JP2007252282A - Ageを認識するリフォールディングされた分子 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
【解決手段】細菌宿主細胞を用いて、ビオチン化した後期糖化反応生成物レセプター(RAGE)およびそのホモログの封入体を組換え発現し、リフォールディングしたポリペプチドを得ることによって、上記課題が解決された。
【選択図】なし
Description
しかしながら、RAGEを高発現する細胞は、後期の糖尿病患者の細胞でありそのため、天然の供給源は、限られている。AGEを検出する物質(センサー)としてRAGEを用いる場合には、RAGEを組換え発現する必要がある。
山本 靖彦、外4名、「AGE−RAGE系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」、日薬理誌、日本薬理学会、2003年、121、49〜56 GeethaSrikrishna、外6名、N-Glycans on the receptor for advanced glycation end productsinfluence amphoterin binding and neurite outgrowth、Journal of Neurochemistry、InternationalSociety for Neurochemistry、2002、80、998−1008
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程:
(i)該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程;および
(ii)該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程;
を包含する、方法。
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程:
(i)該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程;および
(ii)該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程;
を包含する、方法。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。。
coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli
HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium
glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp.D−0110などが例示される。
RAGE遺伝子の発現にT7プロモーターを用いる場合、T7 RNAの天然のインヒビターであるT7 リゾチウムを欠損する宿主細胞株を用いることが、好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、AD494(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI、BL21 trxB(DE3)、BLR(DE3)、B834(DE3)、HMS174(DE3)、Origami(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta(DE3)、Roseetta−gami(DE3)、RosettaBlue(DE3)、およびTuner(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)が挙げられるが、これに限定されない。
I:The Conformation of Biological Macromolecules(1980)を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には50〜350アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート(βストランドなど)およびα−ヘリックスのストレッチ(stretch)のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。
Jら (1987) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する)、液体SIMS(LSIMS−一次種がイオンであることを除いてFABと同様)、プラズマ脱着質量分析法(MeV一次イオンを用いることを除いてSIMSと同様)、大量クラスタ衝撃法(MCI−大きいクラスタの一次イオンを用いてSIMSと同様)、レーザ脱着/イオン化法(LDI−レーザ光を用いて、表面から種を脱着/イオン化する)、マトリクス補助型レーザ脱着/イオン化法(MALDI−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着/イオン化することを除いてLDIと同様)などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着/イオン化、飛行時間質量分光測定(TOF)を用いる方法が挙げられる。
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子(例えば、リガンドを含む混合物)の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと;前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと;前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、1つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと;前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと;このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子(例えば、受容体に特異的に結合するリガンド)のイオンの質量を検出することができる。
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、(1)封入体を形成しない(または少量のみの封入体を形成する)宿主細菌細胞の使用、(2)封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、(3)形成された封入体のリフォールディング、または、(4)これら(1)〜(3)の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、以下のように実施することが可能である。
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングは、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中、または環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中で行われる。本明細書において使用される環状糖質サイクロアミロース(CAと略す)の重合度の下限は17以上、好ましくは25以上、より好ましくは40以上であり、重合度の上限は150以下、好ましくは100以下、より好ましくは50以下である。
宿主細菌細胞としてOrigami(DE3)を用いた。図1に記載のように、目的RAGE遺伝子クローニングサイトとして、5’側はNdeI,3’側にはXhoI(BamHI,SmaI,HindIIIもまた使用可能)を使用する。その結果、目的タンパク質のC末側にビオチンリガーゼによって認識されるビオチン化アミノ酸配列が付加される。RAGEの場合、N末側が細胞外領域でありAGEの認識に必須な領域であるため、チップ化などに際してC末側で固定化が可能なように、C末側にビオチン化アミノ酸配列を付加した。この手順を用いて、配列番号1のアミノ酸配列のC末端側にビオチン化アミノ酸配列「GLNDIFEAQKIEWHE」(配列番号4)をコードする核酸配列を連結し、T7プロモーターの制御下に配置したプラスミドを作製した。用いたプラスミドのクローニング部位を図1に示す。図1中、「FXa」は第Xa因子の切断部位を示し、「rbs」はリボゾーム結合部位を示す。このプラスミドと、ビオチンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミド(ColE1系であるpETベクターと不和合性グループが異なるため同一細胞内で安定に共存しうるp15A系プラスミドであるpACベクターにビオチンリガーゼ遺伝子を挿入したプラスミド)の両方を用いて宿主細菌細胞を形質転換した。この形質転換した宿主細胞の培養に使用した培地は、50μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコール、15μg/mlカナマイシン、12.5μg/mlテトラサイクリンを添加した、改変LB培地(0.5% NaCl、0.5%酵母エキス、1%トリプトン)である。
大腸菌で発現させたビオチン化RAGEは、可溶性画分には存在せず、ほとんどが封入体として蓄積されていることが明らかとなった。そこで、封入体からビオチン化RAGEを人工シャペロン法によりリフォールディングすることを試みた。
、3%CA溶液6m1を加えさらに1時間室温で反応させた。
リフォールディングされたポリペプチドを4℃にて一週間保存した後にCDスペクトルを測定し、その安定性について評価した。
実施例2に従って調製した組換えRAGEのAGE結合能を確認した。
AGEとしては、糖化BSAを用いた。糖化BSAは、以下の手順によって調製した。
1.5mlの遠心用チューブに粗精製sRAGE溶液(Lysis buffer:10mM イミダゾール、100mM NaH2PO4, 150mM NaCl;タンパク濃度は、2.5〜5mg/ml)300μlを分注した。次に20μlのストレプトアビジン−ムテインマトリックス50%スラリーを添加し、室温で回転混和により10分間反応させた。スイングローターにより500g×5 分間の遠心処理を行い、上清を除去し、sRAGEが固定化されたストレプトアビジン−ムテインマトリックス(SA−Mutein)を沈澱画分として回収した。300μlのLysis bufferを添加し、転倒混和、遠心処理によるsRAGE固定化SA−Muteinの回収を2回繰り返すことにより、非特異的にSA−Muteinに吸着しているタンパク質などを除去した。続いて、300μlのAGE−BSA(12週間糖化処理を行なったAGE−BSA、4mg/ml)を添加し、室温で回転混和により1時間反応させた。上述の遠心処理によりAGE−BSA−sRAGE−SA−Mutein複合体が回収された。この複合体を0.05%Tween 20を含むPBS(1mM KH2PO4, 10mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7mM KCL, pH 7.4)を300μl添加し、転倒混和、遠心処理を2回繰り返す洗浄の作業を行ない、非特異的に吸着していた分子を除去した。最終的に回収されたAGE−BAS−sRAGE− SA−Mutein複合体を200μlのPBSに懸濁した後、96ウェルの無蛍光のマイクロタイタープレートに添加し、335nmで励起し、420nmの吸収波長で蛍光強度を測定した。コントロールとしてFruc−500−BSAの代わりにフルクトース非存在下で糖化処理区と同条件で37℃に放置したBSAを使用した。独立した3回の測定を行なった結果を以下の表に記す。
(実験条件)0.22μmのポアサイズのニトロセルロース膜上に1μlのリガンド溶液(20ng〜8μgの濃度勾配)を直接スポットすることにより吸着させる。リガンド溶液としては12週間反応のAGE−BSA、フルクトース非存在下で調製したBSA(コントロール)を用いる。スポットを完全に乾燥させた後、タンパク質の結合していない部分をブロックするため、ブロッキング緩衝液:5% スキムミルクを含むTBS−T(0.1% Tween 20, 20 mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0)中で、室温で1時間反応させた。続いて10μg/mlもしくは1μg/mlの濃度のsRAGE、コントロールとして10μg/ml(いずれも最終濃度)BSAを含むTBS−T中で室温にて1時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜をTBS−T中にて15分間振とうする洗浄の過程、さらに同様の洗浄を1.5分で3回繰り返し、非特異的な結合を除去する。続いて室温にて1時間、一次抗体との反応を行なう。抗体は、抗RAGE抗体ウサギIgG(Santa Crua Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA )をTBS−Tにて1:1000に希釈して使用する。反応後の膜をTBS−Tにて上記同様に洗浄した。次に二次抗体との反応を行なう。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギIgG抗体(Bio Rad, Hercules, CA, USA)をTBS−Tにて1:1000に希釈して使用した。室温で1時間振とう反応させた後、上述の洗浄の過程を経て、最後の検出の段階に進む。検出はECL(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden )キットにより、X線フィルムへの露光により、各ドットに由来する発光を可視化する。
AGEなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へビオチン化RAGEを固定化し、実際のリガンドの結合を検討する。表面プラズモン共鳴装置としては、BIACORE杜製のBIACORE、並びに株式会社日立ハイテクノロジーズ製のIAsysを使用する。
リフォールディングにより得られたsRAGEをBIACOREのセンサーチップSA上に固定化した。実施例4に従って調製された、異なった濃度のフルクトースにより糖化処理を行なったAGE−BSAをインジェクションした。その結合と解離を測定したセンサーグラムを図5に示す。0秒でAGE−BSAを添加し、180秒後に緩衝液による洗浄を開始した。流速を20μl/分とした。sRAGEを固定化していないフローセルをリファレンスセルとし、リファレンスセルの値との差を応答(RU)として示した。図5中、応答(RU)値の大きい順に、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/mlの糖化処理AGE−BSAを用いたセンサーグラムの結果が示されている。
RAGEポリペプチドまたはそのホモログを、AGEなどを検出するセンサーとして使用する目的で、水晶発振子マイクロバランスにより検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチン化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を測定する。装置としては、Intium社製のAffinixQを使用する。
配列番号2 RAGEタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号3 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号4 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号5 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号6 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号7 ビオチンリガーゼのアミノ酸配列
配列番号8 FactorXaの認識配列
配列番号9 エンテロキナーゼの認識配列
配列番号10 トロンビンの認識配列
配列番号11 pET16−aviTagのクローニング部位
Claims (8)
- レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、AGEと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下:
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程:
(i)該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程;および
(ii)該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程;
を包含する、方法。 - 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、17〜50または40〜150である、請求項1記載の方法。
- 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、40〜150である、請求項2記載の方法。
- 前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルまたはスクロース脂肪酸エステルである、請求項1に記載の方法。
- レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むビオチン化ポリペプチドの製造方法であって、ここで、該ポリペプチドは、AGEと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下:
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
該方法は、以下の工程:
(i)該ビオチン化ポリペプチドを、細菌宿主内で封入体として組換え発現する工程;および
(ii)該封入体を、環状糖質サイクロアミロースとイオン性界面活性剤を含有する溶液中でリフォールディングして、可溶性ビオチン化ポリペプチドを調製する工程;
を包含する、方法。 - 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、17〜50または40〜150である、請求項5記載の方法。
- 前記環状糖質サイクロアミロースの重合度が、40〜150である、請求項6記載の方法。
- 前記イオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドまたはミリスチルサルホオベタインである、請求項5に記載の方法。
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