JP2007097420A - アポトーシス誘導遺伝子ｐｌ−３およびｐｌ−３蛋白を標的としたアポトーシス関連疾患の治療および予防 - Google Patents

Abstract

【課題】アポトーシス関連疾患を予防および治療するための手段を提供する。
【解決手段】アポトーシス誘導遺伝子ＰＬ−３およびＰＬ−３蛋白を標的としたアポトーシス抑制因子または促進因子、それらの使用、およびそれらのスクリーニング方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、アポトーシス誘導遺伝子ＰＬ−３およびＰＬ−３蛋白を標的としたアポトーシス抑制因子または促進因子、ならびにそれらの使用に関する。さらに本発明は、かかる因子のスクリーニング方法等にも関する。

心筋梗塞や脳梗塞のごとき虚血性疾患はアポトーシスにより引き起こされることが知られている（非特許文献１参照）。心筋梗塞は動脈硬化によって血管が閉塞し、血流が途絶することによって心筋細胞がアポトーシスを起こした病態である。同様に脳梗塞は脳の細胞がアポトーシスを起こした病態である。これらのアポトーシスは虚血によって細胞に十分な酸素が供給されなくなったために起こる。従来これらのアポトーシスを防止する確実な方法はなく、従来の治療方法は血流を再開する方法が中心であった。このような従来の治療方法では、心筋梗塞や脳梗塞のようなアポトーシス関連疾患を十分に治療および予防することは不可能であった。

本発明者らは、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）欠損マウスの動脈硬化症の病巣から、該細胞において特異的に発現している遺伝子をクローニングし、この遺伝子の発現によりアポトーシスが誘導されることを明らかにしている（特許文献１参照）。しかしながら、このようなアポトーシス誘導遺伝子やその産物である蛋白を標的とした、動脈硬化によるアポトーシスあるいはアポトーシス関連疾患の治療や予防のための具体的手段は詳細に検討されていなかった。
国際公開ＷＯ２００３／０７０９５１明細書

本発明が解決しようとする課題は、動脈硬化によるアポトーシスあるいは心筋梗塞や脳梗塞のようなアポトーシス関連疾患を十分に予防および治療するための具体的手段を提供することであった。

本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アポトーシス遺伝子ＰＬ−３およびＰＬ−３蛋白を標的としてアポトーシスを抑制することにより、動脈硬化あるいは心筋梗塞や脳梗塞のようなアポトーシスに関連する虚血性疾患を十分に治療および予防できることを見出し、本発明を完成するに至った。詳細には、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはｓｉＲＮＡ等の因子を製造し、さらにはＰＬ−３遺伝子およびＰＬ−３蛋白の発現および作用を抑制する物質を見出し、これらを用いて効果的に上記疾患を治療または予防できることを見出した。さらにアポトーシスを抑制または促進する因子、ならびにそれらのスクリーニング方法も開発した。

すなわち本発明は、下記のものを提供する。
（１）ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を抑制する因子。
（２）アンチセンスプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよび低酸素条件からなる群より選択される（１）記載の因子。
（３）アンチセンスオリゴヌクレオチドである（１）記載の因子。
（４）下記のいずれかのヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：８に示すヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
を有する（３）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（５）ｓｉＲＮＡである（１）記載の因子。
（６）下記のいずれかのヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：９、１０または１１に示すヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイゼーションする配列
を有する（５）記載のｓｉＲＮＡ。
（７）低酸素条件である（１）記載の因子。
（８）ＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子。
（９）ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）からなる群より選択される（８）記載の因子。
（１０）ＰＬ−３蛋白に対する抗体。
（１１）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の因子を含む、アポトーシスを抑制することが有益な疾患を治療するための医薬組成物。
（１２）該疾患が動脈硬化、心筋梗塞または脳梗塞である（１１）記載の医薬組成物。
（１３）ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子。
（１４）リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび過酸化水素からなる群より選択される（１３）記載の因子。
（１５）ＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子。
（１６）リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび過酸化水素からなる群より選択される（１５）記載の因子。
（１７）（１３）ないし（１６）のいずれかに記載の因子を含む、アポトーシスを促進することが有益な疾患を治療するための医薬組成物。
（１８）該疾患が癌、動脈硬化または自己免疫疾患である（１７）記載の医薬組成物。
（１９）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の因子で処理された細胞。
（２０）（１３）ないし（１６）のいずれかに記載の因子で処理された細胞。
（２１）下記工程：
（ｉ）ＰＬ−３ ＤＮＡを発現している細胞を候補薬剤の存在下で培養し、次いで、
（ｉｉ）候補薬剤の不存在下で同様に培養を行った場合と比較して、細胞のアポトーシスを抑制または促進する候補薬剤を見出す
を特徴とする、アポトーシス抑制または促進因子のスクリーニング方法。
（２２）（２１）記載の方法により見出されるアポトーシス抑制または促進因子。

本発明によれば、アポトーシス遺伝子ＰＬ−３およびＰＬ−３蛋白を標的としてアポトーシスを抑制することにより、アポトーシスの抑制が有益な疾患、例えば、動脈硬化によるアポトーシスあるいは心筋梗塞や脳梗塞のようなアポトーシスに関連する虚血性疾患を十分に治療および予防することができる。また、アポトーシスの促進が有益な疾患、例えば、癌を治療または予防することもできる。さらに、アポトーシスを抑制する因子または促進する因子、ならびにそれらのスクリーニング方法も提供される。

本発明は第１の態様において、ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を抑制する因子に関するものである。本明細書において、ＰＬ−３ ＤＮＡとは下記のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ
あるいは
（ｄ）配列番号：２に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡに対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ
をいう。

ＰＬ−３ ＤＮＡの典型例は、配列番号：１に示すマウス平滑筋由来のヌクレオチド配列を有するもので、本明細書において-Ａｐｏｐ−１ ＤＮＡと称される。また、配列番号：１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡもＰＬ−３ ＤＮＡに包含される。さらなる態様において、上記相同性は、好ましくは少なくとも８５％、そのうえさらに好ましくは少なくとも９０％である。また、Ａｐｏｐ−１ ＤＮＡのスプライスバリアントもＰＬ−３ ＤＮＡに包含され、本明細書においてＡｐｏｐ−２ ＤＮＡと称される（そのヌクレオチド配列を配列番号：２に示す）。配列番号：２に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、そのうえさらに好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡもＰＬ−３ ＤＮＡに包含される。さらなる態様において、上記相同性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％である。したがって、ヒトおよびその他の哺乳動物のＰＬ−３カウンターパートであるＤＮＡもＰＬ−３ ＤＮＡに包含される。本発明のＰＬ−３ ＤＮＡのさらなる典型例として、ヒトのＰＬ−３ ＤＮＡがあり、そのヌクレオチド配列を配列番号：３に示す。

これらのＰＬ−３ ＤＮＡが発現することにより、細胞、特に平滑筋細胞や神経細胞におけるアポトーシスが惹起される。

なお、本明細書において、ＰＬ−３ ＤＮＡを含む遺伝子をＰＬ−３遺伝子ということがある。また本明細書において、ＰＬ−３遺伝子の発現という場合にはＰＬ−３ ＤＮＡの発現を包含する。

さらに、上記ＰＬ−３ ＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡもやはりＰＬ−３ ＤＮＡに包含されるものとする。ここに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であるが、例えば、０．５ｘ ＳＳＣ ０．１％ ＳＤＳで５５℃ ３０分間の洗浄、あるいは０．２ｘ ＳＳＣ ０．１％ ＳＤＳで６５℃ １５分間の洗浄といった条件が挙げられる。さらに、配列番号：１または２に示すヌクレオチド配列において、１個ないし複数個のヌクレオチドが置換、欠失または付加されているヌクレオチド配列、あるいはそれらの組み合わせを含んでいるヌクレオチド配列を有するＤＮＡもＰＬ−３ ＤＮＡに包含されるものとする。ここで、複数個とは好ましくは約１２０個、より好ましくは約９０個、さらに好ましくは約６０個を意味する。

これらのＰＬ−３遺伝子の発現を抑制することにより、細胞、特に平滑筋細胞や神経細胞におけるアポトーシスを抑制することができる。例えば、ＰＬ−３遺伝子の発現あるいはその発現産物である蛋白の作用を抑制する因子でもって細胞、特に平滑筋細胞や神経細胞を処理することによって、これらの細胞におけるアポトーシスを抑制することができる。したがって、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子で処理された細胞、特に平滑筋細胞や神経細胞も本発明の１態様であり、かかる細胞を用いて、アポトーシスの抑制が有益な疾患を治療することができる。

アポトーシスの抑制が有益な疾患としては、動脈硬化、血栓症、心筋梗塞、脳梗塞などが挙げられる。動脈硬化の場合は、動脈硬化により生じた血管の閉塞によりその下流が虚血状態となり、アポトーシスが起こる。血栓の下流においても同様にアポトーシスが起こる。また、種々の要因により虚血状態に陥った部位においてアポトーシスが起こった結果として心筋梗塞や脳梗塞が生じる。本発明のＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子は、かかるアポトーシスが原因となる疾病を治療または予防するのに有用である。

ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子は、ＰＬ−３遺伝子の合成を抑制するものであってもよく、あるいはＰＬ−３遺伝子の作用および機能を抑制するものであってもよい。本明細書において、特に断らないかぎり、遺伝子の「発現を抑制する」とは、その遺伝子の発現を通常レベルよりも低下させること、ならびに完全に消失させてしまうことを包含する。具体的には、遺伝子の「発現を抑制する」とは、その遺伝子の合成を不活性化あるいは消失させること、その遺伝子の制御・調節機構を発現抑制の方向にシフトさせることなどを包含する。例えば、ＰＬ−３遺伝子を、公知の方法によりノックダウン、ノックアウト、あるいは欠失させてもよい。また例えば、同種の機能を有する蛋白、例えばアイソザイムをコードする遺伝子が複数ある場合において、それらの遺伝子のうち１つまたはそれ以上、あるいはすべての発現を抑制してもよい。本明細書において、特に断らない限り、遺伝子という場合はＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。したがって、「ＰＬ−３遺伝子」とは、ＤＮＡであるＰＬ−３遺伝子のみならずその対応ＲＮＡも包含する。

ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子の例としては、ＰＬ−３のアンチセンスを発現するアンチセンスプラスミド、ＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡを包含）、ＰＬ−３ ＤＮＡに対するＳｉＲＮＡ等の因子や薬剤、あるいは低酸素条件等が挙げられるが、これらに限らない。低酸素条件における酸素濃度は、３％未満、好ましくは１％未満である。ＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやＰＬ−３ ＤＮＡに対するｓｉＲＮＡはＰＬ−３遺伝子に対する特異性が高く、ノックダウンあるいはノックアウト効率も高く、副作用のリスクも小さいという利点を有する。そのうえこれらの因子の細胞への導入方法（例えば、トランスフェクション法）も確立されており、導入が容易で使用しやすいという利点もある（ｓｉＲＮＡ導入用キットも市販されている）。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡの設計・製造方法は当業者に公知であり、商業的にオーダーメードすることにより入手することもできる。

好ましいＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
下記のいずれかのヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：８に示すヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
を有するものである。

本発明のＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％の相同性、そのうえさらに好ましくは８０％の相同性を有する。さらなる態様において、上記相同性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％である。また、上記ヌクレオチド配列において、１個ないし複数個のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されたヌクレオチド配列、あるいはそれらの組み合わせを含むヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも好ましい。ここに、複数個とは好ましくは約１２０個、より好ましくは約９０個、さらに好ましくは約６０個を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを適当なベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターなど）中に組み込むことにより得られた構築物を細胞に導入して行うことが一般的であるが、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ＨＶＪリポソーム、リポフェクション等の方法により導入してもよい。

ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する好ましい因子として、さらにｓｉＲＮＡが挙げられる。ＰＬ−３ ＤＮＡに対する好ましいｓｉＲＮＡは、
下記のいずれかのヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：９、１０または１１に示すヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイゼーションする配列
を有するものである。

本発明のＰＬ−３ ＤＮＡに対するｓｉＲＮＡは、配列番号：９、１０または１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、そのうえさらに好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる態様において、上記相同性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％である。また、上記ヌクレオチド配列において、１個ないし複数個のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されたヌクレオチド配列、あるいはそれらの組み合わせを含むヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡも好ましい。ここに、複数個とは好ましくは４個、より好ましくは３個、さらに好ましくは２個を意味する。

好ましくは、ｓｉＲＮＡはアンチセンスＲＮＡｉ配列であり（配列番号：９、１０または１１はすべてアンチセンスＲＮＡｉ配列である）、公知の方法で合成することができる。不安定なｓｉＲＮＡを安定化させるために、３’末端にｄＴｄＴ配列を付加してもよい。ｓｉＲＮＡの細胞への導入方法としては様々なものがあるが、ｓｉＲＮＡと細胞を接触させることによる直接導入法が一般的である。

細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制することができる。これらの因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知である。例えば、細胞への遺伝子の導入には、直接細胞に接触させて導入する方法、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、ＨＶＪリポソームなどの方法を用いることができる。当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。また、当該分野で公知の他の方法により、細胞のＰＬ−３遺伝子の発現を抑制してもよい。

患者から得られ、上記のごとくＰＬ−３ ＤＮＡの発現を抑制する因子で処理された細胞を、好ましくはその患者自身に戻すことによっても、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防を行うことができる。好ましい細胞は平滑筋細胞、神経細胞などである。

本発明は、もう１つの態様において、ＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子に関するものである。すなわち、本発明のこの態様は、上で定義したＰＬ−３ ＤＮＡによりコードされる蛋白（以下、「ＰＬ−３蛋白」ということがある）の作用を抑制する因子に関するものである。ＰＬ−３蛋白はアポトーシスを促進する作用を有している。ＰＬ−３蛋白の例として、配列番号：１のＡｐｏｐ−１ ＤＮＡによりコードされるＡｐｏｐ−１蛋白のアミノ酸配列を配列番号：４に、配列番号：２のＡｐｏｐ−２ ＤＮＡによりコードされるＡｐｏｐ−２蛋白のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。さらなるＰＬ−３蛋白の例として、配列番号：３のヒトＰＬ−３ ＤＮＡによりコードされるヒトＰＬ−３蛋白のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。

ＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子の例としては、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）等が挙げられる。本発明に用いられるＰＬ−３蛋白の作用を抑制する好ましい因子の例としては、ＰＬ−３蛋白に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。かかる抗体の作成方法は当業者に公知であり、種々の方法から適宜選択して用いることができる。本明細書において、特に断らないかぎり、ある物質の「作用を抑制する」とは、その物質の作用を通常レベルよりも低下させること、ならびに完全に消失させてしまうことを包含する。同種の蛋白（例えば、アイソザイム）が複数存在する場合に、それらのうちの１つまたはそれ以上の作用を抑制してもよく、あるいは全部の作用を抑制してもよい。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することによりＰＬ−３蛋白の作用を抑制することができる。また、これらのＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。細胞としては、ＰＬ−３蛋白を発現しているものであればよく、例えば、平滑筋細胞、神経細胞、心筋細胞等が挙げられる。

患者から得られ、上記のごとくＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子で処理された細胞を、好ましくはその患者自身に戻すことによっても、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防を行うことができる。

さらに別の態様において、本発明は、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子あるいはＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子を含む、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防のための医薬組成物に関するものである。通常は、これらの医薬組成物は担体または賦形剤を含む。これらの因子のかわりに、これらの因子で処理された細胞を用いてもよい。これらの因子や細胞以外にも、アポトーシスを抑制することがわかっている薬剤を本発明の医薬組成物に含有させてもよい。医薬組成物の製造方法、剤形、投与量、投与経路については、当業者が疾病や対象の状態等に応じて適宜選択することができる。

さらなる態様において、本発明は、本発明は、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞を対象に投与することを特徴とする、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防方法に関するものである。

さらなる態様において、本発明は、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防のための医薬組成物の製造における、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞の使用に関するものである。

さらなる態様において、本発明は、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞を対象に投与することを特徴とする、アポトーシスの抑制が有益な疾病の治療または予防方法に関するものである。

さらにもう１つの態様において、本発明は、ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子
に関するものである。すなわち、上記とは逆に、ＰＬ−３遺伝子の発現を促進する因子でもって細胞、特に平滑筋細胞や神経細胞を処理することによって、これらの細胞におけるアポトーシスを促進することができる。したがって、これらの因子で処理された細胞を用いて、アポトーシスの促進が有益である疾病を治療することができる。

アポトーシスの促進が有益である疾病としては、種々の癌や悪性腫瘍、動脈硬化、自己免疫疾患等が挙げられる。

ＰＬ−３遺伝子の発現を促進する因子は、ＰＬ−３遺伝子の合成を促進するものであってもよく、あるいはＰＬ−３遺伝子の作用および機能を促進するものであってもよい。本明細書において、特に断らないかぎり、遺伝子の「発現を促進する」とは、その遺伝子の発現を通常レベルよりも高めることをいう。具体的には、遺伝子の「発現を促進する」とは、その遺伝子の合成を活性化させること、その遺伝子の制御・調節機構を発現促進の方向にシフトさせることなどを包含する。また例えば、同種の機能を有する蛋白、例えばアイソザイムをコードする遺伝子が複数ある場合において、それらの遺伝子のうち１つまたはそれ以上、あるいはすべての発現を促進してもよい。ＰＬ−３遺伝子の発現を促進する因子の例としては、リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォア、例えばＡ２３１８７、過酸化水素等が挙げられるが、これらに限らない。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、ＰＬ−３遺伝子の発現を抑制することができる。これらの因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子をまたはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞に接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞への遺伝子の導入には、細胞に直接接触させて導入する方法、ベクターによる方法、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、ＨＶＪリポソームなどの方法を用いることができる。

患者から得られ、上記のごとくＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子で処理された細胞を、好ましくはその患者自身に戻すことによっても、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防を行うことができる。

さらにもう１つの態様において、本発明は、ＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子
に関するものである。すなわち、本発明のこの態様は、ＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子に関するものである。

ＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子の例としては、リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォア、例えばＡ２３８１７、過酸化水素等が挙げられるが、これらに限らない。本明細書において、特に断らないかぎり、ある物質の「作用を促進する」とは、その物質の作用を通常レベルよりも上昇させることを包含する。同種の蛋白（例えば、アイソザイム）が複数存在する場合に、それらのうちの１つまたはそれ以上の作用を抑制してもよく、あるいは全部の作用を抑制してもよい。細胞をこれらの因子で処理することにより、例えば、細胞をこれらの因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより、ＰＬ−３蛋白の作用を促進することができる。また、これらの因子をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。これらの因子で細胞を処理する方法、例えば、これらの因子またはこれらの因子をコードする遺伝子を細胞と接触させ、あるいは細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、当業者は細胞の種類、因子の種類等に応じて、これらの方法を適宜選択して用いることができる。細胞としては、ＰＬ−３蛋白を発現しているものであればよく、例えば、平滑筋細胞、神経細胞、心筋細胞等が挙げられる。

本発明のさらなる態様において、患者から得られ、上記のごとくＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子で処理された細胞を、好ましくはその患者自身に戻すことによっても、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防を行うことができる。

さらに別の態様において、本発明は、ＰＬ−３ 遺伝子またはＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子あるいはＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子を含む、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防のための医薬組成物に関するものである。通常は、これらの医薬組成物は担体または賦形剤を含む。これらの因子のかわりに、これらの因子で処理された細胞を用いてもよい。これらの因子や細胞以外にも、アポトーシスを促進することがわかっている薬剤を本発明の医薬組成物に含有させてもよい。医薬組成物の製造方法、剤形、投与量、投与経路については、当業者が疾病や対象の状態等に応じて適宜選択することができる。

さらなる態様において、本発明は、本発明は、ＰＬ−３ 遺伝子またはＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞を対象に投与することを特徴とする、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防方法に関するものである。

さらなる態様において、本発明は、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防のための医薬組成物の製造における、ＰＬ−３遺伝子の発現を促進する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞の使用に関するものである。

さらなる態様において、本発明は、ＰＬ−３遺伝子の発現を促進する因子、あるいはＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子、あるいはこれらの因子で処理された細胞を対象に投与することを特徴とする、アポトーシスの促進が有益な疾病の治療または予防方法に関するものである。

さらにもう１つの態様において、本発明は、
下記工程：
（ｉ）ＰＬ−３ ＤＮＡを発現している細胞を候補薬剤の存在下で培養し、次いで、
（ｉｉ）候補薬剤の不存在下で同様に培養を行った場合と比較して、細胞のアポトーシスを抑制または促進する候補薬剤を見出す
を特徴とする、アポトーシス抑制または促進因子のスクリーニング方法に関するものである。

本発明のスクリーニング法において、先ず、ＰＬ−３遺伝子を発現している細胞、例えば、平滑筋細胞または神経細胞を用意する。ＰＬ−３遺伝子を発現していることが明かである細胞を用いてもよく、ＰＬ−３ ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞にＰＬ−３遺伝子を発現させてもよい。特に、アポトーシスを抑制する候補薬剤をスクリーニングする場合にはアポトーシスを誘発することが知られている因子の存在下でスクリーニングを行ってもよい。次いで、該細胞を候補薬剤の存在下で培養して細胞のアポトーシスの程度を調べ、候補薬剤の不存在下で同様に培養した細胞のアポトーシスの程度と比較する。候補薬剤としては、細胞のアポトーシスを抑制または促進することが知られている物質、およびそれらのアナログ、誘導体、変異体等が挙げられるが、これらに限らない。本発明のアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびこれらの変異体、誘導体等がアポトーシス抑制物質として例示される。エトポシド、リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、およびこれらのアナログ、誘導体等がアポトーシス促進物質の候補物質として例示される。低酸素条件（アポトーシス促進）等の細胞周囲の環境条件も「候補薬剤」に包含される。細胞のアポトーシスの程度を調べる方法は当業者によく知られている。例えば、細胞の収縮、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した場合の凝縮され断片化された核のような形態学的特徴、ＴＵＮＥＬ染色によるＤＮＡの断片化、フローサイトメーターによるアポトーシスの定量等を調べることにより、細胞のアポトーシスの程度を調べることができる。また、例えば、例えば、ＰＬ−３ ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入して候補薬剤をスクリーニングする場合には、ＰＬ−３とＧＦＰなどのマーカー蛋白の融合蛋白を発現できるようにして、視覚的チェックを併用することもできる。

かかるスクリーニング方法により見出されたアポトーシス抑制または促進因子を、上で説明したように用いることができる。

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は単に説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。

ＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、およびそれを発現するベクターの製造
ＰＬ−３ ＤＮＡ（Ａｐｏｐ−１）（配列番号：３）に対するアンチセンスＤＮＡフラグメントを、ＰＬ−３蛋白とＧＦＰの融合蛋白発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３ ＰＬ３／ＧＦＰ）から制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ）を用いて切り出すことにより得た。ｐｃＤＮＡ３．１ｐｌｕｓベクター（Invitrogen）のＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ）部位とＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）部位に、ＰＬ−３ ＤＮＡフラグメントをアンチセンス向きに挿入した。挿入されたフラグメントは上記のＰＬ−３とＧＦＰの融合蛋白発現ベクターから切り出したため、ＧＦＰ配列の一部（配列番号：７のヌクレオチド９１７から１０３９まで）も含まれていたが、実施例２に示すようにアンチセンス作用には問題を生じなかった。このようにして得られたＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡを含むアンチセンスプラスミドベクターをｐｃＤＮＡ３ＡＳと命名した。ｐｃＤＮＡ３ＡＳの構成スキームを図１に、その全ヌクレオチド配列を配列番号：７に示す。挿入フラグメント中のＧＦＰ由来の配列を除いたヌクレオチド配列、すなわちＰＬ−３ ＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：８に示す。

ＰＬ−３ ＤＮＡに対するｓｉＲＮＡの製造
配列番号：９、１０および１１に示すｓｉＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡｉ）を常法により化学合成した。合成ＲＮＡを安定化させるために、配列番号：９、１０および１１の３’にｄＴｄＴ配列を付加したもの（それぞれＲＮＡｉ−１、ＲＮＡｉ−２、ＲＮＡｉ−３と称する）を実験に使用した。ＰＬ−３ ＲＮＡの標的配列と各アンチセンスＲＮＡｉとのハイブリダイゼーションの様子を図２に示す。

アンチセンスＤＮＡによるＰＬ−３発現の抑制
ＰＬ−３蛋白（Ａｐｏｐ−１）とＧＦＰの融合蛋白発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ）、ｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ＋ｐｃＤＮＡ３ＡＳ、およびｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ＋ｐｃＤＮＡ３．１を（各１μｇ）、平滑筋細胞（ＡｐｏＥ欠損マウスの下行胸大動脈細胞）に導入した。ｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰは、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（invitrogen）にＡｐｏｐ−１遺伝子を挿入することにより作成した。細胞へのベクター導入はエレクトロポレーション法によった。５％ ＣＯ_２雰囲気下、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有Ｄ−ＭＥＭ培地にて、３７℃、２４時間培養し、緑色蛍光を観察した。結果を図３に示す。図３ａからわかるように、ｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰを導入した細胞において緑色蛍光が認められ、Ａｐｏｐ−１の発現が確認された。ｐｃＤＮＡ３ＡＳをｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰとともに導入した細胞では緑色蛍光が認められず、アンチセンスＤＮＡによりＡｐｏｐ−１の発現が完全にブロックされたことがわかる（図３ｂ）。図３ｃは対照実験の結果であり、ｐｃＤＮＡ３ＡＳのかわりに空ベクターｐｃＤＮＡ３．１をｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰとともに細胞に導入した結果である。緑色蛍光が認められ、Ａｐｏｐ−１の発現が認められた。

ｓｉＲＮＡによるＰＬ−３発現の抑制
ＲＮＡｉ−１、ＲＮＡｉ−２、ＲＮＡｉ−３を用いてＰＬ−３の発現を抑制した。各ｓｉＲＮＡ（１μｇ）の細胞への導入は、直接導入法により行った。結果を図４に示す。ＰＬ−３蛋白（Ａｐｏｐ−１）とＧＦＰの融合蛋白発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ）を平滑筋細胞（マウス動脈由来）に導入し（導入方法および培養方法は実施例３と同じ）、発現させたところ、緑色蛍光が認められ、Ａｐｏｐ−１の発現が確認された（陽性対照）（図４Ａ）。ＲＮＡｉ−１、ＲＮＡｉ−２、ＲＮＡｉ−３（各１μｇ）をｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ（１μｇ）とともに細胞に導入することにより、緑色蛍光が抑制され、Ａｐｏｐ−１の発現が抑制されたことが確認された（それぞれ図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ）。実施例３と同様に、ｐｃＤＮＡ３ＡＳ（１μｇ）をｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ（１μｇ）とともに細胞に導入した場合には、Ａｐｏｐ−１の発現が完全にブロックされた（図４Ｅ）。対照ｓｉＲＮＡ（ＣＧＴ ＡＣＧ ＣＧＧ ＡＡＴ ＡＣＴ ＴＣＧ Ａ（配列番号：１２））（１μｇ）をｐｃＤＮＡ３Ａｐｏｐ−１／ＧＦＰ（１μｇ）とともに細胞に導入した場合には、Ａｐｏｐ−１の発現は抑制されなかった（図４Ｆ）。

アンチセンスＤＮＡのＰＬ−３発現抑制作用による心筋細胞生存率の増加
心筋細胞（ラット胎児由来）を低酸素条件下（１％）にて培養した場合におけるアンチセンスＤＮＡによる心筋細胞生存率の増加を調べた。図５の左のバーは、心筋細胞（ラット由来）を５％ ＣＯ_２雰囲気下、Ｄ−ＭＥＭ培地にて、３７℃、２４時間培養し、その場合の細胞生存率を１としたものである。図５の中央のバーは、心筋細胞を低酸素条件下（１％）にて培養した場合（他の条件は同じ）の生存率を示す。低酸素により生存率は０．５以下に減少した。図５の右のバーは、ｐｃＤＮＡ３ＡＳを導入した心筋細胞の低酸素条件下で同様に培養した場合の生存率を示す（ベクターの導入方法は上記実施例と同じ）。アンチセンスＤＮＡの導入により生存率が完全に回復したことが確認された。ｐｃＤＮＡ３ＡＳのかわりに実施例４記載のＲＮＡｉ−１、−２および−３を用いた場合にも生存率の回復が確認された（データ示さず）。

アポトーシス誘導因子により誘導されたアポトーシスのアンチセンスＤＮＡによる抑制
アポトーシスを誘導することがわかっている物質および環境因子（エトポシド（ＥＴＰ）（１００μＭ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２００μＭ）、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）（５０μＭ）、および低酸素条件（ＨＯ）（１％））の存在下で平滑筋細胞を培養した。図中ＣＴＬは対照実験系で、上記物質および環境因子を作用させなかった。平滑筋細胞にｐｃＤＮＡ３．１（対照ベクター）あるいはｐｃＤＮＡ３ＡＳ（アンチセンスＤＮＡを担持するベクター）を導入しておいた。使用細胞とその培養法およびベクターの導入法は実施例３と同様であった。２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイにより生細胞数をカウントした。次いで、上記物質を含む培地（無血清培地）中、あるいは低酸素条件にてさらに２４時間細胞を培養してから生存率を評価した。生存率の評価にはＭＴＴアッセイを用いた。結果を図６に示す。

ｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞において、試験したすべての物質および低酸素条件によりアポトーシスが誘導された（図６の黒色バー参照）。アポトーシス誘導の程度に差異があり、ＳＮＰのアポトーシス誘導作用が大きかった。これらの結果から、この系をアポトーシス誘導物質または誘導環境のスクリーニングに使用できることがわかった。次に、ｐｃＤＮＡ３ＡＳを導入した細胞について見てみると、ＥＴＰ処理細胞以外においては、若干の程度の差異はあるものの生存率が回復していた。ｐｃＤＮＡ３ＡＳのかわりに実施例４記載のＲＮＡｉ−１、−２および−３を用いた場合にも生存率の回復が確認された（データ示さず）。したがって、この系をアポトーシス抑制物質または抑制環境のスクリーニングに使用できることがわかった。

配列表フリーテキスト
配列番号：１はマウスＰＬ−３ ＤＮＡ（Ａｐｏｐ−１ ＤＮＡ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号：２はマウスＰＬ−３ ＤＮＡ（Ａｐｏｐ−２ ＤＮＡ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号：３はヒトＰＬ−３ ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：４はマウスＰＬ−３蛋白（Ａｐｏｐ−１蛋白）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５はマウスＰＬ−３蛋白（Ａｐｏｐ−２蛋白）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６はヒトＰＬ−３蛋白のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７はｐｃＤＮＡ３ＡＳの全ヌクレオチド配列を示す。
配列番号：８はｐｃＤＮＡ３ＡＳに挿入されたアンチセンスＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：９は本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：１０は本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：１１は本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号：１２は実施例４で使用した対照ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。

本発明は、アポトーシスに関連した医薬品の開発や製造の分野、ならびに生化学的研究分野等において利用可能である。

図１はｐｃＤＮＡ３ＡＳのスキームを示す図である。 図２は本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列およびそれらの標的配列を示す図である。 図３は本発明のアンチセンスＤＮＡによるＰＬ−３発現の抑制を示す蛍光顕微鏡写真である。 図４は本発明のｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡによるＰＬ−３発現の抑制を示す蛍光顕微鏡写真である。 図５は本発明のアンチセンスＤＮＡのＰＬ−３発現抑制作用による心筋細胞生存率の増加を示す図である。 図６はアポトーシス誘導因子による細胞の生存率の低下を、本発明のアンチセンスＤＮＡにより回復できることを示す図である。

Claims (22)

1. ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を抑制する因子。
2. アンチセンスプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよび低酸素条件からなる群より選択される請求項１記載の因子。
3. アンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１記載の因子。
4. 下記のいずれかのヌクレオチド配列：
   （ａ）配列番号：８に示すヌクレオチド配列、
   （ｂ）（ａ）のＤＮＡに対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
   を有する請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. ｓｉＲＮＡである請求項１記載の因子。
6. 下記のいずれかのヌクレオチド配列：
   （ａ）配列番号：９、１０または１１に示すヌクレオチド配列、
   （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して全長にわたって８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列、あるいは
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイゼーションする配列
   を有する請求項５記載のｓｉＲＮＡ。
7. 低酸素条件である請求項１記載の因子。
8. ＰＬ−３蛋白の作用を抑制する因子。
9. ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）である請求項８記載の因子。
10. ＰＬ−３蛋白に対する抗体。
11. 請求項１ないし１０のいずれか１項記載の因子を含む、アポトーシスを抑制することが有益な疾患を治療するための医薬組成物。
12. 該疾患が動脈硬化、心筋梗塞または脳梗塞である請求項１１記載の医薬組成物。
13. ＰＬ−３ ＤＮＡの発現を促進する因子。
14. リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび過酸化水素からなる群より選択される請求項１３記載の因子。
15. ＰＬ−３蛋白の作用を促進する因子。
16. リゾホスファチジルコリン、ニトロプルシドナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび過酸化水素からなる群より選択される請求項１５記載の因子。
17. 請求項１３ないし１６のいずれか１項記載の因子を含む、アポトーシスを促進することが有益な疾患を治療するための医薬組成物。
18. 該疾患が癌、動脈硬化または自己免疫疾患である請求項１７記載の医薬組成物。
19. 請求項１ないし１０のいずれか１項記載の因子で処理された細胞。
20. 請求項１３ないし１６のいずれか１項記載の因子で処理された細胞。
21. 下記工程：
    （ｉ）ＰＬ−３ ＤＮＡを発現している細胞を候補薬剤の存在下で培養し、次いで、
    （ｉｉ）候補薬剤の不存在下で同様に培養を行った場合と比較して、細胞のアポトーシスを抑制または促進する候補薬剤を見出す
    を特徴とする、アポトーシス抑制または促進因子のスクリーニング方法。
22. 請求項２１記載の方法により見出されるアポトーシス抑制または促進因子。
    
    

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