JP2007151498A - 連結分子モーター及びａｔｐセンサー - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＴＰ濃度が低い場合であっても連続的に回転でき、ナノアクチュエーター又は高感度センサーとして応用可能なトルクを有する連結分子モーターを提供すること。
【解決手段】少なくともαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットから構成されるＦ_１−ＡＴＰアーゼの２つを連結させた連結分子モーターであって、前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの、αサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対向するように、２つの前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの連結が生じている連結分子モーター。
【選択図】なし

Description

本発明は、連結分子モーター及びそれを用いたＡＴＰセンサーに関する。

真核生物のミトコンドリア内膜等に存在するＦ_０Ｆ_１−ＡＴＰ合成酵素のＦ_１部分にはＡＴＰを加水分解する触媒部位があり、３個のα、３個のβ及び１個のγサブユニットを含むＦ_１−ＡＴＰａｓｅは、トルク発生装置を備える分子モーターとして機能することが知られている（非特許文献１）。最近では、Ｆ_１−ＡＴＰａｓｅの分子モーターとしての性質が、ナノアクチュエーター又は高感度センサーに応用可能であるとして期待されている（特許文献１）。

一方、食品、医薬品等の製造、臨床医学、臨床検査、基礎研究等の現場では、試料中の細胞の有無の判定又は細胞数の測定等を目的として、ＡＴＰの測定が行なわれている。特に、製造業の分野では、製品の品質管理及び環境衛生の観点から、原料、中間体、製品及び環境への微生物（菌類、細菌類等）の汚染を防止することが責務とされている（特許文献２）。

ＡＴＰの測定は、まず、ＡＴＰ抽出試薬を試料に添加してＡＴＰを抽出し、その後、抽出されたＡＴＰを定量する方法が一般的である。ＡＴＰ抽出試薬としては、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、界面活性剤等が使用され、ＡＴＰの定量方法としては、抽出されたＡＴＰにルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム等を含む生物発光試薬を添加し、ＡＴＰとの反応で生じる発光をルミノメーター等の測定器で測定する方法が使用される（非特許文献２）。
特開２００５−２２９８７５号公報 特開２００３−３３４０７０号公報 Ｉｔｏｈ，Ｈら、ＮＡＴＵＲＥ、２００４年、４２７：４６５−４６８ 倉田浩、「ＡＴＰバイオルミネッセンス法の微生物汚染対策への有効性」、月刊フードケミカル、１９９５年、５号、ｐ．５５−６３

しかしながら、上記Ｆ_１−ＡＴＰａｓｅからなる分子モーターは、ＡＴＰ濃度が低い場合には不連続な回転となり、生体組織に近いＡＴＰ濃度では、回転速度を数値化することが困難であった。また、分子モーターをナノアクチュエーター又は高感度センサーとして応用するには、分子モーターのトルクを上げることが必要であった。この際、複数の分子モーターを同時に使用する試みも考えられるが、各分子モーターの動きを揃える（同期する）必要があるため、現状においては実用化が困難であった。

また、従来のＡＴＰ測定方法では、生物発光試薬等の指示薬を測定用試料に添加する必要があるため、測定用試料は繰り返して他の用途に使用できず、生体組織や細胞中におけるｉｎ ｓｉｔｕでのＡＴＰ測定が原理的に不可能であった。

そこで、本発明の目的は、ＡＴＰ濃度が低い場合であっても連続的に回転でき、ナノアクチュエーター又は高感度センサーとして応用可能なトルクを有する分子モーターを提供することにある。

本発明の連結分子モーターは、少なくともαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットから構成されるＦ_１−ＡＴＰアーゼの２つを連結させた連結分子モーターであって、上記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対向するように、２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼの連結が生じていることを特徴とする。

本発明の連結分子モーターは、分子モーターとして機能するＦ_１−ＡＴＰアーゼが２個連結したものであるが、αサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対向するように連結しているにも拘わらず、双方の回転が打ち消されることがなく、一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼの回転速度の２倍又はそれ以上の回転速度で他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼが回転する。また、ＡＴＰ濃度が低い場合であっても回転が途切れることなく連続的に回転する。したがって、本発明の連結分子モーターはナノアクチュエーター又は高感度センサーとして利用できる。また、高トルクの回転が可能になるため、既存の分子モーターでは回転が得られないような状況であっても分子モーターを適用できるようになる。

上記連結分子モーターの連結は、一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットにおける少なくとも２つのアミノ酸残基部分が、他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットにおける少なくとも２つのアミノ酸残基部分と、直接又はリンカーを介して結合することにより生じていることが好ましく、さらに、該連結は、一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第１の官能基２個と、他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第２の官能基２個とが、上記第１及び第２の官能基と反応性の第３の官能基を少なくとも４個備えるリンカーと結合することにより生じていることがより好ましい。ここで、第１の官能基と第２の官能基は同一であってもよい。

上記γサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基での連結は、２つの分子モーターのγサブユニットが対向する配置での連結を可能とするため、一方の分子モーターのトルクを他方の分子モーターに効率よく伝えることができ、強いトルクを有する連結分子モーターの提供が可能となる。

上記第１及び第２の官能基は、いずれも、上記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のシステイン残基にそれぞれビオチンを結合させて導入した同一の官能基であり、上記リンカーは、該第１及び第２の官能基と反応性の第３の官能基を少なくとも４個有するストレプトアビジンであることが好ましい。

このＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基がシステインである場合には、該システインの例えばＳＨ基にビオチンを特異的に結合させることが容易であり、ストレプトアビジンをリンカーとして用いることで、２つの分子モーターのγサブユニットが対向する配置で連結させることが可能となる。

また、ストレプトアビジンは、広範囲のｐＨ（ｐＨ２．０〜１０．０）で、ビオチンに対して高い親和性（Ｋｄ＝１０^−１５Ｍ）を有し、等電点が低いために非特異的結合が少なく、さらに、温度変化、イオン強度変化及び界面活性剤に対しても強い耐性を有している。従って、上記連結分子モーターの製造過程において、２つの分子モーターのγサブユニットを特異的に連結させることが可能となり、連結分子モーターの収率を高めることができる。さらに、上記連結分子モーターの連結部は、温度変化、イオン強度変化及び界面活性剤に対して耐性を有し、連結分子モーター本体についても壊れにくい性質を備えている。

本発明のＡＴＰセンサーは、上記連結分子モーターと観測用標識とを備えるＡＴＰセンサーであって、上記観測用標識は、上記連結分子モーターを構成する少なくとも一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、上記連結分子モーターと結合していることを特徴とする。上記観測用標識は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理されたビーズ状又は繊維状の観測用標識であり、上記少なくとも一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼは、αサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端に結合したヒスチジンタグからなるＮ末端部分を備えており、該観測用標識は、該Ｎ末端部分で上記連結分子モーターと結合していることが好ましい。

また、本発明のＡＴＰセンサーは、上記連結分子モーターと観測用標識と基板とを備えるＡＴＰセンサーであって、上記観測用標識は、上記連結分子モーターを構成する一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、上記連結分子モーターと結合しており、上記基板は、上記連結分子モーターを構成する他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、上記連結分子モーターと結合していることを特徴とする。上記観測用標識は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理されたビーズ状又は繊維状の観測用標識であり、上記基板は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理された基板であり、双方の上記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、αサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端に結合したヒスチジンタグからなるＮ末端部分を備えており、上記観測用標識は、一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼの該Ｎ末端部分で、上記連結分子モーターと結合しており、上記基板は、他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼの該Ｎ末端部分で、上記連結分子モーターと結合していることが好ましい。

本発明のＡＴＰセンサーは、連結分子モーターの回転を計測することでＡＴＰ濃度の測定が可能となるため、ＡＴＰ濃度を測定したい試料に、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等の生物発光試薬を外部から添加することなくＡＴＰ濃度を測定することが可能となる。さらに、ＡＴＰ濃度が低い生体組織や細胞であっても、ホモジナイズ等の処理をすることなく、ｉｎ ｓｉｔｕでＡＴＰ濃度を直接測定することが可能となる。

尚、上記ＡＴＰセンサーを構成するＦ_１−ＡＴＰアーゼは、通常、ＡＴＰ分解酵素として働くが、ＡＴＰを分解する方向とは逆方向に強制的にγサブユニットを回転させると、ＡＤＰと無機リン（Ｐｉ）の存在下でＡＴＰ合成酵素として働き、上記連結分子モーターの構造から、１回転当たり最大６個のＡＴＰを合成することも可能と考えられる。すなわち、上記ＡＴＰセンサーは、ＡＴＰ合成器としても使用することができる。

本発明の連結分子モーターは、ＡＴＰ濃度が低い場合であっても連続的に回転することが可能となり、ナノアクチュエーター又は高感度センサーとしての利用が可能となる。また、従来からの１個のＦ_１−ＡＴＰアーゼからなる分子モーターに加え、トルクの異なる連結分子モーターがラインナップされることになるため、分子モーターの応用範囲が広がる。

本発明のＡＴＰセンサーは、ＡＴＰ濃度を測定したい試料に、外部から生物発光試薬等の指示薬を添加することなくＡＴＰ濃度を測定することを可能とできる。また、ＡＴＰ濃度が低い生体組織や細胞であっても、ホモジナイズ等の処理をすることなく、ｉｎ ｓｉｔｕでＡＴＰ濃度を直接測定することが可能となる。

以下に、図面を参照しながら、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。尚、同一の要素には同一符号を用いるものとし、重複する説明は省略する。また、図面の比率は説明のものと必ずしも一致していない。

（連結分子モーター）
図１は、本発明の連結分子モーターの第一実施形態を示す斜視図である。

同図に示す連結分子モーター１００は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａとＦ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂが結合したものである。Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａは、１個のγサブユニット６ａの一端が突出するように、その周囲を３個のαサブユニット２ａと３個のβサブユニット４ａで取り囲んだ構成を有しており、αサブユニット２ａとβサブユニット４ａは交互に配列している。γサブユニット６ａの突出部には官能基７ａが存在しており、当該官能基７ａはγサブユニット６ａのアミノ酸残基に導入された官能基である。ここで「官能基」は、ＳＨ基のような基のみならず、他の分子と結合を生じる分子や分子団も含む概念（例えば、抗体と結合する抗原も官能基に含める）である（以下同様）。

一方、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂは、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａと同様の構成を有しており、１個のγサブユニット６ｂの一端が突出するように、その周囲を３個のαサブユニット２ｂと３個のβサブユニット４ｂで取り囲んだ構成を有しており、αサブユニット２ｂとβサブユニット４ｂは交互に配列している。γサブユニット６ｂの突出部には官能基７ｂが存在しており、当該官能基７ｂはγサブユニット６ｂのアミノ酸残基に導入された官能基である。

連結分子モーター１００は、γサブユニット６ａの突出部とγサブユニット６ｂの突出部とが対向するように、官能基７ａと官能基７ｂとが直接結合することにより、連結が生じている。

γサブユニット６ａ，６ｂの突出部が互いに対向する配置となるように、官能基７ａと官能基７ｂとが直接結合しているのは、連結分子モーター１００を構成するＦ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂそれぞれの回転運動が阻害されないようにするためである。

このような配置を実現するためには、例えば、一方のγサブユニットの突出部のアミノ残基に抗原となるタンパク質、ヒスチジンタグ又はビオチン等を結合させて官能基７ａとし、もう一方のγサブユニットの突出部のアミノ残基に、それぞれ対応する抗体、ニッケル化合物又はストレプトアビジン等を結合させて官能基７ｂとし、官能基７ａ及び官能基７ｂを結合させればよい。上記抗原タンパク質と抗体の組み合わせとしては、例えば、ｃ−Ｍｙｃと抗ｃ−Ｍｙｃ抗体、ＦＬＡＧと抗ＦＬＡＧ抗体、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と抗ＧＳＴ抗体が例示できる。

Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂは、いずれもＡＴＰの加水分解で生じるエネルギーを力学的エネルギーに変換し、γサブユニット６ａ，６ｂを回転させる回転型モーター（分子モーター）である。Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂの、αサブユニット２ａ，２ｂ及びβサブユニット４ａ，４ｂは、いずれもＡＴＰ結合部位を有し、βサブユニット６ａ，６ｂはさらに触媒活性をも有している。従って、ＡＴＰがαサブユニット２ａ，２ｂ並びにβサブユニット４ａ，４ｂの少なくとも一つのＡＴＰ結合部位に結合すると、βサブユニット４ａ及び／又はβサブユニット４ｂがＡＴＰ分解活性を発揮し、γサブユニット６ａ，６ｂが回転する。

ここで、γサブユニット６ａの回転方向と、γサブユニット６ｂの回転方向が同一方向であれば、双方の回転は打ち消されるはずであるが、本実施形態のような構成の連結分子モーター１００では、回転が打ち消されるどころか、一方の回転速度と他方の回転速度の和又はそれ以上で回転が生じる。このような現象が生じる理由については必ずしも明らかでないが、お互いのローターにトルクを印加し合うことによる強制的なインヒビション状態からの脱離に起因する可能性があると考えられる。

連結分子モーター１００は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂのどちらか一方のαサブユニット（２ａ又は２ｂ）又はβサブユニット（４ａ又は４ｂ）を基板に固定してＡＴＰと反応させれば、連結された２個のＦ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂを同期して回転させ、従来の分子モーターと比較して少なくとも２倍のトルクを発揮させることが容易となる。

次に、第一実施形態に係る連結分子モーターの製造方法について説明する。まず、連結分子モーターの構成ユニットであるＦ_１−ＡＴＰアーゼは、分子生物学的手法を用いて、以下のようにして作成できる。まず、必要とするＦ_１−ＡＴＰアーゼの起源となる細菌又は真核生物のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子及びγサブユニット遺伝子を取得する。遺伝子は、ＡＴＣＣ等の遺伝子バンクや試薬メーカー等から購入したり、自ら目的とする遺伝子をクローニングして取得することができる。

遺伝子のクローニング方法としては、例えば、公知であるＦ_１−ＡＴＰアーゼαサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子及びγサブユニット遺伝子の塩基配列を基にＤＮＡプローブを調製し、目的とする生物種のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法や、上記塩基配列を基にプライマーセットを合成し、目的とする生物種の全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行う方法が挙げられる。

次に、得られたＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子及びγサブユニット遺伝子を市販の発現ベクターのプロモーターの下流に組み込み、プロモーターに対応した宿主で３種類のタンパク質を同時に発現させれば、目的とするＦ_１−ＡＴＰアーゼが再構成される。

ここで、再構成されたＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対抗するように連結するため、上記γサブユニット遺伝子にはアミノ酸置換を引き起こすトリプレット変異を導入することができる。トリプレット変異は、２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼを直接又はリンカーを介して結合きるアミノ酸への置換を実現できればよく、２以上のアミノ酸残基を置換することが好ましく、システイン残基への置換を実現する変異がより好ましい。

Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子及びγサブユニット遺伝子を発現させ、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを再構成するための適当な宿主−ベクター系としては、大腸菌及び枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞等の真核細胞の系が挙げられる。例えば、大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＴＤ・Ｔ７、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が例示でき、真核生物用発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。発現ベクターを細胞に導入するには、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。

さらに、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを用いれば、小麦胚芽抽出物等のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを再構成できる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６等が例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II等が例示できる。

形質転換細胞で発現させ再構成されたＦ_１−ＡＴＰアーゼを精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。

精製されたＦ_１−ＡＴＰアーゼは、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対抗するように連結するが、このために上記γサブユニット遺伝子に導入したトリプレット変異を利用することができる。例えば、上記のトリプレット変異により２以上のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されていれば、該システイン残基をビオチンマレイミドと反応させて、該システイン残基にビオチンを結合させ、ストレプトアビジンをリンカーに用いることにより、２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼを連結できる。

図２は、本発明の連結分子モーターの第二実施形態を示す斜視図である。

同図に示す連結分子モーター２００は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａとＦ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂがリンカー９を介して結合したものである。Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａは、１個のγサブユニット６ａの一端が突出するように、その周囲を３個のαサブユニット２ａと３個のβサブユニット４ａで取り囲んだ構成を有しており、αサブユニット２ａとβサブユニット４ａは交互に配列している。一方、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂは、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａと同様の構成を有しており、１個のγサブユニット６ｂの一端が突出するように、その周囲を３個のαサブユニット２ｂと３個のβサブユニット４ｂで取り囲んだ構成を有しており、αサブユニット２ｂとβサブユニット４ｂは交互に配列している。

連結分子モーター２００は、γサブユニット６ａの突出部とγサブユニット６ｂの突出部とが対向するように、第１の官能基８ａ及び第２の官能基８ｂがリンカー９と結合することにより、連結が生じている。

連結分子モーター２００においても、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａ，１０ｂは分子モーターであるため、ＡＴＰがαサブユニット２ａ，２ｂ並びにβサブユニット４ａ，４ｂの少なくとも一つのＡＴＰ結合部位に結合すると、βサブユニット４ａ及び／又はβサブユニット４ｂがＡＴＰ分解活性を発揮し、γサブユニット６ａ，６ｂが回転する。また、連結分子モーター２００においても、連結分子モーター１００の場合と同様に、一方の分子モーターの回転速度に他方の分子モーターの回転速度を加えた速度又はそれ以上の速度で回転が生じ、トルクも２倍以上となる。

連結分子モーター２００においては、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａのγサブユニット６ａのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第１の官能基８ａの２個と、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂのγサブユニット６ｂのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第２の官能基８ｂの２個とが、第１の官能基８ａ及び第２の官能基８ｂと反応性の第３の官能基を４個備えるリンカー９と結合することが好ましい。

また、γサブユニット６ａ及び６ｂのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基は、予め変異を導入してアミノ酸置換を起こしたシステイン残基であることが好ましい。そして、第１の官能基８ａと第２の官能基８ｂは、いずれも、このように導入されたシステイン残基にビオチンを結合させることにより得られるメルカプト基（ＳＨ基）であることが好ましく、リンカー９は、このようにして得られた４つのＳＨ基と反応性を有する、ストレプトアビジンであることが好ましい。

次に、第二実施形態に係る連結分子モーターの製造方法について説明する。まず、第一実施形態で記載したようにしてＦ_１−ＡＴＰアーゼを再構成するが、再構成されたＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対抗するように連結するため、上記γサブユニット遺伝子にはアミノ酸置換を引き起こすトリプレット変異を導入することができる。トリプレット変異は、２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼを直接又はリンカーを介して結合きるように、γサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基の置換が実現できればよく、該アミノ酸残基がシステイン残基であることがより好ましい。

第一実施形態で記載したようにして精製されたＦ_１−ＡＴＰアーゼは、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対抗するように連結するが、このために上記γサブユニット遺伝子に導入したトリプレット変異を利用することができる。例えば、上記のトリプレット変異によりγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されていれば、該システイン残基をビオチンマレイミドと反応させて、該システイン残基にビオチンを結合させ、ストレプトアビジンをリンカーに用いることにより、２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼを連結できる。

（ＡＴＰセンサー）
図３は、本発明のＡＴＰセンサーの第一実施形態を示す斜視図であり、図４は、本発明のＡＴＰセンサーの第二実施形態を示す斜視図である。

図３に示すＡＴＰセンサー３００は、上述の連結分子モーター１００に観測用標識２０が結合したものであり、図４に示すＡＴＰセンサー４００は、上述の連結分子モーター２００に観測用標識２０及び基板３０が結合したものである。

ＡＴＰセンサー３００においては、観測用標識２０は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂのαサブユニット２ｂ及び／又はβサブユニット４ｂのＮ末端部分で、連結分子モーター１００と結合している。一方、ＡＴＰセンサー４００においては、観測用標識２０は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂのβサブユニット４ｂのＮ末端部分で連結分子モーター２００と結合しており、基板３０は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａのβサブユニット４ｂのＮ末端部分で連結分子モーター２００と結合している。

ＡＴＰセンサー４００において、観測用標識２０は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理されたビーズ状の観測用標識であり、基板３０は、Ｎｉ−ＮＴＡで表面処理された基板であり、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａは、βサブユニット４ａのＮ末端に結合したヒスチジンタグ１２からなるＮ末端部分を備えており、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂは、βサブユニット４ｂのＮ末端に結合したヒスチジンタグ１２からなるＮ末端部分を備えている。そして、観測用標識２０は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ｂのヒスチジンタグ１２からなるＮ末端部分で連結分子モーター２００と結合しており、基板３０は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ１０ａのヒスチジンタグ１２からなるＮ末端部分で連結分子モーター２００と結合している。なお、ヒスチジンタグ１２はαサブユニット２ａ，２ｂのＮ末端に形成させてもよく、αサブユニット２ａ，２ｂのＮ末端及びβサブユニット４ａ，４ｂのＮ末端に形成させてもよい。

観測用標識２０は、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ又アクチン繊維をＮｉ−ＮＴＡで表面処理したものが好ましく、基板３０は、ガラス板、プラスチック板又は金属板（特には、ガラス板）をＮｉ−ＮＴＡで表面処理したものが好ましい。

ＡＴＰセンサー３００においては、連結分子モーター１００が回転していることを、観測用標識２０を観測することにより検出して、ＡＴＰセンサーとして用いる。ＡＴＰセンサー４００においても同様に、連結分子モーター２００が回転していることを、観測用標識２０を観測することにより検出して、ＡＴＰセンサーとして用いる。ＡＴＰセンサー４００では、連結分子モーター２００の一端が基板３０に結合しているため、検出がより容易である。なお、連結分子モーター１００，２００の回転速度は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの基質であるＡＴＰ濃度に依存するため、観測用標識２０の回転速度を測定すれば、ＡＴＰ濃度を算出できる。

次に、第一実施形態に係るＡＴＰセンサーの製造方法について説明する。第一実施形態の連結分子モーターに観測用標識を結合させるため、上述したαサブユニット遺伝子及び／又はβサブユニット遺伝子に、アミノ酸置換を引き起こすためのトリプレット変異の導入をすることができる。また、翻訳後のタンパク質のＮ末端に、例えばヒスチジンタグが付加されるように、ヒスチジンタグ付加配列をその５’末端に付加することができる。

トリプレット変異は、観測用標識と直接又はリンカーを介して結合できればよく、アミノ酸置換後のアミノ酸残基がシステイン残基であることがより好ましい。システイン残基に置換されていれば、該システイン残基をビオチンマレイミドと反応させて、該システイン残基にビオチンを結合させ、ストレプトアビジンをリンカーに用いることにより、ビオチン化された観測用標識と連結することができる。また、翻訳後のタンパク質のＮ末端に、ヒスチジンタグが付加されれば、ニッケル分子との結合を介して、Ｎｉ−ＮＴＡ化された観測用標識と連結することができる。

ストレプトアビジンをリンカーとしてビオチン化したＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットと結合させる場合、観測用標識はビオチン化されている必要があり、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分のヒスチジンタグと結合させる場合、観測用標識はＮｉ−ＮＴＡで表面処理がされている必要がある。

次に、第二実施形態に係るＡＴＰセンサーの製造方法について説明する。第二実施形態の連結分子モーターに観測用標識を結合させるため、上述したαサブユニット遺伝子及び／又はβサブユニット遺伝子に、翻訳後のタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグが付加されるように、ヒスチジンタグ付加配列をその５’末端に付加することができる。翻訳後のタンパク質のＮ末端に、ヒスチジンタグが付加されれば、ニッケル分子との結合を介して、Ｎｉ−ＮＴＡ化された観測用標識と連結することができる。

観測用標識は、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分のヒスチジンタグと結合するためにはＮｉ−ＮＴＡで表面処理がされている必要がある。

上記の観測用標識が結合した連結分子モーターを基板上に固定させるため、上述したαサブユニット遺伝子及び／又はβサブユニット遺伝子に、翻訳後のタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグが付加されるように、ヒスチジンタグ付加配列をその５’末端に付加することができる。翻訳後のタンパク質のＮ末端に、ヒスチジンタグが付加されれば、ニッケル分子との結合を介して、Ｎｉ−ＮＴＡ化された基板と連結することができる。なお、基板と、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分のヒスチジンタグと結合するためにはＮｉ−ＮＴＡで表面処理がされている必要がある。

本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの調製）
まず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＰＳ３から全ＲＮＡを抽出し、これを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０７８０４のＴＦ１−ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ）、βサブユニット遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０７８０４のＴＦ１−ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ）及びγサブユニット遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０７８０４のＴＦ１−ｇａｍｍａ ｓｕｂｕｎｉｔ）をクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲに用いたＰＣＲプライマーは、各遺伝子の公知のｃＤＮＡ配列に基づいて設計し、逆転写反応及びＰＣＲは、逆転写酵素（サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム、インビトロジェン社）の製造元のプロトコールに従って行った。

その後、βサブユニット遺伝子は、翻訳後のタンパク質のＮ末端に１０残基のヒスチジンタグが付加されるように、ヒスチジンタグ付加配列（ｃａｃの繰り返し配列）を５’末端に付加し、γサブユニット遺伝子は、Ｎ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基がステイン残基に置換されるように、トリプレット変異（ａｇａ）を導入した。尚、αサブユニット遺伝子は、Ｎ末端から第１９３番目に存在する唯一のシステイン残基をセリン残基に変えている。

こうして得られたＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット遺伝子、ヒスチジンタグ付加配列を付加したβサブユニット遺伝子及びトリプレット変異を導入したγサブユニット遺伝子は、Ｍａｔｓｕｉらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９９５年、１２３１：１３９−１４６）に従って、大腸菌株ＪＭ１０３株Δ(ｕｎｃＢ-ｕｎｃＤ)と大腸菌発現用ベクターｐＫＫ２２３−３の系で同時に発現させ、Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを再構成させた。まず、上記の３種類の遺伝子は、大腸菌発現用ベクターｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモーターで制御されるように、αサブユニット遺伝子、トリプレット変異を導入したγサブユニット遺伝子及びヒスチジンタグ付加配列を付加したβサブユニット遺伝子の順に組み込み、大腸菌株ＪＭ１０３株Δ(ｕｎｃＢ-ｕｎｃＤ)に形質転換し、目的とする変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを発現するクローンを選択した。その後、得られた形質転換大腸菌クローンは大量に培養し、変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの精製に用いた。

大量培養した形質転換大腸菌は、遠心分離することによって集菌し、集菌バッファー（５０ｍＭＮａＰ_２ＰＯ_４、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）に懸濁した。大腸菌は、１０分間超音波処理により破砕し、６５℃で１０分間の熱処理を行った。熱処理により変性した蛋白質画分は、遠心分離を行うことによりペレットとして除去し、ヒスチジンタグを有する変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのみをＮｉ−アフィニティーカラム（キアゲン社）で精製した。その際、変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、０．３ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４を含む２５０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出された。溶出された変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ画分は、疎水性カラム（ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐａｌカラム；東ソー社）に供して、内在性のヌクレオチドを取り除き、限外濾過に供してイミダゾールを取り除き、最後にゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００；アマシャムファルマシア社）に供して精製した。こうして得られた変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、連結分子モーター及びシングル分子モーターを作成するための材料として以下の実験に用いた。

（連結分子モーターの調製）
まず、精製した変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元後、変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼに対して４倍量以上のビオチンマレイミドと反応させ、γサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のステイン残基にビオチンを結合させた（以下、このビオチン化された変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを、ビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼという）。

ゲル濾過により未反応のビオチンマレイミドを除去した後、ビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの半分量を新たなチューブに移し、そこにストレプトアビジンを加えることで、ビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのビオチンとストレプトアビジンとを結合させた（以下、このストレプトアビジンが結合された変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを、ストレプトアビジン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼという）。尚、未反応のストレプトアビジンは、ビオチンマレイミドの除去と同様にゲル濾過により除去した。

その後、ストレプトアビジン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼには、観測用標識であるＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズを加え、ストレプトアビジン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを構成するβサブユニットのＮ末端のヒスチジンタグとニッケル分子との結合を介して、Ｎｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズを結合させた（以下、このＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズが結合した変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを、Ｎｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズ結合変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼという。）。尚、未反応のＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズは、ゲル濾過により除去した。

残り半分のビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、βサブユニットのＮ末端のヒスチジンタグを介してカバーガラス上に表面処理されたＮｉ−ＮＴＡと結合させ、未反応のビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを洗い流した。こうして得られたカバーガラス上に固定されたビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼには、その後引き続き、５ｍｇ／ｍｌの牛血清を懸濁したバッファーに、等量のＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズ結合変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを加え、ビオチンとストレプトアビジンの結合を介して、両者を結合させた。その後、未反応のＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズ結合変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを洗い流すことにより、観測用標識としてＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズを有し、ガラス板上に固定された連結分子モーターを得た。尚、得られた連結分子モーターには、適当量のＭｇ−ＡＴＰを加えて実験に用いた。

（シングル分子モーターの調製）
連結分子モーターの性能を比較するために用いるシングル分子モーターは、以下のようにして調製した。

上記のビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、βサブユニットのＮ末端のヒスチジンタグとカバーガラス上に表面処理されたＮｉ−ＮＴＡとの結合を介してカバーガラス上に固定され、バッファー交換を数回繰り返すことにより、未反応のビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを洗い流した。

その後、カバーガラス板に固定されたビオチン化変異型Ｆ_１−ＡＴＰアーゼに観測用標識としてストレプトアビジン化磁気ビーズを加えて反応させて両者を結合させ、未反応のストレプトアビジン化磁気ビーズを十分に洗い流した。これにより、観測用標識としてＮｉ−ＮＴＡ化磁気ビーズを有し、ガラス板上に固定されたシングル分子モーターを得た。尚、得られたシングル分子モーターには、適当量のＭｇ−ＡＴＰを加えて、実験に用いた。

（実施例１）：シングル分子モーターと連結分子モーターの回転の比較
倒立顕微鏡下にシングル分子モーターと連結分子モーターとをそれぞれ設置し、透過光照明でそれぞれの分子モーターの回転をＣＣＤカメラでビデオ録画し、単位時間当たりの回転数を解析した。図５は、室温２３℃、ＡＴＰ濃度が２００ｎＭにおけるシングル分子モーターと連結分子モーターの単位時間当たりの回転数をプロットしたグラフである。

その結果、シングル分子モーターでは、分子モーターの回転を検出後４０秒から８０秒付近で回転が停止し、その後回転を再開したが、再度、９０秒付近で回転が停止した。一方、連結分子モーターでは、観測時間を通じて回転の停止は認められなかった。

また、シングル分子モーターと連結分子モーターの回転速度を比較した結果、連結分子モーターの回転速度はシングル分子モーターの回転速度と比較して２倍以上早いものであった。

第一実施形態の連結分子モーターを示す斜視図である。 第二実施形態の連結分子モーターを示す斜視図である。 第一実施形態のＡＴＰセンサーを示す斜視図である。 第二実施形態のＡＴＰセンサーを示す斜視図である。 連結分子モーターと従来の分子モーターの回転運動を比較した結果を示す図である。

符号の説明

２ａ，２ｂ・・・αサブユニット、４ａ，４ｂ・・・βサブユニット、６ａ，６ｂ・・・γサブユニット、７ａ，７ｂ・・・官能基、８ａ・・・第１の官能基、８ｂ・・・第２の官能基、９・・・リンカー、１０ａ，１０ｂ・・・Ｆ_１−ＡＴＰアーゼ、１２・・・ヒスチジンタグ、２０・・・観測用標識、３０・・・基板、１００，２００・・・連結分子モーター、３００，４００・・・ＡＴＰセンサー。

Claims (8)

1. 少なくともαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットから構成されるＦ_１−ＡＴＰアーゼの２つを連結させた連結分子モーターであって、
   前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの、αサブユニット及びβサブユニットから突出したγサブユニットの突出部が互いに対向するように、２つの前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの連結が生じている連結分子モーター。
2. 前記２つのＦ_１−ＡＴＰアーゼの連結は、
   一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットにおける少なくとも２つのアミノ酸残基部分が、他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットにおける少なくとも２つのアミノ酸残基部分と、直接又はリンカーを介して、結合することにより生じている、
   請求項１記載の連結分子モーター。
3. 前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼの連結は、
   一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第１の官能基２個と、
   他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のアミノ酸残基に導入された第２の官能基２個とが、
   前記第１及び第２の官能基と反応性の第３の官能基を少なくとも４個備えるリンカーと結合することにより生じている、
   請求項１又は２に記載の連結分子モーター。
4. 前記第１及び第２の官能基は、いずれも、前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットのＮ末端から第１０７番目と第２１０番目のシステイン残基にそれぞれビオチンを結合させて導入した、同一の官能基であり、
   前記リンカーは、該第１及び第２の官能基と反応性の第３の官能基を少なくとも４個有するストレプトアビジンである、
   請求項３記載の連結分子モーター。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の連結分子モーターと、観測用標識と、を備えるＡＴＰセンサーであって、
   前記観測用標識は、前記連結分子モーターを構成する少なくとも一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、前記連結分子モーターと結合しているＡＴＰセンサー。
6. 前記観測用標識は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理されたビーズ状又は繊維状の観測用標識であり、
   前記少なくとも一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼは、αサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端に結合した、ヒスチジンタグからなるＮ末端部分を備えており、
   前記観測用標識は、該Ｎ末端部分で前記連結分子モーターと結合している、請求項５記載のＡＴＰセンサー。
7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の連結分子モーターと、観測用標識と、基板と、を備えるＡＴＰセンサーであって、
   前記観測用標識は、前記連結分子モーターを構成する一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、前記連結分子モーターと結合しており、
   前記基板は、前記連結分子モーターを構成する他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼのαサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端部分で、前記連結分子モーターと結合している、ＡＴＰセンサー。
8. 前記観測用標識は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理されたビーズ状又は繊維状の観測用標識であり、
   前記基板は、ニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で表面処理された基板であり、
   双方の前記Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、αサブユニット及び／又はβサブユニットのＮ末端に結合した、ヒスチジンタグからなるＮ末端部分を備えており、
   前記観測用標識は、一方のＦ_１−ＡＴＰアーゼの該Ｎ末端部分で、前記連結分子モーターと結合しており、
   前記基板は、他方のＦ_１−ＡＴＰアーゼの該Ｎ末端部分で、前記連結分子モーターと結合している、請求項７記載のＡＴＰセンサー。
   
   

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