JP2007104939A - 核酸高分子の分解方法及び分解装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微粒子に結合したプローブ核酸高分子を標的核酸高分子の特定の位置で特異的相補鎖対形成(ハイブリダイズ)させ、次に微粒子を高エネルギー状態にすることにより、時間空間を制御して微粒子近傍の標的核酸高分子の部位を切断することができる。
【選択図】図2
Description
ョン(hybridization)という)、次に微粒子を高エネルギー状態にすることにより、時
間空間を制御して微粒子近傍の標的核酸高分子の部位を切断することができる。
物質状態や高圧状態も含む。また、「表面近傍」とは具体的には微粒子表面から外部または内部に100nm以下、好ましくは10nm以下、より好ましくは1nm以下の範囲のことをいう。
まず、標的核酸高分子(ターゲット核酸高分子)中の特定の部位に相補的に付加するプローブ核酸高分子と微粒子とを結合させ、プローブ核酸高分子結合微粒子を形成する。プローブ核酸高分子は、DNA、RNA及びPNAのうち少なくとも1つである。プローブ核酸高分子を標的核酸高分子の切断対象となる位置と相補的に付加するように適切に設計することにより、標的核酸高分子の目的の位置への特異性を付与することができる。この場合、制限酵素のような特異性付与に関する制限がない。
(b)PNAと標的核酸高分子とのハイブリダイゼーション反応が迅速に行われるため、DNAまたはRNAをプローブ核酸高分子として用いるより反応時間を大幅に短縮することができる。
(c)PNAは電荷のない中性の安定した骨格構造を有するため、溶液のpH、塩濃度等に影響されることなくハイブリダイゼーションが進行する。
(d)PNAは生体内に存在しない化学合成物質のため、核酸、タンパク分解酵素、加水分解等によりほとんど分解されることがない。
次に、前記プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子に標的核酸高分子を付加、すなわち標的核酸高分子の特定の位置でプローブ核酸高分子を特異的相補鎖対形成させて、付加微粒子を形成する。例えば、上記プローブ核酸高分子結合微粒子として、金微粒子にプローブDNAを結合させたものを用いた場合、プローブDNAを含む溶液と標的核酸高分子として標的DNAを含む溶液を混合し、ハイブリダイゼーションさせる。
最後に、付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にして、高エネルギー状態となった微粒子からの周囲へのエネルギー移動により標的核酸高分子を特定部位で分解する。
もよい。二本鎖核酸の場合、プローブ核酸高分子としてPNAを使用すると効率よく二本鎖核酸に入り込み、相補的な部位とハイブリダイズを起こさせることができる。
Wレーザー)の場合は、0.1mW〜10Wの範囲であることが好ましい。レーザー24の強度が大きいと標的核酸高分子28の分解効率が高くなるが、レーザー24の照射強度が100μJ/パルスより低いと、標的核酸高分子28の分解が進行しない場合があり、100mJ/パルスより大きいと、集光領域の大きさによっては、溶媒自体が誘電破壊する場合があり、さらには容器(セル)が損傷する場合がある。レーザー24等の強度を高くすると標的核酸高分子28の分解部分の範囲が大きくなるため、レーザー強度の調整により標的核酸高分子28の分解部分の範囲を制御することができる。
ギー移動により標的核酸高分子28が特定部位で分解される。エネルギー移動の形態としては、熱エネルギー、高エネルギーを有する微粒子30の構成粒子、またはそのイオンや電子等が考えられる。レーザー照射で金微粒子を高エネルギー状態にする場合を例に説明すると、金微粒子の表面プラズモン共鳴によりレーザー光を吸収した電子のエネルギーが金微粒子の格子の振動エネルギーに緩和し、固体状態の金微粒子が溶解を始める。溶液状態になった金微粒子はさらに蒸発して原子状になる。このようにして高エネルギー状態の金微粒子表面から放出された金原子、金クラスター、金イオン、電子、ラジカル等の高エネルギー粒子が金微粒子表面近傍に存在する標的核酸高分子28を分解すると考えられる。また、放出された電子はレーザーの強い電場で加速され、これが周囲の金原子や溶媒分子と衝突してこれをイオン化し、ここから放出された電子がさらに次の分子と衝突し、雪崩のようにプラズマ状態等の高エネルギー状態に移行する。これらの高エネルギー粒子は微粒子表面から数10nm以下の微粒子表面近傍に存在すると考えられるので、標的核酸高分子28の分解される部位も微粒子表面近傍に存在するものに限られる。すなわち、分解される標的核酸高分子の部位は、微粒子表面近傍に存在する数塩基程度の部位に限られるため、位置特異的切断が進行する。
る金原子のうち約10−4〜10−3の割合の金原子が電子を放出すると考えられる。ここで金微粒子中の金原子の密度は、〜6.0×1022atoms/cm3なので放出電子の密度は、〜1019/cm3以上となる。水中でのプラズマ形成に必要な電子密度〜1018/cm3より十分に大きい。
式で表される。
断することができる。その最大の長所は、(1)巨大なDNAでも望みの位置特異性をもって切断できることができる、(2)プローブ核酸高分子の用意が他の方法に比較して非常に簡単である、ことである。この方法を用いることにより、標的RNAの機能の発現を消失させ、生体内における疾患起因遺伝子または障害を起こす遺伝子の発現を防止することもできる。
<金微粒子の作製>
金微粒子はHAuCl4のクエン酸による還元法により作製した。1mMのHAuCl4水溶液10mLを撹拌しながら加熱して還流条件下においた。これに38.8mMのクエン酸三ナトリウムをすばやく加えた。溶液の色が黄色から深赤に変わったら、さらに15分間撹拌した。溶液を室温(25℃)まで下げ、径が0.45μmのフィルターに通した。このように合成した金微粒子の平均粒径については、HAuCl4とクエン酸の濃度を調整し、13nmになるようにした。
平均粒径13nmの金微粒子を含む水溶液に末端をチオール化したプローブDNA(50mer)を5μMの濃度で混ぜ16時間放置した。さらに0.1MのNaCl、10mMのリン酸緩衝液(pH=7.0)の溶液にし、さらに40時間放置した。そしてこれを遠心と再分散を3回繰り返し、余分な物質を除去した。
標的DNAのM13mp18ssDNA(一本鎖DNA 7249b.p.)と上記プローブ核酸高分子結合微粒子を混合し、5分間60℃に保温した。さらにこれを室温(25℃)で3時間放置した。アガロースゲル電気泳動により確認したところ、これではハイブリダイズしなかった。そこで、放置時間が足りないと考えられたので、50℃で48時間放置した。アガロースゲル電気泳動にてハイブリダイゼーションの確認を行った。ゲルの写真を図4と図5に示す。
置に観察された(図に点線を示す)。矢印Aは電気泳動の最前部を示す。これは標的DNAに金微粒子が結合したプローブDNAがハイブリダイズしていることを示している。ここで、溶液はリン酸バッファでpHを7.0に調整し、さらに0.1MのNaClを添加した。
上記で作製した金微粒子が結合した探索子用DNAと標的DNAとのハイブリッド(付加微粒子)を含む溶液50μLを底面が0.5cm×0.5cmのセルに入れ、波長532nmで1パルスあたり4mJレーザーを5分間照射した。レーザー光はレンズを用いて、(0.1mm)3程度になるように溶液中に集光した。この間、セルの底に長さ2mm幅1mmの撹拌子を入れ溶液を撹拌した。波長532nmは金微粒子の表面プラズモン共鳴に一致しているため、効率よく金微粒子を高エネルギー状態にすることができた。標的DNAの切断の確認はアガロースゲル電気泳動にて行った。
<金微粒子とプローブDNAとが結合したプローブ核酸高分子結合微粒子と標的DNAのハイブリダイズとその確認>
標的DNAのM13mp18ssDNA(一本鎖DNA 7249b.p.)(濃度1.8×10−8M)と、図7に示したDNA−1とDNA−2をそれぞれプローブDNAとして用いたものが結合した金微粒子(濃度5.4×10−8M)を混合し、30℃に保温した。溶液はリン酸バッファー(0.01M)でpHを7.0に調整し、さらに0.1MのNaClになるようにNaClを添加した。
作製した金微粒子が結合したプローブDNAと標的DNAのハイブリッド(付加微粒子)を含む溶液に波長532nmで1パルスあたり2mJのレーザーを5分間照射した(実施例1に比較してレーザー強度は弱い)。標的DNAの切断の確認はアガロースゲル電気泳動にておこなった。これを図8に示す。レーン1と2はそれぞれDNA−2とDNA−1をプローブDNAとして用いたものにレーザー照射したもの、レーン3と4はそれぞれDNA−2とDNA−1をプローブDNAとして用いたもののレーザー照射前のもの、MはRNAマーカーでその右側に塩基数を示した。左側の欄に表示した1、2、3merは標的核酸が1つの金微粒子にハイブリダイズした数を、A、Bはそれぞれレーン1と2に検出された標的DNAの切断生成物バンドの位置を示す(図に点線を示す)。標的位置に
よって長さの異なるDNAに切断されていることがアガロースゲル電気泳動で確認できた。
Claims (9)
- 標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解方法であって、
プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させて、プローブ核酸高分子結合微粒子を形成する工程と、
標的核酸高分子を前記プローブ核酸高分子結合微粒子に含まれるプローブ核酸高分子に付加させて、付加微粒子を形成する工程と、
前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にして、前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解する工程と、
を含むことを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項1に記載の核酸高分子の分解方法であって、
生成する前記高エネルギーの領域は微小な領域であることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項1または2のいずれか1項に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記微粒子に電磁波、音波及び超音波のうちの少なくとも1つを照射することによって、前記微粒子を高エネルギー状態にすることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項3に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記電磁波は、レーザーであることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記微粒子は、金属微粒子であることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記標的核酸高分子は、DNA及びRNAのうち少なくとも1つであることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸高分子の分解方法であって、
前記プローブ核酸高分子は、DNA、RNA及びPNAのうち少なくとも1つであることを特徴とする核酸高分子の分解方法。 - 標的核酸高分子を分解する核酸高分子の分解装置であって、
プローブ核酸高分子と微粒子とを結合させ、前記プローブ核酸高分子に標的核酸高分子を付加させた付加微粒子を収容するための収容部と、
前記付加微粒子に含まれる微粒子を高エネルギー状態にするためのエネルギー供給手段と、
を有し、
前記高エネルギー状態となった微粒子からのエネルギー移動により前記標的核酸高分子を分解することを特徴とする核酸高分子の分解装置。 - 請求項8に記載の核酸高分子の分解装置であって、
さらに、前記収容部中の付加微粒子を分散させるための分散手段を有することを特徴とする核酸高分子の分解装置。
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