JP2007282542A - 低温ストレス耐性を有するトランスジェニック植物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シロイヌナズナにおいてAtCSP3遺伝子と称される遺伝子を過剰発現させることによって、植物に低温ストレス耐性を付与できるといった知見を見いだした。なお、シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子については、低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードしているが、植物体に低温ストレス耐性を付与できるといった知見は新規な発見である。
【選択図】なし
Description
(1)シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現するように改変されたトランスジェニック植物。
(2)上記遺伝子は低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードすることを特徴とする(1)記載のトランスジェニック植物。
(3)上記遺伝子は、以下の(a)〜(d)の少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする(1)記載のトランスジェニック植物。
(a)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子
(b)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子
(4)上記遺伝子は過剰発現プロモーターに連結されていることを特徴とする(1)記載のトランスジェニック植物。
(5)シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現するように改変する、植物に低温ストレス耐性を付与する方法。
(6)上記遺伝子は低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードすることを特徴とする(5)記載の方法。
(7)上記遺伝子は、以下の(a)〜(d)の少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする(5)記載の方法。
(a)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子
(b)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子
(8)上記遺伝子は過剰発現プロモーターに連結されていることを特徴とする(5)記載の方法。
本発明にかかるトランスジェニック植物は、シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現するように改変されたものである。本発明においてシロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子は、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(以下AtCSP3と称する)をコードしている。植物の低温耐性獲得における低温ショックドメインRNA結合タンパク質の機能解明を行う過程(後述の実施例参照)で、AtCSP3遺伝子を欠損したシロイヌナズナにおいては、耐凍性が著しく減少するといった表現型を示す。この知見より、AtCSP3遺伝子の産物がシロイヌナズナにおける耐凍性の獲得に必須であることが示されている。
本発明にかかるトランスジェニック植物において、過剰発現させる遺伝子とは、シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子、あるいはシロイヌナズナ以外の植物におけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子である。
(1) シロイヌナズナのmRNA及びcDNAライブラリーの調製
mRNAの供給源としては、シロイヌナズナの葉、茎、根、花など植物体の一部又は植物 体全体が挙げられる。また、シロイヌナズナの種子をGM培地、MS培地、#3培地などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体も用いることができる。本発明に用いる遺伝子のシロイヌナズナ植物体中のmRNAレベルは、低温ストレス(例えば、-10〜10℃)に曝露することにより増大するため、これらのストレスに曝露させたシロイヌナズナ植物体を用いてもよい。
(1) 組換えベクターの作製
組換えベクターは、上述したAtCSP3遺伝子或いはAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子(以下、「目的遺伝子」ともいう)を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌(Escherichia coli)及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列よりなるボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能なベクターである(EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991))。一方、pUC系のベクターは、植物に目的遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス(BGMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
本発明の形質転換植物は、上記(1)の組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換することで調製できる。形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、PEG−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合(in planta法)がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法(スフェロプラスト法)、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片(リーフディスク)に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物(幼苗)、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
本発明の形質転換植物の低温ストレスに対する耐性は、バーミキュライト、パーライトなどを含む土を入れた植木鉢に形質転換植物を植え、低温ストレスを負荷した場合の植物体の状態(例えば、生育速度、生存率、草丈、重量、収量、あるいはこれらの組合せ)を調べることによって評価することができる。ここで、低温ストレスの負荷条件は前項の通り行うことができる。
上述したAtCSP3遺伝子及びAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子は、植物の低温ストレス耐性を調節する物質のスクリーニングに用いることができる。植物体または植物細胞における上記遺伝子の発現量が増加すれば、その植物の低温ストレス耐性は上昇し、該遺伝子の発現量が減少すれば、低温ストレス耐性は低下する。従って、上述した遺伝子の植物体または植物細胞における発現量の増減を指標とすることにより、低温ストレス耐性の調節物質をスクリーニングすることができる。具体的には、環境ストレス耐性調節物質の候補物質を、上述した遺伝子を発現可能な植物、例えばシロイヌナズナに添加し、該植物細胞内における上述した遺伝子の発現レベルの変化を、定量的PCR法、ノーザン法等で測定する。候補物質を添加することにより上述した遺伝子の発現量が増加した場合には、当該候補物質は植物の低温ストレス耐性を強化させる物質の候補物質とすることができ、当該候補物質を添加することにより本発明の遺伝子の発現量が減少した場合には、当該候補物質は植物の低温ストレス耐性を弱化させる物質の候補物質とすることができる。
アラビドプシス(Columbia-0)のロゼット葉よりRNeasy Mini Kit (Qiagen社製)を用いてTotal RNAを抽出した。得られたRNAを用いてPCR Core Kit (Applied Biosystem社製)を利用してcDNAを合成した。
上記の通り合成されたcDNAを鋳型として、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてPCRを行った。
フォワードプライマー:
5’-tctagacgaacaaagtgcttcg-3’(下線部はXhoI部位:配列番号3)
リバースプライマー:
5’-gagctcttaagcaaccgaagta-3’(下線部はSacI部位:配列番号4)
これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、既知のAtCSP3遺伝子の塩基配列(Genebankアクセッション番号At2g18780)の5’UTRから終止コドンまでを増幅できるように設計したものである。PCRは50μlの反応系で行った。
以上のようにして、単離されたAtCSP3遺伝子をTi系ベクターであるpBI 121ベクター (Clonetech社製)中のCaMV35Sプロモーターの下流に、センス鎖方向で導入した。
形質転換した植物から得られた種を滅菌溶液(70%エタノール、0.5% Triton X-100)で30分間滅菌し、その後100%エタノールで2分滅菌した。その後、カナマイシン(50mg/L)、バンコマイシン(200mg/L)を含むMS培地に種を播いた。同培地上で正常に生育した植物体(T0世代)を自家受粉してえられたT1世代で形質転換体と野生株の分離比が3:1であることを確認した。さらにT2世代で導入遺伝子をホモでもつ植物体を選抜した。以上の実験に使用した培地の組成は表4の通りである。
AtCSP3遺伝子のノックアウト変異株を得るため、TAIRのホームページ(http://www.arabidopsis.org/)よりAtCSP3の低温ショックドメインにT-DNAが挿入された変異株(WiscDsLox353G12)を購入した(図2参照)。購入した種子を土(バーミキュライト(釧路石炭乾溜社製)とジーフィーミックス(サカタのタネ社製)を3:1の割合で混合したもの)に播き、ロゼット葉まで生育させた後、Leaf PCR法(Klimyuk et al.、(1993) Alkali treatment for rapid preparation of plant material for reliable PCR analysis. Plant J. Mar;3(3):493-4)によりゲノムDNAを抽出した。T-DNA挿入をホモにもつ変異株を選択するためT-DNAに対する特異的プライマー(5’-cgtccgcaatgtgtta-3’:配列番号5)とAtCSP3遺伝子に対する特異的プライマー(5’-tgtacgaacaaagtgcttcga -3’:配列番号6及び5’- tacaatccctagcgaaatgtc-3’:配列番号7)を使用しPCR反応を行った。PCR反応はアラビドプシスのゲノムDNA(約1ng/μl)を1μl、Ex Taq DNAポリメラーゼ(TAKARA BIO INC.;5 units/μl)を0.1μl、10×ポリメラーゼバッファー(MgCl2を含む)を2μl、dNTP液(2.5mM)を1μl、上記の各プライマー(10pmol/μl)を0.2μlを混合し、さらに反応液全量をミリQ水で20μlとした。用いたPCRの反応条件及び反応回数は、以下の表5に示す。
AtCSP3遺伝子ノックアウト変異株のロゼット葉よりRNeasy Mini Kit (Qiagen社製)を用いてTotal RNAを抽出した。得られたRNAを用いてPCR Core Kit (Applied Biosystem社製)を利用してcDNAを合成した。上記で合成されたcDNAを鋳型として、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてPCRを行った。
フォワードプライマー:5’-aagtgcttcgagtttttgtta-3’(配列番号8)
リバースプライマー:5’-gcagtgaacaggttgcat-3’(配列番号9)
AtCSP3過剰発現株、AtCSP3遺伝子ノックアウト変異株及びアラビドプス野生株(Columbia-0)の種子を滅菌溶液(70%エタノール、0.5% Triton X-100)で30分間滅菌し、その後100%エタノールで2分間滅菌し、Gamborg培地に播いた。22℃、連続光の条件下で2週間生育させた後、TEMPERATURE CABINET(TABAI ESPEC社製)を用いて凍結耐性の評価を行った。その後、22℃、連続光の条件に戻して1週間後に生存率の測定を行った。凍結耐性評価のステップ、温度、時間は以下の表7に示す。
Claims (8)
- シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現するように改変されたトランスジェニック植物。
- 上記遺伝子は低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードすることを特徴とする請求項1記載のトランスジェニック植物。
- 上記遺伝子は、以下の(a)〜(d)の少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のトランスジェニック植物。
(a)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子
(b)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子 - 上記遺伝子は過剰発現プロモーターに連結されていることを特徴とする請求項1記載のトランスジェニック植物。
- シロイヌナズナにおけるAtCSP3遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現するように改変する、植物に低温ストレス耐性を付与する方法。
- 上記遺伝子は低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードすることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 上記遺伝子は、以下の(a)〜(d)の少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする請求項5記載の方法。
(a)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子
(b)配列番号1に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低温ショックドメインを有するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子 - 上記遺伝子は過剰発現プロモーターに連結されていることを特徴とする請求項5記載の方法。
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