に行われなかった場合も想定される。そこで、本ＡＳＰ−ＰＣＲ法によるマーカーを共優性様にする、つまり十石由来ｓｄ１遺伝子型では無い場合にも区別できる増幅産物が得られるように改良することを試みた。
Example 5 Rice Variety Identification (4)
As described above, the ASP-PCR method for the sd1 genotype derived from Togoku was developed by using the primers SD1JR and SD1F3. The genotype determination using the present invention is performed based on the presence or absence of an amplification product. In other words, ASP-PCR is a dominant marker. When a dominant marker is put into practical use for inspection, it is generally difficult to maintain inspection accuracy. For example, when an amplification product is not obtained by ASP-PCR, the cause is that PCR amplification is not normal due to a technical error in addition to the case where the DNA used as a PCR template is not the Toseki-derived sd1 genotype. It is also assumed that this was not done. Therefore, an attempt was made to improve the ASP-PCR method so that a marker is codominant, that is, an amplification product that can be distinguished even when it is not the sd1 genotype derived from Toseki.
十石では、図２の５１６番目（ＧＡ２０ｏｘ−２エクソン１の開始点から２８１番目）の塩基がＧ（グアニン）からＴ（チミン）に変異している。前記のように、本塩基がＴであることを検出するＡＳＰ−ＰＣＲ法を作製している。よって、共優性様のマーカーにするためには、同時に５１６番目のＧを検出する検出系を構築する必要がある。まず、プライマーとして、ＳＤ１Ｆ３、ＳＤ１ＮＲ、ＳＤ１ＮＲＭ（表４）を用い、実施例３の（２）に記載の通りの条件で検討を実施した。ＳＤ１ＮＲおよびＳＤ１ＮＲＭは、その５’末端をＦＡＭにて標識して、さらにＳＤ１ＮＲおよびＳＤ１ＮＲＭはＳＤ１ＪＲよりも５’側に３ｂｐ長くし、蛍光の種類および電気泳動での移動度の差異で区別できるように設計した。ＰＣＲ産物の検出は、3730 DNA analyzer（ＡＢＩ社製）にて実施した。鋭意検討の結果、ＳＤ１Ｆ３とＳＤ１ＮＲＭのプライマーを用いた場合、５１６番目がＧである遺伝子型を特異的に増幅することが明らかになった（図７）。 In Toishi, the 516th base (the 281th position from the start of GA20ox-2 exon 1) in FIG. 2 is mutated from G (guanine) to T (thymine). As described above, the ASP-PCR method for detecting that the base is T is prepared. Therefore, in order to make a codominant-like marker, it is necessary to construct a detection system for detecting the 516th G at the same time. First, SD1F3, SD1NR, and SD1NRM (Table 4) were used as primers, and examination was performed under the conditions described in (2) of Example 3. SD1NR and SD1NRM are labeled with FAM at the 5 ′ end, and further SD1NR and SD1NRM are 3 bp longer than SD1JR to be distinguishable by the difference in fluorescence type and mobility in electrophoresis. Designed. The PCR product was detected with a 3730 DNA analyzer (ABI). As a result of intensive studies, it was revealed that when the SD1F3 and SD1NRM primers were used, the 516th genotype was specifically amplified (FIG. 7).
次に、プライマーＳＤＦ３、十石由来遺伝子型（５１６番目がＴ）特異的プライマーＳＤ１ＪＲ（ＶＩＣで標識）、および５１６番目がＧ特異的プライマーＳＤ１ＮＲＭ（ＦＡＭで標識）を同時にＰＣＲ反応液に加え、実施例３の（２）に記載の条件でＰＣＲを実施した。その結果、図８で示したとおり、十石タイプのｓｄ１を持つヒカリ新世紀とヒヨクモチではＶＩＣで標識された増幅産物（黒塗りピーク）が検出され、それ以外ではＦＡＭで標識された増幅産物（白抜きピーク）が検出された。「にこまる」とヒカリ新世紀は、異なるタイプの半矮性遺伝子型（Dee-geo-woo-gen）由来のｓｄ１を有している。図２に示したとおり、それらは、５３２番目から３８３ｂｐの欠失がある（非特許文献３、あるいは、Wolfgang et al., (2002) PNAS, 25, Vol. 99, No. 13, 9043-9048）。したがって、プライマーＳＤＮＲＭの５‘末端の４ｂｐは相補的ではない。しかしながら、野生型と同様に、ＳＤ１ＮＲＭによって増幅産物が得られることが明らかになった（図８）。品種によって、増幅産物に１ｂｐから３ｂｐの差異があった、これは、増幅領域内のＳＳＲに多型がある（M. Tomita, (2009) Field Crops Research, Vol. 114, No. 2, 10 November 2009, 173-181）ことが原因であると思われる、しかしながら、波形ピークの蛍光の種類をみることでどちらのリバースプライマー由来の増幅産物であるかは明確であり、本法により、５１６番目の塩基がＴであるものとＧであるものが効率的かつ高精度にて検出できる。さらに、本法に関しても、ＳＳＲマーカーとのマルチプレックスＰＣＲが可能であり、ヒカリ新世紀の効率的かつ正確な同定法として用いることができる。 Next, a primer SDF3, a genotype derived from Toishi (516th is T) specific primer SD1JR (labeled with VIC), and a 516th G-specific primer SD1NRM (labeled with FAM) were simultaneously added to the PCR reaction solution, and then performed. PCR was performed under the conditions described in Example 3, (2). As a result, as shown in FIG. 8, amplification products labeled with VIC (black peaks) were detected in Hikari New Century and Hiyokumochi with Toseki type sd1, and amplification products labeled with FAM (black peaks) otherwise ( A white peak) was detected. “Nikomaru” and Hikari New Century have sd1 derived from different types of semi-dwarf genotypes (Dee-geo-woo-gen). As shown in FIG. 2, they have a deletion of 532 to 383 bp (Non-Patent Document 3 or Wolfgang et al., (2002) PNAS, 25, Vol. 99, No. 13, 9043-9048 ). Therefore, 4 bp at the 5 'end of primer SDNRM is not complementary. However, as with the wild type, it was revealed that an amplified product was obtained by SD1 NRM (FIG. 8). Depending on the cultivar, there was a difference of 1 to 3 bp in the amplification product. This is a polymorphism in the SSR within the amplification region (M. Tomita, (2009) Field Crops Research, Vol. 114, No. 2, 10 November 2009, 173-181) seems to be the cause, however, it is clear from the reverse primer-derived amplification product by looking at the fluorescence type of the waveform peak. A base having T and G can be detected efficiently and with high accuracy. Furthermore, multiplex PCR with SSR markers is also possible with this method, and can be used as an efficient and accurate identification method for Hikari New Century.
本発明は、イネの品種鑑別に利用することができる。 The present invention can be used for rice variety identification.
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号４〜５５の配列で表される各塩基配列は、プライマー配列である。 The numerical heading <223> in the sequence listing below describes the “Artificial Sequence”. Each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 4 to 55 is a primer sequence.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010153970A JP5750672B2 (en) | 2009-07-06 | 2010-07-06 | A short-term Koshihikari-type paddy rice cultivar Hikari |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009160119 | 2009-07-06 | ||
| JP2009160119 | 2009-07-06 | ||
| JP2010153970A JP5750672B2 (en) | 2009-07-06 | 2010-07-06 | A short-term Koshihikari-type paddy rice cultivar Hikari |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011030567A true JP2011030567A (en) | 2011-02-17 |
| JP5750672B2 JP5750672B2 (en) | 2015-07-22 |
Family
ID=43760261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010153970A Active JP5750672B2 (en) | 2009-07-06 | 2010-07-06 | A short-term Koshihikari-type paddy rice cultivar Hikari |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5750672B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016002005A (en) * | 2014-06-13 | 2016-01-12 | 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 | Purity detection method of strawberry f1 seeds by using crude extraction liquid of dna of strawberry seeds |
| CN115181740A (en) * | 2022-07-05 | 2022-10-14 | 北京擎科生物科技有限公司 | Lysate, PCR reaction kit and method |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004065251A (en) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | Method for discriminating rice plant cultivar using microsatellite marker |
| JP2004248635A (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | National Agriculture & Bio-Oriented Research Organization | Development of method for judging single nucleotide polymorphism of rice genom and application to discrimination of rice species |
| JP2008035781A (en) * | 2006-08-07 | 2008-02-21 | Tomy Digital Biology Co Ltd | Homozygous haplotype method |
| JP2008048730A (en) * | 2006-07-25 | 2008-03-06 | Tokai Univ | Eating disorder-related gene and method for judging risk of eating disorder crisis |
| JP2008125390A (en) * | 2006-11-17 | 2008-06-05 | Saitama Medical Univ | Method for extracting homoeologous domain by reverse homozygosty mapping method and method for screening gene |
| JP2009022217A (en) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Plant Genome Center Co Ltd | Method for producing rice of early maturing heading date |
| JP2009100653A (en) * | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | Polynucleotide containing single nucleotide polymorphism (snp), snp marker used for discriminating species of rice and comprising the polynucleotide, and method for discriminating species of rice by the snp analysis |
-
2010
- 2010-07-06 JP JP2010153970A patent/JP5750672B2/en active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004065251A (en) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | Method for discriminating rice plant cultivar using microsatellite marker |
| JP2004248635A (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | National Agriculture & Bio-Oriented Research Organization | Development of method for judging single nucleotide polymorphism of rice genom and application to discrimination of rice species |
| JP2008048730A (en) * | 2006-07-25 | 2008-03-06 | Tokai Univ | Eating disorder-related gene and method for judging risk of eating disorder crisis |
| JP2008035781A (en) * | 2006-08-07 | 2008-02-21 | Tomy Digital Biology Co Ltd | Homozygous haplotype method |
| JP2008125390A (en) * | 2006-11-17 | 2008-06-05 | Saitama Medical Univ | Method for extracting homoeologous domain by reverse homozygosty mapping method and method for screening gene |
| JP2009022217A (en) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Plant Genome Center Co Ltd | Method for producing rice of early maturing heading date |
| JP2009100653A (en) * | 2007-10-19 | 2009-05-14 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | Polynucleotide containing single nucleotide polymorphism (snp), snp marker used for discriminating species of rice and comprising the polynucleotide, and method for discriminating species of rice by the snp analysis |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6014038606; 富田因則: '半矮性遺伝子ｓｄ１を導入した短桿コシヒカリ型の水稲品種'ヒカリ新世紀'' 農業および園芸 ８４巻１号, 200901, ｐ．５８-６６ * |
| JPN6014038609; ＭＡＴＳＵＢＡＲＡ Ｋ． ｅｔ ａｌ: 'Ｎｏｖｅｌ ＱＴＬｓ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｃｒｏｓ' Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｖｏｌ．１１７ Ｎｏ．６, 2008, ｐ．９３５-９４５ * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016002005A (en) * | 2014-06-13 | 2016-01-12 | 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 | Purity detection method of strawberry f1 seeds by using crude extraction liquid of dna of strawberry seeds |
| CN115181740A (en) * | 2022-07-05 | 2022-10-14 | 北京擎科生物科技有限公司 | Lysate, PCR reaction kit and method |
| CN115181740B (en) * | 2022-07-05 | 2023-09-08 | 北京擎科生物科技股份有限公司 | Lysate, PCR reaction kit and method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5750672B2 (en) | 2015-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10301687B2 (en) | Sidt 1 gene controlling determinate growth habit in sesame and SNP molecular marker thereof | |
| KR101095220B1 (en) | DNA marker associated with resistance of cabbage clubroot disease and uses thereof | |
| CN109628627B (en) | Development and application of SNP (single nucleotide polymorphism) marker of broad-spectrum rice blast resistance gene Pigm of rice | |
| KR101883117B1 (en) | SNP marker for selecting tomato cultivars resistant to tomato Bacterial wilt and use thereof | |
| CN109628628B (en) | Development and application of SNP (single nucleotide polymorphism) marker of rice blast resistance gene Pi2 | |
| JP4775945B2 (en) | A method for identifying rice blast resistance using as a marker a molecular marker linked to the Pb1 gene | |
| JP4928853B2 (en) | Kiwi detection primer set | |
| CN113637787B (en) | DNA fragment related to quality of single oil tea fruit and application thereof | |
| JP5750672B2 (en) | A short-term Koshihikari-type paddy rice cultivar Hikari | |
| CN111378781A (en) | Molecular marker primer for quickly and efficiently identifying salt-tolerant gene SKC1 of rice and application | |
| US10214783B2 (en) | Endpoint zygosity assay to detect Rf4 gene in maize | |
| CN104593510A (en) | Primer, probe and method for detecting SNP allele variation of peanut FAD2 genes | |
| KR100920369B1 (en) | Primer set, method and kit for selecting ChiVMV-resistant pepper cultivar | |
| CN113930532A (en) | KASP molecular marker and method for detecting rice high-temperature-resistant gene TT1 | |
| CN109161605B (en) | Development and application of SNP molecular marker of rice blast resistance gene Pi1 | |
| CN112094940B (en) | Indel marker linked with cucumber long hypocotyl gene lh1 as well as primer, kit and application thereof | |
| CN112980985B (en) | PCR primer group for identifying or screening cabbage hybrid lethal parent type 1 and application thereof | |
| CN114606341B (en) | dCAPS molecular marker of aegilops sieboldii based on genome resequencing SNP and application | |
| KR101304380B1 (en) | Methods for identifying low allergenic soybean using P34 gene-specific DNA markers | |
| KR101892461B1 (en) | Molecular marker for discrimination genetic male sterility gene and detection method using the same | |
| CN109161606B (en) | Development and application of SNP molecular marker of rice blast resistance gene Pi9 | |
| WO2023176983A1 (en) | Molecular marker for at least one of degree of grain protein content and degree of number of spikes in wheat plant, and use thereof | |
| CN110872634B (en) | CAPS molecular marker closely linked with P3G and C3G synthetic genes in colored barley | |
| JP4574263B2 (en) | Hop variety identification method using microsatellite DNA | |
| KR20100112501A (en) | Ssr primer derived from buckwheat and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130607 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130607 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140916 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141117 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20141204 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20141204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150317 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150416 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5750672 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |