JP2007219121A - 顕微鏡視野光量分布測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 シェーディングと色収差による焦点ズレを測定できる顕微鏡視野光量分布測定装置を実現する。
【解決手段】顕微鏡と共焦点スキャナにより構成される共焦点顕微鏡と、この顕微鏡写真の撮影のためのカメラとを具備する顕微鏡視野光量分布測定装置において、視野内に蛍光ビーズが１個になるように配置された測定試料と、この測定試料を移動する移動手段と、 この移動手段の移動を制御する移動コントローラと、この移動手段コントローラと前記カメラとを操作する操作コントローラとを具備したことを特徴とする顕微鏡視野光量分布測定装置である。
【選択図】図１

Description

本発明は、シェーディングと色収差による焦点ズレを測定できる顕微鏡視野光量分布測定装置に関するものである。

顕微鏡視野光量分布測定装置に関連する先行技術文献としては次のようなものがある。

特開平０５−０６０９８０号公報

図３は従来より一般に使用されている従来例の構成説明図である。
共焦点顕微鏡本体部１は、顕微鏡２と共焦点スキャナ３により構成されている。
カメラ４は、共焦点顕微鏡写真の撮影のために設けられている。
制御用パソコン５は、カメラ４を操作する。

通常、顕微鏡のシェーディング(周辺減光ムラ)の評価を行う場合において、例えば、顕微鏡視野全体にわたって一様な蛍光を発する一様蛍光板６を顕微鏡の焦点位置に設置し、その画像を得ることにより行う。

しかしながら、マルチピンホールの共焦点スキャナを使用した共焦点顕微鏡においては、視野全体が一様に発光する測定対象に対しては、クロストークを起こして共焦点効果が得られないため、入手の容易な一様蛍光坂を測定対象とした場合、装置のシェーディングを測定することができない。

本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、測定対象を一様蛍光板の代わりに、所定直径の蛍光ビーズを使用することで、シェーディングと色収差による焦点ズレを測定できる顕微鏡視野光量分布測定装置を提供することにある。

このような課題を達成するために、本発明では、請求項１の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、
顕微鏡と共焦点スキャナにより構成される共焦点顕微鏡と、この顕微鏡写真の撮影のためのカメラとを具備する顕微鏡視野光量分布測定装置において、
視野内に蛍光ビーズが１個になるように配置された測定試料と、この測定試料を移動する移動手段と、この移動手段の移動を制御する移動コントローラと、この移動コントローラと前記カメラとを操作する操作コントローラと、前記顕微鏡写真を画像処理する画像処理部とを具備したことを特徴とする。

本発明の請求項２の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項１記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記測定試料は、スライドグラスの一方の面に一方の面が接して設けられ蛍光ビーズを固定するための封入体と、この封入体に展開された蛍光ビーズと、前記封入体の他方の面に一方の面が接して設けられたカバーグラスとを具備したことを特徴とする。

本発明の請求項３の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項１又は請求項２記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記移動手段は、ＸＹＺステージが使用されたことを特徴とする。

本発明の請求項４の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項１又は請求項２記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記移動手段は、ＸＹステージが使用されたことを特徴とする。

本発明の請求項５の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項１乃至請求項４の何れかに記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記画像処理部には、前記測定試料を前記移動手段で移動させながら撮影された所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する変換手段を有することを特徴とする。

本発明の請求項６の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項５記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記変換手段は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）が使用されたことを特徴とする。

本発明の請求項７の顕微鏡視野光量分布測定装置においては、請求項１乃至請求項６の何れかに記載の顕微鏡視野光量分布測定装置において、
前記蛍光ビーズは、所定の蛍光試薬で多重染色された多重染色蛍光ビーズが使用されたことを特徴とする。

本発明の請求項１によれば、次のような効果がある。
マルチピンホールを採用した共焦点スキャナにおいては、視野全体が一様に発光する測定対象(たとえば一様蛍光坂)に対しては、クロストークを起こして共焦点効果を得ることが難しく、特に信号強度が大きな場合はクロストークが顕著となり、焦点面の特定が困難であり、測定の誤差が大きくなる。

しかし、観察対象が微小な点(たとえば微小な蛍光ビーズ)などであれば、クロストークを起こしにくいため、共焦点効果により焦点面が確実となり測定誤差を低減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

即ち、共焦点顕微鏡のシェーディング測定において、視野内に１個だけ配置された微小な蛍光ビーズを測定対象とし、測定試料を移動する移動手段を用いて視野内の所定の位置に測定試料を移動させることにより、クロストークの影響を受けず正確なシェーディング測定ができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

蛍光ビーズが使用されたので、蛍光ビーズの直径を適宜選択することにより、蛍光ビーズの直径により試料の厚み方向の大きさを制御でき、測定ターゲットの正確な厚さが容易に作ることができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項２によれば、次のような効果がある。
測定試料は、スライドグラスの一方の面に一方の面が接して設けられ蛍光ビーズを固定するための封入体と、この封入体に展開された蛍光ビーズと、封入体の他方の面に一方の面が接して設けられたカバーグラスとを具備したので、取り扱いが容易な顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項３によれば、次のような効果がある。
移動手段は、ＸＹＺステージが使用されたので、ＸＹＺの三方向の試料の測定が精度良く正確にできる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項４によれば、次のような効果がある。
移動手段は、ＸＹステージが使用されたので、Ｚ方向は、顕微鏡の対物レンズをＺ方向に移動させる機構を利用でき、安価な顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項５によれば、次のような効果がある。
画像処理部には、測定試料を移動手段で移動させながら撮影された所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する変換手段を有するので、取得画像を１枚にまとめられるため、データ処理対象は１枚のみとなり、保存データ量が軽減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。
また、解析対象を１枚の画像とすることが可能となるため、データ処理時の作業量が軽減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項６によれば、次のような効果がある。
変換手段は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）が使用されたので、所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する作業が確実安定にできる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

本発明の請求項７によれば、次のような効果がある。
蛍光ビーズは、所定の蛍光試薬で多重染色された多重染色蛍光ビーズが使用されたので、蛍光ビーズのＸＹＺの三方向すべての位置を正確に制御しながら、必要とされる励起波長による観察像を必要に応じて撮影することが可能となり、それぞれの励起波長における観察像の色収差による誤差を補正するための測定値を得ることができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

以下本発明を図面を用いて詳細に説明する。
図１は本発明の一実施例の要部構成説明図、図２は図１の要部構成説明図、図３，図４は図１の動作説明図である。
図において、図５と同一記号の構成は同一機能を表す。
以下、図５との相違部分のみ説明する。

図１において、測定試料１１は、視野内に蛍光ビーズが１個になるように配置されている。
測定試料１１は、この場合は、図２に示す如く、スライドグラス１１１と封入体１１２と蛍光ビーズ１１３とカバーグラス１１４とを有する。
封入体１１２は、スライドグラス１１１の一方の面に一方の面が接して設けられ蛍光ビーズ１１３を固定する。

蛍光ビーズ１１３はこの封入体１１２に展開されている。この場合は、直径１０−０．０５ｕｍの蛍光ビーズが使用されている。
この場合は、蛍光ビーズ１１３は、さまざまな蛍光試薬で多重染色したものが使用されている。

カバーグラス１１４は、封入体２１１の他方の面に一方の面が接して設けられている。
一例として、封入体１１２は、厚さが１００μｍ以下、カバーグラス１１４の厚さが０．１７μｍが使用されている。

蛍光ビーズ１１３は封入体１１２の濃度を設定することにより視野に１個となるように配置されている。
封入体１１２の必要とされる濃度は、顕微鏡の視野内にビーズが１個あるような濃度である。

ただし、本発明の場合、視野内で蛍光ビーズ１１３を移動することになるため、蛍光ビーズ１１３が１つだけ存在してほしい空間、すなわち１個の蛍光ビーズ１１３当たりの占有体積は、蛍光ビーズ１１３が視野内のどこに移動しても視野内に蛍光ビーズ１１３が１個しかないことを満たす大きさでなくてはならない。

たとえば隣接する２個の視野範囲において蛍光ビーズ１１３が２個存在するとき、最悪の場合には、両者の境界に蛍光ビーズ１１３が局在し、蛍光ビーズ１１３が隣り合わせる可能性がある。
視野内に１個の蛍光ビーズ１１３を確実に満たすためには、顕微鏡視野の半径の倍のから４倍の範囲において蛍光ビーズ１１３が１個しかないことが必要である。

移動手段１２は、測定試料１１の移動を移動する。
この場合は、ＸＹＺステージが使用されている。
移動コントローラ１３は、移動手段１２の移動を制御する。
操作コントローラ１４は、移動手段コントローラ１３とカメラ４とを操作する。
画像処理部１５は、カメラ４による顕微鏡写真を画像処理する。

画像処理部１５には、測定試料１１を移動手段１２で移動させながら撮影された所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する変換手段１６を有する。
この場合は、変換手段１６は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）が使用されている。

以上の構成において、顕微鏡視野内に蛍光ビーズ１１３が一個になるように視野を設定する。
ＸＹＺステージ１２のＺステージの操作により焦点面を決定する。
図３に示す如く、蛍光ビーズ１１３をＸＹＺステージ１２のＸＹステージで移動させながら、光量分布を測定するのに充分な点数の顕微鏡写真Ａ１，Ａ２，Ａ３……を撮影する。矢印は測定順序を示す。

図４に示す如く、撮影された画像は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）を用いて一枚の画像Ｂに変換する。
変換後の画像より、蛍光ビーズ１１３が存在していた位置およびその位置での強度を計測する。

この結果、
マルチピンホールを採用した共焦点スキャナにおいては、視野全体が一様に発光する測定対象(たとえば一様蛍光坂)に対しては、クロストークを起こして共焦点効果を得ることが難しく、特に信号強度が大きな場合はクロストークが顕著となり、焦点面の特定が困難であり、測定の誤差が大きくなる。

しかし、観察対象が微小な点(たとえば微小な蛍光ビーズ１１３)などであれば、クロストークを起こしにくいため、共焦点効果により焦点面が確実となり測定誤差を低減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

即ち、共焦点顕微鏡のシェーディング測定において、視野内に１個だけ配置された微小な蛍光ビーズ１１３を測定対象とし、測定試料を移動する移動手段１２を用いて視野内の所定の位置に測定試料１１を移動させることにより、クロストークの影響を受けず正確なシェーディング測定ができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

蛍光ビーズ１１３が使用されたので、蛍光ビーズ１１３の直径を適宜選択することにより、蛍光ビーズ１１３の直径により試料の厚み方向の大きさを制御でき、測定ターゲット１１の正確な厚さが容易に作ることができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

測定試料１１は、スライドグラス１１１の一方の面に一方の面が接して設けられ蛍光ビーズ１１３を固定するための封入体１１２と、この封入体１１２に展開された蛍光ビーズ１１３と、封入体１１２の他方の面に一方の面が接して設けられたカバーグラス１１４とを具備したので、取り扱いが容易な顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

移動手段１２は、ＸＹＺステージが使用されたので、ＸＹＺの三方向の試料の測定が精度良く正確にできる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。
なお、移動手段１２に、ＸＹステージが使用されれば、Ｚ方向は、顕微鏡２の対物レンズをＺ方向に移動させる機構を利用でき、安価な顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

画像処理部１５には、測定試料１１を移動手段１２で移動させながら撮影された所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する変換手段１６を有するので、取得画像を１枚にまとめられるため、データ処理対象は１枚のみとなり、保存データ量が軽減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。
また、解析対象を１枚の画像とすることが可能となるため、データ処理時の作業量が軽減できる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

変換手段１６は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）が使用されたので、所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する作業が確実安定にできる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

蛍光ビーズ１１３は、所定の蛍光試薬で多重染色された多重染色蛍光ビーズ１１３が使用されたので、蛍光ビーズ１１３のＸＹＺの三方向すべての位置を正確に制御しながら、必要とされる励起波長による観察像を必要に応じて撮影することが可能となり、それぞれの励起波長における観察像の色収差による誤差を補正するための測定値を得ることができる顕微鏡視野光量分布測定装置が得られる。

なお、前述の実施例においては、移動手段１２は、ＸＹＺステージが使用されていると説明したが、移動手段１２は、ＸＹステージを使用し、Ｚステージの替わりに顕微鏡対物レンズをＺ方向に移動させて、測定を行ってもよいことは勿論である。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。
したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明の一実施例の要部構成説明図である。 図１の要部構成説明図である。 図１の動作説明図である。 図１の動作説明図である。 従来より一般に使用されている従来例の構成説明図である。

符号の説明

１ 共焦点顕微鏡本体部
２ 顕微鏡
３ 共焦点スキャナ
４ カメラ
５ 制御用パソコン
６ 一様蛍光板
１１ 測定試料
１１１ スライドグラス
１１２ 封入体
１１３ 蛍光ビーズ
１１４ カバーグラス
１２ 移動手段
１３ 移動コントローラ
１４ 操作コントローラ
１５ 画像処理部
１６ 変換手段
Ａ１ 顕微鏡写真
Ａ２ 顕微鏡写真
Ａ３ 顕微鏡写真
…………
…………
Ｂ 画像

Claims (7)

1. 顕微鏡と共焦点スキャナにより構成される共焦点顕微鏡と、この顕微鏡写真の撮影のためのカメラとを具備する顕微鏡視野光量分布測定装置において、
   視野内に蛍光ビーズが１個になるように配置された測定試料と、
   この測定試料を移動する移動手段と、
   この移動手段の移動を制御する移動コントローラと、
   この移動コントローラと前記カメラとを操作する操作コントローラと、
   前記顕微鏡写真を画像処理する画像処理部と
   を具備したことを特徴とする顕微鏡視野光量分布測定装置。
2. 前記測定試料は、スライドグラスの一方の面に一方の面が接して設けられ蛍光ビーズを固定するための封入体と、
   この封入体に展開された蛍光ビーズと、
   前記封入体の他方の面に一方の面が接して設けられたカバーグラスと
   を具備したことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
3. 前記移動手段は、ＸＹＺステージが使用されたこと
   を特徴とする請求項１又は請求項２記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
4. 前記移動手段は、ＸＹステージが使用されたこと
   を特徴とする請求項１又は請求項２記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
5. 前記画像処理部には、前記測定試料を前記移動手段で移動させながら撮影された所定枚数の顕微鏡写真を一枚の画像に変換する変換手段を有すること
   を特徴とする請求項１乃至請求項４の何れかに記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
6. 前記変換手段は、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法（ＭＩＰ法）が使用されたこと
   を特徴とする請求項５記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
7. 前記蛍光ビーズは、所定の蛍光試薬で多重染色された多重染色蛍光ビーズが使用されたこと
   を特徴とする請求項１乃至請求項６の何れかに記載の顕微鏡視野光量分布測定装置。
   
   

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