JP2007259835A - ヒトTh1/Th2分化誘導系及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトナイーブCD4T細胞を、IL-2、IL-12及び抗IL-4抗体を含む分化誘導培地(Th1分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下で培養し、又は、IL-2、IL-4及び抗IFNγ抗体を含む分化誘導培地(Th2分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下培養し、更に、該分化誘導培地から、夫々、抗IL-4抗体又は抗IFNγ抗体のみを除いた培養条件下で抗CD3抗体による刺激なしで更に培養することから成る、該ヒトナイーブCD4T細胞のTh1及び/又はTh2分化誘導方法。
【選択図】 図6
Description
[1]ヒトナイーブCD4T細胞を、IL-2、IL-12及び抗IL-4抗体を含む分化誘導培地(Th1分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下で培養し、又は、IL-2、IL-4及び抗IFNγ抗体を含む分化誘導培地(Th2分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下培養し、更に、該分化誘導培地から、夫々、抗IL-4抗体又は抗IFNγ抗体のみを除いた培養条件下で抗CD3抗体による刺激なしで更に培養することから成る、該ヒトナイーブCD4T細胞のTh1及び/又はTh2分化誘導方法。
通常、被検化合物は抗CD3抗体による刺激下での培養工程、及び、それに続く抗CD3抗体非刺激下での培養工程の両方を通して所定量添加する。しかしながら、添加する化合物の性質等に応じて、抗CD3抗体による刺激下、又は、抗CD3抗体非刺激下での培養のいずれか一方における培養過程でのみ被検化合物を添加することも可能である。
ヒトナイーブCD4 T 細胞の分離は自動磁気細胞分離装置(autoMACS, Miltenyi Biotec GmbH)を用いて以下に示す方法で行なった。ヒト末梢血を50ml採取し、D-PBS溶液(Product Number D5652 , Sigma-Aldrich Inc) 50mlで等倍に希釈した。次に、12.5mlの Ficoll-Paque Plus(Catalog No.17-1440-02, Amersham Biosciences)を分注した4本の遠心チューブに上記の希釈末梢血25mlをゆっくり重層し、水平ローターを装着した遠心機を用いて室温で950Gにて30分間の遠心分離を行った。遠心後、Ficoll-Paqueと上清との間の中間層に存在するリンパ球を回収し、3%仔牛胎児血清(FCS:Cat No. 2103-500M, JRH Biosiences),2mMEDTA(Cat No 345-01865, Dojindo Inc)を含むD-PBS溶液 (以下、「MACSバッファー」という)を用いて懸濁し、遠心機を用いて4℃にて500Gにて5分間の遠心を行ってリンパ球を沈降させた。沈降したリンパ球細胞ペレットを再度MACSバッファーに懸濁し500Gにて5分間の遠心を行ってリンパ球を沈降させ、2回洗浄したリンパ球細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを再度MACSバッファーに1x108個/mlになるように細胞を懸濁し、リンパ球1x107個に対してFITC標識抗ヒトCD8抗体(Cat.No 555366, BD BioScience Phamingen) 2μL, FITC標識抗ヒトCD45RO抗体(Cat.No. 555492, BD BioScience Phamingen)を2μLそれぞれ添加して氷上で30分間反応させて各々の抗体を結合させた後に、MACSバッファーを加え遠心し4℃にて2回洗浄した。次に各々の抗体を結合させたリンパ球1x107個に対して10μLの抗FITCマイクロビーズ(Cat No.120-000-293, Miltenyi Biotec GmbH)を添加して氷上で15分間反応させた後にMACSバッファーを加え遠心し4℃にて2回洗浄した。得られた細胞ペレットを5x107/mlの細胞濃度になるようにMACSバッファーで調製してナイロンメッシュ(#200 アベ科学)を通過させた後、自動磁気細胞分離装置(AutoMACS, Miltenyi Biotec GmbH)を用いCD8及びCD45ROネガティブフラクションを回収する事によってヒトナイーブCD4T 細胞を分離し、Th1分化誘導あるいはTh2分化誘導実験に供した。
実施例1でヒト末梢血から分離調製したナイーブT細胞を用い、本発明の分化誘導方法を実施し、ヒトTh1誘導細胞及びヒトTh2誘導細胞を得た。すなわち、ヒト末梢血から分離したナイーブCD4T細胞を、Th1分化条件では5x105細胞/0.5ml/ウェルとなるように幡種して以下の条件下で刺激とそれに続く培養を行った。Th1刺激とそれに続く培養あるいはTh2刺激とそれに続く培養は、CO2インキュベーターを用い水蒸気で飽和させた5%CO2を含む空気のもと37℃にて行った。
11140-076, GIBCO), 1mMSodiumPyruvate(Cat.No. 11360-070, GIBCO), 55μM 2-Mercaptethanol(Cat. No. 21985-023, GIBCO)を含むRPMI-1640培地(Cat. No. 2006-06, SIGMA)(以降、「分化誘導培地」と呼ぶ)に、50U/mlの濃度となるようにIL-2(イムネース,塩野義)、1ng/mlの濃度となるようにIL-12(Cat.No. 200-12, ペプロテック)及び5μg/mlの濃度となるように抗IL-4抗体(Cat.No BD-554481, Pharmingen) を添加した。抗CD3抗体20μg/ml(オルソクローンOKT3,ヤンセンファーマ)で固層化した平底48穴組織培養プレート(code,3548, Costor)を使用し2日間培養した。更に抗CD3抗体を含まない非固層化プレートに細胞を移し換えて、抗IL-4抗体を含まないが、IL-2及びIL-12を含むTh1分化条件の培養条件にてさらに5日間培養した。
実施例2でTh1分化誘導した細胞(Th1細胞)、Th2分化誘導した細胞(Th2細胞)をMonensin(Cat No.M-5273 Sigma)存在下でPMA(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate,ProducNo.P1585Siguma-Aldrich), Ionomycin (Cat.No 407952, Calbiochem )を添加した培地を使用し、4時間培養し刺激を行った。刺激を行なった後に細胞内染色を以下の方法によりTh1分化誘導の程度あるいはTh2分化誘導の程度について細胞解析装置(FACScalibur, Becton Dickinson)を用いた解析により評価した。詳細には、Th1誘導細胞あるいはTh2誘導細胞を平底48穴組織培養プレートに1ウエルあたり5-10x105の細胞となる様に幡種し、2μMのMonensin存在下、10ng/mlのPMA, 1μMの Ionomycin1の濃度になるように添加し、37℃にて5%の CO2を含む飽和水蒸気を含む空気中でCO2インキュベーターを使用して4時間培養し刺激を行った。上記のMonensin(Cat No.M-5273, Sigma)存在下でPMA、Ionomycin刺激したTh1分化誘導あるいはTh2分化誘導した細胞をPE標識した抗ヒトIL-4抗体(IL-4 PE)とFITCで標識した抗ヒトIFNγ抗体(IFNγFITC)(CatNo.340456Becton-Dickinson)を用いて細胞内に蓄積させたヒトIL-4あるいはヒトIFNγのサイトカイン量を細胞内染色により評価した。また、同時にAPC標識抗ヒトCD4(CD4 APC (CatNo.555349 BD Biosciences)抗体により細胞内染色も行い、細胞解析装置(FACScalibur, Becton Dickinson)を用い測定した。解析はCD4を発現するT細胞のみにゲートをかけて行った。
実施例1の方法でヒト末梢血から分離調製したナイーブT細胞を用い、抗CD3抗体による刺激下での培養に際して被検化合物としてFK506(F4679-5, Sigma)を0.01μMあるいは0.1μMになるよう分化誘導培地に加えた以外は、実施例2で示したヒトTh1/Th2分化誘導系を使用し、それぞれヒトTh1分化誘導あるいはTh2分化誘導を実施し、添加した化合物がヒトTh1誘導あるいはヒトTh2誘導を修飾するか否かを、実施例3に記載した方法によって細胞内染色して評価した。また、ステロイドとして用いられる化合物としてヒドロコーチゾン(Hydrocortisone;H0396, Sigma) を0.1μMあるいは1.0μMになるよう分化誘導培地に加えて、あるいは陰性コントロールとして生理食塩水を用いて上記のFK506と平行してヒトTh1/Th2分化誘導系における各種化合物による修飾について調べた。なお、Th1分化誘導あるいはTh2分化誘導における上記の化合物添加による修飾は、抗CD3抗体固層化プレートを使用し2日間の培養と、続く抗CD3抗体を含まない非固層化プレートに細胞を移し替えて5日間の培養する培養工程の両方の培養工程の全培養工程を通じて化合物添加条件下によりその影響を調べた。
実施例4に記載した方法において、Ca2+/CN経路を阻害することが知られているシクロスポリンA(CyA)(0.01μM及び0.1μM, Cyclosporin A; C3662, Sigma)及び実施例4より低濃度(0.001μM及び0.01μM)のFK506 (F4679-5, Sigma)を被検化合物としてTh1/Th2分化誘導の修飾を評価する試験に供した。なお、Th1分化誘導あるいはTh2分化誘導における上記の化合物添加による修飾は、抗CD3抗体固層化プレートを使用し2日間の培養と、続く抗CD3抗体を含まない非固層化プレートに細胞を移し替えて培養する5日間の培養の両方の工程の全培養工程を通じて化合物添加条件下によりその影響を調べた。
実施例4に記載した方法において、Ras/MAPK経路を阻害することが知られているマップキナーゼ阻害剤としてPD98509(3μM及び30μM, No. 513000, Calbiochem)を被検化合物としてTh1/ Th2分化誘導の修飾を評価する試験に供した。
Th1分化誘導あるいはTh2分化誘導に分化誘導を行う前のナイーブTを5x106細胞(Th0細胞)、Th1分化誘導により得た5x106細胞(Th1細胞)、またTh2分化誘導により得た5x106細胞(Th2細胞)をそれぞれ出発材料として、Trizol溶液(Invitrogen社のTRIsol試薬)とRNase-free水(Invitrogen社の DNase/RNase Free)を使用しトータルRNAを調製した。詳しくは、各々の細胞を1.5mLのポリプロピレン製遠心チューブ中で1mlのTrizol溶液に溶解した、200μLのクロロホルム(Trizol液:クロロホルム=1:4の比)を添加し、ボルテックスミキサーを使用してよく振とうした後3分間室温にて放置し、小型冷却遠心機を用いて4℃にて15,000rpmで15分間遠心した。遠心により分離した上層(水溶液層)を別の1.5mLのポリプロピレン製遠心チューブに採取し、グリコーゲン飽和水溶液1μLとイソプロパノールを250μL添加しボルテックスミキサーを使用してよく振とうしてから室温にて10分間放置した後に、室温にて15,000rpmで15分間遠心した。遠心した後に上清を取り除き、冷70%エタノールを1ml加え、4℃にて15,000rpmで10分間遠心した。遠心後に再び上清を取り除き、1.5mL遠心チューブの底に沈殿したトータルRNAを室温にて風乾した。乾燥したトータルRNAに対しRNase-free水20μLを加えピペッティングにてトータルRNAを溶解させ、60℃に保温した水槽で5分間保温した後に氷上に置いた。
更に、発現量が比較的高いTh1特異的発現遺伝子として、 Th1/Th2の比率が50以上(50倍の差がある)、Th0/Th1の比率が0.25以下(4倍の差がある)かつTh1rawに示される蛍光強度が100以上として絞り込み2遺伝子を選択した(表3)。
Claims (16)
- ヒトナイーブCD4T細胞を、IL-2、IL-12及び抗IL-4抗体を含む分化誘導培地(Th1分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下で培養し、又は、IL-2、IL-4及び抗IFNγ抗体を含む分化誘導培地(Th2分化誘導条件)にて抗CD3抗体による刺激下培養し、更に、該分化誘導培地から、夫々、抗IL-4抗体又は抗IFNγ抗体のみを除いた培養条件下で抗CD3抗体による刺激なしで更に培養することから成る、該ヒトナイーブCD4T細胞のTh1及び/又はTh2分化誘導方法。
- ヒトナイーブCD4T細胞がヒト末梢血から分離したものである、請求項1記載の方法。
- 抗CD3抗体による刺激下で培養が抗CD3抗体固層化プレートにより行われ、抗CD3抗体による刺激なしの培養が抗CD3抗体を含まない非固層化プレートにより行われることを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。
- 抗CD3抗体による刺激下で1〜3日間培養し、且つ、抗CD3抗体による刺激なしで4〜6日間培養することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 抗CD3抗体による刺激下で2日間培養し、且つ、抗CD3抗体による刺激なしで5日間培養することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 分化誘導培地に、IL-2が5〜500U/ml、IL-12が0.1〜100ng/ml、抗IL-4抗体が0.5〜50μg/ml、IL-4が0.1〜100ng/ml、及び、抗IFNγ抗体が0.5〜50μg/mlの濃度で含まれる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 分化誘導培地に、IL-2が50U/ml、IL-12が1ng/ml、抗IL-4抗体が5μg/ml、IL-4が1ng/ml、及び、抗IFNγ抗体が5μg/mlの濃度で含まれる、請求項6に記載の方法。
- Th2分化誘導条件における抗CD3抗体による刺激下の培養、及び、同分化誘導条件による抗CD3抗体による刺激なしの培養からなる培養サイクルを複数回連続して行うことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により、ヒトTh1/Th2分化誘導させた後に、IFNγ、IL-4及び CD4に対する標識抗体を用いて細胞内染色を施し、次に、抗CD4抗体を用いてT細胞のみを選別し、選別した細胞についてIL-4及び IFNγ細胞内染色強度を測定し、それらの強度に基きTh1又はTh2への分化誘導の程度を評価する方法。
- 抗体標識物質がFITC(フルオレセインイソチオシアネート)、PE(フィコエリスリン)、又はAPC(アロフィコシアニン)である、請求項9記載の評価方法。
- 表1及び表2に記載された計13種類のTh2特異的発現遺伝子の少なくとも一つ、及び/又は、表3に記載された2種類のTh1特異的発現遺伝子の少なくとも一つの発現強度を測定し、それらの強度に基づきTh1又はTh2への分化誘導の程度を評価する方法。
- 各遺伝子の発現強度をmRNA又は発現産物(蛋白質)で測定することを特徴とする、請求項11記載の評価方法。
- ヒトナイーブCD4T細胞のTh1及び/又はTh2分化誘導に対する被検化合物の影響をスクリーニングする方法であって、所定量の被検化合物を添加した分化誘導培地を用いて、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により、ヒトTh1/Th2分化誘導させた後に、Th1又はTh2への分化誘導の程度を評価することから成る、前記スクリーニング方法。
- 請求項9〜12の何れか一項に記載の評価方法を用いる、請求項13記載のスクリーニング方法。
- 請求項13又は14のスクリーニング方法を用いる、アレルギー抑制化合物の探索方法。
- 請求項1〜15の何れか一項に記載の方法に使用されるキット。
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